TW202128217A - 醫藥組合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明屬於生物製藥領域，具體涉及一種醫藥組合物。所述醫藥組合物包含B型肝炎表面抗原、B型肝炎核心抗原和免疫刺激組合物，其中，所述免疫刺激組合物包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸，或者所述免疫刺激組合物由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成。
Description
本發明屬於生物製藥領域。具體地，本發明涉及一種醫藥組合物，其包含B型肝炎表面抗原、B型肝炎核心抗原和免疫刺激組合物。其中，該免疫刺激組合物包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸，或者該免疫刺激組城物由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成，其中該CpG寡聚去氧核苷酸序列中具有兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。本發明還涉及該醫藥組合物用於治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的用途。
B型肝炎病毒(HBV)感染是世界範圍的嚴重公共衛生問題之一。HBV感染是導致慢性B型肝炎、肝硬化和肝細胞癌的重要原因(Fatt ovich G. J. Hepatol. 2008；48：335-352)。臨床治療慢性HBV感染的常用藥物主要有核苷類似物和干擾素。核苷類似物無法完全清除肝細胞內的cccDNA，且長期使用易導致耐藥突變株的出現以及停藥後反彈(Kwon H，Lok AS. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2011；8：275-284)。干擾素不適合用於無症狀的HBV攜帶者，在慢性HBV患者中，使用半年後HBeAg血清學轉換發生率僅為33%，而且干擾素副作用較大也限制其應用(Tang SX，Yu GL. Lancet 1990；335(8684)：302)。
目前廣泛應用的B型肝炎蛋白疫苗藉由誘導體液免疫，產生保護性中和抗體，達到預防的目的。大量的研究發現中和抗體僅能夠消除胞外病毒顆粒，而胞內感染的病毒則主要依賴特異性的細胞免疫反應，輔助性T細胞、CD4+T細胞產生的IFN-γ等Th1型細胞因子，尤其是病毒特異性的殺傷性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)來清除(ChinR，Lacamini S. Rev Med Viorl. 2003：13(4)：255-72)。細胞免疫反應的強弱直接決定著B型肝炎的預後。因此，理想的治療性B型肝炎疫苗需要同時誘導特異性的體液免疫和細胞免疫，突破B型肝炎的免疫耐受。例如，中國專利CN104043120B提供了一種治療性B型肝炎疫苗，其包括B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎核心抗原(HBcAg)、寡聚去氧核苷酸(CpG)，可以突破B型肝炎的免疫耐受，用於病毒性B型肝炎，尤其是慢性B型肝炎的治療。
發明人對現有技術進行了深入研究，發現佐劑對治療性B型肝炎疫苗的治療作用發揮重要作用。常用佐劑寡聚去氧核苷酸(CpG)作為一種免疫刺激組合物，其化學本質為含有胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡去氧核苷酸，具有與天然CpG模式識別受體相似的免疫反應，能與細胞膜上的Toll樣受體結合，藉由TLR9信號通路有效引發哺乳動物免疫反應。皂苷佐劑是一類苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的糖苷，屬植物來源佐劑。其中，皂樹皂苷(QS)是從皂樹中提取得到的皂苷，在QS系列中QS-21是目前報導最廣泛的一類佐劑，但QS-21可誘導細胞溶血，有一定系統和局部的毒副作用。Alving等(ALVING CR, MATYAS G, BECK Z, et al. Revue Roumaine de Chimie, 2016, 61(8): 631-635.)研究發現，以ALF脂質體結合MPLA和QS-21作為佐劑對抗HIVgp140蛋白可有效增加血清中抗體滴度。Ng等(NG H, FERNANDO G J P, DEPELSENAIRE A C I, et al. Scientific Reports, 2016, 6(1): 228-230.)使用一種皮下傳遞技術-奈米貼片，與QS-21構成佐劑複合物。結果表明，奈米貼片與傳統肌內注射相比，可顯著減少抗原和QS-21的使用劑量以及誘導更高的IgG滴度(韓子怡，曾忠良，現代農業科技，2019(14)：220-221.)。
現有技術(WO2001051083A3)曾報導關於包含皂苷與CpG寡聚去氧核苷酸的免疫刺激組合物，其中，CpG佐劑涉及CpG1826和CpG7909。然而，由於CpG寡聚去氧核苷酸具備結構多樣性，不同序列的CpG佐劑間的效果差異巨大。
因此，當前對免疫效果更強的佐劑以及B型肝炎治療劑存在需求。
針對現有技術的不足，發明人在進行了大量研究後，出乎意料地發現了免疫效果更強的免疫刺激組合物，以及包含該免疫刺激組合物的醫藥組合物。本發明提供的醫藥組合物包含雙佐劑，並且其中皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸之間表現出高效的協同作用，可以介導更強烈的免疫應答。本發明還提供了該醫藥組合物用於治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的用途。
本發明的目的是藉由以下技術方案實現的：
一方面，本發明提供一種醫藥組合物，其包含：
i)B型肝炎表面抗原、該抗原的活性片段、該抗原的變體，或者其中至少兩種的混成物，
ii)B型肝炎核心抗原、該抗原的活性片段、該抗原的變體，或者其中至少兩種的混成物，
iii)免疫刺激組合物，該免疫刺激組合物包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸，或者該免疫刺激組合物由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成；其中，該CpG寡聚去氧核苷酸序列具有兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。
根據本發明該的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸的序列選自以下中的任一種：
CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)、CpG T2：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7)和CpG T3：TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8)；
較佳地，該CpG寡聚去氧核苷酸的序列為CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該皂苷可以選自皂樹皂苷、人參皂苷、桔梗皂苷、黃芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合歡皮皂苷、麥冬皂苷、柴胡皂苷或竹節參皂苷中的一種或多種。較佳地，該皂苷為皂樹皂苷、人參皂苷、桔梗皂苷或黃芪甲苷；更佳地，該皂樹皂苷為QS-7、QS-17、QS-18或QS-21；進一步較佳地，該皂樹皂苷為QS-21；該人參皂苷可以為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1或人參皂苷Re；該桔梗皂苷可以為桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其兩者的混合物；該黃芪皂苷可以為黃芪甲苷(黃芪皂苷IV)、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II等單體或其中兩個或兩個以上皂苷單體的混合物；該三七皂苷可以為三七皂苷R1；該麥冬皂苷可以為麥冬皂苷D等；該柴胡皂苷可以為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其兩者的混合物；該成歡皮皂苷可以為合歡皮總皂苷等；該甘草皂苷可以為甘草總皂苷；該竹節參皂苷可以為竹節參總皂苷。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該包含皂苷的佐劑為免疫刺激複合物佐劑(Iscom佐劑)。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸可以包含硫代磷酸酯連接；較佳地，該CpG寡聚去氧核苷酸為硫代寡聚去氧核苷酸，更佳地為全硫代寡聚去氧核苷酸。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸與皂苷的重量比為1~40：0.1~2，較佳為2~40：0.1~2。
較佳地，該CpG寡聚去氧核苷酸與皂苷的重量比為1：0.1、1：1、1：2、2：0.1、2：1、40：0.1、40：1或20：1，較佳為1：1、2：1、40：0.1、40：1或20：1，進一步較佳為2：1。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該B型肝炎表面抗原包含如SEQ ID NO: 1所示的序列或由其組成。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該B型肝炎核心抗原包含如SEQ ID NO: 2所示的序列或由其組成；較佳地，該B型肝炎核心抗原的活性片段包含SEQ ID NO: 2中的第1位~第X位的連續胺基酸或由其組成，其中，X可以為149至183之間的整數；進一步較佳地，X為152至183之間的整數。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該醫藥組合物的組分i)、ii)和iii)之間的重量比為4：2：1.1~42，較佳為4：2：2.1~42。
進一步較佳地，該醫藥組合物的組分i)、ii)和iii)之間的重量比為4：2：1.1、4：2：2、4：2：3、4：2：2.1、4：2：40.1、4：2：41或4：2：42，較佳為4：2：2、4：2：3、4：2：40.1、4：2：41或4：2：42，進一步較佳為4：2：3。
根據本發明所述的醫藥組合物，其中，該醫藥組合物還包含：
iv)可藥用載體。
另一方面，本發明提供了一種B型肝炎預防性疫苗或B型肝炎治療性疫苗，其包含該醫藥組合物；較佳地，該疫苗為B型肝炎治療性疫苗。
再一方面，本發明提供了該醫藥組合物在製備用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的藥物中的用途；較佳地，該B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病選自B型肝炎、肝硬化和肝癌。
再一方面，本發明提供了該醫藥組合物在製備用於在物件中產生針對B型肝炎病毒的體液免疫和/或細胞免疫應答的藥物中的用途。
再一方面，本發明提供了該醫藥組合物在製備用於使物件中B型肝炎核心抗體發生亞型轉變的藥物中的用途。
再一方面，本發明提供了該醫藥組合物在製備用於在對象中突破B型肝炎病毒免疫耐受的藥物中的用途。
再一方面，本發明提供了一種預防和/或治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的方法，該方法包括給予有需要的受試者預防和/或治療有效量的醫藥組合物；較佳地，該B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病選自B型肝炎、肝硬化和肝癌。
另一方面，本發明提供了一種在物件中產生針對B型肝炎病毒的體液免疫和/或細胞免疫應答的方法，該方法包括給予有需要的受試者有效量的醫藥組合物。
另一方面，本發明提供了一種使物件中B型肝炎核心抗體發生亞型轉變的方法，該方法包括給予有需要的受試者有效量的醫藥組合物。
另一方面，本發明提供了一種在物件中突破B型肝炎病毒免疫耐受的方法，該方法包括給予有需要的受試者有效量的醫藥組合物。
本發明的醫藥組合物中包含兩種佐劑，具有出乎意料的技術效果，可介導更強的免疫應答。單獨使用CpG T1、CpG T2和CpG T3的免疫刺激作用弱於CpG1018、CpG7909和CpG1826等，但與QS21聯合應用後，該佐劑表現出出人意料的協同作用，免疫效果顯著增強。含有該免疫刺激組合物的B型肝炎治療性疫苗可以突破基因轉殖小鼠的免疫耐受，產生高滴度的抗HBsAg抗體、抗HBcAg抗體、中和抗體。各項檢測結果均顯示，該疫苗藉由多次免疫可以顯著清除基因轉殖小鼠體內的B型肝炎病毒，在免疫過程結束後，HBsAb水準接近飽和，可以保持穩定長效的免疫效果，HBsAg平均下降率維持在92%左右。同時含有該免疫刺激物的B型肝炎疫苗可誘導產生較強的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準，免疫效果顯著優於單獨佐劑，顯著優於其他CPG佐劑和QS21的組合。
定義
除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。胺基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-胺基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。
儘管本發明以廣義範圍顯示數位範圍和參數近似值，但是具體實施例中所示的數值盡可能準確的進行記載。然而，任何數值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自的測量中存在的標準差所致。另外，本文公開的所有範圍應理解為涵蓋其中包含的任何和所有子範圍。例如記載的“1.1至42”的範圍應認為包含最小值1.1和最大值42之間(包含端點)的任何和所有子範圍；也就是說，所有以最小值1.1或更大起始的子範圍，例如1.1至6.1，以及以最大值42或更小終止的子範圍，例如5.5至42。另外，任何稱為“併入本文”的參考文獻應理解為以其整體併入。
另外應注意，如本說明書中所使用的，單數形式包括其所指物件的複數形式，除非清楚且明確的限於一個所指物件。術語“或”可與術語“和/或”互換使用，除非上下文另有清楚指明。
本文使用的術語“醫藥組合物”、“組成藥物”和“藥物組成”可互換地使用，其表示組成在一起以實現某種特定目的的至少一種藥物以及任選的可藥用賦形劑或輔料的組合。在某些實施方案中，該醫藥組合物包括在時間和/或空間上分開的組合，只要其能夠共同作用以實現本發明的目的。例如，該醫藥組合物中所含的成分(例如HBsAg、HBcAg、QS-21、CpG寡聚去氧核苷酸)可以以整體施用於物件，或者分開施用於物件。當該醫藥組合物中所含的成分分開地施用於物件時，該成分可以同時或依次施用於物件。
本文使用的術語“CpG寡聚去氧核苷酸”或CpG-ODN”是指短的單鏈成成DNA分子，其含有一個或更多個“CpG”單元，其中C表示胞嘧啶，G表示鳥嘌呤，p表示磷酸二酯鍵。特別地，該CpG寡聚去氧核苷酸是非甲基化的。在一些實施方案中，該CpG-ODN包含硫代磷酸酯連接或硫代磷酸酯骨架。也就是說，在一些實施方案中，該CpG-ODN為硫代磷酸酯寡聚去氧核苷酸(即硫代寡聚去氧核苷酸)。較佳地，該CpG-ODN中所有核苷酸間連接均為硫代磷酸酯連接，即該CpG-ODN為全硫代寡聚去氧核苷酸。在另一些實施方案中，該CpG-ODN包含兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。特別地，該CpG-ODN具有選自下列的序列：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)、TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7)或TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8)，較佳地為TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)。
本文使用的“人參皂苷、桔梗皂苷、黃芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合歡皮皂苷、麥冬皂苷、柴胡皂苷或竹節參皂苷”是指是存在於對應植物中的活性成分，例如人參皂苷是一種固醇類化合物，主要存在於人參屬藥材中，是人參中的活性成分。在一些實施方案中，該人參皂苷較佳為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re等單體或其中兩個或兩個以上皂苷單體的混合物；桔梗皂苷較佳為桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其兩者的混合物；黃芪皂苷較佳為黃芪甲苷(黃芪皂苷IV)、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II等單體或其中兩個或兩個以上皂苷單體的混合物；三七皂苷較佳為三七皂苷R1等；麥冬皂苷較佳為麥冬皂苷D等；柴胡皂苷較佳為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其兩者的混合物；合歡皮皂苷較佳為合歡皮總皂苷等；甘草皂苷較佳為甘草總皂苷等；竹節參皂苷較佳為竹節參總皂苷等。
本文使用的“Iscom佐劑”為免疫刺激複合物佐劑，具體地為不包含抗原的Iscom基質(ISCOM MATRIX)，是由磷脂、皂苷、膽固醇組成的籠狀結構的佐劑。
本文使用的“治療有效量”或“有效量”是指足以顯示其對於所施用物件益處的劑量。施用的實際量，以及施用的速率和時間過程會取決於所治療者的自身情況和嚴重程度。治療的處方(例如對劑量的決定等)最終是全科醫生及其它醫生的責任並依賴其做決定，通常考慮所治療的疾病、患者個體的情況、遞送部位、施用方法以及對於醫生來說已知的其它因素。
本文所使用的術語“哺乳動物”是指人類，也可以是其它動物，如野生動物(如蒼鷺、鸛、鶴等)，家畜(如鴨、鵝等)或實驗動物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土撥鼠、地松鼠等)。
在另一些實施方案中，本發明組合物還可包含另外的添加劑，如可藥用載體或添加劑，尤其是當它以藥物製劑形式存在時。
較佳的藥物載體尤其是水，緩衝水溶液，較佳等滲鹽溶液如PBS(磷酸鹽緩衝液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂、0.3%甘油、透明質酸、乙醇或聚亞烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用藥物載體的類型尤其依賴於根據本發明的組合物是否配製為用於口服、鼻、皮內、皮下、肌內或靜脈施用。根據本發明的組合物可包含潤濕劑、乳化劑或緩衝液物質作為添加劑。
根據本發明的醫藥組合物、疫苗或者藥物製劑可藉由任何適宜的途徑施用，例如可口服、鼻、皮內、皮下、肌內或靜脈內施用。
以下結合附圖藉由具體實施方式的描述對本發明作進一步說明，但這並非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以作出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。
實施發明的最佳實施方式
以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
實施例
1
免疫刺激組合物的篩選實驗準備
1、HBsAg原液：HBsAg蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
HBsAg蛋白由HBsAg基因重組酵母細胞製備，酵母細胞種類包括漢遜酵母、釀酒酵母和畢赤酵母，較佳為漢遜酵母。具體製備步驟參考中國專利申請CN108330145A，HBsAg基因重組漢遜酵母細胞經發酵培養，收穫菌體。經破菌處理和矽膠吸附、柱層析和TFF等步驟純化。
2、HBcAg原液：HBcAg蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
HBcAg蛋白由HBcAg基因重組酵母細胞製備，酵母細胞種類包括漢遜酵母、釀酒酵母和畢赤酵母，較佳漢遜酵母。具體製備步驟參考中國專利申請CN108047316A，HBcAg基因重組漢遜酵母細胞經發酵培養，收穫菌體。經破菌處理和硫酸銨、柱層析和TFF等步驟純化，製備HBcAg原液。
3、QS-21：購自BRENNTAG公司，CAS.NO.A010-023。
4、CPG寡聚去氧核苷酸原料的製備方法：
寡聚去氧核苷酸是合成製備的寡聚去氧核苷酸序列片段，其含有一個或多個CpG基序，本實施例使用的CPG序列見表1：
表1 CPG寡聚去氧核苷酸的具體序列
| CPG寡聚去氧核苷酸的分型 | CPG寡聚去氧核苷酸 | 序列 |
| B型 | CpG 1018 | TGACTGTGAACGTTCGAGATGA(SEQ ID NO: 3) |
| CpG 7909 | TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO: 4) | |
| CpG 1826 | TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO: 5) | |
| CpG T1 | TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT(SEQ ID NO: 6) | |
| CpG T2 | TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7) | |
| CpG T3 | TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8) | |
| CpG 684 | TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC(SEQ ID NO: 9) | |
| CpG 1668 | TCC ATG ACG TTC CTG ATGCT(SEQ ID NO: 10) | |
| CpG D2 | TGTCGTCGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT(SEQ ID NO: 11) | |
| A型 | CpG 2216 | GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO: 12) |
| ODN 2336 | GGGGACGACGTCGTGGGGGGG(SEQ ID NO: 13) | |
| C型 | ODN 2395 | TCGTCGTTTCGCGCGCGCCG(SEQ ID NO: 14) |
| ODN M362 | TCGTCGTTCGTTCGTCGAACGACGTTTGAT(SEQ ID NO: 15) |
具體製備方法：使用常規固相亞磷醯胺三酯法化學合成方法製備，由3’端開始，1)脫保護基：先用三氯乙酸脫去連接在CpG上的核苷酸的保護基團DMT(二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’羥基，以供下一步縮合反應使用；2)活化：將亞磷醯胺保護的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合並進入合成柱，形成亞磷醯胺四唑活性中間體，此中間體與CpG上已脫保護基的核苷酸發生縮合反應；3)連接：亞磷醯胺四唑活性中間體遇到CpG上已脫保護基的核苷酸時，將與其5’羥基發生親和反應，縮合並脫去四唑，此時寡核苷酸鏈向前延長一個堿基；4)氧化：縮合反應時核苷酸單體是藉由亞磷酯鍵與連在CpG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩定，易被酸或堿水解，此時使用硫代試劑將亞磷醯胺氧化為硫磷雙鍵的磷酸三酯，從而得到穩定的寡核苷酸；5)封閉：縮合反應後為了防止連在CpG上的未參與反應的5’羥基在隨後的迴圈反應中被延伸，常藉由乙醯化來封閉此端羥基；經過以上五個步驟後，一個去氧核苷酸就連到CpG的核苷酸上；重複以上的脫保護基、活化、連接、氧化、封閉過程即可得到一個DNA片段粗品；最後對其進行切割、脫保護基、純化、定量等合成後處理即可。
使用PBS溶液(購自Hyclone公司)將HBsAg原液和HBcAg原液分別稀釋至200μg/ml和100μg/ml；使用PBS溶液將各CPG原料分別溶解並稀釋至100μg/ml，供下一步使用。
實施例
2 CPG
寡聚去氧核苷酸的篩選實驗
1、實驗動物：C57BL/6(N)小鼠，雄性，4週齡，135隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司。
2、實驗分組：見表2，每次注射量為100μL/隻。其中A組為陰性對照，PBS溶液100μL/隻。
表2 實驗動物分組
| 組別 | 數量(隻) | 組分(μg/隻小鼠) | ||||||||||||||
| HBsAg | HBcAg | CpG T1 | CpG T2 | CpG T3 | CpG 1018 | CpG 7909 | CpG 1826 | CpG 684 | CpG 1668 | CPG D2 | CpG 2216 | ODN 2336 | ODN 2395 | ODNM362 | ||
| 對照 | 9 | |||||||||||||||
| 抗原 | 9 | 20 | 10 | |||||||||||||
| T1 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| T2 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| T3 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 1018 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 7909 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 1826 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 684 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 1668 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| D2 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 2216 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 2336 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| 2395 | 9 | 20 | 10 | 10 | ||||||||||||
| M362 | 9 | 20 | 10 | 10 |
3、實驗步驟：小鼠免疫後第7天取脾，按常規方法製備脾淋巴細胞，具體如下：無菌操作取脾臟：用無菌鑷子及剪刀剪取脾臟，放於70μm細胞濾網中，置於含有2ml預冷處理的2%FBS(購自GIBCO公司)-PBS的平皿中；用研磨棒研磨脾臟，脾臟細胞藉由篩目進入平皿中，得到細胞懸液，用巴氏吸管將懸液放入經40μm細胞濾網過濾(購自BD公司)的50ml無菌離心管；500×g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入2ml 1×破紅劑(購自BD公司)重懸細胞，4℃避光靜置5分鐘，以破碎紅細胞；加入10ml 2% FBS-PBS終止破紅反應；500×g，4℃離心5分鐘；棄去上清，加入5ml 2% FBS-PBS重懸細胞備用。分別使用刺激物HBsAg特異性肽庫PS4和HBcAg特異性肽庫PCP刺激脾細胞；按照試劑盒說明書，使用ELISPOT試劑盒(BD公司)檢測HBsAg和HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準；使用ImmunoSPOT Series 3酶聯斑點分析儀讀取ELISPOT試劑盒測出的斑點數(具體操作步驟參考中國專利CN104043120B的實施例7)。
其中，HBsAg特異性肽庫序列參考中國專利CN104043120B的實施例7；HBcAg特異性肽庫序列見SEQ ID NO: 16~30。
4、實驗結果：ELISPOT斑點結果見圖1和圖2，結果顯示，不同序列的B型CpG佐劑具有不同的免疫效果，其中，CpG T1~T3、CpG1018、CpG7909、CpG 1826和CpG 684整體優於A型CpG佐劑和C型CpG佐劑，而CpG1618和CPG D2的免疫效果較差，誘導產生HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水平均低於A型CpG佐劑和C型CpG佐劑。
實施例
3
免疫刺激組合物的篩選實驗
1、實驗動物：C57BL/6(N)小鼠，雄性，4週齡，81隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司，
2、實驗分組：見表3，每次注射量為100μL/隻。其中A組為陰性對照，PBS溶液100μL/隻。
表3 實驗動物分組
| 組別 | 數量(隻) | 組分(μg/隻小鼠) | |||||||||
| HBsAg | HBcAg | CpG T1 | CpG T2 | CpG T3 | CpG 1018 | CpG 7909 | CpG 1826 | CpG 684 | QS21 | ||
| 對照 | 9 | ||||||||||
| 抗原 | 9 | 20 | 10 | ||||||||
| T1 | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 | ||||||
| T2 | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 | ||||||
| T3 | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 | ||||||
| 1018 | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 | ||||||
| 7909 | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 | ||||||
| 1826 | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 | ||||||
| 684 | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 |
3、實驗步驟：同實施例2。
4、實驗結果：ELISPOT斑點結果見圖3和圖4，結果顯示，CpG T1~T3與QS21聯合應用後產生了高效的協同作用，誘導產生HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準顯著高於CpG1018、CpG7909等其他幾種CpG佐劑，具有出人意料的免疫效果。
實施例 4 不同含量佐劑對醫藥組合物免疫效果的影響
1、實驗動物：C57BL/6(N)小鼠，雄性，4週齡，60隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司。
2、試劑材料：
1)HBsAg蛋白、HBcAg蛋白和CpG T1均由實施例1製得；
2)QS-21(CAS.NO.A010-023，購自BRENNTAG公司)
3)使用PBS溶液(購自Hyclone公司)將HBsAg原液、HBcAg原液分別稀釋至200μg/ml、100μg/ml，將QS21分別稀釋至5μg/ml、50μg/ml、100μg/ml，使用PBS溶液將CpG T1溶解並分別稀釋至50μg/ml、100μg/ml、2mg/ml，使用PBS溶液將CPG7909溶解並稀釋至100μg/ml，供下一步使用。
3、實驗分組：見表4，每次注射量為100μL/隻。其中A組為陰性對照，PBS溶液100μL/隻。
4、實驗步驟：同實施例2。
5、實驗結果：ELISPOT斑點結果見圖5和圖6，結果顯示，CpG T1與QS21的劑量變化對疫苗組合物均有顯著性影響，高於劑量5的免疫刺激組合物，誘導產生HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準顯著高於CPG7909組，但由於種屬差異性，佐劑劑量進一步增加誘導效果並無顯著性增加，推測原因為小鼠無法準確反映佐劑的免疫強度。
劑量1、2、4與CPG7909組的免疫刺激效果相當，但是使用的佐劑劑量低於同等CPG7909組，因此也具有一定優勢。
表4 實驗動物分組
| 組別 | 數量(隻) | 組分(μg/隻小鼠) | |||||
| HBsAg | HBcAg | CpG T1 | QS21 | CPG7909 | |||
| 對照 | 5 | ||||||
| 抗原 | 5 | 20 | 10 | ||||
| 劑量1 | 5 | 20 | 10 | 5 | 0.5 | ||
| 劑量2 | 5 | 20 | 10 | 5 | 5 | ||
| 劑量3 | 5 | 20 | 10 | 5 | 10 | ||
| 劑量4 | 5 | 20 | 10 | 10 | 0.5 | ||
| 劑量5 | 5 | 20 | 10 | 10 | 5 | ||
| 劑量6 | 5 | 20 | 10 | 10 | 10 | ||
| 劑量7 | 5 | 20 | 10 | 200 | 0.5 | ||
| 劑量8 | 5 | 20 | 10 | 200 | 5 | ||
| 劑量9 | 5 | 20 | 10 | 200 | 10 | ||
| CPG7909 | 5 | 20 | 10 | 5 | 10 |
實施例 5 B 型肝炎疫苗的實驗組設置及免疫流程
1、實驗動物及模型建立：
C57BL/6(N)小鼠，雄性，4週齡，81隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司，rAAV8-HBV腺病毒，購自北京五加和分子醫學研究所有限公司。在C57BL/6(N)小鼠上尾靜脈注射rAAV8-HBV腺病毒，建立rAAV8-HBV持續感染C57BL/6(N)的小鼠模型。
2、試劑材料：
1) HBsAg蛋白：實施例1製得。
2) HBcAg蛋白：實施例1製得。
3) 使用PBS溶液(購自Hyclone公司)將HBsAg原液、HBcAg原液和QS-21分別稀釋至200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml，使用PBS溶液將CpG溶解並稀釋至100μg/ml，供下一步使用。
3、實驗分組：見表5，每隻小鼠每次注射量為100μL/隻，其中A組為陰性對照，注射PBS溶液100μL/隻。
表5 實驗動物分組及每組注射量
4、動物免疫：所有組別每2週進行1次肌肉注射，接種部位為右側後大腿，共給藥6次，分別於尾靜脈注射rAAV8-HBV病毒後第4週、第6週、第8週、第10週、第12週、第14週給藥。給藥開始後每2週採1次血，採血時間分別為第4週、第6週、第8週、第10週、第12週、第14週、第16週、第18週、第20週、第22週。第22週將所有小鼠處死。
| 組別 | 數量(隻) | 組分(μg/隻小鼠) | ||||
| HBsAg | HBcAg | CpG T1 | CpG 7909 | QS-21 | ||
| A | 9 | |||||
| B | 9 | 10 | ||||
| C | 9 | 5 | ||||
| D | 9 | 10 | 5 | |||
| E | 9 | 20 | 10 | |||
| F | 9 | 20 | 10 | 10 | ||
| G | 9 | 20 | 10 | 5 | ||
| H | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 | |
| I | 9 | 20 | 10 | 10 | 5 |
實施例 6 B 型肝炎疫苗對血清中 HBsAg 水準的影響
1、血清HBsAg的檢測步驟：委託南京鼓樓醫院檢測。
使用兩步免疫測定法，首先檢測樣本和包被B型肝炎表面抗體的順磁微粒子結合，經過洗滌，加入吖啶酯標記的B型肝炎表面抗體結合物，再經過洗滌，加入預激發液和激發液到反應混合物中，測定檢測樣本的相對發光值(RLU)，樣本中的HBsAg含量與RLU之間成正相關性，藉由產生的ARCHTITECT HBsAg標準曲線測定小鼠血清樣本中HBsAg濃度，最終小鼠血清樣本中HBsAg濃度為測定值的50~200倍。
2、結果分析(圖7)：含有本發明該免疫刺激物的H組疫苗，對應的HBsAg水準呈明顯下降趨勢，在免疫過程結束後(第14週起)，保持穩定長效的免疫效果，相比單獨的CpG組(F組)和QS-21組(G組)，具有顯著性優勢。H組HBsAg水準從起始＞6350 IU/ml降低到50 IU/ml左右，該組在第二次免疫(第6週)後HBsAg水準即下降30%以上，在第三次免疫(第8週)後HBsAg水準下降70%以上，且在第14週免疫結束後平均下降率維持在92%左右。具有優越的免疫效果。與雙佐劑對照(I組)相比，H在第14週免疫結束後依舊維持穩定的免疫效果，免疫水準顯著優於I組。
實施例 7 B 型肝炎疫苗的體液免疫效果評價
1、血清HBsAb的檢測步驟：委託南京鼓樓醫院檢測。
使用兩步免疫測定法，即首先檢測樣本和重組HBsAg(rHBsAg)包被順磁微粒子混合，經過洗滌，加入吖啶酯標記的rHBsAg結合物，再經過洗滌，加入預激發液和激發液到反應混合物中，測定檢測樣本的相對發光值(RLU)，樣本中的HBsAb含量與RLU之間成正相關性，藉由產生的ARCHTITECT HBsAb校準曲線測定小鼠血清樣本中HBsAb濃度，最終小鼠血清樣本中HBsAb濃度為測定值的50~200倍。
2、結果分析(圖8)：含有該免疫刺激物的H組疫苗在第二次免疫(第6週)後開始產生HBsAb(＞10mIU/ml)，且隨著免疫次數的增加，HBsAb水準呈現不斷增長的趨勢，且增長趨勢顯著優於單獨的CpG組(F組)和QS-21組(G組)。免疫結束後兩週(第十六週)之後HBsAb水準接近飽和，可達4.0個對數值即10000mIU/ml左右的HBsAb水準，與雙佐劑對照(I組)相比，產生的抗體水準也具有顯著性優勢。
實施例 8 B 型肝炎疫苗的細胞免疫效果評價
1、檢測步驟：同實施例2；實驗分組見表6。
2、評價指標：若對照孔斑點數≤5 SCF，樣品孔斑點數≥10 SCF，判定為陽性；若5 SFC＜對照孔斑點數≤10 SCF，樣品孔斑點數/對照孔斑點數≥2，判定為陽性；若對照孔斑點數＞10 SFC，樣品孔斑點數/對照孔斑點數≥3，判定為陽性。
3、實驗結果：
表6 脾細胞分泌的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ的轉陽率
細胞免疫水準檢測結果：ELISPOT斑點結果見圖9和10，分析結果顯示，F組-I組的HBsAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%，HBcAg特異性IFN-γ陽轉率均為100%。含有該免疫刺激物的H組疫苗可誘導產生較高的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準，分別大於2350 SFC/106
脾細胞和大於1250 SFC/106
脾細胞，與單獨的CpG組(F組)和QS-21組(G組)相比，具有顯著性差異。H組與雙佐劑對照(I組)相比，後者誘導產生的HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準約為1630 SFC/106
脾細胞和750 SFC/106
脾細胞左右，顯著低於H組。
| 組別 | 數量(隻) | 陽轉率(%) | |
| HBsAg | HBcAg | ||
| A | 9 | 11.1 | 11.1 |
| B | 9 | 0 | 11.1 |
| C | 8 | 0 | 0 |
| D | 8 | 12.5 | 12.5 |
| E | 9 | 37.5 | 12.5 |
| F | 9 | 100 | 100 |
| G | 8 | 100 | 100 |
| H | 8 | 100 | 100 |
| I | 8 | 100 | 100 |
實施例 9 醫藥組合物在血清中 HBsAg 和 HBcAg 特異性抗體檢測
1、檢測步驟：用純化的HBsAg和HBcAg包被96孔酶標板，形成固相抗原，經過封閉處理後，將待測血清以一定的起始稀釋度作倍比稀釋，設多個稀釋度，在96孔酶標板中加入倍比稀釋後的血清樣本，再與HRP標記的抗IgG/IgG1/IgG2a抗體結合，形成抗原-抗體(血清)-酶標抗體複合物，最後加入底物TMB顯色，並用酶標儀測定450nm波長下的吸光度(OD值)，顯色顏色的深淺與檢測樣本中的HBsAg和HBcAg特異性抗體IgG/IgG1/IgG2a水準呈正相關，藉由擬合“吸光度OD值-血清樣本稀釋倍數(Log)”的關係曲線，進行抗體滴度的判定。
2、結果分析：
1) 血清中HBsAb IgG抗體及亞型檢測結果：
各組不同時間用ELISA方法檢測小鼠血清中HBsAb IgG抗體及亞型水準如圖11所示。含有該免疫刺激物的H組疫苗產生較高滴度的抗HBsAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體，且隨著免疫次數的增加，抗體水準不斷增長，在第六次免疫(第14週)時抗體水準接近飽和，特異性抗體滴度可達5.4個對數值以上；A組-D組未檢測到特異性抗體，E組-G組雖然產生一定的HBsAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體水準，但抗體水準顯著低於H組，雙佐劑對照(I組)產生的抗HBsAg特異性IgG抗體和IgG2a抗體水準顯著低於H組。
2) 血清中HBcAb IgG抗體及亞型檢測結果：
各組不同時間用ELISA方法檢測小鼠血清中HBcAb IgG抗體及亞型水準如圖12所示。含有該免疫刺激物的H組疫苗產生較高滴度的抗HBcAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體，且隨著免疫次數的增加，抗體水準不斷增長，在第六次免疫(第14週)時抗體水準接近飽和，特異性抗體滴度可達4.8個對數值以上；A組-D組未檢測到特異性抗體，E組-G組雖然產生一定的HBcAg特異性IgG/IgG1/IgG2a抗體水準，但抗體水準顯著低於H組。且H組更偏向於Th1通路，D圖可見特異性抗體IgG2a呈顯著上升趨勢，反映出H組疫苗可以促進抗HBcAg抗體亞型轉變，且轉變效率顯著高於雙佐劑對照(I組)。
實施例 10 不同皂苷對醫藥組合物免疫效果的影響
1、實驗動物：C57BL/6(N)小鼠，雄性，4週齡，40隻，上海靈暢實驗動物技術有限公司。
2、試劑材料：
1) HBsAg蛋白、HBcAg蛋白和CpG T1均由實施例1製得；
2) QS-21(CAS.NO.A010-023，購自BRENNTAG公司)；人參皂苷 Rg1(CAS: 22427-39-0，購自南京春秋生物工程有限公司)、黃芪甲苷(CAS: 84687-43-4，購自南京春秋生物工程有限公司)、桔梗皂苷D(CAS: 58479-68-8，購自湖北雲鎂科技有限公司)，Iscom佐劑(購自上海熹垣生物科技有限公司)。
3) 使用PBS溶液(購自Hyclone公司)將HBsAg原液、HBcAg原液分別稀釋至200 μg/ml、100 μg/ml，將各皂苷分別稀釋至50 μg/ml，使用PBS溶液將CpG T1溶解並稀釋至100 μg/ml，供下一步使用。
3、實驗分組：見表7，每次注射量為100μL/隻。其中A組為陰性對照，PBS溶液100μL/隻。
4、實驗步驟：同實施例2。
5、實驗結果：ELISPOT斑點結果見圖13和圖14，結果顯示，CpG T1與各皂苷聯合應用後均產生了高效的協同作用，誘導產生HBsAg和HBcAg特異性IFN-γ水準顯著高於其他CpG和皂苷的組合物，其中，QS21的效果最佳。
表7 實驗動物分組
| 組別 | 數量(隻) | 組分(μg/隻小鼠) | ||||||||
| HBsAg | HBcAg | CpG T1 | QS- 21 | 人參皂苷Rg1 | 桔梗皂苷D | 黃芪甲苷 | Iscom佐劑 | CpG 7909 | ||
| 對照 | 5 | |||||||||
| 抗原 | 5 | 20 | 10 | |||||||
| QS-21 | 5 | 20 | 10 | 10 | 5 | |||||
| 人參皂苷 Rg1 | 5 | 20 | 10 | 10 | 5 | |||||
| 桔梗皂苷D | 5 | 20 | 10 | 10 | 5 | |||||
| 黃芪甲苷 | 5 | 20 | 10 | 10 | 5 | |||||
| Iscom佐劑 | 5 | 20 | 10 | 10 | 5 | |||||
| 7909 | 5 | 20 | 20 | 5 | 10 |
綜上所述，本發明所述的醫藥組合物應用雙佐劑組合，相比單一佐劑、其他CPG佐劑和QS21的組合，本發明的CpG T1~T3與各種佐劑尤其是QS-21表現出高效的協同作用，可以介導更強烈的免疫應答。含有該免疫刺激組合物的醫藥組合物具有顯著性優勢，表現出高效的免疫治療作用，具有很高的臨床應用價值和廣闊的市場前景。
儘管以上已經對本發明作了詳細描述，但是本領域技術人員理解，在不偏離本發明的精神和範圍的前提下可以對本發明進行各種修改和改變。本發明的權利範圍並不限於上文所作的詳細描述，該修改和改變應歸屬於申請專利範圍的範圍。雖然以上僅描述了本發明的具體實施方式的範例，但本領域的技術人員應當理解，以上這些僅為舉例說明，本發明的保護範圍是由所附申請專利範圍限定的。本領域的技術人員在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改，但這些變更或修改均應落入本發明的保護範圍。
無
以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
圖1顯示了不同的CPG寡聚去氧核苷酸對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖2顯示了不同的CPG寡聚去氧核苷酸對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖3顯示了根據本發明的不同的免疫刺激組合物對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖4顯示了根據本發明的不同的免疫刺激組合物對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖5顯示了根據本發明的不同劑量的免疫刺激組合物對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖6顯示了根據本發明的不同劑量的免疫刺激組合物對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖7顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對血清中HBsAg水準的影響；
圖8顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對血清中HBsAb水準的影響；
圖9顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖10顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖11顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對小鼠血清中HBsAg抗原特異性IgG抗體及其亞型水準的影響；
其中，A圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG水準；B圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG1水準；C圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG2a水準；D圖：各組小鼠血清的HBsAb IgG2a與IgG1的比值；
圖12顯示了含有本發明所述的免疫刺激組合物的B型肝炎疫苗對小鼠血清中HBcAg抗原特異性IgG抗體及其亞型水準的影響；
其中，A圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG水準；B圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG1水準；C圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG2a水準；D圖：各組小鼠血清的HBcAb IgG2a與IgG1的比值；
圖13顯示了含有不同皂苷的免疫刺激組合物對HBsAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響；
圖14顯示了含有不同皂苷的免疫刺激組合物對HBcAg抗原特異性IFN-γ分泌水準的影響。
無
Claims (22)
- 一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含： i) B型肝炎表面抗原、該抗原的活性片段、該抗原的變體，或者其中至少兩種的混成物， ii) B型肝炎核心抗原、該抗原的活性片段、該抗原的變體，或者其中至少兩種的混合物， iii) 免疫刺激組合物，其包含皂苷和CpG寡聚去氧核苷酸，或者其由包含皂苷的佐劑和CpG寡聚去氧核苷酸組成，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸序列具有兩個或兩個以上拷貝的5’-TTCGTT-3’基序或5’-TCGTCGTCG-3’基序。
- 如請求項1所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸的序列選自以下中的任一種： CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)、CpG T2：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7)和CpG T3：TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8)； 較佳地，該CpG寡聚去氧核苷酸的序列為CpG T1：TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)。
- 如請求項1或2所述的醫藥組合物，其中，該皂苷選自皂樹皂苷、人參皂苷、桔梗皂苷、黃芪皂苷、三七皂苷、甘草皂苷、合歡皮皂苷、麥冬皂苷、柴胡皂苷或竹節參皂苷中的一種或多種。
- 如請求項3所述的醫藥組合物，其中，該皂樹皂苷為QS-7、QS-17、QS-18或QS-21，較佳地，該皂樹皂苷為QS-21；該人參皂苷為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3、人參皂苷Rb1或人參皂苷Re；該桔梗皂苷為桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2或其兩者的混合物；該黃芪皂苷為黃芪甲苷、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II或其中兩種或兩種以上皂苷單體的混合物；該三七皂苷為三七皂苷R1；該麥冬皂苷為麥冬皂苷D；該柴胡皂苷為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d或其兩者的混合物；該成歡皮皂苷為合歡皮總皂苷；該甘草皂苷為甘草總皂苷；該竹節參皂苷為竹節參總皂苷。
- 如請求項1至4中任一項所述的醫藥組合物，其中，該包含皂苷的佐劑為Iscom佐劑。
- 如請求項1至5中任一項所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸包含硫代磷酸酯連接。
- 如請求項1至6中任一項所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸為硫代寡聚去氧核苷酸。
- 如請求項1至7中任一項所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸為全硫代寡聚去氧核苷酸。
- 如請求項1至8中任一項所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸與皂苷的重量比為1~40：0.1~2，較佳為2~40：0.1~2。
- 如請求項1至9中任一項所述的醫藥組合物，其中，該CpG寡聚去氧核苷酸與皂苷的重量比為2：1。
- 如請求項1至10中任一項所述的醫藥組合物，其中，該B型肝炎表面抗原包含如SEQ ID NO: 1所示的序列或由其組成；該B型肝炎核心抗原包含如SEQ ID NO: 2所示的序列或由其組成。
- 如請求項1至11中任一項所述的醫藥組合物，其中，該B型肝炎核心抗原的活性片段包含SEQ ID NO: 2中的第1位~第X位連續胺基酸或由其組成，其中，X為149至183之間的整數。
- 如請求項12所述的醫藥組合物，其中，該B型肝炎核心抗原的活性片段包含SEQ ID NO: 2中的第1位~第X位連續胺基酸或由其組成，其中，X為152至183之間的整數。
- 如請求項1至13中任一項所述的醫藥組合物，其中，該醫藥組合物的組分i)、ii)和iii)之間的重量比為4：2：1.1~42，較佳為4：2：2.1~42。
- 如請求項1至14中任一項所述的醫藥組合物，其中，該醫藥組合物的組分i)、ii)和iii)之間的重量比為4：2：3。
- 如請求項1至15中任一項所述的醫藥組合物，其中，該醫藥組合物還包含： iv)可藥用載體。
- 一種B型肝炎預防性疫苗或B型肝炎治療性疫苗，其包含如請求項1至16中任一項所述的醫藥組合物。
- 一種請求項1至16中任一項所述的醫藥組合物在製備用於預防和/或治療B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病的藥物中的用途。
- 如請求項18所述的用途，其中，該B型肝炎病毒感染和/或B型肝炎病毒介導的疾病選自B型肝炎、肝硬化和肝癌。
- 一種請求項1至16中任一項所述的醫藥組合物在製備用於在物件中產生針對B型肝炎病毒的體液免疫和/或細胞免疫應答的藥物中的用途。
- 一種請求項1至16中任一項所述的醫藥組合物在製備用於使物件中BB型肝炎核心抗體發生亞型轉變的藥物中的用途。
- 一種請求項1至16中任一項所述的醫藥組合物在製備用於在對象中突破B型肝炎病毒免疫耐受的藥物中的用途。
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