NL9000622A

NL9000622A - Analytical cytology system for detection of small particles - uses systems for illumination, detection, focussing and image forming

Info

Publication number: NL9000622A
Application number: NL9000622A
Authority: NL
Original assignee: Jan Greve Universiteit Twente
Priority date: 1990-03-17
Filing date: 1990-03-17
Publication date: 1991-10-16

Abstract

The illumination system uses a coherent light source, e.g. an argon ion laser, and a microscope lens assembly. The detection system which also uses the microscope lens, can detect several fluorescing colourings at various wavelengths, as well as scattered light signals. An X-Y positioning system with two stepper motors is used in the scanning system which determines the positions of the particles. The optical focussing and tracking system uses a contactless infra-red light technique. A confocal laser scanning microscope is used for forming an image.

Description

Voortbrengsel voor het detecteren van permanent geordende kleine deeltjes.Product for detecting permanently ordered small particles.

Gebruikte referenties: CI3 B.G. de Grooth, T.H. Geerken, and J. GreveReferences used: CI3 B.G. de Grooth, T.H. Geerken, and J. Greve

The cytodisk: a cytometer based upon a new principle of cell alignment. Cytometry 6:226-233 (1985)The cytodisk: a cytometer based upon a new principle of cell alignment. Cytometry 6: 226-233 (1985)

SamenvattingSummary

De uitvinding betreft een voortbrengsel voor het detecteren van kleine deeltjes- in het bijzonder maar niet uitsluitend biologische cellen- met als bijzonderheid dat gebruik wordt gemaakt van permanente ordening van de te detecteren deeltjes op een objectdrager alsvorens tot detectie over te gaan. De permanente ordenening van de deeltjes -in het bijzonder maar niet alleen op een aantal parallele rechte lijnen- maakt het mogelijk de deeltjes ten eerste efficiënt te detecteren omdat de plaatsen waar de deeltjes zich bevinden bekend zijn en ten tweede om een of meerdere keren achter elkaar precies dezelfde deeltjes of subpopulaties daarvan in precies dezelfde of een andere volgorde te detecteren. Om de voordelen van de permanente ordening te benutten is een apparaat uitgevonden dat objectdragers met daarop geordende deeltjes kan uitlezen.The invention relates to a product for the detection of small particles - in particular, but not exclusively biological cells -, with the special feature that permanent arrangement of the particles to be detected on an object carrier is used before proceeding with detection. The permanent arrangement of the particles - in particular but not only on a number of parallel straight lines - makes it possible to detect the particles efficiently firstly because the places where the particles are located are known and secondly one or more times in a row detect exactly the same particles or subpopulations thereof in exactly the same or different order. In order to utilize the advantages of the permanent arrangement, a device has been invented that can read object carriers with arranged particles on them.

Kenmerkend voor het apparaat zijn de aanwezigheid van een belichtingssysteem, een detectiesysteem, een scansysteem , een (niet noodzakelijkerwijs actief) focusseer— en volgingssysteem en (niet noodzakelijkerwijs) een beeldvormend systeem.Characteristic of the device are the presence of an exposure system, a detection system, a scanning system, a (not necessarily active) focusing and tracking system and (not necessarily) an imaging system.

Opsomming bijlagen: figuur 1. tekening van de uitvinding.List of attachments: figure 1. drawing of the invention.

figuur 2. tekening van de focus- en volg detector.figure 2. drawing of the focus and tracking detector.

figuur 3. tekening van de focusmotor.figure 3. drawing of the focus motor.

De uitvinding heeft betrekking op een apparaat dat op een objectdrager permanent geordende deeltjes op efficiënte wijze kan detecteren. De voordelen van en een aantal procedures voor het permanent ordenen van deeltjes op een objectdrager worden beschreven in een separate patentaanvraag van dezelfde uitvinders. De uitvinding heeft met name maar niet uitsluitend betekenis voor het veld van de analytische cytologie.The invention relates to an apparatus which can efficiently detect permanently ordered particles on an object carrier. The advantages of and a number of procedures for the permanent ordering of particles on an object carrier are described in a separate patent application from the same inventors. The invention has particular but not limited significance for the field of analytical cytology.

De uitvinding maakt gebruik van objectdragers met daarop permanent geordende deeltjes. Deze deeltjes zullen meestal -maar niet altijd- zijn geordend op een aantal parallele rechte lijnen door het toepassen van naar beneden toe taps toelopende groeven op welks bodem de deeltjes worden verzameld. Voor het accuraat detecteren van de eigenschappen van de deeltjes zijn een aantal subsystemen noodzakelijk die achtereenvolgens zullen worden besproken.The invention uses object carriers with permanently arranged particles thereon. These particles will usually - but not always - be arranged on a number of parallel straight lines by the use of tapered grooves on the bottom of which the particles are collected. Accurately detecting the properties of the particles requires a number of subsystems that will be discussed successively.

1. Een belichtingssysteem dat zorg draagt voor de mogelijkheid optische signalen te ontlenen aan de te onderzoeken deeltjes. Met name -maar niet uitsluitend—kan hier worden gedacht aan een al dan niet gefocusseerde laserbundel of bundels of aan licht uit een niet-coherente bron.1. An illumination system that ensures that optical signals can be derived from the particles to be examined. In particular - but not exclusively - one can think here of a focused or unfocused laser beam or beams or of light from a non-coherent source.

2. Een detectiesysteem dat zorg draagt voor het verzamelen van de door het belichtingssysteem en de deeltjes veroorzaakte optische signalen. Met name -maar niet uitsluitend -kan hier worden gedacht aan een lichtverstrooiingssysteem of een fluorescentiesysteem. Ook de voor het omzetten van de optische signalen in electrische signalen noodzakelijke componenten en de daarop volgende opslag, representatie en verwerking van de electrische signalen middels een computer warden onder het detectiesysteem gevat.2. A detection system that collects the optical signals caused by the exposure system and the particles. In particular - but not exclusively - one can think of a light scattering system or a fluorescent system. The components necessary for converting the optical signals into electrical signals and the subsequent storage, representation and processing of the electrical signals by means of a computer were also included under the detection system.

3. Een scansysteem waarmee de lijnen waarop de geordende deeltjes zijn verzameld kunnen worden afgetast zodat alle of een zeker aantal deeltjes in de loop van een meting worden belicht door het belichtingssysteem en - niet noodzakelijkerwijs tegelijkertijd- worden gedetecteerd met het detectiesysteem. Het scansysteem kan -hoewel dit niet noodzakelijk is- een positie-meetsysteem omvatten waarmee de positie van het belichtings- en/of detectiesysteem ten opzichte van de objectdrager kan warden gemeten. Dit systeem maakt het mogelijk de positie van een deeltje op een objectdrager te karakteriseren. Het scansysteem bevat -eveneens niet noodzakelijkerwijs- een inrichting voor het positioneren van een bepaald punt van de objectdrager ten opzichte van het belichtings- en/of detectie systeem.3. A scanning system by which the lines on which the ordered particles are collected can be scanned so that all or a certain number of particles are exposed in the course of a measurement by the exposure system and - not necessarily simultaneously - by the detection system. Although this is not necessary, the scanning system may comprise a position measuring system with which the position of the exposure and / or detection system relative to the object carrier can be measured. This system makes it possible to characterize the position of a particle on an object carrier. The scanning system also does not necessarily include a device for positioning a certain point of the object carrier relative to the exposure and / or detection system.

4. Een focus- en volg systeem dat zorg draagt voor een accurate focussering op en volging van de lijn waarop de deeltjes zijn geordend van het belichtings- en het detectiesysteem tijdens en voor en na het scannen van de lijnen. Dit focus- en volgsysteem kan passief zijn d.w.z dat de lijnen waarop de deeltjes zijn geordend zodanig recht zijn dat met een eenmalige afregeling van de stand van de objectdrager ten opzichte van het scansysteem per objectdrager kan worden volstaan om gedurende de meting van alle of een zeker aantal deeltjes zonder aanpassing van belichtings- of detectiesysteem een voldoende accurate meting te verrichten. Dit systeem zal bijvoorbeeld kunnen bestaan uit een plateau waarop de objectdrager wordt gefixeerd waarna het plateau kan worden uitgelijnd ten opzichte' van het scansysteem om tijdens het scannen voldoende accurate belichting en detectie te waarborgen. Het volgsysteem kan evenwel ook actief zijn in die zin dat tijdens het uitvoeren van een meting de belichting en de detectie worden aangepast. Dit kan gebeuren op basis van vooraf bepaalde informatie over de te verwachten afwijkingen in belichting en detectie, dwz een feedforward regeling, of op basis van actuele meting van de afwijkingen van detectie en belichtingssysteem tijdens een meting gevolgd door correctie van die afwijkingen in een •feedback systeem.4. A focus and tracking system that ensures accurate focusing and tracking of the line on which the particles are arranged from the exposure and detection system during and before and after scanning the lines. This focus and tracking system can be passive, ie the lines on which the particles are arranged are such that a one-off adjustment of the position of the object carrier relative to the scanning system per object carrier is sufficient to measure all or a certain amount during the measurement. number of particles without sufficiently adjusting the lighting or detection system to perform a sufficiently accurate measurement. This system may, for example, consist of a plateau on which the object carrier is fixed, after which the plateau can be aligned with respect to the scanning system in order to ensure sufficiently accurate exposure and detection during scanning. However, the tracking system can also be active in that the exposure and detection are adjusted during a measurement. This can be done on the basis of predetermined information about the expected deviations in exposure and detection, ie a feedforward control, or on the basis of actual measurement of the deviations of the detection and exposure system during a measurement followed by correction of those deviations in a feedback. system.

Ook is een combinatie van passieve en actieve volg- en focussering denkbaar.A combination of passive and active tracking and focusing is also conceivable.

51 Een beeldvormend systeem dat niet noodzakelijkerwijs aanwezig hoeft te zijn. Dit beeldvormende systeem bestaat uit een inrichting waarmee morfologische informatie kan worden verkregen over een of meerdere deeltjes. Onder dit systeem kan bijvoorbeeld worden verstaan een conventionele microscoop, een confocale laser scanning microscoop of een CCD-camera. Het systeem zal hoofdzakelijk worden gebruikt om na een meting van zekere eigenschappen van de permanent geordende deeltjes een klein aantal van deze deeltjes opnieuw te onderzoeken met met beeldvormende systeem. Hiertoe zullen de in eerste instantie gemeten posities van de in tweede instantie te onderzoeken deeltjes worden gebruikt om het scansysteem zodanig te positioneren dat de nader te onderzoeken deeltjes met het beeldvormend systeem kunnen worden onderzocht.51 An imaging system that does not necessarily have to be present. This imaging system consists of a device with which morphological information can be obtained about one or more particles. This system can be understood to mean, for example, a conventional microscope, a confocal laser scanning microscope or a CCD camera. The system will mainly be used to re-examine a small number of these particles with an imaging system after measuring certain properties of the permanently ordered particles. For this purpose, the initially measured positions of the particles to be examined in the second instance will be used to position the scanning system such that the particles to be examined can be examined with the imaging system.

De verhouding van de uitvinding ten opzichte van de stand van de techniek kan als volgt worden gekarakteriseerd.The relationship of the invention to the prior art can be characterized as follows.

In de cytologie zijn van de optische technieken naast de microscopie van belang voor het verkrijgen van informatie over deeltjes de beeldverwerking en de stromingscytometrie. In de beeldbewerking is er sprake van het analyseren van deeltjes middels bijvoorbeeld videocamera's of andere beeldvormende technieken. De deeltjes zijn hierbij niet geordend in bijvoorbeeld rechte lijnen en een objectdrager moet geheel worden afgezocht naar mogelijk interessante deeltjes. Daarnaast wordt voor zover ons bekend geen tweetraps analyse toegepast in de zin dat eerst een snelle analyse wordt gepleegd om een interessante subpopulatie van deeltjes te vinden die vervolgens met andere technieken nader worden onderzocht. Bij de onderhavige uitvinding hoeft slechts een klein gedeelte van de objectdrager te worden afgezocht omdat vrijwel alle deeltjes op een relatief klein aantal lijnen is geordend. De tweetrapsanalyse is bij de onderhavige uitvinding op eenvoudige wijze uit te voeren.In cytology, in addition to microscopy, optical techniques are important for obtaining information about particles, image processing and flow cytometry. Image processing involves analyzing particles using, for example, video cameras or other imaging techniques. The particles are not arranged in straight lines, for example, and an object carrier must be fully searched for potentially interesting particles. In addition, as far as we know, no two-stage analysis is used in the sense that a quick analysis is first conducted to find an interesting subpopulation of particles, which are then further investigated with other techniques. In the present invention, only a small part of the object carrier needs to be searched because almost all particles are arranged on a relatively small number of lines. The two-stage analysis can be carried out in a simple manner in the present invention.

In vergelijking met de stromingscytometrie kan worden opgemerkt dat bij een stromingscytometer weliswaar ordening van de te meten deeltjes optreedt, maar dat deze ordening van tijdelijke aard is en slechts bestaat tijdens het stromen door het stromingscuvet. Na afloop van de meting is de ordening weer opgeheven en kan een interessante subpopulatie niet meer worden teruggevonden tenzij gebruik wordt gemaakt van een sorteerinrichting. Zelfs bij gebruik van een sorteerinrichting kan nooit meer precies dezelfde meting <of een anderssoortige meting) aan deze deeltjes in precies dezelfde volgorde worden verricht. Een specifiek deeltje kan slechts worden teruggevonden door alle deeltjes uit een subpopulatie individueel in een eigen opvanginrichting terecht te laten komen. Het vormen van een beeld van een deeltje dat door een stromingscytometercuvet stroomt kan slechts met grote technische moeilijkheden worden gerealiseerd. De permanente ordening van de uitvinding maakt het eenvoudig om zowel een interessante subpopulatie als een individueel deeltje terug te vinden, eventueel opnieuw te meten en er een beeld van te vormen.In comparison with the flow cytometry, it can be noted that while a flow cytometer arranges the particles to be measured, it is of a temporary nature and only exists during the flow through the flow cuvette. At the end of the measurement, the ordering is canceled and an interesting subpopulation can no longer be found unless a sorting device is used. Even when a sorting device is used, it is never possible again to perform exactly the same measurement (or a different kind of measurement) on these particles in exactly the same order. A specific particle can only be retrieved by letting all particles from a subpopulation individually end up in its own collection facility. Imaging a particle flowing through a flow cytometer cuvette can only be accomplished with great technical difficulties. The permanent arrangement of the invention makes it easy to find, measure and possibly measure an interesting subpopulation as well as an individual particle.

De stand van de techniek voor het detecteren van permanent geordende deeltjes wordt uiteengezet in EU. In termen van de hierboven ingevoerde deelsystemen kan het in C13 beschreven systeem als volgt worden gekarakteriseerd: 1. Als belichtingssysteem wordt gebruik gemaakt van een kwiklamp met daaraan gekoppeld een optische fiber die wordt gebruikt om het licht van de lamp op de bodem van een v-vormige groef te werpen alwaar de deeltjes zich bevinden.The prior art for detecting permanently ordered particles is set forth in EU. In terms of the subsystems introduced above, the system described in C13 can be characterized as follows: 1. As the exposure system, use is made of a mercury lamp with an optical fiber coupled thereto, which is used to light the lamp on the bottom of a v- shaped groove where the particles are located.

2. Als detectiesysteem wordt dezelfde optische fiber gebruikt in combinatie met een fluorescentiedetectiesysteem.2. As the detection system, the same optical fiber is used in combination with a fluorescence detection system.

3. Als scansysteem wordt gebruik gemaakt van een ronddraaiend tableau waarop de objectdrager is gefixeerd. In dit geval is een platenspeler gebruikt.3. As a scanning system, a rotating tray is used on which the object carrier is fixed. In this case, a record player was used.

4. Als volg- en focussysteem wordt gebruik gemaakt van een naald van een grammofoonplatenspeler die door de bovenkant van de v-vormige groet wordt geleid.4. The tracking and focusing system uses a needle from a gramophone record player that is guided through the top of the v-shaped salute.

5. Een beeldvormend systeem is niet aanwezig.5. An imaging system is not present.

De in figuur 1 geschetste uitvinding bestaat uit een lichtbron (1) (luchtgekoelde argon-ionenlaser) waarvan het licht in een bundelverbreder annex spatial-fi1ter (2) wordt verbreed en wordt ontdaan van onregelmatigheden. Na het passeren van een in- en uitschuifbare lens (3) in zijn uit de bundel geschoven toestand en een golflengte-scheidend filter (4) valt het licht op een electromechanisch beweegbare spiegel (5). Deze spiegel kan door een electrisch signaal om een verticale as draaien. Een linearisatie-systeem (6) bestaande uit een infra-rood diodelaser (7) en een split-detector (8) bestaande uit twee antiparallel aangesloten photodiodes lineariseert het gedrag van de spiegel 5.The invention outlined in figure 1 consists of a light source (1) (air-cooled argon-ion laser) whose light is widened in a beam expander annex spatial filter (2) and cleared of irregularities. After passing a retractable and retractable lens (3) in its out-of-beam condition and a wavelength separating filter (4), the light falls on an electromechanically movable mirror (5). This mirror can rotate about a vertical axis by an electrical signal. A linearization system (6) consisting of an infrared red diode laser (7) and a split detector (8) consisting of two anti-parallel connected photodiodes linearizes the behavior of the mirror 5.

De tot dan toe evenwijdige lichtbundel wordt door twee lenzen (9) en (10) van gelijke brandpuntsafstand met een onderlinge afstand van twee brandpuntsafstanden naar een kleurscheidend filter (11) geleid. Spiegel 5 staat in het brandpunt van lens 9 waardoor de bundel ter plaatse van 11 weer evenwijdig is. Na het passeren van 11 valt de evenwijdige bundel op een tweede electromechanische spiegel (12). Lenzen 9 en 10 beelden de spiegel 5 af op de spiegel 12 zodat bij verdraaiing van spiegel 5 geen lichtverlies optreedt op spiegel 12. Spiegel 12 is electrisch te roteren om een horizontale as. De evenwijdige lichtbundel -die nu naar beneden is gericht- valt op een vaste spiegel 13 die door zijn opstelling onder 45 graden de bundel weer in het horizontale vlak brengt, evenwijdig aan maar op een lagere hoogte dan ter plaatse van 4. De lichtbundel valt vervolgens op lens 14 waardoor de bundel wordt gefocusseerd. Via een vaste spiegel 15 wordt de na het focus divergente bundel op een objectief 16 gericht. Het punt waar de bundel door lens 14 wordt gefocusseerd ligt op 160 mm achter het objectief 16. Hiermee wordt het objectief gebruikt in zijn optimale conjugatie verhouding. Tevens beeldt lens 14 de spiegel 12 af op het achtervlak van het objectief 16. Dit zorgt ervoor dat bij het draaien van spiegel 12 geen lichtverlies optreedt in het achtervlak van het objectief 16. Onder objectief 16 bevindt zich de objectdrager met daarop de geordende deeltjes. De hele lichtweg zoals hiervoor beschreven zorgt ervoor dat een zo klein mogelijke -door diffractie begrensde-lichtspot op de objectdrager valt.The hitherto parallel light beam is guided by two lenses (9) and (10) of the same focal length at a distance of two focal lengths to a color-separating filter (11). Mirror 5 is in the focus of lens 9, so that the beam at the location of 11 is again parallel. After passing 11, the parallel beam falls on a second electromechanical mirror (12). Lenses 9 and 10 image mirror 5 on mirror 12, so that when mirror 5 is rotated, no light loss occurs on mirror 12. Mirror 12 can be electrically rotated about a horizontal axis. The parallel beam of light, which is now directed downwards, falls on a fixed mirror 13 which, by means of its arrangement at 45 degrees, brings the beam back into the horizontal plane, parallel to but at a lower height than at location 4. The beam of light then falls on lens 14 which focuses the beam. The fixed beam 15 after the focus divergent beam is directed onto a lens 16. The point where the beam is focused by lens 14 is 160 mm behind the lens 16. This uses the lens in its optimal conjugation ratio. Lens 14 also images mirror 12 on the rear surface of objective 16. This ensures that when mirror 12 is rotated, no light loss occurs in the rear surface of objective 16. Under objective 16, the object carrier with the ordered particles is located. The entire light path as described above ensures that the smallest possible light spot, limited by diffraction, falls on the object carrier.

Wordt lens 3 ingeschoven dan wordt de bundel gefocusseerd door lens 3 in een punt enige millimeters voor de spiegel 5. Omdat spiegel 5 en spiegel 12 op elkaar staan afgebeeld zal eveneens een gefocusseerde spot aanwezig zijn op enige millimeters voor spiegel 12. Omdat spiegel 12 is afgebeeld op het achtervlak van het objectief 16 zal een gefocusseerde spot zich bevinden in de nabijheid van het (achter) brandpunt van 16. Dit betekent dat een (nagenoeg) evenwijdige bundel op de objectdrager valt.When lens 3 is retracted, the beam is focused by lens 3 at a point a few millimeters in front of mirror 5. Because mirror 5 and mirror 12 are shown on top of each other, a focused spot will also be present at a few millimeters in front of mirror 12. Because mirror 12 is depicted on the rear face of the objective 16, a focused spot will be in the vicinity of the (rear) focal point of 16. This means that a (substantially) parallel beam falls on the object carrier.

Signalen van de deeltjes op de objectdrager zullen door 16 worden opgevangen en als een evenwijdige bundel licht weer in de richting van filter 4 worden gestuurd. Filter 4 is zodanig ingericht dat het laserlicht het filter grotendeels passeert maar dat fluoresente signalen met een grotere golflengte worden weggespiegeld naar bundelsplitser 17. Splitser 17 verdeeld de signalen over twee takken: a. een conventioneel (fluorescentie-) detectie systeem 18.Signals from the particles on the object carrier will be received by 16 and sent back in the direction of filter 4 as a parallel beam of light. Filter 4 is arranged in such a way that the laser light largely passes through the filter, but that fluorescent signals with a larger wavelength are reflected away to beam splitter 17. Splitter 17 divides the signals over two branches: a. A conventional (fluorescence) detection system 18.

b. een confocaal (fluorescentie-) detectiesysteem 19.b. a confocal (fluorescence) detection system 19.

Wanneer lens 3 uit de bundel is geschoven kan met het systeem 19 een confocale microscoop-opname worden gemaakt van een object dat op de objectdrager ligt door de spiegels 5 en 12 zodanig te bewegen dat de diffractie begrensde spot over het object scant.When lens 3 is slid out of the beam, system 19 allows a confocal microscope image of an object lying on the object carrier by moving mirrors 5 and 12 to scan the diffraction-limited spot over the object.

Wanneer lens 3 in de bundel wordt geschoven wordt een groot gedeelte van de objectdrager (groot in vergelijking met de grootte van een te meten deeltje) belicht en wordt het integrale signaal van het deeltje gemeten met het systeem 18.When lens 3 is slid into the beam, a large portion of the object carrier (large compared to the size of a particle to be measured) is exposed and the integral signal of the particle is measured with the system 18.

Licht uit een halogeenlamp 20 wordt met behulp van filter 21 omgezet in infra-rood licht. Dit infra rode licht wordt via de splitser 22 en lens 23 en via 11, 12, 13, 14, 15 en 16 afgebeeld op de objectdrager.· De objectdrager zal een deel van het infra-rode licht reflecteren en dat licht valt na passeren van 16, 15, 14, 13, 12, 11 en 23 en na gedeeltelijke spiegeling door splitser 22 op een focus en volg detector 24 vallen. In 24 worden focus—fouten en volg- fouten gedetecteerd. Systeem 24 wordt geschetst in tekening 2. Door het objectief met de later te bespreken focusmotor 28 een sinusvormige trilling uit te laten voeren en de hieruit resulterende intensiteitsveranderingen in het beeld van de vlakke stukken tussen de groeven te detecteren met fotodiodes 25 gevolg door fase-gevoelige detectie kan informatie worden verkregen over de focus toestand van het objectief (wobble methode). Eventuele verschuivingen van de objectdrager in de richting loodrecht op de groeven kunnen worden gedetecteerd met behulp van diodes 26 en 27. De diodes zullen bij verschuiving van de objectdrager niet beide meer even sterk worden belicht en wanneer de signalen van beide diodes worden afgetrokken kan volg-informatie worden verkregen.Light from a halogen lamp 20 is converted into infrared light using filter 21. This infrared light is displayed on the object carrier via the splitter 22 and lens 23 and via 11, 12, 13, 14, 15 and 16. · The object carrier will reflect part of the infrared light and that light falls after passing 16, 15, 14, 13, 12, 11 and 23 and after partial mirroring by splitter 22 fall on a focus and follow detector 24. In 24, focus errors and tracking errors are detected. System 24 is outlined in drawing 2. By having the objective lens with the focus motor 28 to be discussed later produce a sinusoidal vibration and detect the resulting intensity changes in the image of the planes between the grooves with photodiodes 25 followed by phase-sensitive detection, information can be obtained about the focus state of the lens (wobble method). Any shifts of the object carrier in the direction perpendicular to the grooves can be detected with the aid of diodes 26 and 27. The diodes will no longer be equally illuminated when the object carrier is shifted and when the signals are subtracted from both diodes it can follow. information is obtained.

Focusfoutsignalen worden electronisch verwerkt en toegevoerd aan de focusmotor 28 die het objectief naar de correcte focuspositie brengt. Hierdoor ontstaat een gesloten regelkring die het objectief altijd in focus zal trachten te houden.Focus error signals are electronically processed and supplied to the focus motor 28 which moves the lens to the correct focus position. This creates a closed control loop that will always try to keep the lens in focus.

Volgfoutsignalen worden electronisch verwerkt en toegevoerd naar de spiegel 12 die hierdoor zo zal gaan draaien dat weer een symmetrische 1ichtverdeling op de diodes 26 en 27 valt.Tracking error signals are electronically processed and supplied to the mirror 12, which will thereby turn so that a symmetrical light distribution falls on the diodes 26 and 27 again.

Ook hiermee is een gesloten regelkring gevormd die volgfouten zal trachten te minimaliseren.This also forms a closed control circuit that will try to minimize tracking errors.

De focusmotor 28 is geschetst in figuur 3. Het electromechanische systeem bestaat uit een tubus 29 waaraan het objectief 16 is gemonteerd. Tubus 29 is met twee bladveren 30 en 31 in verticale richting -flexibel opgehangen. Een spoel 32 die aan de tubus 29 is bevestigd bevindt zich in de 1 Lichtspleet van een permanente magneet 33. Door een stroom door de spoel te sturen kan de positie van de tubus in verticale zin worden aangepast. Een meetsysteem bestaande uit een in-fra—rood laser diode 34 en een split-detector 35 meten de stand van de tubus ten opzichte van het -frame van het instrument. Deze hoogtesensor wordt gebruikt om het objectief tijdens confocale metingen in een goed gedefinieerde positie te houden middels een op de focusmotor teruggekoppeld regelsysteem.The focus motor 28 is outlined in Figure 3. The electromechanical system consists of a tube 29 to which the objective 16 is mounted. Tube 29 is flexibly suspended with two leaf springs 30 and 31 in the vertical direction. A coil 32 attached to the tube 29 is located in the light gap of a permanent magnet 33. By sending a current through the coil, the position of the tube can be adjusted vertically. A measuring system consisting of an infrared red diode 34 and a split detector 35 measures the position of the tube relative to the frame of the instrument. This height sensor is used to keep the lens in a well-defined position during confocal measurements by means of a control system fed back to the focus motor.

De uitvinding onderscheidt zich op de volgende essentiele punten van de in Cl] geschetste opstelling: 1. Als belichtingssysteem wordt gebruik gemaakt van een coherente lichtbron en een microscoopobjectief. Door het gebruik van de laser en het gebruik van het microscoopobjectief kan het belichtingssysteem efficiënter werken en kan een hogere gevoeligheid worden behaald.The invention differs in the following essential points from the arrangement outlined in Cl]: 1. As the illumination system, use is made of a coherent light source and a microscope objective. The use of the laser and the use of the microscope lens allows the illumination system to work more efficiently and to achieve a higher sensitivity.

2. Als detectiesysteem wordt gebruik gemaakt van hetzelfde microscoopobjectief hetgeen weer een efficientere detectie ten gevolge heeft. Het detectiesysteem is verder ingericht voor het detecteren van meerdere fluorescente kleurstoffen in verschi11ende golflengtegebieden en desgewenst voor het detecteren van 1ichtverstrooiingssignalen.2. The same microscope objective is used as the detection system, which in turn results in more efficient detection. The detection system is further adapted to detect a plurality of fluorescent dyes in different wavelength ranges and, if desired, to detect light scattering signals.

3. Als scansysteem wordt gebruik gemaakt van een x—y- positioneringssysteem op basis van een tweetal stappenmotoren. De uitvoering van de gebruikte objectdrager maakt het mogelijk om rechte dan wel gebogen lijnen af te scannen voor het verkrijgen van de gegevens van de deeltjes. Het meten van de coördinaten van de deeltjes en het positioneren van de objectdrager ten opzichte van het belichtings- en detectiesysteem is hierbij veel simpeler dan bij het ronddraaiende systeem in C13.3. The scanning system uses an x-y positioning system based on two stepper motors. The construction of the used object carrier makes it possible to scan straight or curved lines to obtain the data of the particles. Measuring the coordinates of the particles and the positioning of the object carrier relative to the exposure and detection system is much simpler here than with the rotating system in C13.

4. Als -focus- en volgsysteem wordt gebruik gemaakt van een contactloos optisch systeem op basis van in-fra rood licht.4. As a focus and tracking system, a contactless optical system based on infrared light is used.

Het gebruik van een contactloos systeem heeft als voordeel dat op de objectdrager een dekglas kan worden aangebracht zodat de deeltjes in vloeistof blijven. Dit is bij het mechanische focus- en volg-systeem van Eli niet mogelijk.The use of a contactless system has the advantage that a cover glass can be applied to the object carrier so that the particles remain in liquid. This is not possible with the mechanical focus and tracking system from Eli.

5. Als beeldvormend systeem wordt gebruik gemaakt van een confocale laser scanning microscoop die op eenvoudige wijze kan worden geïntegreerd met de rest van het systeem. Ook is het mogelijk een ander beeeldvormend systeem te gebruiken omdat het in het detectiesysteem aanwezige microscoopobjectief hoogwaardige beelden kan leveren.5. The imaging system uses a confocal laser scanning microscope that can be easily integrated with the rest of the system. It is also possible to use a different imaging system because the microscope lens present in the detection system can provide high-quality images.

Verdere voordelen van het systeem zijn:Further advantages of the system are:

De snelheid van de meting kan eenvoudig worden aangepast door de snelheid van het scansysteem aan te passen. Dit kan van belang zijn om een bepaalde nauwkeurigheid van de optische signalen te verkrijgen. Dit is bijvoorbeeld bij een stromingscytometer niet of binnen kleine marges instelbaar. Verschillende metingen van deeltjes in precies dezelfde volgorde maar met steeds andere configuraties van het meetsysteem kunnen per deeltje een groot aantal gecorreleerde parameters opleveren. Dit aantal is in principe onbeperkt. Bij een stromingscytometer wordt het maximaal aantal per deeltje te bepalen parameters gelimiteerd door de aard van de gebruikte kleurstoffen en de fysieke grootte van de microscoopobjectieven waarmee naar de geordende stroom deeltjes wordt gekeken.The speed of the measurement can be easily adjusted by adjusting the speed of the scanning system. This can be important to obtain a certain accuracy of the optical signals. This is not possible, for example, with a flow cytometer or within small margins. Different measurements of particles in exactly the same order but with different configurations of the measuring system can yield a large number of correlated parameters per particle. In principle, this number is unlimited. With a flow cytometer, the maximum number of parameters to be determined per particle is limited by the nature of the dyes used and the physical size of the microscope objectives used to look at the ordered flow of particles.

Het is mogelijk op een objectdrager meerdere in de ruimte van elkaar gescheiden meetsystemen toe te passen. Zo zou het aantal parameters dat per cel kan worden gemeten ook kunnen worden uitgebreid. Door de ordening weet men immers wanneer een deeltje dat net door het ene systeem is gemeten onder het volgende systeem moet worden verwacht.It is possible to use several measuring systems separated in space from one object carrier. For example, the number of parameters that can be measured per cell could also be expanded. After all, the ordering knows when a particle that has just been measured by one system should be expected under the next system.

Claims

An apparatus intended to detect permanently ordered particles comprising at least but not limited to a: an exposure system b: a detection system c: a scanning system d: a contactless focus and tracking system

2. A device as under 1. characterized by the presence of an imaging system.

3. A device as under 1. characterized in that one or more coherent light sources or one or more non-coherent light sources are used in the lighting system.

4. A device as under 3. characterized in that a (microscope) lens is part of the lighting system.

5. A device as under 4. in which the same (microscope) objective is part of the detection system.

6. An apparatus as under 1. in which multiple fluorescent signals from the particles can be measured in different wavelength ranges, whether or not in combination with light scattering measurements.

7. An apparatus as under 1. characterized in that a scanning system is used based on stepper motors or other motors in which the position of the object carrier relative to the exposure and detection system is measured in some way.

8. A system as under 1. characterized in that the contactless focus and tracking system is active and works on the basis of light.

9. A system as under 1. characterized in that the contactless focus and tracking system is active and works on the basis of capacity measurement.

10. A system as under 1. characterized in that the focus and tracking system is passive.

11. A system as under 2. characterized in that the imaging system is a scanning or non-scanning conventional microscope, a CCD array-based detector or a confocal microscope.

A system as under 1. characterized in that an electromechanical displacement of part or parts of the exposure system and / or of the detection system are used for the focusing system.

A system as under 1. characterized in that a mechanical displacement of part or parts of the illumination system and / or of the detection system are used for the focusing system.

14. A system as under 1. characterized in that one or more electromechanical mirrors are used in the tracking system.

15. A system as under 1. in which one or more components of the scanning system are used for the tracking system.

16. A system as under 1. wherein the information for the focus and tracking system is derived from the flat areas between the grooves in the object carrier.

17. A system as under 8. where the information for the tracking and focusing system is derived from the bottoms or walls of the grooves in the object carrier.

18. A system as under 8. in which both the exposure system and the detection system as the tracking and focus system use the same (microscope) lens.

19. A system as under 8. in which part or all of the tracking and focusing system operates in the infrared wavelength range 0700 nm)

20. A system as under 8. wherein part or all of the tracking and focusing system operates in the region of visible light (400-700 nm).

21. A system as under 8. wherein the wavelength or wavelengths of the illumination system are used for the tracking and focusing system.

22. A system as under 2. characterized in that the imaging system has a separate provision for focusing.

23. A system as under 2. where exposure system, detection system, tracking and focus system and imaging system use the same (microscope) lens.

24. A system as under 2. wherein the imaging system has no common components with the exposure system or the detection system.

25. A system as under 8. wherein position information is obtained by markings applied in the object carrier which are optically read out.

26. A system as under 8, characterized in that the focus and / o-f tracking system is based on inter-f erometric measuring methods.