WO2004024770A1 - Anticuerpos policlonales, método de preparación y uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos policlonales, método de preparación y uso de los mismos Download PDF

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Manuel Sarasa Barrio
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Universidad De Zaragoza
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    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Definitions

  • the present invention relates to polyclonal antibodies that specifically recognize and with great affinity to the two most important amyloid peptides, A ⁇ 40 and A ⁇ 42, as well as their use in the evaluation of both degradation activating drugs of the characteristic amyloid peptides of Alzheimer's disease as a drug that inhibits its formation.
  • they can be useful for the evaluation of the activity of the enzymes involved in the processing of the precursor protein of said peptides or the activity of the enzymes involved in the degradation thereof, as well as of the assessment of the level of expression of the genes involved in all the machinery of events that lead to the deposit and formation of amyloid plaques, characteristic lesions of the brains of patients suffering from Alzheimer's disease.
  • MNF neurofibrillar tangles
  • intraneuronal neurofibrillar tangles are also present in other degenerative diseases, but the presence of amyloid deposits in both the interneuronal spaces (neuritic plaques) and in the surrounding microvasculature (vascular plaques) it seems to be characteristic of Alzheimer's. Of these, the neuritic plaques appear to be the most characteristic (Price, DL et al., Drug Development Research (1985) 5: 59-68).
  • amyloid plaques The main component of these amyloid plaques is a 40-42 amino acid peptide called A ⁇ 4 amyloid peptide.
  • the A ⁇ 4 amyloid peptide is a polypeptide originated by proteolysis from membrane glycoproteins called A ⁇ 4 amyloid peptide precursor proteins ( ⁇ APP). Being these precursor proteins of the amyloid peptide constituted by 695 to 770 amino acids, all of them being produced by the same gene.
  • ⁇ APP A ⁇ 4 amyloid peptide precursor proteins
  • the chicken embryo processes ⁇ APPs in such a way that A ⁇ 4 peptide is produced, due to the action of proteolytic enzymes that cause proteolysis of ⁇ APPs at a key site to produce A ⁇ 4, the proteolytic enzyme that cuts ⁇ APPs for produce A ⁇ 4 is called ⁇ -secretase.
  • the present invention provides polyclonal antibodies, capable of specifically recognizing by any conventional immunological technique (western blot, immunohistochemistry, immunoprecipitation, ELISA, RIA, ...) of the presence of the amyloid peptides A ⁇ 40 and A ⁇ 42, obtained by mammalian immunization, preferably rabbits, with a protein conjugated to a peptide selected from a group consisting of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, optionally shortened by elimination of amino acid residues from the ends N-terminal and / or C-terminal, and optionally elongated by adding the appropriate amino acid residues to conjugate the protein.
  • the peptide corresponds to SEQ ID NO 1, optionally elongated by adding the appropriate amino acid residues to conjugate the protein.
  • the peptide corresponds to SEQ ID NO 2, optionally elongated by adding the appropriate amino acid residues to conjugate the protein.
  • the peptide corresponds to SEQ ID NO 3, optionally elongated by adding the appropriate amino acid residues to conjugate the protein.
  • the peptide corresponds to
  • SEQ ID NO 4 optionally elongated by adding the appropriate amino acid residues to conjugate the protein.
  • the preferred peptides are those of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4.
  • This invention also provides a method for obtaining the aforementioned polyclonal antibodies by immunization of mammals, preferably rabbits, with a protein conjugated to a peptide selected from a group consisting of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, optionally shortened by elimination of the amino acid residues from the N-terminal and / or C-terminal ends, and optionally elongated by addition of the appropriate amino acid residues to conjugate the protein.
  • a protein conjugated to a peptide selected from a group consisting of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, optionally shortened by elimination of the amino acid residues from the N-terminal and / or C-terminal ends, and optionally elongated by addition of the appropriate amino acid residues to conjugate the protein.
  • the protein used for conjugation with the peptide is barnacle hemocyanin (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin in English).
  • the mammals used, for their immunization with the protein conjugated to the peptide are rabbits.
  • a new method for the evaluation of both degradation activating drugs of the amyloid peptides characteristic of Alzheimer's disease, and of drugs inhibiting their production, by the use of antibodies polyclonal described above.
  • the method also serves to assess the activity of the enzymes (proteases) involved in the processing of the precursor protein of said peptides or the activity of the enzymes involved in the degradation thereof.
  • This invention also provides a method for detecting the presence or absence of the amyloid peptides A ⁇ 40 and A ⁇ 42 in a sample, using the chicken embryo or any of the membranes or extra-embryonic liquids of the chicken embryonated egg, as an animal test model.
  • a new method for the evaluation of both degradation activating drugs of the amyloid peptides characteristic of Alzheimer's disease, and of drugs that inhibit their production, by using the chicken embryo or any of the membranes or extraembryonic liquids of the chicken embryonated egg, as an animal test model.
  • a new method for assessing the activity of enzymes (proteases) involved in the processing of the precursor protein of said peptides or the activity of enzymes involved in the degradation of the enzymes is provided. same, by using the chicken embryo or any of the membranes or extraembryonic liquids of the chicken embryo egg, as an animal test model.
  • the method consists of inoculating the drug in the chicken embryonated egg, and by simple drip on the embryo itself or any of its membranes, either by injection into the vitellus (if the embryo is young) or yolk sac (if the embryo is older), in the amniotic sac, in the allantoic sac (in embryos of more than 6 days of incubation) or inside the embryo itself and, after the appropriate incubation time, the embryo and / or any of the extra-embryonic membranes or liquids are removed and the amount of amyloid peptides, characteristic of Alzheimer's disease, is analyzed, by conventional laboratory techniques for the quantification of peptides and proteins such as western blot, immunohistochemistry, immunoprecipitation, ELISA, RIA, HPLC, etc.
  • the peptides were coupled to the barnacle hemocyanin protein (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin), via n-terminus, using the glutaraldehyde coupling agent.
  • KLH barnacle hemocyanin protein
  • the synthetic peptide was added and the 0.3% glutaraldehyde salutation was slowly added while stirring at room temperature.
  • 1M glycine to block the non-reactive glutaraldehyde
  • the peptide-protein conjugate was dialyzed against 3 liters of pH 8.5 borate buffer at a temperature of 4 ° C.
  • the Peptide-KLH conjugate was stored at 4 ° C.
  • the four polyclonal antibodies were generated by immunization of New Zealand White rabbits against the four KLH-coupled peptides that were used as immunogens.
  • Each immunogen was injected into two rabbits, with five injections: the first intradermal injection of the peptide-KLH conjugate in PBS and emulsified in complete Freund's adjuvant and four more intramuscular, as a souvenir dose on days 14, 28, 49 and 80, of the same peptide-KLH conjugate in PBS but this time emulsified in incomplete Freund's adjuvant, control bleeding at 90 days being performed to detect the presence of antibodies.
  • affinity antibodies were purified on a matrix composed of 1.5 ml of EMD-Epoxy activated material (Merck) to which 5mg of the corresponding peptide was added. .
  • the purified fractions were stabilized in 0.1% BSA (Sigma) and stored at 4 ° C, with glycerol 20-50% being added as a cryoprotectant.
  • Antibody titration by ELISA After affinity purification the antibody titer was determined by ELISA. For this, the antigen was placed on a Nunc Maxi Sorb ELISA plate at a rate of 50ng / 50 ⁇ l in PBS pH 7, and the donkey anti-IgG antibody conjugated to alkaline phosphatase was detected, using p-nitrophenyl phosphate (PNPP as substrate) ) in diethanolamine with 5mM MgCl 2 , pH 9.6 and developed at 2 hours.
  • PNPP p-nitrophenyl phosphate
  • the antibodies were generated using the different synthetic peptides described above coupled to KLH. These synthetic peptides contain a very small number of amino acids, which makes them very suitable for the chain production of homogeneous antibodies, with predefined epitopes.
  • amino acids are abbreviated using the one-letter codes accepted in the field, in the form shown below:
  • Trp tryptophan

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Abstract

Anticuerpos policlonales que reconocen específicamente y con gran afinidad a los dos péptidos amiloides más importantes, el Ab40 y el Ab42, así como a su empleo en la valoración tanto de fármacos activadores de la degradación de los péptidos amiloides característicos de la enfermedad de Alzheimer como de fármacos inhibidores de su formación.

Description

Anticuerpos policlonales, método de preparación y uso de los mismos.
La presente invención se refiere a anticuerpos policlonales que reconocen específicamente y con gran afinidad a los dos péptidos amiloides más importantes, el Aβ40 y el Aβ42, así como a su empleo en la valoración tanto de fármacos activadores de la degradación de los péptidos amiloides característicos de la enfermedad de Alzheimer como de fármacos inhibidores de su formación. Del mismo modo, pueden ser útiles para la valoración de la actividad de las enzimas implicadas en el procesamiento de la proteína precursora de los citados péptidos o la actividad de las enzimas implicadas en la degradación de los mismos, así como de la valoración del nivel de expresión de los genes implicados en toda la maquinaria de eventos que conducen al depósito y formación de placas amiloides, lesiones características de los cerebros de pacientes que sufren la enfermedad de Alzheimer.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Se conocen determinados factores acerca de los fenómenos bioquímicos y metabólicos asociados a la presencia de la enfermedad de Alzheimer. Dos cambios morfológicos e histopatológicos observados en cerebros de pacientes con la enfermedad de Alzheimer son marañas neurofibrilares (MNF) y depósitos amiloides.
Las marañas neurofibrilares intraneuronales están también presentes en otras enfermedades degenerativas, pero la presencia de depósitos de amiloide tanto en los espacios interneuronales (placas neuríticas) como en la microvasculatura circundante (placas vasculares) parece ser característica del Alzheimer. De éstas, las placas neuríticas parecen ser las más características (Price, D.L. y col. , Drug Development Research (1985) 5:59-68).
El componente principal de estas placas amiloides es un péptido de 40-42 aminoácidos denominado péptido amiloide Aβ4.
El péptido amiloide Aβ4 es un polipéptido originado por proteolisis a partir de unas glucoproteínas de membrana denominadas proteínas precursoras del péptido amiloide Aβ4 (βAPP) . Estando estas proteínas precursoras del péptido amiloide constituidas por 695 a 770 aminoácidos, siendo todas ellas producidas por el mismo gen.
Se han identificado dos variantes principales del péptido amiloide Aβ4 , el péptido Aβ40 y el Aβ42, de 40 y 42 aminoácidos respectivamente, que presentan una distribución tisular diferente en condiciones tanto fisiológicas como patológicas.
Nosotros hemos clonado y secuenciado el gen de la βAPP en el' pollo y hemos demostrado que es prácticamente idéntico al gen humano, pues produce βAPPs con una enorme homología, del orden del 95%, a las de la especie humana, y el péptido Aβ4, característico de la enfermedad de Alzheimer, es idéntico al humano. Además, el embrión de pollo procesa a las βAPPs de tal forma que se produce péptido Aβ4 , debido a la acción de unas enzimas proteolíticas que provocan la proteolísis de las βAPPs en un sitio clave para producir Aβ4 , la enzima proteolítica que corta las βAPPs para producir Aβ4 es denominada β-secretasa.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona anticuerpos policlonales, capaces de reconocer específicamente mediante cualquier técnica inmunológica convencional (western blot, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, ELISA, RÍA, ...) de la presencia de los péptidos amiloides Aβ40 y Aβ42, obtenidos por inmunización de mamíferos, preferiblemente conejos, con una proteína conjugada con un péptido seleccionado a partir de un grupo que consiste en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 , SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, opcionalmente acortados por eliminación de los restos de aminoácido de los extremos N-terminal y/o C-terminal, y opcionalmente alargados por adición de los restos de aminoácido apropiados para conjugar la proteína.
En una realización particular, el péptido corresponde a SEQ ID NO 1, opcionalmente alargado por adición de los restos de aminoácido apropiados para conjugar la proteína. En otra realización particular el péptido corresponde a SEQ ID NO 2, opcionalmente alargado por adición de los restos de aminoácido apropiados para conjugar la proteína. En otra realización particular el péptido corresponde a SEQ ID NO 3, opcionalmente alargado por adición de los restos de aminoácido apropiados para conjugar la proteína. En otra realización particular el péptido corresponde a
SEQ ID NO 4, opcionalmente alargado por adición de los restos de aminoácido apropiados para conjugar la proteína. Aunque la eliminación de los restos aminoacídicos terminales no elimina la actividad específica, los péptidos preferidos son los de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4.
La provisión de cualquiera de los péptidos, substancialmente puros, antes mencionados es también parte de la presente invención.
Esta invención también proporciona un método para la obtención de los anticuerpos policlonales antes mencionados por inmunización de mamíferos, preferiblemente conejos, con una proteína conjugada a un péptido seleccionado a partir de un grupo que consiste en SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 , SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, opcionalmente acortados por eliminación de los restos de aminoácido de los extremos N-terminal y/o C- terminal, y opcionalmente alargados por adición de los restos de aminoácido apropiados para conjugar la proteína .
Según una forma de realización preferida de realización de la presente invención, la proteína utilizada para su conjugación con el péptido es la hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin en inglés) .
En una realización aún más preferida de la presente invención, los mamíferos utilizados, para su inmunización con la proteína conjugada al péptido, son conejos .
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo método para la valoración tanto de fármacos activadores de la degradación de los péptidos amiloides característicos de la enfermedad de Alzheimer, como de fármacos inhibidores de su producción, mediante el uso de los anticuerpos policlonales descritos anteriormente. Del mismo modo, el método sirve también para valorar la actividad de las enzimas (proteasas) implicadas en el procesamiento de la proteína precursora de los citados péptidos o la actividad de las enzimas implicadas en la degradación de los mismos.
Esta invención también proporciona un método para la detección de la presencia o ausencia de los péptidos amiloides Aβ40 y Aβ42 en una muestra, empleando el embrión del pollo o cualquiera de las membranas o líquidos extraembrionarios del huevo embrionado del pollo, como modelo animal de ensayo.
Según una realización preferida de la presente invención, se proporciona un nuevo método para la valoración tanto de fármacos activadores de la degradación de los péptidos amiloides característicos de la enfermedad de Alzheimer, como de fármacos inhibidores de su producción, mediante el uso del embrión del pollo o cualquiera de las membranas o líquidos extraembrionarios del huevo embrionado del pollo, como modelo animal de ensayo.
De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un nuevo método para valorar la actividad de las enzimas (proteasas) implicadas en el procesamiento de la proteína precursora de los citados péptidos o la actividad de las enzimas implicadas en la degradación de los mismos, mediante el uso del embrión del pollo o cualquiera de las membranas o líquidos extraembrionarios del huevo embrionado del pollo, como modelo animal de ensayo.
El método consiste en la inoculación del fármaco en el huevo embrionado del pollo, ya por simple goteo sobre el propio embrión o alguna de sus membranas, ya por inyección en el vitelo ( si el embrión es joven ) o saco vitelino ( si el embrión es más mayor ) , en el saco amniótico, en el saco alantoideo ( en embriones de más de 6 días de incubación ) o en el interior del propio embrión y, tras el tiempo adecuado de incubación, se extrae el embrión y/o cualquiera de las membranas o líquidos extraembrionarios y se analiza la cantidad de péptidos amiloides, característicos de la enfermedad de Alzheimer, mediante las técnicas convencionales de laboratorio para la cuantificación de péptidos y proteínas como western blot, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación , ELISA, RÍA, HPLC, etc.
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1.
Acoplamiento de los péptidos a hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin)
Los péptidos fueron acoplados a la proteína hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin) , vía n- terminus, utilizando el agente acoplante glutaraldehído. Para lo cual se activó la proteína KLH en solución de buffer borato pH 10. A continuación se añadió el péptido sintético y lentamente se añadió la salución de glutaraldehído 0.3% mientras se agitaba a temperatura ambiente. Tras la adicción de glicina 1M para bloquear el glutaraldehído no reaccionante, se dializó el conjugado péptido-proteína frente a 3 litros de buffer borato pH 8.5 a temperatura de 4 °C. El conjugado péptido-KLH se almacenó a 4 °C.
Ejemplo 2.
Generación de los anticuerpos policlonales.
Los cuatro anticuerpos policlonales fueron generados por inmunización de conejos New Zealand White contra los cuatro péptidos acoplados a KLH que se utilizaron como inmunógeno .
Cada inmunógeno se inyectó en dos conejos, realizándose cinco inyecciones: la primera inyección intradérmica del conjugado péptido-KLH en PBS y emulsionados en adyuvante completo de Freund y cuatro más intramusculares, a modo de dosis de recuerdo en los días 14, 28, 49 y 80, del mismo conjugado péptido-KLH en PBS pero esta vez emulsionados en adyuvante incompleto de Freund, realizándose la sangría de control a los 90 días para detectar la presencia de los anticuerpos .
Ejemplo 3.
Purificación de los anticuerpos por afinidad.
Tras la recogida de sangre, se separó el suero y se prepurificó mediante desalado y posteriormente se purificaron los anticuerpos por afinidad en una matriz compuesta por 1,5 mi de material EMD-Epoxy activated (Merck) a la que se añadió 5mg del correspondiente péptido. Las fracciones purificadas se estabilizaron en 0.1% de BSA (Sigma) y se conservaron a 4 °C, pudiéndose añadir glicerol 20-50% como crioprotector .
Ejemplo 4.
Titulación del anticuerpo por ELISA. Tras la purificación por afinidad se determinó el título del anticuerpo por ELISA. Para ello se puso el antígeno en una placa ELISA Maxi Sorb de Nunc a razón de 50ng/50μl en PBS pH 7 , y se detectó el anticuerpo con anti-IgG de burro conjugada con fosfatasa alcalina, utilizando como substrato p-nitrofenil fosfato (PNPP) en dietanolamina con 5mM MgCl2, pH 9.6 y revelado a las 2 horas .
En conclusión, los anticuerpos se generaron empleando los diferentes péptidos sintéticos descritos anteriormente acoplados a KLH. Estos péptidos sintéticos contienen un número muy pequeño de aminoácidos, lo cual les hace muy adecuados para la producción en cadena de anticuerpos homogéneos, con epítopos predefinidos.
Lista de secuencias.
SEQ ID NO 1 LVFFAEDV
SEQ ID NO 2 GLMVGGW
SEQ ID NO 3 GLMVGGWIA
SEQ ID NO 4 RHDSGYEVHHQK
En esta solicitud los aminoácidos se abrevian utilizando los códigos de una letra aceptados en el campo, en la forma que se muestra a continuación:
A= Ala= alanina, C= Cys= cisteína,
D= Asp= ácido aspártico,
E= Glu= ácido glutámico,
F= Phe= fenilalanina,
G= Gly= glicina, H= His= histidina, 1= Ile= isoleucina,
K= Lys= lisina,
L= Leu= leucina,
M= Met= metionina, N= Asn= asparagina,
P= Pro= prolina
Q= Gln= glutamina,
R= Arg= arginina,
S= Ser= serina, T= Thr= treonina,
V= Val= valina, = Trp= triptofano,
Y= Tyr= tirosina,
La información relativa a la identificación de las secuencias peptídicas, descritas en la presente invención, que se acompaña a la presente memoria en formato legible por ordenador, es idéntica al listado de secuencias que se presenta acompañando a la memoria.
NUMERO DE SECUENCIAS
INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA 1:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 8
TIPO: aminoácido TIPO DE MOLÉCULA: péptido FUENTE: Síntesis Química DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 1
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 1 5
INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA 2 : CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 8 TIPO: aminoácido TIPO DE MOLÉCULA: péptido FUENTE: Síntesis Química DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 2
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 1 5
INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA 3:
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 10 TIPO: aminoácido TIPO DE MOLÉCULA: péptido FUENTE: Síntesis Química DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 3
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val He Ala 1 5 10
INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA 4 :
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 12 TIPO: aminoácido TIPO DE MOLÉCULA: péptido FUENTE: Síntesis Química DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO 4
Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

Claims

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo policlonal para el reconocimiento específico de las formas principales de péptido beta amiloide, Aβ40 y Aβ42, obtenible por inmunización de mamíferos con una proteína conjugada a un péptido seleccionado entre el grupo formado por: el péptido de SEQ ID NO 1, el péptido de SEQ ID NO 2, el péptido de SEQ ID NO 3, el péptido de SEQ ID NO 4 ; los péptidos con una secuencia resultante de eliminar los restos de aminoácido N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID NO 1, de SEQ ID NO 2, de SEQ ID NO 3 O de SEQ ID NO 4; y los péptidos resultantes de añadir a cualquiera de las secuencias precedentes, los restos de aminoácido necesarios para la conjugación de la proteína.
2. Anticuerpo policlonal según la reivindicación 1, caracterizado porque la inmunización se realiza con un péptido seleccionado entre el grupo constituido por: - el péptido de SEQ ID NO 1 ; los péptidos con una secuencia resultante de eliminar los restos de aminoácido N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID NO 1 ; y los péptidos resultantes de añadir a cualquiera de las secuencias precedentes, los restos de aminoácido necesarios para la conjugación de la proteína.
3. Anticuerpo policlonal según la reivindicación 1, caracterizado porque la inmunización se realiza con un péptido seleccionado entre el grupo constituido por: el péptido de SEQ ID NO 2 ; los péptidos con una secuencia resultante de eliminar los restos de aminoácido N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID NO 2 ; y los péptidos resultantes de añadir a cualquiera de las secuencias precedentes, los restos de aminoácido necesarios para la conjugación de la proteína.
4. Anticuerpo policlonal según la reivindicación 1, caracterizado porque la inmunización se realiza con un péptido seleccionado entre el grupo constituido por: el péptido de SEQ ID NO 3 ; los péptidos con una secuencia resultante de eliminar los restos de aminoácido N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID NO 3 ; - y los péptidos resultantes de añadir a cualquiera de las secuencias precedentes, los restos de aminoácido necesarios para la conjugación de la proteína.
5. Anticuerpo policlonal según la reivindicación 1, caracterizado porque la inmunización se realiza con un péptido seleccionado entre el grupo constituido por: el péptido de SEQ ID NO 4 ; - los péptidos con una secuencia resultante de eliminar los restos de aminoácido N-terminal y/o C-terminal de SEQ ID NO 4; y los péptidos resultantes de añadir a cualquiera de las secuencias precedentes, los restos de aminoácido necesarios para la conjugación de la proteína.
6. Anticuerpo policlonal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque la proteína es la hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin en inglés) .
7. Anticuerpo policlonal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque los mamíferos son conejos.
8. Péptido sustancialmente puro caracterizado por tener una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo definido en la reivindicación 1.
9. Péptido según la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia se seleccionad entre el grupo definido en la reivindicación 2.
10. Péptido según la reivindicación 9, caracterizado porque la secuencia es SEQ ID NO 1.
11. Péptido según la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia se selecciona entre el grupo definido en la reivindicación 3.
12. Péptido según la reivindicación 11, caracterizado porque la secuencia es SEQ ID NO 2.
13. Péptido según la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia se selecciona entre el grupo definido en la reivindicación 4.
14. Péptido según la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia es SEQ ID NO 3.
15. Péptido según la reivindicación 8, caracterizado porque la secuencia se selecciona entre el grupo definido en la reivindicación 5.
16. Péptido según la reivindicación 15, caracterizado porque la secuencia es SEQ ID NO 4.
17. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 8 a 16, para la obtención de anticuerpos policlonales mediante conjugación a una proteína e inmunización de mamíferos .
18. Uso según la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína es la hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin en inglés) .
19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 17 a 18, caracterizado porque los mamíferos son conejos.
20. Método de obtención anticuerpos policlonales para el reconocimiento específico de las formas principales de péptido beta amiloide, Aβ40 y
Aβ42, caracterizado porque se inmunizan mamíferos con una proteína conjugada a un péptido seleccionado entre el grupo definido en la reivindicación 1.
21. Método según la reivindicación 20, caracterizado porque la proteína utilizada es la hemocianina de lapa (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin en inglés) .
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 20 a 21, caracterizado porque los mamíferos son conejos.
23. Método de detección de la presencia o ausencia de los péptidos amiloides Aβ40 y Aβ42 en una muestra, caracterizado porque comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo definido como en la reivindicación 1, y detectar la presencia o ausencia del complejo formado por dichos péptidos amiloides y dicho anticuerpo.
24. Método de valoración tanto de fármacos activadores de la degradación de los péptidos amiloides, como de fármacos inhibidores de su producción, mediante el uso de los anticuerpos policlonales descritos en la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea el huevo embrionado del pollo como modelo animal de ensayo.
25. Uso del huevo embrionado de pollo como modelo animal de ensayo para la valoración tanto de fármacos activadores de la degradación de los péptidos amiloides, como de fármacos inhibidores de su producción, mediante el empleo de anticuerpos policlonales como marcadores de la presencia o ausencia de dichos péptidos amiloides .
26. Uso según la reivindicación 25, caracterizado porque los anticuerpos policlonales utilizados son los definidos en la reivindicación 1.
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2075007A3 (en) * 2003-05-08 2009-11-11 Araclón Biotech, S. L. Treatment for Alzheimer's disease
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
US7763250B2 (en) 2005-04-29 2010-07-27 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and nucleic acids encoding same
US7807165B2 (en) 2004-07-30 2010-10-05 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011070174A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Araclon Biotech, S.L. Methods and reagents for improved detection of amyloid beta peptides
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5956674A (en) * 1995-12-01 1999-09-21 Digital Theater Systems, Inc. Multi-channel predictive subband audio coder using psychoacoustic adaptive bit allocation in frequency, time and over the multiple channels
EP2149380A1 (en) * 2008-07-29 2010-02-03 Medivet Pharma, S.L. Veterinary immunotherapy compositions for the Aged Related Cognitive Dysfunction.

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006242A1 (en) * 1987-10-08 1989-07-13 The Mclean Hospital Corporation Antibodies to a4 amyloid peptide

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5525090A (en) * 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Monoclonal antibody to amyloid peptide
US6610493B1 (en) * 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
EP1371986A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-17 ABETA GmbH Diagnosis of Alzheimer's disease based on the hAbeta42:hAbeta40 ratio
EP1523499A2 (en) * 2002-07-24 2005-04-20 Innogenetics N.V. Fragments of beta-amyloid as targets for vaccination against alzheimer disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006242A1 (en) * 1987-10-08 1989-07-13 The Mclean Hospital Corporation Antibodies to a4 amyloid peptide

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CITRON M., ET AL.: "Evidence that the 42- and 40- amino acid forms of amyloid beta protein are generated from the beta- amyloid precursor protein by different protease activities", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 93, November 1996 (1996-11-01), pages 13170 - 13175, XP002986668 *
DOMINGUEZ L., ET AL.: "Developmental spatiotemporal expression of alzheimer beta - APP isoforms in the chick embryo", INT. J. DEV. BIOL., vol. 45, no. S1, 2001, pages S73 - S74, XP002987616 *
See also references of EP1550673A1 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8809010B2 (en) 2003-05-05 2014-08-19 Probiodrug Ag Method for prophylactic treatment of alzheimer's disease using inhibitors of glutaminyl cyclase and glutamate cyclases
US7732162B2 (en) 2003-05-05 2010-06-08 Probiodrug Ag Inhibitors of glutaminyl cyclase for treating neurodegenerative diseases
EP2075007A3 (en) * 2003-05-08 2009-11-11 Araclón Biotech, S. L. Treatment for Alzheimer's disease
US8268593B2 (en) 2004-07-30 2012-09-18 Rinat Neuroscience Corp. Polynucleotides encoding antibodies directed against amyloid-beta peptide
US7927594B2 (en) 2004-07-30 2011-04-19 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide
US7807165B2 (en) 2004-07-30 2010-10-05 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
US7763250B2 (en) 2005-04-29 2010-07-27 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and nucleic acids encoding same
US8398978B2 (en) 2005-04-29 2013-03-19 Rinat Neuroscience Corp. Antibodies directed against amyloid-beta peptide and methods using same
EP2481408A2 (en) 2007-03-01 2012-08-01 Probiodrug AG New use of glutaminyl cyclase inhibitors
WO2008104580A1 (en) 2007-03-01 2008-09-04 Probiodrug Ag New use of glutaminyl cyclase inhibitors
EP2865670A1 (en) 2007-04-18 2015-04-29 Probiodrug AG Thiourea derivatives as glutaminyl cyclase inhibitors
WO2011029920A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Probiodrug Ag Heterocylcic derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
WO2011070174A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Araclon Biotech, S.L. Methods and reagents for improved detection of amyloid beta peptides
WO2011107530A2 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2011110613A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Probiodrug Ag Heterocyclic inhibitors of glutaminyl cyclase (qc, ec 2.3.2.5)
WO2011131748A2 (en) 2010-04-21 2011-10-27 Probiodrug Ag Novel inhibitors
WO2012123563A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Probiodrug Ag Benz imidazole derivatives as inhibitors of glutaminyl cyclase
EP3461819A1 (en) 2017-09-29 2019-04-03 Probiodrug AG Inhibitors of glutaminyl cyclase

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