WO2005035562A1

WO2005035562A1 - 新規な細胞増殖促進剤

Info

Publication number: WO2005035562A1
Application number: PCT/JP2004/015009
Authority: WO
Inventors: Shinya Yamanaka
Original assignee: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2003-10-07
Filing date: 2004-10-05
Publication date: 2005-04-21
Also published as: JPWO2005035562A1

Abstract

　細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進する剤を提供する。　本発明のタンパク質導入ドメインおよびERasタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質あるいは化学的結合体を用いることによって細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進することができる。本発明の細胞増殖促進剤は、可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。

Description

明細書

新規な細胞増殖促進剤技術分野

本発明は細胞増殖促進剤に関するものである。具体的には、胚性幹細胞や体性幹細胞の細胞増殖促進剤を提供するものである。背景技術

胚性幹細胞（ES細胞）や体性幹細胞（組織幹細胞）などの幹細胞は神経疾患、糖尿病、白血病などに対する移植療法の資源として期待されている。 ES細胞は受精卵 (胚盤胞）の内部細胞塊に由来し、分化多能性を有することから特に価値が高い。マウス ES細胞は白血病阻害因子（LIF) により分化多能性を維持することができる。しかしヒトおよびサルの ES細胞は LIF存在下でも、分化多能性を完全に維持しつつ増殖させることが難しい。一方体性幹細胞は受精卵を利用しないため ES細胞のような倫理的問題が無いという長所を持つ。しかし体性幹細胞は ES細胞よりも増殖が悪く、十分な細胞数を得ることが難しい。そのため、これら ES細胞や体性幹細胞の増殖促進物質が望まれている。

本発明者は、 ES細胞で特異的に発現する遺伝子群 ECAT (ES cell associated transcript) を同定し、その機能を解析してきた（W0 02/097090 A1) 。これまでに、 ECAT4 (Nanog) はホメォボックス転写因子であり、 Nanogを ES細胞で過剰に発現させると LIF非依存的に分化多能性を維持できること（Cell, 113, 631-642 (2003) ) 、および ECAT5 (ERas) は恒常活性型の Ras 蛋白質であり、 ERasは PI3キナーゼの活性化を介して ES細胞の増殖を促進していること（Nature, 423， 541-545 (2003) ) などが明らかとなっている。 ERasは ES細胞だけでなく NIH3T3細胞やマウス胎児線維芽細胞（MEF) に対しても強い増殖促進を示す。発明の開示

本発明は、可逆的な細胞増殖促進剤、特に胚性幹細胞（ES細胞）や体性幹細胞の可逆的な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。現在、多分化能を維持したまま ES細胞や体性幹細胞を大量生産することは極めて困難であり、未だ達成されていない。また遺伝子導入は、リポフエクシヨン法ゃレト口ウィルスベクター法などの公知の方法により達成できるが、（i)高い導入効率を得ることが難しい、（ii)導入された遺伝子は染色体に取り込まれるが染色体のどこに組み込まれるか不明で不可逆的であるため癌化するリスクが高い、（iii)操作が煩雑なために多数の細胞を一度に処理しにくい、などの様々な課題がある。したがって臨床応用を考えると、細胞増殖に関与する遺伝子を遺伝子導入して細胞を増殖させることは現実的ではない。

そのため、本発明は遺伝子導入によらない臨床応用可能な細胞増殖促進剤を提供することを目的とする。

本宪明者は、上記の問題点を解決すべく鋭意検討し、 ERas (ECAT5) タンパク質に HIV由来の TATぺプチドを組み合わせた融合タンパク質を培地に添加することによつて、該融合タンパク質が細胞に取り込まれて細胞増殖が促進されることを見出した。なお、培地から融合蛋白質を除去すると、細胞内に取り込まれた蛋白質が分解されるとともに反応は停止するため、本発明における細胞増殖促進作用は可逆的である。

これらの知見から、本究明者は、 ERasタンパク質を細胞に取り込ませることによつて細胞増殖を可逆的に促進させることができ、特に、多分化能を保ったまま培養して増殖させるのが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞を増殖させるのに有用であると考え、本発明を完成するに至った。 ' 即ち本発明の要旨は、以下のとおりである。

[ 1 3 タンパク質導入ドメインぉよび ERasタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質、

〔2〕 ERasタンパク質がヒト、サル、ゥシまたはマウス由来のものである、上記〔 1〕記載の融合タンパク質、

〔3〕タンパク質導入ドメインが、 HIV TAT、アンテナぺディア ·ホメォドメイン (Antonnapedia homeodomain) 、 HSV VP22また fまこれらのうちレヽずれ力のフラグメントである、上記〔1〕または〔2〕記載の融合タンパク質、

〔4〕タンパク質導入ドメインが、 HIV Revのフラグメント、 flock house virus Coat (FHV Coat)のフラグメント、 brome mosaic virus Gag (BMV Gag)のフラグメント、 human T cell leukemia virus- Π Rex (HTLV _ Π Rex)のフラグメント、 cowpea chlorotic mottle virus Gag (CCMV Gag)のフラグメント、 P22 Nのフラグメント、え Nのフラグメント、 Φ 21Νのフラグメント、酵母 PRP6のフラグメント、またはオリゴアルギニンからなるペプチドである、上記〔1〕または〔2〕記載の融合タンパク質、

〔5〕タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（FGF) 、肝細胞増殖因子 (HGF) またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、上記〔1〕または〔 2〕記載の融合タンパク質、

〔6〕上記〔1〕〜〔5〕いずれ力記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸、

〔7〕上記〔6〕記載の核酸を含有する発現ベクター、

〔8〕上記〔7〕記載の発現ベクターを含有する細胞、

〔9〕上記〔8〕記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、上記〔1〕〜〔5〕いずれ力、記載の融合タンパク質の製造方法、〔1 0〕ビスフォスフォネート化合物、グルコース一 6—リン酸、 P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物またはアルギニンを有する分岐型ぺプチドと、 ERasタンパク質との化学的結合体、

〔1 1〕上記〔1〕〜〔5〕いずれ力記載の融合タンパク質または上記〔1 0〕記載の化学的結合体を有効成分として含有する細胞增殖促進剤、

〔1 2〕 Nanogタンパク質をさらに含有する、上記〔1 1〕記載の細胞増殖促進剤

〔1 3〕細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔1 1〕または〔1 2〕記載の細胞増殖促進剤、

〔1 4〕上記〔1〕〜〔5〕いずれ力、記載の融合タンパク質または上記〔1 0〕記載の化学的結合体と細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖促進方法、

〔1 5〕 Nanogタンパク質をさらに接触させる、上記〔1 4〕記載の細胞増殖促進方法、

〔1 6〕 .細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、上記〔1 4〕または〔1 5〕記載の細胞増殖促進方法、

〔1 7〕ピノサイト一シスで上記〔1〕〜〔5〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔1 0〕記載の化学的結合体を細胞内に取り込ませる工程を含む、上記〔 1 4〕〜〔1 6〕いずれか記載の細胞増殖促進方法、

〔1 8〕上記〔1〕〜〔5〕いずれか記載の融合タンパク質または上記〔1 0〕の化学的結合体を含有する細胞。図面の簡単な説明

図 1は、融合タンパク質の例で、 ERasタンパク質の N末端に HIV由来の TATぺプチドを融合させたものを示している。これらのタンパク質は大腸菌内や Cell Free 合成系で合成、精製することができる。

図 2は、 TAT-ERasタンパク質による細胞増殖促進作用を示している。発明を実施するための最良の形態

本明において「融合タンパク質」とは、タンパク質導入ドメインと ERasタンパク質を含んでいる融合タンパク質であり、細胞に取り込まれることにより細胞增殖活性の亢進が認められるものであればよい。この融合タンパク質を細胞に取り込ませることにより、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞などの培養の効率性と経済性の向上が期待できる。

融合タンパク質における 2つのドメィンの融合はいずれの可能な位置でもよく、タンパク質導入ドメインは ERasタンパク質の N末端または C末端のいずれに融合してもよいが、好ましくは ERasタンパク質の N末端に融合する。

タンパク質導入ドメインは、公知の方法で融合することができ、例えば、直接的な化学結合により、あるいはリンカ一分子を介して、 ERasタンパク質に融合してもよい。かかる場合、リンカ一分子は、 2つのドメインを連結させることのできるいずれの 2価の化学構造物であってもよい。本発明の好ましいリンカ一分子は短いぺプチド、例えば、 1〜 2 0個のァミノ酸残基、好ましくは 1〜 1 0個のァミノ酸残基を有するものである。融合タンパク質は公知の遺伝子工学的な手法を用いて作製することもできる。本明細書において「タンパク質」には、特定のアミノ酸配列（配列番号： 2 , 4 ， 6または 8 ) で示されるタンパク質だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログゃスプライスバリアント）、変異体、誘導体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらは HomoloGene ( http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/HomoloGene/) により同定された遺伝子の塩基配列力ら演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質と、少なくとも 70%、好ましくは 80°/₀、より好ましくは 95%、さらにより好ましくは 97%相同なものを挙げることができる。従って、本明細書において「ERasタンパク質」は、特に言及しない限り、特定ァミノ酸配列（配列番号 2， 4 , 6または 8 ) で示される ERasタンパク質やその同族体、変異体、誘導体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号： 2 に記載のァミノ酸配列を有するマウス ERasタンパク質、配列番号： 4に記載のァミノ酸配列を有するヒト ERasタンパク質、配列番号： 6に記載のァミノ酸配列を有するサル ERasタンパク質、配列番号： 8に記载のァミノ酸配列を有するゥシ ERasタンパク質、およびラットホモログなどが包含される。ここで配列番号 2に示すタンパク質は、マウス由来の ERas遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号 4に示すタンパク質は、ヒト由来の ERas遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号 6に示すタンパク質は、サル由来の ERas遺伝子によってコードされるタンパク質である。配列番号 8に示すタンパク質は、ゥシ由来の ERas遺伝子によってコードされるタンパク質である。

ERasタンパク質には、配列番号 2， 4， 6または 8に示す各アミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記各ァミノ酸配列において、 1もしくは複数 (通常数個）のアミノ酸が欠失、置換または付カロされたァミノ酸配列からなり、且つもとのァミノ酸配列の ERasタンパク質と実質的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。

ここで実質的に同等の活性とは、該タンパク質を発現させた細胞の細胞増殖が促進される、あるいは該タンパク質を取り込ませた細胞の細胞増殖が促進されるという性質を示す。このような ERasタンパク質の性質は、公知の方法（Nature, 423, 541-545 (2003) ) などにより容易に測定することができる。

なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数および変異部位は、その活性が保持される限り制限はない。活性を消失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、揷入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全アミノ酸の 5%以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の 1%以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質が ERasタンパク質の活性を保持している限り、特に制限されない。この置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、アミノ酸の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、両親媒性などにおいて置換前のァミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Met、 Pheおよび Trpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asnおよび Ginは互いに非荷電性ァミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Aspおよび Gluは互いに酸性ァミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Argおよび Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。

ERasタンパク質は、後述する ERasタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体を培養することによって製造することができる。

本発明において「タンパク質導入ドメイン」とは、タンパク質を導入することができる、またはタンパク質導入を補助することのできるものであればよく、何ら限定されない。例えば、 (i)公知である HIV TAT、アンテナぺディア ·ホメォドメイン (Antonnapedia homeodomain) 、 HSV VP22またはこれらのうちいずれかのフラグメント、（ii) HIV Revのフラグメント、 flock house virus Coat (FHV Coat)のフラグメント、 brome mosaic virus Gag (BMV Gag)のフフグメント、 human T cell leukemia- Π Rex (HTLV Π Rex)のフラグメント、 cowpea chlorotic mottle virus Gag (CCMV Gag)のフラグメント、 P22 Nのフラグメント、 λ Νのフラグメント、 φ 21Nのフラグメントまたは酵母 PRP6のフラグメント、 (iii)オリゴアルギニンを有するペプチド、（iv) cell penetrating peptides (CPP) 、線維芽細胞増殖因子（FGF ) 、 f細胞増殖因子（HGF) またはこれらのうちいずれかのフラグメント、などを挙げることができる。

前記（i)〜（iii)のいずれかのタンパク質導入ドメインを用いることによって、広範囲な細胞に ERasを細胞内に取り込ませることができる。また、目的細胞において特異的に発現するレセプターと結合する物質をタンパク質導入ドメインとして用いることによつて組織あるいは細胞特異的な取り込みが可能となるため、前記（iv)のタンパク質導入ドメィンを用いれば、対応するレセプターが発現した組織あるいは細胞特異的に ERasを細胞内に取り込ませることができる。

前記（i)のタンパク質導入ドメインである HI V TAT、アンテナぺディア ·ホメォドメイン (Antonnapedia homeodomain) 、 HSV VP22には、 HIV由来の TAT (Green and Loewnstein, Cell, 56 (6)， 1179-88 (1988)、 Frankel and Pabo, Cell, 55 (6)， 1189-93 (1988) ) 、ショウジヨウバエ由来のアンテナぺディア蛋白（Vives et al. , J. Biol. Chem, 272 (25) , 16010-7 (1997) ) 、 HSV由来の VP22 (Elliott and 0' Hare, Cell, 88 (2) , 223-33 (1997) ) のみならず、その機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログゃスプライスバリアント）、変異体などが包含される。なお、変異体としては、変異のないタンパク質と少なくとも 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 95%、さらにより好ましくは 97%相同なものを挙げることができる。

更に前記（i)のタンパク質導入ドメインは、 HIV TATのフラグメント、アンテナぺディア■ホメォドメインのフラグメントまたは HSV VP22のフラグメントであり、且つタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものも包含する。該フラグメントの長さは、タンパク質導入またはタンパク質導入を補助する機能を有するのであればよく、何ら限定はされない。

HIV TAT、アンテナぺディア ·ホメォドメインおよび HSV VP22は、細胞膜を貫通する能力を有する蛋白トランスダクシヨンドメイン (以下、 rpTDj という）が同定されているため、タンパク質導入ドメインである HIV TATのフラグメント、アンテナぺディア ·ホメォドメインのフラグメントおよび HSV VP22のフラグメントには、これらの PTDからなるフラグメントも包含される。異種蛋白と PTDを融合することにより、培養細胞中に導入することができることは公知であり、その作製方法も知られている (Fawell et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (2) , 664-8 (1994) 、 Elliott and 0， Hare (1997) , Phelan et al. , Nature Biotech. 16, 440-443 (1998)および Dilber et al. , Gene Ther. , 6 (1)， 12-21 (1999)、特許番号第

2702285号）。 HIV TATの PTDについては、 HIV TAT蛋白由来の 11アミノ酸の PTDに融合した ]3—ガラクトシダーゼ蛋白が、生きたマウスのすべての組織に浸潤してすべての単一細胞に到達できることが報告されている（Schwarze et al. , Science, 285 (5433) , 1569-72 (1999) ) 。

HIV TATのフラグメントどしては、具体的には、前記の公知文献等に記載されているものを挙げることができるが、好ましくは特許番号第 2702285号に記載の HIV TATフラグメントであり、更に好ましくは配列番号 13で示される配列を含有するぺプチドが挙げられる。配列番号 13で示される配列を含有するペプチドとしては、例えば、配列番号 17に示されるアミノ酸配列を有する HIV TAT- (48- 60)ペプチドが挙げられる。

アルギニンに富む塩基性ぺプチドは細胞膜透過能を有しており、 HIV TATのフラグメントは分子中央部を全てアルギニンに置換しても（配列番号 16) 、該フラグメント（ペプチド）は細胞膜透過能を有することが知られているため（

J. Biol. Chem. , 276, 5836-5840 (2001) ) 、 HIV TATのフラグメント、アンテナぺディァ -ホメォドメインのフラグメントおよび HSV VP22のフラグメントは、複数個のアミノ酸がアルギニンに置換されていてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメインに含まれる。

前記（ii)のタンパク質導入ドメインである HIV Revのフラグメント、 flock house virus Coat (FHV Coat)のフラグメント、 brome mosaic virus Gag (BMV Gag)のフラグメント、 human T cell leukemia virus- Π Rex (HTLV - Π Rex)のフラグメント、 cowpea chlorotic mottle virus Gag (CCMV Gag)のフラグメント、 P22 Nのフラグメント、 Νのフラグメント、 φ 21Νのフラグメントおよび酵母 PRP6のフラグメントは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。これらのフラグメントは、細胞膜透過能を有することが知られている (J. Biol. Chem. , 276， 5836-5840 (2001) ) 。例えば、 HIV Revのフラグメントとしては HIV Rev- (34-50)ペプチド（配列番号 18) 、 FHV Coatのフラグメントとしては FHV Coat- (35- 49)ぺプチド（配列番号 19) 、 BMV Gagのフラグメントとしては BMV Gag- (7 - 25)ペプチド（配列番号 20) 、 HTLV-Π Rexのフラグメントとしては HTLV-Π Rex- (4- 16)ペプチド（配列番号 21) 、 CCMV Gagのフラグメントとしては CCMV Gag- (7- 25)ぺプチド（配列番号 22) 、 P22 Nのフラグメントとしては P22 N -（14-30)ぺプチド（配列番号 23) 、 Νのフラグメントとしては N- (1-22)ぺプチド（配列番号 24) 、 φ 21Nのフラグメントとしては φ 21N -（12 - 29)ぺプチド（配列番号 25) 、酵母 PRP6のフラグメントとしては酵母 PRP6- (129- 144)ペプチド（配列番号 26) の全部または一部を有するフラグメントが挙げられる。また、これらのフラグメントの配列において複数個のァミノ酸がアルギニンに置換されてもよく、置換後のフラグメントがタンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していれば、本発明のタンパク質導入ドメィンに含まれる。

前記（i ii)のタンパク質導入ドメィンであるオリゴアルギニンからなるぺプチドは、タンパク質導入機能またはタンパク質導入を補助する機能を有していればよく、何ら限定されない。オリゴアルギニンおよびオリゴアルギェンを有するペプチドが細胞膜透過能を有することは公知であるため（J. Biol. Chem.， 276， 5836 - 5840 (2001)、 J. Biol. Chera. , 277 (4) , 2437-2743 (2002) ) 、例えば、これらの文献に挙げられている細胞膜透過能を有するペプチドをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。オリゴアルギニンを有するペプチドは、オリゴアルギユン（ n = 5〜9 ) を有するぺプチドが好ましく、オリゴアルギニン ( n = 6 ~ 8 ) を有するぺプチドが更に好ましい。

前記（iv)のタンパク質導入ドメインである、「線維芽細胞増殖因子（FGF) 、肝細胞増殖因子（HGF) またはこれらのうちいずれかのフラグメント」とは、公知の FGFタンパク質、公知の HGFタンパク質またはこれらのうちレ、ずれかのフラグメントであり、対応するレセプター発現細胞にタンパク質を導入する機能またはタンパク質導入を補助する機能を有するものであればよく、何ら限定されない。線維芽細胞増殖因子（FGF) のフラグメントとの結合体が細胞内に取り込まれることは公知である (Rojas, M. et al. , Nat. Biotechnol. , 16, 370-375 (1998)、 Lin, Y. Z. et al. , J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995) ) 。従って、これらの文献に報告されている FGFフラグメントをタンパク質導入ドメインとして用いることができる。 FGFのフラグメントとしては、例えば、配列番号 15に記載のァミノ酸配列を含有するフラグメントを挙げることができる。

本明には、前記の本発明融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸も含まれる。

ここで「核酸」とは、「RNAJ または「DNA」が含まれ、その長さによって特に制限されるものではない。「DNA」とは、特に言及しない限り、ヒトゲノム DNAを含む 2本鎖 DNA、 cDNAを含む 1本鎖 DNA (正鎖）並びに該正鎮と相補的な配列を有する 1本鎖 DNA (相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。「RNA」とは、 1本鎮 RNAのみならず、それに相補的な配列を有する 1本鎖 RNA、さらにはそれらから構成される 2本鎖 RNAを包含する趣旨で用いられる。なお、核酸は機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、ェキソン、またはイントロンを含むことができるため、上記 DNAには、 cDNA、ゲノム DNA、及び合成 DNAのいずれもが含まれ、上記 RNAには、 total RNA、 mRNA, rRNA、及び合成の RNAのいずれもが含まれる。

本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、前記 ERasタンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドとタンパク質導入ドメインをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する。，

タンパク質導入ドメインが HIV TATフラグメントである場合は、本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸は、具体的には、例えば

(a)配列番号： 2記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号： 1 3記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、

(b)配列番号： 4記載のァミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチドと配列番号： 1 3記載のァミノ酸酉己列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、

(c)配列番号： 6記載のァミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチドと配列番号： 1 3記載のァミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチドを含有する核酸、

(d)配列番号： 8記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと配列番号： 1 3記載のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含有する核酸、

(e)配列番号： 1記載の塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含有する核酸、

(f)配列番号： 3記載の塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含有する核酸、

(g)配列番号： 5記載の塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含有する核酸、

(h)配列番号： 7記載の塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含有する核酸、

(i)配列番号： 1記載の塩基配列の第 178番目のヌクレオチドから第 858番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含有する核酸、

(j)配列番号： 3記載の塩基配列の第 252番目のヌクレオチドから第 950番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含 · 有する核酸、

(k)配列番号： 5記載の塩基配列の第 1番目のヌクレオチドから第 699番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含有する核酸、

(1)配列番号： 7記載の塩基配列の第 116番目のヌクレオチドから第 817番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と配列番号： 1 1または 1 2記載の塩基配列を含有する核酸、

(m)配列番号： 1 0記載のアミノ酸配列をコードする核酸、

(n)配列番号： 1 4記載のァミノ酸配列をコードする核酸、

(o)配列番号： 9記載の塩基配列を含有する核酸、

(p)配列番号： 9記載の塩基配列からなる核酸、

またはこれら（a)〜 (p)の核酸と実質的 ^同一の塩基配列を含有する核酸が挙げられる。

これら配列番号： 1 , 3 , 5または 7に記載の塩基配列を含有するポリヌクレオチドは、本明細書の配列表の配列番号： 1 , 3， 5または 7に開示されている塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーションのプローブあるいは PCRのプライマーに用いて、例えば ES細胞由来の cDNAライプラリーをスクリーユングすることなどによりクロー-ングすることができる。該クローニングは、例えば Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。

また前記 (a) ~ (p)のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する核酸とは、具体的には、

(q) 前記 (a)〜 (p)のいずれかの核酸の相補鎖に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸、

(r) 前記 (a)〜(p)のいずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸

(s) 前記 (a)〜(_P)のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において 1若しくは複数のァミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加されたァミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸、

などが挙げられる。

ここで前記 (a)〜 (p)のいずれかの核酸の相捕鎖に対してストリンジントな条件下でハイブリダイズする核酸とは、例えば前記 (a)〜 (p)のいずれかの核酸の塩基配列と約 4 0 %以上、好ましくは約 6 0 %以上、より好ましくは約 7 0 %以上、より好ましくは約 8 0 °/₀以上、さらに好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の配列同一性を有する塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記（a) ~ (p)のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。

ハイブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の方法に従って行うことができる。また市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

「ストリンジェントな条件」とは、例えば、 6xSSC (20xSSCは、 333mM Sodium citrate, 3³³mM NaClを示す）、 0. 5%SDSおよび 50%ホルムアミドを含む溶液中で 4 2 °Cにてハイブリダィズさせる条件、または 6XSSCを含む（50%ホルムアミドは含まない）溶液中で 6 5 °Cにてハイプリダイズさせる条件などが挙げられる。またハイブリダィゼーシヨン後の洗浄の条件としては、 0. lxSSC、 0. 5%SDSの溶液中で 68 °Cにて洗浄するような条件が挙げられる。

前記 (a)〜 (p)の、ずれかの核酸との配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸とは、例えば前記 (a)〜（p)のいずれかの核酸の塩基配列と約 4 0 %以上、好ましくは約 6 0 %以上、より好ましくは約 7 0 %以上、より好ましくは約 8 0 %以上、さらに好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の配列同一性を示す塩基配列を含有する核酸が挙げられる。具体的には、前記 (a)〜(p)のいずれかの核酸の部分配列などが挙げられる。このような配列同一性を有する核酸は、前述のハイブリダィゼーシヨン反応や P C R反応により、または後述する核酸の改変（欠失、付力置換）反応により作製することができる。

前記 (a)〜(p)のいずれかの核酸によりコードされるタンパク質において 1若しくは複数のァミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたァミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸とは、人為的に作製したいわゆる改変タンパク質や、生体内に存在するァレル変異対等のタンパク質をコードする核酸を意味する。

ここでタンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、本発明の核酸によりコードされるタンパク質の活性（細胞増殖促進活 I"生）が保持される限り制限はない。このように活 ¾Ξを喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個欠失、置換及び/又は付加されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 1 0 %以内であり、好ましくは全ァミノ酸の 5 % 以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の 1 %以内である。また置換されるアミノ酸は、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala、 Val、 Leu、 lieヽ Pro, Met、 Phe及び Trpは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn及ぴ Ginは互いに非荷電性ァミノ酸に分類されるァミノ酸であり、 Asp及ぴ Gluは互いに酸性ァミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するァミノ酸を適宜選択することができる。この改変タンパク質をコードする核酸は、例えば、 Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に記載の種々の方法、例えば部位特異的変異誘発や P C R法等によって製造することができる。また市販のキットを用いて、 Gapped duplex法や Kunkel法などの公知の方法に従って製造することもできる。

以上のような、前記 (a)〜(p)のいずれかの核酸と実質的に同一の塩基配列を含有する本発明の核酸は、当該核酸によりコードされるタンパク質が、細胞内への導入が可能であり、導入された後は配列番号： 2， 4 , 6または 8に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質であることが好ましい。ここで実質的に同質の活性とは、本発明の核酸によりコードされるタンパク質を発現させた細胞は細胞増殖が促進されるという性質、あるいは当該タンパク質を取り込んだ細胞の細胞増殖が促進するという性質を指す。当該活性およびその測定については、公知の方法にて実施することができる。

本発明の核酸が 2本鎖の場合、前記本発明の核酸を発現ベクターに揷入することにより、本発明のタンパク質を発現するための組換え発現ベクターを作製することができる。

ここで用いる発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウィルスベクター等が挙げられる。例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、 _PUC118、 pUC119、 pBR322、 _PCR3等のプラスミドベクター、 λΖΑΡΠ、 Xgtllなどのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、 pYES2、 pYEUra3などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、 pAcSGHisNT- Aなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、 pCEP4、 pKCR、 pCDM8、 pGL2、 pcDNA3. 1、 pRc/RSV、 pRc/CMVなどのプラスミドベクターや、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウィルスベクターが挙げられる。

前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、シグナル配列をコードする遺伝子、選択用マーカー遺伝子、ターミネータ一などの因子を適宜有していても良い。また、単離精製が容易になるように、チォレドキシン、 Hisタグ、あるいは GST ( グルタチオン S -トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付カ卩されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ lac、 tac、 trc、 trp、 CMV、 SV40初期プロモーターなど）を有する GST融合タンパクベクター（PGEX4Tなど）や、 Myc、 Hisなどのタグ配列を有するベクター（ pcDNA3. 1/Myc - Hisなど）、さらにはチォレドキシンおょぴ Hisタグとの融合タンパク質を発現するベクター（_PET32a) などを用いることができる。

前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、当該発現べクターを含有する形質転換細胞を作製することができる。

ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、 E. coli K-12系統の HB101株、 C600株、 JM109株、 DH5a株、 AD494 (DE3)株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス ■セルビジェなどが挙げられる。動物細胞としては、 L929細胞、 BALB/c3T3細胞、 C127細胞、 CH0細胞、 COS細胞、 Vero細胞、 Hela細胞、 293-EBNA細胞などが挙げられる。昆虫細胞としては sf 9などが挙げられる。

宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、 DEAE-デキストラン法、エレクト口ポレーシヨン法、遺伝子導入用リピッド（Lipofectamine、

Lipofectin; Gibco- BRL社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカ一を含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞を選択することができる。

以上のようにして得られた形質転換細胞を好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のタンパク質を製造することができる。得られたタンパク質は、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離 ·精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ァフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ一等が挙げられる。また本発明のタンパク質を、前述のチォレドキシンや Hisタグ、 GST等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離'精製することができる。

なお、実施例に示すように、これらの融合タンパク質は、試験管内で合成、精製することもできる。本発明の「化学的結合体」とは、 ERasタンパク質を、ビスフォスフォネート化合物、グルコース一 6—リン酸、 P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物（たとえば B C R Pインヒビター）またはアルギニンを有する分岐型ぺプチドと化学的に結合して得られる結合体のことである。 .

「ビスフォスフォネート化合物」とは、例えば、ェチドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、インカドロネート、パミドロネート等の公知の化合物を挙げることができる。ビスフォスフォネート化合物は骨芽細胞に選択的に取り込まれるため、この公知の性質を利用したビスフォスフォネート化合物との結合体が報告されている（Calcif. Tissue Int. , 59, 168—173 (1996)、 Bioorg. Med. Chem. Lett. , 4， 1375-1380 (1995) ) 。そのため、 ERasタンパク質にビスフォスフォネート化合物を化学的に結合させた化学的結合体は骨芽細胞に将来分化していく間質系幹細胞特異的に取り込まれる。

「グルコース一 6—リン酸」は公知の物質であり、 ERasタンパク質とグルコース一 6—リン酸を化学的に結合させた化学的結合体は肝細胞および膝細胞に将来分化していく前駆細胞特異的に取り込まれる。

「P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物」とは、例えば B C R Pインヒビターを挙げることができる。具体的には、例えば、 B C R Pインヒビターである GF120918などを挙げることができる。 P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物と Nanogタンパク質と化学的に結合させることにより、化学的結合体は SP細胞と呼ばれる各種体性幹細胞特異的に取り込まれる。

「アルギニンを有する分岐型ペプチド」とは、例えば、文献 Biochemistry, 41, 7925-7930, (2002)に記載されているような細胞膜透過能をもつ 8個程度のアルギ- ンを有する分岐型ペプチドのことであり、具体的には、該文献の（R₂ ) ₄ペプチドや (RG₃ R) ₄ぺプチドなどが挙げられる。

ERasタンパク質は前記のように作製することができる。精製された ERasタンパク質と上記物質の化学的結合体は公知の方法に従って化学的に結合させて作製することができる。例えば、アミノ基を持つリンカ一をつけることで酸アミド結合など公知の方法に従って化学的に結合させることによって作製することができる。

本発明の「細胞増殖促進剤」とは、上記の本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のうち少なくとも 1つを含有する剤のことであり、細胞に取り込まれることによって該細胞の増殖を促進する。

ここで細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ゥシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織，臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ATCC社など）、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞ゃヒト体性幹細胞である。

また、マウス E S細胞に Nanogタンパク質を強制発現させると LIFなしでも万能性を維持したまま継代することができるため（Cell, 113, 631-642 (2003) ) 、本発明の細胞増殖促進剤は本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、 Nanog (ECAT4) タンパク質も含有されていてもよい。

本発明の「Nanogタンパク質」とは、 Nanogタンパク質のみに限定されず、本発明の融合タンパク質や化学的結合体と同様に、細胞内に取り込まれやすくした態様のものも包含される。本発明の Nanogタンパク質は、そのアミノ酸配列および塩基配列が公知であるため（W0 02/097090 A1) 、前記の ERasタンパク質、融合タンパク質、あるいは化学的結合体と同様の方法にて作製することができる。

本発明の細胞増殖促進剤を作用させるには、当該剤を直接体内に導入する in vivo法、ヒトからある種の細胞を採取し、体外で該細胞に添加してその細胞を体内に戻す ex vivo法、および培養細胞に添加する in vitro法がある。

投与方法としては、 ex vivo法または in vitro法であれば、細胞を培養している培養液中に添加、あるいは細胞に直接添加すればよい。添加量は、細胞の種類、細胞数等により適宜調整することができるが、細胞毒性が認められず細胞増殖促進活性が認められればよい。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の添加量は通常培地に 0. 0001 μ Μ〜1000 μ M、好ましくは 0. 0001 /i M〜10 / M、より好ましくは 0. 0001 μ Μ〜1 μ Μであり、これを 1〜数日に 1回添加するのが好ましい。

また、 in vivo法の投与方法としては、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、静脈内投与などが挙げられる。製剤中の本発明の融合タンパク質または結合体の投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重などにより適宜調整することができるが、通常 0. 0001m g〜1000m g、好ましくは 0. 001m g〜100m g、より好ましくは 0. 01 m g〜10m gであり、これを 1〜数日に 1回投与するのが好ましい。

細胞増殖促進剤の有効成分である本発明の融合タンパク質あるいは結合体は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体 (賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）、慣用の添加剤などと混合して試薬あるいは医薬組成物として調製することができ、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または培地等を含むものであってもよい。当該医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などに調整することができる本発明の「細胞増殖促進方法」とは、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞に接触させることにより、細胞増殖を促進する方法である。具体的には、例えば、本発明の細胞増殖促進剤を細胞培養培地中に添加して細胞に接触させ、細胞に取り込ませることによつて細胞増殖を促進する方法のことである本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体のいずれかを細胞と接触させた後に、細胞のピノサイト一シス（飲作用）により取り込まれ、細胞の増殖が促進される方法であってもよい。細胞のピノサイト一シスを利用した取り込み（導入）は、例えば、市販のキットである Influx (登録商標） Pinocytic Cell-Loading Reagent (Molecular Probe社)を用レヽることによって：^施することができる。

本発明の細胞増殖促進方法は、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体だけでなく、さらに前記 Nanogタンパク質を接触させる工程を加えることもできる。細胞は、特に限定されないが、哺乳動物細胞を挙げることができる。哺乳動物細胞とは、ヒト、サル、ゥシ、ラットやマウス等の哺乳動物の組織'臓器細胞またはこれら由来の細胞であって、個体の細胞、個体から取り出した初代細胞、または培養細胞のいずれでもよい。好ましくは、市販の培養細胞（ATCC社など）、胚性幹細胞ゃ体性幹細胞などの幹細胞を挙げることができ、より好ましくはヒト胚性幹細胞ゃヒト体 ¾Ξ幹細胞である。

前記の細胞増殖促進剤あるいは細胞増殖促進方法により、本発明の融合タンパク質あるいは化学的結合体を含有する細胞を作製することができる。実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

実施例 1

( 1 ) TAT- ERas発現ベクターの構築

オリゴ DNAの TAT- S (配列番号 11) と TAT- AS (配列番号 12) を 94度で 1分間変性の後、徐々に室温に戻し 2本鎖 DNAを作製した。これを pCDNA3. 1の Hindlll/BamHI部位にライゲーシヨンした（pCDNA3. 1-TAT) 。この pCDNA3. 1-TATの BaraHI/EcoRV部位に Gateway rfB Casetteを揷入して pCDNA3. l-TAT- GWを作製した。 pCDNA3. 1- TAT - GWと pEnter- mERasで LR組み換え反応（Invitrogen社）を行い、 pCDNA3. 1- TAT- ERas (図 1 ) を作製した。 TAT_ERasの DNA配列は配列番号 9に、アミノ酸配列は配列番号 10で示されている。

( 2 ) TAT- ERasタンパク質の合成と精製

融合タンパク質の合成と精製は、 PureGeneシステムを用いて in vitroにおいて行つた。

( 3 ) TAT-ERasタンパク質による細胞増殖促進

マウス 12. 5日胚よりマウス胎児線維芽細胞（MEF) を単離した。 MEFは 10%牛胎児血清を含む DMEM中で培養した。ここに TAT_ERasタンパク質を加えると増殖が有意に促進された（図 2 ) 。一方、 ERasの C末端の CMXモチーフを欠失し膜局在できなくした TAT- ERas- ACを加えても細胞増殖促進は認められなかった。

実施例 2

( 1 ) TAT- ERas発現ベクターの構築

オリゴ DNAの TAT- S (配列番号 11) と TAT-AS (配列番号 12) を 94度で 1分間変性の後、徐々に室温に戻し 2本鎖 DNAを作製する。これを pCDNA3. 1の Hindlll/BaraHI部位にライゲーシヨンする（pCDNA3. 1- TAT) 。この pCDNA3. 1- TATの BaraHI/EcoRV部位に Gateway rfB Casetteを揷入して pCDNA3. l-TAT- GWを作製する。 pCDNA³. 1-TAT - GWと pEnter- mERasで LR組み換え反応（Invitrogen社）を行い、実施例 1と同様に、 pCDNA3. l-TAT- ERasを作製する。 TAT_ERasの ERasは、マウス ERasではなくヒト ERas を用いるため、作製される TAT-ERasのァミノ酸配列は配列番号 14に示されている。 ( 2 ) TAT - ERasタンパク質の合成と精製

融合タンパク質の合成と精製は、実施例 1と同様に、 PureGeneシステムを用いて in vitroこおレヽて行う。

( 3 ) TAT- ERasタンパク質による細胞増殖促進

ヒト胚性幹細胞（ES細胞）およびヒト体性幹細胞を常法により培養する。細胞に、実施例 1または実施例 2で作製した TAT - ERasタンパク質を加えることにより、いずれの細胞についても細胞増殖が有意に促進されることが観察される。産業上の利用可能性

本発明により、細胞、特に胚性幹細胞や体性幹細胞の増殖を促進することができる融合タンパク質、または化学的結合体を提供することができる。本発明の細胞増殖促進剤は、多能性を維持させたまま増殖させることが困難な胚性幹細胞や体性幹細胞にも用いることができる。また本発明の細胞増殖促進剤は、多数の細胞を一度に簡便に処理することができるだけでなく、可逆的に調整をすることができるため、遺伝子導入法に比べてより臨床応用が可能である。配列表フリーテキスト

配列番号： 11に記載の塩基配列は TAT- Sである。

配列番号： 12に記載の塩基配列は TAT- ASである。

配列番号： 13に記載のァミノ酸配列は HIV TATぺプチドである。

配列番号： 15に記載のァミノ酸配列は FGFフラグメントである。

配列番号： 16に記載のアミノ酸配列は置換後の HIV TATぺプチドである。

配列番号： 17に記载のァミノ酸配列は HIV TATぺプチドである。

配列番号： 18に記載のァミノ酸配列は HIV Rev- (34- 50)ぺプチドである。

配列番号： 19に記載のァミノ酸配列は FHV Coat- (35-49)ぺプチドである。

配列番号： 20に記載のアミノ酸配列は? MV Gag- (7- 25)ぺプチドである。

配列番号： 21に記載のアミノ酸配列は HTLV- Π Rex- (4-16)ぺプチドである 2 配列番号： 22に記載のアミノ酸配列は CCMV Gag- (7 - 25)ぺプチドである。配列番号： 23に記載のァミノ酸配列は P22 N -（14-30)ぺプチドである。

配列番号： 24に記載のアミノ酸配列は λ Ν- (1-22)ぺプチドである。

配列番号： 25に記載のアミノ酸配列は 21N- (12 - 29)ぺプチドである。

配列番号： 26に記載のァミノ酸配列は酵母 PRP6- (129- 144)ぺプチドである。

Claims

請求の範囲

1 . タンパク質導入ドメインおよび ERasタンパク質を含んでいることを特徴とする融合タンパク質。

2 . ERasタンパク質がヒト、サル、ゥシまたはマウス由来のものである、請求項 1記載の融合タンパク質。

3 . タンパク質導入ドメインが、 HIV TAT、アンテナぺディア 'ホメォドメイン（Antonnapedia homeodomain) 、 HSV VP22またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、請求項 1または 2記載の融合タンパク質。

4 . タンパク質導入ドメインが、 HIV Revのフラグメント、 FHV Coatのフラグメント、 BMV Gagのフラグメント、 HTLV - Π Rexのフラグメント、またはォリゴアルギニンからなるぺプチドである、請求項 1または 2記載の融合タンパク質。

5 . タンパク質導入ドメインが、線維芽細胞増殖因子（FGF) 、肝細胞増殖因子（HGF) またはこれらのうちいずれかのフラグメントである、請求項 1または 2 記載の融合タンパク質。

6 . 請求項 1〜 5いずれか記載の融合タンパク質をコードする塩基配列を含有する核酸。

7 . 請求項 6記載の核酸を含有する発現ベクター。

8 . 請求項 7記載の発現ベクターを含有する細胞。

9 . 請求項 8記載の細胞を、融合タンパク質の発現可能な条件下で培養することを特徴とする、請求項 1〜 5 、ずれか記載の融合タンパク質の製造方法。

1 0 . ビスフォスフォネート化合物、グルコース一 6—リン酸、 P糖タンパク質に結合活性を持つ化合物またはアルギェンを有する分岐型ぺプチドと、 ERasタンパク質との化学的結合体。

1 1 . 請求項 1〜 5いずれか記載の融合タンパク質または請求項 1 0記載の化学的結合体を有効成分として含有する細胞増殖促進剤。

1 2 . Nanogタンパク質をさらに含有する、請求項 1 1記載の細胞増殖促進剤

1 3 . 細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、請求項 1 1または 1 2記載の細胞増殖促進剤。

1 4 . 請求項 1〜5いずれ力記載の融合タンパク質または請求項 1 0記載の化学的結合体と細胞とを接触させる工程を含む、細胞増殖促進方法。

1 5 . Nanogタンパク質をさらに接触させる、請求項 1 4記載の細胞増殖促進方法。

1 6 . 細胞が胚性幹細胞または体性幹細胞である、請求項 1 4または 1 5記載の細胞増殖促進方法。

1 7 . 請求項 1〜 5いずれ力、記載の融合タンパク質または請求項 1 0記載の化学的結合体を含有する細胞。