TW201945384A - 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法 - Google Patents

用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201945384A
TW201945384A TW108103881A TW108103881A TW201945384A TW 201945384 A TW201945384 A TW 201945384A TW 108103881 A TW108103881 A TW 108103881A TW 108103881 A TW108103881 A TW 108103881A TW 201945384 A TW201945384 A TW 201945384A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
antibody
protein
modified
dimer
Prior art date
Application number
TW108103881A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI786265B (zh
Inventor
王順海
嚴悅天
Original Assignee
美商再生元醫藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商再生元醫藥公司 filed Critical 美商再生元醫藥公司
Publication of TW201945384A publication Critical patent/TW201945384A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI786265B publication Critical patent/TWI786265B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5032—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on intercellular interactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供在蛋白質之子結構域層級上表徵二聚合界面之系統及方法。例示性方法包括將蛋白質二聚體樣品消化成子結構域，標記該消化之蛋白質樣品，分離標記之二聚體及單體子結構域片段，及對該標記之樣品進行肽映射(mapping)以確定該等二聚體片段經標記之位置及該等二聚體片段未經標記之位置。二聚體部分比單體部分顯示標記程度降低之區域可能與該二聚合界面有關或非常接近。

Description

用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
本發明概言之係關於用於表徵蛋白質及其片段中非共價相互作用位點之分析方法及系統。
在過去之20年中，單株抗體(mAb)已經成功地用於靶向寬範圍之治療領域(Walsh G.,Nature biotechnology 2014；32：992-1000；Lawrence S.Nature biotechnology 2007；25：380-2)。蛋白質聚集仍然係單株抗體及其他治療性蛋白質生產中之主要問題。由於對效力及免疫原性之潛在影響，理解聚集機制非常重要，以使得可實施適當之控制策略來確保產品品質。
由於mAb二聚體之複雜性及異質性，在mAb分子中映射二聚合界面仍然具有挑戰性。儘管氫-氘交換質譜(HDX MS)已經成功地研究了蛋白質-蛋白質相互作用，但在揭露mAb二聚合界面方面幾乎沒有成功，此可能係由於檢測蛋白質側鏈相互作用之方法限制。
因此，本發明之目的係提供用於映射蛋白質之異質二聚合界面之系統及方法。
本發明之另一個目的係提供二聚合程度降低之蛋白質藥物產品。
本發明之另一個目的係提供生產具有減少之二聚合之蛋白質藥物產品之方法。
本文提供在蛋白質之肽/殘基層級上表徵蛋白質二聚合界面之系統及方法。例示性方法包括將蛋白質二聚體樣品消化成子結構域，標記消化之蛋白質樣品混合物，分離標記之二聚體及單體子結構域片段，及對 標記之樣品進行映射以確定並比較二聚體及單體中之標記程度。二聚體部分比單體部分顯示標記程度降低之區域可能與二聚合界面有關或非常接近。
在一個實施例中，藉由肽映射分離及分析非共價二聚體以定位非共價相互作用位點。在另一個在肽/殘基層級上定位非共價二聚合界面之實施例中，將富集之mAb二聚體樣品消化成F(ab)[或F(ab’)]同二聚體、F(ab)[或F(ab’)]及Fc單體之混合物，並進行標記實驗，隨後進行分餾、胰蛋白酶消化及LC-MS分析，用於肽/殘基層級上之標記程度量化及比較。下文提供所揭示方法之步驟之更多細節。
另一個實施例提供產生抗體之方法，其包括以下步驟：在細胞培養物中培養產生抗體之細胞，自細胞培養物獲得樣品，根據上述方法表徵抗體樣品中之二聚合界面，及修改細胞培養物之一或多個培養條件以減少細胞培養期間產生之抗體之二聚合或非共價相互作用/聚集之量。在一些實施例中，在細胞培養期間以任一間隔採集樣品。在其他實施例中，樣品係在生產培養後、蛋白質收穫後或純化後採集。經改變以減少二聚合或聚集之量之細胞培養物之一或多個條件可選自由以下組成之群：溫度、pH、細胞密度、胺基酸濃度、滲透壓、生長因子濃度、攪拌、氣體分壓、表面活性劑或其組合。此等細胞可為真核細胞或原核細胞。細胞可為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS細胞(例如COS-7)、視網膜細胞、Vero細胞、CV1細胞、腎細胞(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa細胞、HepG2細胞、WI38細胞、MRC 5細胞、Colo25細胞、HB 8065細胞、HL-60細胞、淋巴球細胞如自體T細胞、Jurkat(T淋巴球)或Daudi(B淋巴球)、A431(表皮)細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C127細胞、SP2/0細胞、NS-0細胞、MMT細胞、幹細胞、腫瘤細胞以及衍生自任一前述細胞之細胞系。在一個實施例中，細胞係雜交瘤或四源雜交瘤(quadroma)。
另一個實施例提供產生抗體之方法，其包括以下步驟：在細胞培養物中培養產生抗體之細胞，然後純化及配製抗體以獲得配製藥物物質(FDS)，在配製抗體之前及/或之後獲得純化抗體之樣品，根據上述方法表徵 抗體樣品或FDS樣品中之二聚合界面，及修改抗體純化或配製之一或多個條件以減少細胞培養期間產生之抗體之二聚合或非共價相互作用/聚集之量。經改變以減少二聚合或聚集量之抗體純化之一或多個條件可選自由以下組成之群：溫度、pH、親和基質、層析樹脂、緩衝液、過濾器或其組合。經改變以減少二聚合或聚集量之抗體製劑之一或多個條件可選自由以下組成之群：pH、抗體濃度、賦形劑濃度、緩衝液、表面活性劑、穩定劑或其任何組合。FDS之一或多種賦形劑可經改變以減少二聚合或聚集之量，並且選自業內已知賦形劑中之任一者。
另一個實施例提供藉由本文所述方法產生之抗體。
本文亦提供相對於未修飾之蛋白質藥物產品具有減少之二聚合或非共價相互作用之經修飾之蛋白質藥物產品之方法。在一個實施例中，蛋白質藥物產品係單株抗體或其抗原結合片段。
圖1係用於mAb二聚合界面映射之例示性有限消化及單標記策略之工作流程圖。
圖2係所指示鏈/殘基之甘胺酸乙酯鹽酸鹽(GEE)(單體-二聚體)百分比之圖，顯示了由富集HMW樣品之有限Lys-C消化產生之mAb-1 Fab二聚體與Fab單體之間之差異GEE標記圖。
圖3A係在肽層級上mAb-1之所指示抗體片段之GEE百分比之條形圖。圖3B係在胺基酸殘基層級上mAb-2之所指示抗體片段之GEE百分比之條形圖。
圖4A-4C係散點圖，顯示了有限LysC消化之mAb1 HMW樣品之氧化物種之泊松擬合(Poisson fitting)。圖4A代表Fc區，圖4B代表LC區，且圖4C代表Fd區。該線表示每個圖之泊松擬合。
圖5A係在mAb-1肽層級上所指示片段之FPOP修飾程度之條形圖。圖5B係在mAb-1之殘基層級上所指示片段之FPOP修飾程度之條形圖。
圖6A及6B係散點圖，顯示了在不同聚焦位置及雷射功率條件下溶菌酶蛋白之氧化物種之泊松擬合。
圖7A-7F係散點圖，顯示了在不同濃度之清除劑(500μM、350μM或200μM His)及不同雷射功率設置(97mJ或156mJ)下溶菌酶蛋白之氧化物種之泊松擬合。
圖8A-8D係散點圖，顯示了在不同濃度之清除劑(500μM或200μM His)及不同蛋白質濃度(1mg/mL或0.1mg/mL)下溶菌酶蛋白之氧化物種之泊松擬合。
圖9A-9B係散點圖，顯示了mAb1(圖9A)或去醣基化mAb1(圖9B)之氧化物種之泊松擬合。
相關申請案的對照參考
本申請主張於2018年2月2日提出申請之美國臨時專利申請第62/625,732號及於2018年9月28日提出申請之美國臨時專利申請第62/738,051號之權益及優先權，此等申請之全部內容皆以引用方式併入本文中。
I.定義
除非本文另有指示或上下文明顯矛盾，否則在描述目前所主張本發明之上下文中(特別是在申請專利範圍之上下文中)使用術語「一(a、an)」、「該」及類似之指代物應解釋為覆蓋單數及複數。
除非在此另有指示，否則在此列舉值之範圍僅意欲用作個別提及落入該範圍內之每個單獨值之速記方法，並且每個單獨值納入本說明書中，就像在本文個別列舉一樣。
術語「約」之使用意欲描述在高於或低於所述值大約+/-10%範圍內之值；在其他實施例中，此等值之值可以在高於或低於所述值大約+/-5%之範圍內；在其他實施例中，此等值之值可以在高於或低於所述值之大約+/-2%之範圍內；在其他實施例中，此等值之值可以在高於或低於所述值之大約+/-1%之範圍內。前面之範圍意欲藉由上下文來闡明，且並不意味著進一步限制。除非本文另有指示或上下文另外明顯矛盾，否則本文描述之所有方法皆可以任何合適之順序實施。除非另外主張，本文提供之任何 及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)之使用僅僅意欲更好地說明本發明，而不係對本發明之範圍構成限制。本說明書中之任何語言皆不應解釋為指示任何未主張之元素對於實踐本發明之實施係必不可少的。
「蛋白質」係指包含藉由肽鍵彼此連接之兩個或更多個胺基酸殘基之分子。蛋白質包括多肽及肽，且亦可包括修飾，例如醣基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧基化、烷基化、羥基化及ADP-核糖基化。蛋白質可以具有科學或商業價值，包括基於蛋白質之藥物，且蛋白質尤其包括酶、配位體、受體、抗體及嵌合或融合蛋白。蛋白質係由各種類型之重組細胞使用熟知細胞培養方法產生，並且通常係藉由遺傳改造核苷酸載體(例如，編碼嵌合蛋白之序列、密碼子最佳化序列、無內含子序列等)之轉染引入細胞中，在該等細胞中該等載體可以作為附加體存在或者整合至細胞之基因組中。
「抗體」係指由四條多肽鏈(兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L))組成之免疫球蛋白分子，該等重鏈及輕鏈藉由二硫鍵相互連接。每個重鏈具有重鏈可變區(HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區含有CH1結構域、鉸鏈結構域、CH2結構域及CH3結構域。每個輕鏈具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區由一個結構域(CL)組成。VH及VL區可以進一步細分為超變區，稱為互補決定區(CDR)，散佈有更保守之區域，稱為框架區(FR)。每個VH及VL由三個CDR及四個FR構成，自胺基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每個VH/CH1及VL/CL鏈結合(例如藉由二硫鍵)形成一對，或F(ab)，在其N末端具有抗原結合位點。因此，在有限之酶消化後，F(ab)[或F(ab’)]片段係仍然與抗原結合之抗體片段，但係單價的，沒有Fc部分。就抗原結合而言，抗體通常係二價的，且因此包括兩個F(ab)部分，稱為F(ab’)2，藉由上鉸鏈中之二硫鍵連接在一起。F(ab')2片段係藉由有限消化整個抗體以去除大部分Fc區同時保留完整之一些鉸鏈區而產生，並且可進一步減少為F(ab’)片段。術語「抗體」包括任何同種型或亞類之醣基化及非醣基化免疫球蛋白。術語「抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之抗體分子，例如自轉染表現抗體之宿主細胞分離之抗體。術語抗體亦包括雙特異性抗體，其包括可結 合至一個以上不同表位之異四聚免疫球蛋白。就每個抗原結合位點對不同抗原之特異性而言，二價抗體結構亦可係雙特異性的。雙特異性抗體通常描述在美國專利申請公開第2010/0331527號中，該專利申請以引用方式併入本申請中。
「Fc融合蛋白」包含兩種或更多種蛋白質之一部分或全部，其中一種係免疫球蛋白分子之Fc部分，該兩種蛋白質在自然界中原本係不存在的。包含與抗體衍生多肽之不同部分(包括Fc結構域)融合之某些異源多肽之融合蛋白之製備已闡述於例如Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.ScL USA 88：10535,1991；Byrn等人，Nature 344：677,1990；及Hollenbaugh等人，「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」，Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁，1992。「受體Fc融合蛋白」包含與Fc部分偶合之受體之一或多個細胞外結構域，在一些實施例中，該等細胞外結構域包含接在免疫球蛋白CH2及CH3結構域之後之鉸鏈區。在一些實施例中，Fc融合蛋白包含結合至一或多個配位體之兩個或多個不同之受體鏈。舉例而言，Fc融合蛋白係陷阱，例如IL-1陷阱或VEGF陷阱。
「細胞培養」係指細胞在容器如燒瓶或生物反應器中之繁殖或增殖，且包括(但不限於)進料分批培養、連續培養、灌注培養及諸如此類。
術語「MS/MS」係指串聯使用兩個質譜儀之質譜技術。在兩個分析儀(MS1及MS2)之間有一個碰撞氣室。MS1選擇之前體離子與室中之高壓氣體(通常係He)碰撞並經歷片段化。
術語「LC-MS」係指液相層析-質譜，其係將液相層析(或HPLC)之物理分離能力與質譜(MS)之質量分析能力相結合之分析化學技術。
術語「保守胺基酸取代」係指用另一種具有相似性質之胺基酸替代一種胺基酸。預期此種類型之替代很少會導致相應蛋白質之功能障礙。
II.蛋白質藥物產品
一個實施例提供蛋白質藥物產品，其已經修飾以減少蛋白質藥物產品之二聚合或非共價相互作用。修飾可係保守之胺基酸取代。在保守胺基酸取代中，一個胺基酸交換成另一個具有相似性質之胺基酸。預期此 種類型之替代很少會導致相應蛋白質之功能障礙。
A.所欲蛋白質
在一個實施例中，蛋白質藥物產品可含有一或多種適於在原核或真核細胞中表現之所欲蛋白質。舉例而言，所欲蛋白質包括(但不限於)抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生長因子或其片段、細胞介素或其片段、或細胞表面受體之細胞外結構域或其片段。所欲蛋白質可為由單個亞單位組成之簡單多肽或為由兩個或更多個亞單位組成之複雜多亞單位蛋白質。所欲蛋白質可係生物製藥產品、食品添加劑或防腐劑或任何經受純化及品質標準之蛋白質產品。
在一些實施例中，蛋白質產品(所欲蛋白質)係抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙價抗體、三價抗體或四價抗體、雙特異性四價免疫球蛋白G樣分子(稱為雙可變結構域免疫球蛋白(DVD-IG))、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。在一個實施例中，抗體係IgG1抗體。在一個實施例中，抗體係IgG2抗體。在一個實施例中，抗體係IgG4抗體。在另一個實施例中，抗體包含嵌合鉸鏈。在其他實施例中，抗體包含嵌合Fc。在一個實施例中，抗體係嵌合IgG2/IgG4抗體。在一個實施例中，抗體係嵌合IgG2/IgG1抗體。在一個實施例中，抗體係嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗體。
在一些實施例中，抗體係選自由以下組成之群組：抗程式控制性細胞死亡1抗體(例如如美國專利申請公開第US2015/0203579A1號中所述之抗PD1抗體)、抗程式控制性細胞死亡配位體-1(例如如美國專利申請公開第US2015/0203580A1號中所述之抗PD-L1抗體)、抗Dll4抗體、抗血管生成素-2抗體(例如如美國專利第9,402,898號中所述之抗ANG2抗體)、抗血管生成素樣3抗體(例如如美國專利第9,018,356號中所述之抗AngPtl3抗體)、抗血小板源生長因子受體抗體(例如如美國專利第9,265,827號中所述之抗PDGFR抗體)、抗Erb3抗體、抗泌乳素受體抗體(例如如美國專利第9,302,015號中所述之抗PRLR抗體)、抗補體5抗體(例如如美國專利申請公 開第US2015/0313194A1號中所述之抗C5抗體)、抗TNF抗體、抗表皮生長因子受體抗體(例如如美國專利第9,132,192號中所述之抗EGFR抗體或如美國專利申請公開第US2015/0259423A1號中所述之抗EGFRvIII抗體)、抗前蛋白轉化酶枯草溶菌素-9抗體(例如如美國專利第8,062,640號或美國專利申請公開第US2014/0044730A1號中所述之抗PCSK9抗體)、抗生長及分化因子-8抗體(例如抗GDF8抗體，亦稱為抗肌骨素抗體，如美國專利第8,871,209或9,260,515號中所述)、抗升糖素受體(例如如美國專利申請公開第US2015/0337045A1或US2016/0075778A1號中所述之抗GCGR抗體)、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、介白素4受體抗體(例如如美國專利申請公開第US2014/0271681A1號或美國專利第8,735,095號或第8,945,559號中所述之抗IL4R抗體)、抗介白素6受體抗體(例如如美國專利第7,582,298號、第8,043,617號或第9,173,880號中所述之抗IL6R抗體)、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗介白素33(例如如美國專利申請公開第US2014/0271658A1號或第US2014/0271642A1號中所述之抗IL33抗體)、抗呼吸道融合病毒抗體(例如如美國專利申請公開第US2014/0271653A1號中所述之抗RSV抗體)、抗分化簇3(例如如美國專利申請公開第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號及美國申請第62/222,605號中所述之抗CD3抗體)、抗分化簇20(例如如美國專利申請公開第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號及美國專利第7,879,984號中所述之抗CD20抗體)、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗分化簇-48(例如如美國專利第9,228,014號中所述之抗CD48抗體)、抗Fel d1抗體(例如如美國專利第9,079,948號中所述)、抗中東呼吸症候群病毒(例如如美國專利申請公開第US2015/0337029A1號中所述之抗MERS抗體)、抗埃博拉病毒(Ebola virus)抗體(例如如美國專利申請公開第US2016/0215040號中所述)、抗茲卡病毒(Zika virus)抗體、抗淋巴球活化基因3抗體(例如抗LAG3抗體或抗CD223抗體)、抗神經生長因子抗體(例如如美國專利申請公開第US2016/0017029號及美國專利第8,309,088號及第9,353,176號中所述之抗NGF抗體)及抗活化素A抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體係選自由以下組成之群：抗 CD3×抗CD20雙特異性抗體(如美國專利申請公開第US2014/0088295A1號及第US20150266966A1號中所述)、抗CD3×抗黏液素16雙特異性抗體(例如抗CD3×抗Muc16雙特異性抗體)及抗CD3×抗前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體(例如抗CD3×抗PSMA雙特異性抗體)。在一些實施例中，所欲蛋白質係選自由以下組成之群：阿昔單抗(abciximab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿達木單抗-atto、阿多-曲妥珠單抗(ado-trastuzumab)、阿倫珠單抗(alemtuzumab)、阿利人單抗(alirocumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利木單抗(belimumab)、苯雷利珠單抗(benralizumab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、貝洛托單抗(bezlotoxumab)、布利莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、布羅達單抗(brodalumab)、卡那單抗(canakinumab)、卡羅單抗噴地肽(capromab pendetide)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、賽美麗單抗(cemiplimab)、西妥昔單抗(cetuximab)、地諾單抗(denosumab)、地妥昔單抗(dinutuximab)、度匹魯單抗(dupilumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、埃洛妥珠單抗(elotuzumab)、艾美賽珠單抗(emicizumab)-kxwh、阿利人單抗艾坦辛(emtansinealirocumab)、依伐單抗(evinacumab)、依伏庫單抗(evolocumab)、法希姆單抗(fasinumab)、戈利木單抗(golimumab)、古塞庫單抗(guselkumab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、依達賽珠單抗(idarucizumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、英夫利昔單抗-abda、英夫利昔單抗-dyyb、伊匹單抗(ipilimumab)、伊珠單抗(ixekizumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、奈昔木單抗(necitumumab)、奈伐單抗(nesvacumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、奧托昔單抗(obiltoxaximab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、歐瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉單抗(olaratumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、瑞西巴庫單抗(raxibacumab)、瑞麗珠單抗(reslizumab)、利諾庫單抗(rinucumab)、利妥昔單抗(rituximab)、賽瑞蘆單抗(sarilumab)、蘇金單抗(secukinumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、托西莫單抗(tocilizumab)、托西莫單抗、曲妥珠單抗 (trastuzumab)、曲弗單抗(trevogrumab)、優特克單抗(ustekinumab)及維多珠單抗(vedolizumab)。
在一些實施例中，所欲蛋白質係含有Fc部分及另一結構域之重組蛋白(例如，Fc融合蛋白)。在一些實施例中，Fc融合蛋白係受體Fc融合蛋白，其含有與Fc部分偶合之受體之一或多個細胞外結構域。在一些實施例中，Fc部分包含鉸鏈區，其後為IgG之CH2及CH3結構域。在一些實施例中，受體Fc融合蛋白含有兩個或更多個不同之受體鏈，其結合至單個配位體或多個配位體。舉例而言，Fc融合蛋白係TRAP蛋白，例如IL-1陷阱(例如，列洛西普(rilonacept)，其含有與hIgG1之Fc融合之Il-1R1細胞外區融合之IL-1RAcP配位體結合區；見美國專利第6,927,004號，其全文以引用方式併入本文中)或VEGF陷阱(例如，阿柏西普(aflibercept)或ziv-阿柏西普，其包含與hIgG1之Fc融合之VEGF受體Flk1之Ig結構域3之VEGF受體Flt1之Ig結構域2；見美國專利第7,087,411號及第7,279,159號)。在其他實施例中，Fc融合蛋白係ScFv-Fc融合蛋白，其含有與Fc部分偶合之抗體之一或多個抗原結合結構域，例如可變重鏈片段及可變輕鏈片段。
B.生產蛋白質之方法
在一個實施例中，蛋白質藥物產品係在進料分批細胞培養物中生產。在蛋白質生產中，「進料分批細胞培養物」或「進料分批培養物」係指分批培養物，其中細胞及培養基最初供應至培養容器中，並且在培養過程中，在終止培養之前，在有或沒有週期性細胞及/或產物收穫之情況下，以不連續之增量將額外之培養營養物緩慢進給至培養物中。進料分批培養包括「半連續進料分批培養」，其中週期性地去除整個培養物(可能包括細胞及培養基)，並用新鮮培養基代替。進料分批培養不同於簡單的「分批培養」，而用於細胞培養之所有組分(包括動物細胞及所有培養營養物)在分批培養之培養過程開始時供應至培養容器。進料分批培養可以不同於「灌注培養」，由於在標準進料分批過程中上清液沒有自培養容器中去除，而在灌注培養中，細胞藉由例如過濾限制在培養物中，並且培養基連續或間歇地引入培養容器中並自培養容器去除。然而，考慮在進料分批細胞培養期間出於測試目的去除樣品。進料分批過程繼續進行，直至確定達到最大工 作體積及/或蛋白質產量，然後收穫蛋白質。
一個實施例提供在連續細胞培養物中生產之蛋白質藥物產品。片語「連續細胞培養物」係指一種用於連續生長細胞之技術，通常在特定之生長階段。舉例而言，若需要持續供應細胞，或需要生產特定之所欲蛋白質，則細胞培養可能需要維持在特定之生長階段。因此，為了將細胞維持在該特定階段，必須持續監控並相應地調整條件。
用於生產蛋白質藥物產品之細胞培養物包括細胞培養基。術語「細胞培養基」及「培養基」係指用於生長哺乳動物細胞之營養液，其通常提供促進細胞生長所需之營養物，例如碳水化合物能量源、必需胺基酸(例如苯丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、色胺酸、蛋胺酸、白胺酸、異白胺酸、離胺酸及組胺酸)及非必需胺基酸(例如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲胺酸及酪胺酸)、微量元素、能量源、脂質、維生素等。細胞培養基可以含有提取物，例如血清或蛋白腖(水解產物)，其供應支持細胞生長之原料。培養基可以含有酵母源或大豆提取物，而非動物源提取物。化學定義之培養基係指其中所有化學組分皆已知(即具有已知化學結構)之細胞培養基。化學定義之培養基完全不含動物源組分，如血清或動物源蛋白腖。在一個實施例中，培養基係化學定義之培養基。
溶液亦可含有能提高生長及/或存活率超過最小速率之組分，包括激素及生長因子。溶液可以配製成對於培養之特定細胞之存活及增殖最佳之pH及鹽濃度。
「細胞系」係指經由細胞之連續傳代或傳代培養自特定譜系中獲得之一或多種細胞。術語「細胞」與「細胞群」可互換使用。
術語「細胞」包括適於表現重組核酸序列之任何細胞。細胞包括原核生物及真核生物之細胞，例如細菌細胞、哺乳動物細胞、人類細胞、非人動物細胞、鳥類細胞、昆蟲細胞、酵母細胞或細胞融合物，例如雜交瘤或四體雜交瘤。在某些實施例中，細胞係人類、猴子、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在其他實施例中，細胞係選自以下細胞：中國倉鼠卵巢(CHO)(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、視網膜 細胞、Vero、CV1、腎臟(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、淋巴球(例如Jurkat(T淋巴球)或Daudi(B淋巴球))、A431(表皮)、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、幹細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞之細胞系。在一些實施例中，細胞包含一或多個病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如PER.C6®細胞)。在一些實施例中，細胞係CHO細胞。在其他實施例中，細胞係CHO K1細胞。
純化蛋白質之方法為業內所熟知。在細胞培養及蛋白質收穫之後，藥物產品可經歷許多純化步驟，以去除與細胞培養過程相關之雜質，包括宿主細胞蛋白質及藥物產品之異常形式。層析之形式為業內所熟知，例如「親和層析」，其係利用蛋白質之間特定之可逆相互作用而非蛋白質之一般性質(如等電點、疏水性或大小)來實現層析分離之層析方法。「蛋白質A親和層析」或「蛋白質A層析」係指利用蛋白質A之IgG結合結構域對免疫球蛋白分子Fc部分之親和力之特異性親和層析方法。此Fc部分包含人類或動物免疫球蛋白恆定結構域CH2及CH3或與此等結構域實質上相似之免疫球蛋白結構域。其他形式之層析或分離技術包括(但不限於)：蛋白質G親和層析、帶His標籤之親和層析、離子交換(弱陽離子、弱陰離子、強陽離子、強陰離子)層析、尺寸排除層析、反相層析、正相層析、疏水相互作用層析、親水相互作用層析。每種技術皆需要最佳化合適之條件，包括(但不限於)樹脂電荷及大小、洗滌條件、pH、負載體積、負載濃度及諸如此類。超濾及滲濾技術亦可涵蓋於純化製程中。
配製蛋白質之方法為業內所熟知。本發明之藥物產品包括包含本發明抗原結合分子(例如抗體)之液體藥物組合物。本發明之藥物組合物與合適之載劑、賦形劑及提供改進之轉移、遞送、耐受性及諸如此類之其他試劑一起配製。在所有藥物化學家已知之處方集中可找到許多合適之配方：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。舉例而言，賦形劑可包括穩定劑、緩衝劑、張力劑(tonicifier)、表面活性劑、有機溶劑、鹽或其組合。在一些實施例中，穩定劑係選自由以下組成之群組：多元醇、糖、胺基酸、非離子表面活性劑及其組合。在一些實施例中， 張力劑係選自由以下組成之群：糖、胺基酸、鹽及其組合。在一些實施例中，藥物產品係藥物產品之液體製劑或重構凍乾製劑。在一些實施例中，藥物產品係包含兩種或更多種不同抗體之共製劑。
III.用於表徵蛋白質中之二聚合界面之方法
蛋白質聚集仍然係單株抗體生產中之主要問題。由於對純度、效力及免疫原性之潛在影響，理解聚集機制非常重要，以使得可實施適當之控制策略來確保產品品質。由於mAb二聚體之複雜性及異質性，在mAb分子中映射二聚合界面仍然具有挑戰性。儘管氫-氘交換質譜(HDX MS)已經成功地研究了蛋白質-蛋白質相互作用，但在揭露mAb二聚合界面方面幾乎沒有成功，此可能係由於檢測蛋白質側鏈相互作用之方法限制。
為了克服此等障礙，提供新的系統及方法，用於藉由基於MS之綜合方法成功地映射蛋白質之異質二聚合界面(共價及非共價)。圖1提供二聚合界面映射之例示性策略。該蛋白質可為抗體或其抗原結合片段、重組蛋白或融合蛋白。
A.表徵非共價相互作用位點之方法
一個實施例提供在蛋白質之肽/殘基層級上確定二聚合界面之方法。一種例示性方法包括將蛋白質二聚體樣品消化成子結構域，標記消化之蛋白質樣品混合物，分離標記之二聚體及單體子結構域片段，及對標記之樣品進行肽映射，以確定並比較二聚體及單體中之標記程度。二聚體部分比單體部分顯示標記程度降低之區域可能與二聚合界面有關或非常接近。
在一個實施例中，藉由肽映射分離及分析肽以定位非共價相互作用位點。在另一個在肽/殘基層級上定位非共價二聚合界面之實施例中，將富集之mAb二聚體樣品消化成F(ab)[或F(ab’)]同二聚體、F(ab)[或F(ab’)]及Fc單體之混合物，然後進行共價標記實驗，隨後進行SEC分餾、胰蛋白酶消化及LC-MS分析，用於肽/殘基層級上之標記程度量化及比較。在另一個在肽/殘基層級上定位非共價二聚合界面之實施例中，將富集之mAb二聚體樣品消化成F(ab)[或F(ab’)]同二聚體、F(ab)[或F(ab’)]及Fc單體之混合物，然後進行單一FPOP(蛋白質之快速光化學氧化)標記實驗，隨後進行SEC 分餾、胰蛋白酶消化及LC-MS分析，用於肽/殘基層級上之標記程度量化及比較。下文提供所揭示方法之步驟之更多細節。
1.蛋白質二聚體之片段化
在一個實施例中，自細胞培養物獲得蛋白質藥物產品，例如抗體，並富集二聚體以提供富集之二聚體樣品。富集之二聚體樣品可使用多種富集技術產生，包括(但不限於)液相層析。較佳液相層析技術包括(但不限於)尺寸排阻層析。在一些實施例中，富集之二聚體樣品含有除二聚體以外之一些蛋白質聚集體。因此，富集之二聚體樣品不需要僅由二聚體構成。在一個實施例中，富集之二聚體樣品含有超過50%之二聚體。
可使用通常稱為有限消化之習用技術(包括化學及酶技術)來完成蛋白質產品之片段化或消化，例如以保持形成mAb二聚體之非共價相互作用。在一個實施例中，使用蛋白酶在天然條件下消化mAb二聚體樣品，以產生各種Fab及Fc片段，例如F(ab)同二聚體、F(ab)及Fc單體之混合物。例示性蛋白酶係內切蛋白酶LysC。其他蛋白酶包括木瓜蛋白酶及無花果蛋白酶。在一個實施例中，可將mAb二聚體稀釋於10mM Tris-HCl(pH 7.5)中，然後與內切蛋白酶Lys-C(蛋白質：酶=400：1)一起培育。此種有限之消化處理特定裂解Lys殘基處之重鏈，該Lys殘基係兩個鉸鏈區二硫鍵之N末端，產生Fab及Fc片段。來自二聚體物種之任何非共價二聚體相互作用(最常見為F(ab)-F(ab))保持在混合物中。
在另一個實施例中，在天然條件下，使用以名稱FabRICATOR®出售之IdeS蛋白酶將mAb二聚體樣品消化成F(ab’)2及Fc*片段(即兩種藉由非共價相互作用相互作用之Fc多肽，在本文中稱為Fc單體)。首先可將mAb二聚體稀釋於10mM Tris-HCl(pH 8.0)中，且然後用FabRICATOR®(1IUB毫單位/1μg蛋白質)。此種有限之消化處理特定在兩個Gly殘基之間裂解，該兩個殘基係兩個鉸鏈區二硫鍵之C末端。此種處理可產生一個F(ab’)2片段及兩個相同之Fc/2片段，其經由非共價相互作用(Fc*)結合在一起。然後可將消化混合物與還原劑一起培育，該還原劑還原鏈間二硫鍵，同時保持鏈內二硫鍵完整。因此，F(ab’)2片段還原成兩個F(ab’)片段，且Fd及LC經由非共價相互作用結合在一起。來自二聚體物種之非共價二聚體相互作 用(最常見為F(ab’)-F(ab’))亦保持在混合物中。
可使用之例示性還原劑包括(但不限於)二硫蘇糖醇(DTT，CAS 3483-12-3)、β-巰基乙醇(BME、2BME、2-ME、b-mer，CAS 60-24-2)、2-胺基乙烷硫醇(2-MEA-HCl，亦稱為半胱胺-HCl，CAS 156-57-0)、三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP，CAS 5961-85-3)、半胱胺酸鹽酸鹽(Cys-HCl，CAS 52-89-1)或2-巰基乙烷磺酸鈉鹽(MESNA)。用於還原蛋白質鍵之其他方法為業內已知，例如含有樹脂之固定化還原劑管柱，基於硫醇之還原劑已經固定至該樹脂上，以實現肽及蛋白質二硫鍵之固相還原。亦設想適用於還原多肽之間之化學相互作用之還原劑，包括氧化劑。
2.標記蛋白質片段 i.羧基標記
在一個實施例中，使用羧基標記標記消化之mAb樣品。羧基足跡法係一種常用之共價標記技術，藉由用甘胺酸乙酯鹽酸鹽(GEE)標記Asp及Glu殘基之側鏈來研究蛋白質構形及相互作用。在GEE標記反應中，位於蛋白質表面之Asp及Glu殘基之羧基很容易被修飾，而埋藏在蛋白質結構內部之羧基則很少或甚至沒有修飾。在一個實施例中，可將消化之樣品與0.2M 1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及2M GEE混合，並在室溫下培育1小時。可藉由添加1M Tris-HCl(pH 8)淬滅GEE標記反應。在一個實施例中，然後可濃縮樣品溶液。濃縮樣品之方法為業內所熟知。例示性方法包括(但不限於)膜透析、沈澱或鹽析、纖維素膜濃縮器及離心。在較佳實施例中，藉由使用例如Ultracel-10K離心過濾器離心來濃縮樣品。
ii.蛋白質之快速光化學氧化(FPOP)
在一個實施例中，使用FPOP標記消化之mAb樣品。FPOP係一種成熟之羥基自由基標記方法，其以μs時間標度在胺基酸殘基側鏈上標記蛋白質，並已廣泛應用於研究蛋白質-蛋白質/配位體相互作用。在一個實施例中，含有mAb片段之消化的mAb二聚體及非共價連接片段二聚體經緩衝液交換至合適之緩衝液中，例如PBS(pH 7.4)。緩衝液交換係必要的，此乃因淬滅劑與OH自由基反應迅速，在標記過程中應避免。常見之淬滅劑 包括(但不限於)某些緩衝溶液如Tris-HCl及化學品如甘油及DTT。
‧OH標記可導致蛋白質天然構形之構形變化。在一個實施例中，清除劑可用於控制OH自由基壽命，因此蛋白質不會被過度標記，確保捕獲天然構形，而非構形變化之過度標記蛋白質。可使用之例示性清除劑包括(但不限於)Cys、Trp、Tyr、Met、His、Phe、Arg、Ile、Leu、Val、Pro、Gln、Thr及Lys。在較佳實施例中，清除劑係His。首先可將緩衝液交換之混合物與PBS及濃縮清除劑溶液以及H2O2儲備溶液混合。His可以200-500μM之濃度添加。His濃度可為200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475或500μM。例示性混合物含有1mg/mL mAb消化混合物、350μM His及20mM H2O2，以製成最終100μL溶液。在一個實施例中，H2O2可在將溶液注入FPOP管道之前添加。
蛋白質之氧化標記可藉由泊松分佈對未修飾、+16Da、+32Da及+48Da物種之強度建模來監測。可測試氧添加狀態分佈值與泊松分佈之擬合度。在一個實施例中，未擬合至所預測泊松分佈之數據指示蛋白質之過度標記。或者，若數據擬合至泊松模型，則有足夠之標記而不會過度標記蛋白質。
在一個實施例中，可將樣品裝載至100μL氣密注射器中，並經由偶合至150μm內徑熔融石英管道之注射幫浦引入。管道可在面向雷射束之中心有一個透明之窗口。雷射器可係準分子雷射器，例如KrF準分子雷射器。可使用任何市售之準分子雷射器，例如COMPex 50雷射器(Coherent Inc.)。KrF準分子雷射功率可在約100與150mJ/脈衝之間。在較佳實施例中，雷射功率可在約100與120mJ/脈衝之間。雷射器之脈衝頻率可設置為6Hz。透明樣品管窗口處之雷射束寬度可為約1.5mm至3.0mm。雷射寬度可為1.5mm、1.75mm、2mm、2.25mm、2.5mm、2.75mm或3mm。雷射功率可隨時間波動。因此，在一個實施例中，同一組標記實驗可在同一天實施，以獲得最大之標記一致性。在另一個實施例中，可添加劑量計來監測運行至運行之標記效率波動。
打開脈衝雷射器後，樣品溶液可注入管道中，例如流速為23.86μL/min。流速可根據管道內徑、雷射頻率及量測之雷射束寬度進行調節。 流速應足以確保20%之排除體積，以避免重複之‧OH暴露及反應。在一個實施例中，可將毛細管流出物收集至含有溶液之小瓶中，以還原殘餘H2O2。殘餘H2O2之還原可使用還原劑、抗氧化劑或其組合來達成。例示性非酶抗氧化劑包括(但不限於)維生素A、維生素C、維生素E、β-胡蘿蔔素、胡蘿蔔素、牛磺酸、次牛磺酸、麩胱甘肽、硒、鋅、蛋胺酸及泛醌。酶抗氧化劑包括(但不限於)SOD、過氧化氫酶、麩氧還蛋白及麩胱甘肽還原酶。在較佳實施例中，還原殘餘H2O2之溶液含有蛋胺酸及過氧化氫酶。標記之樣品流出溶液可藉由離心、例如使用ultracel-10K離心過濾器濃縮。
iii.標記之mAb片段二聚體及單體之分離
在一個實施例中，共價標記之樣品混合物可使用尺寸排阻層析(例如BEH® SEC管柱)分離。在SEC分離及UV檢測(280nm)後，可收集二聚體及單體片段用於胰蛋白酶肽映射分析。
應理解，所揭示之方法不限於如本文所呈現之分餾(有限消化)及標記步驟之任何特定順序。
iv.標記之二聚體片段之肽映射
在一個實施例中，二聚體及單體部分可經受胰蛋白酶肽映射。胰蛋白酶肽映射之方法為業內已知。在一個實施例中，在胰蛋白酶肽映射之前，二聚體及單體部分可在例如SpeedVac中乾燥，並在含有8M尿素、5mM二硫蘇糖醇(DTT)及0.1M Tris-HCl(pH 7.5)之溶液中重構。變性及還原之樣品可在黑暗中用10mM碘乙醯胺(IAA)烷基化30分鐘。然後，樣品溶液可用0.1M Tris-HCl(pH 7.5)稀釋以降低尿素濃度，並在37℃下用胰蛋白酶以1：20(w/w)之酶/受質比消化過夜。可藉由向每個消化之蛋白質樣品中添加10%甲酸(FA)來停止消化。然後可藉由反相UPLC分離樣品，隨後進行在線質譜分析，以確定肽質量並確認肽身分。在一個實施例中，MS及MS/MS實驗係在Thermo Q Exactive Plus MS系統上進行，該系統在MS/MS實驗期間採用高能碰撞解離(HCD)進行肽片段化。
v.二聚合界面之鑑別及表徵
在羧基標記之一個實施例中，為了鑑別GEE標記之胰蛋白酶肽，例如利用諸如BYONICTM(Protein Metrics)之軟體針對含有相應mAb蛋白質 序列之數據庫或搜索引擎搜索LC-MS/MS數據，其中GEE1(+85.0522)及GEE2(+57.0209)之可變修飾限於Asp及Glu殘基。為了量化每個含有Asp/Glu殘基之胰蛋白酶肽上之GEE標記程度，基於GEE標記肽及天然肽之第一同位素峰之m/z，生成提取之離子層析圖(EIC)，並整合提取之峰面積。使用相對於標記肽及天然肽之峰面積之和之相應EIC峰面積來計算每個GEE標記肽之百分比。在含有多個Asp及Glu殘基之胰蛋白酶肽之情形下，首先檢查在不同滯留時間溶析之GEE標記肽之MS/MS光譜以確認標記位點，且然後使用相應EIC峰面積計算位點特異性標記百分比。最後，比較每種胰蛋白酶肽或殘基之二聚體部分與單體部分之間之GEE標記程度。二聚體部分比單體部分顯示標記程度降低之區域可能與二聚合界面有關或非常接近。
在FPOP標記之一個實施例中，首先針對含有相應mAb蛋白質序列及所有已知氧化標記產物(表1)之數據庫搜索LC-MS/MS數據，以鑑別所有標記產物/肽。基於MS/MS資訊鑑別肽上之修飾位點，並藉由精確之m/z進行確認，且某個肽之修飾程度計算為：
Figure TW201945384A_D0001
，其中Iox係經修飾肽之強度(由於在非標記樣品處理期間引入之Met上可能之氧化而排除Met氧化)，且I係未經修飾肽之強度。對於顯示在二聚體與單體之間在肽層級上修飾程度不同之肽以及含有Met殘基之肽，亦實施殘基層級上之氧化標記之定量分析。肽上之修飾位點指配有MS2資訊。在一些實施例中，倘若由於來自MS2之有限片段化資訊或存在肽異構體共溶析之干擾，不可能定位對單個殘基之修飾，則指示修飾發生在一組可能之殘基上。二聚體部分比單體部分顯示標記程度降低之區域可能與二聚合界面有關或非常接近。
一個實施例提供用於鑑別蛋白質藥物產品中之非共價相互作用位點或二聚合界面之方法，該方法藉由在天然有限消化條件下消化蛋白質藥物產品之富集二聚體樣品，形成含有非共價連接之二聚體子結構域(例如F(ab)二聚體)及單體子結構域之蛋白質藥物混合物樣品，並將可檢測到之修飾引入蛋白質藥物混合物樣品之二聚體及單體中，以產生經修飾之二聚體及經修飾之單體。該方法包括使用天然尺寸排阻層析法將經修飾之二聚體 及經修飾之單體分離成經修飾之二聚體及經修飾之單體部分，並消化經修飾之二聚體及經修飾之單體部分之大量肽鍵以形成消化之肽樣品。該方法亦包括使用液相層析/質譜分析消化之肽樣品，以獲得消化之肽樣品之質譜數據，並使用消化之肽之質譜數據與蛋白質藥物產品之已知質譜數據進行比較，確定消化之肽樣品中消化肽之修飾位點，該等蛋白質藥物產品具有引入蛋白質藥物產品中之特異性殘基修飾。
在一個實施例中，二聚體及單體藉由快速光化學氧化修飾，以使可檢測到之氧化修飾形成於二聚體及單體中。修飾可為胺基酸側鏈修飾。
如上所述，蛋白質藥物產品可為抗體或其抗原結合片段、重組蛋白、融合蛋白或其組合。較佳之蛋白質藥物產品係單株抗體或其抗原結合片段。
在一個實施例中，使用包含乙酸銨及碳酸氫銨之流動相實施天然尺寸排阻層析。在另一個實施例中，用反相液相層析分離消化之蛋白質樣品。
在一個實施例中，修飾係選自由以下組成之群：氧化、二氧化、三氧化、犬尿胺酸、二硫甲基、脫羧基化、氫化犬尿胺酸(hydrozykynurenin)及其組合。
通常，蛋白質藥物產品係用酶消化，例如用蛋白酶消化。用於有限消化之例示性蛋白酶包括(但不限於)木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、內切蛋白酶Lys-C及IdeS。用於肽鍵消化以形成大量肽之例示性蛋白酶包括(但不限於)胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶及rLys-C。
在一些實施例中，蛋白質藥物產品樣品來自進料分批培養。
B.生產具有還原非共價相互作用或聚集之蛋白質藥物產品之方法
一個實施例提供產生抗體之方法，其包括以下步驟：在合適之條件下培養產生抗體之細胞以產生抗體；在合適之條件下純化抗體以提取抗體；在合適之條件下將抗體與賦形劑混合以穩定抗體；由下列取得抗體之樣品，i)自細胞培養物，ii)自細胞培養物純化抗體後，或iii)向純化之抗體中添加賦形劑後；使用本文所揭示之系統及方法表徵抗體中之二聚合界 面，並修改產生抗體之條件或修改抗體之二聚合界面，以相對於未修飾之抗體具有減少之二聚合及非共價相互作用。上文解釋了改變產生抗體之條件。
在一個實施例中，修飾可為保守胺基酸取代或二聚合界面之化學修飾。
實例 實例1：藉由共價標記對二聚體及單體混合物進行單標記 方法 mAb-1之有限消化
mAb-1係IgG1同種型，在天然條件下用內切蛋白酶LysC消化成F(ab)及Fc片段。首先將mAb-1二聚體在10mM Tris-HCl(pH 7.5)中稀釋至1μg/μL，且然後與內切蛋白酶Lys-C(蛋白質：酶=400：1)在37℃培育1小時。此種有限之消化處理特定裂解Lys殘基處之重鏈，該Lys殘基係兩個鉸鏈區二硫鍵之N末端，產生F(ab)及Fc片段。來自二聚體物種之任何非共價二聚體相互作用(最常見為F(ab)-F(ab))保持在混合物中。
mAb-2之有限消化
在天然條件下用來自化膿鏈球菌(Streptocoocus pyogenes)之IdeS酶FabRICATOR®將mAb-2及IgG4同種型消化成F(ab’)2及Fc*片段。首先將mAb-2二聚體在10mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀釋至1μg/μL，且然後用FabRICATOR®(1IUB毫單位/1μg蛋白質)在37℃消化1小時。此種有限之消化處理特定在兩個Gly殘基之間裂解，該兩個Gly殘基係兩個鉸鏈區二硫鍵之C末端。此種處理導致產生一個F(ab’)2片段及兩個相同之Fc/2片段，其經由非共價相互作用(Fc*)結合在一起。然後將消化混合物與5mM之二硫蘇糖醇(DTT)在37℃一起培育30分鐘，此還原了鏈間二硫鍵，同時保持鏈內二硫鍵完整。因此，Fab2片段還原成兩個F(ab’)片段，且Fd及LC經由非共價相互作用結合在一起。來自二聚體物種之非共價二聚體相互作用(最常見為F(ab’)-F(ab’))亦保持在混合物中。
上述產生之mAb片段及非共價連接片段二聚體之混合物首先緩衝液交換至1×PBS(pH 7.4)中達約2mg/mL。
羧基標記
羧基足跡法係一種常用之共價標記技術，藉由用GEE標記Asp及Glu殘基之側鏈來研究蛋白質構形及相互作用。在GEE標記反應中，位於蛋白質表面之Asp及Glu殘基之羧基很容易被修飾，而埋藏在蛋白質結構內部之羧基則很少或甚至沒有修飾。為了進行標記，將100μL消化之mAb-1樣品與50μL 0.2M 1-乙基-3-[3-二甲基胺基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及50μL 2M甘胺酸乙酯鹽酸鹽(GEE)混合，並在室溫下培育1小時。藉由添加500μL 1M Tris-HCl(pH 8)淬滅GEE標記反應後，藉由使用Ultracel-10K離心過濾器離心將樣品溶液濃縮至約40μL。
蛋白質之快速光化學氧化(FPOP)
FPOP係一種成熟之羥基自由基標記方法，其以μs時間標度在胺基酸殘基側鏈標記蛋白質，並已廣泛應用於研究蛋白質-蛋白質/配位體相互作用。在標記過程中，首先將50μL上述緩衝液交換混合物與1×PBS及濃縮His溶液及H2O2儲備溶液混合，製成最終100μL含有1mg/mL mAb-2消化混合物、350μM His及20mM H2O2之溶液。在將溶液注入FPOP管道中之前，添加H2O2。將樣品裝載至100μL氣密注射器中，並經由偶合至150μm內徑熔融石英管道之注射幫浦引入，該管道在面向雷射束之中心有一個透明窗口。KrF準分子雷射功率調節至100-120mJ/脈衝，且其脈衝頻率設置為6Hz。量測透明樣品管窗口處之雷射束寬度為3.0mm。打開脈衝雷射器後，樣品溶液以23.86μL/min之流速注入管道中(根據管道內徑、雷射頻率及量測之雷射束寬度進行調整)，以確保20%之排除體積，避免重複‧OH暴露及反應。將毛細管流出物收集在含有20μL 100mM Met及2μL 1mg/mL過氧化氫酶之小瓶中，以還原殘餘H2O2。最後，藉由使用ultracel-10K離心過濾器離心將標記之樣品溶液濃縮至約40μL。
SEC/MS
將共價標記之樣品混合物注入BEH® SEC管柱(300mm×4.6mm，200Å，1.7μm)中，用流動相(140mM乙酸銨及10mM碳酸氫銨，pH 7.4)以0.2mL/min之流速預平衡。在SEC分離及UV檢測(280nm)後，收集二聚體及單體片段用於胰蛋白酶肽映射分析。
肽映射
在胰蛋白酶消化之前，在SpeedVac中乾燥所有二聚體及單體部分，並在含有8M尿素、5mM二硫蘇糖醇(DTT)及0.1M Tris-HCl(pH 7.5)之溶液中重構，且在50℃下保持30分鐘。在黑暗中用10mM碘乙醯胺(IAA)將變性及還原之樣品烷基化30分鐘。然後將樣品溶液用0.1M Tris-HCl(pH 7.5)稀釋10次，以將尿素濃度降低至0.8M，並在37℃下用胰蛋白酶以1：20(w/w)之酶/受質比消化過夜。然後藉由添加10% FA來停止消化，以製成最終之0.2% FA。然後藉由反相UPLC分離每個消化之蛋白質樣品之等分試樣(約5μg)，隨後進行在線質譜分析，以確定肽質量並確認肽身分。在Thermo Q Exactive Plus MS系統上實施MS及MS/MS實驗，該系統在MS/MS實驗期間採用高能碰撞解離(HCD)進行肽片段化。
結果 羧基標記
對於羧基標記，為了鑑別GEE標記之胰蛋白酶肽，針對含有相應mAb蛋白質序列之數據庫搜索LC-MS/MS數據，其中GEE1(+85.0522)及GEE2(+57.0209)之可變修飾限於Asp及Glu殘基。為了量化每個含有Asp/Glu殘基之胰蛋白酶肽上之GEE標記程度，基於GEE標記肽及天然肽之第一個同位素峰之m/z，生成提取之離子層析圖(EIC)，並整合提取之峰面積。使用相對於標記肽及天然肽之峰面積之和之相應EIC峰面積計算每個GEE標記肽之百分比。在含有多個Asp及Glu殘基之胰蛋白酶肽之情形下，首先檢查在不同滯留時間溶析之GEE標記肽之MS/MS光譜以確認標記位點，且然後使用相應之EIC峰面積計算位點特異性標記百分比。最後，比較每種胰蛋白酶肽或殘基之二聚體部分與單體部分之間之GEE標記程度。二聚體部分比單體部分顯示標記程度降低之區域可能與二聚合界面有關或非常接近(圖2、3A及3B)。
FPOP標記
對於FPOP標記，首先針對含有相應mAb蛋白質序列及所有已知氧化標記產物(表1)之數據庫搜索LC-MS/MS數據，以鑑別所有標記產物。基於MS/MS資訊鑑別肽上之修飾位點，並藉由精確之m/z進行確認，且某 個肽之修飾程度計算為：
Figure TW201945384A_D0002
，其中Iox係修飾肽之強度(由於在 非標記樣品處理期間引入之Met上可能之氧化而排除Met氧化)，且I係未修飾肽之強度。亦對肽進行殘基層級上之氧化標記定量分析，顯示二聚體及單體以及含有Met殘基之肽在肽層級上之修飾程度不同。肽上之修飾位點指配有MS2資訊。在少數情形下，倘若由於MS2之碎片資訊有限或存在肽異構體共溶析之干擾，無法定位對單個殘基之修飾，則指示修飾發生在一組可能之殘基上。在子結構域層級上+0、+16、+32、+48等標記物種之泊松分佈指示沒有過度標記發生(圖4A-4C)。二聚體部分比單體部分顯示標記程度降低之區域可能與二聚合界面有關或非常接近(圖5A及5B)。
實例2：FPOP最佳化 方法：
遵循實例1之FPOP方案。操縱該方案之各個組成部分(即雷射位置、清除劑濃度及納入淬滅劑)以確定其對分析之效應。
結果：
表2顯示圖6A及6B之實驗參數。如圖6A及6B所示，位置及雷射功率影響溶菌酶蛋白之標記效率。使用圖6B之參數(包括更近之聚焦位置及122mJ之雷射功率)分析之樣品中之氧化物質顯示+0、+16、+32...狀態產物分佈與泊松分佈之良好擬合。此指示標記效率提高。
如圖7A-7F及8A-8D中之泊松分佈日期所證實，雷射功率及清除劑濃度在比蛋白質濃度大得多之水準上影響蛋白質之標記效率。
與進行緩衝液交換之mAb1(圖9A)相比，不進行緩衝液交換之去醣基化mAb1顯示標記程度降低(圖9B)。此提示淬滅劑會干擾蛋白質之氧化標記。
儘管在前面之說明書中，已經針對本發明之某些實施例描述了本發明，並且出於說明之目的，已經提出了許多細節，但熟習此項技術者應明瞭，本發明容易受到其他實施例之影響，並且在不背離本發明之基本原理之情況下，本文描述之某些細節可有相當大之變化。
貫穿本揭示案提及之所有參考文獻之全文皆以引用方式併入本文中。

Claims (23)

  1. 一種用於鑑別蛋白質藥物產品中非共價相互作用位點或二聚合界面之方法，其包含：在天然條件下採用蛋白質藥物產品之有限消化，以形成包含單體及非共價連接之二聚體之蛋白質藥物二聚體樣品混合物；將可檢測到之修飾引入該蛋白質藥物二聚體樣品混合物之該等二聚體及該等單體中，以產生經修飾之二聚體及經修飾之單體；使用天然尺寸排除層析將該等經修飾之二聚體及該等經修飾之單體分離成經修飾二聚體及經修飾單體部分；消化該等經修飾之二聚體及該等經修飾之單體部分以形成肽樣品；使用液相層析/質譜(LC-MS)分離該等肽樣品以獲得肽樣品之質譜數據；藉由計算該等蛋白質藥物產品之每個肽及經修飾肽之質量，使用該等肽之該等質譜數據與該等蛋白質藥物產品之已知質量數據進行比較，確定該等肽樣品中每個肽之修飾位點。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中天然有限消化條件保留多肽之間之二硫鍵及二聚體之間之非共價相互作用。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該等二聚體及該等單體藉由快速光化學氧化修飾以使可檢測到之氧化修飾形成於該等二聚體及該等單體中。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中該蛋白質藥物產品包含抗體或其抗原結合片段、重組蛋白、融合蛋白或其組合。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中該蛋白質藥物產品係抗體，且該混合物中之該等二聚體基本上係由兩種相互作用F(ab')或F(ab)片段組成。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該蛋白質藥物產品係抗體，且該混合物中之該等單體基本上係由F(ab)片段及Fc片段組成。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法，其中該修飾係胺基酸側鏈修飾。
  8. 如申請專利範圍第4至7項中任一項之方法，其中該抗體係單株抗體、雙特異性抗體或其抗原結合片段。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之方法，其中該天然尺寸排除層析係使用包含乙酸銨及碳酸氫銨之流動相進行。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之方法，其中該消化之蛋白質樣品係使用反相液相層析分離。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之方法，其中該修飾係選自由以下組成之群組：氧化、二氧化、三氧化、犬尿胺酸、二硫甲基、脫羧基化、羥基犬尿胺酸及其組合。
  12. 如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該蛋白質藥物產品係使用酶消化。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該酶係選自由以下組成之群組：木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、內切蛋白酶Lys-C及IdeS或其經修飾形式。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該等經修飾之二聚體及經修飾之單體部分係藉由酶消化，該酶破壞連接兩個連續胺基酸殘基之共價化學鍵以形成肽。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之方法，其中該蛋白質藥物產品樣品係來自進料批次培養物、純化製程步驟或配製藥物物質。
  16. 一種產生抗體之方法，其包含：在合適之條件下在細胞培養物中培養產生該抗體之細胞以產生該抗體；在合適之條件下純化該抗體以提取該抗體；在合適之條件下混合該抗體與賦形劑以穩定該抗體；由下列獲得該抗體之樣品，i)自該細胞培養物，ii)自該細胞培養物純化該抗體後，或iii)將賦形劑添加至該經純化抗體後； 根據如申請專利範圍第1至15項中任一項之方法表徵該抗體之二聚合界面或非共價相互作用位點，及修改一或多個細胞培養、純化或賦形劑條件以減少該抗體之二聚合或非共價相互作用之量。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中被改變以減少該二聚合或非共價相互作用量之該一或多個條件係選自由以下組成之群組：pH、細胞密度、胺基酸濃度、滲透壓、生長因子濃度、攪拌、溶解氧、金屬離子、氣體分壓、親和基質、層析樹脂、緩衝劑、表面活性劑、穩定劑或其組合。
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項之方法，其中該等細胞係選自由以下組成之群：細菌細胞、酵母細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS細胞(例如COS-7)、視網膜細胞、Vero細胞、CV1細胞、腎細胞(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa細胞、HepG2細胞、WI38細胞、MRC 5細胞、Colo25細胞、HB 8065細胞、HL-60細胞、淋巴球細胞如自體T細胞、Jurkat(T淋巴球)或Daudi(B淋巴球)、A431(表皮)細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C127細胞、SP2/0細胞、NS-0細胞、MMT細胞、幹細胞、腫瘤細胞及衍生自前述細胞中任一者之細胞系。
  19. 如申請專利範圍第16項或第17項之方法，其中該等細胞係雜交瘤細胞或四源雜交瘤細胞。
  20. 一種藉由如申請專利範圍第12至15項中任一項之方法產生之抗體。
  21. 一種製造經修飾抗體之方法，其包含：使用如申請專利範圍第1至15項中任一項之方法表徵該抗體中之二聚合界面或非共價相互作用位點，及修飾該等二聚合界面或非共價相互作用位點中之胺基酸以減少該抗體之二聚合或非共價相互作用。
  22. 一種如申請專利範圍第21項之經修飾抗體。
  23. 如申請專利範圍第21項或第22項之抗體，其中該抗體係單株抗體或其抗原結合片段。
TW108103881A 2018-02-02 2019-01-31 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法 TWI786265B (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862625732P 2018-02-02 2018-02-02
US62/625,732 2018-02-02
US201862738051P 2018-09-28 2018-09-28
US62/738,051 2018-09-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201945384A true TW201945384A (zh) 2019-12-01
TWI786265B TWI786265B (zh) 2022-12-11

Family

ID=65685942

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW108103881A TWI786265B (zh) 2018-02-02 2019-01-31 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
TW111143498A TW202311746A (zh) 2018-02-02 2019-01-31 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111143498A TW202311746A (zh) 2018-02-02 2019-01-31 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法

Country Status (14)

Country Link
US (3) US10718754B2 (zh)
EP (1) EP3746795A1 (zh)
JP (3) JP7171746B2 (zh)
KR (3) KR102486360B1 (zh)
CN (2) CN111630388B (zh)
AU (2) AU2019215125B2 (zh)
BR (1) BR112020013009B1 (zh)
CA (1) CA3085625A1 (zh)
IL (1) IL276102A (zh)
MX (1) MX2020007991A (zh)
SG (1) SG11202005479QA (zh)
TW (2) TWI786265B (zh)
WO (1) WO2019152796A1 (zh)
ZA (1) ZA202003546B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11525823B2 (en) 2018-02-02 2022-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method for characterizing protein dimerization

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021108237A1 (en) * 2019-11-26 2021-06-03 Merck Sharp & Dohme Corp. On-line ultra performance hydrophobic interaction chromatography for monitoring at least one product attribute
IL310875A (en) * 2021-09-14 2024-04-01 Regeneron Pharma NMASS spectrometry-based strategy for characterizing high molecular weight species of a biological product
IL314918A (en) * 2022-02-25 2024-10-01 Regeneron Pharma Size exclusion chromatography for characterizing host cell proteins

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
GB0131014D0 (en) * 2001-12-28 2002-02-13 James Peter Method for molecule-mlecule analysis
DE60309238T2 (de) 2002-03-08 2007-06-06 Asml Netherlands B.V. Lithographische Maske, lithographischer Apparat und Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung
WO2003091720A1 (fr) * 2002-04-26 2003-11-06 Ajinomoto Co., Inc. Technique d'analyse de la structure d'une proteine, analyseur de structure de proteine, programme et support d'enregistrement
CA2603408C (en) * 2005-03-31 2018-08-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP5011277B2 (ja) * 2005-04-06 2012-08-29 アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ホモダイマー、ホモテトラマーまたはダイマーのダイマーのからなる安定に連結された複合体を発生させるための方法および使用
EP2041177B1 (en) 2006-06-02 2011-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity antibodies to human il-6 receptor
US7608693B2 (en) 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor
US7879984B2 (en) 2007-07-31 2011-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human CD20 and method of using thereof
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
KR102010827B1 (ko) 2009-06-26 2019-08-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
US20110151493A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-23 Amgen Inc. Polypeptide disulfide bond analysis
JO3417B1 (ar) 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
US9170262B2 (en) * 2010-06-16 2015-10-27 Abbvie, Inc. Comparison of protein samples
JOP20190250A1 (ar) 2010-07-14 2017-06-16 Regeneron Pharma صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب
AR083044A1 (es) 2010-09-27 2013-01-30 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos
MY158130A (en) 2010-10-06 2016-08-30 Regeneron Pharma Stabilized formulations containing anti-interleukin-4 receptor )il-4r) antibodies
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
JO3412B1 (ar) 2011-06-17 2019-10-20 Regeneron Pharma أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها
JP6177249B2 (ja) 2011-11-14 2017-08-09 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｇｄｆ８及び／又はアクチビンａに特異的に拮抗することによって筋肉量及び筋力を増加させる組成物及び方法
JO3533B1 (ar) 2012-01-23 2020-07-05 Regeneron Pharma تركيبات ثابته تحتوي على مضادات حيوية مقاومة لـ ang2
JO3820B1 (ar) 2012-05-03 2021-01-31 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها
TWI641619B (zh) 2012-06-25 2018-11-21 美商再生元醫藥公司 抗－ｅｇｆｒ抗體及其用途
EP2882778B1 (en) 2012-08-13 2018-04-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
JO3405B1 (ar) 2013-01-09 2019-10-20 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها
JO3532B1 (ar) 2013-03-13 2020-07-05 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها
TWI659968B (zh) 2013-03-14 2019-05-21 再生元醫藥公司 針對呼吸道融合病毒ｆ蛋白質的人類抗體及其使用方法
EP2968454B1 (en) 2013-03-15 2019-02-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il-33 antagonists and uses thereof
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
PL3126388T3 (pl) 2014-03-11 2019-10-31 Regeneron Pharma Przeciwciała anty-egfrviii i ich zastosowania
TWI754319B (zh) 2014-03-19 2022-02-01 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
EP3636073B1 (en) 2014-05-05 2023-11-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized c5 and c3 animals
EP3146345A4 (en) * 2014-05-21 2017-11-29 Reclaimrx, LLC A method for the comparison of protein higher order structures
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
KR20170062466A (ko) 2014-09-16 2017-06-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-글루카곤 항체 및 그것의 사용
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
CN107037116B (zh) * 2016-12-01 2019-04-23 白波 检测gpcr之间相互作用及其交界面的方法
TWI786265B (zh) 2018-02-02 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11525823B2 (en) 2018-02-02 2022-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method for characterizing protein dimerization

Also Published As

Publication number Publication date
KR102486360B1 (ko) 2023-01-09
SG11202005479QA (en) 2020-07-29
CN111630388B (zh) 2024-02-09
JP2023022021A (ja) 2023-02-14
AU2023202820A1 (en) 2023-05-25
ZA202003546B (en) 2023-12-20
BR112020013009A2 (pt) 2020-11-24
JP7171746B2 (ja) 2022-11-15
CN117871866A (zh) 2024-04-12
US10718754B2 (en) 2020-07-21
MX2020007991A (es) 2020-09-09
EP3746795A1 (en) 2020-12-09
US20230110712A1 (en) 2023-04-13
KR20200116913A (ko) 2020-10-13
WO2019152796A1 (en) 2019-08-08
KR102711623B1 (ko) 2024-09-30
US20190242877A1 (en) 2019-08-08
KR20230008920A (ko) 2023-01-16
CN111630388A (zh) 2020-09-04
AU2019215125B2 (en) 2023-03-30
TWI786265B (zh) 2022-12-11
JP7449351B2 (ja) 2024-03-13
IL276102A (en) 2020-08-31
JP2021512300A (ja) 2021-05-13
US11525823B2 (en) 2022-12-13
TW202311746A (zh) 2023-03-16
US20200309768A1 (en) 2020-10-01
KR20240148924A (ko) 2024-10-11
JP2024059930A (ja) 2024-05-01
CA3085625A1 (en) 2019-08-08
AU2019215125A1 (en) 2020-07-23
BR112020013009B1 (pt) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3768709B1 (en) Microchip capillary electrophoresis assays and reagents
JP7449351B2 (ja) タンパク質二量体化を特徴解析するためのシステムおよび方法
JP7349998B2 (ja) サイズバリアントおよび電荷バリアントである薬物製品不純物を特徴解析するためのシステムおよび方法
US20220169704A1 (en) System and method for characterizing drug product impurities
EA045127B1 (ru) Система и способ характеризации димеризации белков
BR122022014045B1 (pt) Método para identificar sítios de interação não covalente ou interfaces de dimerização em um medicamento proteico

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees