RU2577143C2 - Detection of aad-1 of object das-40278-9 - Google Patents

Detection of aad-1 of object das-40278-9 Download PDF

Info

Publication number
RU2577143C2
RU2577143C2 RU2012110253/10A RU2012110253A RU2577143C2 RU 2577143 C2 RU2577143 C2 RU 2577143C2 RU 2012110253/10 A RU2012110253/10 A RU 2012110253/10A RU 2012110253 A RU2012110253 A RU 2012110253A RU 2577143 C2 RU2577143 C2 RU 2577143C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
corn
seq
dna
sequence
specified
Prior art date
Application number
RU2012110253/10A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2012110253A (en
Inventor
Юньсин Кори ЦУЙ
Томас Уилльям ГРИН
Стефен НОВАК
Нин Чжоу
Original Assignee
ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи filed Critical ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи
Publication of RU2012110253A publication Critical patent/RU2012110253A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2577143C2 publication Critical patent/RU2577143C2/en

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

FIELD: chemistry.
SUBSTANCE: invention relates to field of biochemistry, in particular to method for determining zygosity of corn plant, containing transgenic construction, which contains arylozyalkanoate dioxigenase, where said method includes: obtaining sample of genome DNA from said corn plant; obtaining sample, brought in contact, by contact of said DNA sample with first primer and second primer and fluorescent probe, determination of zygosity of said corn plant, as well as to set for its realisation.
EFFECT: invention makes it possible to effectively determine zygosity of corn plant, containing arylozyalkanoate dioxigenase gene.
15 cl, 3 dwg, 1 tbl, 1 ex

Description

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Ген aad-1 (исходно ген Sphingobium herbicidovorans) кодирует белок арилоксиалканоатдиоксигеназу (AAD-1). Этот признак обеспечивает устойчивость к гербицидам 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте и арилоксифеноксипропионату (которые обычно обозначают как гербициды "фоп", такие как диклофоп и кизалофоп), и его можно применять в качестве селективного маркера во время трансформации растения, а также в селекционных питомниках. Роль гена aad-1 в устойчивости к гербицидам впервые раскрыта в WO 2005/107437 (см. также US 2009-0093366).The aad -1 gene (originally the Sphingobium herbicidovorans gene) encodes an aryloxyalkanoate dioxygenase (AAD-1) protein. This feature provides resistance to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and aryloxyphenoxypropionate herbicides (which are commonly referred to as “fop” herbicides such as diclofop and kisalofop) and can be used as a selective marker during plant transformation, as well as in breeding nurseries. Role aad -1 gene for herbicide resistance first disclosed in WO 2005/107437 (see. Also US 2009-0093366).

Известны различные способы детекции объекта (event). Однако все они имеют свои недостатки. Один способ представляет собой пиросеквенирование, как описано Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). По этому способу сконструирован олигонуклеотид, который перекрывается со стыком фланкирующей геномной ДНК и ДНК-вставки. Олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечным ПЦР-продуктом из нужной области (с одним праймером во встроенной последовательности и одним праймером во фланкирующей геномной последовательности) и инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ, сульфурилазы, люциферазы, апиразы, аденозин-5'-фосфосульфата и люциферина. Отдельно добавляют DNTP и оценивают результаты включения по световому сигналу. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно или множество оснований сигнал указывает на наличие вставки/фланкирующей последовательности.There are various methods for detecting an object (event). However, they all have their drawbacks. One method is pyrosequencing as described by Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). According to this method, an oligonucleotide is constructed that overlaps with the junction of the flanking genomic DNA and the DNA insert. The oligonucleotide is hybridized with a single-stranded PCR product from the desired region (with one primer in the inserted sequence and one primer in the flanking genomic sequence) and incubated in the presence of DNA polymerase, ATP, sulfurylase, luciferase, apyrase, adenosine 5'-phosphosulfate and luciferin. Separately, DNTP is added and the inclusion results are evaluated by the light signal. Upon successful amplification, hybridization, and extension to one or multiple bases, the signal indicates the presence of an insert / flanking sequence.

Флуоресцентная поляризация представляет собой другой способ, который можно использовать для детекции ампликона по настоящему изобретению. По этому способу сконструирован олигонуклеотид, который перекрывается со стыком геномной фланкирующей последовательности и ДНК-вставки. Олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечным ПЦР-продуктом из нужной области (с одним праймером во встроенной последовательности и одним праймером во фланкирующей геномной последовательности) и инкубируют в присутствии ДНК-полимеразы и флуоресцентно меченных ddNTP. Однонуклеотидное удлинение приводит к включению ddNTP. Включение можно оценивать по изменению поляризации с применением флюориметра. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно основание изменение поляризации указывает на присутствие трансгенной вставки/фланкирующей последовательности.Fluorescence polarization is another method that can be used to detect the amplicon of the present invention. According to this method, an oligonucleotide is constructed that overlaps with the junction of the genomic flanking sequence and the DNA insert. The oligonucleotide is hybridized with a single-stranded PCR product from the desired region (with one primer in the inserted sequence and one primer in the flanking genomic sequence) and incubated in the presence of DNA polymerase and fluorescently labeled ddNTP. Single nucleotide extension leads to the inclusion of ddNTP. Inclusion can be estimated by the change in polarization using a fluorimeter. Upon successful amplification, hybridization, and one-base extension, a change in polarization indicates the presence of a transgenic insert / flanking sequence.

Описаны молекулярные сигнальные индикаторы для применения в детекции последовательности. В кратком изложении, сконструирован олигонуклеотидный зонд FRET, который перекрывается со стыком геномной фланкирующей последовательности и ДНК-вставки. Благодаря своей уникальной структуре зонд FRET содержит вторичную структуру, которая удерживает флуоресцентные и гасящие фрагменты в непосредственной близости. Зонд FRET и праймеры ПЦР (один праймер во встроенной последовательности и один праймер во фланкирующей геномной последовательности) подвергают циклам гибридизации в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. После успешной ПЦР-амплификации гибридизация зонда FRET с последовательностью-мишенью приводит к удалению вторичной структуры зонда и пространственному отделению флуоресцентной части от нефлуоресцирующей части. В результате этого продуцируется флуоресцентный сигнал. При успешной амплификации и гибридизации этот флуоресцентный сигнал указывает на наличие фланкирующей последовательности/трансгенной вставки.Molecular signal indicators for use in sequence detection are described. In summary, an FRET oligonucleotide probe is constructed that overlaps with the junction of the genomic flanking sequence and the DNA insert. Due to its unique structure, the FRET probe contains a secondary structure that holds the fluorescent and quenching fragments in close proximity. The FRET probe and PCR primers (one primer in the inserted sequence and one primer in the flanking genomic sequence) are subjected to hybridization cycles in the presence of thermostable polymerase and dNTP. After successful PCR amplification, hybridization of the FRET probe with the target sequence leads to the removal of the secondary structure of the probe and the spatial separation of the fluorescent part from the non-fluorescent part. As a result, a fluorescent signal is produced. Upon successful amplification and hybridization, this fluorescent signal indicates the presence of a flanking sequence / transgenic insert.

Анализ на основе гидролиза зондов, иначе известный как метод TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, California), представляет собой способ детекции и количественного определения наличия ДНК-последовательности. В кратком изложении, сконструирован олигонуклеотидный зонд FRET, который перекрывается со стыком геномной фланкирующей последовательности и ДНК-вставки. Зонд FRET и ПЦР-праймеры (один праймер во встроенной ДНК и один праймер во фланкирующей геномной ДНК-последовательности) подвергают циклам гибридизации в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. Гибридизация зонда FRET приводит к отщеплению и высвобождению флуоресцентной части от нефлуоресцирующей части на зонде FRET. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно основание флуоресцентный сигнал указывает на присутствие фланкирующей последовательности/трансгенной вставки.Probe hydrolysis analysis, otherwise known as the TAQMAN method (PE Applied Biosystems, Foster City, California), is a method for detecting and quantifying the presence of a DNA sequence. In summary, an FRET oligonucleotide probe is constructed that overlaps with the junction of the genomic flanking sequence and the DNA insert. The FRET probe and PCR primers (one primer in the inserted DNA and one primer in the flanking genomic DNA sequence) are subjected to hybridization cycles in the presence of thermostable polymerase and dNTP. Hybridization of the FRET probe results in cleavage and release of the fluorescent portion from the non-fluorescent portion on the FRET probe. Upon successful amplification, hybridization, and extension to one base, a fluorescent signal indicates the presence of a flanking sequence / transgenic insert.

Еще одна задача, среди многих других, заключается в поиске подходящего референтного гена для данного теста. Например, как указано в реферате Czechowski et al., "Исключительно большая группа данных, полученных при анализе генома Affymetrix ATH1 GeneChip, предоставляет способы идентификации нового поколения референтных генов с очень стабильными уровнями экспрессии у модельного вида растения Arabidopsis {Arabidopsis thaliana). Найдены сотни генов Arabidopsis, превосходящих традиционно применявшиеся референтные гены в отношении стабильности экспрессии в ходе развития и при различных условиях окружающей среды". (Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17.)Another challenge, among many others, is to find a suitable reference gene for a given test. For example, as cited in an abstract by Czechowski et al., "An exceptionally large group of data from the Affymetrix ATH1 GeneChip genome analysis provides methods for identifying a new generation of reference genes with very stable expression levels in the model plant species Arabidopsis { Arabidopsis thaliana ). Hundreds of genes have been found. "Arabidopsis superior to traditionally used reference genes with respect to expression stability during development and under various environmental conditions." (Czechowski et al. (2005) Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17.)

Brodmann et al. (2002) описывает количественную ПЦР в реальном времени для детекции содержания трансгенной кукурузы в пище для четырех различных сортов кукурузы, утвержденных Европейским Союзом.Brodmann et al. (2002) describes real-time quantitative PCR for detecting transgenic corn in food for four different varieties of corn approved by the European Union.

Brodmann, P.D., P.D., Ilg E. C, Berthoud H., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85 (3).Brodmann, P.D., P.D., Ilg E. C, Berthoud H., and Herrmann, A. Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction Methods for Four Genetically Modified Maize Varieties and Maize DNA Content in Food. J. of AOAC international 2002 85 (3).

Hernandez et al. (2004) указывает четыре возможных гена для применения в ПЦР в реальном времени.Hernandez et al. (2004) indicates four possible genes for use in real-time PCR.

Hernandez, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real-time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637.Hernandez, M., Duplan, M.-N., Berthier, G., Vaitilingom, M., Hauser, W., Freyer, R., Pla, M., and Bertheau, Y. Development and comparison of four real- time polymerase chain reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays LJ Agric. Food Chem. 2004, 52, 4632-4637.

Costa et al. (2007) изучил эти четыре гена (также в контексте ПЦР в реальном времени) и заключил, что гены алкоголь-дегидрогеназы и зеинов представляют собой лучшие референтные гены для детекции образцов "объекта" (гена лектина) в трансгенных продуктах питания. Costa, L. D., and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273.Costa et al. (2007) studied these four genes (also in the context of real-time PCR) and concluded that alcohol dehydrogenase and zein genes are the best reference genes for detecting “object” samples (lectin gene) in transgenic food products. Costa, L. D., and Martinelli L. Development of a Real-Time PCR Method Based on Duplo Target Plasmids for Determining an Unexpected Genetically Modified Soybean Intermix with Feed Components. J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1264-1273.

Huang et al. (2004) применяли плазмиды pMulM2 в качестве референтных молекул для детекции трансгенов MON810 и NK603 у кукурузы. Huang and Pan, "Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods," J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp. 3264-3268.Huang et al. (2004) used plasmids pMulM2 as reference molecules for the detection of MON810 and NK603 transgenes in maize. Huang and Pan, "Detection of Genetically Modified Maize MON810 and NK603 by Multiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods," J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (11), pp. 3264-3268.

Gasparic et al. (2008) предложили технологию ЗНК, созданную на основе способа циклизации зонда, TaqMan и различных составляющих ПЦР в реальном времени, для количественной оценки объектов кукурузы (таких как MON810). Gasparic, Cankar, ZeI, and Gruden, "Comparison of different realtime PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms," BMC Biotechnol. 2008; 8: 26.Gasparic et al. (2008) proposed ZNK technology based on the method of probe cyclization, TaqMan, and various real-time PCR components for quantifying corn objects (such as MON810). Gasparic, Cankar, ZeI, and Gruden, "Comparison of different realtime PCR chemistries and their suitability for detection and quantification of genetically modified organisms," BMC Biotechnol. 2008; 8: 26.

US 20070148646 относится к способу удлинения праймера для количественной оценки, требующему контролируемого высвобождения отдельных нуклеотидов, которые можно детектировать и количественно оценивать на основе числа включенных нуклеотидов. Этот способ отличается от способа ПЦР TaqMan, в котором применяют целый референтный ген.US 20070148646 relates to a quantitative evaluation primer extension method that requires the controlled release of individual nucleotides that can be detected and quantified based on the number of nucleotides incorporated. This method differs from the TaqMan PCR method, in which a whole reference gene is used.

Для различения гомозиготных и гемизиготных генотипов TC 1507 успешно проводили анализ Invader для этого объекта. Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. MoI. Breeding 2008, 21, 173-181.To distinguish between homozygous and hemizygous genotypes, TC 1507 successfully performed Invader analysis for this object. Gupta, M., Nirunsuksiri, W., Schulenberg, G., Hartl, T., Novak, S., Bryan, J., Vanopdorp, N., Bing, J. and Thompson, S. A non-PCR-based Invader Assay Quantitatively Detects Single-Copy Genes in Complex Plant Genomes. MoI Breeding 2008, 21, 173-181.

Huabang (2009) описывает основанный на ПЦР анализ зиготности трансгенной кукурузы. Однако в этой работе не применяли референтных генов. Huabang, "An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize," Molecular Plant Breeding, 2009, Vol.7, No.3, 619-623.Huabang (2009) describes a PCR-based zygosity analysis of transgenic maize. However, reference genes were not used in this work. Huabang, "An Accurate and Rapid PCR-Based Zygosity Testing Method for Genetically Modified Maize," Molecular Plant Breeding, 2009, Vol. 7, No.3, 619-623.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение предоставляет способы детекции наличия объекта AAD-1 кукурузы, обозначаемого DAS-40278-9, в образце (например, в зерне кукурузы). (Образцы семян депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC) под регистрационным номером PTA-10244 (гибридные семена желтой зубовидной кукурузы (Zea Mays L.):DAS-40278-9; депонированы согласно Будапештскому договору Dow AgroSciences LLC; дата получения семян/штамма(ов) в ATTC: 10 июля 2009 года; жизнеспособность подтверждена 17 августа 2009 года.) Также приведены наборы и условия, использованные при проведении анализов.The present invention provides methods for detecting the presence of an AAD-1 corn object, designated DAS-40278-9, in a sample (e.g., corn grain). (Samples of seeds deposited with the American Type Culture Collection (ATCC) under accession number PTA-10244 (hybrid yellow dent corn seeds (Zea Mays L):. DAS -40278-9; deposited under the Budapest Treaty Dow AgroSciences LLC; date of receipt of seeds / strain (s) at ATTC: July 10, 2009; viability confirmed August 17, 2009.) Also sets and conditions used in the analysis are given.

Более конкретно, настоящее изобретение частично относится к анализу TaqMan ПЦР по конечной точке для объекта AAD-1 кукурузы с применением эндогенных референтных генов кукурузы. Некоторые варианты осуществления направлены на способы анализа зиготности с высокой пропускной способностью. Настоящее изобретение далее частично относится к поиску предпочтительных референтных генов инвертаз для применения в определении зиготности.More specifically, the present invention relates in part to TaqMan end-point PCR analysis for a maize AAD-1 object using endogenous maize reference genes. Some embodiments are directed to high throughput zygosity analysis methods. The present invention further relates in part to the search for preferred invertase reference genes for use in determining zygosity.

Таким образом, это изобретение также частично относится к селекции растений, включающей описанные здесь способы детекции. В некоторых вариантах осуществления указанный объект можно "сочетать" с другими признаками, включая, например, другой (другие) ген(ы) устойчивости к гербицидам и/или белки устойчивости к насекомым. Данные процедуры можно использовать для однозначной идентификации линий кукурузы, содержащих объект по настоящему изобретению.Thus, this invention also partially relates to plant breeding comprising the detection methods described herein. In some embodiments, said object can be “combined” with other traits, including, for example, other herbicide resistance gene (s) and / or insect resistance proteins. These procedures can be used to uniquely identify corn lines containing an object of the present invention.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

На фиг. 1 представлена стратегия клонирования ДНК-вставки в объект DAS-40278-9 кукурузы.In FIG. 1 shows a strategy for cloning a DNA insert into a corn object DAS-40278-9.

На фиг. 2 представлена схема праймеров, использованных в ПЦР-амплификации для подтверждения наличия фланкирующих пограничных областей в объекте DAS-40278-9 кукурузы. Схема отображает расположение праймеров для подтверждения полноразмерного секвенса объекта DAS-40278-9 кукурузы AAD-1 от 5'-конца до 3'-конца.In FIG. Figure 2 shows the scheme of the primers used in PCR amplification to confirm the presence of flanking border regions in the DAS-40278-9 object of maize. The scheme displays the location of the primers to confirm the full-length sequence of the DAS-40278-9 object AAD-1 corn from the 5'-end to 3'-end.

На фиг. 3 представлена стратегия клонирования для фланкирующих пограничных областей объекта DAS-40278-9 кукурузы. Геномную ДНК объекта кукурузы DAS-40278-9 расщепляли с применением EcoR V, Stu I или Sca I и составляли соответствующие библиотеки GenomeWalker™, которые использовали как матрицу для амплификации нужной ДНК-последовательности.In FIG. 3 illustrates a cloning strategy for the flanking border regions of a corn object DAS-40278-9 The genomic DNA of the corn object DAS-40278-9 was digested with Eco R V, Stu I or Sca I and the corresponding GenomeWalker ™ libraries were compiled, which were used as a template for amplification of the desired DNA sequence.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙBRIEF DESCRIPTION OF SEQUENCES

SEQ ID NO:1 представляет собой последовательность 5'- и 3'- фланкирующих геномных последовательностей с каждой стороны вставки AAD-1, включая вставку, для объекта DAS-40278-9 кукурузы.SEQ ID NO: 1 is a sequence of 5 ′ and 3 ′ flanking genomic sequences on each side of an AAD-1 insert, including the insert, for maize DAS-40278-9.

SEQ ID NO:2-7 представляют собой праймеры и зонды для применения по настоящему изобретению.SEQ ID NO: 2-7 are primers and probes for use in the present invention.

SEQ ID NO:8 представляет собой пример ампликона объекта.SEQ ID NO: 8 is an example of an amplicon of an object.

SEQ ID NO:9 представляет собой пример референтного ампликона.SEQ ID NO: 9 is an example of a reference amplicon.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Трансгенный объект DAS-40278-9 кукурузы AAD-1 (обеспечивающий устойчивость к гербицидам) получали посредством трансформации встряхиванием клеток в суспензии микроигл. Фланкирующие последовательности как 5'-конца, так и 3'-конца этой трансгенной вставки AAD-1 клонировали, секвенировали и анализировали, как описано в USSN 61/235248 (поданной 19 августа 2009 года).The transgenic object DAS-40278-9 of corn AAD-1 (providing resistance to herbicides) was obtained by transformation by shaking cells in a suspension of microneedles. The flanking sequences of both the 5 ′ end and the 3 ′ end of this AAD-1 transgenic insert were cloned, sequenced, and analyzed as described in USSN 61/235248 (filed August 19, 2009).

Конструировали специальные праймеры TAQMAN и зонды, как описано в настоящем документе, частично соответствующие последовательностям ДНК, расположенным на 5'-конце соединения вставки и геномной ДНК. Проводили успешный дуплексный анализ объект-специфичности праймеров и зондов посредством ПЦР в реальном времени для 16 различных объектов AAD-1 кукурузы и двух нетрансгенных разновидностей кукурузы с геном инвертазы кукурузы в качестве референтного гена. Разработаны процедуры для обработки результатов объект-специфичного анализа TAQMAN для DAS-40278-9 AAD-1 кукурузы, как описано в настоящем документе.Special TAQMAN primers and probes were designed as described herein, partially corresponding to the DNA sequences located at the 5'-end of the insert and genomic DNA compound. A successful duplex analysis of the object-specificity of primers and probes was performed by real-time PCR for 16 different maize AAD-1 objects and two non-transgenic maize varieties with the maize invertase gene as a reference gene. Procedures have been developed for processing the results of an object-specific analysis of TAQMAN for DAS-40278-9 AAD-1 maize, as described herein.

Последовательность, включающая область стыка хозяйской ДНК растения и интегрированной генной конструкции в этой AAD-1 кукурузе, является уникальной. Ее использовали для проведения объект-специфических анализов (традиционной ПЦР или ПЦР в реальном времени) для детекции наличия AAD-1 кукурузы DAS-40278-9 для тестирования ГМО и определения зиготности растений в размножающейся популяции. Объект-специфический анализ TAQMAN, описанный в настоящем документе, можно применять для обеих целей.The sequence, including the junction of the host plant DNA and the integrated gene construct in this AAD-1 corn, is unique. It was used to conduct object-specific analyzes (traditional real-time PCR or PCR) to detect the presence of AAD-1 maize DAS-40278-9 for testing GMOs and determining the zygosity of plants in a breeding population. The TAQMAN object-specific analysis described herein can be used for both purposes.

Настоящее изобретение предоставляет анализы для детекции присутствия представляющего интерес трансгенного объекта DAS-40278-9 кукурузы (также известного как pDAS 1740-278) в образце. Аспекты настоящего изобретения включают способы конструирования и/или получения диагностических молекул нуклеиновой кислоты, приведенных в качестве примеров или предоставленных в настоящем документе.The present invention provides assays to detect the presence of a corn transgenic object DAS-40278-9 of interest (also known as pDAS 1740-278) in a sample. Aspects of the present invention include methods for constructing and / or producing diagnostic nucleic acid molecules, exemplified or provided herein.

Настоящее изобретение также частично относится к селекции растений, включающей любые из этих способов. В некоторых вариантах осуществления объект по настоящему изобретению можно "сочетать" с другими признаками (например, такими как другой (другие) ген(ы) устойчивости к гербицидам и/или гены(ы), кодирующие белки устойчивости к насекомым). Линии растений, содержащие указанный объект, можно детектировать с применением последовательностей, раскрытых и предоставленных в настоящем документе.The present invention also partially relates to plant breeding, including any of these methods. In some embodiments, an object of the present invention may be “combined” with other traits (for example, such as other herbicide resistance gene (s) and / or genes (s) encoding insect resistance proteins). Plant lines containing the indicated object can be detected using the sequences disclosed and provided herein.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к идентификации устойчивых к гербицидам линий кукурузы. Настоящее изобретение частично относится к детекции наличия указанного объекта для выяснения того, несут ли потомки скрещивания представляющий интерес объект. Кроме того, предоставлен способ детекции объекта, полезный, например, с точки зрения соблюдения правил, предписываемых регуляторными органами, дающими разрешение на поступление данного продукта на рынок и требующих, например, наличия на упаковке пищевого продукта информации о том, что он получен из рекомбинантных сельскохозяйственных растений.In some embodiments, the present invention relates to the identification of herbicide-resistant maize lines. The present invention relates in part to detecting the presence of said object to determine whether the descendants of the cross carry an object of interest. In addition, a method for detecting an object is provided, useful, for example, from the point of view of complying with the rules prescribed by regulatory authorities that give permission for a given product to enter the market and require, for example, the presence on the packaging of a food product of information that it was obtained from recombinant agricultural plants.

Настоящее изобретение частично относится к основанной на флуоресценции обработке результатов анализа TaqMan ПЦР с применением эндогенного гена в качестве референтного (число копий) контроля для анализа зиготности объекта кукурузы AAD-1 с высокой пропускной способностью. Настоящее изобретения частично относится к обнаружению предпочтительного референтного гена, инвертазы. Несколько референтных генов указаны в качестве возможных.The present invention partially relates to fluorescence-based processing of TaqMan PCR analysis results using an endogenous gene as a reference (number of copies) controls for analyzing the zygosity of an AAD-1 maize object with high throughput. The present invention relates in part to the discovery of a preferred reference gene, invertase. Several reference genes are indicated as possible.

Настоящее изобретение также частично относится к разработке анализа TaqMan ПЦР по конечной точке для AAD-1 объект-специфического анализа зиготности. Далее, настоящее изобретение частично относится к получению тестовых наборов для селекции AAD-1.The present invention also partially relates to the development of an TaqMan endpoint PCR assay for an AAD-1 object-specific zygosity assay. Further, the present invention partially relates to the production of test kits for the selection of AAD-1.

Анализы TaqMan по конечной точке основаны на стратегии плюс-минус, где "плюс" обозначает образец, положительный на изучаемый ген, a "минус" обозначает образец, отрицательный на изучаемый ген. В этих анализах, как правило, применяют два набора олигонуклеотидов для определения трансгенной последовательности AAD-1 и генной последовательности дикого типа, соответственно, а также двояко-меченные зонды для измерения содержания трансгенной последовательности и последовательности дикого типа.Endpoint TaqMan assays are based on a plus or minus strategy, where plus indicates a sample positive for the gene being studied, and minus indicates a sample negative for the studied gene. These assays typically use two sets of oligonucleotides to determine the AAD-1 transgenic sequence and the wild-type gene sequence, respectively, as well as double-labeled probes to measure the content of the transgenic sequence and the wild-type sequence.

Хотя анализ Invader признан надежным способом оценки объектов, он очень чувствителен к качеству ДНК. Кроме того, для анализа необходимо большое количество ДНК. Для анализа Invader также необходимо проведение дополнительного этапа денатурации, в случае неправильного проведения которого анализ Invader может оказаться неуспешным. Кроме того, проведение анализа Invader занимает много времени, что не позволяет эффективно обрабатывать большое количество образцов AAD-1 для проведения анализа в коммерческих целях. Главное преимущество настоящего изобретения заключается в сокращении времени анализа и исключении этапа денатурации.Although Invader analysis is recognized as a reliable way to evaluate objects, it is very sensitive to DNA quality. In addition, large amounts of DNA are required for analysis. An Invader analysis also requires an additional denaturation step, if not performed correctly, Invader analysis may be unsuccessful. In addition, Invader analysis takes a lot of time, which does not allow efficient processing of a large number of AAD-1 samples for analysis for commercial purposes. The main advantage of the present invention is to reduce analysis time and to eliminate the denaturation step.

Рассматриваемый анализ TaqMan по конечной точке для детекции AAD-1 объектов предоставляет неожиданные преимущества по сравнению с анализом Invader, особенно при обработке большого количества образцов.The end-point TaqMan analysis under consideration for detecting AAD-1 objects provides unexpected advantages over Invader analysis, especially when processing a large number of samples.

Настоящее изобретение может помочь получать и описывать признаки устойчивости AAD-1 к гербицидам у сельскохозяйственных культур, включая кукурузу, сою и хлопок.The present invention can help to obtain and describe signs of resistance of AAD-1 to herbicides in crops, including corn, soy and cotton.

Определения и примеры предоставлены в настоящем документе для удобства описания настоящего изобретения и для указания специалистам в данной области способов осуществления изобретения. Если не указано иначе, термины следует понимать согласно традиционному применению специалистами в соответствующей области. Использована система обозначения оснований ДНК, приведенная в 37 CFR §1.822. Как применяют в настоящем документе, термин "потомство" обозначает потомков любого поколения родительского растения, которое содержит объект DAS-40278-9 кукурузы AAD-1.Definitions and examples are provided herein for the convenience of describing the present invention and for indicating to those skilled in the art how to practice the invention. Unless otherwise indicated, the terms should be understood according to traditional use by those skilled in the art. The DNA base designation system given in 37 CFR §1.822 was used. As used herein, the term "offspring" refers to the descendants of any generation of the parent plant that contains the AAD-1 maize object DAS-40278-9.

Трансгенный "объект" (event) получают трансформацией растительных клеток гетерологичной ДНК, т.е. конструкцией нуклеиновой кислоты, которая включает необходимый трансген, с последующей регенерацией популяции растений в результате встраивания трансгена в геном растения и отбора конкретного растения, характеризующегося наличием вставки в конкретном положении генома. Термин "объект" относится к исходному трансформанту и потомству этого трансформанта, которое включает гетерологичную ДНК. Термин "объект" также означает потомство, продуцированное путем полового ауткроссинга между данным трансформантом и другим сортом, который включает гетерологичную ДНК. Даже после повторного возвратного скрещивания с рекуррентным родителем встроенная ДНК и фланкирующая ДНК от трансформированного родителя присутствует в потомстве этого кросса в том же самом положении хромосомы. Термин "объект" также означает ДНК от исходного объекта, содержащего встроенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, непосредственно смежную со встроенной ДНК, которая, как ожидают, должна передаваться потомству, которое наследует встроенную ДНК, включающую нужный трансген, переданный в результате полового скрещивания родительской линии, содержащей встроенную ДНК (например, исходный трансформант и потомство, полученное в результате самоопыления), с родительской линией, которая не содержит встроенной ДНК.A transgenic “event” is obtained by transforming plant cells with heterologous DNA, i.e. a nucleic acid construct that includes the necessary transgene, followed by regeneration of the plant population by incorporating the transgene into the plant genome and selecting a particular plant, characterized by the presence of an insert at a particular position of the genome. The term "object" refers to the original transformant and offspring of this transformant, which includes heterologous DNA. The term "object" also means offspring produced by sexual outcrossing between a given transformant and another variety that includes heterologous DNA. Even after repeated crossbreeding with the recurrent parent, the integrated DNA and flanking DNA from the transformed parent are present in the offspring of this cross in the same chromosome position. The term “object” also means DNA from a source object containing an integrated DNA and a flanking genomic sequence directly adjacent to the integrated DNA, which is expected to be transmitted to offspring that inherits the integrated DNA including the desired transgene transmitted as a result of sexual crosses of the parent line containing embedded DNA (for example, the original transformant and offspring resulting from self-pollination), with a parent line that does not contain embedded DNA.

"Последовательность стыка" охватывает область, в которой встроенная в геном ДНК стыкуется с ДНК природного генома кукурузы, фланкирующей сайт инсерции. В нее включены последовательности ДНК, охватывающие вставки в объекты кукурузы, описанные в настоящем документе, и имеющие одинаковую длину с фланкирующими ДНК.The “junction sequence" encompasses the region in which the DNA embedded in the genome mates with the DNA of the natural maize genome flanking the insertion site. It includes DNA sequences spanning the inserts in the corn objects described herein and having the same length as the flanking DNAs.

Настоящее изобретение относится к идентификации нужного объекта. Соответствующие ПЦР-праймеры и ампликоны включены в изобретение. Эти молекулы можно использовать для детекции или определения коммерческих разновидностей трансгенной кукурузы или линий, полученных от рассматриваемых линий трансгенной кукурузы.The present invention relates to the identification of the desired object. Appropriate PCR primers and amplicons are included in the invention. These molecules can be used to detect or determine commercial varieties of transgenic corn or lines derived from the transgenic corn lines in question.

Полная последовательность вставки вместе с участками соответствующих фланкирующих последовательностей представлена в настоящем документе в SEQ ID NO: 1. Сайты вставки и фланкирующих последовательностей для этого объекта в отношении SEQ ID NO: 1 (всего 8557 пар нуклеотидов) приведены ниже.The complete insertion sequence along with portions of the corresponding flanking sequences is presented herein in SEQ ID NO: 1. The sites of the insertion and flanking sequences for this object with respect to SEQ ID NO: 1 (total 8557 nucleotides) are given below.

Figure 00000001
Figure 00000001

Компоненты AAD-1 вставки и фланкирующих последовательностей для этого объекта далее приведены на фиг. 1-3.The components of the AAD-1 insert and flanking sequences for this object are further illustrated in FIG. 1-3.

Способы детекции по настоящему изобретению можно использовать в сочетании с селекцией растений для определения того, какие потомки содержат данный объект после скрещивания родительского растения, содержащего представляющий интерес объект, с растением другой линии с целью внесения одного или нескольких дополнительных признаков, представляющих интерес, в потомство. Способы по изобретению можно применять, например, в программах селекции кукурузы, а также в контроле качества, особенно для трансгенных семян кукурузы, применяемых в коммерческих целях. Это также может облегчить регистрацию продуктов и управление производством. Эти способы можно использовать для улучшенных стратегий селекции.The detection methods of the present invention can be used in combination with plant breeding to determine which offspring contain this object after crossing the parent plant containing the object of interest with another line plant in order to introduce one or more additional traits of interest into the offspring. The methods of the invention can be used, for example, in corn breeding programs, as well as in quality control, especially for transgenic corn seeds used for commercial purposes. It can also facilitate product registration and production management. These methods can be used for improved selection strategies.

В некоторых вариантах осуществления основанный на флуоресценции анализ TaqMan по конечной точке для определения зиготности позволяет непосредственно анализировать результаты в спектрофотометре для чтения планшетов с идентификацией AAD-1 объекта в кукурузе и референтного гена.In some embodiments, the implementation of fluorescence-based TaqMan endpoint analysis for determining zygosity allows direct analysis of the results in a spectrophotometer for reading tablets with identification of the AAD-1 object in corn and the reference gene.

Настоящее изобретение включает области применения в селекции, такие как анализ интрогрессии AAD-1 объекта в другие линии кукурузы.The present invention includes applications in breeding, such as analysis of the introgression of an AAD-1 object into other maize lines.

Способы детекции и наборы по настоящему изобретению можно использовать для определения объектов согласно настоящему изобретению. Способы и наборы по настоящему изобретению можно использовать для улучшенных стратегий селекции и анализа сцепления генов.Detection methods and kits of the present invention can be used to identify objects according to the present invention. The methods and kits of the present invention can be used for improved strategies for selection and analysis of gene linkage.

Способы детекции по настоящему изобретению особенно эффективны в сочетании с селекцией растений для определения того, какие потомки содержат данный объект после скрещивания родительского растения, содержащего представляющий интерес объект, с растением другой линии с целью передачи одного или нескольких дополнительных признаков, представляющих интерес, потомству. Эти способы анализа Taqman ПЦР эффективны для применения в программах селекции кукурузы, а также в контроле качества, особенно для коммерчески используемых семян кукурузы. Также можно получать и применять наборы Taqman ПЦР для таких линий трансгенной кукурузы. Это также может быть эффективным для регистрации продуктов и управления производством.The detection methods of the present invention are particularly effective in combination with plant breeding to determine which offspring contain the given object after crossing the parent plant containing the object of interest with another line plant in order to transmit one or more additional traits of interest to the offspring. These Taqman PCR assay methods are effective for use in maize breeding programs as well as in quality control, especially for commercially used maize seeds. Taqman PCR kits can also be prepared and used for such transgenic maize lines. It can also be effective for product registration and production management.

Более того, указанные способы можно использовать для изучения и описания процесса интеграции трансгена, описания геномного сайта интеграции, сортировки объектов, стабильности трансгенов и их фланкирующих последовательностей и генной экспрессии (особенно относящейся к подавлению транскрипции гена, паттернам метилирования трансгена, эффекту положения и потенциально связанным с экспрессией элементами, такими как MARS [районы присоединения к ядерному матриксу], и т.п.).Moreover, these methods can be used to study and describe the process of transgene integration, to describe the genomic integration site, sort objects, stability of transgenes and their flanking sequences and gene expression (especially related to suppression of gene transcription, transgene methylation patterns, position effect and potentially related expression by elements such as MARS [regions of attachment to the nuclear matrix], etc.).

Как применяют в настоящем документе, термин "кукуруза" означает маис (Zea mays) и включает все его разновидности, которые можно скрестить с кукурузой.As used herein, the term "corn" means maize ( Zea mays ) and includes all varieties that can be crossed with corn.

Настоящее изобретение далее включает способы скрещивания и применение способов по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение включает способ получения гибридных семян F1 посредством скрещивания представленного в качестве примера растения с другим (например, инбредным родительским) растением с получением гибридных семян, и детекцию необходимого объекта. Качества полученных растений можно также улучшать посредством объединения способов по настоящему изобретению.The present invention further includes crossing methods and the application of the methods of the present invention. For example, the present invention includes a method for producing F 1 hybrid seeds by crossing an exemplary plant with another (eg, inbred parent) plant to produce hybrid seeds, and detecting the desired object. The qualities of the resulting plants can also be improved by combining the methods of the present invention.

Устойчивые к гербицидам растения кукурузы можно скрещивать посредством полового скрещивания первого родительского растения, представляющего собой растение кукурузы, выращенное из семян линии, указанной в настоящем документе, со вторым родительским растением кукурузы с получением множества растения первого поколения; и затем отбора растения первого поколения, устойчивого к гербициду (или несущего рассматриваемый объект); и самоопыления растений первого поколения с получением множества растения второго поколения; и затем отбора из растений второго поколения растения, устойчивого к гербициду (или несущего, по меньшей мере, один из объектов). Эти этапы могут далее включать возвратное скрещивание растения первого поколения или растения второго поколения со вторым родительским растением кукурузы или третьим родительским растением кукурузы. Урожай зерна, содержащий семена кукурузы по настоящему изобретению, или их потомство, можно высаживать.Herbicide-resistant corn plants can be crossed by sexually mating the first parent plant, which is a corn plant grown from the seeds of the line described herein, with a second parent corn plant to produce multiple first-generation plants; and then selecting a first-generation plant resistant to the herbicide (or carrying the subject in question); and self-pollination of plants of the first generation to obtain many plants of the second generation; and then selection from plants of the second generation of the plant resistant to the herbicide (or carrying at least one of the objects). These steps may further include backcrossing the first generation plant or second generation plant with the second parent corn plant or third parent corn plant. A grain crop containing the corn seeds of the present invention, or their offspring, can be planted.

Также необходимо понимать, что два различных трансгенных растения также можно скрещивать с получением потомства, которое содержит два независимо сегрегирующихся экзогенных гена. В результате самоопыления соответствующего потомства можно получать растения, гомозиготные по обоим этим экзогенным генам. В настоящем изобретении также рассматривается возвратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, а также вегетативное размножение. Другие способы скрещивания, общеупотребительные для различных признаков и культур, также известны в данной области. Возвратное скрещивание применяли для переноса генов, кодирующих признаки с простым доминантным наследованием, в нужную гомозиготную культурную или инбредную линию, которая представляет собой рекуррентного родителя. Растение-носитель признака, подлежащего переносу, называют родителем-донором. Ожидают, что полученное растение несет признаки рекуррентного родителя (например, культурного сорта) и желаемый признак, полученный от родителя-донора. После первого скрещивания отбирают растения, обладающие фенотипом родителя-донора, и повторно скрещивают их (возвратное скрещивание) с рекуррентным родителем. Ожидают, что полученное растение несет признаки рекуррентного родителя (например, культурного сорта) и желаемый признак, полученный от родителя-донора.It should also be understood that two different transgenic plants can also be crossed to produce offspring that contain two independently segregated exogenous genes. As a result of self-pollination of the corresponding offspring, it is possible to obtain plants homozygous for both of these exogenous genes. The present invention also contemplates crossbreeding with a parent plant and outcrossing with a non-transgenic plant, as well as vegetative propagation. Other crossing methods commonly used for various traits and cultures are also known in the art. Backcrossing was used to transfer genes encoding traits with simple dominant inheritance to the desired homozygous cultural or inbred line, which is a recurrent parent. The carrier plant of the trait to be transferred is called the donor parent. The resulting plant is expected to bear the traits of a recursive parent (e.g., cultivar) and the desired trait received from the donor parent. After the first crossover, plants possessing the phenotype of the donor parent are selected, and they cross-cross (backcrossing) with the recurrent parent. The resulting plant is expected to bear the traits of a recursive parent (e.g., cultivar) and the desired trait received from the donor parent.

Настоящее изобретение можно использовать в сочетании со способом скрещивания с применением маркера (MAB). Также молекулы ДНК по настоящему изобретению можно использовать с другими способами (такими как маркеры AFLP, маркеры RFLP, маркеры RAPD, SNP и SSR), которые позволяют идентифицировать генетически сцепленные агрономически полезные признаки. Признаки устойчивости к гербицидам можно отслеживать у потомства кросса (или потомков этого потомства и любых других культурных сортов или разновидностей кукурузы) с применением способов MAB. Способы по настоящему изобретению можно использовать для идентификации любых разновидностей кукурузы, несущих представляющий интерес объект.The present invention can be used in combination with a marker crossing method (MAB). Also, the DNA molecules of the present invention can be used with other methods (such as AFLP markers, RFLP markers, RAPD, SNP and SSR markers), which allow the identification of genetically linked agronomically useful traits. Signs of resistance to herbicides can be monitored in the offspring of cross (or offspring of this offspring and any other cultivars or varieties of corn) using MAB methods. The methods of the present invention can be used to identify any varieties of maize bearing an object of interest.

Способы по настоящему изобретению включают способ получения устойчивых к гербицидам растений кукурузы, где указанный способ включает скрещивание с растением, несущим представляющий интерес объект. Предпочтительные способы дополнительно включают отбор потомков от указанного кросса посредством проверки указанного потомства на наличие объекта, детектируемых согласно настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение можно использовать для отслеживания нужного объекта в циклах скрещивания растений, несущих желаемые признаки, такие как агрономические признаки. Растения, содержащие нужный объект и желаемые признаки, можно, например, детектировать, идентифицировать, отбирать и быстро применять в дальнейших циклах скрещивания. Нужный объект/признак можно также сочетать посредством скрещивания с признаком (признаками) устойчивости к насекомым и/или дополнительными признаками устойчивости к гербицидам и отслеживать согласно настоящему изобретению. Один предпочтительный вариант осуществления представляет собой растение, содержащее нужный объект в сочетании с геном, кодирующим устойчивость к гербицидам имидазолинону, глифосату и/или глуфосинату. В некоторых вариантах осуществления можно применять ген устойчивости к дикамбе.The methods of the present invention include a method for producing herbicide-resistant maize plants, wherein said method comprises crossbreeding with a plant bearing an object of interest. Preferred methods further include selecting offspring from said cross by checking said offspring for the presence of an object detectable according to the present invention. For example, the present invention can be used to track a desired object in cross-breeding cycles of plants bearing desired traits, such as agronomic traits. Plants containing the desired object and desired traits can, for example, be detected, identified, selected and quickly applied in further crosses. The desired object / sign can also be combined by crossing with the sign (s) of resistance to insects and / or additional signs of resistance to herbicides and track according to the present invention. One preferred embodiment is a plant containing the desired object in combination with a gene encoding the herbicide resistance of imidazolinone, glyphosate and / or glufosinate. In some embodiments, a dicamba resistance gene can be used.

Таким образом, настоящее изобретение можно комбинировать с, например, генами, кодирующими устойчивость к глифосату (например, устойчивое растение или бактериальные EPSPS, GOX, GAT), устойчивость к глуфосинату (например, Pat, bar), устойчивость к гербицидам, ингибирующим ацетолактатсинтазу (ALS) (например, имидазолинонам [таким как имазетапир], сульфонилкарбамиду, триазолопиримидина сульфонанилиду, пиримидинилтиобензоатам и другим химическим соединениям [Csrl, SurA, et al.]), устойчивость к бромоксинилу (например, Bxn), устойчивость к ингибиторам фермента HPPD (4-гидроксифенил-пируват-диоксигеназа), устойчивость к ингибиторам фитоен десатуразы (PDS), устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосистему II (например, psbA), устойчивость к гербицидам, ингибирующим фотосистему I, устойчивость к гербицидам, ингибирующим протопорфириноген оксидазу IX (PPO) (например, PPO-I), устойчивость к гербицидам фенилуреи (например, CYP76B1), дикамба-разрушающим ферментам (см., например, US 20030135879), и другими, которые можно сочетать по отдельности или в сложных комбинациях для предоставления возможности эффективного контроля или предотвращения заражения сорными растениями и/или устойчивости к гербицидам указанных выше классов.Thus, the present invention can be combined with, for example, genes encoding glyphosate resistance (e.g., a resistant plant or bacterial EPSPS, GOX, GAT), glufosinate resistance (e.g. Pat, bar), resistance to acetolactate synthase inhibiting herbicides (ALS ) (for example, imidazolinones [such as imazetapyr], sulfonylcarbamide, triazolopyrimidine sulfonanilide, pyrimidinylthiobenzoates and other chemical compounds [Csrl, SurA, et al.]), resistance to bromoxynil (eg Bxn), resistance to enzyme inhibitors 4 (enzyme 4) hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase), resistance to phytoene desaturase inhibitors (PDS), resistance to photosystem II inhibitors (e.g. psbA), resistance to photosystem I inhibitors, resistance to protoporphyrinogen oxidase IX inhibitors (PPO) (e.g. , PPO-I), resistance to phenyluric herbicides (e.g., CYP76B1), dicamba-degrading enzymes (see, for example, US 20030135879), and others that can be combined individually or in complex combinations to provide effective control or other dotvrascheniya infection weeds and / or herbicide resistance classes mentioned above.

В отношении дополнительных гербицидов некоторые дополнительные предпочтительные ALS (также известные как AHAS) ингибиторы включают триазолопиримидина сульфонанилиды (такие как клорансулам-метил, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пеноксулам), пиримидинилтиобензоаты (такие как биспирибак и пиритиобак) и флукарбазон. Некоторые предпочтительные ингибиторы HPPD включают мезотрион, изоксафлютол и сулькотрион. Некоторые предпочтительные ингибиторы PPO включают флумиклорак, флумиоксазин, флуфенпир, пирафлуфен, флутиацет, бутафенацил, карфентразон, сульфентразон и дифенилэфиры (такие как ацифлуорфен, фомесафен, лактофен и оксифлуорфен).For additional herbicides, some additional preferred ALS (also known as AHAS) inhibitors include triazolopyrimidine sulfonanilides (such as cloransulam methyl, diclosulam, flurasulam, flumetsulam, metosulam and penoxulam), pyrimidinyl thiobenzoates (such as bispiribibacone and). Some preferred HPPD inhibitors include mesotrione, isoxaflutol, and sulcotrione. Some preferred PPO inhibitors include flumiclorac, flumioxazine, flufenpyr, piraflufen, flutiacet, butafenacil, carfentrazone, sulfentrazone and diphenylethers (such as acifluorfen, fomesafen, lactofen and oxyfluorfen).

Кроме того, AAD-1 по отдельности или в сочетании с одним или несколькими дополнительными признаками HTC можно сочетать с одним или несколькими дополнительными первичными (например, устойчивость к насекомым, устойчивость к грибам или устойчивость к стрессу и др.) или вторичными (например, повышенная урожайность, улучшенные характеристики масел, повышенное качество волокон и др.) признаками. Таким образом, настоящее изобретение можно применять для предоставления полного агрономического набора, включающего улучшенное качество культуры и возможность гибкого контроля любого количества сельскохозяйственных вредителей с оптимальными затратами.In addition, AAD-1, individually or in combination with one or more additional HTC features, can be combined with one or more additional primary (for example, insect resistance, resistance to fungi or stress resistance, etc.) or secondary (for example, increased productivity, improved characteristics of oils, increased quality of fibers, etc.) signs. Thus, the present invention can be applied to provide a complete agronomic set, including improved crop quality and the ability to flexibly control any number of agricultural pests with optimal costs.

Как применяют в настоящем документе, "линия" представляет собой группу растений, которая характеризуется низким генетическим разнообразием или ее отсутствием между индивидуумами для, по меньшей мере, одного признака. Такие линии можно получать посредством самоопыления и отбора для нескольких последовательных поколений, или посредством вегетативного размножения одного родительского растения с применением способов тканевой или клеточной культуры.As used herein, a “line” is a group of plants that is characterized by low genetic diversity or lack thereof between individuals for at least one trait. Such lines can be obtained by self-pollination and selection for several successive generations, or by vegetative propagation of one parent plant using tissue or cell culture methods.

Как применяют в настоящем документе, термины "культурный сорт" и "разновидность" являются синонимами и относятся к линии, которую применяют для коммерческого производства.As used herein, the terms "cultivar" and "variety" are synonymous and refer to the line used for commercial production.

"Стабильность" или "стабильный" означает, что в отношении данного компонента компонент получают от поколения к поколению, и, предпочтительно, по меньшей мере, в течение трех поколений, на практически одинаковом уровне, например, предпочтительно ±15%, более предпочтительно ±10%, наиболее предпочтительно ±5%. На стабильность может влиять температура, место, стресс и время посадки. При сравнении последовательных поколений в полевых условиях уровни получения компонента должны быть сходными."Stability" or "stable" means that in relation to this component, the component is obtained from generation to generation, and preferably at least for three generations, at almost the same level, for example, preferably ± 15%, more preferably ± 10 %, most preferably ± 5%. Stability can be affected by temperature, location, stress, and landing time. When comparing successive generations in the field, the levels of component production should be similar.

Под "коммерческой пригодностью" понимают высокую мощность растений и высокую фертильность, в связи с чем урожай могут получать фермеры, применяющие традиционное фермерское оборудование, а из семян можно выделять масло с описанными компонентами с применением традиционного дробильного и экстракционного оборудования. Коммерчески пригодный урожай при оценке по массе семян, содержанию масла и общему количеству масла, получаемому в расчете на акр, отличается не более 15% от среднего урожая сопоставимой коммерческой разновидности кукурузы без признаков исключительных признаков, растущей в том же регионе.By "commercial suitability" is meant a high plant capacity and high fertility, in connection with which farmers using traditional farm equipment can get a crop, and oil with the described components can be extracted from seeds using traditional crushing and extraction equipment. A commercially viable crop, when estimated by seed weight, oil content and total oil per acre, differs by no more than 15% from the average yield of a comparable commercial variety of maize without signs of exceptional growth in the same region.

"Агрономически ценный" означает, что линия обладает желаемыми агрономическими характеристиками, такими как урожайность, спелость, устойчивость к заболеваниям и т.п., в дополнение к устойчивости к насекомым, обусловленной рассматриваемым(и) объектом (объектами). Агрономические признаки рассматривают по отдельности или в сочетании.“Agronomically valuable” means that the line possesses the desired agronomic characteristics, such as yield, ripeness, disease resistance, etc., in addition to insect resistance due to the object (s) in question. Agronomic traits are considered individually or in combination.

Специалисты в данной области в свете настоящего изобретения должны понимать, что предпочтительные варианты осуществления наборов для детекции, например, могут включать зонды и/или праймеры. Например, они включают полинуклеотидные зонды, праймеры и/или ампликоны, как указано в настоящем документе.Specialists in this field in the light of the present invention should understand that the preferred embodiments of the kits for detection, for example, may include probes and / or primers. For example, they include polynucleotide probes, primers, and / or amplicons, as described herein.

Специалисты в данной области также должны понимать, что можно конструировать праймеры и зонды для гибридизации в диапазоне стандартных условий гибридизации и/или ПЦР с участком SEQ ID NO:1 (или комплементарной последовательности) и комплементарными ему последовательностями, где праймер или зонд не полностью комплементарны приведенной в качестве примера последовательности. Таким образом, можно допускать некоторую степень нарушения комплементарности. Например, для праймера длиной в приблизительно 20 нуклеотидов, как правило, один или два или т.п. нуклеотидов могут не связываться с противолежащей нитью, если некомплементарное основание является внутренним или находится на конце праймера, противоположном ампликону. Различные подходящие условия гибридизации приведены ниже. Синтетические аналоги нуклеотидов, такие как инозин, также можно использовать в зондах. Также можно использовать зонды из пептидных нуклеиновых кислот (ПНК), а также ДНК- и РНК-зонды. Важно, что такие зонды и праймеры являются диагностическими признаками (способными однозначно идентифицировать и различать) на наличие объекта по настоящему изобретению.Specialists in this field should also understand that it is possible to design primers and probes for hybridization in the range of standard hybridization conditions and / or PCR with the plot of SEQ ID NO: 1 (or a complementary sequence) and its complementary sequences, where the primer or probe is not completely complementary to the above as an example of a sequence. Thus, a degree of complementarity violation can be tolerated. For example, for a primer of approximately 20 nucleotides in length, typically one or two or the like. nucleotides may not bind to the opposite strand if the non-complementary base is internal or is located at the end of the primer opposite the amplicon. Various suitable hybridization conditions are given below. Synthetic nucleotide analogs, such as inosine, can also be used in probes. You can also use probes from peptide nucleic acids (PNAs), as well as DNA and RNA probes. It is important that such probes and primers are diagnostic features (capable of uniquely identifying and distinguishing) for the presence of the object of the present invention.

Компоненты каждой "вставки" приведены на фиг. 1-3. Полинуклеотидные последовательности ДНК этих компонентов или их фрагментов можно использовать в качестве ДНК-праймеров или зондов в способах по настоящему изобретению.The components of each insert are shown in FIG. 1-3. Polynucleotide DNA sequences of these components or fragments thereof can be used as DNA primers or probes in the methods of the present invention.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предоставлены композиции и способы детекции наличия области-вставки трансген/геном у растений и семян и т.п. кукурузы.In some embodiments, compositions and methods are provided for detecting the presence of a transgene / genome insertion region in plants and seeds and the like. corn.

В некоторых вариантах осуществления последовательности ДНК, содержащие смежный фрагмент новой области-вставки трансген/геном, представляют собой аспекты по настоящему изобретению. Включены последовательности ДНК, содержащие достаточное количество полинуклеотидов из последовательности трансгенной вставки и достаточное количество полинуклеотидов из геномной последовательности кукурузы и/или последовательности, применяемой в качестве последовательности праймера для получения ампликона для диагностики одного или нескольких таких растений кукурузы.In some embodiments, DNA sequences containing an adjacent fragment of a new transgene / genome insertion region are aspects of the present invention. DNA sequences are included that contain a sufficient amount of polynucleotides from the transgenic insert sequence and a sufficient number of polynucleotides from the genomic sequence of the maize and / or the sequence used as a primer sequence to produce an amplicon for the diagnosis of one or more such maize plants.

Связанные с этим варианты осуществления относятся к последовательностям ДНК, содержащим, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более последовательных нуклеотидов трансгенного участка последовательности ДНК, приведенной в настоящем документе, или комплементарных ей последовательностей. Такие последовательности можно применять в качестве ДНК-праймеров в способах амплификации ДНК. Ампликоны, полученные с применением этих праймеров, являются диагностическими признаками наличия объекта кукурузы, указанного в настоящем документе. Таким образом, изобретение также включает ампликоны, полученные с применением таких ДНК-праймеров и гомологичных праймеров.Related embodiments relate to DNA sequences containing at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 or more consecutive nucleotides of the transgenic portion of the DNA sequence described herein, or its complementary sequences. Such sequences can be used as DNA primers in DNA amplification methods. Amplicons obtained using these primers are diagnostic indications of the presence of the corn object indicated in this document. Thus, the invention also includes amplicons obtained using such DNA primers and homologous primers.

Настоящее изобретение включает способы детекции наличия в образце ДНК, соответствующей ДНК объекта кукурузы, указанного в настоящем документе. Такие способы могут включать этапы: (а) контактирования биологического образца с парой праймеров, которые при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с указанной ДНК продуцируют ампликон, который представляет собой диагностический показатель присутствия указанного(ых) объекта(ов); (b) проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты с получением ампликона; и (с) детекции указанного ампликона.The present invention includes methods for detecting the presence in the sample of DNA corresponding to the DNA of the corn object specified herein. Such methods may include the steps of: (a) contacting the biological sample with a pair of primers which, when used in the amplification reaction of a nucleic acid with said DNA, produce an amplicon, which is a diagnostic indicator of the presence of said object (s); (b) conducting a nucleic acid amplification reaction to produce an amplicon; and (c) detecting said amplicon.

Дальнейшие способы детекции по настоящему изобретению включают способ детекции присутствия в образце ДНК, соответствующей, по меньшей мере, одному из указанных объектов, где указанный способ включает этапы: (а) контактирования биологического образца с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с указанной ДНК и не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК контрольного растения кукурузы (не содержащего представляющую интерес встроенную ДНК); (b) создания жестких условий гибридизации для указанного образца и зонда; и (с) детекции гибридизации указанного зонда с ДНК.Further detection methods of the present invention include a method for detecting the presence of DNA in a sample corresponding to at least one of said objects, wherein said method comprises the steps of: (a) contacting a biological sample with a probe that hybridizes under stringent hybridization conditions with said DNA and does not hybridize under stringent hybridization conditions with the DNA of a control corn plant (containing no embedded DNA of interest); (b) creating stringent hybridization conditions for said sample and probe; and (c) detecting hybridization of said probe with DNA.

Настоящее изобретение включает способы детекции присутствия в образце ДНК от, по меньшей мере, одного растения кукурузы, указанного в настоящем документе. Такие способы могут включать этапы: (a) контактирования биологического образца с парой праймеров, которые при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с указанной ДНК продуцируют ампликон, который представляет собой диагностический показатель присутствия указанного(ых) объекта(ов); (b) проведения реакции амплификации TAQMAN ПЦР, используя референтный ген, указанный в настоящем документе; и (c) анализа результатов.The present invention includes methods for detecting the presence of DNA in a sample from at least one corn plant specified herein. Such methods may include the steps of: (a) contacting the biological sample with a pair of primers which, when used in the amplification reaction of a nucleic acid with said DNA, produce an amplicon, which is a diagnostic indicator of the presence of the indicated object (s); (b) carrying out a TAQMAN PCR amplification reaction using the reference gene specified herein; and (c) analysis of the results.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает способы получения растения кукурузы, содержащего AAD-1 объект по настоящему изобретению, где указанный способ включает этапы: (a) полового скрещивания первой родительской линии кукурузы (содержащей экспрессирующие кассеты по настоящему изобретению, которые предоставляют указанный признак устойчивости к гербицидам растениям указанной линии) и второй родительской линии кукурузы (лишенной признака устойчивости к гербицидам) с получением множества растений-потомков; и (b) отбора потомков с применением молекулярных маркеров. Такие способы необязательно содержат дальнейший этап возвратного скрещивания потомства со второй родительской линией кукурузы с получением гомозиготного растения, несущего указанный признак устойчивости к гербицидам.In further embodiments, the present invention includes methods for producing a corn plant containing the AAD-1 subject of the present invention, wherein said method comprises the steps of: (a) sexually crossing the first parent line of the corn (containing expression cassettes of the present invention that provide said sign of resistance to herbicides to plants of the indicated line) and the second parent line of maize (devoid of the characteristic of resistance to herbicides) to obtain many descendant plants; and (b) selection of offspring using molecular markers. Such methods optionally comprise a further step of backcrossing the offspring with the second parent line of the corn to produce a homozygous plant bearing the indicated herbicide resistance trait.

По другому аспекту изобретения предоставлены способы определения зиготности потомства кросса с применением рассматриваемого объекта. Указанные способы могут включать контактирование образца, содержащего ДНК кукурузы, с парой праймеров по настоящему изобретению. Указанные праймеры при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с указанной ДНК продуцируют первый ампликон, который представляет собой диагностический признак наличия, по меньшей мере, одного из указанных объектов кукурузы. Такие способы дополнительно включают проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты с получением первого ампликона; детекцию первого ампликона; и контактирование образца, содержащего ДНК кукурузы, с парой указанных праймеров, которые при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК растений кукурузы продуцируют второй ампликон, содержащий природную геномную ДНК кукурузы, гомологичную геномной области кукурузы; и проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты с получением второго ампликона. Способы дополнительно содержат детекцию второго ампликона и сравнение первого и второго ампликонов в образце, где наличие обеих ампликонов указывает на то, что образец является гетерозиготным по трансгенной вставке.In another aspect of the invention, methods are provided for determining the zygosity of offspring of a cross using the subject in question. These methods may include contacting a sample containing corn DNA with a pair of primers of the present invention. These primers, when used in a nucleic acid amplification reaction with said DNA, produce the first amplicon, which is a diagnostic sign of the presence of at least one of these corn objects. Such methods further include carrying out a nucleic acid amplification reaction to produce a first amplicon; detection of the first amplicon; and contacting a sample containing maize DNA with a pair of these primers which, when used in a nucleic acid amplification reaction with the genomic DNA of maize plants, produce a second amplicon containing the natural maize genomic DNA of the maize homologous to the genomic region of maize; and conducting a nucleic acid amplification reaction to produce a second amplicon. The methods further comprise detecting the second amplicon and comparing the first and second amplicons in the sample, where the presence of both amplicons indicates that the sample is heterozygous for the transgenic insert.

Наборы для детекции ДНК можно получать с применением композиций, описываемых в настоящем документе, и способов, хорошо известных в области детекции ДНК. Наборы эффективны для идентификации ДНК рассматриваемого объекта кукурузы в образце, и их можно применять в способах скрещивания растений кукурузы, содержащих такую ДНК. Наборы содержат последовательности ДНК, гомологичные или комплементарные ампликонам, например, описываемым в настоящем документе, или последовательностям ДНК, гомологичным или комплементарным ДНК, содержащейся в трансгенных генетических элементах рассматриваемых объектов. Эти последовательности ДНК можно использовать в реакциях амплификации ДНК или в качестве зондов в способе гибридизации ДНК. Наборы могут также содержать реагенты и материалы, необходимые для проведения детекции.DNA detection kits can be prepared using the compositions described herein and methods well known in the field of DNA detection. The kits are effective for identifying the DNA of the subject corn object in the sample, and can be used in methods of crossing corn plants containing such DNA. The kits contain DNA sequences homologous or complementary to amplicons, such as those described herein, or DNA sequences homologous or complementary to the DNA contained in the transgenic genetic elements of the subject objects. These DNA sequences can be used in DNA amplification reactions or as probes in a DNA hybridization method. Kits may also contain reagents and materials necessary for the detection.

"Зонд" представляет собой выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, связанную со стандартной детектируемой меткой или репортерной молекулой (такой как радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентное средство или фермент). Такой зонд комплементарен последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, а в случае настоящего изобретения - последовательности геномной ДНК, происходящей от одного из указанных объектов кукурузы, либо от растения кукурузы, либо от образца, включающего ДНК данного объекта. Зонды по настоящему изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие материалы-зонды, которые специфически связываются с ДНК-последовательностью-мишенью и которые можно применять для детекции присутствия такой ДНК-последовательности-мишени.A “probe” is an isolated nucleic acid molecule coupled to a standard detectable label or reporter molecule (such as a radioactive isotope, ligand, chemiluminescent agent or enzyme). Such a probe is complementary to the target nucleic acid sequence, and in the case of the present invention, a genomic DNA sequence derived from one of these corn objects, or from a corn plant, or from a sample containing the DNA of this object. The probes of the present invention include not only deoxyribonucleic or ribonucleic acids, but also polyamides and other probe materials that specifically bind to the target DNA sequence and which can be used to detect the presence of such a target DNA sequence.

"Праймеры" представляют собой выделенные/синтезированные нуклеиновые кислоты, которые отжигаются с комплементарной ДНК-последовательностью-мишенью с образованием гибрида между праймером и ДНК-последовательностью-мишенью с последующим удлинением вдоль цепи ДНК-мишени посредством полимеразы, например, ДНК-полимеразы. Пары праймеров по настоящему изобретению применяют для амплификации последовательности-мишени нуклеиновой кислоты, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других традиционных способов амплификации нуклеиновых кислот."Primers" are isolated / synthesized nucleic acids that are annealed with a complementary target DNA sequence to form a hybrid between the primer and the target DNA sequence, followed by extension along the target DNA strand by polymerase, for example, DNA polymerase. The primer pairs of the present invention are used to amplify a target nucleic acid sequence, for example, by polymerase chain reaction (PCR) or other conventional nucleic acid amplification methods.

Длина зондов и праймеров составляет, как правило, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500 полинуклеотидов или более. Такие зонды и праймеры специфично гибридизуются с последовательностью-мишенью при строгих условиях гибридизации. Предпочтительно последовательности зондов и праймеров по настоящему изобретению полностью совпадают с последовательностью-мишенью, хотя традиционными способами можно конструировать зонды, отличающиеся от последовательности-мишени и сохраняющие способность гибридизоваться с последовательностью-мишенью.The length of the probes and primers is usually 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75 , 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 , 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125 , 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150 , 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 , 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200 , 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 or 500 polynucleotides or more. Such probes and primers specifically hybridize to the target sequence under stringent hybridization conditions. Preferably, the sequences of the probes and primers of the present invention are completely identical to the target sequence, although traditional methods can be used to design probes that are different from the target sequence and retain the ability to hybridize with the target sequence.

Способы получения и применения зондов и праймеров описаны, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989. Пары ПЦР-праймеров можно получать из известной последовательности, например, с применением компьютерных программ, предназначенных для этой цели.Methods for preparing and using probes and primers are described, for example, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989. Pairs of PCR primers can be obtained from a known sequence, for example, using computer programs designed for this purpose.

Праймеры и зонды, сконструированные на основе фланкирующих ДНК и последовательностей-вставок, описанных в настоящей заявке, можно применять для подтверждения (и, при необходимости, корректировки) рассматриваемых последовательностей традиционными способами, например, посредством повторного клонирования и секвенирования таких последовательностей.Primers and probes designed based on the flanking DNA and the insert sequences described herein can be used to confirm (and, if necessary, adjust) the sequences in question by traditional methods, for example, by re-cloning and sequencing of such sequences.

Зонды нуклеиновых кислот и праймеры по настоящему изобретению гибридизуются в жестких условиях с ДНК последовательностью-мишенью. Для детекции наличия в образце ДНК трансгенного объекта можно применять любой традиционный способ гибридизации или амплификации нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты или их фрагменты способны к специфической гибридизации с другими молекулами нуклеиновой кислоты при определенных условиях. Как применяют в настоящем документе, указано, что две молекулы нуклеиновой кислоты способны специфически гибридизоваться друг с другом, если указанные две молекулы способны к образованию антипараллельной двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты. Молекулу нуклеиновой кислоты считают "комплементарной" другой молекуле нуклеиновой кислоты, если они имеют полную комплементарность. Как применяют в настоящем документе, считают, что молекулы имеют "полную комплементарность", если каждый нуклеотид одной молекулы комплементарен нуклеотиду другой молекулы. Считают, что две молекулы имеют "минимальную комплементарность", если они могут гибридизоваться друг с другом со стабильностью, достаточной для их гибридизации друг с другом, по меньшей мере, в стандартных условиях "низкой жесткости". Аналогично, считают, что молекулы "комплементарны", если они могут гибридизоваться друг с другом со стабильностью, достаточной для их гибридизации друг с другом в стандартных условиях "высокой жесткости". Стандартные условия жесткости описаны в Sambrook et al., 1989. Таким образом, отклонения от полной комплементарности допустимы при условии, что такие отклонения никак не препятствуют способности молекул образовывать двухцепочечные структуры. Чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, необходимо только, чтобы степень ее комплементарности нужной последовательности была достаточной для образования стабильной двухцепочечной структуры в конкретном растворителе и в конкретных концентрациях соли.The nucleic acid probes and primers of the present invention hybridize under stringent conditions with the target DNA sequence. Any conventional method of nucleic acid hybridization or amplification can be used to detect the presence of a transgenic object in a DNA sample. Nucleic acid molecules or fragments thereof are capable of specific hybridization with other nucleic acid molecules under certain conditions. As used herein, it is indicated that two nucleic acid molecules are capable of specifically hybridizing with each other if said two molecules are capable of forming an antiparallel double-stranded nucleic acid structure. A nucleic acid molecule is considered “complementary” to another nucleic acid molecule if they are fully complementary. As used herein, it is believed that molecules are “fully complementary” if each nucleotide of one molecule is complementary to the nucleotide of another molecule. It is believed that two molecules have "minimal complementarity" if they can hybridize with each other with a stability sufficient to hybridize with each other, at least under standard "low stringency" conditions. Similarly, it is believed that molecules are "complementary" if they can hybridize with each other with a stability sufficient to hybridize with each other under standard "high stringency" conditions. Standard stiffness conditions are described in Sambrook et al., 1989. Thus, deviations from full complementarity are acceptable provided that such deviations do not in any way interfere with the ability of molecules to form double-stranded structures. For a nucleic acid molecule to serve as a primer or probe, it is only necessary that the degree of complementarity of the desired sequence is sufficient to form a stable double-stranded structure in a particular solvent and at specific salt concentrations.

Как применяют в настоящем документе, по существу гомологичная последовательность представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, специфически гибридизующуюся с комплементом последовательности нуклеиновой кислоты, с которой ее сравнивают, в условиях высокой жесткости. Термин "жесткие условия" функционально определяют в отношении гибридизации нуклеиновокислотного зонда с нуклеиновой кислотой-мишенью (т.е. с определенной последовательностью нуклеиновой кислоты, представляющей интерес) посредством способов гибридизации, описанных в Sambrook et al., 1989, в 9.52-9.55. См. также Sambrook et al., 1989 в 9.47-9.52 и 9.56-9.58. Таким образом, нуклеотидные последовательности по изобретению можно использовать благодаря их способности специфично образовывать двойные молекулы с комплементарными участками фрагментов ДНК.As used herein, a substantially homologous sequence is a nucleic acid sequence that specifically hybridizes to a complement of the nucleic acid sequence with which it is compared under high stringency conditions. The term "stringent conditions" is functionally defined in relation to the hybridization of a nucleic acid probe with a target nucleic acid (i.e., with a specific nucleic acid sequence of interest) by the hybridization methods described in Sambrook et al., 1989, at 9.52-9.55. See also Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52 and 9.56-9.58. Thus, the nucleotide sequences of the invention can be used due to their ability to specifically form binary molecules with complementary regions of DNA fragments.

В зависимости от области применения можно использовать различные условия гибридизации для достижения различных степеней специфичности зонда к последовательности-мишени. Для областей применения, требующих высокой специфичности, как правило, применяют относительно жесткие условия для получения гибридов, например, применяют условия с относительно низкой концентрацией соли и/или высокой температурой, такие как от приблизительно 0,02 M до приблизительно 0,15 M NaCl при температуре от приблизительно 50°C до приблизительно 70°C. Жесткие условия, например, могут включать, по меньшей мере, двукратную промывку фильтра для гибридизации буфером для промывки в условиях высокой жесткости (0,2X SSC, 0,1% SDS, 65°C). Подходящие условия жесткости, которые способствуют гибридизации ДНК, например, 6,0X хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно 45°C с последующей промывкой 2,0X SSC при 50°C, известны специалистам в данной области. Например, концентрация соли на этапе промывки может варьировать от концентрации, используемой в условиях низкой жесткости и составляющей приблизительно 2,0X SSC при 50°C, до концентрации, используемой в условиях высокой жесткости и составляющей приблизительно 0,2X SSC при 50°C. Кроме того, температуру на этапе промывки можно увеличивать от комнатной температуры, используемой в условиях низкой жесткости и составляющей приблизительно 22°C, до температуры, используемой в условиях высокой жесткости и составляющей приблизительно 65°C. Можно изменять одновременно и температуру, и концентрацию соли, или можно поддерживать температуру на постоянном уровне, изменяя концентрацию соли, и наоборот. Такие избирательные условия не допускают несовпадения, или допускают только небольшое несовпадение, между зондом и матричной цепью или цепью-мишенью. Детекция последовательности ДНК посредством гибридизации хорошо известна специалистам в данной области, и патенты США №№ 4965188 и 5176995 предоставляют примеры способов анализа гибридизации.Depending on the application, various hybridization conditions can be used to achieve different degrees of specificity of the probe to the target sequence. For applications requiring high specificity, generally relatively stringent conditions are used to produce hybrids, for example, conditions with a relatively low salt concentration and / or high temperature, such as from about 0.02 M to about 0.15 M NaCl at a temperature of from about 50 ° C to about 70 ° C. Severe conditions, for example, may include at least washing the filter twice for hybridization with the washing buffer under high stringency conditions (0.2X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C). Suitable stringency conditions that facilitate DNA hybridization, for example 6.0X sodium chloride / sodium citrate (SSC) at approximately 45 ° C followed by washing with 2.0X SSC at 50 ° C, are known to those skilled in the art. For example, the salt concentration in the washing step can vary from a concentration used under low hardness conditions of approximately 2.0X SSC at 50 ° C to a concentration used under high hardness conditions of approximately 0.2X SSC at 50 ° C. In addition, the temperature in the washing step can be increased from room temperature used under low hardness conditions of approximately 22 ° C to a temperature used in high hardness conditions of approximately 65 ° C. You can change both the temperature and salt concentration, or you can maintain the temperature at a constant level by changing the salt concentration, and vice versa. Such selective conditions do not allow mismatch, or allow only a slight mismatch, between the probe and the matrix circuit or target chain. Detection of a DNA sequence by hybridization is well known to those skilled in the art, and US Pat. Nos. 4,965,188 and 5,176,995 provide examples of methods for analyzing hybridization.

В особенно предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота по настоящему изобретению специфически гибридизуется с одним или несколькими праймерами (или ампликонами или другими последовательностями), приведенными в качестве примеров или предоставленными в настоящем документе, включая их комплементы и фрагменты, в условиях высокой жесткости. В одном из аспектов настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению имеет последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:2-7, или ее комплементы и/или фрагменты.In a particularly preferred embodiment, the nucleic acid of the present invention specifically hybridizes to one or more primers (or amplicons or other sequences) provided by way of example or provided herein, including their complements and fragments, under high stringency conditions. In one aspect of the present invention, the nucleic acid molecule of the present invention has the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2-7, or its complement and / or fragments.

В другом аспекте настоящего изобретения последовательность маркерной молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению на 80-100% или 90-100% идентична последовательности такой нуклеиновой кислоты. В дополнительном аспекте настоящего изобретения последовательность маркерной молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению на 95-100% идентична такой последовательности. Такие последовательности можно использовать в качестве маркеров в способах скрещивания растений для идентификации потомства генетических кроссов. Гибридизацию зонда с молекулой ДНК-мишени можно детектировать различными способами, известными специалистам в данной области, причем эти способы включают в качестве неограничивающих примеров флуоресцентные метки, радиоактивные метки, метки на основе антител и хемилюминесцентные метки.In another aspect of the present invention, the sequence of the marker nucleic acid molecule of the present invention is 80-100% or 90-100% identical to the sequence of such a nucleic acid. In an additional aspect of the present invention, the sequence of the marker nucleic acid molecule of the present invention is 95-100% identical to such a sequence. Such sequences can be used as markers in plant crossing methods to identify offspring of genetic crosses. Hybridization of the probe with the target DNA molecule can be detected by various methods known to those skilled in the art, and these methods include, but are not limited to, fluorescent labels, radioactive labels, antibody-based labels, and chemiluminescent labels.

Что касается амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени (например, посредством ПЦР) с применением определенной пары праймеров для амплификации, "жесткие условия" представляют собой условия, которые позволяют паре праймеров гибридизоваться только с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, с которой связывается праймер, содержащий соответствующую последовательность дикого типа (или ее комплемент), с предпочтительным получением уникального продукта амплификации, ампликона.Regarding amplification of a target nucleic acid sequence (for example, by PCR) using a specific pair of amplification primers, “stringent conditions” are conditions that allow a pair of primers to hybridize only with the target nucleic acid sequence to which the primer containing the corresponding a wild-type sequence (or its complement), with the preferred production of a unique amplification product, amplicon.

Термин "специфический для (последовательности-мишени)" означает, что зонд или праймер гибридизуется в жестких условиях гибридизации только с последовательностью-мишенью в образце, содержащем последовательность-мишень.The term “specific for (target sequence)” means that the probe or primer hybridizes under stringent hybridization conditions only to the target sequence in the sample containing the target sequence.

Как применяют в настоящем документе, "амплифицированная ДНК" или "ампликон" относится к продукту нуклеиновокислотной амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которая является частью матричной нуклеиновой кислоты. Например, чтобы определить, содержит ли растение кукурузы, полученное в результате полового скрещивания, геномную ДНК трансгенного объекта, происходящего от растения кукурузы по настоящему изобретению, ДНК, выделенную из образца ткани растения кукурузы, подвергают нуклеиновокислотной амплификации с применением пары праймеров, которая включает один праймер, происходящий от фланкирующей последовательности в геноме растения, смежной с сайтом инсерции встроенной гетерологичной ДНК, и второй праймер, происходящий от встроенной гетерологичной ДНК, с получением ампликона, который является диагностическим признаком наличия трансгенной ДНК. Длина и последовательность ампликона также являются диагностическими признаками наличия объекта. Длина такого ампликона может варьировать, составляя общую длину пар праймеров плюс одна пара нуклеотидов, и/или общую длину пар праймеров плюс приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 или более пар нуклеотидов (плюс или минус значения удлинения, приведенные выше). Альтернативно, пара праймеров может происходить от фланкирующей последовательности с обеих сторон встроенной ДНК, так, чтобы продуцировать ампликон, включающий всю встроенную нуклеотидную последовательность. Член пары праймеров, происходящий от геномной последовательности растения, может находиться на расстоянии от встроенной последовательности ДНК. Это расстояние может варьировать от одной пары нуклеотидов до приблизительно двадцати тысяч пар нуклеотидов. В частности, применение термина "ампликон" исключает димеры праймеров, которые могут образовываться в реакции термоамплификации ДНК.As used herein, “amplified DNA” or “amplicon” refers to the product of a nucleic acid amplification of a target nucleic acid sequence that is part of a template nucleic acid. For example, in order to determine whether a corn plant obtained by sexual intercourse contains the genomic DNA of a transgenic object derived from a corn plant of the present invention, DNA extracted from a tissue sample of a corn plant is subjected to nucleic acid amplification using a pair of primers that includes one primer originating from the flanking sequence in the genome of the plant adjacent to the insertion site of the inserted heterologous DNA, and a second primer derived from the inserted heterolog egg DNA to produce an amplicon, which is a diagnostic sign of the presence of transgenic DNA. The length and sequence of the amplicon are also diagnostic signs of the presence of an object. The length of such an amplicon can vary, making up the total length of the primer pairs plus one nucleotide pair and / or the total length of the primer pairs plus approximately 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 , 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 , 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 , 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 or more pairs of nucleotides (plus or minus the elongation values given above). Alternatively, a pair of primers may be derived from the flanking sequence on both sides of the inserted DNA, so as to produce an amplicon including the entire inserted nucleotide sequence. A member of a primer pair derived from the genomic sequence of a plant may be located at a distance from the inserted DNA sequence. This distance can vary from one pair of nucleotides to about twenty thousand pairs of nucleotides. In particular, the use of the term “amplicon” excludes dimers of primers that can form in the thermal amplification reaction of DNA.

Амплификацию нуклеиновых кислот можно проводить различными способами амплификации нуклеиновых кислот, известными в данной области, которые включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Ряд способов амплификации известны в данной области и описаны, в том числе, в патенте США № 4683195 и патенте США № 4683202. Разработаны способы ПЦР-амплификации для амплификации до 22 т.п.н. геномной ДНК. Эти способы, а также другие известные в данной области способы амплификации ДНК, можно применять в практическом осуществлении настоящего изобретения. Последовательность гетерологичной трансгенной ДНК-вставки или фланкирующей геномной последовательности, происходящей от рассматриваемого объекта кукурузы, можно подтверждать (и при необходимости корректировать) посредством амплификации таких последовательностей указанного объекта с применением праймеров, происходящих от последовательностей, приведенных в настоящем документе, с последующим проведением стандартного секвенирования ДНК ПЦР-ампликона или клонированной ДНК.Amplification of nucleic acids can be carried out by various methods of amplification of nucleic acids known in the art, which include polymerase chain reaction (PCR). A number of amplification methods are known in the art and are described, including in US Pat. No. 4,683,195 and US Pat. No. 4,683,202. PCR amplification methods have been developed for amplification up to 22 kb. genomic DNA. These methods, as well as other DNA amplification methods known in the art, can be used in the practice of the present invention. The sequence of the heterologous transgenic DNA insert or flanking genomic sequence derived from the subject of corn can be confirmed (and if necessary corrected) by amplification of such sequences of the specified object using primers derived from the sequences given in this document, followed by standard DNA sequencing PCR amplicon or cloned DNA.

Ампликон, который получают этими способами, можно детектировать различными способами. Электрофорез в агарозном геле и окрашивание бромистым этидием представляет собой традиционный хорошо известный способ детекции ДНК-ампликонов. Другой такой способ представляет собой анализ генетического кода, в котором конструируют ДНК-олигонуклеотид, перекрывающийся как со смежной фланкирующей геномной последовательностью ДНК, так и со встроенной последовательностью ДНК. Олигонуклеотид иммобилизуют на лунках микролуночного планшета. После проведения ПЦР нужной области (с применением одного праймера во встроенной последовательности и одного праймера в смежной фланкирующей геномной последовательности) одноцепочечный ПЦР-продукт можно гибридизовать с иммобилизованным олигонуклеотидом, и он может служить в качестве матрицы для реакции удлинения на одно основание с применением ДНК-полимеразы и меченых ddNTP, специфических к следующему предполагаемому основанию. Считывание данных можно проводить посредством флуоресцентного анализа или ELISA-анализа. При успешной амплификации, гибридизации и удлинении на одно основание сигнал указывает на присутствие вставки/фланкирующей последовательности.The amplicon obtained by these methods can be detected in various ways. Agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining is a traditional well-known method for detecting DNA amplicons. Another such method is the analysis of the genetic code in which a DNA oligonucleotide is constructed that overlaps both the adjacent flanking genomic DNA sequence and the integrated DNA sequence. The oligonucleotide is immobilized in the wells of a microwell plate. After PCR of the desired region (using one primer in the inserted sequence and one primer in the adjacent flanking genomic sequence), the single-stranded PCR product can be hybridized with an immobilized oligonucleotide and it can serve as a matrix for the extension reaction to one base using DNA polymerase and labeled ddNTPs specific for the following alleged base. Reading data can be carried out by fluorescence analysis or ELISA analysis. Upon successful amplification, hybridization, and extension to one base, the signal indicates the presence of an insert / flanking sequence.

Все патенты, патентные заявки, предварительные заявки и публикации, упоминаемые или цитируемые в настоящем документе, в полном объеме включены путем ссылки в той степени, в которой они соответствуют идее настоящего изобретения.All patents, patent applications, provisional applications, and publications referenced or cited herein are hereby incorporated by reference in full to the extent that they are consistent with the idea of the present invention.

Применяют приведенные ниже сокращения, если не указано иначе.The abbreviations below apply unless otherwise indicated.

AAD-1Aad-1 арилоксиалканоатдиоксигеназа-1aryloxyalkanoate dioxygenase-1 п.н.bp пара нуклеотидовnucleotide pair °C° C градусы Цельсияdegrees Celsius ДНКDNA дезоксирибонуклеиновая кислотаDeoxyribonucleic acid DIGDig дигоксигенинdigoxygenin ЭДТАEDTA этилендиаминтетрауксусная кислотаethylenediaminetetraacetic acid т.п.н.tbp тысяча пар нуклеотидовthousand pairs of nucleotides мкгmcg микрограммmicrograms мклμl микролитрmicroliter млml миллилитрmilliliter MM молярная массаmolar mass OLPOLP перекрывающийся зондoverlapping probe ПЦРPCR полимеразная цепная реакцияpolymerase chain reaction PTUPTU единица транскрипции растенияplant transcription unit SDSSds додецилсульфат натрияsodium dodecyl sulfate SOPSop стандартная методика работыstandard working method SSCSSC буферный раствор, содержащий смесь хлорида натрия и цитрата натрия, pH 7,0buffer solution containing a mixture of sodium chloride and sodium citrate, pH 7.0 TBETBE буферный раствор, содержащий смесь триса, борной кислоты и ЭДТА, pH 8,3buffer solution containing a mixture of tris, boric acid and EDTA, pH 8.3 VV вольтvolt

ПРИМЕРЫEXAMPLES

Пример 1. Объект-специфичный анализ TaqmanExample 1. Object-specific analysis of Taqman

Объект-специфичный анализ Taqman разработан для детекции наличия объекта кукурузы DAS-40278-9 и определения типа зиготности растений в размножающихся популяциях. Для проведения объект-специфического анализа разработаны специфичные праймеры и зонды Taqman на основе последовательности ДНК, расположенной в области 5'-конца стыка трансген-геном. Для специфической детекции DAS-40278-9 амплифицировали фрагмент ДНК длиной в 73 т.п.н., который охватывает область стыка на 5'-конце, с применением двух специфичных праймеров. Амплификацию этого ПЦР-продукта оценивали с применением мишень-специфического зонда MGB, синтезированного Applied Biosystems, содержащего метку FAM на 5'-конце. Специфичность такого способа детекции Taqman для объекта DAS-40278-9 AAD-1 кукурузы тестировали на 16 различных объектах AAD-1 кукурузы и нетрансгенных разновидностях кукурузы с применением специфичного для кукурузы эндогенного референтного гена, гена инвертазы.The Taqman object-specific analysis was designed to detect the presence of the DAS-40278-9 maize object and determine the type of plant zygosity in breeding populations. To conduct an object-specific analysis, specific Taqman primers and probes based on a DNA sequence located at the 5'-end of the junction with the transgene genome were developed. For specific detection, DAS-40278-9 amplified a 73 kb DNA fragment that encompasses the junction at the 5'end using two specific primers. Amplification of this PCR product was evaluated using a target-specific MGB probe synthesized by Applied Biosystems containing the FAM tag at the 5'-end. The specificity of this Taqman detection method for maize DAS-40278-9 AAD-1 was tested on 16 different maize AAD-1 and non-transgenic maize varieties using a maize-specific endogenous reference gene, the invertase gene.

Пример 1.1. Выделение гДНКExample 1.1. Isolation of gDNA

Тестировали образцы гДНК от 16 различных объектов AAD-1 кукурузы и нетрансгенных разновидностей кукурузы. гДНК выделяли с применением двух способов, набора Qiagen и CTAB. Для образцов гДНК, выделенных посредством набора Qiagen, использовали восемь свежих кусочков листа кукурузы для выделения гДНК согласно модифицированной методике Qiagen DNeasy 96 Plant Kit. Для образцов гДНК, выделенных с применением способа CTAB, использовали приблизительно 0,3 г лиофилизированной ткани листа согласно методике, приведенной в Permingeat et al., 1998. Количество гДНК оценивали посредством способа Pico Green согласно инструкции производителя (Molecular Probes, Eugene, OR). Для проведения настоящего исследования образцы гДНК разбавляли свободной от ДНКазы водой с получением концентрации, составляющей 10 нг/мкл.Tested gDNA samples from 16 different maize AAD-1 objects and non-transgenic maize varieties. gDNA was isolated using two methods, Qiagen kit and CTAB. Eight fresh pieces of corn leaf were used for the gDNA samples isolated using the Qiagen kit to isolate the gDNA according to the modified Qiagen DNeasy 96 Plant Kit technique. For gDNA samples isolated using the CTAB method, approximately 0.3 g of lyophilized leaf tissue was used according to the method described in Permingeat et al., 1998. The amount of gDNA was estimated using the Pico Green method according to the manufacturer's instructions (Molecular Probes, Eugene, OR). For the present study, gDNA samples were diluted with DNase-free water to obtain a concentration of 10 ng / μl.

Пример 1.2. Анализ Taqman и результатыExample 1.2 Taqman Analysis and Results

Для проведения анализа Taqman, специфичного к объекту DAS-40278-9, конструировали специфические праймеры и зонды Taqman. Эти реагенты можно использовать в условиях, приведенных ниже, для детекции объекта DAS-40278-9 AAD-1 кукурузы. В таблице 1 приведены последовательности праймера и зонда, специально разработанных для детекции объекта DAS-40278-9.For Taqman analysis specific to the DAS-40278-9 object, specific Taqman primers and probes were designed. These reagents can be used under the conditions below to detect the corn object DAS-40278-9 AAD-1. Table 1 shows the sequences of the primer and probe, specially designed for the detection of the object DAS-40278-9.

Таблица 1
Праймеры ПЦР и зонды
Table 1
PCR primers and probes
Реакция с объектом-мишеньюTarget reaction НазваниеTitle ОписаниеDescription Последовательность от 5'-конца к 3'-концуSequence from 5'-end to 3'-end Corn278-FCorn278-F Прямой праймерDirect primer Seq ID NO:2: 5' - ATTCTGGCTTTGCTGTAAATCGT - 3'Seq ID NO: 2: 5 '- ATTCTGGCTTTGCTGTAAATCGT - 3' Corn278-RCorn278-R Обратный праймерReverse primer Seq ID NO:3: 5' - TTACAATCAACAGCACCGTACCTT - 3'Seq ID NO: 3: 5 '- TTACAATCAACAGCACCGTACCTT - 3' Corn278-ProbeCorn278-Probe ЗондProbe Seq ID NO:4: 5' - FAM-CTAACCTTCATTGTATTCC-MGB - 3'Seq ID NO: 4: 5 '- FAM-CTAACCTTCATTGTATTCC-MGB - 3' Реакция с референтным геном инвертазыInvertase reference gene reaction НазваниеTitle ОписаниеDescription Последовательность от 5'-конца к 3'-концуSequence from 5'-end to 3'-end IVFIVF Прямой праймерDirect primer Seq ID NO:5: 5' - TGGCGGACGACGACTTGT - 3'Seq ID NO: 5: 5 '- TGGCGGACGACGACTTGT - 3' IVRIVR Обратный праймерReverse primer Seq ID NO:6: 5' - AAAGTTTGGAGGCTGCCGT - 3'Seq ID NO: 6: 5 '- AAAGTTTGGAGGCTGCCGT - 3' IV-ProbeIv-probe ЗондProbe Seq ID NO:7: 5' - HEX-CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC-BHQ2 - 3'Seq ID NO: 7: 5 '- HEX-CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC-BHQ2 - 3'

Условия множественной ПЦР для амплификации следующие: 1X буфера ПЦР, 0,5-2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкМ праймера Corn-278-F, 0,2 мкМ праймера Corn-278-R, 0,2 мкМ праймера IV-F, 0,2 мкМ праймер IV-R, 0,08 мкМ зонда Corn-278-Probe, 0,08 мкМ зонда IV-Probe, 40 Ед/мл HotStart Taq, 0,6-2,4 мкг/мл ДНК в общей реакционной смеси объемом 25 мкл. Тестировали различные концентрации MgCl2 и ДНК. Применяли концентрации, составляющие 0,5 мМ, 1,0 мМ, 1,8 мМ и 2,5 мМ MgCl2. Смесь амплифицировали с применением следующих условий: i) 95°C в течение 15 мин, ii) 95°C в течение 20 с, iii) 60°C в течение 60 с, iv) повторение этапов ii-iii в течение 50 циклов, v) удержание при 4°C. ПЦР в реальном времени проводили на приборе Bio-rad iCycler™. Анализ данных основывали на измерении порогового цикла (CT), который представляет собой номер цикла ПЦР, во время которого флуоресценция достигает установленного значения. Значение CT рассчитывали автоматически с применением программного обеспечения iCycler.Multiple PCR conditions for amplification are as follows: 1X PCR buffer, 0.5-2.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTP, 0.2 μM Corn-278-F primer, 0.2 μM Corn-278-R primer, 0.2 μM IV-F primer, 0.2 μM IV-R primer, 0.08 μM Corn-278-Probe probe, 0.08 μM IV-Probe probe, 40 U / ml HotStart Taq, 0.6-2 , 4 μg / ml DNA in the total reaction mixture with a volume of 25 μl. Different tested concentrations of MgCl 2 and DNA. Applied concentrations of 0.5 mm, 1.0 mm, 1.8 mm and 2.5 mm MgCl 2 . The mixture was amplified using the following conditions: i) 95 ° C for 15 min, ii) 95 ° C for 20 s, iii) 60 ° C for 60 s, iv) repeating steps ii-iii for 50 cycles, v ) retention at 4 ° C. Real-time PCR was performed on a Bio-rad iCycler ™ instrument. Data analysis was based on the measurement of the threshold cycle (CT), which is the PCR cycle number during which fluorescence reaches the set value. The CT value was calculated automatically using iCycler software.

Последовательности ампликонов, полученных с применением указанных выше праймеров, представляют собой:The amplicon sequences obtained using the above primers are:

278F и 278R:278F and 278R:

ttacaatcaacagcaccgtaccttgaagcggaatacaatgaaggttagctacgatttacagcaaagccagaatttacaatcaacagcaccgtaccttgaagcggaatacaatgaaggttagctacgatttacagcaaagccagaat

(SEQ ID NO:8)(SEQ ID NO: 8)

IVF и IVR:IVF and IVR:

tggcggacgacgacttgtccgagcagaccgccgtgtacttctacctgctcaagggcacggacggcagcctccaaacttttggcggacgacgacttgtccgagcagaccgccgtgtacttctacctgctcaagggcacggacggcagcctccaaacttt

(SEQ ID NO:9)(SEQ ID NO: 9)

Способ Taqman для детекции объекта кукурузы AAD-1 DAS-40278-9 тестировали на 16 различных объектах AAD-1 кукурузы и нетрансгенных разновидностях кукурузы с применением специфичного для кукурузы эндогенного гена инвертазы в качестве референтного гена. Этот анализ позволял специфично обнаруживать объект кукурузы AAD-1 DAS-40278-9 и не давал никаких ложноположительных результатов для контрольных образцов (т.е. 16 различных объектов кукурузы AAD-1 и нетрансгенных разновидностей кукурузы). Объект-специфические праймеры и зонды можно использовать для детекции AAD-1 объекта DAS-40278-9 кукурузы, а также эти условия и реагенты применимы для анализов зиготности.The Taqman method for detecting the AAD-1 maize object DAS-40278-9 was tested on 16 different maize AAD-1 objects and non-transgenic maize varieties using the maize-specific endogenous invertase gene as a reference gene. This analysis allowed the specific detection of the AAD-1 DAS-40278-9 maize object and did not yield any false positive results for control samples (i.e. 16 different AAD-1 maize objects and non-transgenic maize varieties). Object-specific primers and probes can be used to detect AAD-1 object DAS-40278-9 corn, as well as these conditions and reagents are applicable for zygosity analyzes.

Claims (15)

1. Способ определения зиготности растения кукурузы, содержащего SEQ ID NO: 1 в геноме кукурузы,
где указанный геном кукурузы содержит трансгенную конструкцию, содержащую ген арилоксиалканоатдиоксигеназы (AAD-1),
где указанная трансгенная конструкция фланкирована 5′-фланкирующей геномной ДНК кукурузы и 3′-фланкирующей геномной ДНК кукурузы,
где указанная 5′-фланкирующая геномная ДНК кукурузы состоит из остатков 1-1873 последовательности SEQ ID NO: 1 и указанная 3′-фланкирующая геномная ДНК кукурузы состоит из остатков 6690-8557 последовательности SEQ ID NO: 1, и
где указанная трансгенная конструкция состоит из остатков 1874-6689 последовательности SEQ ID NO: 1,
где указанный способ включает:
получение образца геномной ДНК от указанного растения кукурузы;
получение приведенного в контакт образца посредством контактирования указанного образца ДНК с
a) первым праймером и вторым праймером, где указанный первый праймер содержит сегмент указанной трансгенной конструкции, указанный второй праймер содержит сегмент указанной 5′-фланкирующей геномной ДНК кукурузы или сегмент указанной 3′-фланкирующей геномной ДНК кукурузы, и
где указанный первый праймер и указанный второй праймер продуцируют ампликон, который затем помещают в условия количественной ПЦР,
b) флуоресцентным зондом, который гибридизуется с указанным ампликоном;
помещение указанного приведенного в контакт образца в условия основанной на флуоресценции количественной ПЦР по конечной точке;
проведение количественного анализа указанного флуоресцентного зонда, гибридизованного с указанным ампликоном; и
определение зиготности указанного растения кукурузы, содержащего SEQ ID NO: 1.
1. The method of determining the zygosity of a corn plant containing SEQ ID NO: 1 in the genome of corn,
where the specified genome of the corn contains a transgenic construct containing the aryloxyalkanoate dioxygenase gene (AAD-1),
where the specified transgenic design is flanked by 5′-flanking genomic DNA of the corn and 3′-flanking genomic DNA of the corn,
where the specified 5′-flanking genomic DNA of the corn consists of residues 1-1873 of the sequence SEQ ID NO: 1 and the specified 3′-flanking genomic DNA of the corn consists of residues 6690-8557 of the sequence SEQ ID NO: 1, and
where the specified transgenic construct consists of residues 1874-6689 of the sequence SEQ ID NO: 1,
where the specified method includes:
obtaining a sample of genomic DNA from the specified corn plant;
obtaining a contacted sample by contacting said DNA sample with
a) a first primer and a second primer, wherein said first primer comprises a segment of said transgenic construct, said second primer comprises a segment of said 5′-flanking genomic DNA of maize or a segment of said 3′-flanking genomic DNA of maize, and
where said first primer and said second primer produce an amplicon, which is then placed under quantitative PCR conditions,
b) a fluorescent probe that hybridizes with the specified amplicon;
placing said contacted sample under fluorescence based quantitative end-point PCR;
quantitative analysis of the specified fluorescent probe hybridized with the specified amplicon; and
determining the zygosity of said corn plant containing SEQ ID NO: 1.
2. Способ по п. 1, где указанные ампликоны состоят из 50-100 остатков.2. The method of claim 1, wherein said amplicons are comprised of 50-100 residues. 3. Способ по п. 1, где указанный второй праймер связывается с остатками 1673-1873 последовательности SEQ ID NO: 1 или комплементарной ей последовательностью.3. The method of claim 1, wherein said second primer binds to residues 1673-1873 of the sequence SEQ ID NO: 1 or a sequence complementary thereto. 4. Способ по п. 1, где второй праймер объекта связывается с остатками 6690-6890 последовательности SEQ ID NO: 1.4. The method according to p. 1, where the second primer of the object is associated with residues 6690-6890 of the sequence SEQ ID NO: 1. 5. Способ по п. 1, где указанный способ используют для анализа интрогрессии трансгенной конструкции AAD-1, содержащей последовательность SEQ ID NO: 1, в целях селекции в другую линию кукурузы.5. The method according to p. 1, where the specified method is used to analyze the introgression of the transgenic construct AAD-1 containing the sequence of SEQ ID NO: 1, for selection in another line of corn. 6. Способ по п. 5, где указанная другая линия кукурузы лишена последовательности SEQ ID NO: 1.6. The method according to p. 5, where the specified other line of corn is devoid of the sequence of SEQ ID NO: 1. 7. Способ по п. 1, где указанный ампликон DAS-4 027 8-9 представляет собой 73 пар оснований.7. The method according to p. 1, where the specified amplicon DAS-4 027 8-9 represents 73 base pairs. 8. Способ по п. 1, где указанные зонды мечены флуоресцентным красителем и гасителем.8. The method of claim 1, wherein said probes are labeled with a fluorescent dye and quencher. 9. Способ по п. 8, где указанный зонд содержит FAM в качестве указанного флуоресцентного красителя на 5′-конце указанного зонда и гаситель MGB на 3′-конце указанного зонда.9. The method of claim 8, wherein said probe comprises FAM as said fluorescent dye at the 5′-end of said probe and an MGB quencher at the 3′-end of said probe. 10. Способ по п. 1, где указанный ампликон состоит из последовательности SEQ ID NO: 8.10. The method according to p. 1, where the specified amplicon consists of the sequence of SEQ ID NO: 8. 11. Способ по п. 1, где указанный зонд состоит из SEQ ID NO: 4.11. The method according to p. 1, where the specified probe consists of SEQ ID NO: 4. 12. Способ по п. 1, где указанные праймеры выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3.12. The method of claim 1, wherein said primers are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. 13. Способ по п. 1, где результаты указанной зиготности растения кукурузы считывают непосредственно на устройстве для чтения планшетов.13. The method of claim 1, wherein the results of said zygosity of the corn plant are read directly on the tablet reader. 14. Способ по п. 1, где указанный образец ДНК получают из растения кукурузы в поле.14. The method of claim 1, wherein said DNA sample is obtained from a corn plant in a field. 15. Набор для осуществления способа по п. 1, где указанный набор включает указанные праймеры, состоящие из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и указанный зонд, состоящий из SEQ ID NO: 4. 15. The kit for implementing the method according to claim 1, wherein said kit includes said primers consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, and said probe, consisting of SEQ ID NO: 4.
RU2012110253/10A 2009-08-19 2010-08-18 Detection of aad-1 of object das-40278-9 RU2577143C2 (en)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23524809P 2009-08-19 2009-08-19
US61/235,248 2009-08-19
US23736610P 2010-04-23 2010-04-23
US61/237,366 2010-04-23
PCT/US2010/045871 WO2011022471A1 (en) 2009-08-19 2010-08-18 Detection of aad-1 event das-40278-9

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012110253A RU2012110253A (en) 2013-09-27
RU2577143C2 true RU2577143C2 (en) 2016-03-10

Family

ID=43607318

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012110253/10A RU2577143C2 (en) 2009-08-19 2010-08-18 Detection of aad-1 of object das-40278-9

Country Status (16)

Country Link
JP (1) JP5771208B2 (en)
KR (1) KR101772638B1 (en)
CN (1) CN102575299B (en)
AU (1) AU2010284286B2 (en)
BR (1) BR112012003873A2 (en)
CA (1) CA2771581C (en)
CL (1) CL2012000410A1 (en)
CO (1) CO6511214A2 (en)
HK (1) HK1173194A1 (en)
IL (1) IL218175A (en)
IN (1) IN2012DN01800A (en)
MX (1) MX336072B (en)
NZ (1) NZ598598A (en)
RU (1) RU2577143C2 (en)
WO (1) WO2011022471A1 (en)
ZA (1) ZA201201210B (en)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2614120C2 (en) 2009-08-19 2017-03-22 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Event das-40278-9 aad-1, related lines of transgenic maize and their event-specific identification
US8598413B2 (en) * 2009-08-19 2013-12-03 Dow AgroSciecnes, LLC. AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines, event-specific identification thereof, and methods of weed control involving AAD-1
TWI667347B (en) 2010-12-15 2019-08-01 瑞士商先正達合夥公司 Soybean event syht0h2 and compositions and methods for detection thereof
CN107072163A (en) * 2014-03-20 2017-08-18 孟山都技术公司 Transgenic corn events MON87419 and its application method
GB201622007D0 (en) 2016-12-22 2017-02-08 And See Cambridge Display Tech Ltd Syngenta Participations Ag Polymorphs
EP3558961B1 (en) 2016-12-22 2021-01-20 Syngenta Participations AG Polymorphs
UY37623A (en) 2017-03-03 2018-09-28 Syngenta Participations Ag DERIVATIVES OF OXADIAZOL THIOPHEN FUNGICIDES
WO2018177880A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
MX2019011239A (en) 2017-03-31 2019-10-21 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions.
WO2018185013A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112019020734B1 (en) 2017-04-05 2023-12-05 Syngenta Participations Ag Compounds derived from oxadiazole, agrochemical composition, method for controlling or preventing infestation of useful plants by phytopathogenic microorganisms and use of said compounds
WO2018184982A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2018184987A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112019020756B1 (en) 2017-04-05 2023-11-28 Syngenta Participations Ag COMPOUNDS DERIVED FROM OXADIAZOLE MICROBICIDES, AGROCHEMICAL COMPOSITION COMPRISING THE SAME, METHOD FOR CONTROLLING OR PREVENTING INFESTATION OF USEFUL PLANTS BY PHYTOPATHOGENIC MICROORGANISMS AND USE OF THESE COMPOUNDS
WO2018184985A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112019020819B1 (en) 2017-04-05 2023-12-05 Syngenta Participations Ag COMPOUND OF FORMULA (I), AGROCHEMICAL COMPOSITION, METHOD FOR CONTROLLING OR PREVENTING INFESTATION OF USEFUL PLANTS BY PHYTOPATHOGENIC MICROORGANISMS AND USE OF A COMPOUND OF FORMULA (I)
WO2018185211A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
CN110709395A (en) 2017-06-02 2020-01-17 先正达参股股份有限公司 Microbicidal oxadiazole derivatives
WO2018219773A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Syngenta Participations Ag Fungicidal compositions
BR112019026331A2 (en) 2017-06-14 2020-07-21 Syngenta Participations Ag fungicidal compositions
JP7171634B2 (en) 2017-06-28 2022-11-15 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー Bactericidal composition
WO2019011923A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112020000456A2 (en) 2017-07-11 2020-07-21 Syngenta Participations Ag microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2019011928A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2019011926A1 (en) 2017-07-11 2019-01-17 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
BR112020000371A2 (en) 2017-07-12 2020-07-14 Syngenta Participations Ag microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2019012001A1 (en) 2017-07-12 2019-01-17 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
WO2019012003A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
UY37913A (en) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag PICOLINAMIDE DERIVATIVES FUNGICIDES THAT CARRY A QUATERNARY TERMINAL GROUP
UY37912A (en) 2017-10-05 2019-05-31 Syngenta Participations Ag PICOLINAMIDE DERIVATIVES FUNGICIDES THAT CONTAIN HETEROARILO OR HETEROARILOXI TERMINAL GROUPS
BR112020009659A2 (en) 2017-11-15 2020-11-10 Syngenta Participations Ag microbiocidal picolinamide derivatives
CN112020503A (en) 2018-04-26 2020-12-01 先正达参股股份有限公司 Microbicidal oxadiazole derivatives
CN112351981A (en) 2018-06-29 2021-02-09 先正达农作物保护股份公司 Microbicidal oxadiazole derivatives
CN112714764A (en) 2018-07-02 2021-04-27 先正达农作物保护股份公司 3- (2-thienyl) -5- (trifluoromethyl) -1,2, 4-oxadiazole derivatives as agrochemical fungicides
CN112689631A (en) 2018-07-16 2021-04-20 先正达农作物保护股份公司 Microbicidal oxadiazole derivatives
CN113195462A (en) 2018-10-17 2021-07-30 先正达农作物保护股份公司 Microbicidal oxadiazole derivatives
AR116628A1 (en) 2018-10-18 2021-05-26 Syngenta Crop Protection Ag MICROBIOCIDAL COMPOUNDS
WO2020165403A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Syngenta Crop Protection Ag Phenyl substituted thiazole derivatives as microbiocidal compounds
EA202192238A1 (en) 2019-02-20 2022-01-20 Сингента Кроп Протекшн Аг USE OF SPIROPIDIONE
GB201903942D0 (en) 2019-03-22 2019-05-08 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
WO2020208095A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal picolinamide derivatives
JP2022527592A (en) 2019-04-10 2022-06-02 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト Bactericidal composition
JP2022539244A (en) 2019-07-05 2022-09-07 シンジェンタ クロップ プロテクション アクチェンゲゼルシャフト Microbicidal picolinamide derivatives
GB201910037D0 (en) 2019-07-12 2019-08-28 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
UY39114A (en) 2020-03-05 2021-10-29 Syngenta Crop Protection Ag FUNGICIDE MIXTURES OF ARYL METHOXYACRYLATE DERIVATIVES
UY39115A (en) 2020-03-05 2021-10-29 Syngenta Crop Protection Ag FUNGICIDE MIXTURES OF ARYL METHOXYACRYLATE DERIVATIVES
GB202006386D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal Compounds
GB202006399D0 (en) 2020-04-30 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006480D0 (en) 2020-05-01 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202006606D0 (en) 2020-05-05 2020-06-17 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
GB202014840D0 (en) 2020-09-21 2020-11-04 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal compounds
KR102383881B1 (en) * 2020-10-16 2022-04-06 국립생태원 Simultaneous detection method for genetically modified maize
TW202231187A (en) 2020-11-27 2022-08-16 瑞士商先正達農作物保護公司 Pesticidal compositions
WO2022117650A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
UY39544A (en) 2020-12-02 2022-06-30 Syngenta Crop Protection Ag FUNGICIDE COMPOSITIONS COMPRISING A MIXTURE OF COMPONENTS (A) AND (B) AS ACTIVE PRINCIPLES
AR125089A1 (en) 2021-03-19 2023-06-07 Syngenta Crop Protection Ag PESTICIDE COMPOSITIONS
AU2022269255A1 (en) 2021-05-04 2023-11-02 Syngenta Crop Protection Ag Use of clethodim for insect control
MX2024000074A (en) 2021-07-02 2024-02-23 Syngenta Crop Protection Ag Use of fluazifop-p-butyl for insect control.

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005059103A2 (en) * 2003-12-15 2005-06-30 Monsanto Technology Llc Corn plant mon88017 and compositions and methods for detection thereof
WO2005107437A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
RU2270254C2 (en) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Identification of transgenic dna sequences in plant material and products made of the same, oligonucleotide kit and bioarray therefor
WO2008143993A2 (en) * 2007-05-17 2008-11-27 Monsanto Technology Llc Corn polymorphisms and methods of genotyping

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6245974B1 (en) * 1997-08-06 2001-06-12 North Carolina State University Matrix attachment regions
AR042145A1 (en) * 2002-11-27 2005-06-08 Dow Agrociences Llc IMMUNOGLOBULIN PRODUCTION IN PLANTS WITH A REDUCED FUCOCILATION
US8598413B2 (en) * 2009-08-19 2013-12-03 Dow AgroSciecnes, LLC. AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines, event-specific identification thereof, and methods of weed control involving AAD-1
RU2614120C2 (en) * 2009-08-19 2017-03-22 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Event das-40278-9 aad-1, related lines of transgenic maize and their event-specific identification

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005059103A2 (en) * 2003-12-15 2005-06-30 Monsanto Technology Llc Corn plant mon88017 and compositions and methods for detection thereof
WO2005107437A2 (en) * 2004-04-30 2005-11-17 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
RU2270254C2 (en) * 2004-04-30 2006-02-20 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Identification of transgenic dna sequences in plant material and products made of the same, oligonucleotide kit and bioarray therefor
WO2008143993A2 (en) * 2007-05-17 2008-11-27 Monsanto Technology Llc Corn polymorphisms and methods of genotyping

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GERMAN M.A.et al., A rapid method for the analysis of zygosity in transgenic plants, Plant Science, 2003, Vol. 164, pp. 183-187. *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010284286B2 (en) 2015-08-20
CA2771581A1 (en) 2011-02-24
WO2011022471A1 (en) 2011-02-24
CO6511214A2 (en) 2012-08-31
MX2012002076A (en) 2012-03-21
RU2012110253A (en) 2013-09-27
MX336072B (en) 2016-01-06
JP2013505706A (en) 2013-02-21
IN2012DN01800A (en) 2015-06-05
IL218175A (en) 2017-04-30
ZA201201210B (en) 2012-10-31
CA2771581C (en) 2018-05-01
HK1173194A1 (en) 2013-05-10
CN102575299B (en) 2015-09-09
JP5771208B2 (en) 2015-08-26
BR112012003873A2 (en) 2016-11-22
NZ598598A (en) 2014-05-30
AU2010284286A1 (en) 2012-03-29
KR20120053038A (en) 2012-05-24
CN102575299A (en) 2012-07-11
CL2012000410A1 (en) 2012-10-19
KR101772638B1 (en) 2017-08-31
IL218175A0 (en) 2012-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2577143C2 (en) Detection of aad-1 of object das-40278-9
US9353381B2 (en) Cotton event pDAB4468.19.10.3 detection method
WO2011066360A1 (en) Detection of aad-12 soybean event 416
US20110151441A1 (en) Endpoint taqman methods for determining zygosity of corn comprising tc1507 events
RU2573898C2 (en) Detecting of aad-12-event 416 at soy
US9204599B2 (en) Detection of AAD1 event DAS-40278-9
AU2011311955B9 (en) Endpoint TaqMan methods for determining zygosity of cotton comprising Cry 1F event 281-24-236
US9243287B2 (en) Endpoint TaqMan methods for determining zygosity of cotton comprising Cry1Ac event 3006-210-23
US9534260B2 (en) Materials and methods for detecting the aryloxyalkanoate dioxygenase gene (AAD-12) containing event pDAB4472-1606 in plants
EP2467500B1 (en) Detection of aad-1 event das-40278-9
EP2768981B1 (en) Method to determine zygosity of the fad2 gene in canola using end-point pcr
RU2630998C2 (en) Method for fad3 gene zygosity determination in canola

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20180819