WO2004105503A1 - 飲食品の呈味および／または風味の改善方法 - Google Patents

飲食品の呈味および／または風味の改善方法 Download PDF

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WO2004105503A1
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aminopeptidase
eap
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nucleic acid
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Tomohiro Sakamoto
Nami Nakamura
Tomohiro Kodera
Noriki Nio
Noriaki Yamada
Hidehiko Wakabayashi
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the taste and / or flavor of foods and drinks such as seasonings and seasoning materials.
  • soy sauce is produced in two stages: koji making and fermentation. Mainly, in the koji-making stage, the raw materials are decomposed by enzymes produced by koji molds (Aspergillus filamentous fungi). At that time, in order to improve the taste in soy sauce, it is important to increase the amount of free amino acids in moromi, particularly the amount of glutamate released.
  • amino acids are produced from a raw protein in two steps. The first is the release of peptides from proteins by proteases, and the second is the production of amino acids by peptide hydrolysis catalyzed by peptides.
  • soybean cotyledons were able to efficiently remove peptide peptides (acid-amino acid-containing peptides) from soybean cotyledons. (Aminopeptidase and oral aminopeptidase) which were degraded into ribonucleic acid and succeeded in efficiently hydrolyzing soybean protein (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-294583).
  • Soybean aminopeptidase is an enzyme that has been revealed from its enzymatic properties to be a novel aminopeptidase that has not been reported before, and its existence is not known except for germinated soybean. Had not been. Soybean aminopeptidase has the activity of efficiently releasing an N-terminal acidic amino acid from a peptide having an acidic amino acid such as glutamic acid at the N-terminal. It is known that natural seasonings containing protein hydrolysates such as soy sauce contain a large amount of dipeptide consisting of two residues of glumic acid as a hardly decomposable peptide. Therefore, by the action of soybean aminopeptidase, such a hardly decomposable dipeptide is decomposed, and a seasoning solution having a high glutamic acid release rate and excellent taste can be produced.
  • Ninomiya et al. Succeeded in mass-producing soybean aminopeptidase using genetic recombination technology (JP-A-2000-325090), but used soybean aminopeptidase GX produced by this method to produce seasoning liquid. Utilization is difficult because soybean-derived beptidase is not recognized as a food enzyme. In addition, recombinant soybean has poor temperature stability, is not suitable for performing the reaction at 50 ° C or higher, and has a practical problem.
  • Aspergillus oryzae oryzae which contains a lot of microorganisms for food use, is derived from Aspergillus oryzae or Aspergillus soja (JP-A-11-346777, DE95- 1952648, WO 98/51163, WO 96/28542, WO 96/15504, WO 98/51803, WO 98/14599).
  • JP-A-11-346777, DE95- 1952648, WO 98/51163, WO 96/28542, WO 96/15504, WO 98/51803, WO 98/14599 there are many reports on leucine aminopeptidase, but there is no report on a peptidase having an enzymatic activity to efficiently release glutamate, which is excellent in taste, such as soybean aminopeptidase GX.
  • a method of enhancing sweetness there is known a method of using a saccharide-decomposing enzyme or a microorganism having the enzyme, or using another enzyme in combination with the enzyme to improve sweetness and flavor.
  • a saccharide-decomposing enzyme or a microorganism having the enzyme or using another enzyme in combination with the enzyme to improve sweetness and flavor.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-299094 after a sugar is reacted with an enzyme or a microorganism, alcohol fermentation is performed to modify the flavor.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 09-299094 has succeeded in improving sweetness by the action of glycolytic enzymes and transglycosylation / condensation reactions.
  • Phospholipase is used in the method for improving the flavor of egg yolk
  • JP 2002-325559 specifies the effect of phospholipase A1.
  • a bitter amino acid is converted into an alpha-mill by using alpha-millyl transpeptidase to successfully reduce bitterness, increase sourness, and improve taste.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-32769 the taste and solubility of isoflavones are improved by the action of glycosyltransferase.
  • a method for producing a taste-improving food material using glutamate decarboxylase JP-A-2000-166502
  • a method for synthesizing theanine with a glucanase minase enzyme to provide a flavor-improving composition JP-A-09-313129
  • Food flavor 3 method using primebec fermentation Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-140675
  • method for modifying oil and fat flavor using lipase enzyme preparation Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a food or drink having a high content of glutamic acid and aspartic acid, and having improved taste and / or flavor.
  • the present invention is as follows.
  • (a) has an activity of catalyzing a reaction that specifically releases glutamic acid and aspartic acid from the N-terminus of a peptide and / or protein;
  • the activity of decomposing Glu-Glu dipeptide is 5 U / mg or more, preferably 10 U / mg or more.
  • the aminopeptidase is encoded by a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 (1)
  • the method according to (1) which is an aminopeptidase encoded by the obtained nucleic acid molecule.
  • nucleus having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 An aminopeptidase encoded by an acid molecule or a nucleic acid molecule capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6, (1) The method described in 3.
  • the aminopeptidase is encoded by a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 or can hybridize under stringent conditions to a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9
  • the method according to (1) which is an aminopeptidase encoded by a nucleic acid molecule.
  • the aminopeptidase is encoded by a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 or hybridized with a nucleic acid molecule having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12 under stringent conditions;
  • the method according to (1) which is an aminopeptidase encoded by a nucleic acid molecule capable of soybean.
  • a method for producing a food or drink having an improved taste and / or Z or flavor which comprises reacting aminopeptidase encoded by aminopeptidase with a proteinaceous material, if necessary, in the presence of a protease.
  • FIG. 1 is a graph showing the substrate specificity of EAP.
  • Figure 1A Alpergillus-olize EAP
  • Figure 1B Aspergillus' niger EAP
  • Figure 1C Coryne EAP
  • Figure 1D Yeast EAPo
  • FIG. 2 is a graph showing the temperature response characteristics of EAP. The horizontal axis is temperature (° C), and the vertical axis is the relative value of aminopeptidase activity when the activity value at 37 ° C is 100.
  • FIG. 3 is a graph showing the temperature stability of EAP. The horizontal axis shows the storage time, and the vertical axis shows the relative value of aminopeptidase activity when the activity value when the storage time is 0 minutes is 100.
  • Fig. 3A Alpergillus oryzae EAP
  • Fig. 3B Aspergillus nigerium EAP
  • Fig. 3C Alpergillus niger EAP
  • Fig. 3A Alpergillus oryzae EAP
  • Fig. 3B Aspergillus nigerium EAP
  • Fig. 3C Alpergillus niger EAP
  • FIG. 4 is a graph showing the pH response characteristics of EAP. .
  • the horizontal axis is pH, and the vertical axis is the relative value of aminopeptidase activity when the activity value at pH 7.5 is 100.
  • Figure 4A Alpergillus oryzae EAP
  • Figure 4B Aspergillus nidulans EAP
  • Figure 4C Alpergillus nigaichi EAP
  • Figure 4D Coryne EAP
  • Figure 4E Yeast EAP.
  • FIG. 5 is a graph showing the pH stability of EAP.
  • the horizontal axis is the pH of the stored buffer, and the vertical axis is the relative value of aminopeptidase activity when the activity value before storage is 100.
  • Figure 5A Alpergillus oryzae EAP
  • Figure 5B Aspergillus nidulans EAP
  • Figure 5C Alpergillus niger EAP
  • Figure 5D Coryne EAP
  • Figure 5E Yeast EAP.
  • FIG. 6 is a graph showing the response characteristics of EAP to peptides of various lengths.
  • A, B, C, and D shown on the horizontal axis represent the types of substrates, respectively: A: Glu-Glu, B: Glu-His-Phe-Arg- Trp-Gly ⁇ C: Glu-Gly-Va Tyr -Va means His-Pro-Val D: Asp-Glu.
  • Figure 6A Alpergillus oryzae EAP
  • Figure 6B Alpergillus niger EAP
  • Figure 6C Coryne EAP
  • Figure 6D Yeast EAP.
  • FIG. 7 is a graph showing the taste enhancing effect of EAP on the bonito extract seasoning.
  • Figure 8 shows that the isolated soybean protein was prepared from a commercially available protease
  • protease M 5 is a graph showing the effect of adding EAP to a hydrolyzed protein hydrolyzed by a peptidase preparation, mamizam. The vertical axis indicates the amount of free Glu contained in the hydrolysis solution.
  • Figure 8A Alpergillus oryzae EAP
  • Figure 8B Aspergillus nidulans EAP. 1: ⁇ MamiZim 1% + Protease M 1%; 2: ⁇ MamiZim 2%; 3: Protease M 2%.
  • Figure 9 shows the effect of EAP on the separation of soybean protein from alkalase, a commercial protease preparation, and hydrolyzate from the soybean protein, flavorzyme, a peptidase preparation.
  • FIG. The vertical axis indicates the amount of free Glu contained in the hydrolysis solution.
  • Figure 9A Alpergillus oryzae EAP
  • Figure 9B Aspergillus nidulans EAP. 1: Alcalase 1% + flavor 2%
  • 2 Alcalase 1% + flavor 1%
  • 3 Alcalase 1%.
  • the present invention relates to a method for producing a food or drink having improved taste and Z or flavor by allowing a microorganism-derived aminopeptidase having the above-mentioned enzymatic properties to act on a protein material in the presence of a protease, if necessary. is there.
  • the aminopeptidase used in the present invention is a glutamic acid and Z or aspartic acid-specific aminopeptidase derived from a microorganism.
  • aminopeptidase used in the present invention is considered to be a counterpart of the aforementioned soybean aminopeptidase GX in Aspergillus oryzae
  • the microorganism-derived gluminic acid and / or // used in the present invention are used in the present specification.
  • the aspartate-specific aminopeptidase protein may be referred to as “EAP” or “aminopeptidase EAP”, and the gene encoding EAP may be referred to as “EAP gene”.
  • glutamic acid and / or aspartic acid-specific aminopeptidase EAP derived from the microorganism used in the present invention is simply referred to as “aminopeptidase”.
  • glutamic acid and / or aspartic acid-specific aminopeptidase derived from Aspergillus' oryzae and glucuric acid and / or aspartic acid-specific aminopeptidase derived from Aspergillus nidulans used in the present invention are: However, they may be referred to as Aspergillus 'oryzae EAP and Aspergillus' didurans EAP, respectively.
  • the above-mentioned aminopeptidase derived from soybean Japanese Patent 2000-325090
  • aminopeptidase refers to a protein having an activity of catalyzing a reaction of releasing an acidic amino acid such as glutamic acid-aspartic acid from the N-terminal of a peptide.
  • the nucleic acid molecule encoding the aminopeptidase EAP used in the present invention is obtained as follows from chromosomal DNA or cDNA of Aspergillus such as Aspergillus 'oryzae and Aspergillus' nidulans, for example, Aspergillus nidulans A26 strain. can do.
  • PCR polymerase
  • JP-A-2000-325090 germinated soybean
  • EST nucleotide sequence of an EST fragment with high homology in Aspergillus nidulans EST.
  • 'Chain' reaction Prepare a primer and code for Aspergillus nidulans cDNA or Aspergillus nidulans chromosome.
  • Aminopeptidase EAP that can be used in the method of the present invention by a PCR method using DNA as a type II. A clone containing a nucleic acid molecule can be obtained.
  • a PCI having an oligonucleotide having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 or 18 as a primer and a primer shown in SEQ ID NO: 19 or 20 It can be obtained by 5'-RACE using a oligonucleotide as a primer.
  • One of the primers for obtaining a sequence completely containing the open reading frame (0RF) is an oligonucleotide having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 22 and 23.
  • the nucleotide sequence of the genomic DNA containing the gene encoding aminopeptidase derived from Aspergillus nidulans A26 obtained as described above is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of the cDNA is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3. Comparing the nucleotide sequences of the genomic DNA and the cDNA, no intron was found in the genomic DNA.
  • the nucleic acid molecule encoding aminopeptidase used in the present invention can also be obtained from a microorganism belonging to another species of the genus Aspergillus, such as chromosomal DNA or cDNA of Aspergillus oryzae. Specifically, it can be obtained by PCR from Aspergillus oryzae, for example, cDNA of Aspergillus oryzae 0 (ATCC42149). Based on the nucleotide sequence of the aminopeptidase derived from Aspergillus nidulans, an oligonucleotide primer for PCR was synthesized, and cDNA prepared from Aspergillus oryzae RIB40 cells, for example, was prepared.
  • PCR primers for this include the dT primer and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 25 and 26 for 5'-RACE, and the sequence shown in FIG. Oligonucleotides having the sequences shown in 27 and 28.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding Aspergillus oryzae MB40 EAP obtained as described above is shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence of Aspergillus nidulans EAP shown in SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence of aminopeptidase of Aspergillus oryzae shown in SEQ ID NO: 7 have about 83% homology, and about 85 amino acid residues have about 85 amino acid residues. Is different.
  • the homology between the Aspergillus oryzae EAP gene and the Aspergillus nidulans EAP gene is as a result of analysis with the analysis software GENETYX-MAC Ver.10, it was about 76% in the code region and more than 80% in the amino acid sequence level.
  • intron was contained in five places in the genomic DNA of Aspergillus oryzae.
  • the genomic nucleotide sequence encoding Aspergillus oryzae EAP is shown in SEQ ID NO: 4.
  • nucleic acid molecules encoding each aminopeptidase EAP derived from Aspergillus niger, Corynebacterium, and yeast can be obtained.
  • the genome sequences of the aminopeptidase EAP genes derived from Aspergillus nigatai, yeast, and Corynebacterium are described in SEQ ID NOs: 8, 11, and 14, respectively, and the nucleotide sequence of the coding region is shown in SEQ ID NO: 9, respectively. , 12 and 15.
  • the amino acid sequence of each EAP is shown in SEQ ID NOS: 10, 13, and 1 ⁇ , respectively.
  • 0RF The entire sequence of 0RF contained in the cDNA sequence shown in SEQ ID NO: 6, that is, the nucleotide sequence encoding aminopeptidase used in the present invention, is described on the EST database of Aspergillus oryzae. Further, in the aforementioned database, the putative function of the protein encoded by this 0RF is described as “aspartyl aminopeptidase j. Revealed that the enzyme actually obtained had a function significantly different from that of aspartylaminopeptidase, for example, aspartylaminopeptidase liberated glutamic acid compared to aspartic acid.
  • the activity of the aminopeptidase used in the present invention to release glutamic acid is different from the activity to release aspartic acid.
  • One of the features of the present invention is that it is of the same degree, and aspartylaminopeptidase degrades short substrates such as dipeptides. Although the activity is a little (S. Wilk, E. Wilk, RP Magnusson, Arch. Biochem. Biophys.
  • the aminopeptidase used in the present invention efficiently decomposes short peptides containing a hardly decomposable dipeptide, which are often found in the soy sauce brewing process and the like.
  • the present invention is a method that utilizes functions and properties that are clearly different from those of the hypothetical protein estimated on the EST database of Aspergillus oryzae.
  • the aminopeptidase used in the present invention may be a substitution, deletion, or insertion of one or more amino acids at one or more positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, as long as the activity of the above-mentioned amisopeptidase is not impaired. , Or may include additions.
  • the term “plurality” varies depending on the positions and types of amino acid residues in the three-dimensional structure of the aminopeptidase protein, but is usually 2 to 85 ′, preferably 2 to 50, and most preferably 2 to 10.
  • amino acid substitutions are observed between aminopeptidase derived from Aspergillus oryzae and aminopeptidase derived from Aspergillus nidulans, as shown in the examples, it is confirmed that both maintain the same activity. It's clear. Thus, it is expected that amino acid substitutions within the above ranges will maintain the activity and properties of the aminopeptidase to a sufficient extent for use in the methods of the present invention.
  • the gene encoding aminopeptidase EAP used in the present invention includes DNA having a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 1 to 1494 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6. Further, the parallel may include a change due to degeneracy of the genetic code. Furthermore, the nucleic acid molecule encoding a protein having properties equivalent to EAP is modified, for example, by site-directed mutagenesis, so that the nucleotide sequence of the EAP gene is modified so that amino acids at specific sites are substituted, deleted, inserted, or added. Can also be obtained. The modified nucleic acid molecule as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Mutation treatment includes aminopeptidase A method for in vitro treatment of MA encoding hydroxylase with a hydroxylamine or the like; and irradiating a bacterium belonging to the genus Escherichia carrying DNA encoding aminopeptidase with ultraviolet light or N-methyl-1N, 12-trough N-nitrosogua.
  • Examples of the method include treatment with a mutagen that is commonly used for artificial mutation, such as dizine (NTG) or nitrite.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of bases as described above also includes naturally occurring mutations such as differences among Aspergillus species or strains.
  • a nucleic acid molecule having the above mutation in an appropriate cell and examining the EAP activity of the expression product, a nucleic acid molecule encoding a protein substantially identical to EAP can be obtained.
  • nucleic acid molecule encoding EAP having a mutation or a cell carrying the same for example, a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence consisting of base number 11494 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing and a stringent
  • stringent conditions refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed.
  • nucleic acid molecules with high homology The conditions are such that nucleic acid molecules having homology are hybridized with each other, and nucleic acid molecules having lower homology are not hybridized with each other, or washing conditions for ordinary Southern hybridization are 60.
  • Genes that hybridize under these conditions may include those with stop codons generated in the middle or those that have lost their activity due to mutations in the active center. Easily removed by measuring EAP activity by the method described below Can be
  • the homology of the aminopeptidase EAPs derived from Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, and Aspergillus niger used in the present invention was analyzed using the analysis software GENETYX-MAC Ver.10. It is 80% or more at the amino acid sequence level even among aminopeptidases.
  • the nucleic acid molecule encoding the aminopeptidase used in the present invention can be used for producing the aminopeptidase used in the present invention.
  • the nucleic acid molecule encoding aminopeptidase (EAP) used in the present invention can be used to breed filamentous fungi such as Aspergillus or to produce EAP.
  • EAP activity possessed by a filamentous fungus can be increased by introducing MA encoding EAP into a filamentous fungus (eg, Aspergillus oryzae) cell, preferably in multiple copies.
  • EAP can be produced by expressing a nucleic acid molecule encoding EAP in a suitable host.
  • the vector for introducing the nucleic acid molecule into the filamentous fungus as described above is not particularly limited, and those usually used for breeding filamentous fungi and the like can be used.
  • vectors used for Aspergillus spores include pUNG (Lee, BR et al. 5 Appl. Microbiol. BiotechnoL, 44, 425-431 (1995)), pMARG (Tsuchiya, K. et al., Appl. Microbiol BiotechnoL, 40, 327-332 (1993)), pUSC (Gomi, K. et al., Agric. Biol. Chem. 51, 2549-2555). (1987)).
  • pUNG is Aspergillus oryzae niaD300 (Minetoki, T. et al., Curr. Genet. 30, 432-438 (1996)), a marker that complements niaD— (nitrate utilization deficiency), and pMARG is Aspergillus oryzae. M2-3 (Gomi, K. et al., Agric. Biol. Chem., 51 (9), 2549-2555 (1987)), a marker that complements argB-1 (arginine requirement), pUSC is Aspergillus oryzae. NS4 (Yamada, 0. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61 (8), 1367-1369 (1997)) sC-1 (ATP sulphurylase deficient ⁇ g) Have. .
  • EAP When a vector containing a promoter is used among such vectors, EAP is expressed by inserting a DNA molecule encoding EAP into the downstream of the promoter in frame. Can be done. For example, since pUNG and pMAG have the glucoamylase gene (glaA) promoter and the amylase gene (amyB evening / mine / night), EAP is downstream of the promoter. EAP can be expressed under the control of the promoter by introducing a coding DNA (for example, a region containing base numbers 1 to 1497 in SEQ ID NO: 6) together with the frame.
  • a coding DNA for example, a region containing base numbers 1 to 1497 in SEQ ID NO: 6
  • EAP is introduced into the host filamentous fungus by co-transformation of a plasmid such as PUC19 into which the above DNA is inserted and pUSC. Can be expressed.
  • the resulting host filamentous fungus or EAP can be used in the method of the present invention.
  • DHFR Yuroshora Klassa JP-A-62-272988 Taka-Amira-se, Asruki, Rus'orise,
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-115976 describes a novel motor sequence. Ruki, Rus'orise, JP-A-7-59571 New; 7 ° protein sequence is described. Ruki ,, Rus' Orise, Mouth ⁇ Tf Tatsunori Hatsuko: Child Mu. , &, Hi-Amirase ,, (AnyB) As Luki ,, Lus' Orise,
  • Aspergillus oryzae can be transformed as follows.
  • DPY medium glucose 2%, peptone 1%, yeast extract 0.5%, pH 5.0
  • the culture solution is filtered with Myracloth (manufactured by CALBIO CHEM) or sterilized gauze, and the cells are collected, washed with sterile water, and drained well.
  • the cells are placed in a test tube, and an enzyme solution (1.0% Yatalase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) or 0.5% Novozym (NovoZyme, manufactured by Novo Nordisk) and 0.5% cellulase (for example Cellulase Onozuka ⁇ manufactured Yakult Co.) ⁇ 0.6M (3 ⁇ 4) 2 S0 4, 50 ⁇ malic acid, ⁇ 5 ⁇ 5) is added and shaken for approximately 3 hours gently at 30 ° C. Observe the degree of protoplast formation with a microscope, If good, store on ice.
  • an enzyme solution (1.0% Yatalase, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • Novozym Novozym
  • cellulase for example Cellulase Onozuka ⁇ manufactured Yakult Co.
  • the enzyme reaction solution was filtered with Miracloth to remove bacterial cell residues, and an equal amount of buffer A (1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 , 35 mM NaCl 2 , lOmM Tris-HC1, pH7.5) and place on ice. After centrifuging at 0 ° C and 1500-2500 rpm for 5-0 min, gently stop, wash the pellet with buffer A, and resuspend in an appropriate amount of buffer A. To a 100-200 ⁇ 1 protoplast suspension, add 20 ⁇ 1 or less DNA solution (5- (10 g), and place on ice for 20-30 minutes.
  • buffer A 1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 , 35 mM NaCl 2 , lOmM Tris-HC1, pH7.5
  • Buffer B (60% polyethylene glycol 6000, 50 mM CaCl 2 lOmM Tris-HCl, pH 7.5) was added at 250/1 and mixed gently, and again 250 1 of Buffer: B was added and mixed gently. Thereafter, add 850 l of Buffer B, mix gently, and allow to stand at room temperature for 20 minutes. Then, add 10 ml of Buffer A, invert the tube, and centrifuge at 0 ° C; l, 500-2,500 rpm for 5-10 minutes, and suspend the pellet in 500-1 buffer A. I do.
  • the EAP gene is expressed and EAP is produced.
  • EAP can be produced by culturing at about 30 ° C for about 3 days.
  • the culture can be diluted with distilled water or the like and treated with Stomazka or the like to obtain a crude enzyme extract containing EAP. Wear.
  • the EAP can be further purified from the obtained crude extract by using gel filtration, various types of chromatography and the like.
  • the obtained EAP can be further purified by salting out, isoelectric focusing, gel filtration, ion chromatography, reverse phase chromatography, etc., and used for releasing acidic amino acids from the peptide.
  • the free amino acid content can be increased by directly reacting the culture of the transformed microorganism with improved EAP activity or, if necessary, with a protein raw material together with a proteolytic enzyme (protease) to act on the protein or its mixture. It is also possible to obtain foods and drinks such as seasonings, protein hydrolysates, etc., which have high taste and improved taste and / or flavor.
  • the protein ingredients to be acted on include, for example, soybeans, wheat, wheat gluten, cornmeal, milk casein, potato, katsuobushi, fishmeal, and all proteins used in foodstuffs. It may be various proteins that have been subjected to processing such as shading or solubilization, or proteins separated from these various raw materials.
  • a commercially available enzyme preparation may be used, and it may contain another enzyme such as a cell wall degrading enzyme.
  • Proteolytic enzymes produced by microorganisms belonging to the genus Aspergillus and Bacillus can be used.
  • commercially available enzyme preparations such as Mamizam, Protease M, Flavor Zam, and Alcalase can be used.
  • Foods containing proteins and peptides that can improve flavor and taste by the action of glutamate and / or aspartate-specific peptidases include, for example, brewed and fermented foods such as soy sauce and miso, and cheese.
  • Dairy products such as yogurt, beverages such as vegetable and fruit juices, soy foods such as soy milk and tofu, wheat foods such as bread and ⁇ , kneaded foods such as kamaboko and bamboo rings, and livestock meat foods such as sausages and hams.
  • dairy products such as yogurt, beverages such as vegetable and fruit juices, soy foods such as soy milk and tofu, wheat foods such as bread and ⁇ , kneaded foods such as kamaboko and bamboo rings, and livestock meat foods such as sausages and hams.
  • a wide range of food products a wide range of food products.
  • Practical conditions under which a culture of a transformed microorganism or a crude enzyme is allowed to act on a protein include, for example, a protein material having a concentration of 0.2 to 50%, preferably 1 to 20%.
  • the purified enzyme or, if necessary, a proteolytic enzyme is further added and mixed, and the mixture is reacted at 5 to 55 ° C, preferably 30 to 55 ° C, for 1 minute to 10 days, preferably for 1 hour to 10 days.
  • Aspergillus nidulans EAP was cloned from Aspergillus nidulans cDNA as follows.
  • Aspergillus nidulans A26 strain (available from the Fungal Genetics Stock Center, Department of Microbiology, University of Kansas Medical Center) in 50 ml of YG medium (0.5% yeast extract, 2.5% glucose, 0.1% trace elements * 0.1%, pH 6.5) 30 ° for 48 hours by shaking culture (trace elements *:. FeS0 4 '73 ⁇ 40 0.1 %, ZnS0 4 -7H 2 0 0.88%, CuS0 4 - 53 ⁇ 40 0.04%, ⁇ 4 43 ⁇ 40 0.015%, ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 4 0 7 ⁇ 103 ⁇ 40 0.01 %, ( ⁇ 3 ⁇ 4) 6 ⁇ 0 24 ⁇ 43 ⁇ 40 0.005%).
  • RNA was prepared using easy Plant Mini Kit (QIAGE), and mRNA was prepared using oligotex-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (TaKaRa).
  • cDNA was synthesized using TaKafia RNA PCR IQt (Xia) Ver.2.1 (TaKaRa).
  • cloning of the full-length cDNA of EAP was performed by PCR using an oligonucleotide having the following sequence designed from Aspergillus nidulans ESTpOflOal.fl sequence as a primer and RACE method. went.
  • the 5, RACE and 3 'RACE methods were used to obtain all 0 Aspergillus nidulans RF sequences.
  • the PCR reaction conditions were as follows: heat denaturation at 94 ° C for 9 minutes; The reaction was performed for 30 cycles at 30 seconds at 30 ° C. and 30 seconds at 72 ° C., and further for 5 minutes at 72 ° C.
  • the 5 'RACE method using the primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 revealed all 0' RF sequences on the 5 'side, and the SEQ ID NO: 21 revealed all 0 RF sequences on the 3' RACE side It became.
  • nucleotide of these DNA fragments The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2, and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the Aspergillus nidulans EAP cDNA fragment was inserted into the HincII site of PUC19.
  • An expression plasmid pUCtrpnidGX in which a trp promoter was connected upstream of the inserted sequence was also constructed.
  • Escherichia coli E. coli JM109 strain transformed with the obtained plasmid was obtained.
  • Aspergillus oryzae RIB40 was cultured in 50 ml of a medium containing 1.5% isolated soybean at 30 ° C for 64 hours. The cells were collected by filtration, and 1 g was recovered. Immediately freeze the cells with liquid nitrogen, grind them in a mortar, prepare total RNA using the Plant Mini Kit (QIAGEN), and use the oligotex-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (TaKaEa). mRNA was prepared. From this mRNA, TaKaHa RNA PCR CDNA was synthesized using Kit (layer) Ver.2.1 (TaXaRa).
  • SEQ ID NO: 4 The genome sequence of Aspergillus oryzae containing this intron is shown in SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 6 The nucleotide sequence of full-length cMA encoding aminopeptidase derived from Aspergillus oryzae is shown in SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence of aminopeptidase derived from Aspergillus oryzae is shown in SEQ ID NO: 7.
  • Aspergillus nigaichi JCM2261 in 50 ml of medium containing 1.5% isolated soybean Cultured at 30 ° C for 64 hours. The cells were collected by filtration, and lg was recovered. The cells were immediately frozen in liquid nitrogen, crushed in a mortar, and prepared for total RNA using the Plant Mini Kit (QIAGEN), and then using oligotex-dT30 and Super> mRNA Purification Kit (TaKaRa). mRNA was prepared. From this mRNA, cMA was synthesized using TaKaRa RNA PGR Kit (AMV) Ver. 2.1 (TaKaRa).
  • SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 correspond to 100% homologous sequences between Aspergillus nidulans obtained in Example 1 and Aspergillus nidulans obtained in Example 2 between EAP sequences.
  • a primer was designed. Using both primers, a partial cDNA of aminopeptidase EAP from Aspergillus niger was obtained.
  • Saccharomyces YPH500 (IF010506) was cultured overnight at 30 ° C. using 50 ml of a medium consisting of YPD (1% ist extract, 2% peptide, 2% glucose) and adenine. Genomic DNA was extracted from the culture using Gen Toru-kun (for yeast) (TaKaEa).
  • Corynebacterium was cultured overnight at 30 ° C. in 50 ml of LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride salt). Genomic DNA was extracted from the culture using Gen Toru-kun (for yeast) (TaKaRa).
  • the bacterium transformed with pUCtrpGX was cultured in a refreshing medium (1% tryptone, 0.5% extract 'extract, 0.5% NaCl, 0.1% glucose) at 30 ° C for 8 hours with shaking. Then, the obtained culture solution 5 ml 350 ml casamino acid medium (N HP0 4 0.6% KH 2 P0 4 0.3%, NH 4 C1 0. 1% NaCl 0.05% casamino acids, 0.0002% thiamine, MgS0 4 ImM, CaCl 2. ImM, glucose 0.1%) at 37 ° C for 20 hours. However, the culture temperature was set to 34 ° C only for coryne. The obtained cells were disrupted according to a standard method to obtain a cell extract.
  • a refreshing medium 1% tryptone, 0.5% extract 'extract, 0.5% NaCl, 0.1% glucose
  • Ammonium sulfate was added to the cell extract to obtain a 40% -65% ammonium sulfate precipitate fraction. However, only the yeast obtained a 0 ° / -40% fraction.
  • the above fraction was suspended in a 50 mM phosphate buffer (PH7.5), separated on a gel filtration column (Amersham Biotech, sephadex200) previously equilibrated with the phosphate buffer, and crude EAP was purified. I got it. The obtained enzyme solution was concentrated by ultrafiltration. The crude purified EAP was further separated on an anion exchange column (Amersham Biotech) nonoQ to obtain purified EAP.
  • the obtained purified EAP exhibited a molecular weight of about 300 to 480 kD on a native polyacrylamide gel, and a molecular weight of about 40 to 60 kD on a denatured polyacrylamide gel.
  • Example 7 Characterization of aminopeptidase EAP
  • Aminopeptidase activity in the purified enzyme solution prepared as described above was measured as follows. That is, 0.02 ml of the purified enzyme solution was added to 0.16 ml of 5 mM Glu-Glu (50 mM HEPES buffer, pH 7.5), reacted at 37 ° C for 10 minutes, and 0.02 ml of 20% acetic acid was added to perform the reaction. Stopped. The amount of free Glu in the reaction solution was measured using a glutamic acid measurement kit (Yamasa Shoyu Co., Ltd.). The activity was defined as the enzyme activity that produces 1 mol of Glu per minute as 1 unit (U).
  • EAP activity can also be measured using Glu-pNA as a substrate. That is, add 0.02 ml of the enzyme solution to 0.75 ml of lmM Glu-pNA (50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5), react at 37 ° C for 10 minutes, and add 0.25 ml of 40% acetic acid. To stop the reaction. The absorbance at 405 nm of the reaction solution was measured, and the activity was measured. The activity was defined as one unit (U) of the enzyme activity that produces 1 mol of paraditroanilide per minute. Using X-pNA instead of Glu-pNA, the degradation activity of various X-pNA was measured. Figure 1 shows the relative activity values when the maximum activity value is 100. This enzyme was found to specifically and efficiently degrade N-terminal acidic amino acids, namely, glutamic acid and aspartic acid.
  • FIG. 2 shows the relative activity values when the activity value at 37 ° C. is set to 100. From FIG. 2, it can be seen that the relative activity is high in the range of 30 ° C. to 60 ° C., more preferably in the range of 37 ° C. to 50 ° C. (iii) Temperature stability
  • Glu-Glu As a substrate, EAP was stored at various temperatures for 10, 20, 30, 40, and 60 minutes, and then the EAP activity was measured by the activity measurement method.
  • Fig. 3 shows the relative activity value when the activity value at the time of storage of 0 minutes is 100.
  • Aspergillus oryzae EAP, Aspergillus nidulans EAP and Aspergillus niger-1 EAP showed a residual activity of 80% or more after storage at pH 7.5, 25 ° C to 40 ° C for 1 hour.
  • coryne EAP and yeast EAP are used at pH 7.5, 25 ° C to 50 ° C! After storage for 1 hour, it exhibited a residual activity of 80% or more, and had an activity of 40% or more of the activity at the time of non-heating when heated at pH 7.5 and 25 to 60 ° C for 30 minutes.
  • a GTA buffer at each pH was added to the reaction solution so as to have a final concentration of 50 mM instead of 50 HEPES buffer (PH7.5).
  • the EAP activity in PH7.5 was set to 100.
  • Figure 4 shows the activity at each pH. According to FIG. 4, the activity was at least 50% of the activity at the optimum pH in the pH range of 6.0 to 9.0.
  • FIG. 5 shows the relative activity values when the activity value before storage was set to 100.
  • Aspergillus oryzae EAP, Aspergillus nidulans EAP, Aspergillus niger EAP and yeast EAP showed a residual activity of 90% or more when stored at 0 ° C for 24 hours at pH 6.0 to 10.0.
  • Coryne EAP showed a residual activity of 90% or more when stored at 0 ° C for 24 hours in a pH range of 7.0 to 8.0.
  • aminopeptidase activity was measured using another substrate having Glu at the N-terminus and having a different number of amino acid residues. That is, 0.02 ml of enzyme purified solution was added to 0 and 16 ml of 5 mM each substrate (50 mM HEPES buffer, pH 7.5), reacted at 37 ° C for 10 minutes, and 0.02 ml of 20% acetic acid was added to perform the reaction. Stopped. The amount of free Glu in the reaction solution was measured using a glutamic acid measurement kit (Yamasa Shoyu Co., Ltd.).
  • the activity was defined as the enzyme activity that produces 1 mol of Glu per minute as 1 unit (U), and the specific activity ( ⁇ / mg), which is the activity value per weight, was calculated and shown in FIG.
  • the substrates used were (a) Glu-Glu (Bachem), (b) Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly (Bachem) (SEQ ID NO: 39), (c) Glu-Gly-Val- Tyr-Val-His-Pro-Val (Bachem) (SEQ ID NO: 40) and (d) Asp-Glu (Bachem).
  • the activity on long-chain peptides tends to be higher than the activity on dipeptides.
  • Example 8 Taste enhancing effect on natural seasonings
  • Aspergillus oryzae EAP, Aspergillus niger EAP, and yeast EAP increased the amount of free Glu by about 300 mg / l by the reaction for 120 minutes (see FIG. 7).
  • the increase by coryne EAP was about one-third.
  • the umami intensity according to the sensory evaluation was proportional to the amount of free Glu (see Table 2).
  • a 5% isolated soybean protein solution was adjusted to pH 8.0 and heat denatured by autoclaving at 121 ° C for 20 minutes.
  • 1% of soybean protein based on the mass of soybean protein
  • Ml% of protease Manoenzyme
  • Aspergillus oryzae EAP was added at 0.2% (% by mass), and the reaction was carried out at 37 ° C for 24 hours.
  • the amount of free Glu contained in the sample containing Aspergillus oryzae or EAP and the sample not added was measured using a glutamic acid measurement kit (Yamasa Shoyu Co., Ltd.).
  • the amount of free Glu was increased about 1.5 times by the addition of Aspergillus oryzae EAP. It increased (see Fig. 8).
  • the effect of Aspergillus oryzae cajun with EAP on cheese was confirmed.
  • the raw milk used was the same raw milk (about 35 L). After defatting according to the prescribed method, the fat percentage was adjusted to 3%. After adding a certain amount of lactic acid bacteria, the raw milk was heated to 32 ° C, and chymosin was added to the raw material by 0.003%. After confirming that the raw milk was coagulated, cutting and stirring were performed to remove about 1/3 of the whey. Next, the temperature was slowly raised to 34 ° C at a speed of l ° C / 2min, and the mixture was stirred, and 1/3 of the whey was removed.
  • the temperature was slowly increased to 38 ° C at a speed of l ° C / 2min, and the mixture was stirred for 1 hour, and then turned off to obtain a curd.
  • the amount of Aspergillus oryzae EAP added was 0.5 mg per 100 g of force.
  • the control group had no enzyme added.
  • the enzyme was added directly to 1500 g of curd and mixed well to make it even.
  • the lactic acid bacteria used were four mixed lactic acid bacteria (Gouda cheese) from Christian Hansen.
  • 3% salt was added to the force of the force.
  • 0.002% Na nitrate was added to the raw milk to suppress butyric acid bacteria.
  • curd of about 375 g of cheese was added to the mold.
  • the ripening was kept in a ripening room at 10 ° C after vacuum packaging to shorten the test period. After storage for 140 days, sensory evaluation was performed.
  • Aspergillus oryzae increased the ripening rate (solubilized nitrogen rate) by adding EAP, but no significant difference was observed compared to the control without addition.
  • the solubilized nitrogen ratio was determined by determining the amount of nitrogen in the fraction soluble in 12% trichloroacetic acid relative to the total amount of nitrogen.
  • the increase in free glutamic acid by addition of Aspergillus * olize EAP was lmg / 100g cheese.
  • effects such as enhanced cheese flavor, overall cohesiveness, and smooth texture were observed with the use of Aspergillus oryzae calo with EAP.
  • the bitterness of the cheese was eliminated by the addition of Aspergillus oryzae EAP, which was presumed to be due to the effect of increasing free glumic acid.
  • Example 1 1. Improvement of taste and / or flavor of beverage (I)
  • Aspergillus oryzae EAP treatment increased free glumic acid by about 3%. However, since 0.2% (W / W) of free glutamic acid was originally present in tomato juice, the effect of umami intensity on the increase of free glutamic acid content by 3% was not observed. On the other hand, in the enzyme-treated group, the sweetness was increased and the acidity was suppressed, so the resistance characteristic of tomato juice was weakened. This taste and / or flavor improving effect was not observed in the control group. The effect of Aspergillus oryzae EAP on tomatoes was remarkable in petit tomatoes and mature ripened tomatoes. Example 1 2. Improvement of taste and / or flavor of beverage (II)
  • Aspergillus oryzae EAP at a concentration of 3 mg / l was added to 100 ml of a commercially available soymilk drink (domestic soymilk; Taishi Foods Industry Co., Ltd.).
  • soymilk drink domestic soymilk; Taishi Foods Industry Co., Ltd.
  • heat-inactivated peptidase was used. These were subjected to an enzyme reaction at 37 ° C for 1 hour, and then subjected to sensory evaluation.
  • Aspergillus oryzae EAP treatment of soybean milk did not increase the amount of glumic acid, and thus no umami toughening was observed.
  • the enzyme-added group has a weaker soymilk peculiar blue odor (hexanal odor), and has a gradual change, so that the taste and / or flavor improving effect on soymilk is reduced. It could be confirmed.
  • Those who produce foods and drinks with high free amino acids and enhanced taste according to the present invention A law is provided. In particular, it can efficiently degrade hard-to-degrade peptides such as Glu-Glu that exist under soy sauce brewing conditions, etc., and produce a seasoning solution with a strong taste.
  • the amount of free Glu in the protein hydrolyzate can be increased by using it in combination with commercially available proteases and / or peptidase preparations. This is because commercially available proteases and peptidase preparations hardly contain enzymes having EAP-like activity, and hardly degradable peptides such as Glu-Glu exist as they are. Conceivable. As described above, the use of aminopeptidase EAP according to the present invention makes it possible to further enhance the taste of foods and drinks such as soy sauce and protein hydrolysates. '

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Abstract

　本発明は、以下の酵素特性を示す微生物由来のアミノペプチダーゼを、必要によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることによって、呈味、風味の改善された飲食品を製造する方法を開示する：（ａ）ペプチド及び／又はタンパク質のN末端からグルタミン酸、アスパラギン酸を特異的に遊離する反応を触媒する活性を有する、（ｂ）pH6.0～9.0において至適pHでの活性の50％以上の活性を有する、（ｃ）pH7.5、25～60℃30分加熱において、未加熱時の活性の４０％以上の活性を有する、（ｄ）SDS-PAGEにより測定した分子量が約40～60kDであり、native-PAGEにより測定した分子量が約300～480kDである、（e）Glu-Gluジペプチドに対する分解活性が5 U/mg以上、好ましくは10U/mg以上を示す。

Description

明細書
飲食品の呈味および/または風味の改善方法 技術分野
本発明は、 調味料、 調味料素材等の飲食品の呈味および/または風味の改善方 法に関する。 背景技術
酵素を用いた呈味および/または風味の改質法として既に多くの報告がある。 例えばうま味を強ィ匕する方法としてプロテア一ゼゃぺプチダ一ゼを併用して遊離 アミノ酸を増加する手段が知られている。 この様な手段は天然系調味料製造だけ でなく、 肉質味改良の際にも用いられる （特開平 05-276899)。 また特開平 11- 075765ゃ特開平 07-115969で報告されているようにプロリンに特異的に作用す る酵素を使用する方法がある。 プロテア一ゼ反応時にァ- GTP (ァグル夕ミルトラ ンスぺプチダ一ゼ） を利用してグルタミン酸を増強する方法 （特閧平 07- 099923) や、 グル夕ミンをグル夕ミナ一ゼでグル夕ミン酸に変換し、 うま味を増 強する方法も知られている。 本特許記載のぺプチダーゼもグル夕ミン酸ゃァスパ ラギン酸を特異的に遊離するため、 うま味強化の作用を有することを既に報告し ている （特開 2000-325090)。
例えば、 醤油、 味噌、 その他のタンパク質加水分解物を含む天然調味料の製造 に、 麹菌が利用されている。 たとえば、 醤油は、 製麹および発酵の 2段階を経て 製造される。 主として、 製麹段階において、 麹菌 （ァスペルギルス (Aspergillus)属糸状菌） が生産する酵素によって原料が分解される。 その際、 醤油中の呈味性をよくするためには、 諸味中の遊離アミノ酸の量、 特にグルタミ ン酸の遊離量を上昇させることが重要である。 一般にアミノ酸は、 原料タンパク質から 2つの段階を経て生成される。 第一は、 プロテアーゼによるタンパク質からのぺプチドの放出であり、 第二はぺプチダ一 ゼによつて触媒されるぺプチドの加水分解によるアミノ酸の生成である。
浅野らはダイズが、 その発芽過程において、 種子中の貯蔵タンパク質を非常に 短時間にアミノ酸まで分解することに着目し、 ダイズ子葉中よりぺプチダ一ゼ類 (酸性ァミノ酸含有べプチドを効率的に分解するァミノぺプチダ一ゼ、 及び口ィ シンアミノぺプチダ一ゼ群） を見出し、 ダイズタンパク質の効率的な加水分解を 行うことに成功した （特開平 9-294583号)。
ダイズのァミノべプチダーゼはその酵素学的諸性質から、 それまでに報告され ていない新規なアミノぺプチダ一ゼであることが明らかにされた酵素であり、 発 芽ダイズ以外にはその存在は知られていなかった。 ダイズのァミノぺプチダ一ゼ は N末端にグル夕ミン酸などの酸性アミノ酸を有するぺプチドから、 効率的に N 末端の酸性アミノ酸を遊離する活性を有する。 醤油等のタンパク質加水分解物を 含む天然調味料には、 難分解性のぺプチドとしてグル夕ミン酸 2残基からなるジ ペプチドが多量に含まれていることが知られている。従って、 ダイズのアミソぺ プチダ一ゼの作用により、 このような難分解性ジペプチドを分解し、 グルタミン 酸の遊離率が高く呈味性の優れた調味液の製造が可能である。
二宮らはダイズのァミノべプチダーゼを遺伝子組換え技術を用いて大量生産す ることに成功した （特開 2000-325090) が、 この方法により生産したダイズのァ ミノべプチダーゼ GXを調味液製造に利用することは、 ダイズ由来べプチダ一ゼ が食品用酵素として認められていないために実用化は困難である。 また、 組換え 体ダイズは、 温度安定性が悪く、 50°C以上での反応を行うことに適さず、 実用面 での課題も残っている。
食品用微生物種を多く含む麹菌のぺプチダ一ゼについては、 ァスペルギルス · オリゼゃァスペルギルス · ソ一ャ由来のもの （特開平 11-346777号、 DE95- 1952648、 WO 98/51163、 WO 96/28542、 WO 96/15504、 WO 98/51803、 WO 98/14599) について報告されている。 そのなかで、 ロイシンアミノぺプチダーゼ についての報告は多いが、 ダイズのアミノぺプチダーゼ GXのような、 呈味性に 優れるグル夕ミン酸を効率良く遊離する酵素活性を有するぺプチダーゼの報告は ない。例えば、 鯉渕らは、 ダイズのアミノぺプチダーゼと相同性のあるァスペル ギルス '二ジュランス （A.nidulans) EST をプロ一プとしてァスペルギルス ·二 ジュランスのゲノム DNAライブラリ一をスクリーニングし、 ァスペルギルス ·二 ジュランスの新規ァミノべプチダ一ゼをコードする DNA を取得した（W0 02/077223)。 しかし、 得られた新規アミノぺプチダーゼは、 ダイズ GXと 40%近 い配列相同性があるにもかかわらず活性ィ匕にコバルトイオン、 或いは亜鉛イオン を必要とするロイシンアミノぺプチダーゼ （LAP) 活性を有する酵素であった。 このように、 ダイズのアミノぺプチダ一ゼ様の特性を有する酵素はダイズ以外か らは取得されていない。 また、 上述のように、 配列の相同性からだけではダイズ のアミノぺプチダーゼ様活性の有無は判断できないことが示されている。
なお、 2003 年 3 月 31 日、 独立行政法人酒類総合研究所 HP にて、 麹菌 (Aspergillus oryzae RIB40 )の ESTデ一夕ベースが公開になり配列の検索が可 能となっている。
一方、 甘味の増強法として糖質分解酵素や当該酵素を有する微生物を利用して、 あるいは当該酵素に更に別の手段を併用して、 甘味並びに風味を改質する方法が 知られている。 例えば特開平 09-299094では糖質-と酵素または微生物を反応させ た後、 アルコール発酵を行って風味を改質している。 また特開平 09- 299094では 糖分解酵素と糖転移 ·縮合反応作用により甘味質の改善に成功している。 更に特 開 2003- 153651では渋味の多い茶葉原料や乾燥茶葉にタンニン分解、 多糖類分解、 タンパク質分解を行う分解酵素を作用させて渋味を少なくして、 甘みや旨味を増 加している。 しかしべプチダーゼ単独の作用により甘味を増強する方法は報告さ れていない。
塩力ド感の低減法として各種エキス （特開 2002-034496) や酵母で処理 （特開 平 11—276113) する方法、 あるいはダイズミネラル濃縮物 （特開平 05-049439) の添カ卩などが報告されている。 しかしべプチダーゼ処理により塩力ド感を低減し た例は知られていない。
また、 酵素による風味 ·呈味の全般的な改質方法に関しては以下の手法が報告 されている。 卵黄の風味改善法にはホスホリパーゼが使用されており、 特開 2002-325559ではホスホリパーゼ A1の効果が明記されている。 特開 2002-25317 1ではァ—グル夕ミルトランスぺプチダ一ゼで苦味アミノ酸をァ一グル夕ミル化 し、 苦味低減、 酸味増加、 及び呈味性改善に成功している。 また特開 2000 - 32769 では糖転移酵素を作用させてイソフラボンの味質と溶解性を改善してい る。 これら以外にもグルタミン酸脱炭酸酵素による呈味改善食品素材製法 （特開 2000-166502)、 グル夕ミナ一ゼ酵素でテアニンを合成し風味改善組成物を提供す る方法 （特開平 09-313129)、 ープリメべ口シダ一ゼを用いた食品フレーバー 3夂善法 （特開平 08-140675)、 リパーゼ酵素剤を用いる油脂風味の改質法 （特開 平 07- 135972)、 乳酸菌とリパーゼ、 プロテア一ゼ併用によるパンの風味改善法 など様々な手段が知られているが、 ぺプチダーゼのみの使用で風味 ·呈味を改質 する方法は知られていない。 発明の開示
本発明はグルタミン酸、 ァスパラギン酸の含量が高く、 呈味および/または風 味の改善された飲食品の製造方法を提供することを目的とする。
本研究者らは上記課題を解決するために、 ダイズ由来アミノぺプチダーゼ GX 遺伝子と相同性のあるァスペルギルス '二ジュランス （A.nidulans) ESTを基に、 55 RACE法を用いてダイズ由来アミノぺプチダ一ゼ様活性を有するァスペルギル ス ·ニジュランス由来の新規ァミノぺプチダ一ゼをコードする DNAを取得し、 さ らに、 得られた配列情報に基づいてダイズ由来アミノぺプチダ一ゼ様活性を有す るァスペルギルス .ォリゼ、 ァスペルギルス '二ガ一、 酵母、 コリネ菌由来の新 規アミノぺプチダーゼをコードする DNAを取得した。 さらに、 これらのアミノぺ プチダーゼを必要によりプロテア一ゼの共存下で夕ンパク質原料に作用させるこ とにより、 特に遊離グルタミン酸量が増加し、 呈味および Zまたは風味の増強さ れた飲食品を製造し得ることを見いだした。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1)以下の酵素特性を示す微生物由来のァミノべプチダーゼを、 必要によりプ 口テア一ゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、 呈味および/ま たは風味の改善された飲食品の製造方法：
(a)ペプチド及び/又はタンパク質の N末端からグルタミン酸、 ァスパラギン 酸を特異的に遊離する反応を触媒する活性を有する；
(b) pH6.0〜9.0において至適 pHでの活性の 50%以上の活性を有する；
(c) PH7.5, 25〜60°C、 30分加熱において、 未加熱時の活性の 40%以上の活性 を有する；
(d) SDS-PAGE により測定した分子量が約 40〜60kDであり、 native- PAGE に より測定した分子量が約 300〜480kDである；および、
(e) Glu-Gluジペプチドに対する分解活性が 5U/mg以上、 好ましくは 10U/mg 以上を示す。
(2) アミノぺプチダーゼが、 配列番号 2に記載のヌケレオチド配列を有する核 酸分子によってコードされる、 または、 配列番号 2に記載のヌクレオチド配列を 有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る核酸分子に よってコードされるアミノぺプチダーゼである、 （1)記載の方法。
(3) アミノぺプチダ一ゼが、 配列番号 6に記載のヌクレオチド配列を有する核 酸分子によってコードされる、 または、 配列番号 6に記載のヌクレオチド配列を 有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る核酸分子に よってコードされるアミノぺプチダ一ゼである、 （1 ) 言 3載の方法。
( 4 ) ァミノぺプチダーゼが、 配列番号 9に記載のヌクレオチド配列を有する核 酸分子によってコードされる、 または、 配列番号 9に記載のヌクレオチド配列を 有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る核酸分子に よってコードされるアミノぺプチダ一ゼである、 （1 ) 記載の方法。
( 5 ) アミノぺプチダーゼが、 配列番号 1 2に記載のヌクレオチド配列を有する 核酸分子によってコードされる、 または、 配列番号 1 2に記載のヌクレオチド配 列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る核酸分 子によってコードされるアミノぺプチダーゼである、 （1 ) 記載の方法。
( 6 )配列番号 1 5に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコード される、 または、 配列番号 1 5に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸分子によってコードされる アミノぺプチダ一ゼを必要によりプロテア一ゼの共存下で夕ンパク質原料に作用 させることを含む、 呈味および Zまたは風味の改善された飲食品の製造方法。
( 7 ) アミノぺプチダーゼが形質転換微生物により生産されるものである （1 ) 〜 （ 6 ) のいずれか 1に記載の方法。
( 8 )飲食品が調味料又は夕ンパク質加水分解物又はチ一ズ又はトマト果汁含有 飲料又は豆乳含有飲料である （1 ) 〜 （7 ) のいずれか 1に記載の方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 EAPの基質特異性を示したグラフである。 図 1A:アルペルギルス -ォ リゼ EAP、 図 1B：ァスペルギルス '二ガー EAP、 図 1C:コリネ EAP、 図 1D:酵母 EAPo 図 2は、 EAPの温度反応特性を示したグラフである。横軸は温度 （°C)、 縦軸 は 37°Cにおける活性値を 100 としたときのアミノぺプチダーゼ活性の相対値で ある。 図 2A:アルペルギルス 'ォリゼ EAP、 図 2B：ァスペルギルス ·ニジュラン ス EAP、 図 2C：アルペルギルス ·ニガ一 EAP、 図 2D:コリネ EAP、 図 2E:酵母 EAP。 図 3は、 EAPの温度安定性を示したグラフである。 横軸は保存時間、 縦軸は保 存時間 0分の場合の活性値を 100としたときのアミノぺプチダーゼ活性の相対値 である。 図 3A:アルペルギルス ·ォリゼ EAP、 図 3B：ァスペルギルス ·ニジユラ ンス EAP、 図 3C：アルペルギルス ·二ガー EAP、 図 3D:コリネ EAP、 図 3E:酵母 図 4は、 EAPの pH反応特性を示したグラフセある。横軸は pH、 縦軸は pH7.5 における活性値を 100としたときのアミノぺプチダーゼ活性の相対値である。 図 4A:アルペルギルス ·ォリゼ EAP、 図 4B：ァスペルギルス '二ジュランス EAP、 図 4C：アルペルギルス ·ニガ一 EAP、 図 4D:コリネ EAP、 図 4E:酵母 EAP。
図 5は、 EAPの pH安定性を示したグラフである。横軸は保存した緩衝液の pH、 縦軸は保存前の活性値を 100とした場合のアミノぺプチダーゼ活性の相対値であ る。 図 5A:アルペルギルス ·ォリゼ EAP、 図 5B：ァスペルギルス ·ニジュランス EAP、 図 5C：アルペルギルス ·ニガ一 EAP、 図 5D:コリネ EAP、 図 5E:酵母 EAP。 図 6は、 EAPの種々の長さのぺプチドに対する反応特性を示したグラフである。 横軸に示した A、 B、 C、 D は基質の種類を表し、 それぞれ、 A:Glu- Glu、 B:Glu- His-Phe-Arg- Trp-Glyヽ C:Glu- Gly-Va卜 Tyr-Vaト His-Pro- Valヽ D:Asp-Glu を意味 する。 図 6A:アルペルギルス 'ォリゼ EAP、 図 6B：アルペルギルス ·二ガー EAP、 図 6C:コリネ EAP、 図 6D :酵母 EAP。
図 7は、 かつおエキス調味料に対する EAPの呈味増強効果を示したグラフであ
-S o
図 8は、 分離ダイズ夕ンパクを市販のプロテア一ゼ製 ¾|であるプロテアーゼ M と、 ぺプチダーゼ製剤であるゥマミザィムで分解した夕ンパク加水分解液に対す る EAPの添加効果を示したグラフである。縦軸は、 加水分解液中に含まれる遊離 Glu量を示す。 図 8A:アルペルギルス ·ォリゼ EAP、 図 8B：ァスペルギルス ·二 ジュランス EAP。 1 ：ゥマミザィム 1 % +プロテア一ゼ M 1 % ; 2 :ゥマミザィ ム 2 %； 3 ：プロテア一ゼ M 2 %。
図 9は、 分離ダイズ夕ンパクを市販のプロテア一ゼ製剤であるアルカラ一ゼと、 ぺプチダ一ゼ製剤であるフレーバーザィムで分解した夕ンパク加水分解液に対す る EAPの添加効果を示したグラフである。縦軸は、 加水分解液中に含まれる遊離 Glu量を示す。 図 9A:アルペルギルス 'ォリゼ EAP、 図 9B：ァスペルギルス ·二 ジュランス EAP。 1 ：アルカラーゼ 1 % +フレーバ一ザィム 2 %； 2 ：アルカラ —ゼ 1 % +フレーバ一ザィム 1 %； 3 ：アルカラ一ゼ 1 %。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 上述した酵素特性を示す微生物由来のアミノぺプチダーゼを、 必要 によりプロテアーゼの共存下でタンパク質原料に作用させることによって呈味お よび Zまたは風味の改善された飲食品を製造する方法である。 特に本発明におい て使用するアミノぺプチダーゼは微生物由来のグルタミン酸および Zまたはァス パラギン酸特異的ァミノぺプチダーゼである。
本発明において使用するアミノぺプチダ一ゼは上述したダイズのアミノぺプチ ダーゼ GXの麹菌における対応物と考えられるので、 本明細書においては、 本発 明において使用する微生物由来グル夕ミン酸および/またはァスパラギン酸特異 的アミノぺプチダーゼタンパク質を 「EAP」 または「アミノぺプチダ一ゼ EAP」 と記載し、 EAP をコードする遺伝子を 「EAP遺伝子」 と記載することがある。 ま た、 文脈上明らかな場合は、 本発明で使用する微生物由来のグルタミン酸および /ま はァスパラギン酸特異的アミノぺプチダ一ゼ EAPを単に 「アミノぺプチダ —ゼ」 と称することがある。 例えば、 本発明で使用する、 ァスペルギルス 'オリ ゼ由来のグルタミン酸および/またはァスパラギン酸特異的アミノぺプチダ一ゼ、 およびァスペルギルス ·ニジュランス由来のグル夕ミン酸および/またはァスパ ラギン酸特異的アミノぺプチダーゼは、 それぞれァスペルギルス 'ォリゼ EAPお よびァスペルギルス '二ジュランス EAPと記載することがある。 一方、 前述した ダイズ由来のアミノぺプチダーゼ （特閧 2000-325090) は 「GX」 または 「ダイズ のアミノ プチダーゼ GX」 または 「ダイズ GX」 と記載することがある。
また、 本明細書において、 特に 「アミノぺプチダ一ゼ」 とは、 ペプチドの N- 末端からグル夕ミン酸ゃァスパラギン酸等の酸性アミノ酸を遊離する反応を触媒 する活性を有するタンパク質をいう。
本発明に使用するアミノぺプチダーゼ EAPをコ一ドする核酸分子は、 ァスペル ギルス 'ォリゼおよびァスペルギルス '二ジュランス等のァスペルギルス、 例え ばァスペルギルス ·ニジュランス A26株の染色体 DNA又は cDNAから以下のよう にして取得することができる。
発芽ダイズ由来のアミノぺプチダーゼ （特開 2000-325090) の遺伝子配列とァ スペルギルス '二ジュランス ESTデ一夕べ一ス中の相同性の高い EST断片のヌク レオチド配列を参考に、 PCR (ポリメラ一ゼ 'チェイン ' リアクション） プライ マ一を作製し、 ァスペルギルス '二ジュランス cDNA もしくはァスペルギルス · ニジュランス染色体. DNAを铸型とした PCR法により本発明の方法に使用し得るァ ミノぺプチダーゼ EAPをコ一ドする核酸分子を含むクローンを取得することがで きる。
ァスペルギルス■ニジュランスのポリ （A) RNAから調製した cDNA ライブラ リーから、 例えば配列番号 1 7及び 1 8に示すヌクレオチド配列を有するオリゴ ヌクレオチドをプライマ一とする PCI さらに配列番号 1 9及び 2 0に示すォリ ゴヌクレオチドをプライマ一とする 5' - RACEによって、 取得することができる。 オープンリーディングフレーム （0RF) を完全に含む配列を得るためのプライマ 一として配列番号 2 2及び 2 3に示すヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオ チドが挙げられる。 上記のようにして得られるァスペルギルス ·ニジュランス A26由来のアミノぺプチダーゼをコードする遺伝子を含むゲノム DNAのヌクレオ チド配列を配列番号 1に示す。 また、 cDNAのヌクレオチド配列を配列番号 2に、 アミノ酸配列を配列番号 3に示す。 ゲノム DNAと cDNAのヌクレオチド配列を比 較した結果、 ゲノム DNA中にはィントロンは見出されなかった。
また、 本発明に用いるアミノぺプチダーゼをコードする核酸分子は、 ァスペル ギルス属の他の種に属する微生物、 例えばァスペルギルス ·ォリゼの染色体 DNA 又は cDNAから取得することもできる。 具体的には、 ァスペルギルス 'ォリゼ、 例えばァスペルギルス 'オリゼ麵 0 (ATCC42149) の cDNAから PCR法により取 得することができる。 上記ァスペルギルス ·ニジュランス由来のアミノぺプチダ —ゼのヌクレオチド配列をもとに、 PCR用のオリゴヌクレオチドプライマ一を合 成し、 ァスペルギルス ·ォリゼ、 例えばァスペルギルス ·ォリゼ RIB40の菌体よ り調製した cDNAを錶型とする PCRを行うことにより調製することができる。 こ のための PCR用プライマーとしては、 dT プライマーと配列番号 2 4に示すヌク レオチド配列、 5' - RACE用には配列番号 2 5及び 2 6に示すヌクレオチド配列、 全 0RFを得るには、 配列 2 7および 2 8に示す配列を有するオリゴヌクレオチド が挙げられる。
上記のようにして得られるァスペルギルス ·ォリゼ MB40の EAPをコードする cDNAのヌクレオチド配列を配列番号 6に、 アミノ酸配列を配列番号 7に示す。 配列番号 3に示すァスペルギルス ·ニジュランス EAPのアミノ酸配列と配列番号 7に示すァスペルギルス ·ォリゼのアミノぺプチダ一ゼのアミノ酸配列は、 約 83%の相同性を有しており、 約 85 アミノ酸残基が異なっている。 ァスペルギル ス 'ォリゼ EAP遺伝子とァスペルギルス ·ニジュランス EAP遺伝子との相同性は、 解析ソフト GENETYX-MAC Ver.10で解析した結果、 コ一ド領域では約 76%であり、 アミノ酸配列レベルでは 80%以上であった。 また、 ゲノム DMと cDNAのヌクレ ォチド配列を比較した結果、 ァスペルギルス ·ォリゼのゲノム DNA中にはィント ロンが 5箇所に含まれていた。 ァスペルギルス ·ォリゼ EAPをコードするゲノム ヌクレオチド配列を配列番号 4に示す。
同様な方法に従って、 ァスペルギルス ·二ガー、 コリネ菌、 酵母由来の各アミ ノぺプチダ一ゼ EAP をコードする核酸分子を得ることができる。 ァスペルギル ス ·二ガ一、 酵母、 コリネ菌由来の各ァミノぺプチダーゼ EAP遺伝子のゲノム配 列をそれぞれ、 配列番号 8、 1 1および 1 4に記載し、 コード領域のヌクレオチ ド配列をそれぞれ配列番号 9， 1 2および 1 5に記載した。 各 EAPのアミノ酸配 列はそれぞれ配列番号 1 0、 1 3および 1 βに記載した。
配列番号 6に示す cDNA配列に含まれる 0RF、 すなわち、 本発明において使用 するアミノぺプチダーゼをコードするヌクレオチド配列について、 ァスペルギル ス 'ォリゼの ESTデータベース上にその全配列が記載されている。 さらに、 前述 のデータべ—ス上では、 この 0RFによってコードされるタンパク質の推定される 機能として 「ァスパルチルアミノぺプチダ一ゼ （aspartyl aminopeptidase)j と 記載されている。 しかしながら、 本発明者らによって実際に得られた酵素はァス パルチルアミノぺプチダーゼと著しく異なつた機能を有していることが明らかに なった。例えば、 ァスパルチルアミノぺプチダ一ゼはァスパラギン酸と比較して グルタミン酸を遊離する活性が弱い （Cheung, H. S. and Cushman, D.W. B.B.A. 242, 190-193(1971 ))。 一方、 本発明において使用するアミノぺプチダ一ゼのグ ルタミン酸を遊離する活性はァスパラギン酸を遊離する活性と同程度である点に 本発明の一つの特徴がある。 また、 ァスパルチルァミノべプチダーゼはジぺプチ ドのような短い基質を分解する活性が殆どないとされているが (S. Wilk, E. Wilk, R.P. Magnusson, Arch. Biochem. Biophys. 407 (2002) 176-183)、 本発 明は、 本発明において使用するアミノぺプチダーゼが醤油醸造過程等において多 く見られる難分解性のジペプチドを含む短いペプチドも効率よく分解する点も特 徴の一つとする。
このように、 本発明はァスペルギルス 'ォリゼの ESTデータペース上で推定さ れている仮想的タンパク質の機能および性質とは明らかに異なる機能および性質 を利用する方法である。
本発明に用いるァミノぺプチダーゼは、 上述したアミソぺプチダーゼの活性が 損なわれない限り、 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 1以上の位置にお ける 1または複数のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 又は付加を含むものであって もよい。 ここで、 「複数」 とは、 アミノぺプチダ一ゼタンパク質の立体構造にお けるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが、 通常 2〜85'個、 好ましく は 2〜50個、 最も好ましくは 2〜10個である。 ァスペルギルス .ォリゼ由来の アミノぺプチダーゼとァスペルギルス ·ニジュランス由来のアミノぺプチダ一ゼ の間では 85個のアミノ酸置換が見られるが、 実施例に示すように両者は同等の 活性を維持していることが明らかになつている。従って、 上述の範囲内のアミノ 酸置換であればァミノぺプチダーゼの活性および特性は本発明の方法に使用する ために十分な程度に維持されると期待される。
本発明に用いるアミノぺプチダーゼ EAPをコードする遺伝子には配列番号 6に 示すヌクレオチド配列のうち塩基番号 1〜； 1494からなるヌクレオチド配列を有 する DNAが含まれる。 また、 当該並列において遺伝暗号の縮重による変更を含ん でいても良い。 さらに、 EAP と同等の性質を有するタンパク質をコードする核酸 分子は、 例えば部位特異的変異法によって、 特定の部位のアミノ酸が置換、 欠失、 挿入、 付加されるように EAP遺伝子のヌクレオチド配列を改変することによって も得られる。 また、 上記のような改変された核酸分子は、 従来知られている突然 変異処理によっても取得され得る。 突然変異処理としては、 アミノぺプチダーゼ をコードする MAをヒドロキシルァミン等でインビトロ処理する方法、 及びァミ ノぺプチダーゼをコ一ドする DNAを保持するェシェリヒア属細菌を、 紫外線照射 または N—メチル一N，一二トロー N—ニトロソグァ二ジン （NTG) もしくは亜硝酸 等の通常人工突然変異に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられ る ο
また、 上記のような塩基の置換、 欠失、 挿入、 又は付加、 等には麹菌の種ある いは菌株による差等、 天然に生じる変異も含まれる。 上記のような変異を有する 核酸分子を、 適当な細胞で発現させ、 発現産物の EAP活性を調べることにより、 EAPと実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が得られる。 また、 変異 を有する EAPをコードする核酸分子またはこれを保持する細胞から、 例えば配列 表の配列番号 6に記載のヌクレオチド配列のうち、 塩基番号 1 1494からなるヌ クレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズ し、 かつ、 EAP活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を単離することに よっても、 EAPタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードする核酸分子が 得られる。 ここでいう 「ストリンジェン卜な条件」 とは、 いわゆる特異的なハイ ブリヅドが形成される条件をいう。 この条件は個々の配列の G C含量や繰り返し 配列の有無などに依存するため明確に数値化することは困難であるが、 一例を示 せば、 相同性が高い核酸分子同士、 例えば 65%以上の相同性を有する核酸分子 同士がハイプリダイズし、 それより相同性が低い核酸分子同士がハイプリダイズ しない条件、 あるいは通常のサザンハイプリダイゼ一シヨンの洗滌条件である 60。C、 l xSSG, 0.1%SDS、 好ましくは、 O. lxSSCヽ 0.1% SDSに相当する塩濃度 でハイプリダイズする条件が挙げられる。 このような条件でハイプリダイズする 遺伝子の中には途中にストヅプコドンが発生したものや、 活性中心の変異により 活性を失ったものも含まれる可能性があるが、 それらについては、 市販の活性発 現べクタ一につなぎ EAP活性を後述の方法で測定することによって容易に取り除 くことができる。
なお、 本発明で使用するァスペルギルス '二ジュランス、 ァスペルギルス 'ォ リゼ、 ァスペルギルス ·ニガ一由来のアミノぺプチダーゼ EAPの相同性は、 解析 ソフト GENETYX- MAC Ver.10 で解析した結果、 いずれの 2種のアミノぺプチダ一 ゼ間でもアミノ酸配列レベルにおいて 80%以上である。
本発明において使用するアミノぺプチダ一ゼをコ一ドする核酸分子は本発明に おいて使用されるアミノぺプチダ一ゼを製造するために使用することができる。 本発明に使用するアミノぺプチダーゼ （EAP) をコードする核酸分子を用いて、 麹菌等の糸状菌の育種、 あるいは EAPを製造することができる。 例えば、 EAPを コ一ドする MAを、 糸状菌 （例えばァスペルギルス ·ォリゼ） 細胞内に好ましく はマルチコピーで導入することにより、 糸状菌の有する EAP活性を増大させるこ とができる。 また、 EAP をコードする核酸分子を適当な宿主で発現させることに より、 EAPを製造することができる。
本発明に使用するアミノぺプチダーゼをコードする核酸分子を導入する糸状菌 としては、 ァスペルギルス 'ォリゼ、 ァスペルギルス ·ニガ一 （A. niger)、 ァ スペルギルス .ニジュランス等のァスペルギルス属、 ニューロスポラ ·クラッサ (Neurospora crassa) 等のニューロスボラ属、 リゾムコ一ノレ · ミ一ヘイ (Rhizomucor liehei) 等のリゾムコール属に属する糸状菌が挙げられる。 ァス ペルギルス属糸状菌が特に好ましい。
上記のような糸状菌に上述の核酸分子を導入するためのべク夕一としては特に 制限されず、 糸状菌の育種等に通常用いられているものを使用することができる。 例えば、 ァスペルギルス■ォリゼに用いられるベクターとしては、 pUNG (Lee, B.R. et al.5 Appl. Microbiol. BiotechnoL , 44, 425-431 (1995) )、 pMARG ( Tsuchiya, K. et al.， Appl. Microbiol. BiotechnoL , 40， 327-332 (1993) )、 pUSC ( Gomi, K. et al.， Agric. Biol. Chem. 51, 2549-2555 (1987)) 等が挙げられる。 pUNGはァスペルギルス 'ォリゼ niaD300 (Minetoki, T. et al. , Curr. Genet. 30, 432-438 (1996)) の niaD— (硝酸資化能欠損) を 相補するマーカ一を、 pMARGはァスペルギルス 'ォリゼ M2-3 (Gomi, K. et al. , Agric. Biol. Chem. , 51(9), 2549-2555 (1987)) の argB一 (アルギニン要求) を相補するマーカ一を、 pUSC はァスペルギルス 'ォリゼ NS4 (Yamada, 0. et al. , Biosci. Biotech. Biochem. , 61(8)， 1367-1369 (1997)) の sC一 (ATP ス ルフリラ一ゼ欠^ g) を相補するマーカ一を、 それぞれ有している。.
このようなベクターのうち、 プロモ一夕一を含むベクタ一を利用する場合は、 そのプロモー夕一の下流に EAPをコ一ドする DNA分子をフレームを合わせて挿入 することにより EAPを発現させることが出来る。例えば、 pUNG及び pMA Gは、 グルコアミラ一ゼ遗伝子 (glaA) のプロモ一夕一及び —アミラーゼ遺伝子 (amyB の夕一ミネ一夕一） を有しているので、 該プロモーターの下流に EAP を コ一ドする DNA (例えば配列番号 6において塩基番号 1〜： 1497を含む領域） をフ レームを合わせて揷入することにより、 該プロモー夕一制御下で EAPを発現させ ることができる。 また、 プロモーターを含まないベクター、 例えば pUCS等を利 用する場合は、 上記 DNAを挿入した PUC19等のプラスミドと pUSCとの共形質転 換 （Co- transformation) により宿主糸状菌に導入することによって EAP を発現 させることができる。得られる宿主糸状菌または EAPを本発明の方法に使用する ことが出来る。
また、 以下の表 1中に示した文献に記載されているベクタ一、 プロモーター及 びマーカーも宿主糸状菌に応じて使用することができる。 表 1中、 プロモーター の名称は天然にその制御下にある遺伝子がコードする酵素名を用いて示してある。 文献 プロモ一夕一 トカ- 宿主糸状菌
特表平 4-503450号 中性 アミラ-セ、、 ァス ルキ、、ルス'二力、、- argB ァス ルキ、、ルス'二力、、 - argB ァスへ。ルキ、、ルス'ニシ、、ュランス trpC ァスへ0ルキ、、ルス'ニシ、、ュランス amdS ァスへ。ルキ、、ルス'ニシ、、ュランス pyi'4 ニューロスホ。ラ ·クラッサ
DHFR ：:ユ ロスホ°ラ ·クラッサ 特開昭 62-272988 タカアミラ-セ、、 ァス ルキ、、ルス'ォリセ、、
ァス八 °ラキ、、ン酸フ。口テア-セ、、 リリ、、ム； I-ル'ミ - M リ八 °—セ、、 リ ム： ι-ル·ミ- M ク、、ルコアミラ-セ、、、 リハ。-セ、、 ァスへ0ルキ、、ルス'二力、、- ァミラ-セ、、、 ク、、ルコアミラ-セ、、、 セル
ラ—
フ°口テア-セ、 \ 解糖系酵素
特開平 7-51067 タカアミラ-セ、、 ァス ルキ、、ルス属
特開平 7-115976 新規フ°11モ-タ-配列が記載 ァスへ。ルキ、、ルス'ォリセ、、 特開平 7-59571 新規； 7° ϋΐ-タ-配列が記載 ァスへ。ルキ、、ルス 'ォリセ、、 口 α Tf 辰库廿: 子ム ϋ。, &、 ひ-アミラーセ、、 (anyB) ァス ルキ、、ルス'ォリセ、、
Vol.71,No.10(1997) ク、、ルコアミラ-セ、、 (glaA) ァス ルキ Ί1ス 'オリセ、、
1018-1023 ク、、ルコシ夕、、-セ、、 (agdA) ァスへ。ルキ、、ルス'ォリセ、、
糸状菌の形質転換は、 上記文献に記載されている方法の他、 任意の公知の方法 を採用することができる。 例えばァスペルギルス ·ォリゼは以下のようにして形 質転換することができる。
DPY培地 （グルコース 2 %、 ペプトン 1 %、 酵母エキス 0.5%、 pH5.0) に菌体 (分生子） を植菌し、 30°Cで 24 時間程度激しく振盪培養する。 培養液をミラク ロス （Myracloth、 CALBIO CHEM社製） 又は滅菌したガーゼ等で濾過し、 菌体を 回収し、 滅菌水で洗浄し、 水分をよく切る。 この菌体を、 試験管に入れ、 酵素液 ( 1.0%ャ夕ラ一ゼ （Yatalase、 宝酒造 （株） 製）、 または 0.5 %ノボザィム (NovoZyme, ノボノルディスク社製） 及び 0.5%セルラ一ゼ （例えば Cellulase Onozukaヽ ヤクルト社製）ヽ 0.6M ( ¾)2S04、 50ηιΜ リンゴ酸、 ρΗ5· 5) を加え、 30°Cで 3時間程度穏やかに振盪する。 顕微鏡でプロトプラスト化の程度を観察し、 良好であれば氷中に保存する。
次に上記酵素反応液をミラクロスで濾過して菌体残渣を除去し、 プロトプラス トを含む濾液に等量の緩衝液 A (1.2Mソルビトール、 50mM CaCl2、 35mM NaCl2、 lOmM Tris - HC1、 pH7.5) を加えて氷中に置く。 これを 0 °C、 1500〜2, 500rpmで 5〜：0分間遠心した後、 緩やかに停止させ、 ペレットを緩衝液 Aで洗浄し、 適 量の緩衝液 Aに懸濁する。 100〜200〃1のプロトプラスト懸濁液に 20〃 1以下の DNA溶液 （5〜； lO zg) を加え、 20〜30分氷中に置く。緩衝液 B (60%ポリェチ レングリコール 6000、 50mM CaCl2 lOmM Tris-HCl、 pH7.5) を 250 /1加えて穏 やかに混合し、 再び緩衝液: Bを 250 1加えて穏やかに混合した後、 さらに緩衝 液 Bを 850 l加えて穏やかに混合し、 20分室温で静置する。 その後、 10mlの緩 衝液 Aを加えて試験管を反転させ、 0 °C；、 l, 500〜2, 500rpmで 5分間〜 10分間遠 心し、 ペレヅトを 500〃 1の緩衝液 Aに懸濁する。
上記懸濁液の適量を、 予め分注し保温しておいた 5 ml のトップァガ一に加え て、 下層培地 (1.2Mソルビトールを含有し、 マーカーに応じて調製した選択培 地） に重層し、 30°Cで培養する。生育した菌体を選択培地に植え継いで、 形質転 換体であることを確認する。 さらに、 菌体から組換え DNAを調製し、 制限酵素解 析又はサザン解析等によって、 EAPをコードする DNAが導入されていることを確 謌してもよい。 ，
使用するプロモーターに適した条件にて上記のようにして得られる形質転換体 を培養することによって EAP遺伝子が発現し、 EAPが産生される。 例えば、 ァス ペルギルス 'ォリゼを宿主に用い、 プロモーターとしてグルコアミラーゼプロモ 一夕一を使用する場合には、 小麦フスマ、 リン酸カリウム等を含む培地に形質転 換ァスペルギルス 'ォリゼの胞子を懸濁し、 約 30°Cにて約 3日間培養すること により EAPを産生させることができる。 必要に応じて培養物を蒸留水等で希釈し、 ストマヅカ一等で処理することによって EAPを含む酵素粗抽出液を得ることがで きる。得られた粗抽出液はゲル濾過、 種々のクロマトグラフィー等を用いること によって更に EAPを精製することもできる。 得られた EAPは更に塩析、 等電点沈 殿、 ゲル濾過、 イオンクロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー等によって 精製し、 ぺプチドからの酸性アミノ酸遊離のために使用することができる。
しかしながら、 EAP活性の向上した形質転換微生物の培養物をそのまま、 また は必要によりタンパク質分解酵素 （プロテア一ゼ） とともにタンパク質原料と直 接混合してタンパク質またはその混合物に作用させることにより、 遊離アミノ酸 含量が高く、 呈味および/または風味の改善された調味料、 タンパク質加水分解 物等の飲食品を得ることもできる。作用させるタンパク質原料としては、 例えば 大豆、 小麦、 小麦グルテン、 コーンミール、 ミルクカゼイン、 力ヅォ、 カツォ節、 フィッシュミール、 食品用に用いられるあらゆるタンパクが挙げられ、 さらに脱 脂大豆あるレヽは膨ィ匕や可溶化等の加工をされた種々のタンパク質あるいはこれら の種々の原料からの分離タンパク質であってもよい。 タンパク質分解酵素を使用 する場合、 市販の酵素製剤でよく、 細胞壁分解酵素等、 他の酵素を含むものであ つても構わない。 ァスペルギルス属ゃバチルス属の微生物が生産するタンパク質 分解酵素を使用することができ、 例えばゥマミザィム、 プロテア一ゼ M、 フレー バ一ザィム、 アルカラ一ゼなどの市販の酵素製剤を用いることができる。
グル夕ミン酸および/またはァスパラギン酸特異的ぺプチダーゼを作用させる ことによって風味'呈味を改善し得るタンパク質、 ペプチドを含む食品には、 例 えば、 醤油、 味噌などの醸造 ·発酵食品や、 チーズ、 ヨーグルトなどの乳製品、 野菜 ·果実ジュースなどの飲料品、 豆乳、 豆腐などの大豆食品、 パン、 麵などの 小麦食品、 かまぼこ、 竹輪などの水練り食品、 ソーセージ、 ハムなどの畜肉食品 などが含まれるが、 これらに限定されず広範な食品が含まれる。
形質転換微生物の培養物または粗精製酵素をタンパク質に作用させる実用的条 件としては、 たとえば 0.2〜50%、 好ましくは 1〜20%の濃度のタンパク質原料に 精製酵素または必要により更にタンパク質分解酵素を加えて混合し、 5〜55°C、 好ましくは 30〜55°Cにて 1分間〜 10日間、 好ましくは 1時間〜 10日間反応させ ればよい。
反応終了後、 未反応のタンパク質原料、 菌体などの不溶物は遠心分離や濾過等、 従来の分離法を用いて除去することができる。 また、 必要に応じて減圧濃縮、 逆 浸透法などにより濃縮を行い、 濃縮物は、 凍結乾燥、 減圧乾燥、 噴霧乾燥等の乾 燥処理により粉末ィ匕または顆粒ィ匕することもできる。 かくして遊離グルタミン酸 含有量が高く、 呈味および/または風味の改善された調味料、 タンパク質分解物 等の飲食品を得ることができる。 実施例 '
実施例 1 . ァスペルギルス '二ジュランス EAPをコードするゲノム DNAのクロ一 ニング
発芽ダイズ由来アミノぺプチダ一ゼの配列をもとに、 ァスペルギルス ·ニジュ ランスの cDNAデ一夕ベース (http： //www. enome . ou. edu/fungal . html )を用いて、 ホモロジ一検索したところ、 相同性の高い ESTpOflOal.flを見出した。
この情報を基に、 ァスペルギルス ·ニジュランス cDNAからァスペルギルス · ニジュランス EAPのクロ一ニングを以下のように行った。
ァスペルギルス ·ニジュランス A26 株 （Fungal Genetics Stock Center, Department of Microbiology, University of Kansas Medical Centerから fe入 可能） を YG培地 （酵母エキストラクト 0.5%, グルコース 2.5%, 微量元素 * 0.1%、 pH 6.5) 50ml で 30° 48時間振とう培養した （微量元素 *:FeS04'7¾0 0.1% , ZnS04-7H20 0.88%, CuS04- 5¾0 0.04% , 誦4. 4¾0 0.015%, Ν¾Β407· 10¾0 0.01%, (Ν¾)6Μο024·4¾0 0.005% )。
菌体を回収し、 液体窒素にて凍結後、 乳鉢を用いて粉砕した。粉砕物より、 HN easy Plant Mini Kit (QIAGE 社）を用いて全 RNA の調製を行い、 oligotex- dT30<Super>mRNA Purification Kit (TaKaRa社） を用いて mRNAの調製を行った。 この mRNAから、 TaKafia RNA PCR IQt (厦) Ver.2.1(TaKaRa社）を用い cDNAを合' 成した。 得られた cDNA を錶型として、 ァスペルギルス '二ジュランス ESTpOflOal . fl配列よりデザィンした下記配列を有するオリゴヌクレオチドをプ ライマ一に用いた PCR、 および RACE法により、 EAPの完全長 cDNAのクロー二 ングを行った。
(5，末端用プライマ一）
CGC ATT CCG ACG TTG GCT ATC C (配列番号 1 7 )
(3，末端用プライマー）
ATG TTG GAA GAG CTC TTG AAG AG (配列番号 1 8 )
PCR反応は、 94°C 3分間の熱変性後、 94°C 30秒、 55°C 30秒、 72°C 30秒の 反応を 25 サイクルで行なった。 その結果、 予想されるサイズの DNA断片 （約 lOOObp) が増幅されたため、 プラスミド pUC19に揷入した。 このプラスミドでェ シユリヒア 'コリ JM109株を形質転換し、 形質転換菌からプラスミド DNAを調製 してヌクレオチド配列を決定した。 その結果、 ESTデ一夕べ一スに示された配列 と同一の配列であることが判明した。
続いて、 ァスペルギルス ·ニジュランス全 0RF配列を得るために、 5，RACE法 と 3' RACE法を用いた。 PCRの反応条件は、 94°C 9分間の熱変性の後、 94°C 30 秒、 55。C 30秒、 72°C 30秒の反応を 30サイクル行い、 さらに 72°C 5分の反応 を行った。 その結果、 配列番号 1 9及び 2 0のプライマ一を用いた 5' RACE法に より 5'側の全 0RF配列が明らかになり、 配列番号 2 1を用いた 3' RACE側の全 0RFが明らかとなった。配列番号 2 2及び 2 3のプライマ一を用いた PCRにより、 全 0RFを含む、 約 1500bpの増幅断片が得られた。 これらの DNA断片のヌクレオ チド配列を配列番号 2に、 ヌクレオチド配列から予想されるアミノ酸配列を配列 番号 3に示す。
上記ァスペルギルス ·ニジュランス EAP cDNA断片を、 PUC19の HincI I部位に 揷入した。 また、 挿入した配列の上流に trpプロモーターを接続した発現プラス ミド pUCtrpnidGXも構築した。得られたプラスミドで形質転換されたェシエリヒ ァ 'コリ JM109株を得た。
(5， RACE用 プライマ一）
TAG GGA ACA GTT GAG TCT C (配列番号 1 9 )
(5， RACE用 プライマー）
TCC GTG TGA GCC CCG ATC ATG (配列番号 2 0 )
(3， RACE用 プライマ一）
TCC CGC TAC AAC TCT TTG TCG T (配列番号 2 1 )
(5，末端用プライマ一）
ATG AGG TCT AAT CTA ACG AAG (配列番号 2 2 )
(3，末端甩プライマ一）
GAT TCA CTA GCC CTC GCA CTA C (配列番号 2 3 ) 実施例 2 . ァスペルギルス 'ォリゼ由来の、 ァスペルギルス '二ジュランス EAP に相同な cDNAのクロ一二ング
( 1 ) ァスペルギルス 'ォリゼ由来 cDNAの取得
ァスペルギルス 'オリゼ RIB40 (ATCC42149) を、 1.5%分離ダイズを含む培地 50mlで 30°C、 64時間培養した。 菌体をろ過により集め、 1 gを回収した。 この 菌体を直ちに液体窒素で凍結し、 乳鉢で粉砕した後、 Plant Mini Kit (QIAGEN 社）を用いて全 RNAの調製を行い、 oligotex- dT30<Super>mRNA Purification Kit (TaKaEa社） を用いて mRNAの調製を行った。 この mRNAから、 TaKaHa RNA PCR Kit (層) Ver.2.1(TaXaRa社）を用い cDNAを合成した。
( 2 ) ァスペルギルス ·ニジュランス由来 EAPに相当するァスペルギルス ·オリ ゼ由来アミノぺプチダーゼのクロ一ニング
実施例 1で得たァスペルギルス■ニジュランスの EAP配列を参考に、 配列番号 2 4で示したオリゴヌクレオチドと dT プライマーアダプタープライマーを用い た 3' RACEおよび配列番号 2 5及び 2 6を用いた 55 BACEによって、 ァスペルギ ルス ·ニジュランスのアミノぺプチダ一ゼ EAPに相同なァスペルギルス ·ォリゼ 由来の cDNAのクローニングを行った。
(3， RACE用 5，末端プライマ一）
TCC ACC TTG ATC GCC AGG AGA CTT (配列番号 2 4 )
(5， RACE用 プライマ一）
TAG GGA ACA ATT GGG TCT C (配列番号 2 5 )
(5， RACE用 プライマ一）
GGC TTC CAT TTC TTG CCG (配列番号 2 6 )
3， RACEの PCR反応は、 95°Cで 9分熱変性した後、 94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 1分め反応を 35サイクル行った。 これにより約 800bpのァスペルギルス · ニジュランス由来のアミノぺプチダ一ゼ EAP に相同な遺伝子断片を得た。 5' RACEの PCR反応は、 94°C 30秒、 53°C 30秒、 72°C 1分の反応を 35サイクル行 つた。 これによりそれぞれ約 300bの、 ァスペルギルス ·ニジュランス EAPに相 同なァスペルギルス ·ォリゼ遺伝子断片を得た。 配列番号 2 7と 2 8に示した 配列を用いて PCR反応を行うことにより、 全 0RFを含む、 約 1500bpのヌクレオ チド配列を得た。 PCR反応は、 94°C 30秒、 54°C 30秒、 72°C 45秒の反応を 2 5サイクル行った。 (5，末端用 プライマー）
ATG ACT TCG AAA ATC GCC CM AAT TTG AAG (配列番号 2 7 )
(3，末端用 プライマ一）
TCA GTC AAC AAA GAT TGT CTT TGA CGTG (配列番号 2 8 ) 上記遺伝子断片のヌクレオチド酉己列を決定したところ、 ァスペルギルス 'ニジ ュランス由来アミノぺプチダーゼ EAPに相同な完全長配列を含むことが明らかと なったため、 この遺伝子はァスペルギルス 'ォリゼにおいて、 ァスペルギルス - ニジュランス EAPに対応するアミノぺプチダ一ゼをコードする遺伝子であると推 定した。 また、 ァスペルギルス ·ォリゼのゲノム DNAを錶型に、 配列番号 2 7と 2 8に示すプライマ一を用いて PCRを行うことにより、 イントロンを 5個含む約 1800b のヌクレオチド配列を得ることができる。 このイントロンを含むァスぺ ルギルス ·ォリゼのゲノム配列を配列番号 4に示す。 また、 ァスペルギルス 'ォ リゼ由来アミノぺプチダ一ゼをコ一ドする全長 cMAのヌクレオチド配列を配列 番号 6に、 ァスペルギルス ·ォリゼ由来ァミノぺプチダ一ゼのァミノ酸配列を配 列番号 7に示す。
この断片をプラスミド pUC19に挿入して得られたプラスミドでェシエリヒア ' コリ JM109株を形質転換した。 また、 cDNAの上流に trpプロモー夕一を接続し、 発現用べクタ一 pUCtrpoGX を得た。 得られたぺクタ一でエシュリヒア 'コリ JM109株を形質転換した。 実施例 3 . ァスペルギルス '二ジュランスおよびァスペルギルス 'ォリゼ由来 EAPに相同な、 ァスペルギルス ·ニガ一由来の EAP cDNAのクロ一ニング
( 1 ) ァスペルギルス ·ニガ一由来ァミノぺプチダ一ゼ cDNAの取得
ァスペルギルス ·ニガ一 （JCM2261) を、 1.5%分離ダイズを含む培地 50ml で 30°C；、 64時間培養した。 菌体をろ過により集め、 l gを回収した。 この菌体を 直ちに液体窒素で凍結し、 乳鉢で粉砕した後、 Plant Mini Kit (QIAGEN社）を用 いて全 RNA の調製を行い、 oligotex-dT30く Super>mRNA Purification Kit (TaKaRa社） を用いて mRNAの調製を行った。 この mRNAから、 TaKaRa RNA PGR Ki t ( AMV ) Ver .2 · 1 ( TaKaRa社）を用い cMAを合成した。
( 2 ) ァスペルギルス ·ニジュランスおよびァスペルギルス ·ォリゼ由来 EAPに 相当するァスペルギルス 'ニガ一由来 EAPのクローニング
実施例 1で得たァスペルギルス ·ニジュランスおよび実施例 2で得たァスペル ギルス 'ォリゼの EAPの配列間で 100%のホモロジ一がある配列部分に、 配列番 号 2 9および配列番号 3 0で示したプライマ一を設計した。 両プライマ一を用い て、 ァスペルギルス ·ニガ一由来アミノぺプチダ一ゼ EAPの部分的な cDNAを取 得した。 これをテンプレートとし、 配列番号 3 1で示したオリゴヌクレオチドと dTプライマーアダプタ一プライマーを用いた 3， RACEおよび酉 3列番号 3 2を用 いた 53 RACEによって、 ァスペルギルス '二ジュランスおよびァスペルギ ス · ォリゼ由来 EAPに相同なァスペルギルス ·ニガ一由来 EAPの cDNAのクローニン グを行った。 3' RACE には、 3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Endsdnvitrogen 社）を、 5 ' RACE には、 5， RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends( Invitrogen社)を用いた。
(部分的 cDNA取得用 5， 側プライマ一）
TTG TCC TTT GTC AAT GC (配列番号 2 9 )
(部分的 cDNA取得用 3' 側プライマ一）
CGG ATA CTG TGC ATG GTT (配列番号 3 0 )
(35 RACE用プライマー） CAA C GGG CCC TGT TAT C (配列番号 3 1 )
(5， RACE用プライマ一）
CTT TGC CGA CT6 AAC GGC (配列番号 3 2 )
3， RACEの PCR反応は、 95°Cで 9分熱変性した後、 94°C 30秒、 60°C 30秒、 72°C 1分の反応を 35サイクル行った。 これにより約 120bpのァスペルギルス · ニジュランスおよびァスペルギルス 'ォリゼ由来 EAPに相同な遺伝子断片を得た。
5' RACEの PCR反応は、 94°C 30秒、 53°C 30秒、 72°C 1分の反応を 35サイク ル行った。 これにより約 lOObpの、 スペルギルス '二ジュランスおよびァスぺ ルギルス ·ォリゼ由来 EAPに相同なァスペルギルス■ニガ一遺伝子断片を得た。 配列番号 3 3と 3 4に示した配列を用いて PCR反応を行うことにより、 全 0RFを 含む、 約 1500bpのヌクレオチド配列を得た。 PCR反応は、 94°C 30秒、 54°C 30秒、 72°C 45秒の反応を 2 5サイクル行った。
(3， 末端用プライマ一）
GTA AGG AGG TTT AAA ATG ACT TCG AAA ATC GCC C (配列番号 3 3 )
(5' 末端用プライマ一）
CTA ATC AAC AAA GAT GGT CTT GGA AA6 ATT GGC G (配列番号 3 4 ) 上記遺伝子断片をもとに、 ァスペルギルス ·二ガー由来 EAPをコ一ドする全長 cDNAのヌクレオチド配列を決定し、 配列番号 9に示した。 また、 ァスペルギル ス■二ガー由来 EAPのアミノ酸配列を配列番号 1 0に示した。
この断片をプラスミド PUC19に揷入して得られたプラスミドでェシエリヒア · コリ JM109株を形質転換した。 また、 cDMの上流に trpプロモー夕一を接続し、 発現用ベクター pUCtrpnigGX を得た。 得られたベクターでエシュリヒア ·コリ JM109株を形質転換した。 実施例 4 . サヅカロマイセス由来のダイズ由来 GX に相同な遺伝子のクロ一ニン
( 1 ) サヅカロマイセス由来ゲノム DNAの取得
サヅカロマイセス YPH500 (IF010506) を、 YPD ( 1 %ィ一ストエキス、 2 %ぺプ トン、 2 %グルコース） とアデニンからなる培地 50ml を用い、 30°Cで一晩培養 した。 培養液から、 Genとるくん （酵母用） （TaKaEa社） を用いてゲノム DNAを 抽出した。
( 2 ) ダイズ GXに相当するサヅカロマイセス由来 EAPのクロ一ニング サヅカロマイセスのゲノムデ一夕ペースから、 特開平 9-294583記載のダイズ GXの配列とホモロジ一のある配列を検索したところ、 43 のホモロジ一の見られ る配列が確認され、 開始コドンおよび終止コドンの位置が特定された。 これを基 に、 配列番号 3 5および配列番号 3 6で示したプライマ一を設計し、 両プライマ 一を用いて、 ゲノム DNAからサヅカロマイセス由来 EAPの遺伝子断片をクロ一二 ングした。
(5， 側プライマ一）
CTA TGT TCA GGA TAC AAC TGA GAA (配列番号 3 5 )
(3， 側プライマー）
CAG TTT AGA GAA CAA TTT GAG ATT (配列番号 3 6 ) 上記遺伝子断片をもとに、 サッカロマイセス由来 EAPをコードする全長 DNAの ヌクレオチド配列を決定し、 配列番号 1 2に示した。 また、 サッカロマイセス由 来 EAPのアミノ酸配列を配列番号 1 3に示した。
この断片をプラスミド pUC19に揷入して得られたプラスミドでェシエリヒア ' コリ JM109株を形質転換した。 また、 cDNAの上流に trpプロモー夕一を接続し、 発現用ぺク夕一 pUCtrpsGX を得た。 得られたベクターでエシュリヒア 'コリ JM109株を形質転換した。 実施例 5 . コリネ菌由来のダイズ GXに相同な遺伝子のクローニング
( 1 ) コリネ菌由来ゲノム DNAの取得
コリネ菌 （ATCC13869)を、 LB培地 （トリプトン 1 %、 酵母エキストラクト 0.5%、 塩ィ匕ナトリウム 1 %) 50mlを用い、 30°Cで一晩培養した。 培養液から、 Genとる くん （酵母用） （TaKaRa社） を用いてゲノム DNAを抽出した。
( 2 ) ダイズ GXに相当するコリネ菌由来ァミノぺプチダーゼのクロ一ニング コリネ菌のゲノムデータベースから、 特開平 9-294583記載のダイズ由来アミ ノぺプチダーゼの配列とホモロジ一のある配列を検索したところ、 ァスパルチル アミノぺプチダーゼをコードする配列と 48%のホモロジ一が確認された。 これを 基に、 配列番号 3 7および配列番号 3 8で示したプライマ一を設計し、 両プライ マ一を用いて、 ゲノム DNAからコリネ菌由来 EAPの遺伝子断片をクローニングし た。
(5， 側プライマ一）
GTA AGG AGG TTT AAA ATG CAT GTA ACT GAC GAT TTC TTA AGT TTT ATT GCC C
(配列番号 3 7 )
(3' 側プライマ一）
TTA ATT TAC CAG ATA GGC TTC CAG GGC TT (配列番号 3 8 ) 上記遺伝子断片をもとに、 コリネ菌由来 EAPをコードする全長 DNAのヌクレオ チド配列を決定し、 配列番号 1 5に示した。 また、 コリネ菌由来 EAPのアミノ酸 配列を配列番号 1 6に示した。 この断片をプラスミド PUC19に挿入して得られたプラスミドでェシヱリヒア - コリ JM109株を形質転換した。 また、 cDNAの上流に trpプロモ一夕一を接続し、 発現用べク夕一 pUCtrpcGX を得た。 得られたベクタ一でエシュリヒア ·コリ JM109株を形質転換した。 実施例 6 . ァスペルギルス '二ジュランス EAP、 ァスペルギルス 'ォリゼ EAP、 ァスペルギルス ·ニガ一 EAP、 酵母 EAP、 およびコリネ EAP のェシエリヒア 'コ リ JM109株における大量発現
( 1 ) ァスペルギルス '二ジュランス EAP、 ァスペルギルス 'オリゼ EAP、 ァス ペルギルス ·ニガ一 EAP、 酵母 EAP、 およびコリネ EAPの精製
pUCtrpGXで形質転換した菌をリフレツシュ培地 （トリプトン 1%, ィ一スト ' エキストラクト 0.5%， NaCl 0.5% グルコース 0.1%) にて、 30°Cで 8時間振とう 培養した。 次いで、 得られた培養液 5mlを 350mlカザミノ酸培地 (N HP04 0.6% KH2P04 0.3%, NH4C1 0. 1% NaCl 0.05% カザミノ酸 ， チアミン 0.0002%， MgS04 ImM, CaCl2. ImM, グルコース 0. 1%)にて 37°Cで 20時間培養した。 ただし、 コリネのみ培養温度を 34°Cとした。得られた菌体を定法に従って破砕し、 細胞 抽出液を得た。 この細胞抽出液に硫酸アンモニゥムを添カ卩し、 40% - 65%硫安沈殿 画分を取得した。 ただし、 酵母のみ 0°/- 40%画分を取得した。 上記画分を 50mMリ ン酸緩衝液 (PH7.5)に懸濁し、 あらかじめ前述のリン酸緩衝液で平衡化したゲル ろ過カラム （アマシャムバイオテク社製 sephadex200) にて分離を行い、 粗精製 EAP を得ることができた。得られた酵素溶液を限外ろ過にて濃縮した。 粗精製 EAPは陰イオン交換カラム （アマシャムバイオテク社製 ] nonoQ) にて更に分離操 作を行い、 精製 EAPを得た。
得られた精製 EAPは未変性ポリアクリルアミドゲル上で約 300〜480kDの分子 量を示し、 変性ポリアクリルアミドゲル上で約 40〜60kDの分子量を示した。 実施例 7 . アミノぺプチダ一ゼ EAPの特性解析
上述のように調製した酵素精製液中のァミノぺプチダーゼ活性を以下のように 測定した。 即ち、 5 mM Glu-Glu (50mM HEPESバッブァ一、 pH7.5) 0.16mlに酵素 精製液 0.02mlを加え、 37°Cで 10分間反応させた後、 20% 酢酸を 0.02ml添加し て反応を停止した。 反応液中の遊離 Glu量をグルタミン酸測定キット （ャマサ醤 油社) ·を用いて測定した。 活性は 1分間あたりに 1〃molの Gluを生成する酵素 活性を 1ュニヅト （U) とした。
その結果、 得られた精製アミノぺプチダ一ゼ酵素の酵素学的諸性質を示す。
( i )基質特異性
EAP の活性測定は、 Glu-pNA を基質として用いても可能である。 即ち、 lmM Glu-pNA (50mMリン酸ナトリゥムバッファ一、 pH7.5) 0.75mlに酵素溶液、 0.02ml を加え、 37°Cで 10分間反応させた後、 40% 酢酸を 0.25ml添加して反応を停止 した。 反応液の 405nmの吸光度を測定し、 活性を測定した。 活性は 1分間あたり に l〃molのパラ二トロア二リドを生成する酵素活性を 1ユニット （U) とした。 Glu-pNAの代わりに X-pNAを用い、 各種 X- pNAの分解活性を測定した。 最大の分 解活性値を 100とした時の相対活性値を図 1に示す。 本酵素は N末端の酸性ァミ ノ酸、 即ちグルタミン酸とァスパラギン酸の 2種類を特異的に効率よく分解する ことがわかった。
( ) 温度反応特性
前記 Glu-Gluを基質とした活性測定法において、 各種温度で EAP活性を測定し た。 37°Cでの活性値を 100とした時の相対活性値を図 2に示す。 図 2から、 30°C 〜60°Cの範囲、 より好ましくは 37°C〜50°Cの範囲で相対活性が高いことが分か ( iii ) 温度安定性
前記 Glu-Gluを基質とした活性測定法において、 各種温度で EAPを 10、 20、 30、 40、 60分保存した後、 前記活性測定方法で EAP活性を測定した。保存時間 0 分の際の活性値を 100としたときの相対活性値を図 3に示す。
ァスペルギルス 'ォリゼ EAP、 ァスペルギルス ·ニジュランス EAPおよびァス ペルギルス ·ニガ一 EAPを、 pH7.5、 25°C〜40°C、 1時間保存した後に 80%以上 の残存活性を示した。 また、 コリネ EAPおよび酵母 EAPを、 pH7.5、 25°C〜50°C！、 1時間保存した後に 80%以上の残存活性を示し、 pH7.5、 25〜60°C30分加熱にお いて、 未加熱時の活性の 4 0 %以上の活性を有していた。
( iv ) pH反応特性
前記 Glu-Glu を基質とした活性測定法において、 50 HEPES バッファ一 (PH7.5) の代わりに、 終濃度 50mMとなるよう、 各 pHの GTA緩衝液を反応液に 加えた。 PH7.5中における EAP活性を 100とした。 各 pHにおける活性を図 4に 示す。 図 4より、 pH6.0〜9.0 の範囲において、 至適 p Hでの活性の 5 0 %以上 の活性を有していた。
( v ) pH安定性
精製酵素を 50mMの各種 pHの GTA緩衝液中、 0°Cで 24時間保存した後、 前記 活性測定方法 （PH7.5) で EAP活性を測定した。 保存前の活性値を 100とした時 の相対活性値を図 5に示す。 ァスペルギルス 'オリゼ EAP、 ァスペルギルス ·二 ジュランス EAP、 ァスペルギルス■二ガー EAPおよび酵母 EAPにおいて、 pH6.0 〜10.0の範囲で 0°Cにて 24時間保存した場合に 90%以上の残存活性を示した。 また、 コリネ EAPにおいて、 pH7.0〜8.0の範囲で 0 °Cにて 24時間保存した場合 に 90%以上の残存活性を示した。 ( i ) ペプチド長に対する反応特性
Glu-Glu基質を用いる代わりに、 Gluを N末端に持つ、 アミノ酸残基数の異な る他の基質を用いてアミノぺプチダーゼの活性を測定した。 即ち、 5 mM各基質 (50mM HEPESバッファ一、 pH7.5) 0, 16mlに酵素精製液 0.02mlを加え、 37°Cで 10分間反応させた後、 20%酢酸を 0.02ml添加して反応を停止した。 反応液中 の遊離 Glu量をグルタミン酸測定キット （ャマサ醤油社） を用いて測定した。 活 性は 1分間あたりに 1〃molの Gluを生成する酵素活性を 1ュニット （U) とし、 重量あたりの活性値である比活性 (ϋ/mg)を算出して図 6に示した。 用いた基質は、 (a)Glu-Glu (Bachem社)、 (b) Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly (Bachem社） （配列番号 3 9 ) 、（c) Glu-Gly-Val-Tyr-Val-His-Pro-Val (Bachem社） (配列番号 4 0 )、 (d)Asp-Glu (Bachem社） の 4種類である。 図 6より、 ジペプチドに対する活性 に比べ、 長鎖べプチドに対する活性が高い傾向にある。 実施例 8 . 天然調味料に対する呈味増強効果
「本造り一番だし極味かつお」 （味の素社） に各種精製 EAPを 0.1mg/ml添カロし、 37°Cで反応させ、 0、 60、 120分後に経時的にサンプリングした。 そして、 サン プリングした反応溶液中の遊離 Glu量を、 グルタミン酸測定キット （ャマサ醤油 社） を用いて測定した。 また、 120分反応後のサンプルを 20倍希釈し、 官能評 価を行った。
その結果、 ァスペルギルス ·ォリゼ EAP、 ァスペルギルス ·二ガー EAP、 酵母 EAPは、 120分間の反応により遊離 Glu量を約 300mg/l増加させた（図 7参照)。 一方、 コリネ EAPによる増加は、 その 3分の 1程度であった。 また、 官能評価に よるうま味強度は、 遊離 Glu量に比例していた (表 2参照)。
3 表 2
Figure imgf000033_0001
—：変化無し； + :やや上昇； + + :上昇； + + + :顕著に上昇 実施例 9 . 呈味の強いタンパク質加水分解物の作製
5%分離ダイズ夕ンパク溶液を PH8.0に調製し、 121°C、 20分間オートクレープ 滅菌することにより熱変性を行った。 得られたタンパク溶液に、 ダイズ夕ンパク 質量に対してゥマミザィム 1% (アマノエンザィム社)、 プロテア一ゼ Ml% (ァマノ ェンザィム社） を添加し、 50°Cにて 48時間反応を行った。 その後、 ァスペルギ ルス ·ォリゼ EAPを 0.2% (質量％) 添加し、 37°Cにて 24時間反応を行った。 ァ スペルギルス 'オリゼ EAP添加サンプルと、 未添加サンプル中に含まれる遊離 Glu量をグルタミン酸測定キット （ャマサ醤油社） を用いて測定した結果、 遊離 Glu量がァスペルギルス ·ォリゼ EAPの添加によって約 1.5倍に増カ卩した（図 8 参照)。
上記と同様に処理したダイズ夕ンパク溶液に、 アルカラ一ゼ 1% (ノボザィム 社）を添加し、 50°Cにて 48時間反応を行った。 その後、 121°Cにて 10分間アル力 ラーゼを失活させ、 フレーバーザィム 1% (ノボザィム社）を添加し、 37°C24時間 の条件で反応を行った。 その後、 ァスペルギルス 'オリゼ EAPを添加し、 さらに 37°Cにて 24時間反応を行った。 ァスペルギルス ·ォリゼ EAPを添加したサンプ ルと未添加サンプル中に含まれる遊離 Glu量を上記と同様に測定した結果、 ァス ペルギルス■ォリゼ EAPの添加によって遊離 Glu量が約 2.2倍に増加した（図 9 参照）。 実施例 1 0 . 乳製品の呈味および/または風味の改善
ァスペルギルス ·ォリゼ EAP添カ卩のチーズへの効果を確認した。原料乳は同一 生乳 (約 35L)を使用した。所定の方法にて脱脂後、 脂肪率は 3 %に調乳した。 所 定量の乳酸菌ス夕一夕一を添加後、 原料乳を 32°Cに加温し、 キモシンを原料に 対し 0.003%添加した。原料乳が凝固している事を確認後、 カッティング、 攪拌 し、 約 1/3のホェ一を排除した。 次に 34°Cまで l °C/2minのスピードでゆつく り昇温、 攪拌し、 更に 1/3 のホェ一を排除した。 その後、 38°Cまで l °C/2min のスピードでゆっくり昇温し、 1時間攪拌した後、 ホェ一オフし、 カードを得た。 ァスペルギルス ·ォリゼ EAP添加量は力一ド 100gに対し 0.5mgとした。 このと きコントロール群は酵素無添加とした。 酵素はカード 1500gに直接添加し、 均一 になるように良くかき混ぜた。 使用乳酸菌は、 クリスチャン ·ハンゼン社の 4種 混合乳酸球菌 (ゴーダチーズ)使用した。 なお力一ド重量に対して 3 %の食塩を添 加した。 高温 (10°C )熟成のため、 酪酸菌を抑制のため硝酸 Naを 0.002%原料乳 に加えた。 製造日から翌朝で予備乾燥した後、 チーズ約 375gのカードをモール ドに添加した。 試験期間を短縮するため熟成は、 真空包装の後に 1 0 °Cの熟成室 に保管した。 140日保管後、 官能評価した。
ァスペルギルス 'ォリゼ EAP添加による熟成率 （可溶化窒素率） の上昇は無添 加のコントロールと比較して有意な差は認められなかった。 可溶化窒素率は 1 2 %トリクロロ酢酸に可溶性の画分の窒素量を、 全窒素量に対する比率で求めた。 一方、 ァスペルギルス *ォリゼ EAP添加による遊離グルタミン酸の増加量は lmg/100gチーズであった。 官能評価の結果、 ァスペルギルス 'ォリゼ EAP添カロ により、 チーズ風味が強まる、 全体のまとまり感が出る、 食感が滑らかになる等 の効果が認められた。 またチーズの苦味がァスペルギルス 'ォリゼ EAP添加によ り消失していたが、 これは遊離グル夕ミン酸の上昇による効果と推測された。 実施例 1 1 . 飲料の呈味および/または風味の改善 (I )
トマト （桃太郎、 およびプチトマト） を洗浄後、 家庭用ミキサーで粉砕しトマ ト果汁を調製した。 本果汁 100m 1にァスペルギルス 'ォリゼ EAPを 3mg/lの濃 度に添加した。 コントロールとして予め熱失活させたァスペルギルス 'オリゼ EAPを添加した。 反応は 3 7 ° 1時間で、 反応後の果汁を官能評価した。
ァスペルギルス ·ォリゼ EAP処理により遊離のグル夕ミン酸は約 3 %増加した。 しかしトマト果汁中には元来 0.2% (W/W) の遊離グルタミン酸が存在してい るため、 3 %の遊離グル夕ミン酸含量増加によるうま味強度の影響は認められな かった。 一方で、 酵素処理群は甘味が強まり、 かつ酸味が抑制されていたため、 トマ卜果汁独特の抵抗感が弱まっていた。 この呈味および/または風味改質効果 はコントロール群では認められなかった。 なお、 ァスペルギルス ·ォリゼ EAPの トマトへの効果はプチトマトや、 熟成の進んだトマトで顕著であつた。 実施例 1 2 . 飲料の呈味および/または風味の改善（II)
市販の豆乳飲料 （国産豆乳；太子食品工業株式会社） 100m 1にァスペルギル ス ·ォリゼ EAPを 3mg/lの濃度に添加した。 コントロールとして予め熱失活した ぺプチダーゼを用いた。 これらを 3 7 °Cで 1時間酵素反応させた後、 官能評価に 供した。
豆乳へのァスペルギルス ·ォリゼ EAP処理によるグル夕ミン酸量の増加は認めら れなかった ό よってうま味強ィ匕は認められなかった。 しかし酵素添加群はコント ロール群と比較して、 豆乳独特の青臭さ （へキサナール臭） が弱まっており、 尚 且つ、 まろやかに変化しており、 豆乳に対する呈味および/または風味改質効果 が確認できた。 · 本発明により、 遊離アミノ酸量が高く、 呈味の増強された飲食品を製造する方 法が提供される。 特に、 醤油醸造条件下などで存在する Glu-Gluといった難分解 性ペプチドを効率よく分解し、 呈味の強い調味液をつくることができる。 市販の プロテア一ゼ、、、 ぺプチダ一ゼ製剤と併用することによってタンパク質加水分解 物中の遊離 Glu量を上昇させることができる。 これは、 市販のプロテア一ゼ、 ぺ プチダ一ゼ製剤には EAP様活性を有する酵素が殆ど含まれておらず、 Glu-Gluと いった難分解べプチドがそのまま存在しているからであると考えられる。 このよ うに、 本発明によりアミノぺプチダ一ゼ EAPを用いることによって、 醤油、 タン ノ ク質加水分解物などの飲食品の呈味性をさらに高めることが可能となる。'

Claims

請求の範囲
1·. 以下の酵素特性を示す微生物由来のアミノぺプチダーゼを、 必要によりプロ テア一ゼの共存下でタンパク質原料に作用させることを含む、 呈味および Ζまた は風味の改善された飲食品の製造方法：
( a ) ペプチド及び Z又はタンパク質の N末端からグルタミン酸、 ァスパラギン 酸を特異的に遊離する反応を触媒する活性を有する；
( b ) pH6.0〜9.0において至適 pHでの活性の 50%以上の活性を有する；
( c ) ρΗ7.5Ν 25~60°C、 30分加熱において、 未加熱時の活性の 40%以上の活 性を有する；
( d ) SDS-PAGE により測定した分子量が約 40〜60k Dであり、 未変性- PAGE に より測定した分子量が約 300〜480k Dである；および、
( e ) Glu-Gluジぺプチドに対する分解活性が ΙΟϋ/mg以上を示す。
2 . アミノぺプチダーゼが、 配列番号 2に記載のヌクレオチド配列を有する核酸 分子によってコードされる、 または、 配列番号 2に記載のヌクレオチド配列を有 する核酸分子とストリンジヱン卜な条件下でハイプリダイズし得る核酸分子によ つてコードされるアミノぺプチダ一ゼである、 請求項 1記載の方法。
3 . アミノぺプチダーゼが、 配列番号 6に記載のヌクレオチド配列を有する核酸 分子によってコードされる、 または、 配列番号 6に記載のヌクレオチド配列を有 する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る核酸分子によ つてコードされるァミノぺプチダーゼである、 請求項 1記載の方法。
4 . アミノぺプチダーゼが、 配列番号 9に記載のヌクレオチド配列を有する核酸 分子によってコードされる、 または、 配列番号 9に記載のヌクレオチド配列を有 する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得る核酸分子によ つてコードされるアミノぺプチダーゼである、 請求項 1記載の方法。
5 . アミノぺプチダーゼが、 配列番号 1 2に記載のヌクレオチド配列を有する核 酸分子によってコードされる、 または、 配列番号 1 2に記載のヌクレオチド配列 を有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイプリダイスし得る核酸分子 によってコードされるアミノぺプチダーゼである、 請求項 1 載の方法。
6 . 配列番号 1 5に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードさ れる、 または、 配列番号 1 5に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子とスト リンジェントな条件下でハィブリダイズし得る核酸分子によってコードされるァ ミノぺプチダーゼを必要によりプロテア一ゼの共存下で夕ンパク質原料に作用さ せることを含む、 呈味および/または風味の改善された飲食品の製造方法。
7 . アミノぺプチダーゼが形質転換微生物により生産されるものである請求項 1 〜 6のいずれか 1項記載の方法。
8 . 飲食品が調味料又は夕ンパク質加水分解物又はチーズ又はトマト果汁含有飲 料又は豆乳含有飲料である請求項 1〜 7のいずれか 1項記載の方法。
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