NO326833B1

NO326833B1 - Stamme av bakterier av arten Lactobasillus paracasei underart paracasei, preparat for anvendelse i naeringsmidler og produkt inneholdende stammen

Info

Publication number: NO326833B1
Application number: NO20002919A
Authority: NO
Inventors: Torkel Wadstrom; Per Aleljung; Ulla Svensson; Rangne Fonden
Original assignee: Arla Foods Ab
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 2000-06-07
Publication date: 2009-02-23
Also published as: DE69833691D1; HUP0100428A3; SE9704577L; HU228050B1; JP2001526024A; EP1036160B1; NO20002919L; DE69833691T2; JP4247458B2; CA2313245A1; CZ300143B6; AU1896899A; EE04724B1; SE9704577D0; WO1999029833A1; DK1036160T3; NO20002919D0; ATE318889T1; PL341010A1; EP1036160A1

Description

STAMME AV BAKTERIER AV ARTEN LACTOBASSILLUS PARACEI UNDERART PARACASEI, PREPARAT FOR ANVENDELSE I NÆRINGSMIDLER 06 PRODUKT INNEHOLDENDE STAMMEN.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en stamme av Lactobacillus paracasei underart paracasei, et preparat derav for anvendelse i næringsmidler såvel som et produkt som inneholder nevnte stamme.

Definisjon og karakterisering av stammen

Den nye stammen (som i det etterfølgende for enkelhets skyld vil bli betegnet LMG P-17806) er en variant av arten Lactobacillus paracasei underart paracasei. Den har egenskapene til arten med et GC-innhold på 44 %. LMG P-17806 er blitt isolert fra prøver fra gastrointestinal-mikrofloraen i mennesker. LMG P-17806 har en Gram-positiv, homofermenta-tiv stavformet bakterie. Den produserer L-melkesyre (venstredreiende stereoisomer av melkesyre) og vokser optimalt ved 37 °C. Stammen er kjennetegnet ved at den er tolerant in vitro overfor saltsyre og magesaft ved å tolerere gallesalter uten dekonjugering derav og ved at den har stor evne til å assimilere kolesterol. Stammen er også kjennetegnet ved at den inneholder tre plasmider med størrelser på henholdsvis 2,2, 4,36 og 9,1 Kb. Andre egenskaper er at stammen fermenterer ribose, adonitol, galaktose, glukose, fruktose, mannose, sorbose, mannitol, sorbitol, N-acetyl-glukosamin, esculin, cellobiose, maltose, laktose, sakkarose, trehalose, inulin, melezitose, D-turanose og D-tagatose. På den annen side fermenterer den ikke glycerol, erytritol, D-og L-arabinose, D- og L-xylose, (5-metyl-D-xylosid, rhamnose, dulcitol, inositol, a-metyl-D-mannosid, a-metyl-D-glukosid, amygdalin, arbutin, salicin, melibiose, raffinose, stivelse, glykogen, xylitol, gentiobiose, D-lyksose, D- og L-fukose, D-og L-arabitol og 2- og 5-ketoglukonat.

Stammen er blitt kjennetegnet ved SDS gelelektroforese, hvor den er blitt sammenlignet med seks andre stammer av

Lactobasillus paracasei underart paracasei. I denne sammenligning er den blitt vist til å avvike fra alle andre beskrevne stammer og samtidig, når den sammenlignes med andre lactobacilli, synes den å tilhøre den designerte art. Den er også blitt karakterisert med hensyn til ribosom-RNA i en såkalt Riboprinter. Med denne metoden er stammen blitt vist til å ha 76 % likhet med typen stamme for Lactobasillus paracasei underart paracasei og '72 % likhet med typen stamme av Lactobasillus casei analysert ved den samme anledning.

Stammen er blitt deponert ved Belgian Coordinated Collections of Microorganisms - BCCM, LMG collection, og er blitt gitt deponeringsnr. LMG P-17806.

Fordelene med stammen

LMG P-17806 har, sammenlignet med kjente stammer av Lactobasillus, avgjørende fordeler ved bruk som probiotika i næringsmidler og naturopatiske medisiner ved en unik kombinasjon av gode egenskaper, -stammen har god resistens overfor magesaft og gallesalter, men til forskjell fra en rekke andre stammer dekonjugerer den ikke gallesaltene,

-den har stor evne til å assimilere kolesterol,

-stammen klarer godt passeringen gjennom magen,

-stammen har en innvirkning på forholdene i tykktarmsmodellen ved å øke produksjonen av melkesyre deri, -stammen er ikke mer pro-inflammatorisk enn vanlige yoghurtbakterier, -stammen forhindrer at tarmceller invaderes av patogene mikroorganismer, som Salmonella typhmurium, -stammen har en antagonistisk virkning mot den gastriske ulcusbakterien Helicobacter pylori, -stammen danner bakteriociner som er aktive mot clostridiumbakterier, -stammen overlever godt i melk såvel som i frossen og tørket form,

stammen har, til forskjell fra de fleste andre lactobacilli, en gunstig innvirkning på smaken av fermenterte melkeprodukter (gir ingen bismak).

Den foreliggende stamme av Lactobasillus paracasei underart paracasei kan anvendes som en tilsetning til næringsmidler eller som naturopatisk medisin, såkalt "Medical Food", eller som en tilsetning til naturopatisk medisin

Slike medisiner kan anvendes for barn med det formål å lindre atopiske problemer, for eldre personer for å korrigere endret mikroflora bevirket ved normale aldersforandringer eller en endret sekresjon av saltsyrer, og for personer generelt for å normalisere tarmfloraen, idet innholdet av clostridiumbakterier avtar, lactobacilli og bufidobakterier øker og høye innhold av koliforme bakterier er redusert

Ved hjelp av disse egenskaper avviker stammen LMG P-17806 fra de tidligere kjente stammer, som vil bli vist i de etterfølgende eksempler

Fremstilling av stammen

Stammen fremstilles på vanlig måte for lactobacilli Et substrat egnet for lactobacilli anvendes Dette substratet bør for eksempel inneholde minst ett av karbohydratene som stammen kan fermentere i henhold til det som er angitt i det foregående, i kombinasjon med proteiner, vitaminer, mineraler og andre næringsstoffer som normalt kreves av lactobacilli. Eksemler på passende kommersielle substater er gjærekstrakt-glukosemedium, MRS (de Man-Rogosa-Sharpmedium), Rogosa, melk tilsatt en mindre mengde gjærekstrakt, osv Stammen dyrkes mikroaerofilt eller i fullstendig fravær av oksygen, passende ved en temperatur på mellom +15 °C og +42 °C. Dersom substratet er podet med 0,1 til 1 % poding er en dyrkmgstid på mellom 10 og 40 timer passende. Stammen kan om ønsket konsentreres ved sentrifugering eller filtrering hvoretter konsentratet vaskes for å fjerne dyrkingsmediet Konsentratet kan deretter fryses etter frysetørkes på vanlig måte. På denne måten kan preparater med mellom 100 millioner og 100 000 millioner levende bakterier LMG P-17806 per g fremstilles Et preparat kan deretter anvendes som sådan eller anvendes som en tilsetning til næringsmidler, f.eks til melk eller annet produkt som gir LMG P-17806 muligheten til å overleve og om ønsket til å vokse.

UNDERSØKELSER

A. Undersøkelse vedrørende passering av stammen gjennom

gas trom tes tinalkanalen.

LMG P-17806 ble dyrket på den måten som er beskrevet over og tilsatt sammen med yoghurtkultur til melk. Et fermentert produkt ble dannet ved å inkubere melken i 5 timer ved +42 °C Det ble oppnådd et velsmakende produkt som inneholdt godt og vel 100 millioner levende LMG P-178 0 6 per gram produkt. Friske personer ble gitt 3 x 200 g produkt daglig i en uke. Det totale inntak av LMG P-17806 var mellom 4 0 milliarder og 200 milliarder

Faecesprøver ble undersøkt før inntak, etter en ukes forbruk og en uke etter at inntaket hadde opphørt Som det fremgår fra tabellene 1 og 2 i det etterfølgende, ble det oppnådd en sterk økning i antallet laktobasiller i forsøksindividene To isolater per testmdivid ble klassifisert som to arter for hver anledning, dvs. totalt 20 isolater. 18 av isolatene for konsumpsjonstiden viste seg å bestå av LMG P-17806 i henhold til fenotypisk klassifikasjon Denne bakteriestammen ble ikke funnet i prøvene før eller etter inntaket av LMG P-17806. 1 gjennomsnitt var mholdene i faecesprøvene under tilførse-len svært høye og varierte kun moderat fra 63 millioner til 320 millioner per gram, dvs. med en faktor på 5 Innholdene var bemerkelsesverdig stort sett de samme, uavhengig av de innhold som ble målt før forsøkets start. Etter at tilførselen hadde opphørt gikk innholdene tilbake til det som synes å være naturlig for det aktuelle forsøksmdividet.

I tabellene 1 og 2 i det etterfølgende ble innholdet av lactobacilli i faeces bestemt i millioner per gram ved utplatmg og ved anvendelse av substratet Rogosa.

Undersøkelsen viser at stammen har god overlevelse ved passering gjennom gastromtestmalkanalen.

B. Undersøkelse som vedrører dannelsen av L-melkesyre ved

hjelp av stammen i en tykktarmsmodell

Det fermenterte produktet i det foregående ble tilsatt til en såkalt SHIME-reaktor som er en m vitro-modell av tarmen. Prøver ble tatt fra deler av reaktoren som svarer til de viktigste delene i tykktarmen. Tilsvarende sammenlignings-forsøk ble gjennomført med enkelte andre Lactobacillus-stammer, dvs nær beslektet med L. paracasei underart paracasei. Som det fremgår fra den etterfølgende tabell 3 gav LMG P-17806 en sterk økning i dannelsen av L-melkesyre, som er akkurat den melkesyreisomeren som dannes ved LMG P-17806 En dannelse av melkesyre betraktes som gunstig av en rekke grunner, bl.a. under betraktning av den antibakteri-elle effekten til melkesyren såvel som det faktum at en lavere pH antas å redusere tilgjengeligheten og dannelse av nitrogenforbindelser.

I tabellen refererer "L" til den venstredreiende isomeren av melkesyre og "D" til den høyredreiende isomeren.

Reaktor 4 svarer til den øvre delen av tykktarmen, reaktor 5 til den midtre delen og reaktor 6 til den nedre delen av tykktarmen. Undersøkelsen viser at stammen danner L-melkesyre i tykktarmsmodellen. C. Undersøkelse vedrørende hvordan stammen beskytter tarmepxtelceller fra invasjon av Salmonella typhimurium.

Tarmepitelceller av typen CaCo-2-celler ble dyrket in vitro.

Disse ble tilsatt en kombinasjon av lactobacilli og Salmonella typhimurium i forholdet 100-1 med tilsetning av 1 million salmonella per ml Effekten ble undersøkt etter inkubasjon i 2 0 minutter ved 37 °C. Mengden invaderende salmonella ble bestemt ved å vaske platene med adhererende CaCo-2-celler tre ganger De adhererende celler ble behandlet med antibiotikumet gentamycin i en konsentrasjon på 100 mg/ml i en time for å drepe alle bakterier som ikke hadde invadert celler. Deretter ble platene vasket med PBS for å fjerne alt gentamycin og til slutt ble de fangede bakterier frigitt ved å behandle CaCo-2-cellene med 0,1 % Triton-X under rysting Antallet salmonella ble deretter bestemt ved vanlig utplatingsmetodologi LMG P-17806 hadde en utpreget effekt ved at den reduserte antall invaderte celler. Den nær beslektede paracasei-varianten 506 synes på den annen side heller å stimulere invasjonen av salmonellabakterier. Også med hensyn til denne egenskapen viste LMG P-17806 en positiv effekt. Resultatene er angitt i den etterfølgende tabell 4.

Tabellen viser at stammen LMG P-17806 gir en markert beskyttelse mot invasjon av salmonellabakterier. D. Undersøkelse vedrørende beskyttelse mot Helxcobacter pylon.

I en musemodell hvor musene var blitt infisert med Helicobacter pylon ble virkningen av tilførsel av et fermentert melkeprodukt med en stamme av LMG P-17806, på den ene side, og uten nevnte stamme, på den annen side, på innholdet av H.

pylon målt i faeces undersøkt

Musene ble infisert med 10 0 millioner av stammen H Pylori 17874 i helisk form ved tre anledninger med et intervall på ett døgn. Deretter fikk musene eksperimentelle produkter og innholdet av H pylori i faeces ble målt ved hjelp av hepanniserte magnetkuler og Enzyme Immuno Assay. Tre produkter ble undersøkt Alle de fermenterte melkeprodukter syntes å redusere andelen H. pylon, men effekten forekom betydelig raskere i de tilfeller hvor produktet inneholdt LMG P-17806 sammenlignet med henholdsvis vanlig yoghurt og med en stamme av L fermentum KLD.

Tallene i tabellen angir absorbansen med 4 05 nm og er relative innhold.

E. Undersøkelse av xnnvxrknxngen av stammen LMG P-17806 på

immunforsvaret.

Immunforsvarsystemet kontrolleres ved en rekke signalsubstan-ser, såkalte cytokmer Noen av disse kan være protem-flammatoriske Innvirkningen av LMG P-17806 på dannelsen av cytokiner TNF-alfa og IL-6 ble sammenlignet med innvirkningen av to arter inneholdt i en yoghurtkultur, L. delbruckei underart bulgaricus og Streptococcus thermophilus Leukocytter ble separert fra humant blod og tilsatt til levende bakterier eller bakterier drept med glutaraldehyd i en mengde på 10 millioner leukocytter. Som kontroll ble lipopolysakka-rider (LPS) fra E. coil anvendt. Resultatene er angitt i den etterfølgende tabell 6. Resultatene viser at LMG P-17806 har de samme inflammatoriske egenskaper som vanlig yoghurtkultur i den anvendte modellen.

F. Undersøkelse av motstanden hos stammen LMG P-17806 mot

antibiotika

Probiotika kan være nyttige for bruk i forbindelse med lidelser som gjelder balansen i tarmfloraen under medisinering med antibiotika. Samtidig er det viktig at probiotika ikke bidrar til å spre motstand mot antibiotika, og dette er særlig viktig ved den samtidige bruk av probiotika og antibiotika. Motstanden hos stammen LMG P-17806 mot forskjellige antibiotika er blitt etablert av denne grunn. Sensitiviteten hos stammen LMG P-17806 overfor ulike antibiotika ble bestemt ved å etablere det innhold hvorved en reduksjon i veksten av stammen på 50 %, som målt ved optisk tetthet, ble oppnådd.

Det fremkom at stammen LMG P-17806 var resistent mot vankomycin og ble ikke inhibert selv ved 256 mg/l Stammen viste noe resistens mot trimetoprim og cefotaxim, idet en optisk tetthet (OD) på 50 % ved henholdsvis 12 og 4 mg/l ble oppnådd. Stammen LMG P-17806 var på den annen side sensitiv overfor klorafenikol, erytromycin, rifampicin og tetracyklin, hvor allerede nivåer under 1 mg/l resulterte i en mhibering av veksten på 50 %

Påvirkningen av antibiotika ble også undersøkt som en oversikt ved anvendelse av såkalte Sensi discs fra Oxoid I henhold til disse resualtater var LMG P-17806 resistent overfor aztreonam, ceftaximid, cefoxitm, colistmsulfat, kanamycin, polymyxin B, streptomycin og vancomycin

LMG P-17806 kan således, i henhold til disse resultater være særlig interessant for anvendelse samtidig som terapi med antibiotika slik som vancomycin, trimetoprim såvel som en rekke cefloxaciner, som alle er antibiotika med kjente bivirkninger på tarmfloraen og tarmfunksjonen.

ANVENDELSE AV STAMMEN LMG P-17806

Eksempel 1

Fremstilling av bakteriekonsentrat

Et frossent bakteriekonsentrat med 10 milliarder LMG P-17806 per gram ble fremstilt på den måten som er angitt i det foregående ved å dyrke lactobacilli i et nærmgssubstrat tilsatt 1 g gjærekstrakt per liter ved en konstant pH på 5,5 i 14 timer ved 3 6 °C. Bakteriene ble separert ved sentrifugering med kontinuerlig vasking av sentrifugatet. Sentrifugatet ble frosset i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 °C inntil bruk.

Eksempel 2

Fremstilling av fermentert melkeprodukt

Et melkeprodukt ble fremstilt fra melk ved å homogenisere melken, varmebehandling derav ved +95 °C i 5 minutter og med temperering til +37 °C Melkeproduktet ble podet med 0,01 % av en kommersiell frossen yoghurtkultur og 0,5 % av LMG P-17806-konsentratet. Kulturen fikk vokse i 6 timer ved den angitte temperatur Melken hadde da koagulert og pH avtatt til 4,55. Den koagulerte form ble nedbrutt og produktet avkjølt til +12 °C hvoretter det ble pakket i vanlige plastkopper som normalt anvendes for yoghurt og etteravkjølt i et kjølerom ved en temperatur på +5 °C i en dag og en natt. pH hadde deretter falt til 4,4. Produktet ble deretter lagret ved +8 °C i opptil 3 uker.

Innholdet av stammen LMG P-17806 ble målt og som det fremgår fra resultatene i den etterfølgende tabell 7 var der en begrenset vekst av stammen LMG P-17806 under dyrkingen og LMG P-17806 overlevde lagring i tre uker ved pH under 4,4 svært godt.

Inneholdene er gitt i millioner per gram

Produktet hadde et normalt utseende med en separasjon av valle på knapt 1 % etter lagring i fjorten døgn Produktet smakte utmerket og hadde ensartet konsistens og en frisk, mild aroma Testproduktet fikk bedre bedømmelser enn normal yoghurt i en uavhengig forbrukerundersøkelse gjennomført ved et forskningsinstitutt. Produktet ble sammenlignet i en for-brukerundersøkelse , hvor forsøkspersonene ikke visste hvilket produkt man smakte på, sammen med tilsvarende produkter uten stammen LMG P-17806. Produktet med LMG P-17806 var foretrukket av 74 % av personene i forsøkspanelet, og det mottok en gjennomsnittsverdi på 7,6 i en skala på 9, som er signifikant høyere enn resultatet for vanlig yoghurt Bedømmelsen var noe mer enn 1 punkt høyere enn en tidligere kjent probiotisk kultur med Lactobasillus acidophilus. Resultatene avviker også fra dem som ble oppnådd ved sammenligning mellom henholdsvis ren yoghurt og de blandede produkter av yoghurt og de probiotiske bakterier Lactobasillus acidopfilus og Bifidobacterium longum Ingen signifikante forskjeller kunne ses mellom ren yoghurt og det respektive blandede produkt i disse sammenligninger

Eksempel 3

Passende tilsetning av stammen LMG P-17806

Forsøk ble også gjennomført for å finne ut det passende

område med hensyn til tilsetnig av stammen LMG P-17806. Melk ble behandlet og deretter ble yoghurtkultur tilsatt i henhold til det foregående, mens tilsetning av konsentrat av stammen LMG P-17806 ble variert fra 5 % til 0,01 %. Ved et slikt høyt innhold som 5 % poding av LMG P-17806 ble det oppnådd en bismak, som sannsynligvis stammet fra komponenter i selve podingen. Forandringen i pH var imidlertid normal og produktets utseendevar normalt Innholdet av LMG P-17806 i nylaget produkt var 504 millioner per gram og innholdene forble på dette nivået under lagringen. Ved tilsetning av 0,01 % LMG P-17806 konsentrat kunne produktet ikke skjelnes sensorisk fra vanlig yoghurt og innholdet av LMG P-17806 var allerede etter en uke mindre enn 1 million per ml, som er det

laveste innhold et produkt må inneholde for at det skal være tillatt å angi at produktet inneholder et spesifikt probiotika i henhold til forslag til internasjonal lovgivning.

Eksempel 4

Fremstilling av fermentert spesialprodukt

Forsøket ble gjennomført som over med unntak av at melken også fikk tilsatt 0,4 g gjærekstrakt per liter Podingen ble utført med 0,01 % av den samme yoghurtkultur som over, men kun 0,1 % LMG P-17806 konsentrat ble tilsatt. Inkubasjonen ble gjennnomført ved +34 °C i 8 timer hvoretter prosessen ble avbrutt og produktet avkjølt, pakket og lagret som i eksempel 3 i det foregående. LMG P-17806 vokste ti ganger under disse betingelser og tilsvarende som angitt i det foregående overlevde bakteriene godt under lagring. Resultatene er angitt i

tabellen i det etterfølgende

Innholdene i tabellene er gitt i millioner per gram produkt.

Produktet hadde et normalt utseende med en separasjon av valle på 1,5 % etter lagring i 14 døgn Produktet hadde en god, tørr aroma og homogen konsistens.

Eksempel 5

Fremstilling av vegetabilsk juice inneholdende stammen

LMG P-17806

En vegetabilsk juice ble fremstilt ved å blande gulrotkonsen-trat og et appelsinsaftkonsentrat i like deler slik at pH i sluttblandingen ble pH 3,9. Den blandede drikkevare ble varmebehandlet og tilsatt henholdsvis 1 % og 0,1 % LMG P-17806 konsentrat. Innholdet av LMG P-17806 ble henholdsvis 100 og 10 millioner per ml. Drikkevarene ble lagret ved +7 °C i fire uker Produktets aroma ble ikke påvirket og ingen innvirkning av lagring eller tilsetning av LMG P-17806 ble observert. Tilsetning av LMG P-17806 til et innhold som overskrider 50 millioner synes imidlertid å redusere nedgangen i vitamin C I et produkt uten LMG P-17806, som produktet med 10 millioner bakterier per ml, avtok innholdet av vitamin C fra 25mg/100g før lagring til 18mg/100g etter fire uker. Med tilsetning av 100 millioner LMG P-17806 per ml avtok vitamin C-mnholdet kun til 22mg/100g, dvs en mer enn 50 % mindre nedgang i vitamin C-mnholdet. LMG P-17806 overlevde godt og innholdet av LMG P-17806 etter fire uker var kun rundt 40 % mindre enn i nylaget produkt uavhengig av den tilsatte mengde

I et annet forsøk fikk den samme fruktdrikk tilsatt 5 %

LMG P-17806 Dette gav en bismak som ble verre under lagring.

Eksempel 6

Fremstilling av vellingpulver ("Pap-Powder").

Vellingpulver produseres på vanlig måte. LMG P-17806 konsentrat i henhold til det ovennevnte frysetørkes etter blanding med maisstivelse og lagres etter pakking i en oksygentett emballasje ved en temperatur på -2 0 °C. Det frysetørkede preparatet inneholdt 61 milliarder LMG P-17806 per gram Vellingpulveret ble tørrblandet med 0,03 % LMG P-17806 og pakket i en atmosfære av nitrogengass i en oksygentett emballasje Pulveret ble først lagret i tre måneder ved +12 °C og deretter ved romtemperatur i ytterligere fire måneder Innholdet av LMG P-17806 fremgår klart fra den etterfølgende tabell 9 Vellingpulveret gav gode muligheter for overlevelse med hensyn til LMG P-17806 og det er derfor mulig å fremstille f eks barnematprodukter med et høyt innhold av LMG P-178 06

Innholdet i den ovennevnte tabell er gitt i millioner per gram pulver

Vellingpulveret ble oppløst i 9 deler vann ved +50 °C og innholdet av LMG P-17806 ble bestemt Innholdet var 1 million LMG P-17806 per ml drikkevare i det tilfellet hvor et seks måneder gammelt pulver ble anvendt Vellmgproduktet kunne ikke skjelnes fra et vanlig produkt. Etter lagring i en natt ved romtemperatur smakte imidlertid vellmgproduktet med LMG P-17806-tilsetnmg lett surt og hadde en pH på 5,7.

I et annet forsøk ble effekten av tilsetning av henholdsvis

1 % og 0,001 % frysetørket LMG P-17806-preparat undersøkt Innholdene derav i vellingpulveret etter tilsetning var henholdsvis 570 og 0,8 millioner per gram

Pulverne ble lagret på en tilsvarende måte og undersøkt etter lagring i 5 måneder. Etter oppløsning som i det foregående var innholdet i det fremstilte vellmgproduktet 800 millioner, for den lave tilsetningen henholdsvis mindre enn 10 000 per ml. Med den høye tilsetningen ble en lett sur aroma registrert allerede etter lagring i 4 timer av vellmgproduktet ved kroppstemperatur

Eksempel 7

Fremstilling av tørket pulver for anvendelse som "medisinsk ernærm<g>smiddel" .

Et frysetørket LMG P-17806 konsentrat ble blandet med forskjellige mengder maisstivelse i mengdeandelene på henholdsvis 1-1, 1:9, l 99 og 1:999. De blandede pulvere ble lagret i små poser med 1 til 100 g per pose Materialet i posene var tett med hensyn til oksygen og vanndamp. Posene ble lagret i henholdsvis fryser, kjølerom og ved romtemperatur Innholdet ble deretter anvendt som et additiv til en drikkevare ved å blande pulveret med drikkevaren før drikkevaren konsumeres Tilsvarende overlevelse som i eksempel 6 i det foregående ble oppnådd Pulveret med mengdeandelsen 1:1 ble også pakket i gelatmkapsler med 0,4 g per kapsel. Antall bakterier per kapsel var 10 milliarder. Kapslene ble vakuumpakket i et materiale med gode isolerende egenskaper overfor oksygen og vanndamp. Kapslene ble lagret på samme måte som angitt i det foregående og tilsvarende gode overlevelsesresulater ble oppnådd

Eksempel 8

Fremstilling og bruk av bakterieblandinger

LMG P-17806 kan blandes med andre lactobacilli uten å

inhibere dem. LMG P-17806 synes ikke å danne noen substanser som inhiberer andre lactobacilli eller lactococci hvor LMG P-178 06 ko-kultiveres med yoghurtkulturer, kulturer av surmelk med lactococci eller andre lactobacilliarter som L. acidophilus, L. fermentum eller L. rhamnosus Forsøk med blandinger av frysetørkede preparater som inneholder alle disse tre bakterier har indikert uforandrede lagringsegen-skaper enten blanding ble utført med maisstivelse eller med vellingpulver. Etter oppløsning av vellingpulveret og en lagring i 12 timer ved kroppstemperatur og 12 timer ved romtemperatur kunne ingen negativ innvirkning av LMG P-17806

spores, verken på det totale innholdet av lactobacilli eller på innholdet av noen av bakteriene.

I et forsøk for å fremstille probiotisk surmelk ble 0,5 % surmelkskultur og 0,6 % frysetørket konsentrat av hver av L. acidophilus NCFB 1748, L fermentum KLD og LMG P-17806 tilsatt til normalt behandlet konsummelk. Kun 0,1 % KLD ble imidlertid tilsatt, fordi høyere tilsetninger førte til bismak og til et uønsket koagel Melk ble lagret i 19 timer ved romtemperatur Da var pH i melken 4,50. Melken ble avkjølt til +10 °C, pakket og lagret ved +6 °C eller opptil 14 døgn Resultatene fremgår klart fra den etterfølgende tabell 10

Innholdene er i millioner per ml av de forskjellige bakterier.

80 friske forsøksmdivider ble gitt produktene for spising i forbindelse med en konferansereise til Istanbul i Tyrkia. Gruppen ble delt i to, én som spiste en surmelk i henhold til det overnevnte med kun LMG P-178 06 mens den andre spiste probiotisk surmelk med tre forskjellige prebiotiske stammer Forsøksindividene var på konferansestedet i 8 døgn. De begynte å spise produktene to døgn før avgang til konferansestedet og fortsatte å spise dem i fire døgn etter at de kom hjem Produktene ble spist som 3 snacks som var jevnt for-delt i løpet av dagen med 150 g/måltid. Alle forsøksmdivid-ene unntatt to personer i surmelksgruppen erklærte at de spiste produktet i henhold til planen I en undersøkelse ble de spurt om å angi ubehag i gastrointestmalkanalen i form av magesmerter, spenninger, diaré eller forstoppelse på en tredelt skala. Bortsett fra diaré var der så langt en forskjell at 5 % av forsøksindividene som kun hadde spist LMG P-17806 angav at de hadde hatt alvorlig eller svært alvorlig diaré i løpet av minst to døgn mens denne forekomst var kun 22 % i gruppen som spiste den probiotiske surmelken

Det synes således som om en blanding av flere ulike lactobacilli kan være enda mer effektiv enn kun en enkel bakterie-stamme. Dette kan skyldes det faktum at de administrerte lactobacilli hadde ulike egenskaper.

Claims

1. Stamme av Lactobacillus som er en Gram-positiv, homofermenterende, stavformet bakterie som er i stand til å danne L-melkesyre, og hvis stamme er anvendbar som probiotika i næringsmidler og naturopatiske medisiner og som in vitro er resistent overfor saltsyrer og magesafter og tolererer gallesalter uten å dekonjugere dem, mens en sterk assimilering derav forekommer, som har stor evne til å assimilere kolesterol og som har god overlevelse ved passering gjennom magen og gastrointestinalkanalen og hvis stamme vokser optimalt ved omtrent 37 oC, karakterisert ved at stammen er Lactobacillus paracasei underart paracasei, har deponeringsnummer LMG P-17806, deponert ved The Belgian Coordinated Collections (BCCM/LMG) i henhold til Budapestkonvensjonen, hvis stamme inneholder tre plasmider med en størrelse på henholdsvis 2,2, 4,36 og 9,1 Kb.

2. Stamme som angitt i krav 1, karakterisert ved at den inneholder 44 % GC.

3. Stamme som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den er blitt isolert fra prøver fra gastrointestinal-mikrofloraen i mennesker.

4. Stamme som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at stammen fermenterer ribose, adonitol, galaktose, glukose, fruktose, mannose, sorbose, mannitol, sorbitol, N-acetyl-glukosamin, esculin, cellobiose, maltose, laktose, sakkarose, trehalose, inulin, melezitose, D-turanose og D-tagatose.

5. Stamme som angitt i krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at den er tilveiebragt som et konsentrat i form av et frossent eller frysetørket pulver.

6. Anvendelse af en stamme som angitt i ett eller flere av de foregående krav i næringsmidler og/eller som naturopatiske medisiner, karakterisert ved at stammen Lactobacillus paracasei underart paracasei er tilsatt til et melkeprodukt, et fermentert melkeprodukt, til fruktdrikker eller vegetabilske drikker som vegetabilsk juice, sitrusfrukt]uice eller juice fra en annen frukt eller plante i et innhold på mellom 0,001 % og 5 %, foretrukket mellom 0,01 % og 1 %.

7. Anvendelse af en stamme som angitt i ett eller flere av kravene 1-4 som et probiotika i næringsmidler og/eller naturo-patiske medisiner, karakterisert ved at stammen Lactobacillus paracasei underart paracasei i henhold til oppfinnelsen er kokultivert med yoghurtkulturer og surmelkskulturer med laktokokker eller andre lactobacillusarter som L. acidophilus, L. fermentum eller L. rhamnosus.

8. Anvendelse af en stamme som angitt i krav 6 eller 7, karakterisertvedat stammen Lactobacillus paracasei underart paracasei i henhold til oppfinnelsen er til stede i et innhold på mellom 1 million og 10 000 millioner levende bakterier per gram komposittprodukt.

9. Produkt inneholdende stammen Lactobacillus paracasei underart paracasei som angitt i ett eller flere av kravene 1-5, karakterisert ved at' produktet omfatter et melkeprodukt, et fermentert melkeprodukt, en vegetabilsk drikk eller fruktdrikk eller vellingpulver som alle inneholder stammen Lactobacillus paracasei underart paracasei i et innhold på 5 x IO<5> - 5 x IO<9>, vanligvis 1 x IO<5> - IO<9> levende bakterier per g produkt, svarende til 0,0005 - 0,5 % av produktet, eller en konsentrert naturopatisk medisin hvor stammen Lactobacillus paracasei underart paracasei er til stede i et innhold på 1000 til 100 000 millioner levende bakterier per g produkt svarende til 0,001 - 100 % av produktet.

10. Produkt som angitt i krav 9 inneholdende det angitte innholdet av bakterier, karakterisert ved at, i tilfellet av næringsmiddelprodukter, inneholder det ytterligere en liten mengdeandel, f.eks. 0,001 - 0,1 %, gjærekstrakt eller andre substanser som bidrar til vekst eller overlevelse av Lactobacillus paracasei underart paracasei i produktet, og at, i tilfellet av naturopatiske medisiner, inneholder det substanser som er viktige for overlevelsen til bakteriene og/eller rester av kultursubstratet.

11. Produkt som angitt i krav 9 eller 10, karakterisert ved at stammen Lactobacillus paracasei underart paracasei er tilveiebragt som et konsentrat i en frossen eller frysetørket tilstand for blanding inn i et melkeprodukt, et fermentert melkeprodukt, en vegetabilsk drikk eller en fruktdrikk, i vellingpulver eller i en konsentrert naturopatisk medisin før produktet konsumeres.

12. Produkt inneholdende en stamme av Lactobacillus paracasei underart paracasei som angitt ett eller flere av kravene 1-5, karakterisert ved at den anvendes for barn for det formål å lindre atopiske problemer, for eldre personer for å korrigere endret mikroflora bevirket ved normale forandringer på grunn av alder eller en endret sekresjon av saltsyrer, og for personer generelt for å normalisere tarmfloraen i hvilket tilfelle innholdet av clostridiabakterier er avtagende, bifidobakterier er økende og høye innhold av koliforme bakterier er avtagende.