MXPA06009694A

MXPA06009694A - Nuevos polipeptidos cristalinos y polinucleotidos de bacillus thuringiensis y composiciones con los mismos.

Info

Publication number: MXPA06009694A
Application number: MXPA06009694A
Authority: MX
Inventors: Kevin Mcbride; Erica Bermudez; Robin Emig; Takashi Yamamoto
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2004-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2007-03-30
Also published as: CN101671680A; HUE028143T2; US20100210551A1; CA2556736A1; CA2799245C; JP2007526773A; CA2556736C; CN1942582A; WO2005082077A2; US7208474B2; US7737331B2; AU2009202561A1; EP2184360A2; PT2184360E; AU2009202561B2; BRPI0508068A; US7737117B2; CA2799245A1; US20100210550A1; CN101671681B

Abstract

Polipeptidos insecticidas relacionados con polipeptidos Cry 2 de Bacillus. Tambien se proveen los acidos nucleicos que codifican los polipeptidos de la invencion. Se proveen metodos para usar los polipeptidos y acidos nucleicos de la invencion para mejorar la resistencia de plantas a la predacion por insectos.

Description

NUEVOS POUPEPTIDOS CRISTALINOS Y POLINUCLEOTIDOS DE BACILLUS THURINGIENSIS Y COMPOSICIONES CON LOS MISMOS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en general con el campo del control de plagas y provee polipéptídos insecticidas relacionados con polipéptidos Cry2 de Bacillus, y los polinucleótidos que los codifican. La presente invención también se relaciona con métodos y composiciones para alterar la resistencia de las plantas a la predación por insectos, incluyendo, sin limitaciones, la producción de plantas transgénicas. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Numerosas plantas de valor comercial, incluyendo cultivos agrícolas comunes, son susceptibles de ser atacadas por plagas de insectos y nematodes. Estas plagas pueden causar reducciones sustanciales en el rendimiento y la calidad de los cultivos. Tradicionalmente, los granjeros han empleado plaguicidas químicos para combatir el daño causado por las plagas. Sin embargo, el uso de plaguicidas químicos genera su propio conjunto de problemas, incluyendo el costo y la inconveniencia de aplicar los plaguicidas. Además, los residuos químicos provocan preocupaciones ambientales y de salud. Por estas y otras razones, existe una demanda de agentes insecticidas alternativos. Un abordaje para el control de plagas beneficioso para el ambiente es el uso de las proteínas cristalinas plaguicidas derivadas de la bacteria habitante de la tierra Bacillus thuringiensis ("Bt"), conocidas comúnmente como "proteínas Cry". Muchas de estas proteínas son bastante tóxicas para insectos blanco específicos, pero son inofensivas para las plantas y otros organismos distintos del blanco. Se han expresado algunas proteínas Cry en forma recombinante en plantas de cultivo para proporcionar plantas transgénicas resistentes a plagas. Entre éstas, se ha cultivado ampliamente algodón y maíz transgénico-Bt.

Se ha aislado, caracterizado y clasificado una gran cantidad de proteínas Cry sobre la base de la homología de sus secuencias de aminoácidos (Cric more et al., 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 807-813). Este esquema de clasificación provee un mecanismo sistemático para nombrar y categorizar proteínas Cry recién descubiertas. Generalmente se ha establecido que las proteínas Cry individuales poseen espectros de actividad relativamente estrechos, con la excepción de Cry2A. Cry2A es inusual, ya que constituye un subconjunto de proteínas Cry que poseen un rango efectivo más amplio, que incluye toxicidad a los órdenes de insectos Lepidoptera y Díptera. Se ha descubierto que la proteína Cry2A es una toxina que presenta actividad doble contra Trichoplusia ni (rizador del repollo) y Aedes taeniorhynchus (mosquito) (Yamamoto y McLaughlin,1982, Biochem. Biophys. Res. Comm. 130: 414-421). La molécula de ácido nucleico que codifica la proteína Cry2A (denominada Cry2Aa) fue clonada y expresada en B. Megaterium, y se estableció que era activa contra insectos lepidópteros y dípteros (Donovan et al. 1988, J. Bacteriol. 170: 4732-4738). Se clonó una secuencia codificante adicional homologa a Cry2Aa (denominada Cry2Ab), y se descubrió que era activa solamente contra larvas de lepidópteros (Widner y Whiteley, 1989, J Bacteriol 171 :2). Los cultivos transgénicos de segunda generación podrían ser más resistentes a los insectos si fueran capaces de expresar múltiples y/o nuevos genes Bt. Por consiguiente, se desean nuevas proteínas insecticidas con espectros de actividad más amplios. 3. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un nuevo polipéptido Cry2, Cry2Ax (SEQ ID N° 2), aislado de Bacillus thuríngiensis. La presente invención también comprende los polipéptidos derivados de Cry2Ax (SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260). Además de la secuencia del polipéptido Cry2Ax y los polipéptidos derivados de Cry2Ax, se apreciará que los polipéptidos de la invención también abarcan variantes de polipéptidos, incluyendo, sin limitaciones, cualquier fragmento, análogo, homólogo, alelo de ocurrencia natural o mutante de éstos. Los polipéptidos de la invención también comprenden aquellos polipéptidos que son codificados por cualquier ácido nucleico Cry2Ax o derivado de Cry2Ax de la invención. En una realización, los polipéptidos tienen al menos una actividad funcional de Cry2Ax (por ejemplo, actividad insecticida) y al menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticos a la secuencia del polipéptido de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, o variantes de éstos. En otra realización, se incluyen los polípéptidos que tienen al menos una actividad funcional de Cry2Ax (por ejemplo, actividad insecticida), que tienen al menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600 ó 625 aminoácidos contiguos de largo, y que están codificados por un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones severas con el ácido nucleico que codifica cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, , 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, o una variante de éstas. También se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención, por ejemplo, por medios recombinantes. También se incluyen las composiciones que comprenden uno o más polipéptidos de la ¡nvención. La presente invención también se relaciona con las moléculas de ácidos nucleicos de Cry2Ax (SEQ ID N° 1) y las moléculas de ácidos nucleicos derivadas de Cry2Ax (SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 211 , 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259). La presente invención también comprende los fragmentos y los análogos que codifican polipéptidos que presentan una actividad funcional al menos parcial, es decir, que son capaces de presentar una o más actividades funcionales asociadas con un polipéptído Cry2Ax tipo salvaje. En una realización, la invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos i) que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID N° 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 211 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259; ii) que hibridiza con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID N° 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 1 13, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 211 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259, o un complemento de ésta, bajo condiciones severas; y/o ¡ii) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260. También se incluyen los vectores que comprenden los ácidos nucleicos de la ¡nvención. También se incluyen las células o las plantas que comprenden los vectores de la invención. La presente invención también se relaciona con plantas transgénicas que expresan un ácido nucleico y/o un polipéptído de la invención. Las plantas transgénicas pueden expresar el transgen de cualquier forma conocida en la técnica, incluyendo, sin limitaciones, la expresión constitutiva, la expresión regulada por el desarrollo, la expresión específica por tejido, etcétera. También están comprendidas las semillas obtenidas de una planta transgénica de la invención. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 muestra la actividad insecticida de los clones de ADN del segundo experimento de barajado. Cada clon se expresó en hojas de N. benthamiana usando infiltración forzada. Se alimentó cada disco de hoja a una única larva de H. zea de 3er estadio. Después de un período de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación por observación visual, y se la expresó como una fracción aproximada del área foliar remanente. El eje y es el porcentaje de disco foliar remanente después de exponerlo al insecto. El eje x es el clon expresado en el disco de hoja. Varios clones presentaron una actividad insecticida incrementada, tales como (D_S01000779) (SEQ ID N° 10), 15K (D_S00999080) (SEQ ID N° 12), 16K (D_S01000269) (SEQ ID N° 14), 16R (D_S01037143) (SEQ ID N° 16) y 473R (D_S01037677) (SEQ ID N° 18) FIG. 2 muestra la actividad insecticida del clon resultante del primer barajado 44 (D_S00503970) y el clon resultante del tercer barajado D_S01764701. Cada clon se expresó en hojas de N. benthamiana usando infiltración forzada. Se alimentó cada disco de hoja a una única larva de H. zea de 3er estadio. Después de un período de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación por captura en video del disco de hoja. El eje y es la cantidad de píxeles presentes en la imagen capturada del disco de hoja. El eje x es el clon expresado en el disco de hoja. Se presentan los resultados del promedio de tres experimentos. Para cada experimento, se evaluaron al menos ocho discos de hojas para cada clon. Las FIGS. 3A-3B muestran los resultados de eficacia para tres plantas de tabaco transgénicas que expresan el clon resultante del primer barajado 44 en el compartimiento del plástido (paneles de la izquierda) o en el citoplasma (paneles de la derecha). Se determinó la eficacia de inhibición de (A) H. zea o (B) S. exigua después de incubar las hojas con larvas por 24 horas. Se observó la cantidad de hoja remanente con equipo de captura de video para realizar el cálculo real del área foliar relativa remanente (cantidad de píxeles). Se tomaron seis discos de hojas para analizar en cada planta transgénica. Como se prepararon veinticinco plantas transgénicas usando cada construcción transgénica, las cantidades distinguen distintas plantas que usan una construcción particular. Las FIGS. 4A-4B muestran los niveles de expresión de transgenes en las plantas transgénicas que expresan el clon resultante del primer barajado 44. Este polipéptido derivado de Cry2 se expresó en los compartimientos celulares (A) plastídico y (B) citoplas ático, vía transformación con pMAXY5469 o pMAXY5471 , respectivamente. Se realizó un análisis de Western blot en extractos de plantas transgénicas usando un anticuerpo policlonal dirigido contra la región de la toxina del polipéptido del clon resultante del primer barajado 44. Los controles negativos fueron extractos tomados de planta sin transformar. Los controles positivos fueron 20 ng o 40 ng de toxina Cry2Ax purificada. El peso molecular del control positivo Cry2Ax difiere de aquél del polipéptido derivado de Cry2Ax en los extractos de plantas debido a que el primero está activado por tripsina y el segundo es la pro-toxina. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención provee polipéptidos insecticidas relacionados con polipéptidos Cry2 de Bacillus. También se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la ¡nvención. También se abarcan los métodos para usar los polipéptidos y los ácidos nucleicos de la invención para mejorar la resistencia de las plantas a la predación por insectos. 5.1 Polipéptidos de la invención La presente invención se relaciona con un nuevo polipéptido Cry2, Cry2Ax (SEQ ID N° 2), aislado de Bacillus thuríngiensis. La presente ¡nvención también comprende los polipéptidos derivados de Cry2Ax (SEQ ID N° 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260). Los polipéptidos de la invención también abarcan aquellos polipéptidos codificados por cualquier ácido nucleico Cry2Ax o derivado de Cry2Ax de la invención (véase la sección 5.2). Además de las secuencias de los polipéptidos Cry2Ax y derivados de Cry2Ax, se apreciará que los polipéptidos de la invención también comprenden variantes de éstos, incluyendo, sin limitaciones, cualquier secuencia sustancialmente similar, cualquier fragmento, análogo, homólogo, alelo de ocurrencia natural o mutante de éstos. Las variantes comprendidas por la invención son polipéptidos que presentan una actividad funcional al menos parcial, es decir, son capaces de presentar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con un polipéptido Cry2Ax tipo salvaje. Estas actividades funcionales incluyen, sin limitaciones, actividades biológicas, tales como actividad insecticida; antigenicidad, es decir, la capacidad de unirse o competir con la unión de Cry2Ax a un anticuerpo anti-Cry2Ax; inmunogenicidad, es decir, la capacidad de generar un anticuerpo que se una a un polipéptido Cry2Ax. En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos una actividad funcional que es sustancialmente similar a aquella del polípéptido original (por ejemplo, una variante de Cry2Ax tendrá al menos una actividad funcional que es sustancialmente similar a aquella de Cry2Ax). Como se lo usa en la presente documentación, se considerará la actividad funcional de la variante como "sustancialmente similar" a aquella del polipéptido progenitor si está dentro de una desviación estándar de la original. En una realización, los polipéptidos que tienen al menos una actividad funcional de Cry2Ax (por ejemplo, actividad insecticida) y son al menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticos a la secuencia del polipéptido de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260 están abarcados por la invención. Estos polipéptidos de la invención contienen al menos 1 , al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30 o todos los 40 residuos de aminoácidos del grupo que consiste en H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45, D51, A58, V69, R78, N79, K99, Tus, V124, E125, R-129, N138, R-139, A141, T-|62, Ql65, M-|66, 1-183, l-|92, H211, R2-|3, R2-| , D218, V324, I386, T399, S405, Q445, I551, 587, I591, I-610 y L631- El subíndice indica la posición del residuo de aminoácido correspondiente en la posición en SEQ ID N° 2, al completarse el alineamiento óptimo de la secuencia del polipéptido con SEQ ID N° 2. Respecto de una secuencia de aminoácidos que se alinea en forma óptima con una secuencia de referencia, un aminoácido "corresponde" a la posición en la secuencia de referencia con la cual está apareado el residuo en el alineamiento.

Como se lo usa en la presente documentación, cuando se define una secuencia como "al menos X% idéntica" a una secuencia de referencia, por ejemplo, "un polipéptido al menos 95% idéntico a SEQ ID N° 2", debe interpretarse que "X% idéntico" hace referencia al porcentaje de identidad absoluta, a menos que se indique lo contrario. El término "porcentaje de identidad absoluta" hace referencia a un porcentaje de identidad de secuencia, que se determina asignando a los aminoácidos y los ácidos nucleicos idénticos un valor de uno, y cero para cualquier sustitución, sin importar la similitud de los aminoácidos o los ácidos nucleicos no coincidentes. En un alineamiento de secuencia típico, el "porcentaje de identidad absoluta" de dos secuencias se presenta como un porcentaje de "identidades" de aminoácidos o ácidos nucleicos. En los casos en que el alineamiento óptimo de dos secuencias requiere la inserción de una extensión vacía en una o ambas secuencias, un residuo de aminoácido en una secuencia alineado con parte de la sección vacía en la otra secuencia se cuenta como una falta de coincidencia, para los propósitos de la determinación del porcentaje de identidad. Las extensiones vacías pueden ser internas o externas, es decir, un corte. Puede determinarse fácilmente el porcentaje de identidad absoluta usando, por ejemplo, el programa Clustal W, versión 1.8, Junio 1999, con los parámetros por omisión (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680). En otra realización, la invención abarca los fragmentos de polipéptidos Cry2Ax y derivados de Cry2Ax. Se abarcan polípéptidos que tienen al menos una actividad funcional de Cry2Ax (por ejemplo, actividad insecticida), que tienen al menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600 ó 625 aminoácidos contiguos de largo de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, y que están codificados por un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones severas con el ácido nucleico que codifica cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, , 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260. En las realizaciones donde el fragmento de la invención comprende cualquiera de los residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos 2, 7, 27, 35, 36, 43, 44, 45, 51 , 58, 69, 78, 79, 99, 118, 124, 125, 129, 138, 139, 141 , 161 , 165, 166, 183, 192, 211 , 213, 217, 218, 324, 386, 399, 405, 445, 551 , 587, 591 , 610, 631 de SEQ ID N° 2, estos polipéptidos de la ¡nvención contienen al menos 1 , al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30 o todos los 40 residuos de aminoácidos del grupo que consiste en H2, S7, Q27, Q35, E3e, K43, D44, N45, D5?, A58, V6g, R78, N g, K99, Tus, V-I24, E-125, R-129, N-|38, Rl39, A141, T-162, Ql65, M166, L-183, I 92, H2n, R213, R217, D2I8, V324, I386, T399, S405, Q445, ¡551, Sd87, 1591, Ld10 Y 1-631- En una realización específica, un fragmento de la invención corresponde a la longitud de la pro-toxina procesada. Existe una diferencia de 5-6 kDa en el peso molecular entre la pro-toxina Cry2 completa y la toxina Cry2 procesada. Esto es el resultado del corte de aproximadamente 40 aminoácidos del polipéptido de la protoxina de Cry2 (Rukminí et al., 2000, Biochimie 82:109-116; Aronson et al., 1993, Mol. Microbiol. 7:489-496; Morse et al., 2001 , Structure, 9:409-17). Los polipéptidos que corresponden a este fragmento Cry2 procesado pueden obtenerse en forma directa en los métodos de la presente invención, para evitar la necesidad de procesamiento de la pro-toxina. En otra realización específica, un fragmento de la invención corresponde a un dominio Cry2. Los polipéptidos Cry2 tienen tres dominios, incluyendo i) el dominio I, que participa en la inserción en la membrana apical del mesenterón del insecto y afecta la función de los canales de iones, ii) el dominio II, que participa en la unión con el receptor en la membrana de las células epiteliales del mesenterón del insecto, y iii) el dominio lll, que participa en la función de los canales de iones, la unión de los receptores y la inserción en la membrana (Dean et al., 1996, Gene 179:111-117; Schnepf et al., 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:775-806). En otra realización, la ¡nvención comprende polipéptidos análogos. Los polipéptidos análogos pueden poseer residuos que hayan sido modificados, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula a los polipéptidos Cry2Ax o derivados de Cry2Ax. Por ejemplo, pero sin limitaciones, puede modificarse un polipéptido análogo de la ¡nvención, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, corte proteolítico, unión con un ligando u otra proteína celular, etcétera. Puede modificarse un polipéptido análogo de la ¡nvención a través de modificaciones químicas, usando procedimientos conocidos por aquellos entrenados en la técnica, incluyendo, sin limitaciones, corte químico específico, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etcétera. Además, un análogo de un polipéptido de la invención puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. También se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de la invención, por ejemplo, por medios recombinantes (véase la sección 5.6). También se comprenden composiciones que comprenden uno o más polipéptidos de la ¡nvención. Además, las composiciones de la invención pueden comprender agentes adicionales, incluyendo, sin limitaciones, coadyuvantes dispersantes-adhesivos, agentes estabilizadores, otros aditivos insecticidas, diluyentes, agentes que optimizan las propiedades reológicas o la estabilidad de la composición, tales como, por ejemplo, agentes tensioactivos, emulsificantes, dispersantes y/o polímeros. 5.2 Ácidos nucleicos de la invención La presente ¡nvención también se relaciona con las moléculas de ácidos nucleicos de Cry2Ax (SEQ ID N° 1) y las moléculas de ácidos nucleicos derivadas de Cry2Ax (SEQ ID N° 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 211 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259). Las moléculas de ácidos nucleicos de la ¡nvención también comprenden aquellas moléculas de ácidos nucleicos que codifican cualquier polipéptido Cry2Ax o derivado de Cry2Ax de la invención (véase la sección 5.1). Además de las moléculas de ácidos nucleicos de Cry2Ax y las moléculas de ácidos nucleicos derivadas de Cry2Ax, se apreciará que los ácidos nucleicos de la invención también abarcan variantes de ácidos nucleicos, incluyendo, sin limitaciones, cualquier secuencia sustancialmente similar, cualquier fragmento, homólogo, alelo de ocurrencia natural, o mutante de éstos. Las variantes de las moléculas de ácidos nucleicos comprendidas por la presente invención codifican polipéptídos que presentan una actividad funcional al menos parcial, es decir, que son capaces de presentar una o más actividades funcionales conocidas asociadas con un polipéptido Cry2Ax tipo salvaje. Estas actividades funcionales incluyen, sin limitaciones, actividades biológicas, tales como actividad insecticida; antigenicidad, es decir, la capacidad de unirse o competir con la unión de Cry2Ax a un anticuerpo anti-Cry2Ax; inmunogenicidad, es decir, la capacidad de generar un anticuerpo que se una a un polipéptido Cry2Ax. En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos una actividad funcional que es sustancialmente similar a aquella de la molécula de ácido nucleico original (por ejemplo, una variante de una molécula de ácido nucleico de Cry2Ax codificará un polipéptido que tendrá al menos una actividad funcional que es sustancialmente similar a aquella del polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de Cry2Ax). Como se lo usa en la presente documentación, se considerará la actividad funcional de la variante como "sustancialmente similar" a aquella del polipéptído progenitor si está dentro de una desviación estándar de la original. En una realización, las moléculas de ácidos nucleicos que son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas a cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos de SEQ ID N° 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 211 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259 están abarcadas por la invención. Estas moléculas de ácidos nucleicos de la invención codifican polipéptidos que contienen al menos uno, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30 o todos los 40 residuos de aminoácidos del grupo que consiste en H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45, D51, A58, V69, R78, N g, K99, T-118, V-I24, E-I25, Rl29, N-I38, Rl39, A141, Ti62, Ql65, Ml66, L?ß3, Il92, H2IL R213, R217, D2I8, V324, ßß, T399, S405, Q445, I551, S587, I591, I-610 y Lß3i- Para determinar el porcentaje de identidad de dos moléculas de ácidos nucleicos, se alinean las secuencias con el propósito de realizar una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse extensiones vacías en la secuencia de una primera molécula de ácido nucleico, de modo de alinearla en forma óptima con una segunda molécula de ácido nucleico). Luego se comparan los nucleótidos en las posiciones correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido en la posición correspondiente en la segunda secuencia, luego las moléculas son idénticas en esta posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = cantidad de posiciones idénticas superpuestas/cantidad total de posiciones x 100%). En una realización, las dos secuencias tienen la misma longitud. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias también puede realizarse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático utilizado para comparar las dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (Karlin y Altschul, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. 87:2264-2268, modificado como se indica en Karlin y Altschul, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. 90:5873-5877). Este algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403 y Altschul et al., 1997, Nucleic Acid Res. 25:3389-3402). El software para realizar análisis BLAST está disponible para el público, por ejemplo, en el Centro Nacional de Información Biotecnológica. Este algoritmo comprende primero la identificación de los pares de secuencia con mayor puntuación (HSP), mediante la identificación de palabras cortas con longitud W en la secuencia de búsqueda, que coinciden o satisfacen un valor umbral positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T se conoce como el valor umbral de vecindad de palabra (Altschul et al., supra). Estos aciertos iniciales de vecindad de palabras actúan como semillas para iniciar búsquedas para hallar HSP que las contienen. Luego se extienden los aciertos de palabras en ambas direcciones dentro de cada secuencia en la medida en que pueda extenderse el valor de alineamiento acumulativo. Los valores acumulativos se calculan usando, para "secuencias de nucleótidos, los parámetros M (valor de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (valor de penalidad para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular el valor acumulativo. Se detiene la extensión de los aciertos de palabras cuando el valor de alineamiento acumulativo cae debajo en una cantidad X respecto del valor máximo alcanzado; cuando el valor acumulativo disminuye hasta cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de valor negativo; o cuando se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como parámetros por omisión una longitud de palabra (W) de 11 , una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M = 5, N = "4 para la comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por omisión una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, 1989, PNAS, 89:10915). También puede usarse el método de alineamiento Clustal V para determinar el porcentaje de identidad (Higgins y Sharp, 1989, CABIOS. 5:151-153), hallado en el programa Megalign del conjunto bioinformático de computación LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, Wl). Los "parámetros por omisión" son los parámetros prefijados por el fabricante del programa y, para alineamientos múltiples, corresponden una penalidad de falta de coincidencia = 10 y penalidad de longitud de falta de coincidencia = 10, al tiempo que, para los alineamientos por pares, son ktuple 1 , penalidad de falta de coincidencia = 3, ventana = 5 y diagonales guardadas = 5. Después de alinear las secuencias usando el programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" observando la tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa. Puede determinarse el porcentaje de identidad entre dos secuencias usando procedimientos similares a aquellos descriptos previamente, permitiendo o no la existencia de faltas de coincidencia. Para calcular el porcentaje de identidad, típicamente se cuentan sólo las coincidencias exactas. En otra realización, los fragmentos de Cry2Ax y las moléculas de ácidos nucleicos derivadas de Cry2Ax están abarcadas por la ¡nvención. Se incluyen moléculas de ácidos nucleicos que tienen al menos una actividad funcional de Cry2Ax (por ejemplo, actividad insecticida), que comprenden al menos 100, 250, 500, 750, 1000, 1500 ó 1800 nucleótidos contiguos de largo de cualquiera de SEQ ID N° 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 211 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259, y/o hibridizan bajo condiciones severas con las moléculas de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260. En realizaciones donde el fragmento de ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido que comprende cualquiera de los residuos de aminoácidos que corresponden a los residuos de aminoácidos 2, 7, 27, 35, 36, 43, 44, 45, 51 , 58, 69, 78, 79, 99, 118, 124, 125, 129, 138, 139, 141 , 161 , 165, 166, 183, 192, 211 , 213, 217, 218, 324, 386, 399, 405, 445, 551 , 587, 591 , 610, 631 de SEQ ID N° 2, estas moléculas de ácidos nucleicos de la ¡nvención contienen secuencias codificantes de al menos 1 , al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30 o todos los 40 residuos de aminoácidos del grupo que consiste en H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45, D51, A58, V69, R78, N79, K99, T118, V124, E125, Rl29, N-|38, Rl39, A141, T-I62, Ql65, M-166, L-I83, Il92, H2H, R213, R217, D2I8, V324, I386, T399, S405, Q445, 1551, S587, 1591, 1-610 y L631 - En una realización específica, un fragmento de la invención corresponde a la longitud del ácido nucleico que codifica la pro-toxina procesada. Existe una diferencia de 5-6 kDa en el peso molecular entre la pro-toxina Cry2 completa y la toxina Cry2 procesada. Esto es el resultado del corte de aproximadamente 40 aminoácidos en el extremo C-terminal del polipéptido de la pro-toxina de Cry2 (Rukmini et al., 2000, Biochimie 82:109-116; Aronson et al., 1993, Mol. Microbiol. 7:489-496; Morse et al., 2001 , Structure, 9:409-17). En otra realización específica, un fragmento de la invención codifica un polipéptído que corresponde a un dominio Cry2. En otra realización, una molécula de ácido nucleico que hibridiza bajo condiciones severas con cualquiera de SEQ ID N° 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 211 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259 está abarcada por la invención. Estas moléculas de ácidos nucleicos de la invención codifican polipéptidos que codifican al menos 1 , al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30 o todos los 40 residuos de aminoácidos del grupo que consiste en H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45, D51, A58, Veg, R78, N79, K99, Tus, V124, E-125, Rl29, N-I38, Rl39, A-141, T-I62, Ql65, M166, L-183, Il92, H211 , R213, R217, D2I8, V324, I386, T399, S405, Q445, 1551, S587, 1591, 1-610 y 1-631- La frase "condiciones severas" hace referencia a las condiciones de hibridización bajo las cuales un ácido nucleico hibridiza con el ácido nucleico blanco, típicamente en una mezcla compleja de ácidos nucleicos, pero esencialmente sin otros ácidos nucleicos. Las condiciones severas dependen de la secuencia y serán diferentes bajo distintas circunstancias. Los ácidos nucleicos más largos hibridizan específicamente a mayores temperaturas. Pueden hallarse guías extensas sobre la hibridización de ácidos nucleicos en la literatura técnica (por ejemplo, Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)). En general, las condiciones muy severas se seleccionan con temperaturas aproximadamente 5-10°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) del ácido nucleico específico a un pH de fuerza iónica definida. Las condiciones de baja severidad generalmente se seleccionan con temperaturas aproximadamente 15-30°C menores que el T . El Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica, un pH y una concentración de ácidos nucleicos definida) a la cual 50% de las sondas complementarias con el blanco hibridizan con el ácido nucleico blanco en equilibrio (cuando los ácidos nucleicos están presentes en exceso en el Tm, 50% de la sondas están ocupadas en equilibrio). Las condiciones de hibridízación típicamente son aquellas donde la concentración de sal es menor que iones sodio aproximadamente 1,0 M, típicamente una concentración de iones sodio (u otras sales) de entre aproximadamente 0,01 y 1 ,0 M, a un pH de entre 7,0 y 8,3, y a una temperatura de al menos aproximadamente 30°C para las sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para las sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También pueden obtenerse condiciones severas con la adición de agentes desestabilizadores, tales como formamida. Para realizar una hibridización selectiva o específica, una señal positiva es al menos el doble de la híbridización de fondo, y preferiblemente 10 veces la hibridización de fondo. En una realización, las condiciones severas incluyen al menos un lavado (usualmente 2) en SSC 0,2X a una temperatura de al menos aproximadamente 50°C, usualmente aproximadamente 55°C, o algunas veces 60°C o 65°C, por 20 minutos, o condiciones sustancialmente equivalentes. En una realización específica, la molécula de ácido nucleico de la invención hibridiza específicamente después de al menos un lavado en SSC 0,2X a 55°C por 20 minutos, con un polinucleótido que codifica el polipéptido de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260. En otra realización, las condiciones severas incluyen una hibridización en cloruro de sodio/citrato 6X (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida por uno o más lavados en SSC 0,2X, 0,1 % de SDS a 50-65°C. La frase "hibridiza específicamente" hace referencia a la unión, la duplicación o la hibridización de una molécula solamente con una secuencia de nucleótidos particular, bajo condiciones de hibridización severas, cuando dicha secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, una biblioteca de ADN o ARN celular total). También se incluyen los vectores que comprenden los ácidos nucleicos de la invención. También se incluyen las células o las plantas que comprenden ios vectores de la invención. El término "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico", como se lo usa en la presente documentación, hace referencia a un polímero de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos de cadena simple o doble, que se lee desde el extremo 5' hacia el extremo 3'. Incluye ADN cromosómico, plásmidos de replicación autónoma y ADN o ARN que tiene una función estructural primaria. El término "codificante" hace referencia a una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más aminoácidos. El término no requiere un codón de inicio o terminación. Una secuencia de aminoácidos puede estar codificada en cualquiera de los seis marcos abiertos de lectura diferentes proporcionados por una secuencia de polinucleótidos y su complemento.

La Tabla 1 describe secuencias Cry2Ax y derivadas de Cry2Ax, y el número de identidad de secuencia correspondiente. .3 Secuencias derivadas de Crv2Ax Los polipéptidos y los ácidos nucleicos derivados de Cry2Ax de la invención pueden crearse introduciendo una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de Cry2Ax, o en ácidos nucleicos relacionados, de modo o tal que se introduzcan sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Generalmente, se crean derivados de las secuencias Cry2Ax para acentuar una característica deseable o reducir una característica indeseable de un polipéptido Cry2Ax. En una realización, los polipéptidos derivados de Cry2Ax tienen una mayor actividad insecticida respecto de los polipéptidos Cry2Ax, incluyendo, sin limitaciones, mayor potencia y/o mayor rango de insectos plaga. En otra realización, los polipéptidos derivados de Cry2Ax se expresan mejor que los polipéptidos Cry2Ax, incluyendo, sin limitaciones, mayor vida media, menor susceptibilidad a la degradación y/o transcripción o traducción más eficiente. En una realización, se usa una molécula de ácido nucleico de polipéptidos como molde para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. En otra realización, se usa un ácido nucleico relacionado con Cry2Ax como molde para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. En una realización específica, se usa Cry2Ab* como molde. Cry2Ab* tiene dos cambios de aminoácidos respecto de Cry2Ab tipo salvaje (K por.R en la posición 36 y M por T en la posición 241 del N° de acceso GenBank M23724). En otra realización específica, pueden usarse los clones aislados de un experimento de alteración como moldes para realizar otros experimentos de alteración (por ejemplo, los clones 38, 44, y 473R; véanse las secciones 6.2 y 6.4). Pueden introducirse alteraciones de secuencia empleando procedimientos comunes, tales como procedimientos de evolución molecular dirigida, por ejemplo, métodos de barajado de ADN (véanse, por ejemplo, Christians et al., 1999, Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri et al., 1998, Nature, 391 :288-291 ; Crameri, et al., 1997, Nature Biotechnology 15:436-438; Crameri et al., 1996, Nature Biotechnology 14:315-319; Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; Stemmer et al., 1994, Proc. Nati. Acad. Sci., 91 :10747-10751 ; Patentes de los EEUU N° 5605793; 6117679; 6132970; 5939250; 5965408; 6171820; Publicaciones Internacionales N° WO 95/22625; WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651 ; y WO 01/75767); mutagénesis dirigidas a sitios específicos (véanse, por ejemplo, Kunkel, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci., 82:488-492; Oliphant et al., 1986, Gene 44:177-183); mutagenesis dirigida a oligonucleótidos (véase, por ejemplo, Reidhaar-Olson et al., 1988, Science 241 :53-57); mutagénesis química (véase, por ejemplo, Eckert et al., 1987, Mutat. Res. 178:1-10); PCR con susceptibilidad a errores (véase, por ejemplo, Caldwell & Joyce, 1992, PCR Methods Applic. 2:28-33); y mutagénesis de cassettes (véase, por ejemplo, Arkin et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 1992, 89:7871-7815); (véanse en general, por ejemplo, Arnold, 1993, Curr. Opinión Biotechnol. 4:450-455; Ling et al., 1997, Anal. Biochem., 254:157-78; Dale et al., 1996, Methods Mol. Biol. 57:369-74; Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botsteín et al., 1985, Science, 229:1193-1201 ; Cárter, 1986, Biochem. J. 237:1-7; Kramer et al., 1984, Cell 38:879-887; Wells et al., 1985, Gene 34:315-323; Minshull et al., 1999, Current Opinión in Chemical Biology 3:284-290). En una realización, se usa barajadoO de ADN para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. El barajado de ADN puede realizarse in vitro, in vivo, in silico o en una combinación de estos ambientes. Pueden ponerse en práctica métodos de recombinación in silico donde se usen algoritmos genéticos para recombinar extensiones de secuencia que correspondan a ácidos nucleicos homólogos (o aún no homólogos). Las extensiones de secuencias recombinadas resultantes se convierten opcionalmente en ácidos nucleicos sintetizando ácidos nucleicos que corresponden a las secuencias recombinadas, por ejemplo, en combinación con procedimientos de síntesis de oligonucleótidos por reensamblaje. Este abordaje permite generar alteraciones al azar, parcialmente al azar o determinadas. En la técnica se describen muchos detalles respecto de la recombinación in silico, incluyendo el uso de algoritmos genéticos, operadores genéticos y semejantes en sistemas informáticos, combinados con la generación de los ácidos nucleicos correspondientes, así como combinaciones de ácidos nucleicos designados (por ejemplo, basadas en la selección de sitios de cruzamiento), y métodos de recombinación determinada, pseudo-azarosa o al azar (véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales de Patente N° WO 00/42560 y WO 00/42559). En otra realización, se usa mutagénesis dirigida para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax, seleccionando secuencias de nucleótidos o posiciones particulares del ácido nucleico Cry2Ax o relacionado con Cry2Ax que se desea alterar. Estas mutaciones dirigidas pueden introducirse en cualquier posición del ácido nucleico. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" o "esenciales". Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse en la secuencia tipo salvaje sin alterar la actividad biológica, al tiempo que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para al menos una actividad biológica del polipéptido. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que no están conservados o que solamente están semi-conservados entre homólogos de varias especies pueden no ser esenciales para la actividad. Como alternativa, los residuos de aminoácidos que están conservados entre los homólogos de varias especies pueden ser esenciales para la actividad. Estas mutaciones dirigidas pueden ser conservativas o no conservativas.

Una "sustitución de aminoácidos no conservativa" es una donde se reemplaza el residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral disímil. Las familias de residuos de aminoácidos con cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido gluámico, asparragina, glutamina), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales con ramificaciones ß (por ejemplo, treonina, valina, isoleucína) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Como alternativa o además de las sustituciones de residuos de aminoácidos no conservativas, estas mutaciones dirigidas pueden ser conservativas. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una donde se reemplaza el residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Después de la mutagénesis, puede expresarse la proteína codificada en forma recombinante y puede determinarse la actividad de la proteína. En otra realización, se usa mutagénesis al azar para crear nucleótidos derivados de Cry2Ax. Pueden introducirse mutaciones al azar en toda o parte de la secuencia codificante (por ejemplo, por mutagénesis de saturación). En determinadas realizaciones, pueden usarse secuencias de nucleótidos que codifican otros polipéptidos relacionados con dominios, motivos estructurales o sitios activos similares, o que se alinean con una porción de las secuencias de Cry2Ax de la invención con faltas de coincidencia o coincidencias imperfectas, en el proceso de mutagénesis, para generar una diversidad de secuencias. Deberá comprenderse que, para cada paso de mutagénesis en algunos de los procedimientos mencionados previamente, puede ser necesario realizar una cantidad de ciclos de iteración de algunos o todos los pasos, con el fin de optimizar la diversidad de las secuencias. Los métodos descriptos previamente pueden usarse en combinación y en cualquier orden deseado. En muchos casos, los métodos resultan en una reserva de secuencias de ácidos nucleicos alteradas o una reserva de células huésped recombinantes que comprenden secuencias de ácidos nucleicos alteradas. Las secuencias de ácidos nucleicos alteradas, o las células huésped que expresan una secuencia de ácido nucleico alterada con las características deseadas, pueden identificarse realizando búsquedas con uno o más ensayos conocidos en la técnica. Los ensayos pueden efectuarse bajo condiciones que permitan seleccionar polipéptidos con características físicas o químicas deseadas. Pueden determinarse las alteraciones en la secuencia de ácido nucleico secuenciando la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido alterado en los clones. Adicionalmente, las moléculas de ácidos nucleicos de Cry2Ax y derivadas de Cry2Ax pueden tener codones optimizados por completo o en parte. Como todos los aminoácidos (excepto la metíonina) son codificados por una cantidad de codones (Tabla 2), puede cambiarse la secuencia de la molécula de ácido nucleico sin cambiar el aminoácido codificado. La optimización de codones es el procedimiento de alteración de uno o más codones a nivel de los ácidos nucleicos, de modo que no se alteran los aminoácidos, sino que se incrementa la expresión en un organismo huésped particular. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que existen tablas y otras referencias que proporcionan información preferencia para un amplio rango de organismos disponibles en la técnica. 5.4 Métodos para evaluar la actividad insecticida Como se lo usa en la presente documentación, el término "actividad insecticida" hace referencia a la capacidad de un polipéptido de disminuir o inhibir la alimentación del insecto y/o incrementar la mortalidad del insecto una vez ingerido el polipéptido. Aunque puede afectarse cualquier insecto, preferiblemente se ven afectados los insectos de los órdenes Lepidoptera y Díptera. Puede usarse una variedad de ensayos para determinar si un polipéptido particular de la invención tiene actividad insecticida y, de tenerla, en qué grado se presenta dicha actividad. En general, se le proporciona un polipéptido de la ¡nvención a un insecto plaga de cualquier forma que pueda ser ingerida. Se observa la reacción del insecto plaga a la ingestión del polipéptido de la invención (por ejemplo, por entre aproximadamente uno y tres días). Una disminución o una inhibición de la alimentación, y/o un incremento en la mortalidad del insecto plaga después de ingerir el polipéptido de la invención son indicadores de actividad insecticida. Un polipéptido de la invención con actividad insecticida desconocida debería compararse con un control positivo y/o negativo para evaluar el resultado del ensayo con mayor precisión. En una realización, se purifica un polipéptido de la invención (ya sea en forma soluble o en forma cristalina) y se lo agrega a la dieta del insecto. En otra realización, se expresa un polipéptido de la invención en un microbio recombinante (por ejemplo, E. coli). Las plagas de insectos se alimentan directamente con el microbio recombinante (véase Moellenbeck et al., 2001 , Nat. Biotechnol. 19:668). En otra realización, se expresa el polipéptido de la ¡nvención en una planta, y se alimenta el insecto plaga con la planta. Después del período de incubación, puede determinarse la actividad de alimentación del insecto plaga por observación visual (por ejemplo, de una fracción aproximada de área foliar remanente) o captura en video (por ejemplo, cantidad de píxeles en el área foliar remanente) de las partes de la planta que normalmente habrían sido comida por los insectos plaga. En una realización específica, la expresión del polipéptido de la invención en la planta es transitoria. En dichas realizaciones, se clona un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención en un vector de expresión en plantas, y se lo transfecta en Agrobacterium tumefaciens. Las bacterias transformadas se co-cultivan con una hoja de N. Benthamiana, y, usando infiltración forzada, la hoja expresa el polipéptido de la invención. Sin embargo, la expresión del polipéptido es variable entre los co-cultivos de hojas. En otra realización específica, la expresión del polipéptido de la invención en la planta es estable. En estas realizaciones, se prepara una planta transgénica que expresa un polipéptido de la invención.

En otra realización, puede evaluarse la actividad insecticida de un polipéptido de la invención midiendo la muerte celular y/o el crecimiento celular mediante el uso de células en cultivo. Estos ensayos típicamente comprenden el uso de células de insecto en cultivo que son susceptibles a la toxina particular usada, o células que expresan un receptor para la toxina particular, ya sea en forma natural o como resultado de la expresión de un gen heterólogo. Por consiguiente, además de las células de insectos, las células de mamíferos, bacterias y levaduras están entre aquellas células que son útiles para los ensayos in vitro. En la técnica se describen ensayos biológicos in vitro que miden la toxicidad contra células cultivadas (por ejemplo, Johnson, 1994, J. Invertebr. Pathol. 63:123-129). 5.5 Métodos para mejorar la resistencia a insectos en plantas La presente invención provee métodos para mejorar la resistencia de las plantas a insectos plaga, incluyendo, sin limitaciones, miembros de Helicoverpa ssp. (por ejemplo, Helicoverpa Zea) y/o Spodoptera ssp. (por ejemplo, Spodoptera exigua) mediante el uso de polipéptidos insecticidas relacionados con Cry2. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para provocar que estos insectos plaga ingieran uno o más polipéptídos de la invención durante el curso de la alimentación de la planta. De este modo, los insectos plaga ingerirán cantidades insecticidas de uno o más polipéptidos de la invención, y dejarán de alimentarse con la planta. En algunas realizaciones, los insectos plaga son eliminados por la ingestión de uno o más polipéptidos de la invención. En otras realizaciones, puede inhibirse o repelerse la alimentación de los insectos plaga sobre la planta, sin eliminarlos. En una realización, pueden prepararse plantas transgénicas que expresen uno o más polipéptidos de la invención (véase en general la sección 5.7 para hallar métodos para producir plantas transgénicas). La planta transgénica puede expresar uno o más polipéptidos de la invención en todos los tejidos (por ejemplo, expresión global). Como alternativa, puede expresarse uno o más polipéptidos de la invención solamente en un subconjunto de tejidos (por ejemplo, expresión con especificidad tisular), preferiblemente aquellos tejidos consumidos por el insecto plaga. Los polipéptídos de la ¡nvención pueden expresarse en forma constitutiva en la planta, o pueden estar bajo el control de un promotor inducible. En otra realización, puede aplicarse una composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención en forma externa a una planta susceptible a plagas de insectos. La aplicación externa de la composición incluye la aplicación directa sobre la planta, completa o en parte, y/o la aplicación indirecta, por ejemplo, al ambiente que rodea la planta, tal como la tierra. Puede aplicarse la composición empleando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitaciones, rocío, espolvoreado, riego o semejantes. En general, puede aplicarse la composición en cualquier momento durante el crecimiento de la planta. Aquellos entrenados en la técnica pueden usar métodos conocidos en la técnica para determinar en forma empírica el momento óptimo para administrar la composición. Los factores que afectan el momento óptimo para la administración incluyen, sin limitaciones, el tipo de planta susceptible, el tipo de insecto plaga, y cuál o cuáles polipéptídos de la invención se administran en la composición. La composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención puede comprender polipéptidos sustancialmente purificados, una suspensión celular, un precipitado celular, un extracto celular o un complejo de esporas-cristales de células de Bacillus thuringiensis (véase en general la sección 5.7 para hallar procedimientos para sintetizar polipéptidos recombinantes). La composición que comprende uno o más polipéptidos de la invención puede tomar la forma de una solución, una emulsión, una suspensión o un polvo. Las formulaciones líquidas pueden ser acuosas o no acuosas, y pueden proporcionarse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsificables o semejantes. Las formulaciones pueden incluir agentes adicionales, además de uno o más polípéptidos de la invención. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender adicionalmente coadyuvantes dispersantes-adhesivos, agentes estabilizadores, otros aditivos insecticidas, diluyentes, agentes que optimizan las propiedades reológicas o la estabilidad de la composición, tales como, por ejemplo, agentes tensioactivos, emulsificantes, dispersantes y/o polímeros. En otra realización, los huéspedes recombinantes que expresan uno o más polipéptidos de la invención se aplican sobre o cerca de una planta susceptible de ser atacada por un insecto plaga. Los huéspedes recombinantes incluyen, sin limitaciones, huéspedes microbianos y virus que afectan insectos, que han sido transformados y que expresan una o más moléculas de ácidos nucleicos (y, por consiguiente, polipéptidos) de la invención. En algunas realizaciones, el huésped recombinante secreta el polipéptído de la ¡nvención en el ambiente circundante, con el fin de entrar en contacto con el insecto plaga. En otras realizaciones, los huéspedes recombinantes colonizan uno o más tejidos vegetales susceptibles de ser infestados por insectos. 5.6 Expresión recombinante Las moléculas de ácidos nucleicos y los polipéptidos de la invención pueden expresarse en forma recombinante usando procedimientos de ADN recombinante y clonación molecular convencionales bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989). Adicíonalmente, pueden usarse procedimientos de ADN recombinante para crear construcciones de ácidos nucleicos apropiadas para usar en la preparación de plantas transgénicas (véase la sección 5.7). Por consiguiente, un aspecto de la invención se relaciona con vectores, preferiblemente vectores de expresión, que comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención, o una variante de ésta. Como se lo usa en la presente documentación, el término "vector" hace referencia a un polinucleótido capaz de transportar otro ácido nucleico al que haya sido unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que designa un rizo de ADN circular de cadena doble en el que pueden introducirse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde pueden introducirse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de replicarse en forma autónoma en la célula huésped donde se introducen (por ejemplo, los vectores bacterianos que contienen un origen de replicación en bacterias y los vectores episomales). Otros vectores (por ejemplo, los vectores no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped al introducirlos en la célula huésped, y por consiguiente, se replican junto con el genoma del huésped. En general, los vectores de expresión útiles en los procedimientos de ADN recombinante comúnmente toman la forma de plásmidos (vectores). Sin embargo, la invención incluye otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus con replicación defectuosa). Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico de la invención en una forma apropiada para expresar la molécula de ácido nucleico en una célula huésped. Esto significa que los vectores de expresión recombinante incluyen una o más secuencias reguladoras apropiadas, seleccionadas teniendo en cuenta las células huésped usadas para la expresión, que están asociadas operativamente con el polinucleótido que se desea expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, el término "asociada operativamente" denota que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a las secuencias reguladoras de un modo que permite expresar la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped). El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenílación). Estas secuencias reguladoras se describen en la técnica (por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 1990, Academic Press, San Diego, CA). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huésped, y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en determinadas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras con especificidad tisular). Aquellos entrenados en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped que se desea transformar, el nivel de expresión deseado para la proteína, el área del organismo en el que se desea la expresión, etcétera. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células huésped para producir proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por las moléculas de ácidos nucleicos descriptas en la presente documentación. En algunas realizaciones, pueden introducirse ácidos nucleicos aislados, que sirven como elementos promotores o potenciadores, en la posición apropiada (generalmente río arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención, con el fin de regular positiva o negativamente la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, pueden alterarse promotores endógenos in vivo a través de mutación, deleción y/o sustitución (véanse la Patente de los EEUU N° 5565350; la Solicitud Internacional de Patente N° PCT/US93/03868), o pueden introducirse promotores aislados en una célula vegetal, en la orientación apropiada y a una distancia de un gen conocido de un polinucleótido de la presente invención, con el objeto de controlar la expresión del gen. Puede modularse la expresión genética bajo condiciones apropiadas para el crecimiento de las plantas, de modo de alterar la concentración total y/o alterar la composición de los polipéptidos de la presente invención en la célula vegetal. Por consiguiente, la presente ¡nvención provee composiciones y métodos para preparar promotores y/o potenciadores heterólogos unidos operativamente a una forma nativa, endógena (es decir, no heteróloga) de un polinucleótido de la presente ¡nvención.

Si se desea expresar un polipéptido, es generalmente deseable incluir una región de poliadenilacíón en el extremo 3' de una región codificante de un polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar del gen natural, de una variedad de otros genes vegetales o de ADN-T. La secuencia terminal 3' a agregar puede derivar, por ejemplo, de genes de nopalina sintetasa u octopina sintetasa, o como alternativa, de otros genes vegetales, o menos preferiblemente de otro gen eucariota. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para expresar un polipéptido de la ¡nvención en células procariotas (por ejemplo, Enterobacteriaceae, tales como Escherichia; Bacillaceae; Rhizoboceae, tales como Rhizobium y Rhizobacter, Spirillaceae, tales como photobacterium; Zymomonas; Serratia; Aeromonas; Vibrio; Desulfovibrio; Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter, Azotobacteraceae; y Nitrobacteracea ) o eucariotas (por ejemplo, células de insectos, usando vectores de expresión en baculovirus, células de levaduras, células vegetales o células de mamíferos) (véase Goeddel, supra. para hallar una descripción sobre células huésped apropiadas). Como alternativa, puede transcribirse y traducirse el vector de expresión recombinante in vitro, por ejemplo, secuencias reguladoras promotoras T7 y T7 polimerasa. La expresión de proteínas en procariotas comúnmente se efectúa en £. coli, con vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o proteínas que no son de fusión. Loas vectores de fusión agregan una cantidad de aminoácidos a una proteína codificada, comúnmente en el extremo amino de la proteína recombínante. Estos vectores de fusión típicamente sirven para al menos tres propósitos: 1) incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y/o 3) contribuir en la purificación de la proteína recombinante al actuar como ligandos en purificaciones de afinidad. Comúnmente, en los vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de corte proteolítico en la unión entre la porción de fusión y la proteína recombinante, de modo de permitir la separación de la proteína recombinante de la porción de fusión después de purificar la proteína de fusión. Estas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento conocidas, incluyen el Factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith y Johnson, 1988, Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante deseada. En otra realización, el vector de expresión es un vector de expresión en levadura. Los ejemplos de vectores para expresar en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSed (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982, Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54:113-123), pYES2 (Invítrogen Corp., San Diego, CA) y pPicZ (Invitrogen Corp., San Diego, CA). Como alternativa, el vector de expresión es un vector de expresión en baculovirus. Los vectores para baculovirus disponibles para expresar las proteínas en células de insectos cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al., 1983, Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Luckiow y Summers, 1989, Virology 170:31-39). En aún otra realización, se expresa un ácido nucleico de la invención en células vegetales usando un vector de expresión en plantas, incluyendo, sin limitaciones, el virus en mosaico del tabaco y los vectores de expresión con virus de papa. En la técnica se conocen otros sistemas de expresión apropiados para células procariotas y eucariotas (véanse, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al. 1990, Molecular Cloníng, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Puede usarse una cantidad de promotores en la práctica de la invención.

Los promotores pueden seleccionarse sobre la base del resultado deseado. Los ácidos nucleicos pueden combinarse con promotores constitutivos, específicos para tejidos, inducibles u otros, con el fin de obtener expresión en el organismo huésped. Un "promotor con especificidad tisular" puede dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la presente invención en un tejido, un órgano o un tipo celular específico. Los promotores con especificidad tisular pueden ser inducibles. De forma similar, los promotores con especificidad tisular pueden promover la transcripción dentro de un marco de tiempo o una etapa de desarrollo determinada en dicho tejido. Otros promotores con especificidad tisular pueden ser activos durante el ciclo vital de un tejido particular. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que un promotor con especificidad tisular puede dirigir la expresión de secuencias unidas operativamente en tejidos distintos del tejido blanco. Por consiguiente, como se lo usa en la presente documentación, un promotor con especificidad tisular es uno que dirige la expresión preferiblemente en el tejido o el tipo celular deseado, pero también puede conducir a un cierto grado de expresión en otros tejidos. Puede usarse una cantidad de promotores con especificidad tisular en la presente ¡nvención. Con el promotor apropiado, puede realizarse el direccionamiento hacia cualquier órgano, tal como órganos/estructuras vegetativas de los brotes (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estámenes, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endosperma y recubrimiento de las semillas) y frutos. Por ejemplo, los promotores que dirigen la expresión de ácidos nucleicos en hojas, raíces o flores son útiles para mejorar la resistencia a las plagas que infectan estos órganos. Para expresar un polinucleótido de la presente invención en los órganos vegetativos aéreos de una planta, pueden usarse promotores específicos para órganos fotosintéticos, tales como el promotor RBCS (Khoudi et al., Gene 197:343, 1997). Puede lograrse la expresión específica en raíz de los polinucleótidos de la presente ¡nvención bajo el control de un promotor específico para raíz, tal como, por ejemplo, el promotor del gen ANR1 (Zhang y Forde, Science, 279:407, 1998). Otros ejemplos de promotores incluyen el promotor del gen de glutamina sintetasa de soja específico para raíz (Hirel et al., 1992, Plant Molecular Biology 20:207-218) y el elemento de control específico para raíz del gen GRP 1.8 del poroto francés (Keller et al., 1991 , The Plant Cell 3:1051-1061).

Un "promotor constitutivo" se define como un promotor que dirige la expresión de un gen en todos los tejidos, y que es activo bajo casi cualquier condición ambiental y estado del desarrollo o la diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de inicio de la transcripción del virus en mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, el promotor 1' o 2' derivado del ADN-T de Agrobacterium tumafaciens, y otras regiones de inicio de la transcripción de varios genes vegetales conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Estos genes incluyen, por ejemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang et al. 1996, Plant Mol. Biol. 33:125-139), Cat3 de Arabidopsis (N° de acceso GenBank U43147, Zhong et al., 1996, Mol. Gen. Genet. 251 :196-203), el gen que codifica la proteína transportadora estearoil-acil desaturasa de Brassica napus (N° de acceso Genbank X74782, Solocombe et al. 1994, Plant Physiol. 104:1 167-1176), GPd de maíz (N° de acceso Genbank X15596, Martínez et al., 1989, J. Mol. Biol 208:551-565), y Gpc2 de maíz (N° de acceso Genbank U45855, Manjunath et al., 1997, Plant Mol. Biol. 33:97-112). Puede usarse cualquier promotor constitutivo fuerte, tal como el promotor CaMV 35S, para expresar los polinucleótidos de la presente invención en la planta. El término "promotor inducible" hace referencia a un promotor que está bajo un control ambiental o de desarrollo preciso. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden desencadenar la transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas, temperatura elevada, la presencia de luz o rocío con sustancias químicas/hormonas.

Los promotores constitutivos apropiados para usar en una célula huésped vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor nuclear del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos relacionados (Publicación Internacional N° WO 99/43838 y Patente de los EEUU N° 6072050); el promotor nuclear CaMV 35S (Odell et al., 1985, Nature 313:810-812); el promotor de actina de arroz (McEIroy et al., 1990, Pkant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al., 1991 , Theor. Appl. Genet. 81 :581-588); MAS (Velten et al., 1984, EMBO J. 3:2723-2730); el promotor ALS (Patente de los EEUU N° 5659026) y semejantes (por ejemplo, Patentes de los EEUU N° 5608149; 5608144; 5604121 ; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 y 6177611). Otro aspecto de la invención se relaciona con células huésped en las cuales se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan indistintamente en la presente documentación. Puede comprenderse que estos términos no solamente hacen referencia a la célula particular en sí, sino también a la progenie potencial de dicha célula. Como pueden ocurrir algunas modificaciones en las generaciones sucesivas, debido a la mutación o a influencias ambientales, esta progenie, de hecho, puede no ser idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del alcance del término, tal como se lo usa en la presente documentación. Por consiguiente, la presente invención provee una célula huésped que contiene un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de la invención, o una variante de éste. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota (por ejemplo, £ coli, Bacillus thuringiensis) o eucariota (por ejemplo, células de insectos, levaduras o células vegetales). La ¡nvención también provee un método para expresar un ácido nucleico de la invención para obtener de este modo el polipéptido codificado, que comprende los siguientes pasos: i) cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención bajo condiciones que permiten la producción del polipéptído codificado; y ii) aislar el polipéptido expresado. Puede introducirse ADN vector en células procariotas o eucariotas mediante procedimientos de transformación o transfección convencionales. Como se los usa en la presente documentación, los términos "transformación" y "transfección" hacen referencia a una variedad de procedimientos reconocidos en la técnica para ¡ntroducir moléculas de ácidos nucleicos extrañas en una célula huésped, incluyendo co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Pueden hallarse métodos apropiados para transformar o transfectar células huésped en la técnica (por ejemplo, Sambrook, et al. supra.). 5.7 Producción de plantas transgénicas Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para transformar una planta o una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico de la presente ¡nvención. Pueden incorporarse moléculas de ácidos nucleicos en ADN vegetal (por ejemplo, ADN genómico o ADN de cloroplasto), o puede mantenérselas sin insertarlas en el ADN de la planta (por ejemplo, mediante el uso de cromosomas artificiales). Los métodos apropiados para ¡ntroducir moléculas de ácidos nucleicos en células vegetales incluyen microinyección (Crossway et al., 1986, Biotechniques 4:320-334); electroporación (Riggs et al., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. 83:5602-5606; D'Halluin et al., 1992, Plant Cell 4:1495-1505); transformación mediada por Agrobacterium (Patentes de los EEUU N° 5563055 y 5981840, Osjoda et al., 1996, Nature Biotechnology 14:745-750; Horsch et al., 1984, Science 233:496-498, Fraley et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. 80:4803, y Gene Transfer to Plants, Potrykus, editor, Springer-Verlag, Berlín 1995); transferencia directa de genes (Paszkowski et al., 1984, EMBO J. 3:2717-2722); aceleración balística de partículas (Patentes de los EEUU N° 4945050; 5879918; 5886244; 5932782; Tomes et al., 1995, "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment, en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg y Phillips, Springer-Verlag, Berlín; y McCabe et al., 1988, Biotechnology 6:923-926); transformación mediada por virus (Patentes de los EEUU N° 5889191 5889190 5866785 5589367 y 5316931); transformación de polen (De Wet et al., 1985, en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, editado por Chapman et al., Longman, Nueva York, pp. 197-209); transformación Lee 1 (Solicitud de Patente de los EEUU con N° serial 09/435054, Publicación Internacional N° WO 00/28058); transformación mediada por fibrillas (Kaeppler et al., 1990, Plant Cell Reports 9:415-418; Kaeppler et al., 1992, Theor. Appl. Genet. 84:560-566); y tecnología de transformación de cloroplastos (Bogorad, 2000, Trends in Biotechnology 18: 257-263; Ramesh et al., 2004, Methods Mol Biol. 274:301-7; Hou et al., 2003, Transgenic Res. 12:111-4; Kindle et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. 88:1721-5; Bateman y Purton, 2000, Mol Gen Genet. 263:404-10; Sidorov et al., 1999, Plant J. 19:209-216). La elección de los protocolos de transformación usados para generar plantas y células vegetales transgénicas puede variar dependiendo del tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, que se desea transformar. Los ejemplos de protocolos de transformación particularmente apropiados para un tipo de planta particular incluyen aquellos para papa (Tu et al., 1998, Plant Molecular Biology 37:829-838; Chong et al., 2000, Transgenic Research 9:71-78); soja (Christou et al., 1988, Plant Physiol. 87:671-674; McCabe et al., 1988, BioTechnology 6:923-926; Finer y McMullen, 1991 , In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182; Singh et al., 1998, Theor. Appl. Genet. 96:319-324); maíz (Klein et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. 85:4305-4309; Klein et al., 1988, Biotechnology 6:559-563; Klein et al., 1988, Plant Physiol. 91 :440-444; Fromm et al., 1990, Biotechnology 8:833-839; Tomes et al., 1995, "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, editado por Gamborg (Springer-Verlag, Berlín)); cereales (Hooykaas-Van Slogteren et al., 1984, Nature 311 :763-764; Patente de los EEUU N° 5736369). En algunas realizaciones, se usa más de una construcción de transformación para generar las plantas y las células vegetales transgénicas. Pueden incluirse construcciones múltiples en posiciones cis o trans. En realizaciones preferidas, cada construcción tiene un promotor y otras secuencias reguladoras. Las células vegetales transformadas obtenidas a través de cualquiera de los procedimientos de transformación anteriores pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posea el genotipo transformado, y por consiguiente, el fenotipo deseado. Estos procedimientos de regeneración se basan en la manipulación de determinadas fitohormonas en un medio de cultivo de tejido, típicamente se basan en un marcador biocida y/o herbicida que ha sido introducido en combinación con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en la técnica (por ejemplo, Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, Nueva York, 1983; y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Ratón, 1985). También puede efectuarse la regeneración a partir de callos de plantas, explantes, órganos o partes de éstos. Estos procedimientos de regeneración también se describen en la técnica (por ejemplo, Klee et al. 1987, Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486). El término "planta" incluye plantas completas, órganos/estructuras de brotes vegetativos (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estámenes, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endosperma y recubrimiento de las semillas) y frutos (el ovario maduro), tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, tejido enterrado y semejantes) y células (por ejemplo, células de guarda, células huevo, tricomas y semejantes), y progenie de éstas. La clase de plantas que puede usarse en los métodos de la presente invención incluye la clase de las plantas superiores e ¡nferiores susceptibles de ser transformadas con los procedimientos descriptos, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, mohos y algas multicelulares. También se incluyen plantas con una variedad de niveles de ploidía, incluyendo plantas aneuploides, poliploides, diploídes, haploides y hemicigotas. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden usarse para conferir caracteres deseados esencialmente a cualquier planta. Por consiguiente, la invención puede usarse sobre un amplio rango de plantas, incluyendo especies de los géneros Agrotis, Allium, Ananas, Anacardium, Apium, Arachis, Asparagus, Athamantha, Atropa, Avena, Bambusa, Beta, Brassica, Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Carica, Ceratonia. Cicer, Chenopodium, Chicorium, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Coix, Cucumis, Cucúrbita, Cynodon, Dactylis, Datura, Daucus, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eiiusine, Euphorbia, Festuca, Ficus, Fragaria, Geranium, Glicine, Graminae, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hibiscus, Hordeum, Hyosciamus, Ipomoea, Lactuca, Lathyrus, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lupinus, Lycopersicon, Macadamia, Macrophylla, Malus, Mangifera, Manihot, Majorana, Medicago, Musa, Narcissus, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis, Olea, Olyreae, Oryza, Panicum, Panicum, Panieum, Pannisetum, Pennisetum, Petunia, Pelargonium, Persea, Pharoideae, Phaseolus, Phleum, Picea, Poa, Pinus, Pistachia, Pisum, Populus, Pseudotsuga, Pirus, Prunus, Pseutotsuga, Psidium, Quercus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus, Rhododendron, Rosa, Saccharum, Salpiglossis, Sécale, Senecio, Setaria, Sequoia, Sinapis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobromus, Trigonella, Trifolium, Trígonella, Triticum, Tsuga, Tulipa, Vicia, Vitis, Vigna y Zea. En realizaciones específicas, las plantas transgénicas son plantas de maíz, papa, arroz, soja o algodón.

Las plantas transgénicas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con distintas cepas. Pueden cultivarse dos o más generaciones de las plantas para asegurar la expresión de la molécula de ácido nucleico o el polipéptido deseado, y/o el mantenimiento y la herencia estable de la característica fenotípica deseada. Aquellos entrenados en la técnica reconocerán que, después de incorporar en forma estable la molécula de ácido nucleico de la presente invención en las plantas transgénicas y confirmar su operación, puede introducírsela en otras plantas por cruzamiento sexual. Puede usarse cualquiera de una cantidad de procedimientos de cruzamiento convencionales, dependiendo de las especies a cruzar. 5.8 Determinación de la expresión en plantas trans énicas Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para determinar el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico de la invención, o un polipéptido codificado por ésta, en una planta. Por ejemplo, puede determinarse el nivel de expresión de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención en una planta por inmunoensayo, electroforesis cuantitativa en gel, etcétera. Adicionalmente, puede determinarse el nivel de expresión de un polipéptído codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención en una planta a través del grado de alteración que presenta el fenotipo de la planta. En una realización específica, la resistencia mejorada a insectos es el fenotipo a analizar. Como se lo usa en la presente documentación, "resistencia mejorada a insectos" hace referencia a una mayor resistencia de una planta transgénica que expresa un polipéptido de la invención al consumo y/o la infestación por un insecto plaga, en comparación con una planta que no expresa un polipéptido de la invención. Puede medirse la resistencia mejorada en una cantidad de formas. En una realización, se mide la resistencia mejorada a través del daño reducido en una planta que expresa un polipéptído de la invención, en comparación con una planta que no expresa un polipéptido de la ¡nvención, después del mismo período de incubación con insectos. El daño causado por los Insectos puede evaluarse en forma visual. Por ejemplo, puede medirse el daño después de la infestación en plantas de algodón buscando directamente señales de alimentación por parte de los insectos en los copos de la planta de algodón. En otra realización, se mide la resistencia mejorada a través de un rendimiento mejorado del cultivo, en una planta que expresa un polipéptído de la invención, en comparación con una planta que no expresa un polipéptido de la invención, después del mismo período de incubación con insectos. En realizaciones particulares, los insectos plaga son de los órdenes Lepidoptera y/o Díptera. Pueden realizarse las determinaciones usando plantas completas, tejidos de éstas o cultivos de células vegetales. Los contenidos de todos los artículos publicados, los libros, los manuales de referencia y los resúmenes citados en la presente documentación se incorporan por completo en la presente documentación a modo de referencia, con el fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que concierne la invención. Como pueden efectuarse varios cambios en el tema en cuestión sin apartarse del espíritu y el alcance de la presente invención, se interpreta que todo el tema en cuestión contenido en la descripción anterior y/o definido en las reivindicaciones adjuntas puede interpretarse como descriptivo e ilustrativo de la presente invención. Son posibles modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. 6. EJEMPLOS 6.1 Ejemplo 1 : Análisis primario de los insectos El análisis primario de los insectos permitió identificar cultivos Bt activos de una colección de biodiversidad con actividad contra Helicoverpa spp. El análisis se realizó con muestras de complejos de esporas-cristales a una dosis elevada contra larvas neonatas de Helicoverpa zea. Se prepararon complejos de esporas-cristales en placas de producción con cavidades profundas que contenían 1 ml de medio de esporulación CYS (Yamamoto, 1990, Analytical Chemistry of Bacillus thuringiensis 432:46-60). Las placas de producción se incubaron con 10 µl de cultivos de semillas, que habían sido mantenidos congelados a -80°C y se habían incubado a 30°C, a 350 rpm por 3 días, hasta que la mayoría de los cultivos hubieran esporulado y liberado esporas y cristales libres. Se centrifugaron las placas a 4000 rpm por 40 minutos para precipitar las esporas, los cristales y las células no usadas. Los complejos de esporas-cristales precipitados se suspendieron en 1 ,2 ml de acetato de potasio 15 mM que contenía 100 µg de lisozima, y se incubó a 30°C, a 250 rpm por 16 horas para asegurar una esporulación y una lisis celular completa. Después de incubar por 16 horas, se recolectaron los complejos de esporas-cristales por centrifugación y se los suspendió en acetato de potasio 15 mM. Este paso con acetato de potasio se repitió una vez. Se preparó la suspensión final de esporas-cristales en 1 ml de acetato de potasio 15 mM, y se la usó para analizar la actividad contra H. zea. El análisis de los insectos se realizó en placas de 96 cavidades poco profundas, cada una de las cuales contenía 150 µl de dieta artificial para insectos. Se colocaron 20 µl de suspensión de esporas-cristales en la dieta para insectos. Se clocaron aproximadamente 5 larvas neonatas en cada cavidad. Se incubaron las placas de ensayos para insectos a 29°C por 3 días. Las respuestas de los insectos ante los cristales Bt incluyeron la inhibición de la alimentación y la mortalidad. Aproximadamente 400 cultivos presentaron una mortalidad sustancial y, por ende, se los identificó como positivos. Cry2Ax estuvo entre los positivos. 6.2 Ejemplo 2: Barajado de ADN para aislar polipéptidos derivados de Cry2Ax Comenzando con el polipéptido Cry2Ax (SEQ ID N° 2) y el polipéptido Cry2Ab* (Cry2Ab* tiene 2 cambios de aminoácidos respecto de Cry2Ab tipo salvaje; K por R en la posición 36 y M por T en la posición 241 del N° de acceso Genbank M23724), se crearon moldes de ADN sintético para realizar barajado de ADN. Usando una comparación filogenética de Cry2Ab (N° de acceso Genbank M23724) y Cry2Ax (SEQ ID N° 2), se creó una biblioteca donde variaban las 40 posiciones de aminoácidos (véase la sección 5.1) que eran diferentes entre las dos secuencias de polipéptidos. Se crearon bibliotecas de ADN barajado usando barajado dirigido de oligonucleótidos, donde el gen sintético que codificaba Cry2Ax actuó como ADN molde progenitor. Se clonaron las bibliotecas de ADN por PCR en pMAXY3219, reemplazando el gen Cry2Ab*. Se construyeron clones con la toxina de modo tal que se expresaran como una fusión con la proteína de unión a maltosa de £. coli (MBP). El análisis primario de los insectos permitió identificar cultivos activos contra Helicoverpa spp. El análisis se realizó incorporando una pequeña cantidad de cultivo de E. coli que expresaba el polipéptido de fusión MBP::derivado de Cry2Ax a una dosis baja en una dieta artificial, a lo que siguió una infestación con larvas de H. zea larvae. El análisis se realizó en placas de 96 cavidades poco profundas, cada una de las cuales contenía 150 µl de dieta artificial para insectos. Se colocaron aproximadamente 0,5 µl de cultivo que expresaba el polipéptído de fusión MBP::derivado de Cry2Ax en la dieta para insectos. Se clocaron aproximadamente 5 larvas neonatas en cada cavidad. Se incubaron las placas de ensayos para insectos a 29°C por 4 días. Las respuestas de los insectos ante las muestras de E. coli incluyeron la ¡nhibición de la alimentación y la mortalidad. Aquellas muestras que causaron detención del crecimiento severa o muerte se prepararon para realizar un análisis adicional. Para el segundo experimento de barajado, se amplificaron los moldes de ADN progenitor de los clones 38 (D_S00503480) (SEQ ID N° 4) y 44 (D_S00503970) (SEQ ID N° 6) por PCR en presencia de uracilo, y luego se los fragmentó con uracilo N-glicosilasa. Luego se mezclaron los moldes fragmentados y se los re-ensambló antes de amplificar los moldes recombinantes por PCR. Se creó una biblioteca de estos moldes barajados en pMAXY3219, como se describió previamente. Se indica la secuencia de algunos de los clones aislados del primer y el segundo experimento de barajado en la Tabla 3, donde se detallan los residuos de aminoácidos cambiados. Con el fin de diversificar adidonalmente uno de los dos aciertos de mayor desempeño en el segundo experimento, se modificó el clon 473R (D_S01037677) (SEQ ID N° 18), que contiene los primeros 46 residuos de aminoácidos en la región amino terminal del polipéptido, para que contuviera los residuos hallados en ocho secuencias de polipéptidos Cry2 diferentes (es decir, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac, Cry2Ad, Cry2Ae, Cry2Af, Cry2Ag y Cry2Ax). Además, se reemplazaron dos residuos, 113 y D15, por los residuos conservativos valina y glutamato, respectivamente (véase la Tabla 4). El clon modificado se denominó clon 473N (SEQ ID N° 8). 6.3 Ejemplo 3: Actividad de los polipéptidos derivados de Cry2Ax El análisis de las actividades de los clones barajados se realizó en varias etapas. Inicialmente se buscó actividad insecticida elevada en los clones agregando una pequeña cantidad de £ coli que expresaban una proteína de fusión clonal a dieta artificial para larvas de H. zea de primer estadio. Los clones que provocaron muerte completa o detención completa del crecimiento de las larvas se seleccionaron para continuar los estudios. Aquellos clones que demostraron una actividad insecticida elevada se usaron posteriormente para crear una nueva biblioteca en un vector de expresión de plantas en Agrobacterium tumefaciens. Se analizó la biblioteca co-cultivando cada clon en cuatro réplicas con larvas de N. benthamiana (usando la infiltración forzada de cada cultivo respectivo), y luego alimentando cada disco correspondiente a larvas de H. zea de 3er estadio. Después de un período de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación por observación visual, y se la expresó como una fracción aproximada de área foliar remanente. Los clones que pasaron esta repetición adicional de los ensayos de expresión en £ co///incorporación en la dieta, fueron clonados nuevamente en forma individual en el vector de expresión en plantas pMAXY4384. Se evaluó la eficacia in planta como se describió previamente. Se detalla una evaluación final de la actividad in planta de los mejores aciertos del ensayo de expresión con múltiples partes en £ coli y el abordaje de bibliotecas vegetales en la FIG. 1. A partir de este análisis, varios clones parecieron presentar una mayor actividad insecticida, incluyendo 7K (D_S01000779) (SEQ ID N° 10), 15K (D_S00999080) (SEQ ID N° 12), 16K (D_S01000269) (SEQ ID N° 14), 16R (D_S01037143) (SEQ ID N° 16) y 473R (D_S01037677) (SEQ ID N° 18). 6.4 Ejemplo 4: Barajado de ADN para aislar otros polipéptidos derivados de Crv2Ax Se usaron los clones 44 (D_S00503970) (SEQ ID N° 6), 473R (D_S01037677) (SEQ ID N° 18), que fueron los aciertos de barajado del 1er y el 2o experimento de barajado, como se describe en la sección 6.2, y Cry2Ab*, como moldes para continuar el barajado. Usando estos moldes y barajado dirigido a oligonucleótidos, se crearon polipéptidos derivados con diversidad de aminoácidos respecto de los polipéptidos Cry2 tipo salvaje (es decir, Cry2Ae y Cry2Ag), así como sustituciones de aminoácidos conservativas generadas al azar, y sustituciones al azar dentro de los segmentos de determinadas regiones de rizos estructurales. Se clonaron las bibliotecas de ADN barajadas en pMAXY3219 reemplazando el gen Cry2Ab*. Los clones con toxinas están construidos de modo tal que se expresan como una fusión con la proteína de unión a maltosa de £ coli (MBP). Se proporciona un resumen de las secuencias aisladas en Tablas 5-7. 6.5 Ejemplo 5: Actividad de polipéptidos derivados de Cry2Ax adicionales Con el fin de evaluar la actividad de los polipéptidos derivados barajados contra la plaga de algodón Helicoverpa zea, se realizó un análisis de alto desempeño usando dietas artificiales que contenían células completas de E. coli, que expresaban una proteína de fusión del clon, como se describió previamente. Los clones con mayor nivel de actividad se analizaron adicionalmente in planta, para confirmar que los cambios realizados en cada polipéptído derivado no hubieran presentado un impacto negativo sobre la expresión genética o la acumulación de proteínas en células vegetales. Para iniciar este proceso, se clonó cada polipéptído derivado de Cry2Ax en un vector de expresión en plantas basado en Agrobacterium tumefaciens, se los transformó en la cepa huésped de Agrobacterium y luego se los dispuso en placas de microtitulación. Luego se analizaron los aciertos co-cultivando cada uno en cuatro réplicas con hojas de N. benthamiana (usando infiltración forzada de cada cultivo respectivo), a lo que siguió la alimentación de cada disco correspondiente a larvas de H. zea de 3er estadio. Después de un período de incubación de 24 horas, se determinó la actividad de alimentación en cada disco empleando un método de captura y análisis visual como se describió previamente. Algunos polipéptidos derivados de este proceso mejoraron en comparación con los clones progenitores. Uno de estos clones es D_S01764701 (SEQ ID N° 134), que presentó una actividad mejorada respecto del clon 44. Los resultados de alimentación de los tres experimentos se presentan en la FIG. 2. 6.6 Ejemplo 6: Plantas transqénicas que expresan el clon 44 Se generaron plantas de tabaco transgénicas que expresaban el clon 44 (D_S00503970) mediante transformación mediada por Agrobacterium con selección con glifosato, usando los vectores binarios pMAXY5469 y pMAXY5471. Estos vectores contienen un gen GAT dirigido por dSVBV y una molécula de ácido nucleico del clon 44 dirigida por dMMV (SEQ ID N° 5). pMAXY5469 difiere de pMAXY5471 porque contiene señales de direccíonamíento a plástidos fusionadas a la región codificante del clon 44, lo que permite que esta variante de la toxina se acumule en el compartimiento del plástido. Se generaron aproximadamente 25 transformantes para cada construcción. Se colocaron los discos de hojas que expresaban el clon 44 en un lecho de agar en una bandeja de titulación de 48 cavidades, y luego se los infestó con larvas de Helicoverpa zea de 3er estadio y larvas de Spodoptera exigua de 4o estadio. Las hojas se incubaron por 24 horas con las larvas, y luego se retiraron las larvas y se observó el área foliar remanente con equipo de captura en video para realizar el cálculo real del área foliar relativa remanente (cantidad de píxeles). Se indican los resultados usando las mejores transformantes para cada vector en la FIG. 3A para H. zea y la FIG. 3B para S. exigua. Se tomaron 6 discos de hojas de cada planta transgénica para realizar el análisis indicado. Luego se evaluó la expresión del polipéptido del clon 44 en el plástido (FIG. 4A) o el compartimiento citoplasmático (FIG. 4B) de plantas de tabaco transgénicas por Western blot, usando un anticuerpo políclonal dirigido contra la región N-terminal del polipéptido del clon 44. Los números de los carriles en la FIG. 4 corresponden a los números de las plantas en la FIG. 3. El anticuerpo policlonal usado en el Western blot se preparó inmunizando pollos con tripsina purificada truncada con el polipéptido del clon 44, y luego purificando anticuerpos específicos contra Cry2 usando una columna de afinidad preparada con tripsina purificada truncada con el polipéptido del clon 44 como sustrato. La diferencia más obvia entre los dos tipos de plantas transgénicas es que la inhibición de S. exigua es mucho mayor para la toxina acumulada en el plástido (comparando los paneles derecho e izquierdo de la FIG. 3B). Estos datos se correlacionan en general con los datos de expresión (FIG. 4), que muestran que las plantas que contienen el ADN-T derivado de 5469 (FIG. 4A) son capaces de producir mucha más toxina que aquellas de 5471 (FIG. 4B).

Tabla 1 : secuencias de Cry2Ax y derivadas de Cry2Ax Tabla 2: Tabla de codones Aminoácidos Codón Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteina Cys C UGC UGU Ácido Asp D GAC GAU aspártico Acido Glu E GAA GAG glutámico Fenilalanina Phe F UUC uuu Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina He I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparragina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAÁ CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACÁ ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp w UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU L? Tabla 4: Comparación de secuencia de polipéptidos Cry2 tipo salvaje con el clon 473N Tabla 5: Secuencia de clones de interés aislados por barajado de ADN usando Crv2Ab* como gen progenitor Lp Lp Tabla 5: (cont.) Lp s> Lp Tabla 5: (cont.) Lp 00 Lp vD Tabla 5: (cont.) o J 00 Tabla 5: (cont.) s •I-- Lp Tabla 5: (cont.) Tabla 5: (cont.) oo vO Tabla 5: (cont.) o Tabla 6: Tabla 6: Secuencia de los clones de interés aislados por barajado de ADN, usando el clon 44 como progenitor 74 Tabla 7: Secuencia de clones de interés aislados por barajado de AND usando el clon 473R como progenitor 75 01 76 Tsá

Claims

REIVINDICACIONES: 1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende cualquiera de SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, o un complemento de ésta.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste en: a) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID N° 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21,23,25,27,29,31,33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, o un complemento de ésta; b) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260; c) una molécula de ácido nucleico que hibridiza con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, o un complemento de ésta, después de al menos un lavado en SSC 0,2X a 55°C por 20 minutos; y d) un fragmento que comprende al menos 600 nucleótidos consecutivos de cualquiera de SEQ ID N° 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45> D51, A58, V69, 8, N79, K99, Tus, V?24, E?25, R?2g, N138, Rl39, A141, Tl62, Ql65, M166, l83, Il92, H211, R213, R217, D218, V324, I386, T399, S405, Q445, 1551. S587, Id91, UlO Y 1-631 -
4. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 ó 2, donde la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido con actividad insecticida.
5. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 4, donde los dípteros o los lepidópteros son susceptibles a la actividad insecticida del polipéptido.
6. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ó 2.
7. El vector de la reivindicación 6, que es un vector de expresión.
8. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6 ó 7.
9. La célula huésped de la reivindicación 8, donde la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula vegetal, una célula bacteriana, una célula fúngica. 10. Un polipéptido aislado que comprende cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8,
10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 1 16, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260.
11. Un polipéptido aislado seleccionado del grupo que consiste en: a) un polipéptido que es al menos 95% idéntico a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260; b) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 95% idéntico a cualquiera de SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, o un complemento de éstas; c) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que hibridiza con una sonda de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de cualquiera de SEQ ID N° 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, o un complemento de ésta, después de al menos un lavado en SSC 0,2X a 55°C por 20 minutos; d) un fragmento que comprende al menos 200 aminoácidos consecutivos de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260.
12. El polipéptido aislado de la reivindicación 11 , donde el polipéptido comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en H2, S7, Q27, Q35, E36, K43, D44, N45, D51, A58, V69, R78, N79, K99, Tus, V 24, E?25, R?2g, Nl38> Rl39, AH1 > Ti62> Ql65> M166, 1-183, Il92, H21I , R213, R217, D2I8, V324, I386, T399, S405, Q445> 1551, S587, Id91, L-610 Y 1-631 -
13. El polipéptido aislado de la reivindicación 10 u 11 , donde el polipéptido tiene actividad insecticida.
14. El polipéptido aislado de la reivindicación 13, donde los dípteros o los lepidópteros son susceptibles a la actividad insecticida del polipéptido.
15. Una planta transgénica que comprende un transgen que expresa (a) un polipéptido de cualquiera de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260; o (b) una molécula de ácido nucleico de cualquiera de SEQ ID N° 1 , 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51 , 53, 55, 57, 59, 61 , 63, 65, 67, 69, 71 , 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85, 87, 89, 91 , 93, 95, 97, 99, 101 , 103, 105, 107, 109, 111 , 113, 115, 117, 119, 121 , 123, 125, 127, 129, 131 , 133, 135, 137, 139, 141 , 143, 145, 147, 149, 151 , 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171 , 173, 175, 177, 179, 181 , 183, 185, 187, 189, 191 , 193, 195, 197, 199, 201 , 203, 205, 207, 209, 21 1 , 213, 215, 217, 219, 221 , 223, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241 , 243, 245, 247, 249, 251 , 253, 255, 257, 259.
16. La planta transgénica de la reivindicación 15, donde la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, papa y algodón.
17. La planta transgénica de la reivindicación 15, donde la planta transgénica presenta mayor resistencia a un insecto plaga en comparación con una planta que no es transgénica.
18. La planta transgénica de la reivindicación 17, donde el insecto plaga es un díptero o un lepidóptero.
19. Una planta transgénica que comprende un transgen que expresa (a) un polipéptido de la reivindicación 11 , o (b) una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.
20. La planta transgénica de la reivindicación 19, donde la planta se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, papa y algodón.
21. La planta transgénica de la reivindicación 19, donde la planta transgénica presenta mayor resistencia a un insecto plaga en comparación con una planta que no es transgénica.
22. La planta transgénica de la reivindicación 21 , donde el insecto plaga es un díptero o un lepidóptero.
23. Una composición que comprende uno o más polipéptidos de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 1 10, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260 y un agente, donde el agente se selecciona del grupo que consiste en coadyuvantes dispersantes-adhesivos, agentes estabilizadores, aditivos insecticidas, diluyentes, agentes tensioactivos, emulsificantes y dispersantes.
24. La composición de la reivindicación 23, donde la composición comprende además células.
25. La composición de la reivindicación 24, donde las células están completas o usadas.
26. La composición de la reivindicación 25, donde las células están en suspensión o precipitadas.
27. La composición de la reivindicación 23, donde la composición comprende además un complejo de esporas-cristales de Bacillus thuringiensis.
28. La composición de la reivindicación 23, donde el polipéptido está purificado.