PT2667878E

PT2667878E - Composições e métodos para o transplante celular

Info

Publication number: PT2667878E
Application number: PT127042422T
Authority: PT
Inventors: Stephenne Xavier; Sokal Etienne; Najimi Mustapha; Eeckhoudt Stéphane; Hermans Cédric
Original assignee: Univ Catholique Louvain
Priority date: 2011-01-25
Filing date: 2012-01-25
Publication date: 2016-06-03
Also published as: US20130302291A1; US10039789B2; EP2667878A1; CA2825252C; US20170354723A1; EP2667878B1; WO2012101181A1; PL2667878T3; DK2667878T3; CN103402527B; JP6012629B2; CN103402527A; ES2573522T3; US10478459B2; SG192124A1; JP2014508138A; US20170042940A1; IL227529A0; CA2825252A1

Description

DESCRIÇÃO COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRANSPLANTE CELULARCampo da invenção A presente invenção refere-se ao campo da regeneração detecidos em geral e ao transplante celular em particular. Apresente invenção está dirigida a composições e métodos paramelhorar o transplante de células e particularmente para inibira atividade pró-coagulante associada com o transplante decélulas.

Antecedentes da invenção Várias condições causadas por órgãos doentes oudanificados ou prejudicados funcionalmente podem ser tratadaspor transplantes de órgãos. Em particular, transplante decoração, rins, fígado, pulmões, pâncreas, intestino e timo podeser rotineiramente realizado com uma taxa de sucesso razoável.Uma desvantagem importante no transplante de órgãos no entantopermanece a necessidade de encontrar um dador compatível paracada doente recetor, uma vez que a incompatibilidade entre odador e o recetor pode resultar na rejeição do órgãotransplantado. A rejeição de transplantes pode ser reduzidaatravés de serotipagem para determinar a correspondência dedador-recipiente mais apropriada e através da utilização defármacos imunossupressores, embora a adequação destasabordagens possa ser diminuída devido à urgência médica emalguns casos. Igualmente, o uso ao longo da vida de fármacosimunossupressores coloca um fardo sobre o paciente recetor emtermos de efeitos secundários e colaboração.

Nos últimos anos, a terapêutica celular utilizando váriasfontes de células é cada vez mais usada para a medicinaregenerativa, em seres humanos. 0 transplante celular podefornecer uma alternativa valiosa ou terapêutica adicional(adjuvante) para transplantes de órgãos. Além disso, já que nemtodos os órgãos podem ser efetivamente transplantados, o transplante celular pode ser frequentemente a única curadisponível. Vantajosamente, nom transplante de células, ascomplicações relacionadas com a compatibilidade podem, pelomenos em teoria, tornar-se um problema menor. Por exemplo, ascélulas a ser transplantadas podem, por vezes, ser isoladas ouderivadas a partir do próprio paciente (isto é, transplante decélulas autólogas), reduzindo assim o risco de rejeição.Alternativamente, as células de transplante alogénicas oumesmo xenogénicas podem ser prontamente tipificadas earmazenadas durante um período de tempo prolongado em bancosou inventários de células, a partir dos quais célulasgeneticamente correspondentes ou, pelo menos, célulascompatíveis podem ser obtidas para a maioria dos recetores.

Sempre que a administração de células a um paciente estácontemplada, pode ser preferível que as células ou culturascelulares sejam selecionadas de modo a maximizar acompatibilidade dos tecidos entre o paciente e as célulasadministradas, reduzindo assim a probabilidade de rejeição dascélulas administradas pelo sistema imunitário do paciente(rejeição de enxerto contra hospedeiro) . Por exemplo, de modovantajoso, podem ser tipicamente selecionadas células que têmqualquer dos haplotipos de HLA idênticos (incluindo um ou depreferência mais de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-D, HLA-DR, HLA-DPe HLA-DQ; preferentemente um ou preferentemente todos de HLA-A,HLA-B e HLA-C) no paciente, ou que têm a maioria dos alelos doantigénio de HLA comuns para o paciente e nenhum ou quase nenhumdos antigénios de HLA para os quais o paciente contém anticorposanti-HLA pré-existentes.

Podem executar-se procedimentos de regeneração detecidos, por meio do transplante de células utilizando umagrande variedade de fontes de células, e geralmente usandocélulas tendo capacidade proliferativa. Por exemplo, em váriasdoenças metabólicas congénitas humanas, o transplante decélulas hepáticas pode restaurar pelo menos algum grau decontrolo metabólico. Noutro exemplo, o transplante intraportal de ilhotas pancreáticas proporciona um melhor controloglicémico e independência de insulina em diabetes mellitus tipo 1. Por exemplo, células estaminais pluripotentes, capazes dese diferenciar numa variedade de linhagens celulares, oucélulas progenitoras comprometidas com uma ou algumaslinhagens celulares (multipotentes) e exibindo vários graus dediferenciação podem ser utilizadas como uma fonte de célulaspara transplante celular.

Apesar de algum sucesso clinico, as terapêuticas atuaisde transplante celular requerem melhorias adicionais. Umapreocupação entre os médicos e autoridades sanitárias são aspotenciais consequências da atividade pró-coagulante de certascélulas transplantadas aquando do enxerto das células e outrascomplicações. Por exemplo, relatou-se que a atividadepró-coagulante de transplantes de ilhotas causa a perda doenxerto e eventos trombóticos intraportais (Beuneu et al.Diabetes, 2004, vol. 53, 1407-11; Moberg et al. Lancet, 2002,vol. 360, 2039-45). A atividade pró-coagulante foi também observada em hepatócitos primários isolados (Stephenne et al.Liver Transpl., 2007, vol. 13, 599-606).

Consequentemente, persiste uma necessidade urgente natécnica de melhorar o sucesso no transplante celular e nopotencial enxerto de células, e em particular, de reduzircomplicações pró-trombóticas associadas com o transplantecelular.

Furlani et al. Microvasc Res., 2009, vol. 77, 370-6 estudaram a cinética de células estaminais mesenquimatosashumanas após administração intravascular na vasculatura domúsculo cremáster em ratinhos com SCID por microscopiaintravital. Os autores propuseram que a infusão intra-arterialde células estaminais mesenquimatosas pode conduzir à oclusãoda vasculatura distai devido ao tamanho relativamente grandedas células.

Sumário da invenção

Depois de terem realizado extensas avaliações in vitro e clínicas, os inventores descobriram que a atividadepró-coagulante previamente relatada nas células primáriasisoladas, tais como hepatócitos e células das ilhotas é tambémobservada nas células estaminais e nas células progenitorastais como células estaminais mesenquimatosas. A atividadepró-coagulante das células estaminais e progenitoras pode sermotivo de preocupação no transplante destas células, emparticular, pode causar modificações indesejáveis na correntesanguínea, perda de células transplantadas, redução dopotencial de enxerto de células e/ou eventos trombóticos. Alémdisso, esta atividade pró-coagulante não pode ser controladapela heparina não fracionada, o anticoagulante convencionalpara o transplante de hepatócitos.

Portanto, os inventores investigaram modos paraneutralizar a atividade pró-coagulante das célulastransplantadas e descobriram que a administração concomitanteou associada de células com atividade pró-coagulante com umativador de antitrombina e um inibidor de trombina fornece umacombinação particularmente eficaz e segura para prevenirefeitos deletérios pró-coagulantes. Surpreendentemente,embora a administração concomitante de células com atividadepró-coagulante, seja com o ativador de antitrombina ou apenasum inibidor da trombina, não impede de forma adequada eventostrombóticos em concentrações fisiologicamente aceitáveis doativador de antitrombina e inibidor de trombina,respetivamente, a combinação do ativador de antitrombina emconjunto com o inibidor de trombina pode, com vantagem,prevenir a trombose induzida pelo tratamento celular e ascomplicações associadas com a trombose (por exemplo, tromboselocal e indução de inflamação local). Consequentemente, osinventores aperceberam-se de uma terapêutica de combinaçãoparticularmente vantajosa e até mesmo sinérgica e protocolosclínicos úteis para a redução da atividade pró-coagulante dascélulas transplantadas, em particular, de células estaminaise progenitoras.

Por conseguinte, um aspeto refere-se a uma combinação quecompreende células com atividade pró-coagulante, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor de trombina.

Outro aspeto refere-se a uma combinação que compreendepelo menos um ativador de antitrombina, pelo menos um inibidorde trombina e células selecionadas a partir do grupo queconsiste em células progenitoras hepáticas adultas emiofibroblastos hepáticos.

Se for caso disso, a combinação pode ser configurada paraa administração separada, simultânea ou sequencial em qualquerordem das células, pelo menos um ativador de antitrombina e pelomenos um inibidor de trombina. Além disso, é possível misturarou separar as células, pelo menos um ativador de antitrombinae/ou pelo menos um inibidor de trombina, na dita combinação.Também é divulgado um método para produzir a dita combinaçãoque compreende misturar as células, pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina.

Conforme se pretende ao longo da presente memóriadescritiva, quando se faz referência a uma combinaçãocompreendendo as células descritas no presente documento,particularmente as células que tem atividade pró-coagulante,pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menos um inibidorde trombina, ou quando se faz referência a uma combinação quecompreende pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menosum inibidor de trombina, ou quando se refere a qualquer matériacompreendendo ou empregando a dita combinação, osconstituintes individuais da combinação podem ser configuradospara a administração separada, simultânea ou sequencial emqualquer ordem a um indivíduo, ou podem ser administrados a umindivíduo separadamente, simultaneamente ou sequencialmenteem qualquer ordem. Num exemplo, as células, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor de trombinapodem ser incluídos na suspensão celular a ser administrada.Noutro exemplo, as células e pelo menos um ativador deantitrombina podem ser incluídos na suspensão celular a ser administrada, enquanto pelo menos um inibidor de trombina podeser separado da dita suspensão celular e será administrado aoindivíduo em simultâneo ou sequencialmente com a dita suspensãocelular. Ainda noutro exemplo, as células e o pelo menos uminibidor de trombina podem ser incluídos na suspensão celulara ser administrada, enquanto o pelo menos um ativador deantitrombina pode ser separado da dita suspensão celular e seráadministrado ao indivíduo em simultâneo ou sequencialmente coma dita suspensão celular. Num exemplo adicional, tanto o pelomenos um ativador de antitrombina e o pelo menos um inibidorde trombina podem ser separados da suspensão celular e serãoadministrados ao indivíduo em simultâneo ou sequencialmentecom a suspensão celular, e em simultâneo ou sequencialmenteentre si. Quando a administração dos constituintes ésequencial, deve ser entendido que o momento de administraçãoserá selecionado de forma a permitir as ações desejadas dosconstituintes produzidas pela sua combinação. É adicionalmente divulgada uma composição farmacêuticaque compreende (a) uma combinação que compreende células comatividade pró-coagulante, pelo menos um ativador deantitrombina, pelo menos um inibidor de trombina e (b) um oumais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. É adicionalmente divulgada de uma composição farmacêuticaque compreende (a) uma combinação que compreende pelo menos umativador de antitrombina, pelo menos um inibidor de trombinae células selecionadas a partir do grupo que consiste em célulasprogenitoras hepáticas adultas e miofibroblastos hepáticos, e(b) um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica pode ser configurada para aadministração separada, simultânea ou sequencial em qualquerordem das células, pelo menos um ativador de antitrombina e pelomenos um inibidor de trombina. As células, pelo menos umativador de antitrombina, e/ou pelo menos um inibidor detrombina na dita composição farmacêutica podem ser misturadosou podem ser separados. Também é divulgado um método para produzir a dita composição farmacêutica que compreende amistura das células, pelo menos um ativador de antitrombina epelo menos um inibidor de trombina, cada um deles separadamenteou numa mistura, com o um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis.

Além disso, é proporcionado um kit de partes ou um artigode fabrico compreendendo uma combinação que compreende célulastendo uma atividade pró-coagulante, pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, eopcionalmente compreendendo adicionalmente um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Igualmente, é proporcionado um kit de partes ou um artigode fabrico compreendendo uma combinação que compreende pelomenos um ativador de antitrombina, pelo menos um inibidor detrombina e células selecionadas a partir do grupo que consisteem células progenitoras hepáticas adultas e miofibroblastoshepáticos, e que compreende ainda, opcionalmente, um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis. 0 kit de partes ou artigo de fabrico pode ser configuradopara administração separada, simultânea ou sequencial emqualquer ordem das células, pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina. As células,pelo menos um ativador de antitrombina, e/ou pelo menos uminibidor de trombina no dito kit de partes ou artigo de fabricopodem ser misturados ou podem ser separados, em particularpodem ser separados, como por exemplo contidos em recipientesseparados. É também divulgado um método para produzir oreferido kit de partes ou artigo de fabrico que compreende ainclusão das células, pelo menos um ativador de antitrombinae pelo menos um inibidor de trombina, e opcionalmente um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis, num kit de partes ouum artigo de fabrico. Também é fornecido o kit de partes ouartigo de fabrico para utilização em qualquer uma dasindicações descritas no presente documento. São ainda divulgados todos e cada um dos seguintes aspetos : uma combinação compreendendo células com atividadepró-coagulante, pelo menos um ativador de antitrombina epelo menos um inibidor de trombina para utilização como ummedicamento; uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina, pelo menos um inibidor de trombina e célulasselecionadas a partir do grupo que consiste em célulasprogenitoras hepáticas adultas e miofibroblastos hepáticos, para utilização como um medicamento;uma combinação compreendendo quaisquer células tal comodescritas no presente documento, tais como em particular,células com atividade pró-coagulante, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, ou uma composição farmacêutica compreendendo adita combinação e um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis, para utilização no transplante das ditascélulas; utilização de uma combinação compreendendo quaisquercélulas conforme descritas no presente documento taiscomo, em particular, células com atividade pró-coagulante,pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menos uminibidor de trombina, para o fabrico de um medicamento parao transplante das ditas células; uma combinação compreendendo quaisquer células conformedescritas no presente documento, tais como em particular,células com atividade pró-coagulante, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, ou uma composição farmacêutica compreendendo adita combinação e um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis, para utilização no tratamento de trombose oucomplicações trombóticas, particularmente trombose oucomplicações trombóticas causadas por transplante dasditas células; utilização de uma combinação compreendendo quaisquer células conforme descritas no presente documento, taiscomo em particular, células com atividade pró-coagulante,pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menos uminibidor de trombina, para o fabrico de um medicamento parao tratamento de trombose ou complicações trombóticas,particularmente trombose ou complicações trombóticacausadas por transplante das ditas células;uma combinação compreendendo quaisquer células conformedescritas no presente documento, tais como em particular,células com atividade pró-coagulante, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, ou uma composição farmacêutica compreendendo adita combinação e um ou mais excipientes farmaceuticamenteaceitáveis, para utilização na inibição da atividadepró-coagulante das ditas células in vivo;utilização de uma combinação compreendendo quaisquercélulas conforme descritas no presente documento, taiscomo em particular, células com atividade pró-coagulante,pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menos uminibidor de trombina, para o fabrico de um medicamento paraa inibição da atividade pró-coagulante das ditas célulasin vivo; utilização de uma combinação quaisquer células conformedescritas no presente documento, tais como em particular,células com atividade pró-coagulante, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, para a inibição da atividade pró-coagulante dasditas células in vitro; um método para a inibição in vitro da atividadepró-coagulante de quaisquer células conforme descritas nopresente documento, tais como em particular, células comatividade pró-coagulante, pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina;um método para o transplante de quaisquer células conformedescritas no presente documento, tais como em particular, células com atividade pró-coagulante, a um indivíduo emnecessidade de tal transplante compreendendo aadministração ao dito indivíduo de uma quantidadeterapêutica ou profilaticamente eficaz de uma combinaçãoque compreende as ditas células, pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica compreendendo a dita combinação eum ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis;um método para o tratamento de trombose ou complicaçõestrombóticas, particularmente trombose ou complicaçõestrombóticas causadas por transplante de quaisquer célulasconforme descritas no presente documento, tais como emparticular, células com atividade pró-coagulante, numindivíduo em necessidade de tal tratamento, compreendendoa administração ao dito indivíduo de uma quantidadeterapêutica ou profilaticamente eficaz de uma combinaçãoque compreende as ditas células, pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica que compreende a dita combinaçãoe um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis;um método para a inibição da atividade pró-coagulante decélulas, tais como quaisquer células, conforme descritasno presente documento, in vivo num indivíduo em necessidadede tal inibição, que compreende a administração ao ditoindivíduo de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de uma combinação que compreendeas ditas células, pelo menos um ativador de antitrombinae pelo menos um inibidor de trombina, ou uma composiçãofarmacêutica que compreende a dita combinação e um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis. São adicionalmente fornecidas utilizações de umacombinação que compreende as células conforme descritas nopresente documento, tais como em particular, células comatividade pró-coagulante, pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, em todas e cada uma das indicações anteriormente descritas.

Um aspeto adicional refere-se a uma combinação quecompreende pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menosum inibidor de trombina. Se for caso disso, a combinação podeser configurada para administração separada, simultânea ousequencial em qualquer ordem de pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina. Além disso,o pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menos uminibidor de trombina na dita combinação podem ser misturadosou podem ser separados. Também é divulgado um método paraproduzir a dita combinação que compreende misturar o pelo menosum ativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina. É ainda divulgada uma composição farmacêuticacompreendendo uma combinação que compreende pelo menos umativador de antitrombina, pelo menos um inibidor de trombinae um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Acomposição farmacêutica pode ser configurada para aadministração separada, simultânea ou sequencial em qualquerordem de pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menosum inibidor de trombina. 0 pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, na ditacomposição farmacêutica podem ser misturados ou podem serseparados. Também é divulgado um método para a produção da ditacomposição farmacêutica compreendendo a mistura de pelo menosum ativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, cada um separadamente ou numa mistura, com os um oumais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. É igualmente proporcionado um kit de partes ou um artigode fabrico compreendendo uma combinação que compreende pelomenos um ativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina e compreendendo ainda, opcionalmente, um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis. 0 kit de partes ouartigo de fabrico pode ser configurado para a administraçãoseparada, simultânea ou sequencial em qualquer ordem do pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina. 0 pelo menos um ativador de antitrombina e pelo menosum inibidor de trombina no dito kit de partes ou artigo defabrico podem ser misturados ou podem ser separados, emparticular pode ser separados, como por exemplo contidos emrecipientes separados. É também divulgado um método paraproduzir o dito kit de partes ou artigo de fabrico compreendendoa inclusão de pelo menos um ativador de antitrombina e pelomenos um inibidor de trombina, e opcionalmente um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis, num kit de partes oude um artigo de fabrico. Também é fornecido o kit de partes ouartigo de fabrico para utilização em todas e cada uma dasindicações descritas no presente documento.

Também são divulgados todos e cada um dos aspetosconsequentes: uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina parautilização como um medicamento; uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica compreendendo a dita combinação eum ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, parautilização no transplante de células com atividadepró-coagulante (isto é, em conjunto com o transplante decelular); uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica compreendendo a dita combinação eum ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, parautilização no transplante de células selecionada a partirdo grupo que consiste em células progenitoras hepáticasadultas e miofibroblastos hepáticos (isto é, em conjuntocom o transplante celular); utilização de uma combinação que compreende pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, para o fabrico de um medicamento para otransplante de quaisquer células, conforme descritas nopresente documento, tais como em particular células comatividade pró-coagulante; uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica compreendendo a dita combinação eum ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, parautilização no tratamento de trombose ou complicaçõestrombóticas, particularmente trombose ou complicaçõestrombóticas causadas pelo transplante de quaisquercélulas, conforme descritas no presente documento, taiscomo em particular células com atividade pró-coagulante;utilização de uma combinação que compreende pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, para o fabrico de um medicamento para otratamento de trombose ou complicações trombóticas,particularmente trombose ou complicações trombóticascausadas pelo transplante de quaisquer células, conformedescritas no presente documento, tais como em particularcélulas com atividade pró-coagulante; uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica compreendendo a dita combinação eum ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, parautilização na inibição da atividade pró-coagulante dasditas células, tais como quaisquer células, conformedescritas no presente documento, in vivo;utilização de uma combinação que compreende pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, para o fabrico de um medicamento para a inibiçãoda atividade pró-coagulante de células, tais comoquaisquer células, conforme descritas no presentedocumento, in vivo. utilização de uma combinação que compreende pelo menos um ativador de antitrombina e, pelo menos, um inibidor datrombina para a inibição da atividade pró-coagulante decélulas, tais como quaisquer células, conforme descritasno presente documento, in vitro; um método para a inibição in vitro da atividadepró-coagulante de quaisquer células, conforme descritas nopresente documento, tais como em particular células comatividade pró-coagulante, compreendendo estabelecer ocontacto das ditas células com uma combinação quecompreende pelo menos um ativador de antitrombina e pelomenos um inibidor de trombina; um método para o tratamento de trombose ou complicaçõestrombóticas, particularmente trombose ou complicaçõestrombóticas causadas pelo transplante de quaisquer célulasconforme descritas no presente documento, tais como emparticular células com atividade pró-coagulante, numindivíduo em necessidade de tal tratamento, compreendendoa administração ao dito indivíduo de uma quantidadeterapêutica ou profilaticamente eficaz de uma combinaçãoque compreende pelo menos um ativador de antitrombina epelo menos um inibidor de trombina, ou uma composiçãofarmacêutica que compreende a dita combinação e um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis;um método para a inibição da atividade pró-coagulante decélulas in vivo num indivíduo com necessidade de talinibição, que compreende a administração ao dito indivíduode uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficazde uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica compreendendo a dita combinação eum ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Preferentemente, qualquer um dos métodos acima podecompreender as etapas de: (a) preparar uma composição que compreende uma suspensão celular das células conformedescritas no presente documento, tais como em particular células com atividade pró-coagulante numa solução aquosacontendo pelo menos um ativador de antitrombina; (b) prepararuma solução aquosa contendo pelo menos um inibidor de trombina(isto é, distinto ou separado da composição (a) ) ; e (c)administrar a composição tal como definida em (a) e a solução,tal como definida em (b) simultaneamente, em separado ousequencialmente ao indivíduo. Assim, preferentemente, nosaspetos anteriores, (a) será preparada uma composição quecompreende uma suspensão celular das células, conformedescritas no presente documento, tais como em particularcélulas com atividade pró-coagulante numa solução aquosacontendo pelo menos um ativador de antitrombina; (b) serápreparada uma solução aquosa contendo pelo menos um inibidorde trombina (isto é, distinto ou separado da composição (a) ) ;e (c) será administrada a composição tal como definida em (a)e a solução, tal como definida em (b) de forma simultânea,separadamente ou sequencialmente a um indivíduo. São igualmente proporcionadas utilizações de umacombinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina em todas ecada uma das indicações anteriormente descritas. É também proporcionado um arranjo que compreende uminstrumento ou dispositivo cirúrgico para a administração deuma composição a um indivíduo tal como, por exemplo,sistemicamente, topicamente, dentro de um órgão ou tecido (porexemplo, veia porta do fígado, baço, pâncreas, fígado, cápsularenal, peritoneu e bolsa omental) , e compreendendo ainda acomposição ou combinação farmacêutica que compreende ascélulas conforme descritas no presente documento, tais como emparticular células pró-coagulantes como ensinadas no presentedocumento, em que o arranjo é adaptado para administração dadita combinação ou da composição farmacêutica, por exemplo,sistemicamente, topicamente, dentro de um órgão ou tecido. Porexemplo, um instrumento cirúrgico adequado pode ser capaz deinjetar uma composição líquida compreendendo a composição de combinação farmacêutica aqui ensinada, tal comosistemicamente, topicamente, dentro de um órgão ou tecido.

As células com atividade pró-coagulante como pretendidasao longo da presente memória descritiva abrangem quaisquercélulas que são capazes de ativar a cascata de coagulação einduzir a coagulação ou formação de coágulos. A atividadepró-coagulante pode ser convenientemente determinadautilizando qualquer teste de coagulação conhecido, tal como,sem limitação, tromboelastometria.

Por exemplo, as células podem ser indicadas como tendoatividade pró-coagulante no sentido da presente invençãoquando, num teste de tromboelastometria padrão, as célulasapresentam um tempo de coagulação (CT) significativamente maiscurto (p <0,05 aplicando um teste apropriado de significânciaestatística) do que um controlo negativo sem adição de células.Considerando que a tromboelastometria representa uma técnicalaboratorial padrão, razões de orientação adicional detromboelastometria adequada para ensaios da naturezapró-coagulante das células como pretendido no presentedocumento podem ser as seguintes: São realizadas medições num analisador ROTEM® delta(Pentapharm, Munique, Alemanha). ROTEM® avalia a cinética,a qualidade de formação de coágulos e a lise dos coágulos emtempo real. O tempo de coagulação (CT) é definido como operíodo de tempo desde o início da análise, até o início daformação de coágulos, até alcançar a amplitude de 2milímetros. Depois de um curto período de repouso, 300 μΐ desangue total são pipetados para um copo pré-aquecido a 37 °C.As células em suspensão (5xl0exp5) são subsequentementeadicionadas a sangue total (controlo negativo: um volumeigual de meio de suspensão, sem quaisquer células emsuspensão). 20 μΐ de reagente desencadeador que contêm ofator tecidual (TF) a uma diluição final de 1:17000/0,35 pM(tal como Innovin, Siemens, Marburg, Alemanha) diluídos emtampão de Owren (tal como obtido a partir Clin-Tech Ltd, Reino

Unido) são adicionados à mistura de células-sangue, seguidopela adição de 20 μΐ de CaCÍ2 a 0,2 M. Após a adição de cálcio,a medição é iniciada automaticamente. Se não se observarqualquer coagulação depois de 1800 segundos, atromboelastometria é interrompida.

Como divulgado no presente documento, as células conformedivulgadas no presente documento, tais como em particularcélulas com atividade pró-coagulante podem ser de qualquerorigem e/ou estado de diferenciação. As células conformedivulgadas no presente documento, tais como células comatividade pró-coagulante são selecionadas a partir do grupo queconsiste em células estaminais e células progenitoras. Ascélulas conforme divulgadas no presente documento, tais comocélulas com atividade pró-coagulante podem ser célulasestaminais mesenquimatosas. Também preferentemente, ascélulas como pretendidas no presente documento, tais comocélulas com atividade pró-coagulante são células progenitorasou estaminais derivadas de fígado de adulto.

Numa forma de realização, as células como pretendidas nopresente documento, tais como as células com atividadepró-coagulante são células estaminais hepáticas humanasderivadas de adulto, como geralmente descrito no documento WO2007/071339; mais particularmente, as células progenitoras ouestaminais humanas originadas a partir do fígado adulto queexpressam alfa-actina de músculo liso (ASMA) e albumina (ALB)e não expressam citoqueratina-19 (CK-19) tal como aí descrito;ainda mais particularmente, as células progenitoras ouestaminais humanas com origem a partir de fígado adulto queexpressam CD90, CD73, CD44, vimentina, ASMA e ALB e,opcionalmente, expressam CYP3A4 e não expressam CK-19, comodescrito no mesmo; ainda mais particularmente, as célulasestaminais hepáticas humanas obtidas de adulto (ADHLSC) comodescrito por Najimi et al., Cell Transplant, 2007, vol. 16,717-28; e ainda mais particularmente células como depositadaspelo Requerente do documento WO 2007/071339 em 20 de fevereiro de 2006 sob o Tratado de Budapeste com as Coleções CoordenadasBelgas de Microrganismos (BCCM/LMBP) sob o número de acessoLMBP 6452CB.

Numa forma de realização, as células como pretendidas nopresente documento, tais como as células com atividadepró-coagulante, são as células progenitoras pluripotenteshepáticas humanas derivadas de adulto, não ovais descritasgeralmente no documento WO 2006/126236; mais particularmente,uma linha de células progenitoras pluripotentes hepáticashumanas, não ovais isoladas a partir de tecido adulto queexpressa marcadores celulares hepáticos e que é capaz de sediferenciar em células maduras do fígado, células produtorasde insulina, células osteogénicas e células epiteliais, outambém em particular, uma linha de células progenitoraspluripotentes hepáticas humanas, não ovais isoladas a partirde tecido adulto que expressa marcadores celulares hepáticose que é capaz de se diferenciar em células maduras hepáticas,células produtoras de insulina, células osteogénicas e célulasendoteliais, descritas no mesmo; ainda mais particularmente ascélulas estaminais hepáticas humanas (CMHH) descritas porHerrera et al. Stem Cells, 2006, vol. 24, 2840-50.

Sem se pretender estar ligado a qualquer teoria,acredita-se que a expressão do fator tecidual (também conhecidocomo fator tecidual de plaquetas, fator III, tromboquinase ouCD142) pelas células com atividade pró-coagulante é pelo menosem parte causadora da atividade pró-coagulante das ditascélulas (veja-se, por exemplo, Beuneu et al., 2004, Moberg etal., 2002 e Stephenne et al., 2007, supra) . Consequentemente,numa forma de realização, as células com atividadepró-coagulante expressam fator tecidual.

Os inventores aperceberam-se adicionalmente que ascélulas pró-coagulantes particularmente preferidas empreguesno presente documento podem compreender um componente comatividade pró-coagulante independente da expressão do fatortecidual (TF) pelas células. Mais especificamente, tais células pró-coagulantes irão, pelo menos parcialmente (porexemplo, apenas parcialmente ou totalmente), reter a suaatividade pró-coagulante como medida por tromboelastometria noplasma deficiente em Fator VII, ou conforme medida portromboelastometria no sangue ou plasma normal quando aatividade do TF é bloqueada, tal como através da pré-incubaçãodas células com anticorpo anti-TF. Sem se desejar estar ligadopela teoria, a atividade pró-coagulante mensurável de célulasno plasma deficiente em fator VII pode, pelo menos em parte,estar também relacionada com as pequenas quantidades residuaisde fator VII.

Os inventores aperceberam-se adicionalmente que ascélulas pró-coagulantes particularmente preferidas utilizadasno presente documento podem compreender um componente comatividade pró-coagulante resistente à heparina. Maisespecificamente, tais células pró-coagulantes irão, pelo menosparcialmente (por exemplo, apenas parcialmente ou totalmente) ,reter a sua atividade pró-coagulante como medida portromboelastometria na presença de heparina sozinha (ou seja,na ausência de ativador de trombina), tal como particularmentena presença de heparina não fracionada, enoxaparina oufondaparinux, particularmente em concentrações de 10 Ul/ml, 1Ul/ml e 0,34 mg/1, respetivamente. Assim, noutras formas derealização preferidas, as células pró-coagulantes, conformeutilizadas no presente documento, podem compreender umcomponente com atividade pró-coagulante independente daexpressão do fator tecidual (TF) pelas células e podemcompreender uma componente de atividade pró-coagulanteresistente à heparina.

Um ativador de antitrombina como pretendido ao longo destamemória descritiva engloba qualquer agente tal como definidona reivindicação 1 capaz de aumentar a ligação da antitrombinaa qualquer um ou mais dos seus alvos. O ativador de antitrombinaé selecionado a partir do grupo que consiste em heparina,heparina não fracionada e de heparina de baixa massa molecular, preferentemente heparina não fracionada e fondaparinux.

Um inibidor de trombina como pretendido ao longo destamemória descritiva é um agente capaz de se ligar diretamentea trombina e inibir ou prevenir a ativação do fibrinogéniomediada pela trombina. 0 inibidor de trombina é selecionado a partir do grupo queconsiste em bivalirudina e hirudina, preferentemente,bivalirudina. Vantajosamente, a bivalirudina tem uma semividacomparativamente curta de cerca de 35 a cerca de 40 minutos,permitindo assim um regresso rápido de um indivíduo a um estadode hemóstase normal.

Os aspetos anteriores e adicionais, formas de realizaçãoe características preferidas da invenção estão descritas nassecções que se seguem e nas reivindicações anexas. Cada aspeto,forma de realização ou característica descritos no presentedocumento podem ser combinados com qualquer(quaisquer)outro(s) aspeto (s), modo(s) de realização oucaracterística (s), a menos que expressamente indicado ocontrário. Em particular, qualquer característicaespecificada no presente documento, e em particular qualquercaracterística indicada como sendo preferida ou vantajosa,pode ser combinada com qualquer(quaisquer) outra(s)característica (s) especificadas no presente documento, e emparticular com qualquer(quaisquer) outra(s) característica(s)indicada(s) como sendo preferida(s) ou vantajosa(s). O objetodas reivindicações anexas é aqui especificamente incorporadona presente memória descritiva.

Breves descrições das figuras:

Figura 1 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com e sem fator tecidual adicionado (Extern,20 μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ounão de células em suspensão em albumina humana a 5 %. Hep:hepatócitos (branco), ALDSC: células estaminais mesenquimatosas hepáticas humanas derivada de adulto(preto), A: albumina humana a 5 %. ALDSC contra hepatócitos: teste de Mann-Whitney, *p<0,05; ALDSC contra hepatócitoscontra controlo: teste de Kruskal-Wallis, ***p<0,001.Figura 2 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (Extern, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode células em suspensão em albumina humana a 5 % e 10 Ul/mlde heparina (hepar). Hep: hepatócitos (branco), ALDSC: células estaminais mesenquimatosas hepáticas humanasderivada de adulto (preto), A: albumina humana a 5 %. ALDSCcontra hepatócitos: teste de Mann-Whitney, **p<0,01; ALDSCcontra hepatócitos contra controlo: teste de Kruskal-Wallis ***p<0,001.

Figura 3 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (Extern, 20μΐ) , de plasma (300 μΐ) obtido depois de 30 min de incubaçãode sangue com citrato na presença ou não de células emsuspensão em albumina humana a 5 % e heparina (hepar)(10-50-100 Ul/ml). Hep: hepatócitos (branco), ALDSC: célulasestaminais mesenquimatosas hepáticas humanas derivada deadulto (preto), A: albumina humana a 5 %.

Figura 4 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (Extern, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode células. Hep: hepatócitos (branco), ALDSC: células estaminais mesenquimatosas hepáticas humanas derivada deadulto (preto), A: albumina humana a 5 %, hir, hir2, hir5:hirudina a 1, 2, 5 vezes a concentração em bólus de uso clínico(0,4 mg/kg); hepar: 10 Ul/ml de heparina em suspensão celular; controlo: sangue total.

Figura 5 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (Extern, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode células. Hep: hepatócitos (branco), ALDSC: células estaminais mesenquimatosas hepáticas humanas derivada deadulto (preto), A: albumina humana a 5 %, biv, biv2: bivalirudina a 1, 2 vezes a concentração em bólus de usoclínico (0,75 mg/kg); hepar: 10 Ul/ml de heparina emsuspensão celular; controlo: sangue total. ALDSC contraALDSC biva: teste de Mann-Whitney, **p<0,01; A contra ALDSCbiva: teste de Mann-Whitney, **p<0,01; ALDSC biva contraALDSC biva hepar: teste de Mann-Whitney **p<0, 01; ALDSC heparcontra ALDSC biva hepar: teste de Mann-Whitney ***p<0,001;ALDSC contra ALDSC biva contra ALDSC biva hepar: teste deKruskal-Wallis ***p<0,001.

Figura 6 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (Extern, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode células. Hep: hepatócitos (branco), ALDSC: célulasestaminais mesenquimatosas hepáticas humanas derivada deadulto (preto), BMMC: células estaminais mesenquimatosas damedula óssea, BMHC: células estaminais hematopoiéticas damedula óssea, A: albumina. ALDSC contra hepatócitos: testede Mann-Whitney *p<0,05; A contra ALDSC: teste deMann-Whitney, ***p<0,001

Figura 7 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (Extern, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode células estaminais hematopoiéticas da medula óssea emsuspensão em albumina humana a 5 % e 10 Ul/ml de heparina(hepar).

Figura 8 Fator tecidual e expressão de ARNm do inibidor davia do fator tecidual (TFPI) em ALDSC avaliados por RT-PCRconvencional. X = células ALDSC; H = hepatócitos; P = PBMC;C = controlo negativo; TF = Fator tecidual (primeiro conjuntode iniciadores); TF'= fator tecidual (segundo conjunto deiniciadores) , TFPI = inibidor da via do fator tecidual, GAPDH= gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (controlo técnico).Figura 9 ARNm do fator tecidual (TF e as-TF) e expressão deTFPI de ALDSC avaliados por PCR em tempo real. Expressãosemiquantitativa do ARNm do gene de TF (A) , a forma de splicing alternativa as-TF (B) e o gene de TFPI (c) entrecélulas ALDSC (X) e hepatócitos. Células CAPAN-2 e HUVEC sãoo controlo positivo para TF, asTF e TFPI, respetivamente.Figura 10 (A) Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (Extern, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode células em suspensão em albumina humana a 5 %. Nenhumacoagulação é induzida se existe ausência de recalcificação.Hepatócitos (branco), hALPCs (preto), Controlo (albumina)(cinzento). Hepatócitos contra hALPCs p <0,001; Hepatócitoscontra controlo p <0,001; hALPCs contra controlo p<0,01;hALPCs contra hepatócitos contra controlo: teste deKruskal-Wallis ***p<0,001. (B) Tempo de coagulação (TC)avaliado por ROTEM após recalcificação, com fator tecidualadicionado (ExTem, 20 μΐ) , de plasma (300 μΐ) obtido a partirde sangue incubado na presença ou não de células em suspensãoem albumina humana a 5 %. Hepatócitos (branco), hALPCs(preto), Controlo (albumina) (cinzento) . Hepatócitos contrahALPCs p <0,05; Hepatócitos contra controlo p <0,01; hALPCscontra controlo p<0,01; hALPCs contra hepatócitos contracontrolo: teste de Kruskal Wallis ***p<0,001. A atividadepró-coagulante (PCA) de células (hepatócitos e hALPCs) nosangue e plasma é comparável quando Innovin não é adicionado.Figura 11 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, sem fator tecidual adicionado (ExTem, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode células em suspensão em albumina humana a 5 %. Nenhumacoagulação é induzida se existe ausência de recalcificação.Hepatócitos (branco), hALPCs (preto)

Figura 12 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem, 20μΐ) , de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença desobrenadante de cultura de hALPCs. Nenhuma coagulação éinduzida se existe ausência de recalcificação.

Figura 13 Tempo de coagulação (TC) avaliado por ROTEM após recalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem, 20μΐ), de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou nãode hALPCs, hepatócitos, fibroblastos da pele, célulasestaminais mesenquimatosas da medula óssea (BMMSC), célulasestaminais hematopoiéticas da medula óssea (BMHSC),miofibroblastos hepáticos em suspensão em albumina humana a5 %. Fibroblastos contra controlo p<0,01; BMMSC contracontrolo p<0,01; miofibroblastos hepáticos contra controlo p <0,01.

Figura 14 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ)de plasma (300 μΐ) deficiente em fator de coagulação VII, V,X e II (PI 7d, PI 5d, PI lOd, PI 2d) na presença de célulasem suspensão em albumina humana a 5 %. hALPCs (preto),Controlo (albumina) (cinzento). NI PI (plasma normal) contraPI 7d p <0,01; PI 7d contra controlo p <0,01; NI PI contraPI 5d p <0,01; NI PI contra PI lOd p <0,001; NI PI contra PI2d p <0,001

Figura 15 (A) Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs suspensas em albumina humana a 5 % com heparina(Hepar). Pelo contrário, enoxaparina (Eno) ou fondaparinux(Fond) foram extemporaneamente adicionados ao sangue emcontacto com as células suspensas em albumina. hALPCs(preto), controlo (albumina) (cinzento) . * em comparação comhALPCs. f em comparação com o controlo. (B) Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM após recalcificação, comfator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) , de sangue total comcitrato (300 μΐ) na presença ou não de hALPCs suspensas emalbumina humana a 5 %. A bivalirudina (Biva) ou hirudina (Hir)foram extemporaneamente adicionadas ao sangue. hALPCs(preto), controlo (albumina) (cinzento) . * em comparação comhALPCs. f em comparação com o controlo. (C) Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM após recalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) , de sangue total cmcitrato (300 μΐ) na presença ou não de hepatócitos em suspensão de albumina humana a 5 % com heparina (Hepar) . Pelocontrário, enoxaparina (Eno) ou fondaparinux (Fond) foramextemporaneamente adicionados ao sangue em contacto comcélulas suspensas em albumina. Hepatócitos (branco), controlo (albumina) (cinzento) . * em comparação com os hepatócitos. f em comparação com o controlo. (D) Tempo decoagulação (CT) avaliado por ROTEM após recalcificação, comfator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) , de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não de hepatócitos em suspensão em albumina humana a 5 %. Bivalirudina (Biva) ouhirudina (Hir) foram extemporaneamente adicionadas aosangue. Hepatócitos (branco), controlo (albumina) (cinzento). * em relação com os hepatócitos. f em comparaçãocom o controlo.

Figura 16 (A) Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs suspensas em albumina humana a 5 % com heparina(Hepar) ou com enoxaparina (Eno) ou fondaparinux (Fond)extemporaneamente adicionados ao sangue. Obteve-se umacombinação de fármacos anticoagulantes quando a bivalirudina(Biva) foi adicionada ao sangue de forma extemporânea. hALPCs(preto), controlo (albumina) (cinzento). * em comparação comhALPCs. f em comparação com o controlo. $ em comparação coma bivalirudina. (B) Tempo de coagulação (CT) avaliado porROTEM após recalcificação, com fator tecidual adicionado(ExTem 20 μΐ) , de sangue total com citrato (300 μΐ) napresença ou não de hepatócitos suspensos em albumina humanaa 5 % com heparina (Hepar) ou com enoxaparina (Eno) oufondaparinux (Fond) extemporaneamente adicionados aosangue. Hepatócitos (branco), controlo (albumina)(cinzento) . * em comparação com os hepatócitos. f emcomparação com o controlo. $ em comparação com a bivalirudina.

Figura 17 Imunofluorescência para TF foi realizada em hALPCs(A) colocadas em lamelas e fixadas com paraformaldeido(ampliação de 20x) . Os núcleos foram revelados por DAPI(coloração azul). (B) Controlo negativo (sem anticorpo primário).

Figura 18 Expressão de ARNm de fator tecidual e do inibidorda via do fator tecidual (TFPI) em hALPCs e hepatócitosavaliados por RT-PCR convencional. Fator tecidual (TF),Fator Tecidual de splicing alternativo (as-TF), inibidor davia do fator tecidual (TFPI), gliceraldeido-3-fosfatodesidrogenase (GAPDH) (controlo técnico) .

Figura 19 ARNm do fator tecidual (TF e as-TF) e expressão deTFPI de hALPCs e hepatócitos avaliados por PCR em tempo real.Expressão semiquantitativa de ARNm do gene de TF (A) , formade splicing alternativo as-TF (B) e gene de TFPI (C) entreas células hALPCs e hepatócitos. Células CAPAN-2 e HUVEC sãoo controlo positivo para TF, as-TF e TFPI, respetivamente.Figura 20 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não decélulas suspensas em albumina humana a 5 %, após incubaçãodas células com anticorpo de TF (TF+) ou não (TF-) .Hepatócitos (branco), hALPCs (preto), controlo (albumina)(cinzento) . hALPCs TF- contra hALPCs TF+ p<0, 01; HepatócitosTF- contra hepatócitos TF+ P <0,01; hALPCs TF+ contracontrolo p<0,001; Hepatócitos contra controlo nãosignificativo

Figura 21 Após 30 minutos de incubação das células emsuspensão em albumina suplementada ou não com heparina(Hepar) (10 Ul/ml, 50 Ul/ml e 100 Ul/ml) no sangue, aatividade de anti-Xa (Ul/ml) foi medida no plasma obtido apóscentrifugação do sangue. hALPCs (preto), hepatócitos (Hep)(Branco), controlo (cinzento).

Figura 22 Durante a infusão celular, os pacientes recebem bivalirudina (1,75 mg/kg). Entre as infusões celularesconsecutivas, a dose foi reduzida para 0,25 mg/kg durante 2a 4 horas. Os testes de coagulação incluindotromboelastometria (CT na veia porta (port) ou através dalinha central (centr)), plaquetas (PLT) (valores normais:150-350 10exp3/ml) e os níveis de dímeros-D (valores normais:<500 ng/ml), tempo de trombina (TT, valores normais: 15-24seg), tempo de protrombina (PT, valores normais: 9-14 seg)e tempo de tromboplastina parcial (PTT, valores normais:20-33 seg) foram repetidamente realizados antes, 20 minutosapós o início e no final de cada infusão. A paciente comCrigler Najjar; B paciente com Glicogenose tipo la.

Figura 23 (A) Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs (preto) suspensas em albumina humana a 5 %, com ou semheparina (Hepar) a várias concentrações (Hepar-10 Ul/ml,Hepar5x - 50 Ul/ml, Heparl0x-100 Ul/ml). Controlo (albumina)(cinzento) . Controlo contra hALPCs Hepar 5x p <0,01. (B)Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs (preto) suspensas em albumina humana a 5 % com ou semfondaparinux (Fond), enoxaparina (Eno) na concentraçãonormal ou aumentada em 5x da concentração normal. Controlo(albumina) (cinzento). Controlo contra hALPCs Fond 5x, p<0,01; Controlo contra hALPCs Eno 5x, p <0,01; Fond contraFond 5x, n.s.; Eno vs. Eno 5x, n.s.

Figura 24 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ),de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs suspensas em albumina humana a 5 %. Concentraçãoaumentada de hirudina (Hir) (2x (Hir 2x) ou 5x (Hir 5x) ) foiadicionada extemporaneamente ao sangue. hALPCs (preto),Controlo (albumina) (cinzento). Controlo contra hALPCs Hir 2x, p <0,01; hALPCs contra hALPCs Hir 2x, p <0,01; hALPCs Hircontra hALPCs Hir 2x, n.s.

Figura 25 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs (preto) suspensas em albumina humana a 5 %.Concentração aumentada de bivalirudina (Biva) (2x (Biva 2x) )foi extemporaneamente adicionada ao sangue. hALPCs (preto),controlo (albumina) (cinzento). Controlo contra hALPCs Biva2x, p <0,01

Figura 26 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ),de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs suspensas em albumina humana a 5 % com ou sem heparina(Hepar). Enoxaparina (Eno) ou fondaparinux (Fond) foramextemporaneamente adicionados ao sangue com célulassuspensas ou não em heparina hALPCs (preto), controlo(albumina) (cinzento) . Controlo contra hALPCs Hepar + Eno,p <0,01; controlo contra hALPCs Hepar + Fond, p <0,01Figura 27 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não dehALPCs, hepatócitos, fibroblastos cutâneos, célulasestaminais mesenquimatosas de medula óssea (BMMSC), célulasestaminais hematopoiéticas de medula óssea (BMHSC),miofibroblastos hepáticos suspensos em albumina humana a 5 %com ou sem heparina (10 Ul/ml) (Hepar). Fibroblastos Heparcontra controlo n.s.; mi of ibroblastos hepáticos Hepar contracontrolo p <0,01

Figura 28 Tempo de coagulação (CT) avaliado por ROTEM apósrecalcificação, com fator tecidual adicionado (ExTem 20 μΐ) ,de sangue total com citrato (300 μΐ) na presença ou não demiof ibroblastos hepáticos suspensos em albumina humana a 5 %com ou sem heparina (10 Ul/ml) (Hepar) . Combinação defármacos anticoagulantes foi obtida quando bivalirudina (Biva) foi adicionada extemporaneamente ao sangue emcontacto com as células em suspensão em heparina.Descrição Detalhada

Tal como utilizado no presente documento, as formassingulares de "um", "uma", e "o/a" incluem ambos os referentesem singular e plural a menos gue contexto dite claramente ocontrário.

Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendidopor", conforme utilizados no presente documento são sinónimosde "incluindo", "inclui" ou "contendo", "contém", e sãoinclusivos ou não concluintes e não excluem membros, elementosou etapas do método não enumeradas adicionais. 0 termo tambémabrange "consistindo em" e "consistindo essencialmente em". A recitação de intervalos numéricos por critério deavaliação inclui todos os números e frações incluídos nosrespetivos intervalos, bem como os critérios de avaliaçãoindicados.

Embora o termo "um ou mais", tal como um ou mais membrosde um grupo de membros resulte ser evidente per se, através deexemplificação adicional, o termo abrange, inter alia, umareferência a gualguer um dos ditos membros, ou a guaisguer doisou mais dos ditos membros, tais como, por exemplo, gualguer >3, >4, á 5, > 6 ou á 7 etc. dos ditos membros, e até todos osditos membros. 0 termo "cerca de" tal como utilizado no presentedocumento, guando faz referência a um valor mensurável, talcomo um parâmetro, uma guantidade, uma duração temporal esemelhantes, destina-se a englobar as variações de e a partirdo valor especificado, em particular, variações de +/- 10 % oumenos, preferentemente +/- 5 % ou menos, mais preferentemente+/- 1 % ou menos, e ainda mais preferentemente +/- 0,1 % oumenos de e a partir do valor especificado, na medida em gue taisvariações sejam apropriadas para realizar a invençãodivulgada. Deve ser entendido que o valor para o qual omodificador "cerca de" se refere, também é especificamente e, de preferência, divulgado por si mesmo. A menos que especificado de outra forma, todos os termosutilizados na divulgação da invenção, incluindo os termostécnicos e científicos, têm o significado que é normalmenteentendido por um perito na especialidade ao qual a presenteinvenção pertence. Por meio de orientações adicionais, asdefinições do termo podem ser incluídas para apreciar melhoro ensinamento da presente invenção.

As células das combinações, composições, kits, métodos eutilizações conforme descritos no presente documento sãocélulas progenitoras hepáticas adultas ou miofibroblastoshepáticos, mais preferentemente células progenitorashepáticas adultas.

Conforme utilizado no presente documento, o termo"células com atividade pró-coagulante" abrange as células quesão capazes de, ou têm a propensão para, ativar a cascata decoagulação e induzir a coagulação ou a formação de coágulos.

As células com atividade pró-coagulante, como pretendidasno presente documento, podem desencadear a cascata dacoagulação em qualquer fase, pelo que, em última análise ofibrinogénio é convertido em fibrina, que se reticula numcoágulo. Por meio de exemplo e sem limitação, as células comatividade pró-coagulante podem expressar fator tecidual, aexpressão do qual pode desencadear a ativação do fator X emfator Xa, o qual por sua vez, através de clivagem da protrombinaem trombina, conduz à formação de coágulos através da conversãode fibrinogénio em fibrina mediada pela trombina. 0 termo"células com atividade pró-coagulante" pode ser utilizadointermutavelmente com "células pró-coagulantes". 0 termo"atividade pró-coagulante" pode ser utilizadointermutavelmente com "atividade pró-trombótica". Embora aatividade pró-coagulante das células possa ser determinadapela presença (ou ausência) de características celularesespecíficas, tais como, por exemplo e sem limitação, aexpressão de marcadores específicos, tais como o fator tecidual, a atividade pró-coagulante das células podeigualmente ser determinada por técnicas tais como, por exemploe sem limitação, tromboelastometria. De forma breve, atromboelastometria é um método viscoelástico estabelecido paratestes de hemostasia no sangue (ou, por extensão, qualqueramostra contendo os componentes da cascata de coagulação, taiscomo o plasma) , por meio do que as alterações de elasticidadenuma amostra estão correlacionadas com a formação de coágulos.Por meio de exemplo e sem limitação, as medições detromboelastometria podem ser realizadas num analisador ROTEM®delta (Pentapharm, Munique, Alemanha). Alternativamente, aatividade pró-coagulante pode ser medida pelo método de aneltubular, tal como descrito em Johansson et al. (Diabetes, 2005,54:1755-1762). A atividade pró-coagulante também pode, porexemplo, ser evidente a partir de e determinada por perfisespecíficos de citocinas (revisto por exemplo, van der Poli etal. Regulatory role of cytokines in disseminated intravascularcoagulation. Semin Thromb Hemost. 2001, 27:639-51).

As células que têm uma atividade pró-coagulante, comopretendidas no presente documento podem ser particularmenteadequadas ou configuradas para o transplante das mesmas. Ascélulas podem ser células alogénicas (isto é, isoladas a partirde um indivíduo diferente, mas da mesma espécie, que o indivíduoao qual as células devem ser transplantadas) ou,alternativamente, podem ser células autólogas (isto é,isoladas a partir do mesmo indivíduo que o indivíduo ao qualas células devem ser transplantadas) , ou podem até mesmo sercélulas xenogénicas (isto é, isoladas a partir de um indivíduode uma espécie diferente do que o indivíduo ao qual as célulasdevem ser transplantadas). As células pró-coagulantes podemser células primárias ou, alternativamente, podem ser célulasque tenham sido submetidas a manipulação in vitro. Conformeutilizado no presente documento, o termo "manipulação in vitro"refere-se a qualquer tipo de manipulação das células fora docorpo. Exemplos de tais manipulações são, sem limitação, a administração de fármacos ou outros compostos que provocam umefeito nas células; esgotamento dos constituintes celularesespecíficos; manipulação genética; terapia génica; transfeçãotransiente ou estável, infeção (pseudo)virai, outransformação; diferenciação; desdiferenciação; subclonagemetc. Pode ser claro que, independentemente da origem da célula,as células podem ser submetidas a armazenamento (por exemplocriopreservação) e/ou proliferação ou passagem antes dotransplante. As células podem ser induzidas a expressar uma oumais proteínas específicas (seja ou não proprietário da célula,isto é, autólogo) ou para aumentar ou diminuir (ou bloquearcompletamente ou substancialmente por completo) a expressãodas mesmas. Em alternativa à manipulação in vitro, as célulasa serem transplantadas podem ser submetidas a manipulação antesdo isolamento do dador (por exemplo, tratamento farmacológico,terapia génica, etc.) . Igualmente, as células com atividadepró-coagulante podem ser uma linha celular. Células pró-coagulantes, conforme divulgadas no presentedocumento, podem ser células não hematopoiéticas (estaminais),já que as ditas células tendem a não exibir atividadepró-coagulante.

Além do transplante celular para restaurar ou melhorar afuncionalidade fornecida deste modo, nos exemplos nãolimitantes, o produto celular a ser transplantado pode incluir,sem limitação, células cancerosas (por exemplo, para o estudode cancro em modelos animais), vacinas baseadas em células ouagentes de imunotolerância, etc.

Sempre que desejado, as células podem ser transformadasde forma estável ou transiente com ácidos nucleicos deinteresse antes da introdução no indivíduo. As sequências deácidos nucleicos de interesse incluem, mas não estão limitadas,aos produtos génicos codificantes que potenciam o crescimento,a diferenciação e/ou o funcionamento das ditas células. Porexemplo e sem limitação, um sistema de expressão para umaproteína normalmente expressa pelas células do fígado podem ser introduzido de uma forma estável ou transiente com a finalidadede tratamento de doenças ou condições que beneficiam daexpressão de tal proteína empregando as células assimtransformadas (preferentemente hepáticas), por exemplo, errosinatos do metabolismo hepático. Os métodos de transformaçãocelular são conhecidos dos peritos na especialidade.

As células como se pretendem no presente documento, taiscomo em particular células pró-coagulantes como pretendidas nopresente documento podem ser preferentemente de origem animal,mais preferentemente de animais de sangue quente, ainda maispreferentemente de vertebrados, mais preferentemente ainda demamífero, e ainda mais preferentemente de origem primata e,especificamente incluem células de mamífero humano ou nãohumano ou de origem primata. As células preferidas tais comoas células pró-coagulantes são de origem humana. 0 termo"mamífero", tal como utilizado ao longo da presente memóriadescritiva inclui qualquer animal classificado como tal,incluindo, mas não estando limitado a, seres humanos, animaisdomésticos e pecuários, animais de jardins zoológicos, animaisde desporto, animais de estimação, animais de companhia eanimais experimentais, tais como, por exemplo, ratinhos,ratos, hámsteres, coelhos, cães, gatos, porquinhos-da-índia,gado, vacas, ovelhas, cavalos, porcos e primatas, por exemplo,macacos e símios.

As células conforme divulgadas no presente documento,tais como em particular células pró-coagulantes conformedivulgadas no presente documento podem englobar, semlimitação, células progenitoras, células estaminais ou célulasparcial ou completamente diferenciadas, tais como célulasterminalmente diferenciadas (isto é, células totalmenteespecializadas, que podem ser pós-mitóticas).

Preferentemente, conforme pretendido no presentedocumento, as células tais como células pró-coagulantes, eparticularmente células progenitoras ou células estaminais,pode ser de origem adulta (por exemplo, células progenitoras ou estaminais adultas), por exemplo, presentes ou obtidas apartir de (removidas ou isoladas a partir de) um organismo noestádio fetal, ou mais preferentemente depois do nascimento(pós-parto).

Por meio de exemplo e sem limitação, a origem adulta dascélulas conforme pretendida no presente documento, tal como porexemplo, de células progenitoras hepáticas adultas, podereferir-se à origem a partir de tecido neonatal ou a partir detecido em qualquer fase de desenvolvimento posterior, tal como,inter alia, etapas convencionalmente denotadas nodesenvolvimento humano como primeira infância, infância,juventude, adolescência ou adulto. Por exemplo, para célulashumanas (tais como células progenitoras hepáticas humanasadultas), origem adulta pode referir-se à origem de um tecido(tal como tecido hepático) em qualquer momento após onascimento, preferentemente de termo completo, e pode ser, porexemplo, pelo menos um mês de idade após o nascimento, porexemplo, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, por exemplo,pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, por exemplo, pelo menos6 meses de idade após o nascimento, tal como, por exemplo, 1ano ou mais, 5 anos ou mais, pelo menos 10 anos ou mais, 15 oumais anos, 20 anos ou mais, ou 25 anos ou mais de idade apóso nascimento.

Os termos "progenitora" ou "células progenitoras" sãosinónimos e referem-se geralmente a uma célula nãoespecializada ou relativamente menos especializada ecompetente quanto à proliferação, que pode, em condiçõesapropriadas dar origem a pelo menos um tipo de célularelativamente mais especializado, tal como, inter alia,células progenitoras relativamente mais especializadas ou,eventualmente, células terminalmente diferenciadas. Umacélula progenitora pode "dar origem" a outra, célularelativamente mais especializada quando, por exemplo, a célulaprogenitora se diferencia para converter-se na dita outracélula sem se submeter anteriormente a divisão celular, ou se a dita outra célula é produzida após um ou mais ciclos de divisãocelular e/ou diferenciação da célula progenitora. 0 termo "célula estaminal" refere-se geralmente a umacélula progenitora capaz de autorrenovação, isto é, que pode,sob condições apropriadas, proliferar sem diferenciação. 0termo abrange as células estaminais capazes de autorrenovaçãosubstancialmente ilimitada, isto é, na qual pelo menos umaporção da descendência de células estaminais retémsubstancialmente o fenótipo não especializado ou relativamentemenos especializado, o potencial de diferenciação, e acapacidade de proliferação das células-mãe estaminais; bemcomo células estaminais que exibem autorrenovação limitada,isto é, em que a capacidade da descendência das célulasestaminais para a proliferação e/ou diferenciação adicionalestá comprovadamente reduzida em comparação com a célula mãe. Células estaminais ou progenitoras conforme divulgadas nopresente documento podem ser pluripotentes (isto é, capazes,sob condições adequadas de produzir descendência de diferentestipos celulares que são derivados de todas as três camadasgerminativas, ou seja, endoderme, mesoderme e ectoderme, deacordo com um teste aceite na técnica padrão, tal como, interalia, a capacidade de formar um teratoma em ratinhos SCID, oua capacidade de formar células identificáveis de todas as trêscamadas germinativas em cultura de tecidos), multipotentes (ouseja, capazes, sob condições adequadas de produzirdescendência de, pelo menos, três tipos celulares a partir decada um de dois ou mais órgãos ou tecidos diferentes de umorganismo, em que os ditos tipos celulares podem serprovenientes da mesma ou de diferentes camadas germinativas,mas não são capazes de dar origem a todos os tipos celularesde um organismo) , ou comprometeram-se com apenas uma ou algumas(por exemplo, uma, duas ou três linhagens celulares). 0 protótipo de células estaminais pluripotentes demamífero (mPS) pode ser derivado a partir de qualquer tipo detecido embrionário de mamífero, por exemplo, tecido embrionário fetal (não reivindicado) ou tecido pré-fetal.Incluem-se na definição das células mPS células estaminaisembrionárias de vários tipos, exemplificadas sem limitaçãopelas células estaminais embrionárias murinas, por exemplo,tal como descrito por Evans e Kaufman 1981 (Nature 292:154-6)e Martin 1981 (PNAS 78:7634-8); células estaminaispluripotentes de rato, por exemplo, como descrito porIannaccone et al. 1994 (Dev Biol 163:288-292); célulasestaminais embrionárias de hámster, por exemplo, como descritopor Doetschman et al. 1988 (Dev Biol 127: 224-227); célulasestaminais embrionárias de coelho, por exemplo, tal comodescrito por Graves et al. 1993 (Mol Reprod Dev 36: 424-433);células estaminais pluripotentes porcinas, por exemplo, comodescrito por Notarianni et al. 1991 (J Reprod Fértil Suppl 43:255-60) e Wheeler 1994 (Reprod Fértil Dev 6: 563-8); célulasestaminais embrionárias de ovelha, por exemplo, como descritopor Notarianni et al. 1991 (supra); células estaminaisembrionárias bovinas, por exemplo, como descrito por Roach etal. 2006 (Methods Enzymol 418:21-37); células estaminaisembrionárias humanas (hES), por exemplo, como descrito porThomson et al. 1998 (Science 282: 1145-1147); célulasgerminativas embrionárias humanas (hEG), por exemplo, comodescrito por Shamblott et al. 1998 (PNAS 95:13726); célulasestaminais embrionárias de outros primatas, tais como, célulasestaminais de Rhesus, por exemplo, tal como descrito porThomson et al. 1995 (PNAS 92:7844-7848) ou células estaminaisde saguim, por exemplo, como descrito por Thomson et al. 1996(Reprod Biol 55: 254-259).

Como se indica, "células ES humanas" prototípicas (nãoreivindicadas) são descritas por Thomson et al. 1998 (supra)e no documento US 6.200.806. O âmbito do termo abrange ascélulas estaminais pluripotentes, que se obtêm a partir de umembrião humano no estádio de blastocisto, ou antes dadiferenciação substancial das células nas três camadasgerminativas. As células ES, em particular células hES, são tipicamente derivadas da massa celular interna de blastocistosou de blastocistos inteiros. Foi documentada a derivação delinhas de células hES a partir do estádio de mórula e as célulasES assim obtidas podem também ser utilizadas na invenção(Strelchenko et al. 2004. Reprodutive BioMedicine Online9:623-629). Conforme indicado, "células EG humanas"prototípicas são descritas por Shamblott et al. 1998 (supra).Ditas células podem ser derivadas partir de, por exemplo,cristas gonadais e mesentérios que contêm células germinaisprimordiais de fetos. Nos seres humanos, os fetos podem tertipicamente 5-11 semanas pós-fertilização.

Exceto quando exigido explicitamente de outro modo, otermo células mPS pode incluir células teciduais primárias elinhas estabelecidas que carregam as característicasfenotípicas das respetivas células, e derivados de tais célulasprimárias ou linhas celulares que ainda tem a capacidade deproduzir descendência de cada uma das três camadasgerminativas.

As linhas estabelecidas de células ES humanas (nãoreivindicadas) incluem linhas que estão listadas no NIH HumanEmbryonic Stem Cell Registry(https://stemcells.nih.gov/research/registry), e sublinhasdas mesmas, tais como, linhas hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN-03e hESBGN-04 de Bresagen Inc. (Atenas, GA), linhas deSahlgrenska 1 e Sahlgrenska 2 de Cellartis AB (Gotemburgo,Suécia), linhas de HES-1, HES -2, HES-3, HES-4, HES-5 e HES-6do ES Cell International (Singapura) , linha Miz-hESl de MizMediHospital (Seul, Coreia), linhas I 3, I 3.2, I 3.3, 4, I 6, I6.2, J 3 e J 3.2 de Technion - Israel Institute of Technology(Haifa, Israel), linhas HSF-1 e HSF-6 da Universidade daCalifórnia (San Francisco, CA), linhas Hl, H7, H9 , H13, H14da Alumni Research Institute Wisconsin Foundation/WiCellResearch (Madison, WI), linhas CHA-hES-1 e Cha-hES-2 de Cell& Gene Therapy Research Institute / Pochon CHA UniversityCollege of Medicine (Seul, Coreia), linhas Hl, H7, H9, H13, H14, H9.1 e H9.2 de Geron Corporation (Menlo Park, CA) , linhasSahlgrenska 4 a Sahlgrenska 19 da Universidade de Gotemburgo(Gotemburgo, Suécia), linhas MB01, MB02, MB03 de Maria BiotechCo. Ltd. (Seul, Coreia), linhas FCNCBS1, FCNCBS2 e FCNCBS3 doNational Centre for Biological Sciences (Bangalore, índia), elinhas RLS ES 05, RLS ES 07, RLS ES 10, RLS ES 13, RLS ES 15,RLS ES 20 e RLS ES 21 de Reliapce Life Sciences (Mumbai, índia) .Outras linhas de células hES estabelecidas (não reivindicadas)incluem aquelas depositadas no UK Stem Cell Bank(https://www.ukstemcellbank.org.uk/) e sublinhas das mesmas,por exemplo, linha WT3 do King' s College London (Londres, ReinoUnido) e linha hES-NCLl da Universidade de Newcastle(Newcastle, Reino Unido) (Strojkovic et al 2004. Stem Cells 22:790-7). Linhas de células ES exemplificativas adicionais (nãoreivindicadas) incluem as linhas FC018, AS034, AS034.1, AS038,SA111, SA121, SA142, SA167, SA181, SA191, SA196, SA203 e SA204,e sublinhas das mesmas, de Cellartis AB (Gotemburgo, Suécia).

Além disso dentro do termo células estaminaispluripotentes de mamífero encontram-se ditas células mPS quepodem ser obtidas por manipulação como, inter alia, manipulaçãogenética e/ou de fator de crescimento e/ou de manipulaçãomediada por moléculas pequenas, de células de mamíferos nãopluripotentes, tais como células somáticas e particularmentecélulas adultas somáticas de mamífero, incluindo a utilizaçãode células estaminais pluripotentes induzidas (iPS), tal comoensinado, inter alia, por Yamanaka et al. 2006 (Cell126:663-676), Yamanaka et al. 2007 (Cell 131:861-872) e Lin etal. 2009 (Nature Methods 6:805-808).

As células conforme divulgadas no presente documento,tais como células pró-coagulantes, conforme divulgadas nopresente documento podem incluir células estaminaismesenquimatosas. O termo "célula estaminal mesenquimatosa" ou"MSC", conforme utilizado no presente documento refere-se a umacélula estaminal derivada da mesoderme, adulta que é capaz degerar células de linhagens mesenquimatosas, tipicamente células de três ou mais linhagens mesenquimatosas, por exemplo,linhagem osteocítica (osso), condrocítica (cartilagem),miocítica (músculo), tendonocítica (tendão), fibroblástica(tecido conjuntivo) , adipocitária (gordura), estromogénica(estroma da medula). Comummente, mas sem limitação, uma célulapode ser considerada MSC se for capaz de formar células de cadaum das linhagens adipocítica, condrocítica e osteocíticausando condições de diferenciação e métodos de avaliação defenótipo celular padrão, aceites na técnica, por exemplo, comodescrito em Pittenger et al. 1999 (Science 284: 143-7) ou

Barberi et al. (PLoS Med 2: el61,2005) . Células MSC podem serisoladas a partir de, por exemplo, medula óssea, sangue, cordãoumbilical, placenta, saco vitelino fetal, derme especialmenteda pele fetal e adolescente (Young et al. 2001. Anat Rec 264:.51-62) , periósteo e tecido adiposo (Zuk et al. 2001. Tissue Eng7 : 211-28) . As MSC humanas, o seu isolamento, expansão in vitro,e diferenciação, foram descritos em, por exemplo, Pittenger etal. 1999 (supra), documento de patente US N.° 5.486.359;documento de patente US N.° 5.811.094; documento de patente USN.° 5.736.396; documento de patente US N.° 5.837.539; oudocumento de patente US N.° 5.827.740.

O termo abrange também MSC obtidas a partir da medulaóssea, que são comummente referidas como "células estaminaismesenquimatosas de medula óssea", "células estromais de medulaóssea" ou "BMSC" . Uma amostra de medula óssea para o isolamentode BMSC podem ser adquirida, por exemplo, a partir de cristailíaca, fémures, tíbias, coluna vertebral, costelas ou deoutros espaços medulares. Numa forma de realização preferida,populações preferenciais de MSC ou MSC conforme utilizadas nopresente documento podem ser originárias de medula óssea, porexemplo, podem ser isoladas e opcionalmente expandidas a partirde uma amostra de medula óssea. Populações de MSC e MSCoriginadas a partir de medula óssea podem ter características(por exemplo, perfil de marcador, função, expansão,diferenciação, etc) diferentes e/ou favoráveis em relação aMSC originadas a partir de outros tecidos, tais como, semlimitação, podem diferenciar-se de forma mais eficiente e/oumais controlável em determinadas linhagens celulares. Ostermos MSC e BMSC englobam também a descendência de MSC ou BMSC,por exemplo, a descendência obtida por propagação in vitro ouex vivo de MSC ou BMSC obtidas a partir de uma amostra biológicade um indivíduo.

Outras células conforme divulgadas no presente documento,tais como células pró-coagulantes, conforme divulgadas nopresente documento podem incluir, sem limitação célulasprogenitoras ou estaminais adultas obtidas ou derivadas apartir de (por exemplo, removidas ou isoladas a partir de)tecidos, incluindo tecido muscular (por exemplo, célulassatélite), tecido endócrino (por exemplo, pâncreas, gónadas,glândulas suprarrenais, glândula pineal, glândula pituitária,tireoide e glândulas paratireoides), tecido nervoso (porexemplo, tecido neuronal ou glial), sangue e tecidos do sistemaimunitário, epitelial, fígado, osso, cartilagem, tecidosadiposo ou endotelial. Células particularmente preferidas conforme divulgadasno presente documento, tais como em particular células comatividade pró-coagulante são células progenitoras ouestaminais derivadas de fígado adulto, mais especificamente asditas células são conforme se detalham na secção do sumário.

Conforme se utiliza no presente documento, célulasprogenitoras ou estaminais derivadas de fígado adulto oucélulas progenitoras de fígado adulto ou semelhante podegeralmente denotar células originárias do fígado tendocaracterísticas de células progenitoras ou estaminais ecapazes de se diferenciarem num ou mais tipos de célulashepáticas tais como, por exemplo, capazes de pelo menos uma ouapenas diferenciação hepática (isto é, diferenciação nosentido de hepatócitos ou células semelhantes a hepatócitos).

As células que se pretendem no presente documento, taiscomo células pró-coagulantes que são parcialmente ou completamente diferenciadas ou maduras, tal como célulasterminalmente diferenciadas (isto é, células totalmenteespecializadas, que podem ser pós-mitóticas), podem incluir,entre outras, células musculares (por exemplo, cardiomiócitos,miócitos, miotubos, mioblastos, células de músculo lisovasculares) , células pancreáticas endócrinas (por exemplo,células beta, células alfa, células delta, células produtorasde PP ou células épsilon), células do sistema nervoso (porexemplo, neurónios, células gliais, tais como astrocitos,oligodendrócitos, células de Schwann), células do sangue esistema imunitário (por exemplo, linfócitos T ou B, célulasdendríticas, granulócitos macrófagos, etc.), célulasepiteliais (por exemplo, queratinócitos, melanócitos, célulasrenais, células pulmonares), células hepáticas (por exemplo,hepatócitos, células ovais), células ósseas (osteoblastos,osteócitos, odontoblastos), condrócitos, adipócitos, célulasendoteliais (por exemplo, células do músculo liso vasculares).Também são pretendidas células fusionadas, por exemplo,híbridos celulares.

Tal como utilizado no presente documento, o termo"ativador de antitrombina" refere-se a um agente (por exemplo,um composto, substância ou molécula) que ativa diretamente aantitrombina. Como tal, um ativador de antitrombina aumenta aatividade catalítica (antagonista) (isto é, o aumento daconstante de velocidade) de antitrombina para o(s) seu (s)objetivo (s), tais como, por exemplo, trombina, fator Xa e/oufator IXa. Particularmente de forma preferente, um ativador deantitrombina aumenta a atividade catalítica (antagonista) daantitrombina no sentido de pelo menos o fator Xa. Numa outraforma de realização preferida, um ativador de antitrombina podeaumentar a atividade catalítica (antagonista) de antitrombinaespecificamente para o fator Xa tal como, por exemplo, mas semlimitação, fondaparinux. A ativação de antitrombina por umativador de antitrombina pode ser realizada por qualquer meio,por exemplo, e sem limitação, por ligação direta e indução de alterações conformacionais da antitrombina, levando ao aumentoda acessibilidade e/ou atividade do sítio catalítico (ligaçãoao alvo). Tal como utilizado no presente documento"antitrombina" refere-se a qualquer uma das antitrombinasconhecidas, de preferência, antitrombina III (símbolo génicoSERPINC1). Consequentemente, conforme utilizado no presentedocumento, "ativador de antitrombina" refere-sepreferentemente a um ativador da antitrombina III.

Numa forma de realização, o ativador de antitrombina deacordo com a invenção é a heparina. Noutra forma de realização,o ativador de antitrombina de acordo com a invenção éselecionado a partir do grupo que consiste em heparina nãofracionada e heparina de baixa massa molecular. Numa forma derealização adicional, o ativador de antitrombina de acordo coma invenção é fondaparinux, que pode ser representado como2-desoxi-6-0-sulf0-2- (sulfoamino) -α-D-glucopiranosil- (l->4)-Ο-β-D-glucopiranuronosil- (1 ->· 4)-0-2-desoxi-3, 6-di- O-sulfo-2-(sulfoamino) -α-D-glucopiranosil- (1 ->· 4)-0-2-0- sulf o-a-L-idopiranuronosil-(1 ->· 4)-O-metil-2-desoxi-6- O-sulfo-2-(sulfoamino)-α-D-glucopiranósido, sal decasódica.Numa forma de realização preferida, o ativador de antitrombinade acordo com a invenção é heparina não fracionada. Tal comoutilizado no presente documento, "heparina não fracionada"refere-se especialmente a heparina natural, que é polidispersaconsistente em cadeias moleculares de comprimento variável(que normalmente varia entre cerca de 5 e cerca de 40 kDa) . Talcomo pretendido no presente documento, pode ser utilizadoqualquer tipo de heparina. Tipicamente, a heparina de graufarmacêutico é derivada a partir de tecidos mucosos de animaisabatidos para carne, tais como intestino porcino ou pulmãobovino. Tal como utilizado no presente documento, "heparina debaixa massa molecular" (LMWH) refere-se à heparina queapresenta tipicamente uma massa molecular média inferior acerca de 8 kDa e para a qual, pelo menos, cerca de 60 % de todas as cadeias possuem uma massa molecular inferior a cerca de 8kDa. A LMWH é obtida através de vários métodos de fracionamentoou despolimerização de heparina polimérica. Exemplos de LMWHincluem, sem limitação, ardeparina, certoparina, enoxaparina,parnaparina, tinzaparina, dalteparina, reviparina enadroparina.

Tal como contemplado pelos inventores, certos ativadoresde antitrombina podem atuar por meio do aumento da atividadecatalítica (antagonista) de antitrombina (especificamente)relativamente ao fator Xa. Consequentemente, em alguns aspetose formas de realização, são contempladas combinações,composições, kits, métodos e utilizações como descritos nopresente documento que empregam, como uma alternativa aoativador de antitrombina ou em adição ao ativador deantitrombina, um inibidor do fator Xa, particularmente uminibidor do Fator Xa diferente de um ativador de antitrombina.Tal inibidor do Fator Xa pode ser indireta ou,alternativamente, um inibidor direto do fator Xa. Inibidoresindiretos do Fator Xa incluem, por exemplo, substâncias queinibem a conversão do Fator X em Fator Xa. Um inibidor diretodo Fator Xa pode atuar diretamente sobre o Fator Xa na cascatade coagulação, sem a utilização de antitrombina como ummediador, impedindo assim a conversão mediada pelo Fator Xa daprotrombina em trombina. Por meio de exemplo, e sem limitação,inibidores diretos do Fator Xa incluem Apixaban, Edoxaban,Otamixaban, Rivaroxabano, DX9065a e YM466.

Tal como utilizado no presente documento, o termo"inibidor de trombina" refere-se a um composto que se ligadiretamente a e inativa a trombina. Como tal, um inibidor detrombina diminui significativamente ou bloqueia perfeitamentepor completo ou substancialmente por completo a atividadecatalítica da trombina conforme medido convenientemente poruma diminuição da constante de velocidade para o(s) seu (s)alvo(s) catalítico(s), particularmente fibrinogénio. Ainibição de trombina por um inibidor de trombina pode ser reversível ou irreversível, de preferência reversível. Ainibição da trombina por um inibidor de trombina pode serrealizada por qualquer meio, por exemplo, e sem limitação, porligação direta ao sítio catalítico da trombina. 0 inibidor da trombina de acordo com a invenção éselecionado a partir do grupo que consiste em bivalirudina ehirudina. Quimicamente, a bivalirudina (N.° CAS 128270-60-0)é um congénere sintético do fármaco de hirudina que ocorrenaturalmente. A hirudina que ocorre de modo natural contém,geralmente, uma mistura de diferentes isoformas destaproteína. Assim, o termo "hirudina" tal como utilizado nopresente documento inclui particularmente qualquer proteínapossuindo a sequência primária de aminoácidos de uma isoformade hirudina que ocorre naturalmente, tal como, inter alia, HVl,HV2, HV3, Pl ou P2 . Pode-se fabricar hirudina recombinante paraproduzir preparações homogéneas de hirudina, tais como, porexemplo, e sem limitação, lepirudina e desirudina. A hirudinacomo pretendida no presente documento, também englobaderivados adequados ou análogos da hirudina, por exemplo, pormeio de substituição, deleção, extensão, inserção,funcionalização ou modificação química de aminoácidos, o ditoderivado apresenta atividade inibidora de trombina; e englobaainda híbridos de mais do que uma hirudina, que podem serproduzidas por engenharia genética. Por exemplo, o documentoWO 91/17250 descreve uma hirudina composta pelos primeiros 46resíduos de HVl seguidos pelos aminoácidos 47 a 65 de HV2.

Numa forma de realização preferida, o inibidor de trombinaé a bivalirudina (por exemplo, fabricada pela The MedicinesCompany como Angiomax® ou Angiox®) . Considerando que a hirudina(natural ou recombinante) e derivados de hirudina, bem comobivalirudina são conhecidos por um perito na especialidade,para orientação adicional consultar nomeadamente Fenton et al.Semin Thromb Hemost., 1998, vol. 24, 87-91.

Combinações ou composições particularmente preferidasque incorporam os princípios da invenção podem compreender, consistir essencialmente de, ou consistir de um ativador deantitrombina selecionado a partir do grupo que consiste emheparina, heparina não fracionada, heparina de baixa massamolecular e fondaparinux, preferentemente heparina nãofracionada, um inibidor de trombina selecionado a partir dogrupo que consiste em bivalirudina e hirudina,preferentemente, bivalirudina, e células selecionadasopcionalmente a partir do grupo que consiste em célulasprogenitoras hepáticas adultas, células estaminaismesenquimatosas (de preferência, células estaminaismesenquimatosas de medula óssea), fibroblastos cutâneos, oumiofibroblastos hepáticos, preferentemente célulasprogenitoras hepáticas adultas ou miofibroblastos hepáticos,mais preferentemente células progenitoras hepáticas adultas.

Outras combinações ou composições particularmentepreferidas que incorporam os princípios da invençãodivulgam-se no Quadro 1, isto é, combinações ou composições quecompreendem, consistem essencialmente de, ou consistem dasubstância 1, substância 2, e opcionalmente células.

Quadro 1

0 termo "transplante de células" carrega o seu significadonormal e em particular refere-se à administração de células aum indivíduo. 0 termo "transplante de células" pode serutilizado indistintamente com "terapêutica celular". 0transplante celular pode ser realizado por qualquer técnicaconhecida na técnica. Por meio de exemplo, e sem limitação, ascélulas podem ser transplantadas por infusão num indivíduo.Tipicamente, a infusão de células pode ser realizada parentericamente, por exemplo, por via intravascular,subcutânea, intradérmica ou intramuscular, de um modopreferido por via intravascular. As células podem seradministradas, por exemplo, e sem limitação, sistemicamente,topicamente ou no local de uma lesão. Consequentemente, podeser claro que, dependendo da aplicação específica, dos tecidosalvo, do objetivo terapêutico ou do tipo de célula, o ajustepode ser feito em relação às vias de administração, assim comoformulações, concentrações, etc.

Tal como utilizado no presente documento, o termo"complicações trombóticas" ou "complicações pró-coagulantes"pode referir-se em particular a efeitos deletérios oucomplicações associadas com transplante de células comatividade pró-coagulante, com exceção da formação de coágulosper se. Tais efeitos podem ser, por exemplo, e sem limitação,a perda de células, rejeição celular ou inflamação. Por perdade células ou rejeição celular entende-se a perda ou a rejeiçãodas células transplantadas. 0 resultado destes efeitos é umadiminuição da eficácia do transplante de células ou potencialenxerto celular, já que menos do que, ou em casos extremosnenhuma, da quantidade total administrada de células estádisponível para executar a sua função pretendida após otransplante. A perda de células pode, por exemplo, ocorrerdevido à inclusão das células transplantadas em coágulos. Arejeição celular pode ocorrer, por exemplo, devido a umaresposta imunitária do hospedeiro. Uma resposta inflamatóriapode, por exemplo, estar associada, ou ser um resultado, daativação da cascata de coagulação. Alternativamente, ouadicionalmente, a inflamação pode estar associada com, o sero resultado de, ou causar a rejeição celular.

Também são proporcionadas composições que compreendem ascombinações ensinadas no presente documento e que compreendemadicionalmente um ou mais outros componentes. Por exemplo, oscomponentes que podem ser incluídos podem manter ou melhorara viabilidade das células. Por meio de exemplo e sem limitação, tais componentes podem incluir sais para assegurar condiçõessubstancialmente isotónicas, estabilizadores de pH, tais comosistema(s) tampão (por exemplo, para garantir um pHsubstancialmente neutro, tal como o sistema tampão fosfato oucarbonato), proteínas de transporte, tais como por exemploalbumina, meios incluindo meios basais e/ou suplementos dosmeios, soro ou plasma, nutrientes, fontes de hidratos decarbono, conservantes, estabilizantes, antioxidantes ououtros materiais bem conhecidos pelos peritos naespecialidade. Também são divulgados métodos de produção dasditas composições misturando os respetivos componentes dascombinações ensinadas no presente documento com os ditos um oumais componentes adicionais indicados acima. As composiçõespodem ser, por exemplo, líquidas ou podem ser semissólidas ousólidas (por exemplo, podem ser composições congeladas ou podemexistir sob a forma de gel ou podem existir numa estrutura ousuporte sólido, etc.). Os crioconservantes tais como, interalia, DMSO, são bem conhecidos na técnica.

Como já foi salientado, as composições farmacêuticas, talcomo ensinadas no presente documento, compreendem um ou maisexcipiente farmaceuticamente aceitáveis. 0 termo "farmaceuticamente aceitável" conforme utilizadono presente documento, é consistente com a técnica e significameios compatíveis com os outros ingredientes de uma composiçãofarmacêutica e não deletérios para o recetor dos mesmos.

Conforme utilizado no presente documento, "portador" ou"excipiente" inclui qualquer e todos os solventes, diluentes,tampões (tais como, por exemplo, solução salina tamponadaneutra ou solução salina tamponada com fosfato),solubilizantes, coloides, meios de dispersão, veículos,cargas, agentes quelantes (tais como, por exemplo, EDTA ouglutationa), aminoácidos (tais como, por exemplo, glicina),proteínas, agentes desintegrantes, aglutinantes,lubrificantes, humectantes, emulsionantes, edulcorantes,corantes, aromatizantes, espessantes, agentes de alcançar um efeito de libertação prolongada, revestimentos, agentesantifúngicos, conservantes, estabilizantes, antioxidantes,agentes de controlo da tonicidade, agentes de retardamento daabsorção, e semelhantes. A utilização de tais meios e agentespara substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida natécnica. Tais materiais devem ser não tóxicos e não deveminterferir com a atividade das células. A natureza precisa do portador ou excipiente ou outromaterial dependerá da via de administração. Por exemplo, acomposição pode estar na forma de uma solução aquosaparentericamente aceitável, que é isenta de pirogénios e possuipH, isotonicidade e estabilidade adequados. Para princípiosgerais da formulação medicinal, o leitor é remetido para CellTherapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and CellularImmunotherapy, de G. Morstyn e W. Sheridan eds., CambridgeUniversity Press, 1996; e Hematopoietic Stem Cell Therapy, E.D. Ball, J. Lister e P. Law, Churchill Livingstone, 2000.

As composições farmacêuticas líquidas podem incluir,geralmente, um portador líquido tal como água ou uma soluçãoaquosa farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, podemincluir-se solução salina fisiológica, meios de cultivotecidual ou celular, dextrose ou outra solução de sacarídeosou glicóis tais como etilenoglicol, propilenoglicol oupolietilenoglicol. A composição pode incluir uma ou mais moléculas protetorasde células, moléculas de regeneração celular, fatores decrescimento, fatores antiapoptóticos ou fatores que regulam aexpressão génica nas células. Ditas substâncias podem tornaras células independentes do seu ambiente.

Tais composições farmacêuticas podem conter outroscomponentes que assegurem a viabilidade das células nas mesmas.Por exemplo, as composições podem compreender um sistema detampão apropriado (por exemplo, sistema de tampão de fosfatoou carbonato) para atingir o pH desejável, mais geralmenteperto de pH neutro, e podem compreender sal suficiente para assegurar condições iso-osmóticas para as células para evitaro stress osmótico. Por exemplo, uma solução adequada para estesfins podem ser a solução salina tamponada com fosfato (PBS),solução de cloreto de sódio, injeção de Ringer ou injeção delactato de Ringer, conhecidas na técnica. Além disso, acomposição pode compreender uma proteína transportadora, porexemplo, albumina (por exemplo, bovina ou albumina humana) , quepode aumentar a viabilidade das células.

Outros portadores ou aditivos farmaceuticamenteaceitáveis adequados são bem conhecidos para os peritos naespecialidade e, por exemplo, podem ser selecionados a partirde proteínas tais como colagénio ou gelatina, hidratos decarbono tais como amido, polissacarídeos, açúcares (dextrose,glucose e sacarose), derivados de celulose comocarboximetilcelulose sódica ou cálcica, hidroxipropilceluloseou hidroxipropilmetilcelulose, amidos pré-gelatinizados, ágarde pectina, carragenano, argilas, gomas hidrofílicas (gomaarábica, goma guar, goma arábica e goma xantana), ácidoalgínico, alginatos, ácido hialurónico, ácido poliglicólico epoliláctico, dextrano, pectinas, polímeros sintéticos taiscomo polímeros acrílicos solúveis em água oupolivinilpirrolidona, proteoglicanos, fosfato de cálcio esemelhantes.

Se desejado, a preparação celular pode ser administradanum suporte, estrutura, matriz ou material para proporcionaruma melhor regeneração tecidual. Por exemplo, o material podeser um material cerâmico granular, ou um biopolímero tal comogelatina, colagénio ou fibrinogénio. Matrizes porosas podemser sintetizadas de acordo com técnicas convencionais (porexemplo, Mikos et al., Biomaterials 14:323, 1993; Mikos et al.,Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed Mater Res 35:513,1997). Tal suporte, estrutura, matriz ou material podem serbiodegradáveis ou não biodegradáveis. Consequentemente, ascélulas podem ser transferidas e/ou cultivadas num substratoadequado, tal como um substrato poroso ou não poroso, para proporcionar implantes. Por exemplo, as células queproliferaram, ou que se estão a diferenciar em placas decultura, podem ser transferidas para suportes sólidostridimensionais com a finalidade de se multiplicarem e/oucontinuarem o processo de diferenciação através da incubaçãodo suporte sólido num meio nutritivo liquido da invenção, senecessário. As células podem ser transferidas para um suportesólido tridimensional, por exemplo por impregnação do referidosuporte com uma suspensão liquida contendo as ditas células.Os suportes impregnados obtidos deste modo podem serimplantados num indivíduo humano. Tais suportes impregnadospodem também podem ser recultivados por imersão em meio decultura líquido, antes de serem finalmente implantados. 0suporte sólido tridimensional tem de ser biocompatível, de modoa que possa ser implantado num ser humano. Pode serbiodegradável ou não biodegradável.

As células ou populações de células podem seradministradas de uma forma que lhes permita sobreviver,crescer, propagar-se e/ou diferenciar-se em relação a tipos decélulas desejados, tais como, por exemplo, hepatócitos. Ascélulas ou populações de células podem ser enxertadas ou podemmigrar e enxertar-se no órgão pretendido, tal como, porexemplo, fígado. Pode prever-se o enxerto de células oupopulações de células noutros lugares, tecidos ou órgãos taiscomo o fígado, baço, pâncreas, cápsula renal, peritoneu ouomento.

Numa forma de realização, a preparação celularfarmacêutica, tal como definida acima pode ser administradanuma forma de composição líquida. Em formas de realização, ascélulas ou composição farmacêutica que compreende as mesmaspodem ser administradas sistemicamente, topicamente, dentro deum órgão ou num local de lesão ou disfunção orgânica.

Preferentemente, as composições farmacêuticas podemcompreender uma quantidade terapeuticamente eficaz das célulasdesejadas. 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade que pode provocar uma respostabiológica ou medicinal num tecido, sistema, animal ou serhumano que esta a ser procurada por um investigador,veterinário, médico ou outro clinico, e em particular, podeprevenir ou aliviar um ou mais dos sintomas locais ou sistémicosou caracteristicas de uma doença ou condição a ser tratada.

As presentes combinações, composições farmacêuticas eoutros aspetos relacionados são particularmente úteis para otransplante de células como descritas no presente documento,tais como em particular células pró-coagulantes, ainda maisparticularmente para o tratamento de doenças ou condições quepodem beneficiar do transplante das ditas células emindivíduos.

Salvo quando indicado, "indivíduo" ou "paciente" sãoutilizados indistintamente e referem-se a animaispreferentemente vertebrados e mais preferentemente mamíferos,e incluem especificamente pacientes humanos e mamíferos nãohumanos. Consequentemente, "indivíduo" ou "paciente", tal comoutilizados no presente documento, referem-se a qualquerpaciente ou indivíduo animal, mamífero ou humano aos quais ascombinações ou composições como ensinadas no presentedocumento podem ser administradas. Os pacientes preferidos sãoseres humanos.

Conforme utilizados no presente documento, os termos"tratar" ou "tratamento" referem-se tanto a tratamentoterapêutico como a medidas profiláticas ou preventivas, em queo objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) uma alteração oudistúrbio fisiológico indesejado. Resultados clínicosbenéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a,alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença,estabilização (ou seja, sem pioria) do estado da doença, atrasoou retardamento da progressão da doença e ocorrência decomplicações, melhoria ou paliação do estado de doença."Tratamento" também se pode entender como prolongar asobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não se receber o tratamento.

Conforme utilizado no presente documento, uma frase como"um indivíduo com necessidade de tratamento" incluiindivíduos, tais como indivíduos mamíferos ou humanos, quebeneficiariam do tratamento de uma determinada condição,preferentemente, uma condição ou doença tal como acima. Taisindivíduos incluem tipicamente, sem limitação, aqueles queforam diagnosticados com a condição, aqueles propensos a terou desenvolver a dita condição e/ou aqueles em que a condiçãodeve ser prevenida.

As combinações e composições farmacêuticas descritas nopresente documento podem ser utilizadas sozinhos ou emcombinação com qualquer uma das terapêuticas conhecidas oucompostos ativos para os respetivos distúrbios. Aadministração pode ser simultânea ou sequencial em qualquerordem.

Se as células forem derivadas a partir de uma fonteheteróloga (isto é, não autóloga), pode ser tipicamenteadministrada terapêutica imunossupressora concomitante, porexemplo, utilizando agentes imunossupressores, como aciclosporina ou tacrólimo (FK506). A título de exemplo e não de limitação, quando ascombinações ou composições farmacêuticas, tal como pretendidasno presente documento, contêm células hepáticas, tais comocélulas progenitoras ou estaminais hepáticas (por exemplo,células ADHLSC) ou hepatócitos, elas podem ser empregues, interalia, para o tratamento de doenças associadas com o fígado,incluindo, mas não limitadas, a disfunção ou insuficiênciahepática, hepatite e erros congénitos de metabolismo.

Os exemplos não exaustivos de deficiências metabólicascongénitas do fígado incluem fenilcetonúria e outrasaminoácidopatias, hemofilia e outras deficiências de fatoresde coagulação, hipercolesterolemia familiar e outrosdistúrbios do metabolismo lipídico, distúrbios do ciclo daureia, glicogenose, galactosemia, fructosemia, tirosinemia, deficiências do metabolismo das proteínas e hidratos decarbono, acidúria orgânica, doenças mitocondriais, distúrbiosperoxissomais e lisossomais, anormalidades da síntese deproteínas, anomalias dos transportadores celulares hepáticos,anomalias de glicosilação e semelhantes.

Outras doenças ou condições associadas com o fígadoincluem ainda, sem limitação, doenças degenerativas hepáticasprogressivas adquiridas, insuficiência hepática fulminante einsuficiência hepática aguda ou crónica, infeções por vírushepatotrópicos humanos (VHB, VHA, VHC, VHE, VHD,...).

Outros estados de doença ou deficiências tipificadas porperda de massa e/ou função do fígado, e que poderiam beneficiarde combinações ou uma composição farmacêutica compreendendo ascélulas hepáticas, tais como descritas no presente documento,incluem mas não estão limitadas a síndrome de Alagille, doençahepática alcoólica (cirrose induzida pelo álcool) , deficiênciade al-antitripsina (todos os fenótipos) , hiperlipidemias eoutros distúrbios do metabolismo lipídico, hepatite autoimune,síndrome de Budd-Chiari, atresia biliar, colestase familiarprogressiva tipo I, II e III, cancro do fígado, doença deCaroli, síndrome de Crigler-Najjar, fructosemia,galactosemia, alterações de glicosilação deficiente emhidratos de carbono, outros distúrbios do metabolismo doshidratos de carbono, doença de Refsum e outras doençasperoxissomais, doença de Niemann-Pick, doença de Wolman eoutras doenças lisossómicas, tirosinemia, síndrome de triploH, e outros distúrbios metabólicos de aminoácidos, síndrome deDubin-Johnson, fígado gordo (esteatohepatite não alcoólica),síndrome de Gilbert, Doença de armazenamento de glicogénio Ie III, hemocromatose, hepatite A-G, porfiria, cirrose biliarprimária, colangite esclerosante, tirosinemia, deficiênciasde fatores de coagulação, hemofilia B, fenilcetonúria, doençade Wilson, insuficiência hepática fulminante, insuficiênciahepática pós hepatectomia, doenças da cadeia respiratóriamitocondrial. A título de exemplo e não de limitação, as combinações oucomposições farmacêuticas, particularmente aquelas quecompreendem células do fígado, podem ser administradasvantajosamente através de injeção (que engloba também aadministração por cateter) ou implante, por exemplo, injeçãolocalizada, injeção sistémica, injeção intraesplénica(veja-se também Gupta et al. , Seminars in Liver Disease 12:321,1992) , injeção numa veia portal, injeção na polpa hepática, porexemplo, por baixo da cápsula hepática, administraçãoparentrica, ou injeção intrauterina num embrião ou feto. Porexemplo, as combinações ou composições farmacêuticascompreendendo células de fígado ou as células derivados dofígado como descritas no presente documento podem serutilizadas para a manipulação de tecidos e terapêutica celularatravés de transplante celular hepático (LCT). 0 transplantecelular hepático e transplante de células estaminais hepáticas(LSCT) refere-se à técnica de infusão de hepatócitos madurosou células progenitoras do fígado em qualquer modo que produzaum acesso hepático e enxerto das células, preferentementeatravés da veia portal, mas também por injeção hepática direta,ou por injeção intraesplénica. Noutro exemplo, as combinaçõesou composições farmacêuticas compreendendo as célulasestaminais mesenquimatosas, conforme descritas no presentedocumento, podem ser utilizadas para a reparação de qualquerórgão sólido (cérebro, coração, fígado, rim, pâncreas, baço,pulmão, intestino, bexiga, vesícula biliar), para controlar odistúrbio imunitário, para controlar a doença de Crõhn e outrasdoenças autoimunes, para controlar a doença do enxerto contrahospedeiro, para controlar a rejeição de órgãos apóstransplante. Noutro exemplo, as combinações ou composiçõesfarmacêuticas compreendendo os fibroblastos cutâneos,conforme descritos no presente documento podem ser utilizadaspara reparação cutânea ou formação de medula óssea. Num exemploadicional, as combinações ou composições farmacêuticascompreendendo os miofibroblastos hepáticos, conforme descritos no presente documento podem ser utilizados para otratamento ou reparação de danos causados por doenças do tecidoconjuntivo ou para a criação de estruturas em combinação comoutras células.

Em estudos humanos atuais de células de medula ósseamononucleares autólogas, doses empíricas que variam desde 1 a4 células xlO7 têm sido utilizadas com resultadosencorajadores. No entanto, diferentes casos podem exigirotimização da quantidade de células administradas. Assim, aquantidade de células a ser administrada, variará para opaciente a ser tratado. Numa forma de realização preferida,entre 102 a 1010 ou entre 102 e 109, ou entre 103 a 1010, ou entre 103 a 109, ou entre 104 a 1010 ou entre 104 a 109, tal como entre 104 e 108, ou entre 105 e 107, por exemplo, cerca de lxlO5, cercade 5xl05, cerca de lxlO6, cerca de 5xl06, cerca de lxlO7, cercade 5xl07, cerca de lxlO8, cerca de 5xl08, cerca de lxlO9, cercade 2xl09, cerca de 3xl09, cerca de 4xl09, cerca de 5xl09, cercade 6xl09, cerca de 7xl09, cerca de 8xl09, cerca de 9xl09 ou cercade lxlO10 células a um indivíduo humano. Em formas de realizaçãoadicionais, podem administrar-se entre 106 a 108 células porkg de peso corporal ou entre lxlO7 a 9xl07 células por kg depeso corporal, por exemplo, cerca de lxlO7, cerca de 2xl07,cerca de 3xl07, cerca de 4xl07, cerca de 5xl07, cerca de 6xl07,cerca de 7xl07, cerca de 8xl07, cerca de 9xl07 o cerca de lxlO8células por kg de peso corporal a um indivíduo humano. Porexemplo, tal número de células ou tal número de células por kgde peso corporal podem em particular fazer referência ao númerototal de células que será administrado a um indivíduo, cujaadministração pode distribuir-se adequadamente numa ou maisdoses (por exemplo, distribuídas em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou10 ou mais doses) administradas durante um ou mais dias (porexemplo, mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais dias) . Não obstante,a determinação precisa de uma dose terapeuticamente eficaz podeser baseada em fatores individuais para cada paciente,incluindo o seu tamanho, idade, tamanho do dano tecidual e quantidade de tempo desde que o dano ocorreu, e pode serprontamente determinada pelos peritos na especialidade apartir desta divulgação e do conhecimento na técnica.

De um modo adequado, numa composição a ser administrada,as células podem estar presentes numa concentração entre cercade lOVml a cerca de 108/ ml, preferentemente entre cerca de105/ml e cerca de 107/ml, ainda mais preferentemente entre cercade lxl06/ml e cerca de lxlO7/ ml, tal como, por exemplo, cercade 5xl06/ ml. A dosagem ou a quantidade de substâncias ativas conformedivulgadas no presente documento utilizadas (por exemplo,ativador de antitrombina, inibidor da trombina), opcionalmenteem combinação com um ou mais outros ingredientes biológica oufarmaceuticamente ativos, como definidos acima, depende docaso individual e, como é habitual, deve ser adaptada àscircunstâncias individuais para alcançar um efeito ótimo.Assim, depende da natureza e da gravidade do distúrbio a sertratado, e também do sexo, idade, peso corporal, dieta, saúdegeral, capacidade de resposta individual do ser humano ouanimal a ser tratado, eficácia, estabilidade metabólica eduração da ação dos compostos utilizados, modo e tempo deadministração, taxa de excreção, se a terapêutica é aguda oucrónica ou profilático, ou se se administram outrosingredientes biológica ou farmaceuticamente ativos, ou outrasterapêuticas aplicadas, além da(s) substância(s) ativa(s) dainvenção.

Sem limitação, uma dosagem típica única pode variar desdecerca de 1 yg/kg a cerca de 250 mg/kg de peso corporal ou mais,preferentemente desde cerca de 1 yg/kg a cerca de 100 mg/kg depeso corporal, mais preferentemente desde cerca de 0,01 mg/kga cerca de 50 mg/kg de peso corporal, ainda mais preferentementedesde cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso corporal,e ainda mais preferentemente desde cerca de 0,05 mg/kg a cercade 10 mg/kg de peso corporal ou a partir de cerca de 0,05 mg/kga cerca de 1 mg/kg de peso corporal, dependendo dos fatores mencionados acima.

Para administrações repetidas ao longo de vários dias oumais, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão desejadados sintomas da doença. Uma dosagem preferida do agente podevariar desde cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim,uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kgou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem seradministradas ao paciente. Tais doses podem ser administradascomo uma dose diária única, dividida numa ou mais doses por dia,ou essencialmente de forma continua, por exemplo, utilizandouma infusão gota a gota, ou de forma intermitente, por exemplo,casa semana ou de três em três semanas.

Em formas de realização, o ativador de antitrombina eparticularmente a heparina não fracionada podem seradministrados a um indivíduo através de uma suspensão decélulas que compreende tipicamente cerca de 5-15 Ul/ml, maistipicamente cerca de 8-12 Ul/ml, e ainda mais tipicamente cercade 10 Ul/ml. Quando a administração intravenosa de ativador deantitrombina e heparina não fracionada é particularmenteindicada, a dose típica pode ser de cerca de 10-30 UI/kg/h, maistipicamente cerca de 15-25 UI/kg/h, e ainda mais tipicamentecerca de 20 UI/kg/h. Compreensivelmente, a dose pode seradaptada de acordo com os testes de coagulação.

Preferentemente, o inibidor de trombina podem seradministrado a um indivíduo, entre cerca de 0,05 e cerca de 5mg/kg de peso corporal, mais preferentemente entre cerca de 0, 1e cerca de 3 mg/kg de peso corporal, ainda mais preferentementeentre cerca de 0,2 e cerca de 2 mg/kg de peso corporal; maispreferentemente para a bivalirudina entre cerca de 0,50 e cercade 3,00 mg/kg de peso corporal, e ainda mais preferentementeentre cerca de 0,50 e cerca de 2 mg/kg de peso corporal, e aindamais preferentemente entre cerca de 0,75 e cerca de 1,75 mg/kgde peso corporal, ou também preferentemente entre cerca de 1,75e cerca de 3,00 mg/kg de peso corporal ou mais preferentementeentre cerca de 2,25 e cerca de 2,75 mg/kg de peso corporal, como por exemplo cerca de 2,50 mg/kg peso corporal; e maispreferentemente para a hirudina entre cerca de 0,2 e cerca de0, 6 mg/kg de peso corporal, e ainda mais preferentemente entrecerca de 0,3 e cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal, e ainda máspreferentemente cerca de 0,4 mg/kg de peso corporal. A invenção será agora ilustrada por meio dos exemplosseguintes, que não limitam o âmbito da invenção de qualquerforma.

Exemplo 1: Materials e métodos

Preparações celulares Células estaminais mesenquimatosas hepáticas derivadasde adulto (ALDSC, ADHLSC) foram obtidas a partir de dadores defígado saudáveis como anteriormente descrito (Najimi et al.Cell Transplant, 2007, vol 16:717-28). As células foramsuspensas numa solução de albumina contendo ou não heparina auma concentração de 10 U/ml (ou mais quando especificado) . Comocontrolo, foram usados hepatócitos humanos cripreservados/descongelados. Os procedimentos de isolamentohepático e criopreservação/descongelação foram publicadosanteriormente em detalhe (Sokal et al. Transplantation, 2003,vol. 76, 735-738). Fibroblastos humanos foram recolhidos porbiópsia de pele (lado medio-anterior do antebraço) devoluntários com idades compreendidas entre 8 anos e 35 anos apósconsentimento informado por escrito como descritoanteriormente (Lysy et al. Hepatology, 2007, vol. 46,1574-1585). Amostras de medula óssea foram recolhidas poraspiração de vértebras ou cristas ilíacas de dadorespost-mortem com idade entre 8 e 67 anos. Os aspirados foramrecolhidos em seringas heparinizadas, contendo solução salinaequilibrada de Hanks a 10 % (Invitrogen, Merelbeke, Bélgica)e foram processados dentro de 48 h de acordo com um protocolopreviamente descrito (Lysy et al. , CellProlif., 2008, vol. 41,36- 58) .

Expressão de fator tecidual da suspensão com células estaminaismesenquimatosas hepáticas humanas derivadas de adulto A presença da forma de TF ligado à membrana clássica e deTFPI foi analisada por reação em cadeia da polimerase comtranscrição reversa (RT-PCR). Ácido ribonucleico mensageiro(ARNm) foi extraído a partir de 0,5xl06 células utilizando okit de reagente de isolamento TriPure (Roche Applied Science,Bruxelas, Bélgica) seguindo as instruções do fabricante. Umaetapa de RT-PCR foi realizada num instrumento termociclador(Applied Biosystems, Lennik, Bélgica) com iniciadoressintetizados em Invitrogen. A RT-PCR para TF ou gliceraldeído3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi realizada com osiniciadores detalhados no Quadro 2.

Quadro 2

Os produtos foram separados por eletroforese em gel deagarose a 1 % e visualizados com brometo de etídio sob umalâmpada ultravioleta.

Uma RT-PCR em tempo real para TF, as-TF, TFPI e ciclofilinaA também foi realizada num sistema de PCR StepOnePlus em tempo real (Applied Biosystems, Califórnia, EUA), utilizando ensaiosde expressão génica TaqMan®, listados no quadro 3. Para aexpressão de TF, foram utilizados dois ensaios, um (TF comum)amplificando uma região presente tanto na membrana como naforma solúvel (splicing alternativo, asTF), e o outro (TF demembrana) amplificando uma região presente apenas na forma demembrana (clássica). 0 parâmetro Ct foi derivado para cadaamostra de ADNc e par de iniciadores e o Ct de ciclofilina Afoi subtraído para obter o ACt. Em seguida, o AACt foi obtidosubtraindo-se o gene Ct calibrador, e os resultados expressoscomo alteração de vezes da quantidade de ARNm (Figura 9). Aexpressão de asTF foi calculada como a diferença entre a AACtde TF comum e TF de membrana. Em seguida, os iniciadores(obtidos a partir de Applied Biosystems) foram como detalhadono Quadro 3.

Quadro 3

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Atividade pró-coagulante da suspensão com célulasestaminais mesenguimatosas hepáticas humanas obtidas de adultoAs medidas foram realizadas num analisador ROTEM® delta(Pentapharm, Munique, Alemanha). ROTEM avalia a cinética e aqualidade da formação de coágulos e a lise de coágulos em temporeal. 0 tempo de coagulação (CT) é definido como o período detempo desde o início da análise, até ao início da formação doscoágulos, normalmente até que se alcança uma amplitude de 2milímetros. 0 tempo de formação dos coágulos é definido comoo período até que se alcança uma amplitude de 20 milímetros.O ângulo alfa é definido como o ângulo entre a linha central e uma tangente à curva que passa pelo ponto de amplitude de 2mm, que é o fim do CT. A amplitude máxima da curva é definidacomo a firmeza máxima do coágulo. 0 valor máximo de liserepresenta a fibrinólise máxima detetado durante a medição.

Em resumo, depois de um curto período de repouso, 300 μΐde sangue total foram pipetados para um copo pré-aquecido a 37°C. As células em suspensão foram posteriormente adicionadasao sangue total (5xl05 células se não se estabelece qualquerespecificação) . Foram adicionados 20 μΐ de reagentedesencadeador que contém fator tecidual (Innovin, Siemens,Marburgo, Alemanha. Diluição final 1:17.000/0,35 pM) diluídosem tampão Owren (Siemens, Marburgo, Alemanha), quandoespecificado, à mistura de células-sangue, seguido pela adiçãonecessária de 20 μΐ de CaCÍ2 a 0,2 M. Após a adição de cálcio,as medições iniciaram-se automaticamente. Para os ensaios deplasma, as células (5xl05 células se não se estabelece qualquerespecificação) foram incubadas em 3,8 ml de sangue com citratoa 37 °C durante 30 minutos. Após incubação, sangue total foicentrifugado a 4500 rpm durante 10 minutos. 300 μΐ do plasmaobtido estavam, em seguida, prontos para o protocolo,pipetaram-se para o copo, seguido pela adição ou não de fatortecidual e CaCÍ2.

Estatística

As diferenças estatisticamente significativas (*P<0,05,**P<0,01, ***P<0,001) foram avaliadas por testes de

Mann-Whitney. Foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis para aanálise de ANOVA de uma via.

Exemplo 2: Atividade pró-coagulante das células estaminaismesenquimatosas hepáticas humanas derivadas de adulto

Atividade pró-coagulante de células estaminaismesenquimatosas hepáticas humanas derivadas de adulto (ALDSC,ADHLSC) foi demonstrada por um método tromboelastometria. Estaatividade pró-coagulante é mais importante do que a doshepatócitos maduros avaliados pelo tempo de coagulação noensaio de tromboelastógrafo (Figura 1). Além disso, e inversamente à atividade pró-coagulante dos hepatócitos,mostra-se que a atividade pró-coagulante de ALDSC não étotalmente inibida pela heparina não fracionada, heparina debaixa massa molecular (dados não mostrados), fármacosanti-vitamina K (dados não mostrados) ou fármacos antitrombinautilizados sozinhos (hirudina, bivalirudina) (Figuras 2-3).Verificou-se que a utilização concomitante de heparina nãofracionada e hirudina ou bivalirudina é uma combinaçãoespecifica e sinérgica original que permite modular a atividadepró-coagulante de células estaminais mesenquimatosashepáticas humanas derivadas de adulto (Figuras 4-5). Também sedemonstrou uma atividade pró-coagulante de fibroblastos, decélulas estaminais mesenquimatosas da medula óssea, mas nãopara as células estaminais hematopoiéticas de medula óssea(Figuras 6-7). Empregando experiências análogas, também semostra que a utilização concomitante de heparina não fracionadae hirudina ou bivalirudina modula a atividade pró-coagulantede fibroblastos e de células estaminais mesenquimatosas damedula óssea.

Exemplo 3: As células estaminais mesenquimatosas hepáticashumanas derivadas de adulto expressam TF

Foi avaliada a expressão de TF e do seu inibidor naturalTFPI ao nivel do ARNm por meio de RT-PCR (Figura 8). Tanto aforma de membrana como a variante de splicing alternativo deARNm de TF (as-TF) foram expressas em células estaminaismesenquimatosas hepáticas humanas derivadas de adulto (ALDSC) .Em experiências adicionais, RT-PCR em tempo real foi utilizadapara quantificar o TF, as-TF, níveis de ARNm de TFPI conformemostrado na Figura 9.

Exemplo 4: Transplante celular ALDSC são suspensas a uma concentração de 5xl06 células/mlnuma solução de Hibumin (5 %), contendo bicarbonato de sódio(0,84 g/1), glicose (2,5 g/1) e heparina não fracionada (10Ul/ml). A suspensão de ALDSC é infundida parentericamente noindivíduo. Durante a infusão celular, o indivíduo recebe bivalirudina (1,75 mg/kg). Entre as infusões celularesconsecutivas, o indivíduo recebe bivalirudina (0,25 mg/kg)durante 2 a 4 horas, dependendo do teste de tromboelastometria. É evidente que a administração concomitante de um ativadorde antitrombina (por exemplo, heparina) e um inibidor detrombina (por exemplo, bivalirudina) no transplante celularmelhora a eficiência do transplante celular e o potencial deenxerto das células. A administração concomitante de umativador de antitrombina e um inibidor de trombina notransplante celular reduz a atividade pró-coagulante dascélulas e previne a trombose associada com o transplantecelular, bem como complicações associadas com o transplantecelular, tais como a perda de células, rejeição celular einflamação.

Exemplo 5: A combinação de bivalirudina e heparina evita o riscode trombose induzida por células progenitoras hepáticashumanas Métodos O protocolo, incluindo todas as experiências com amostrashumanas, e a utilização do protocolo de anticoagulante nãoprescrito humano, e os consentimentos informados foramaprovados pelo comité de ética institucional.

Preparações de células Células hALPC foram obtidas de dadores de fígado saudáveis(n = 6, idades entre 9 anos e 44 anos) , como descritoanteriormente (Najimi et al., Cell Transplant. 2007;16:717-728) . As células foram estudadas recém-tripsinizadas ouapós a criopreservação/descongelação nas passagens de 4 a 6.As células foram suspensas numa solução de albumina contendoou não contendo heparina na concentração de 10 U/ml (ou mais,quando especificado) . Os inventores também utilizaram, comocontrolo, hepatócitos humanos criopreservados/descongelados(n = 5, com idades entre 16 e 44 anos). Os procedimentos deisolamento hepático e criopreservação/descongelação forampublicados anteriormente em detalhe (Sokal et al.,

Transplantation. 2003; 76:735-738).

Amostras de medula óssea foram recolhidas por aspiraçãode vértebras ou cristas ilíacas de 3 dadores de órgãospost-mortem com idade entre 8 e 67 anos. Os aspirados foramrecolhidos em seringas heparinizadas contendo solução salinaequilibrada de Hanks a 10 % (Invitrogen, Merelbeke, Bélgica)e foram processados dentro de 48 h de acordo com um protocolopreviamente descrito (Lysy etal., CellProlif., 2008, vol. 41,36- 58) .

Os fibroblastos humanos foram recolhidos por biópsia dapele (lado medio-anterior do antebraço) de voluntários de 18anos a 35 anos de idade (n = 3) após consentimento informadopor escrito como anteriormente descrito (Lysy et ai.,Hepatology. 2007; 46:1574-1585).

As células não parenquimatosas hepáticas humanas foramobtidas depois do isolamento hepático realizado no Banco deTecidos dos inventores, filtração e 2 centrifugações a baixavelocidade da suspensão de células a partir de três dadoresdiferentes (fígado de um recém-nascido e dois dadores de 12 anosde idade). A seguir, células estreladas humanas foram isoladaspor centrifugação em gradiente Nicodenz (Myegaard, Oslo,Noruega) de acordo com os protocolos estabelecidos (Guimarãeset ai., J. Hepatol. 2010; 52 (3) :389-397) . Os miofibroblastosativados foram obtidos a partir das células estreladasisoladas.

Sangue O sangue foi obtido a partir de dadores do sexo masculinocom idades entre 29 a 40 anos (n = 5).

Atividade pró-coagulante da suspensão de hALPCs

As medidas foram realizadas num analisador ROTEM® delta(Pentapharm, Munique, Alemanha). ROTEM® avalia a cinética e aqualidade da formação de coágulos e a lise de coágulos em temporeal. O tempo de coagulação (CT) é definido como o período detempo desde o início da análise, até ao início da formação doscoágulos, normalmente até que se alcança uma amplitude de 2 milímetros. 0 tempo de formação dos coágulos é definido comoo período até que se alcança uma amplitude de 20 milímetros.O ângulo alfa é definido como o ângulo entre a linha centrale uma tangente à curva que passa pelo ponto de amplitude de 2mm, que é o fim do CT. A amplitude máxima da curva é definidacomo a firmeza máxima do coágulo. O valor máximo de liserepresenta a fibrinólise máxima detetado durante a medição.

Em resumo, depois de um curto período de repouso, 300 μΐde sangue total foram pipetados para um copo pré-aquecido a 37°C. As células em suspensão foram posteriormente adicionadasao sangue total (5xl05 células se não se estabelece qualquerespecificação) . Foram adicionados em seguida vinte μΐ dereagente desencadeador que contém fator tecidual (Innovin,Siemens, Marburg, Alemanha. Diluição final 1:17.000/0,35 pM)diluídos em tampão Owren (Siemens, Marburgo, Alemanha), àmistura de células-sangue, seguido pela adição necessária de20 μΐ de CaCÍ2 a 0,2 M. Após a adição de cálcio, as mediçõesiniciaram-se automaticamente. A atividade pró-coagulante(PCA) das células foi também determinada, sem adição deInnovin. Para determinar o papel de TF neste modelo decoagulação, as células foram pré-incubadas à temperaturaambiente durante 10 minutos com 0,2 mg/ml de mAb IgG 1 anti-TFhumano (American Diagnostica) ou 0,2 mg/ml de mAb IgGl deratinho (clonell711.11; RnD Systems, Abingdon, Reino Unido)antes de lavagem extensiva em albumina a 5 % e ensaio detromboelastometria.

Para os ensaios em plasma, células (células 5xl0exp5 senão for feita qualquer especificação) foram incubadas em 3,8ml de sangue com citrato a 37 °C durante 30 minutos. Apósincubação, sangue total foi centrifugado a 4500 rpm durante 10minutos. Trezentos μΐ do plasma obtido estavam em seguidaprontos para o protocolo, pipetaran-se para o copo, seguidopela adição ou não de Innovin e CaCÍ2.

Para os ensaios deficientes em plasma, as células emsuspensão (células 5xl0exp5 se não for feita qualquer especificação) foram adicionadas a 300 μΐ de plasma, antes daadição de Innovin e CaCÍ2.

Para a modulação de ensaios de APC, as células foramsuspensas em albumina a 5 %, com ou sem heparina não fracionada(Heparina Leo®, Leo) a uma concentração de 10 Ul/ml.Enoxaparina (Clexane ©, Aventis Pharma) a uma concentração de1 Ul/ml de acordo com as publicações (Guimarães et al., J.Hepatol 2010; 52 (3):389-397), fondaparinux (Arixtra®, GSK) auma concentração de 0,34 mg/1 (extrapolação de dose clinica de2,5 mg para peso adulto e publicações (Feng et al., Clin Ther2009; 31:1559-1567), hirudina (Refludan®, Celgene Europe

Limited) a uma concentração de 5,7 pg/ml (extrapolação de doseclinica 0,4 mg/kg), bivalirudina (Angiox®, The MedicinesCompany) a uma concentração de 10,7 yg/ml (extrapolação de doseclinica 0,75 mg/kg) foram então adicionados ao sangue ou aoplasma. A extrapolação da dose foi baseada no volume de sanguecirculante de acordo com o peso (70 ml/kg).

Se não se observou qualquer coagulação depois de 1800 seg,a tromboelastometria foi arbitrariamente interrompida.

Anel tubular

Um protocolo experimental de sangue total foi adaptado apartir de um modelo anteriormente descrito (Johansson et al,Diabetes 2005; 54:1755-1762). Os anéis foram fabricados a partir de tubos de cloreto de polivinilo (diâmetro interno 6,3mm, comprimento 390 mm) e foram tratados com uma superfície deheparina Corline adquirida em Corline (Uppsala, Suécia). Osanéis foram suplementados com amostras de células (5xl0exp5)suspensas em solução salina tamponada com fosfato antes daadição do sangue. Cinco ml de sangue não anticoagulado a partirde voluntários saudáveis foram de seguida adicionados a cadaanel. Para gerar um fluxo sanguíneo de cerca de 45 ml/minuto,os dispositivos de anel foram colocados sobre uma plataformaoscilante dentro de uma incubadora a 37 °C. As amostras desangue foram recolhidas em tubos com ácidoetilenodiaminotetracético (4,1 mmol/1 de concentração final) e citrato (12, 9 mmol/1 de concentração final) antes e 30 minutosapós o inicio. As plaquetas foram contadas num XE-2100 automate(Sysmex, Japão) e os dimeros-D foram avaliados pelo ensaioimunoturbidimétrica (Innovance D-Dimer, Siemens, Marburgo,Alemanha) num CA-7000 (Sysmex, Japão).

Medição da atividade anti-Xa A medição da atividade anti-Xa foi realizada utilizando 0 kit de heparina Biophen (LRT) adaptado num CA7000 (Siemens,Marburgo, Alemanha). Resumidamente, o ensaio é um métodocinético cromogénico baseado na inibição de uma quantidadeconstante de fator Xa, através da heparina testada (ou outrasubstância anti-Xa) em presença de antitrombina endógena, ehidrólise de um substrato cromogénico especifico do fator Xaatravés do fator Xa em excesso. Após 30 minutos de incubaçãodas células em suspensão em albumina suplementadas ou não comheparina (10 Ul/ml, 50 Ul/ml e 100 Ul/ml) no sangue, mediu-sea atividade anti-Xa no plasma obtida após centrifugação dosangue.

Expressão de TF e de TFPI da suspensão de hALPCs

Os estudos de imunofluorescência foram realizados paraavaliar a presença de TF. Para isto, células estaminaishepáticas humanas derivadas de adulto foram colocadas emlamelas e fixadas com paraformaldeido a 4 % (Merck, Darmstadt,Alemanha) durante 20 minutos. Posteriormente, estas célulasforam incubadas com Triton X-100 (Sigma, Bomem, Bélgica) a 1 %em tampão de Tris base de sódio (50 mmol/1 Tris-HCl pH 7,4 e150 mmol/1 de NaCl) (Organics [VWR], Lovaina, Bélgica) durante15 minutos e, em seguida, com leite a 3 % em tampão Tris basede sódio durante 1 hora. O anticorpo primário, anticorpomonoclonal (mAb) IgGl de murino anti-TF (imunoglobulina [Ig]Gln4508; American Diagnostica, Andresy, França) foi diluído(1/50) de Tris base de sódio e incubado com as células durante 1 hora. O anticorpo secundário utilizado foi anti-IgG deratinho conjugado com isotiocianato de fluoresceína (Sigma).Os núcleos foram revelados por coloração com 4-, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma). Controlos negativosexperimentais foram realizados (ausência de anticorposprimários ou secundários). A presença de TF foi tambémconfirmada por análise de citometria de fluxo. A fim de detetara forma ligada a membrana de TF, as células foram lavadas emsolução salina tamponada com fosfato suplementada com albuminasérica bovina a 0,5 % (tampão FACS) e incubadas durante 20minutos a 4 °C com o mAb IgGl conjugado com isotiocianato defluoresceina (FITC) contra TF no . 4508CJ (American Diagnostica)ou o mAb de controlo de isotipo correspondente (BD Biosciences,Erembogedem, Bélgica) diluído em tampão FACS contendo sorohumano agrupado descomplementado a 10 %. Para detetar a formacitosólica de TF, as células foram incubadas comCytofix/Cytoperm (BD Biosciences) durante 20 min à temperaturaambiente e lavaram-se com Permwash (BD Biosciences). Asamostras foram então incubadas durante 20 minutos à temperaturaambiente com conjugado com mAb anti-TF conjugado com FITC ouo mAb de controlo de isotipo correspondente (BD Biosciences)diluído em permwash. A fluorescência celular foi medida usandoum citómetro de fluxo BD FACS CANTO II e analisada utilizandoo software BD FACS DIVA. Não se obteve qualquer anticorpo anti-TFPI para avaliara expressão do inibidor da via do fator tecidual (TFPI) porimunocitoquímica ou citometria de fluxo. A presença das 2 formas de TF e de TFPI foi analisada porreação em cadeia da polimerase com transcrição reversa(RT-PCR). Ácido ribonucleico mensageiro (ARNm) foi extraído apartir 0,5xl0exp6 células utilizando o kit de reagente deisolamento TriPure (Roche Applied Science, Bruxelas, Bélgica)seguindo as instruções do fabricante. Uma etapa de RT-PCR foirealizada num instrumento termociclador (Applied Biosystems,Lennik, Bélgica) com iniciadores sintetizados em Invitrogen.RT-PCR para TF ou gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase(GAPDH) foi realizada com os iniciadores detalhados no Quadro2 .

Uma RT-PCR em tempo real para TF, as-TF, TFPI e ciclofilinaA também foi realizada num sistema de PCR StepOnePlus em temporeal (Applied Biosystems, Califórnia, EUA), utilizando ensaiosde expressão génica TaqMan®, listados no quadro 3. Para aexpressão de TF, foram utilizados dois ensaios, um (TF comum)amplificando uma região presente tanto na membrana como naforma solúvel (splicing alternativo, asTF), e o outro (TF demembrana) amplificando uma região presente apenas na forma demembrana (clássica). 0 parâmetro Ct foi derivado para cadaamostra de ADNc e par de iniciadores e o Ct de ciclofilina Afoi subtraído para obter o ACt. Em seguida, o AACt foi obtidosubtraindo-se o gene Ct calibrador, e os resultados expressoscomo alteração de vezes da quantidade de ARNm (Figura 9). Aexpressão de asTF foi calculada como a diferença entre a AACtde TF comum e TF de membrana. Os iniciadores (obtidos a partirde Applied Biosystems) foram como detalhado no Quadro 3. A linha celular CAPAN foi utilizada como controlo positivode TF, enquanto a linha celular HUVEC foi utilizada comocontrolo positivo de TFPI.

Infusões de pacientes e protocolo anticoagulação

Uma menina de 3 anos de idade, que sofre de gravedeficiência de OTC (<1 % de atividade) , foi o primeiro recetorde hALPCs. 0 diagnóstico foi estabelecido aos 12 dias após onascimento e confirmado por análise de ADN, indicando umamutação de novo dos exões 6 e 8 no alelo paterno do gene OTC.

Recebeu 2 infusões separadas de 30 milhões de hALPCs porkg de peso corporal, de um dador do sexo masculino, com umintervalo de 2 semanas entre as infusões. No total, a pacienterecebeu 0,9 mil milhões de células progenitoras. As célulasforam suspensas em albumina a 5 % e heparina (10 Ul/ml). A infusão das primeiras hALPCs foi realizada sob anestesiageral sem qualquer pré-medicação. Um cateter transcutâneo foi colocado no ramo principal da veia porta sob orientaçãof luoroscópica e ecografia após a injeção de uma dose decefazolina (40 mg/kg). A infusão celular foi realizadautilizando uma seringa de 50 ml com um caudal de 100 cc/h. Aimunosupressão foi administrada à paciente utilizandotacrólimo (Prograft®, Astellas Pharma) em monoterapêutica (0,1mg/kg) , correspondendo a 2 mg por dia em 2 doses divididas paraatingir níveis mínimos de 6-7 ng/ml. Antibioterapiaprofilática com cefazolina (40 mg/kg) foi administrada 2 vezesapós a infusão com intervalos de 8 horas entre as 2 doses. Osciclos de infusão e pós-infusão foram normais e a criançarecebeu alta do hospital no dia 3 pós-infusão. A segunda infusão de hALPCs foi realizada duas semanasmais tarde. Naquele momento, produziu-se uma trombose parcialde um ramo da veia porta intra-hepática e levou à interrupçãoda infusão. Este evento adverso foi tratado por heparina eanticoagulante cumarínico (5 mg/dia). A concentração de dímeros-D foi marcadamente elevadadepois de ambos os ciclos de infusão celular. Este eventoadverso ocorreu sem consequências para a paciente, masjustificou a investigação do efeito pró-coagulante das célulasprogenitoras.

O segundo paciente era um homem de 24 anos, com síndromede Crigler-Naj j ar de tipo intermédio I/II que não responde aofenobarbital. O diagnóstico foi estabelecido um mês após onascimento e foi confirmado por análise de ADN que indicou umamutação no gene UDP-glicuroniltransferase 1A1 com presença deestado homozigótico da mutação L443P. O paciente recebeu umtotal de 2,2 mil milhões de hALPCs administrado em 7 infusõesdurante 2 dias. Antes da colocação do cateter portal, o pacienterecebeu pré-medicação incluindo cefazolina (1 g) . O cateter foicolocado sob controlo ecográfico no sistema portal. Solumedrol(80 mg) foi injetado antes da infusão. O tratamentoimunossupressor consistiu em tacrólimo (Prograft®, AstellasPharma), tendo como alvo os níveis sanguíneos de 6-8 ng/ml. A profilaxia de coagulação especifica foi prescrita; as célulasforam suspensas em albumina a 5 % e heparina a uma concentraçãode 10 Ul/ml. Durante a infusão de células, o indivíduo recebeubivalirudina (1,75 mg/kg). Entre as infusões celularesconsecutivas, o indivíduo recebeu bivalirudina (0,25 mg/kg)durante 2 a 4 horas, dependendo do teste de tromboelastometria.Os testes de coagulação incluindo tromboelastometria (CT),contagem de plaquetas (valores normais: 150-350 10exp3/yl) econcentrações de dímeros-D (valores normais: <500 ng/ml), tempo de trombina (TT, valores normais: 15-24 seg), tempo deprotrombina (PT, valores normais: 9-14 seg) e tempo de tromboplastina parcial (PTT, valores normais: 20-33 seg) foramrepetidamente realizados antes, 20 minutos após o início e nofinal de cada infusão. Fio realizada ecografia Doppler hepáticaapós cada infusão para avaliar o fluxo portal. O terceiro paciente era um adolescente de 17 anos sofrendode Glicogenose de tipo 1 a, documentada por análise genética(mutação G188R e inserção 380insC) e ausência de atividade daglicose-6-fosfatase na biópsia hepática. Também recebeuprofilaxia com antibióticos antes da colocação do cateterportal e esteroides antes da infusão. Foi aplicado o mesmoregime imunossupressor. O paciente recebeu um total de 3 milmilhões de células progenitoras administrado em 7 infusõesdurante 3 dias com o objetivo de controlar a hipoglicemiarecorrente. Foi aplicado o mesmo protocolo de anticoagulaçãoe coagulação incluindo o seguimento com ecografia Dopplerhepática.

Estatística

Mann-Whitney. Os valores significativos foram ajustados deacordo com a correção de Bonferroni para evitar o erro de tipo1. O teste de Kruskal-Wallis foi aplicado para a análise deANOVA de uma via.

Resultados

Atividade pró-coagulante de hALPCs Método de tromboelastometria e anel tubular

Foi demonstrada a atividade pró-coagulante (PCA) dascélulas progenitoras hepáticas humanas adultas (hALPCs) pelométodo de tromboelastometria em sangue e plasma humano. 0 tempode coagulação (CT) das hALPCs era inferior do que o dehepatócitos avaliados no tromboelastograma (no sangue, 117,5± 33,8 seg (n = 15) contra 285, 8 ± 87,0 seg (n = 11), p <0,001)(no plasma , 112,6 ± 18,4 seg (n = 9)contra 363,0 ± 180,1 seg(n = 5) , p <0,05) (Figuras 10A e 10B) . O CT de controlo, semadição de células, foi medido a 646,2 ± 111,7 seg (n = 15) nosangue e a 781,9 ± 150,5 (n = 9) no plasma. APC comparável dehALPCs foi observada quando não foi adicionado TF extrínseco(Figura 11) . Não se obteve qualquer PCA quando o meio de culturade hALPCs, ausência de células, foi colocado no tromboelastograma em vez das células (Figura 12).

Também se avaliou a PCA de hALPCs no modelo de aneltubular. A diminuição da contagem de plaquetas e o aumento dasconcentrações de dimeros-D foram observados após incubação dehALPCs com sangue. Plaquetas desde 295.000/yl a 109.000/μ1(experiência 1) e de 310.000/μ1 a 134.000/μ1 (experiência 2);dímeros-D de 100 ng/ml a 700 ng/ml (experiência 2) e 95 ng/mla 740 ng/ml (experiência 2).

Atividade pró-coagulante de células mesenguimatosas

Foi também demonstrada a PCA de células estaminaismesenquimatosas da medula óssea (279,3 ± 108,3 seg (n = 3)),fibroblastos cutâneos (121,8 ± 26,53 seg (n = 3)) emiofibroblastos hepáticos (61,7 ±7,6 seg (n = 3) ) pelo métodode tromboelastometria em sangue humano total. Célulasestaminais hematopoiética da medula óssea foram utilizadascomo um controlo de células não pró-coagulantes (590,7 ± 25,3seg (n = 3)) (Figura. 13).

Modulação da atividade pró-coagulante de hALPCs

Em primeiro lugar, foi analisada a PCA de hALPCs no plasmadeficiente em fator de coagulação. Foi demonstrado que quando se utiliza o plasma deficiente em fator VII, cofator de TF, aPCA de hALPCs foi apenas parcialmente diminuída (298,3 ± 42,3seg (n = 3), p <0,01 em comparação com PCA do plasma normal)(Figura 14) . Não foi observada PCA de hALPCs no plasmadeficiente em fator II (trombina) ou X, como para o plasmadeficiente em fator V, mas a uma concentração menor (Figura 14) .Além disso e inversamente à PCA de hepatócitos (Figura 15C),foi demonstrado que a PCA de hALPCs não foi totalmente inibidapor heparina não fracionada (225,8 ± 149,8 seg (n = 15)),heparina de baixa massa molecular (112,3 ± 22,5 seg (n = 3 ))ou fondaparinux (209,7 ± 149,7 seg (n = 3) ) (Figura 15A) , mesmose a dose for aumentada até 5x (Figura 23). Não foi observadaqualquer coagulação quando a heparina foi utilizada na ausênciade células.

Os fármacos inibidores de trombina, hirudina oubivalirudina permitiram apenas um controlo parcial da PCA dehALPCs (256, 3 ± 11,8 seg (n = 3) e 380,8 ± 114,7 seg (n = 4),respetivamente) (Figura 15B), mesmo quando se aumenta a dose(2x ou 5x) (Figuras 24 e 25) . A PCA de hepatócitos foi controladapor fármacos inibidores da trombina, hirudina e bivalirudina(Figura 15d) . Sangue de controlo (na ausência de células) teveum CT em 1075,0 ± 107,2 com bivalirudina enquanto não foiobservada qualquer coagulação mensurável com hirudina.

Os fármacos anti-vitamina K (sangue obtido de pacientestratados com INR 2 a 3) não tiveram influência natromboelastometria mesmo para o controlo (ausência de células)(dados não mostrados). Finalmente, foi demonstrado que autilização concomitante de bivalirudina com heparina nãofracionada (1240,0 ± 338,7 s (n = 3)) ou enoxaparina (725,0 ±90,1 s (n = 3)) ou fondaparinux (909,0 ± 421,4 s (n = 3) ) éuma combinação sinérgica, ativador de antitrombina e inibidorde trombina, permitindo modular a PCA de hALPCs (Figuras 16Ae B). Não foi obtida qualquer modulação completa da PCA dehALPCs quando se combinou heparina e enoxaparina oufondaparinux (Figura 26).

Utilizando experiências análogas, demonstrou-se que aheparina não fracionada pode controlar a PCA de célulasmesenquimatosas da medula óssea, fibroblastos cutâneos, mas aPCA é inativada em miofibroblastos hepáticos (Figura 27). Autilização concomitante de heparina não fracionada ebivalirudina também mostrou modular a PCA de miofibroblastoshepáticos, em contraste com bivalirudina sozinha (Figura 28) .Análise da PCA de hALPCshALPCs expressam TF e TFPI A expressão de TF foi documentada pela primeira vez porimunofluorescência. Conforme mostrado na Figura 17,

verificou-se que todas as células expressavam TF constitutivamente (coloração citoplasmática uniforme). Aanálise de citometria de fluxo de hALPCs confirmou umacoloração positiva e especifica para TF (94,9 ± 1,0 % para aforma ligada a membrana, 93,6 ± 10,2 % para a forma citosólicaem comparação com o isotipo de controlo 24,2 ± 6,1 % e 7,6 ±5,8 %, respetivamente e para as células não marcadas 13,2 ±7,1 % e 3,7 ± 4,1 %, respetivamente; n = 3).

Também se avaliou a expressão de TF e do seu inibidor TFPIao nivel do ARNm empregando RT-PCR (Figura 18). Tanto a formade membrana como a variante de splicing alternativo de ARNm deTF foram expressas em hALPCs. O TFPI também foi expresso. Emexperiências adicionais, utilizou-se RT-PCR em tempo real paraquantificar os niveis de TF, as-TF e de ARNm de TFPI. Conformemostrado na Figura 19, a variante de TF de membrana foi expressapredominantemente (n = 3) . Além disso, a expressão de TF é maisimportante para hALPCs em comparação com hepatócitos (n = 3) .Pelo contrário, a expressão de TFPI por hepatócitos foi maiselevada do que a de hALPCs (n = 3). O papel de TF na indução da PCA foi determinada atravésda pré-incubação de células com IgG anti-TF humano. Conformemostrado na Figura 20, a PCA de hALPCs foi apenas parcialmentecontrolada através do bloqueio de TF (324,8 ± 11,4 seg (n = 5) ,p <0,01 em comparação com a ausência do anticorpo de TF), em contraste com os hepatócitos, como demonstrado anteriormente(Fisher et al., Transplantation. 2000; 69:303-307).

Como já foi mostrado na Figura 13, apenas se obteve umcontrolo parcial da PCA de hALPCs PCA em plasma deficiente emfator VII confirmando que a PCA de hALPCs não estavacompletamente relacionada com o TF.hALPCs e heparina

Observou-se apenas uma pequena atividade anti-Xa noplasma obtido após a incubação de hALPCs (0,05 ± 0,03 Ul/ml)e heparina a uma concentração de 10 Ul/ml (Figura 21), emrelação com a ausência de efeito anticoagulante da heparinasozinho em hALPCs.

Protocolo de anticoagulação especifico para a aplicaçãoclinica O protocolo de anticoagulação foi aplicado com sucesso jáque não se verificou qualquer evento trombótico ou hemorrágicoem ambos os pacientes. Como esperado, com o uso de bivalirudinaobservou-se um aumento substancial no TT e limitado no PT. LeveFoi observado um ligeiro aumento dos dimeros-D em ambos ospacientes, atingindo 1480 ng/ml para o primeiro paciente e 1840ng/ml para o segundo paciente. Foi observado um aumento de PTTem ambos os pacientes, relacionado com a atividade anti-Xadetetável (Figuras 22A e B) . Não foi encontrada qualquermodificação do fluxo portal através de ecografia Dopplerhepática durante as infusões em ambos os pacientes.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Universite catholique de Louvain <120> Composições e métodos para o transplante celular

<130> UCL-096-PCT <150> 11152119.1 <151> 25-01-2011 <160> 8 <17Ο> Patentln versão 3.3 <210> 1<211> 22<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<4 0 0> 1 tgaatgtgac cgtagaagat ga 22 <210> 2<211> 20<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<400> 2 ggagttctcc ttccagctct 20 <210> 3<211> 25<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<400> 3 ggaagaagat cctggaatat cgagg 25 <210> 4<211> 25<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<400> 4 cttggttgat tgcggagtca gggag 25 <210> 5<211> 24<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<400> 5 cggactcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 6<211> 18<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<400> 6 agccttctcc atggtggt 18 <210> 7<211> 27<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<400> 7 tcttcaagtt caggaaagaa atattct 27 <210> 8<211> 21<212> ADN<213> Artificial <22 0> <223> Iniciador<400> 8 ccaggatgat gacaaggatg a 21

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presentepedido de patente foi elaborada apenas para informação doleitor. Não é parte integrante do documento de patenteeuropeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP nãoassume qualquer responsabilidade por eventuais erros ouomissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2007071339 A [0033] • WO 2006126236 A [0034] • US 6200806 B [0064] • US 5486359 A [0068] • US 5811094 A [0068] • US 5736396 A [0068] • US 5837539 A [0068] • US 5827740 A [0068] • WO 9117250 A [0078] • WO 11152119 A [0169]

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina, pelo menos um inibidor de trombina e célulasselecionadas a partir do grupo que consiste em célulasprogenitoras hepáticas adultas e miofibroblastos hepáticos, emque: - o ativador de antitrombina é selecionado a partir do grupoque consiste em heparina, heparina não fracionada, heparinade baixa massa molecular e fondaparinux; e - o inibidor de trombina é selecionado a partir do grupo queconsiste em bivalirudina e hirudina.
2. A combinação de acordo com a reivindicação 1, em que as células progenitoras hepáticas adultas são célulasprogenitoras ou estaminais derivadas de fígado adulto queexpressam alfa-actina de músculo liso (ASMA) e albumina (ALB)e não expressam citoqueratina-19 (CK-19) ou são células progenitoras pluripotentes derivadas de fígado humano adulto,não ovais que expressam marcadores celulares hepáticos e quesão capazes de se diferenciar em células hepáticas maduras,células produtoras de insulina, células osteogénicas e célulasepiteliais, ou são células progenitoras pluripotentesderivadas de fígado humano adulto, não ovais que expressammarcadores celulares hepáticos e que são capazes de sediferenciar em células hepáticas maduras, células produtorasde insulina, células osteogénicas e células endoteliais.
3. A combinação de acordo com qualquer das reivindicações 1ou 2, em que as células: - São células primárias; ou - São uma linha celular; ou Foram submetidas a armazenamento, tal como acriopreservação, e/ou a proliferação ou passagem; ou - São induzidas para expressar uma ou mais proteínas, tais como uma ou mais proteínas que são autólogas com as célulasou que não são autólogas com as células, ou para aumentar oudiminuir, ou bloquear por completo ou substancialmente porcompleto a expressão das mesmas; ou - São transformadas de forma estável ou transiente com umácido nucleico, tal como um ácido nucleico que codifica umproduto génico que potência o crescimento, diferenciaçãoe/ou o funcionamento das células.
4 . A combinação de acordo com qualquer das reivindicações 1a 3, configurada para administração separada, simultânea ousequencial em qualquer ordem das ditas células, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor de trombinaa um indivíduo.
5 . A combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, em que o ativador de antitrombina é heparina nãofracionada.
6. A combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 5, em que o inibidor de trombina é a bivalirudina.
7 . A combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 6, em que as células e o pelo menos um ativador deantitrombina estão incluídos numa suspensão celular.
8. Uma composição farmacêutica que compreende a combinaçãode acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e um ou maisexcipientes farmaceuticamente aceitáveis, em que a composiçãofarmacêutica é líquida, semissólida ou sólida.
9. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação8, em que a composição farmacêutica é líquida, e as célulasestão presentes na composição farmacêutica numa concentraçãoentre 104/mL a 108/mL, preferentemente entre 105/ml e 107/ml, mais preferentemente entre lxl06/ml e lxl07/ml ou 5xl06/ml.
10 . A combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 7 ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 8 ou 9 para utilização como um medicamento.
11. A combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 7 ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 8 ou 9 para utilização no transplante decélulas; ou para utilização no tratamento de trombose oucomplicações trombóticas causadas por transplante das ditascélulas; ou para utilização na inibição da atividadepró-coagulante das ditas células in vivo.
12. A combinação ou composição farmacêutica para utilizaçãode acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, em que: - O ativador de antitrombina é heparina não fracionada paraser administrada a um indivíduo através de uma suspensãocelular compreendendo 5-15 Ul/ml, preferentemente 8-12Ul/ml, mais preferentemente 10 Ul/ml ou por administração porvia intravenosa a 10-30 Ul/kg/h, preferentemente de 15-25Ul/kg/h, mais preferentemente, 20 UI/kg/h; e/ou - o inibidor de trombina é bivalirudina para ser administradaa um indivíduo entre 0,50 e 3,00 mg/kg de peso corporal.
13. A combinação ou composição farmacêutica para utilizaçãode acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, em que(a) uma composição que compreende uma suspensão celular dascélulas numa solução aquosa contendo o pelo menos um ativadorde antitrombina deve ser preparada; (b) uma solução aquosacontendo o pelo menos um inibidor de trombina é deve serpreparada; e (c) a composição tal como definida em (a) e asolução tal como definida em (b) devem ser administradassimultaneamente, separadamente ou sequencialmente a umindivíduo.
14. Um método para a inibição in vitro da atividadepró-coagulante de células selecionados a partir do grupo queconsiste em células progenitoras hepáticas adultas emiofibroblastos hepáticos, que compreende proporcionar umacombinação que compreende as ditas células, pelo menos umativador de antitrombina e pelo menos um inibidor de trombina,em que: - o ativador de antitrombina é selecionado a partir do grupoque consiste em heparina, heparina não fracionada, heparinade baixa massa molecular e fondaparinux; e - o inibidor de trombina é selecionado a partir do grupo queconsiste em bivalirudina e hirudina.
15. Um kit de partes ou de um artigo de fabrico que compreendea combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 7 e que compreende opcionalmente um ou mais excipientesfarmaceuticamente aceitáveis. 16. 0 kit de acordo com a reivindicação 15, em que: - As células, o pelo menos um ativador de antitrombina e opelo menos um inibidor de trombina são misturados; ou - As células, o pelo menos um ativador de antitrombina e opelo menos um inibidor de trombina estão contidos emrecipientes separados; ou - As células e o pelo menos um ativador de antitrombina estãoincluídos numa suspensão celular num recipiente separado deum recipiente contendo o pelo menos um inibidor de trombina.
17. Uma combinação que compreende pelo menos um ativador deantitrombina e pelo menos um inibidor de trombina, ou umacomposição farmacêutica compreendendo a dita combinação e umou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, parautilização no transplante de células selecionadas a partir dogrupo que consiste em células progenitoras hepáticas adultase miofibroblastos hepáticos; ou para utilização no tratamento de trombose ou complicações trombóticas causadas portransplante das ditas células; ou para utilização na inibiçãoda atividade pró-coagulante das ditas células in vivo, em que: - 0 ativador de antitrombina é selecionado a partir do grupoque consiste em heparina, heparina não fracionada, heparinade baixa massa molecular e fondaparinux; e - 0 inibidor de trombina é selecionado a partir do grupo queconsiste em bivalirudina e hirudina.
18. A combinação ou composição farmacêutica para utilizaçãode acordo com a reivindicação 17, incluindo ainda o elementoou elementos caracterizantes tal como definidos em qualquer umadas reivindicações 2 a 9, 12 ou 13.
19. Um método para a inibição in vitro da atividadepró-coagulante de células selecionadas a partir do grupo queconsiste em células progenitoras hepáticas adultas emiofibroblastos hepáticos que compreende colocar as ditascélulas em contacto com uma combinação que compreende pelomenos um ativador de antitrombina e pelo menos um inibidor detrombina, em que: - 0 ativador antitrombina é selecionado a partir do grupo queconsiste em heparina, heparina não fracionada, heparina debaixa massa molecular e fondaparinux; e - 0 inibidor de trombina é selecionado a partir do grupo queconsiste em bivalirudina e hirudina.
20. O método de acordo com a reivindicação 14 ou 19, em queas células progenitoras hepáticas adultas são célulasprogenitoras ou estaminais derivadas de fígado adulto queexpressam alfa-actina de músculo liso (ASMA) e albumina (ALB)e não expressam citoqueratina-19 (CK-19) ou são célulasprogenitoras pluripotentes derivadas de fígado humano adulto,não ovais que expressam marcadores celulares hepáticos e quesão capazes de se diferenciar em células hepáticas maduras, células produtoras de insulina, células osteogénicas e célulasepiteliais, ou são células progenitoras pluripotentesderivadas de fígado humano adulto, não ovais que expressammarcadores celulares hepáticos e que são capazes de sediferenciar em células hepáticas maduras, células produtorasde insulina, células osteogénicas e células endoteliais.