KR20230147092A - 항-her-2/trop-2 작제물 및 이의 용도 - Google Patents

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하이훙 중
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Abstract

본 출원은 HER2 및 Trop-2 둘 모두에 결합하는 신규 이중특이적 항원 결합 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 이들 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 인간 HER2 또는 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 인간 Trop-2 또는 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 이중특이적 항체는 HER2 및 Trop-2에 대해 높은 결합 친화도를 가지며, HER2 및/또는 Trop-2를 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있다. 이중특이적 항체-약물 접합체(ADC)는 시험관내 및 생체내 HER2 및/또는 Trop-2를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다. 이중특이적 항체는 HER2- 및/또는 Trop-2-관련 인간 질환(예를 들어, 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 천식, 이식 거부 및 염증성 장애)을 진단, 예진 및 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

항-HER-2/TROP-2 작제물 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
이 출원은 2021년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 63/140,638의 우선권을 주장하며, 그 내용은 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
기술 분야
본 개시는 항-HER2/Trop2 작제물 및 이의 용도에 관한 것이다.
ASCII 텍스트 파일에 대한 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일에 대한 하기 제출 내용은 전체가 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식(CRF)(파일 이름: 227362000440SEQLIST.TXT, 기록일: 2022년 1월 24일, 크기: 104,030바이트).
오늘날 암은 개발된 수많은 고급 진단 및 치료 방법에도 불구하고 전세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있다. 암의 성공적인 치료 및 방지에 대한 주요 장벽은 많은 암이 여전히 현재의 화학치료 및 면역치료법 개입에 반응하지 못하고 많은 개인이 적극적인 치료 후에도 재발하거나 사망한다는 사실에 있다.
암 면역치료법은 르네상스를 누리고 있으며 지난 몇 년 동안 이 빠르게 발전하는 분야에서는 암을 치료하는 몇 가지 새로운 방법을 개발했다. 수많은 암 면역치료법 전략은 특정 종양 항원에 대한 고갈 항체를 사용한 치료; 항체-약물 접합체를 사용한 치료; 공동 자극 또는 공동 억제 분자(면역 체크포인트)에 대한 효능, 길항 또는 차단 항체를 사용한 치료; 이중특이적 T 세포 연관 항체(BiTE®), 예컨대 블리나투모맙을 사용한 치료; 생물학적 반응 변형제, 예컨대 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ의 투여가 관여하는 치료; 치료용 백신, 예컨대 시푸류셀-T를 사용한 치료; 수지상 세포 백신 또는 종양 항원 펩티드 백신을 사용한 치료; 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포를 사용한 치료; CAR-NK 세포를 이용한 치료; 종양 침윤 림프구(TIL)를 사용한 치료; 및 차용 전달된 항-종양 T 세포(생체외 확장 및/또는 TCR 트랜스제닉)를 사용한 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 광범위한 연구 및 임상 평가의 초점이었다.
인간 표피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원인 HER2(CD340 또는 ERBB2로도 알려짐)는 주로 HER2 게놈 증폭으로 인해 유방암, 위암 및 폐암을 포함하는 특정 악성종양에서 비정상적으로 발현된다. HER2 과발현은 이러한 암에서 재발 위험 증가 및 더 불량한 예후와 관련이 있다. HER2 양성 악성종양에서, 이 단백질은 하류 RAS-RAF-ERK 및 PI3K-PTEN-AKT 신호전달을 자극하고 세포 증식에 중요한 역할을 할 수 있다.
영양막 세포 표면 항원-2(Trop-2)(종양 관련 칼슘 신호 전달인자 2(TACSTD1), 막 구성요소 염색체 1 표면 마커 1(M1S1), 위장관 항원 733-1(GA733-1) 및 상피 당단백질-1(EGP-1))은 적어도 2개의 I형 막 단백질을 포함하는 TACSTD 패밀리에 속한다. 이는 영양막 세포의 세포 표면 마커로 처음 발견되었지만 후속 연구에서는 Trop-2가 상이한 암 유형에서 과발현됨을 제시하였다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시는 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
한 측면에서 본 출원은 HER2 및 Trop-2 둘 모두에 특이적으로 결합하는 신규 작제물(예를 들어, 본원에 기재된 이중특이적 항체 또는 ADC)을 제공한다. 일부 구현예에서, 이들 작제물은 HER2 및 Trop2 중 하나를 표적화하는 scFv와 융합된 HER2 및 Trop-2 중 다른 하나를 표적화하는 전장 항체를 포함한다. 예를 들어, 도 1-5를 참고한다. 일부 구현예에서, 작제물은 모 항체보다 높은 수준으로 HER2 및/또는 Trop2를 발현하는 암 세포에 강하게 결합하는 그 능력에 있어서 특히 유리하다(예를 들어, 도 6a에 나타낸 바와 같은 예시된 이중특이적 항체 HT002 및 TH002 참고). 일부 구현예에서, 작제물은 높은 수준의 HER2 및/또는 Trop-2를 발현하는 암 세포에 강하게 결합하는 그 능력에 있어서 특히 유리하다(예를 들어, 도 7에 나타낸 예시된 이중특이적 항체 HT002 및 TH001b 참고). 일부 구현예에서, 작제물은 오래가는 및/또는 완전 항종양 반응을 달성하는 그 능력에 있어서 특히 유리하다(예를 들어, 도 12 참고).
또 다른 측면에서 본 출원은 예를 들어 암을 치료하기 위해 본원에 기재된 작제물을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 암은 HER2 양성 및/또는 Trop-2 양성이다. 일부 구현예에서, 암은 HER2 저발현 및/또는 Trop-2 저발현이다. 일부 구현예에서, 암은 HER2 고/중발현 및/또는 Trop-2 고/중발현이다.
이중특이적 항체는 2개의 상이한 항원 또는 하나의 항원의 2개의 상이한 부위에 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 2개의 상이한 항원 결합 부위를 포함하는 항체이다. 2개의 상이한 신호전달 경로를 동시에 차단함으로써 종양 세포 사멸을 강화하는 것 외에도, 이중특이적 항체는 또한 하나가 아닌 2개의 상이한 세포 표면 항원과 상호작용함으로써 잠재적으로 결합 특이성을 증가시킬 수 있다. 그것은 오늘날 암 치료법을 위한 효과적인 차세대 분자로 간주된다. 이는 여러 치료 분자의 투여로 인한 규제 및 상업적 문제를 최소화할 수 있다. 또한 모 항체의 혼합물에는 존재하지 않는 신규 활성에 대한 잠재력을 갖는다. 몇 가지 이중특이적 항체가 시판되고 있으며 많은 항체가 임상 개발 중에 있다.
본 출원은 HER2 및 Trop-2 단백질 둘 모두에 특이적으로 결합하고 이를 중화하는 신규 이중특이적 항체 및 항원-결합 단편을 제공한다. 본 출원은 효과기 분자에 연결된 이들 신규 이중특이적 항체 및 항원-결합 단편을 포함하는 ADC를 추가로 제공한다. 따라서, 본 출원은 본원에 기재된 신규 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체, 항원-결합 단편, 및 ADC를 사용하여 HER2 및 Trop-2의 조절로부터 이익을 얻을 병태(예를 들어, 암, 지속적인 감염성 질환, 자가면역 질환, 천식, 이식 거부 및 염증성 장애)를 진단, 예진 및 치료하기 위한 신규 조성물 및 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 출원은 HER2 및 Trop-2 둘 모두에 결합하고 이를 중화하도록 특이적으로 설계된 단리된 이중특이적 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는 작제물을 제공한다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편은 도 1-5에 나타낸 바와 같이 설계된다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인 및 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 HER2 항체 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 Trop-2 항체 결합 부위에 특이적으로 결합한다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인 및 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 Trop-2 항체 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 HER2 항체 결합 부위에 결합한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 scFv 항체 단편을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함한다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 scFv 항체 단편을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 또는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인은 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 VH 및 경쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 VL을 포함한다. 다양한 구현예에서, 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편은 IgG 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, IgG 불변 영역 또는 이의 단편은 IgG1 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, LC 불변 영역은 카파 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 람다 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 도메인을 포함할 수 있는 중쇄를 포함한다. 다양한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다양한 구현예에서, IgG1 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인이다.
다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 인간화 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 인간 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 키메라 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 친화도 최적화 항체이다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 카복시-말단에 공유 결합된다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 카복시-말단 사이에 개재된 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 펩티드 링커는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 아미노-말단에 공유 결합된다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 아미노-말단 사이에 개재된 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 펩티드 링커는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, scFv의 VH 및 VL은 펩티드 링커를 통해 공유 결합된다. 다양한 구현예에서, 펩티드 링커는 서열 번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인, 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인, 및 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인은 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인, 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인은 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인, 및 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인은 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인, 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 면역글로불린 중쇄(HC) 및 면역글로불린 경쇄(LC)를 포함하고, HC는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, LC는 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항체는 적어도 약 1x10-6 M, 적어도 약 1x10-7 M, 적어도 약 1x10-8 M, 적어도 약 1x10-9 M, 적어도 약 1x10-10 M, 적어도 약 1x10-11 M, 또는 적어도 약 1x10-12 M의 해리 상수(KD)로 HER-2 및 Trop-2 단백질에 결합 한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 효과기 분자에 접합되거나 결합된(또는 그렇지 않으면 안정하게 회합된) 이중특이적 HER2/Trop-2 결합 항체를 포함하는 단리된 면역접합체 또는 융합 단백질을 제공한다. 다양한 구현예에서, 효과기 분자는 면역독소, 사이토카인, 케모카인, 약물 모이어티, 치료제 또는 화학치료제이다. 다양한 구현예에서, 본 출원은 화학식 Ab-(L-D)n을 갖는 항체 약물 접합체(ADC)를 제공하며, Ab는 이중특이적 HER2/Trop-2 결합 항체이고, L은 링커이고, D는 약물 모이어티이고, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로부터의 정수이다.
또 다른 측면에서, 본원에 개시된 이중특이적 항체는 추가의 기능적 모이어티, 예컨대 표지 또는 바람직한 약동학적 특성을 부여하는 모이어티에 공유 결합될 수 있다(또는 그렇지 않으면 안정적으로 결합될 수 있음). 다양한 구현예에서, 표지는 형광 표지, 방사성 표지 및 독특한 핵자기 공명 특징부를 갖는 표지로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합된 본 출원의 단리된 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 ADC를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합된 단리된 인간 항체를 포함한다.　다양한 측면에서, 약학 조성물은 피하 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 흉골내 주사, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 척수강내 주사, 심실내 주사, 요도내 주사, 두개내 주사, 활막내 주사로 구성된 군으로부터 선택된 경로를 통한 또는 주입을 통한 투여를 위해 제형화된다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 인간 질환(예를 들어, 암, 감염성 질환, 자가 면역 질환, 천식, 이식 거부 및 염증성 장애)을 진단, 예진 및 치료하기 위한 본 출원의 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 ADC의 용도에 관한 것이다.
다양한 구현예에서, 본 출원은 HER-2- 또는 Trop-2-관련 장애를 앓고 있는 대상체에 치료 유효량의 본 출원의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 ADC를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 다양한 구현예에서, 암은 HER-2 또는 Trop-2의 상승된 발현과 관련된 암이다. 다양한 구현예에서, 암은 결장직장암(CRC), 신장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 전립샘암, 유방암, 난소암, 췌장암, 위암, 간암, 두경부암 및 신경아교종으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 대상체는 이전에 항암 치료법으로의 치료에 반응했지만 치료법 중단 시 재발(이하 "재발성 암")을 겪었다. 다양한 구현예에서, 개체는 내성 또는 불응성 암을 가진다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에 치료 유효량의 본 출원의 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 및 b) 면역치료법, 화학치료법, 소분자 키나제 억제제 표적 치료법, 수술, 방사선 치료법, 백신접종 프로토콜, 줄기 세포 이식 및 면역 세포 치료법(CAR-T, CAR-NK)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 치료법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 감염성 질환을 치료하도록 고안된 조합 치료법에 관한 것이고, 조합 치료법은 종양 세포의 증가된 세포 사멸을 제공하며, 즉 공동-투여될 때 단리된 항체 또는 항원-결합 단편과 추가 치료법 사이에 상승작용이 존재한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 예를 들어, 인간 HER2- 및 Trop-2-관련 질환을 진단하기 위한 샘플에서 인간 HER2- 및 Trop-2 항원의 존재를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 또한 본 출원의 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포가 제공된다. 다양한 구현예에서, 세포는 본 출원의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 다양한 구현예에서, 세포는 하이브리도마이고, 세포의 염색체는 본 출원의 핵산을 포함한다. 세포가 본 출원의 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하도록 하는 조건 하에서 세포를 배양 또는 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 본 출원의 항체 또는 항원 결합 단편을 제조하는 방법이 추가로 제공된다.
도 1은 링커를 통해 부착된 N-말단 허셉틴 scFv를 갖는 항-Trop-2 항체 A1,2X4를 포함하는 대표적인 이중특이적 항체(HT2(HT002)로 지정됨)를 도시한다.
도 2는 링커를 통해 부착된 N-말단 A1,2X4 scFv를 갖는 항-HER2 항체 허셉틴을 포함하는 대표적인 이중특이적 항체(TH2(TH002)로 지정됨)를 도시한다.
도 3은 링커를 통해 부착된 C-말단 hRS7 scFv를 갖는 항-HER2 항체 허셉틴을 포함하는 대표적인 이중특이적 항체(HB1(HT001a)로 지정됨)를 도시한다.
도 4는 링커를 통해 부착된 C-말단 허셉틴 scFv를 갖는 항-Trop-2 항체 hRS7을 포함하는 대표적인 이중특이적 항체(BH1(TH001a)로 지정됨)를 도시한다.
도 5는 링커를 통해 부착된 N-말단 허셉틴 scFv를 갖는 항-Trop-2 항체 hRS7을 포함하는 대표적인 이중특이적 항체(BH2(TH001b)로 지정됨)를 도시한다.
도 6a-6c는 유세포 측정 분석(FACS)에 의한 이중특이적 항체 HT2(HT002) 및 TH2(TH002)(도 6a), HB1(HT001a)(도 6b), BH1(TH001a) 및 BH2(TH001b)(도 6c)의 결합 친화도 평가 결과를 도시하는 선 그래프를 도시한다.
도 7은 이중특이적 항체 TH2(TH002), BH1(TH001a) 및 BH2(TH001b) 내재화의 유세포 측정 분석 결과를 도시한다.
도 8은 감소된 mAb를 갖는 DM 페이로드에 대한 접합 절차를 도시한다.
도 9a-9c는 상이한 수준의 HER2 및 Trop-2 발현을 갖는 종양 세포에서 이중특이적 ADC의 시험관내 세포독성 활성을 도시한다.
도 10a-10b는 BxPC3 이종이식편 모델에서 HT002-BI-P203의 생체내 유효성을 나타낸다.
도 11a-11b는 N87 이종이식편 모델에서 HT002-BI-P203의 생체내 유효성을 나타낸다.
도 12는 BxPC3 이종이식편 모델에서 HT002-MMAE의 생체내 유효성을 나타낸다.
도 13은 생체외 세포독성 검정에서 JIMT-1 유방암 세포에서의 HT002-MMAE의 억제 효과를 나타낸다.
한 측면에서, 본 출원은 인간 HER2 및 Trop-2 둘 모두에 특이적으로 결합하고 이를 중화하는 단리된 신규 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 출원은 신규 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 및 이의 항원 결합 단편을 사용하여 HER2 및 Trop-2의 조절로부터 이익을 얻을 병태(예를 들어, 암, 지속적인 감염성 질환, 자가면역 질환, 천식, 이식 거부 및 염증성 장애)를 진단, 예진 및 치료하는 것에 관한 것이다. 또한 HER2 및 Trop-2에 결합하는 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 항-HER2/Trop-2 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산의 서열을 포함하는 핵산 분자, 그리고 이의 유도체 및 단편이 제공된다. 또한 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 플라스미드, 및 이러한 핵산 및/또는 벡터 및 플라스미드를 포함하는 세포 또는 세포주가 제공된다. 또한 인간 HER2 및 Trop-2에 결합하는 항원 결합 단백질, 예컨대 항-HER2/Trop-2 항체를 제조, 확인 또는 단리하는 방법, 항원 결합 단백질이 Trop-2에 결합하는지 여부를 결정하는 방법, 조성물, 예컨대 인간 HER2 및 Trop-2에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법, 및 HER2 및 Trop-2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 방법, 예를 들어, HER2 및 Trop-2에 의해 매개되는 병태를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 또한 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체로부터 유래된 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다. 또한 이러한 이중특이적 항체로부터 유래된 ADC를 제조하는 방법이 제공된다. 또한 이중특이적 항체로부터 유래된 ADC를 사용하는 방법, 예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 그리고 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 일반적으로 사용되고 당분야에 널리 알려져 있는 것들이다. 본 출원의 방법 및 기술은 달리 표시되지 않는 한 당분야에 널리 알려지고 본 출원에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함된, 문헌(Green 및 Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))을 참고한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당분야에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 사양에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기술은 일반적으로 사용되며 당분야에 잘 알려져 있는 것들이다. 표준 기술이 화학 합성, 화학 분석, 약학 제조, 제형화, 및 전달 그리고 대상체의 치료에서 사용된다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 표준 1글자 또는 3글자 약어를 사용하여 표시된다. 달리 표시되지 않는 한, 폴리펩티드 서열은 왼쪽에 이의 아미노 말단이 있고 오른쪽에 이의 카복시 말단이 있으며, 단일 가닥 핵산 서열, 및 이중 가닥 핵산 서열의 상단 가닥은 왼쪽에 이의 5' 말단 및 오른쪽에 이의 3' 말단을 갖는다. 폴리펩티드의 특정 섹션은 아미노산 잔기 번호, 예컨대 아미노산 80 내지 119 또는 해당 부위의 실제 잔기, 예컨대 Ser80 내지 Ser119로 지정될 수 있다. 특정 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열과 어떻게 다른지에 기반하여 기재될 수도 있다. 특정 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 L1("경쇄 가변 도메인 1") 및 H1("중쇄 가변 도메인 1")로 지정된다. 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체는 경쇄의 명칭과 중쇄 가변 도메인의 명칭을 조합하여 표시된다. 예를 들어, "L4H7"은 예를 들어 L4의 경쇄 가변 도메인 및 H7의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 표시한다.　
본원에 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 가장 넓은 의미에서 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 항체, 항체 단편 및 스캐폴드 항원 결합 단백질이다. 참조 분자와 "동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자"는 경쟁 검정에서 그 항원에 대한 참조 분자의 결합을 50% 이상 차단하는 항원 결합 분자를 지칭하며, 반대로 참조 분자는 경쟁 검정에서 그 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합을 50% 이상 차단한다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 부위"는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자의 일부를 지칭한다. 보다 구체적으로, 용어 "항원-결합 부위"는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이와 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원이 큰 경우 항원 결합 분자는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며 이 부분을 에피토프라고 한다. 항원 결합 부위는 예를 들어 하나 이상의 가변 도메인(가변 영역이라고도 함)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항원 결정기"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이며, 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는, 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들어, 아미노산의 인접 스트레치 또는 비인접 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체형태 구성)를 지칭한다. 유용한 항원 결정기는 예를 들어 종양 세포 표면, 바이러스 감염 세포 표면, 다른 질환 세포 표면, 면역 세포 표면, 혈청 중 유리 상태, 및/또는 세포외 기질(ECM)에서 찾을 수 있다. 본원에서 항원으로 유용한 단백질은 달리 표시되지 않는 한, 포유동물, 예컨대 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 형태의 단백질일 수 있다. 다양한 구현예에서, 항원은 인간 단백질이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다 .
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면 나머지 중쇄 및/또는 경쇄는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
"인간화" 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어, CDR)은 비인간 항체의 HVR에 상응하고, 전부 또는 실질적으로 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체의 "인간화 형태", 예를 들어 비인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다. 본 출원에 포괄되는 "인간화 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합과 관련하여 본 출원에 따른 특성을 생성하기 위해 원래 항체로부터 추가로 변형되거나 변화된 것들이다.
"인간" 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의는 특히 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 제외한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻은 항체를 지칭하며, 즉 집단을 이루는 개별 항체는 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 모노클로날 항체 조제물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과 대조적으로, 모노클로날 항체 조제물의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다.
본원에 사용된 용어 "단일특이적" 항체는 각각 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
용어 "이중특이적"은 항체가 적어도 2개의 별개의 항원 결정기, 예를 들어 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인(VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(VL)에 의해 각각 형성된 2개의 결합 부위에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 이러한 이중특이적 항체는 1+1 형식이다. 다른 이중특이적 항체 형식은 2+1 형식(제1 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 및 제2 항원 또는 에피토프에 대한 1개의 결합 부위 포함) 또는 2+2 형식(제1 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 및 제2 항원 또는 에피토프에 대한 2개의 결합 부위 포함)이다. 전형적으로, 이중특이적 항체는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들 각각은 상이한 항원 결정기에 특이적이다.
본 출원에 사용된 용어 "~가(valent)"는 항원 결합 분자에서 특정된 수의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 이와 같이, 용어 "2가", "4가" 및 "6가"는 항원 결합 분자에서 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본 출원에 따른 이중특이적 항체는 적어도 "2가"이고 "3가" 또는 "다가"(예를 들어 "4가" 또는 "6가")일 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 출원의 항체는 2개 이상의 결합 부위를 갖고 이중특이적이다. 즉, 항체는 2개 초과의 결합 부위가 있는(즉, 항체가 3가 또는 다가인) 경우에도 이중특이적일 수 있다. 특히, 본 출원은 특이적으로 결합하는 각각의 항원에 대해 하나의 결합 부위를 갖는 이중특이적 2가 항체에 관한 것이다.
용어 "전장 항체", "전-장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 클래스 항체는 디설피드 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진 약 150,000달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 하는 가변 영역(VH)을 가지며, 중쇄 불변 영역이라고도 하는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)이 뒤따른다. 마찬가지로, N-말단에서 C-말단까지 각각의 경쇄는 가변 경 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 하는 가변 영역(VL)을 가지며, 경쇄 불변 영역이라고도 하는 경쇄 불변 도메인(CL)이 뒤따른다. 항체의 중쇄는 알파(IgA), 델타(IgD), 엡실론(IgE), 감마(IgG) 또는 뮤(IgM)라고 하는 다섯 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있으며, 그 중 일부는 서브타입, 예를 들어, 감마 1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3), 감마 4(IgG4), 알파 1(IgA1) 및 알파 2(IgA2)로 추가 구분될 수 있다. 항체의 경쇄는 그 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 카파 및 람다라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 교차-Fab 단편; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자(예를 들어, scFv); 항체 단편 및 단일 도메인 항체로 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편의 검토는 문헌(Hudson 등, Nat Med 9, 129-134 (2003))을 참고한다. scFv 단편의 검토는, 예를 들어 문헌(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994))을 참고하며; 또한 WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참고한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의는, U.S. 특허 번호 5,869,046을 참고한다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이며, 예를 들어, 문헌(EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 등, Nat Med 9, 129-134 (2003); 및 Hollinger 등, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993))을 참고한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌(Hudson 등, Nat Med 9, 129-134 (2003))에 기재되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, Mass.; 예를 들어 U.S. 특허 번호 6,248,516 B1 참고). 또한, 항체 단편은 기능적 항원 결합 부위를 제공함으로써 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 VH 도메인의, 즉 VL 도메인과 함께 조립할 수 있는 특성, 또는 VL 도메인의, 즉 VH 도메인과 함께 조립할 수 있는 특성을 갖는 단일 사슬 폴리펩티드를 포함한다. 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 재조합 숙주 세포(예를 들어 대장균 또는 파지)에 의한 생산뿐만 아니라 온전한 항체의 단백분해 소화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
온전한 항체의 파파인 소화는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인과 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유하는 "Fab" 단편이라고 하는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생성한다. 따라서, 용어 "Fab 단편"은 경쇄(CL)의 VL 도메인 및 불변 도메인을 포함하는 경쇄 단편, 및 중쇄의 VH 도메인 및 제1 불변 도메인(중쇄의 CH1)을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서의 몇 개의 잔기 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 갖는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 산출한다.
"단일 사슬 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인(VH), 항체 불변 도메인 1(CH1), 항체 경쇄 가변 도메인(VL), 항체 경쇄 불변 도메인(CL) 및 링커로 구성된 폴리펩티드이며, 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 하기 순서: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL 중 하나를 갖고; 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 천연 디설피드 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이러한 단일 사슬 Fab 분자는 시스테인 잔기(예를 들어, Kabat 번호 매기기에 따른 가변 중쇄의 위치 44 및 가변 경쇄의 위치 100)의 삽입을 통한 사슬간 디설피드 결합의 생성에 의해 추가로 안정화될 수 있다.
"단일 사슬 가변 단편(scFv)"은 10개 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩티드로 연결된, 항체의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커는 일반적으로 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고 VH의 N-말단을 VL의 C-말단에 연결하거나 그 반대로 연결할 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 항체는 예를 들어 문헌(Houston, J. S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)에 기재되어 있다. 또한, 항체 단편은 기능적 항원 결합 분자를 제공함으로써 전장 항체의 항원 결합 특성을 제공하는 VH 도메인의, 즉 VL 도메인과 함께 조립할 수 있는 특성, 또는 VL 도메인의, 즉 VH 도메인과 함께 조립할 수 있는 특성을 갖는 단일 사슬 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 항체 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 특히, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카복실-말단까지 미친다. 그러나 Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다. 중쇄의 아미노산 서열은 항상 C-말단 라이신을 가지고 제시되지만, C-말단 라이신이 없는 변이체도 본 출원에 포함된다.
IgG Fc 영역은 IgG CH2 및 IgG CH3 도메인을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"은 일반적으로 약 위치 231의 아미노산 잔기부터 약 위치 340의 아미노산 잔기까지 미친다. 한 구현예에서, 탄수화물 사슬은 CH2 도메인에 부착된다. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. "CH3 도메인"은 Fc 영역에서 CH2 도메인에 대한 C-말단 잔기의 스트레치(즉, IgG의 약 위치 341의 아미노산 잔기부터 약 위치 447의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인(예를 들어, 이의 한 사슬에 "돌기"("놉")가 도입되고 이의 다른 사슬에 대응하여 "공동"("홀")이 도입된 CH3 도메인; 명시적으로 본원에 참조로 포함된, U.S. 특허 번호 5,821,333 참고)일 수 있다. 이러한 변이체 CH3 도메인은 본원에 기재된 바와 같이 2개의 동일하지 않은 항체 중쇄의 이종이량체화를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 달리 특정되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 번호 매기기는 문헌(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)에 기재된 바와 같은, EU 인덱스라고도 하는 EU 번호 매기기 시스템을 따른다.
"면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 자연 발생 대립유전자 변이체뿐만 아니라 치환, 부가 또는 결실을 일으키지만 면역글로불린이 효과기 기능(예컨대 항체 의존적 세포성 세포독성)을 매개하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 변경을 갖는 변이체를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실될 수 있다. 이러한 변이체는 활성에 대한 영향을 최소화하도록 당분야에 알려진 일반적인 규칙에 따라 선택될 수 있다(예를 들어, Bowie, J. U. 등, Science 247:1306-10 (1990) 참고).
용어 "효과기 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포성 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체 매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역에 의한 연계 후 수용체-보유 세포를 자극하여 효과기 기능을 수행하는 신호전달 이벤트를 유도하는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), 및 FcαRI(CD89)을 포함한다. 특정 활성화 Fc 수용체는 인간 FcγRIIIa이다(UniProt 접근 번호 P08637, 버전 141 참고).
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 일부 구현예에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다. 예를 들어, 본 출원의 이중특이적 항체는 HER2 및 Trop-2를 통한 신호전달을 차단한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고 원치 않는 또는 비특이적 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다. 특정 항원에 결합하는 항원 결합 분자의 능력은 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 당업자에게 친숙한 다른 기술, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(BIAcore 기기 상에서 분석됨)(Liljeblad 등, Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 검정(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합 강도를 지칭한다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있으며, 이는 해리 상수와 회합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비이다. 친화도를 측정하는 특정 방법은 표면 플라즈몬 공명(SPR)이다. 본원에 사용된 용어 항체의 "고친화도"는 표적 항원에 대해 10-9 M 이하, 더욱 특히 10-10 M 이하의 Kd를 갖는 항체를 지칭한다. 용어 항체의 "저친화도"는 10-8 M 이상의 Kd를 갖는 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "감소된 결합"은 예를 들어 SPR에 의해 측정되는, 각각의 상호작용에 대한 친화도의 감소를 지칭한다. 역으로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화도의 증가를 지칭한다.
용어 "HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원 결합-도메인 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체", "HER2 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체", "HER2 및 Trop-2에 특이적인 이중특이적 항원 결합 분자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 항체가 HER2 및 Trop-2를 표적화는 진단제 및/또는 치료제로 유용하도록 충분한 친화도로 HER2 및 Trop-2에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 지칭한다.
용어 "항-HER2 항체" 및 "HER2에 결합하는 항원-결합 부위를 포함하는 항체"는 HER2, 특히 세포 표면 상에 발현된 HER2 폴리펩티드에 항체가 HER2를 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로 유용하도록 충분한 친화도로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 구현예에서, 관련되지 않은 비-HER2 단백질에 대한 항-HER2 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사면역검정(RIA) 또는 유세포 측정(FACS)에 의해 또는 바이오센서 시스템, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 측정된, HER2에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 인간 HER2에 결합하는 항원 결합 분자는, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M의 인간 HER2에 대한 결합 친화도의 KD 값을 갖는다. 용어 "항-HER2 항체"는 또한 HER2 및 제2 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포괄한다.
용어 "항-Trop-2 항체" 및 "Trop-2에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체"는 항체가 Trop-2를 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로, Trop-2, 특히 세포 표면 상에서 발현되는 Trop-2 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 구현예에서, 관련되지 않은 비-Trop-2 단백질에 대한 항-Trop-2 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사면역검정(RIA) 또는 유세포 측정(FACS)에 의해 또는 바이오센서 시스템, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 측정된, Trop-2에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구현예에서, 인간 Trop-2에 결합하는 항원 결합 분자는, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M의 인간 Trop-2에 대한 결합 친화도의 KD 값을 갖는다. "항-Trop-2 항체"는 또한 Trop-2 및 제2 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체; 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체; 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱이 관여된 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 다양한 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용될 때, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거치고 이에 따라 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되었으나 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 이러한 모든 재조합 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합하거나 그렇지 않으면 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정기를 포함한다. 에피토프 결정기는 일반적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그룹화로 구성되며 일반적으로 특정 전하 특성뿐만 아니라 특정 3차원 구조 특성을 가지고 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태"일 수 있다. 선형 에피토프에서 단백질 및 상호작용 분자(예컨대 항체) 사이의 모든 상호작용 지점은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. 입체형태 에피토프에서 상호작용 지점은 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기에 걸쳐 발생한다. 일단 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본 개시에 기재된 기술을 사용하여 해당 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특성규명으로 원하는 에피토프에 대한 정보를 밝힐 수 있다. 이어서 이 정보로부터 동일한 에피토프에 결합하기 위해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체, 예를 들어 항체가 항원으로의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 찾기 위해 교차 경쟁 연구를 수행하는 것이다.
항체를 포함하는 항원 결합 단백질은 적어도 1 x 10-6 M, 또는 적어도 1 x 10-7 M, 또는 적어도 1 x 10-8 M, 또는 적어도 1 x 10-9 M, 또는 적어도 1 x 10-10 M, 또는 적어도 1 x 10-11 M의 해리 상수(KD 또는 아래 정의된 바와 같은, 상응하는 Kb) 값에 의해 결정되는 높은 결합 친화도로 항원에 결합하는 경우 항원에 "특이적으로 결합"한다. 관심 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 동일하거나 다른 친화도로 다른 종으로부터의 동일한 관심 항원에도 결합할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "면역접합체" 또는 "융합 단백질"은 효과기 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합(또는 결합)된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "융합된"은 직접적으로 또는 하나 이상의 펩티드 링커를 통해 펩티드 결합에 의해 결합된 구성요소를 지칭한다. 효과기 분자는 검출 가능 표지, 면역독소, 사이토카인, 케모카인, 치료제 또는 화학치료제일 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 펩티드 링커를 통해 효과기 분자에 접합될 수 있다. 면역접합체 및/또는 융합 단백질은 항체 또는 항원 결합 단편의 면역반응성을 유지하며, 예를 들어 항체 또는 항원 결합 단편은 접합 전과 마찬가지로 접합 후 항원에 결합하는 능력이 대략 같거나 약간만 감소된다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역접합체는 또한 항체 약물 접합체(ADC)로 지칭될 수 있다.　면역접합체 및/또는 융합 단백질은 원래 별도의 기능성을 가진 2개의 분자, 예컨대 항체 및 효과기로부터 제조되기 때문에, 이들은 때때로 "키메라 분자"로도 지칭된다.
"링커"는 공유적으로, 또는 이온, 반 데르 발스 또는 수소 결합을 통해 2개의 다른 분자를 연결하는 분자, 예를 들어 5' 말단에서 하나의 상보적 서열과 및 3' 말단에서 또 다른 상보적 서열에 혼성화하여 2개의 비상보적 서열을 연결하는 핵산 분자를 지칭한다. "절단 가능 링커"는 절단 가능 링커에 의해 연결된 2개의 구성요소를 분리하기 위해 분해되거나 그렇지 않으면 절단될 수 있는 링커를 지칭한다. 절단 가능 링커는 일반적으로 효소, 전형적으로 펩티다제, 프로테아제, 뉴클레아제, 리파제 등에 의해 절단된다. 절단 가능 링커는 또한 예를 들어 온도, pH, 염 농도 등의 변화와 같은 환경 신호에 의해 절단될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "펩티드 링커"는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2-20개 아미노산을 포함하는 펩티드를 지칭한다. 펩티드 링커는 당분야에 알려져 있거나 본원에 기재되어 있다. 적합한 비-면역원성 링커 펩티드는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 링커를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 수이다.
본원에 사용된 용어 "면역원성"은 수신체에 투여될 때 면역 반응(체액성 또는 세포성)을 유도하는 항체 또는 항원 결합 단편의 능력을 지칭하고, 예를 들어 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 포함한다. HAMA 반응은 대상체로부터의 T 세포가 투여된 항체에 대해 면역 반응을 일으킬 때 개시된다. 그런 다음 T 세포는 B 세포를 모집하여 특정 "항-항체" 항체를 생성한다.
본원에 사용된 용어 "면역 세포"는 항원(예를 들어, 자가항원)에 대한 면역 반응을 조절하는 데 관여된 조혈 계통의 임의의 세포를 의미한다. 다양한 구현예에서, 면역 세포는 예를 들어 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 대식균, 랑게르한스 세포 또는 쿠퍼 세포이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다양한 구현예에서, "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 그 알파 탄소가 펩티드 결합을 통해 결합된 아미노산 사슬이다. 따라서 사슬의 한쪽 끝(아미노 말단)에 있는 말단 아미노산은 자유 아미노기를 갖는 반면 사슬의 다른 쪽 끝(카복시 말단)에 있는 말단 아미노산은 자유 카복실기를 갖는다. 본원에 사용된 용어 "아미노 말단"(N-말단으로 약칭됨)은 펩티드의 아미노 말단에 있는 아미노산 상의 자유 α-아미노기 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에 있는 아미노산의 α-아미노기(펩티드 결합에 참여할 때 이미노기)를 지칭한다. 유사하게, 용어 "카복시 말단"은 펩티드의 카복시 말단 상의 자유 카복실기 또는 펩티드 내의 임의의 다른 위치에서의 아미노산의 카복실기를 지칭한다. 펩티드는 또한 본질적으로 아미드 결합과 반대로 펩티드 모방체, 예컨대 에테르에 의해 연결된 아미노산을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 폴리아미노산을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 유래 또는 단리된 융합 분자, 예컨대 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 폴리펩티드를 포함하는 모든 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의도된다.
본 개시의 폴리펩티드는 예를 들어 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위한 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하고, (5) 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형하기 위해, 임의의 방식으로 및 임의의 이유로 변형된 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 단일 또는 다중 아미노산 치환(예를 들어, 보존적 아미노산 치환)이 자연 발생 서열에서(예를 들어, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분에서) 이루어질 수 있다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산의 폴리펩티드에서 기능적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 하기 6개 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:　
알라닌(A), 세린(S) 및 트레오닌(T)　
아스파르트산(D) 및 글루탐산(E)　
아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)　
아르기닌(R) 및 라이신(K)　
이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M) 및 발린(V)　
페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)
"비보존적 아미노산 치환"은 이러한 클래스 중 하나의 구성원의 또 다른 클래스의 구성원으로의 치환을 지칭한다. 다양한 구현예에 따르면, 이러한 변화를 수행함에 있어서 아미노산의 수치요법 지수가 고려될 수 있다. 각 아미노산에는 그 소수성 및 전하 특성에 기반하여 수치요법 지수가 지정되었다. 이들은 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.
단백질 상에 상호작용하는 생물학적 기능을 부여하는 데 있어 수치요법 아미노산 지수의 중요성은 당분야에서 이해되고 있다(예를 들어, Kyte 등, 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131 참고). 특정 아미노산은 유사한 수치요법 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고 여전히 유사한 생물학적 활성을 유지할 수 있음이 알려져 있다. 수치요법 지수에 기반한 변화를 수행할 때, 다양한 구현예에서, 수치요법 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함된다. 다양한 구현예에서 ±1 이내인 치환이 포함되고, 다양한 구현예에서 ±0.5 이내인 치환이 포함된다.
또한, 특히 이에 의해 생성된 생물학적 기능성 단백질 또는 펩티드가 본원에 개시된 바와 같이 면역학적 구현예에서의 사용을 위해 의도되는 경우, 유사한 아미노산의 치환이 친수성에 기반하여 효과적으로 수행될 수 있음이 또한 이해된다. 다양한 구현예에서, 그 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 단백질의 최대 국소 평균 친수성은 그 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다.
하기 친수성 값이 이들 아미노산 잔기에 지정되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0.+-.1); 글루타메이트(+3.0.+-.1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5.+-.1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값에 기반하여 변화를 수행할 때, 다양한 구현예에서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 포함되고, 다양한 구현예에서, ±1 이내인 치환이 포함되며, 다양한 구현예에서, ±0.5 이내인 치환이 포함된다. 포함되어 있다. 예시적인 아미노산 치환은 표 1에 제시되어 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드 단편" 및 "절단된 폴리펩티드"는 상응하는 전장 단백질과 비교하여 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 다양한 구현예에서, 단편은, 예를 들어, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900 또는 적어도 1000개 아미노산 길이일 수 있다. 다양한 구현예에서, 단편은 또한, 예를 들어 최대 1000, 최대 900, 최대 800, 최대 700, 최대 600, 최대 500, 최대 450, 최대 400, 최대 350, 최대 300, 최대 250, 최대 200, 최대 150, 최대 100, 최대 50, 최대 25, 최대 10, 또는 최대 5개 아미노산 길이일 수 있다. 단편은 그 말단 중 하나 또는 둘 모두에 하나 이상의 추가 아미노산, 예를 들어 상이한 자연 발생 단백질로부터의 아미노산 서열(예를 들어, Fc 또는 류신 지퍼 도메인) 또는 인공 아미노산 서열(예를 들어, 인공 링커 서열)을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드 변이체" 및 "폴리펩티드 돌연변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 또 다른 폴리펩티드 서열에 비해 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 다양한 구현예에서, 삽입, 결실 또는 치환될 아미노산 잔기의 수는 예를 들어, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 25, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 125, 적어도 150, 적어도 175, 적어도 200, 적어도 225, 적어도 250, 적어도 275, 적어도 300, 적어도 350, 적어도 400, 적어도 450 또는 적어도 500개 아미노산 길이일 수 있다. 본 개시의 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
폴리펩티드의 "유도체"는 화학적 변형, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민)과 같은 또 다른 화학적 모이어티에 대한 접합, 인산화 및 글리코실화를 거친 폴리펩티드이다.
용어 "서열 동일성%"는 본원에서 용어 "동일성%"와 상호교환적으로 사용되며, 서열 정렬 프로그램을 사용하여 정렬될 때 2개 이상의 펩티드 서열 사이의 아미노산 서열 동일성 수준 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성 수준을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, 80% 동일성은 정의된 알고리즘에 의해 결정된 80% 서열 동일성과 동일한 것을 의미하며 주어진 서열이 또 다른 길이의 또 다른 서열과 적어도 80% 동일함을 의미한다. 다양한 구현예에서, 동일성%는 주어진 서열에 대해, 예를 들어 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 이상의 서열 동일성으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 동일성%는 예를 들어, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99%의 범위이다.
용어 "서열 상동성%"는 본원에서 용어 "상동성%"와 상호교환적으로 사용되며, 서열 정렬 프로그램을 사용한 2개 이상의 펩티드 서열 사이의 아미노산 서열 상동성 수준 또는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 사이의 뉴클레오티드 서열 상동성 수준을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같이, 80% 상동성은 정의된 알고리즘에 의해 결정된 80% 서열 상동성과 동일한 것을 의미하며, 따라서 주어진 서열의 동족체는 주어진 서열의 길이에 걸쳐 80% 초과의 서열 상동성을 갖는다. 다양한 구현예에서, 상동성%는 주어진 서열에 대해, 예를 들어 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 이상의 서열 상동성으로부터 선택된다. 다양한 구현예에서, 상동성%는, 예를 들어, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 95% 내지 약 99%의 범위이다.
2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 컴퓨터 프로그램은 NCBI 웹사이트에서 인터넷 상으로 공개적으로 이용 가능한 BLAST 프로그램 모음, 예를 들어 BLASTN, BLASTX 및 TBLASTX, BLASTP 및 TBLASTN을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한 문헌(Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990(공개된 기본 설정, 즉 매개변수 w=4, t=17에 대해 특히 참조) 및 Altschul 등, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997)을 참고한다. 서열 검색은 전형적으로 GenBank 단백질 서열 및 기타 공개 데이터베이스에서 아미노산 서열 대비 주어진 아미노산 서열을 평가할 때 BLASTP 프로그램을 사용하여 수행된다. BLASTX 프로그램은 GenBank 단백질 서열 및 기타 공개 데이터베이스에서 아미노산 서열에 대해 모든 판독 프레임에서 번역된 핵산 서열을 검색하기 위해 선호된다. BLASTP 및 BLASTX는 둘 모두 11.0의 개방 갭 페널티 및 1.0의 확장 갭 페널티의 기본 매개변수를 사용하여 실행되며 BLOSUM-62 매트릭스를 이용한다. 상기 문헌을 참고한다.
서열 동일성%를 계산하는 것 외에도, BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석도 수행한다(예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 90:5873-5787, 1993 참고). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 최소 합 확률(P(N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 시험 핵산과 참조 핵산의 비교에서 최소 합 확률이 예를 들어 약 0.1 미만, 약 0.01 미만 또는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 폴리펩티드 영역이 참조 서열과 적어도 70%, 전형적으로 적어도 80%, 보다 전형적으로 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 유사성의 서열을 가짐을 표시한다. 예를 들어, 폴리펩티드는 예를 들어 두 펩티드가 하나 이상의 보존적 치환(들)에 의해 서로 상이한 경우, 제2 폴리펩티드와 실질적으로 유사하다.
"폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위로 이루어진 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 자연 발생 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산("DNA") 및 리보핵산("RNA")뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함한다. 핵산 유사체는 비-자연 발생 염기, 자연 발생 포스포디에스테르 결합 이외의 다른 뉴클레오티드와의 결합에 연관되는 뉴클레오티드를 포함하는 유사체 또는 포스포디에스테르 결합 이외의 결합을 통해 부착된 염기를 포함하는 유사체를 포함한다. 따라서, 뉴클레오티드 유사체는 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르, 포스포르아미데이트, 보라노포스페이트, 메틸포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 자동화 DNA 합성장치를 사용하여 합성될 수 있다. 용어 "핵산"은 전형적으로 큰 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 전형적으로, 보통 약 50개 이하의 뉴클레오티드인 짧은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)로 표시될 때, 이는 또한 "U"가 "T"를 대체하는 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
통상적인 표기법이 폴리뉴클레오티드 서열을 기재하기 위해 본원에서 사용된다: 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5'-말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 신생 RNA 전사체에 대해 뉴클레오티드의 5'에서 3'으로의 부가 방향이 전사 방향으로 지칭된다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥은 "코딩 가닥"으로 지칭되고; 해당 DNA로부터 전사된 mRNA와 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5'-말단에 대해 5'에 위치하는 DNA 가닥 상의 서열은 "상류 서열"로 지칭되고; RNA와 동일한 서열을 갖고 코딩 RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'에 있는 DNA 가닥 상의 서열은 "하류 서열"로 지칭된다.　
"상보적"은 2개의 폴리뉴클레오티드의 상호작용 표면의 위상적 적합성 또는 함께 일치하는 것을 지칭한다. 따라서 두 분자는 상보적으로 기재될 수 있으며, 나아가 접촉 표면 특성도 서로 상보적이다. 제1 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 제2 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 결합 파트너의 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일하거나, 제1 폴리뉴클레오티드가 엄격한 혼성화 조건 하에 제2 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 경우, 제1 폴리뉴클레오티드는 제2 폴리뉴클레오티드와 상보적이다.
"~에 특이적으로 혼성화하는" 또는 "특이적 혼성화" 또는 "~에 선택적으로 혼성화하는"은 해당 서열이 복잡한 혼합물(예를 들어, 전체 세포성) DNA 또는 RNA에 존재할 때 핵산 분자가 엄격한 조건 하에 특정 뉴클레오티드 서열에 우선적으로 결합, 듀플렉스화 또는 혼성화하는 것을 지칭한다. 용어 "엄격한 조건"은 탐침이 그 표적 하위서열에 우선적으로 혼성화하고 다른 서열에 더 적은 정도로 혼성화하거나 전혀 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 핵산 혼성화 실험, 예컨대 서던 및 노던 혼성화의 맥락에서 "엄격한 혼성화" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적이며 상이한 환경 매개변수 하에 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 문헌(Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y.; Sambrook 등, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 3.sup.rd ed., NY; 및 Ausubel 등, eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY)에서 찾을 수 있다.
일반적으로 매우 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 일치되는 탐침에 혼성화되는 온도(정의된 이온 강도 및 pH 하에)이다. 매우 엄격한 조건은 특정 탐침에 대한 Tm과 동일하도록 선택된다. 서던 또는 노던 블롯에서 필터 상에 약 100개 초과의 상보적 잔기를 갖는 상보적 핵산의 혼성화를 위한 엄격한 혼성화 조건의 예는 42℃에서 1 mg의 헤파린을 포함하는 50% 포르말린이며, 혼성화는 밤새 수행된다. 매우 엄격한 세척 조건의 예는 약 15분 동안 72℃에서 0.15 M NaCl이다. 엄격한 세척 조건의 예는 15분 동안 65℃에서 0.2 x SSC 세척이다. SSC 완충액에 대한 설명은 문헌(Sambrook 등)을 참고한다. 배경 탐침 신호를 제거하기 위해 높은 엄격성 세척에 낮은 엄격성 세척이 선행될 수 있다. 예를 들어, 약 100개 초과의 뉴클레오티드의 듀플렉스에 대한 예시적인 중간 엄격성 세척은 15분 동안 45℃에서 1 x SSC이다. 예를 들어, 약 100개 초과의 뉴클레오티드의 듀플렉스에 대한 예시적인 낮은 엄격성 세척은 15분 동안 40℃에서 4-6 x SSC이다. 일반적으로, 특정 혼성화 검정에서 관련 없는 탐침에 대해 관찰된 것보다 2 x(또는 그 이상)의 신호 대 노이즈 비는 특정 혼성화의 검출을 표시한다.
"프라이머"는 지정된 폴리뉴클레오티드 주형에 특이적으로 혼성화할 수 있고 상보적 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 개시 지점을 제공할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 합성은 폴리뉴클레오티드 프라이머가 합성이 유도되는 조건, 즉 뉴클레오티드, 상보적 폴리뉴클레오티드 주형 및 중합을 위한 제제, 예컨대 DNA 폴리머라제의 존재 하에 놓일 때 발생한다. 프라이머는 전형적으로 단일 가닥이지만 이중 가닥일 수도 있다. 프라이머는 전형적으로 데옥시리보핵산이지만 매우 다양한 합성 및 자연 발생 프라이머가 많은 적용을 위해 유용하다. 프라이머는 합성 개시 부위로 작용하기 위해 혼성화하도록 설계된 주형과 상보적이지만 주형의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우, 주형에 대한 프라이머의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격성에 의존한다. 프라이머는 예를 들어 발색, 방사성 또는 형광 모이어티로 표지될 수 있고 검출 가능 모이어티로 사용될 수 있다.　
"탐침"은 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 또 다른 폴리뉴클레오티드의 지정된 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 탐침은 표적 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화하지만 주형의 정확한 상보적 서열을 반영할 필요는 없다. 이러한 경우에 표적에 대한 탐침의 특이적 혼성화는 혼성화 조건의 엄격성에 의존한다. 탐침은 예를 들어 발색, 방사성 또는 형광 모이어티로 표지될 수 있고 검출 가능 모이어티로 사용될 수 있다. 탐침이 상보적 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 개시 지점을 제공하는 경우 탐침은 또한 프라이머일 수 있다.　
"벡터"는 이에 연결된 또 다른 핵산을 세포에 도입하기 위해 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 한 가지 유형의 벡터는 "플라스미드"로, 추가 핵산 절편이 결찰될 수 있는 선형 또는 원형 이중 가닥 DNA 분자를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스)이며, 추가 DNA 절편이 바이러스 게놈에 도입될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 포함하는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제된다. "발현 벡터"는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시할 수 있는 유형의 벡터이다.
"조절 서열"은 그것이 작동가능하게 결합된 핵산의 발현(예를 들어, 발현 수준, 시점 또는 위치)에 영향을 미치는 핵산이다. 조절 서열은 예를 들어 조절된 핵산 상에 직접적으로 또는 하나 이상의 다른 분자(예를 들어, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩티드)의 작용을 통해 그 효과를 발휘할 수 있다. 조절 서열의 예는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 조절 서열의 추가 예는 예를 들어 문헌(Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. 및 Baron 등, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06)에 기재되어 있다. 뉴클레오티드 서열은 조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현(예를 들어, 발현 수준, 시점 또는 위치)에 영향을 미치는 경우 조절 서열에 "작동 가능하게 결합된" 것이다.
"숙주 세포"는 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어 대장균일 수 있거나 진핵생물, 예를 들어 단세포 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 기타 진균), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 래트 세포, 마우스 세포 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포는 이후 숙주 세포에서 발현될 수 있는, 폴리펩티드-암호화 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 배양된 세포이다. 어구 "재조합 숙주 세포"는 발현될 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 표시하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 핵산을 포함하지만 조절 서열이 핵산과 작동 가능하게 결합하도록 숙주 세포에 도입되지 않는 한 원하는 수준으로 핵산을 발현하지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본원에 사용된 용어의 범위 내에 포함된다.
용어 "단리된 분자"(여기서 분자는 예를 들어 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드임)는 그 기원 또는 유래의 원천으로 인해 (1) 그 천연 상태에서 그에 수반되는 자연적으로 회합된 구성요소와 회합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 분자이다. 따라서 화학적으로 합성되거나 자연적으로 발생하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 발현되는 분자는 그 자연적으로 회합된 구성요소로부터 "단리"될 것이다. 분자는 또한 당분야에 잘 알려진 정제 기술을 사용하여 단리에 의해 자연적으로 회합된 구성요소가 실질적으로 없게 될 수 있다. 분자 순도 또는 균질성은 당분야에 잘 알려진 여러 수단에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 샘플의 순도는 당분야에 잘 알려진 기술을 사용하여 폴리펩티드를 가시화하기 위해 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔 염색을 사용하여 검정될 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 당분야에 잘 알려진 다른 수단을 사용하여 더 높은 분해가 제공될 수 있다.
단백질 또는 폴리펩티드는 샘플의 적어도 약 60% 내지 75%가 단일 종의 폴리펩티드를 나타낼 때 "실질적으로 순수한", "실질적으로 균질한" 또는 "실질적으로 정제된" 것이다. 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 전형적으로 단백질 샘플의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% W/W, 더 일반적으로 약 95%를 차지할 것이며, 바람직하게는 99% 초과 순수할 것이다. 단백질 순도 또는 균질성은 당분야에 알려진 여러 수단, 예컨대 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 당분야에 알려진 염료로 겔을 염색할 때 단일 폴리펩티드 밴드의 가시화에 의해 표시될 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 당분야에 잘 알려진 다른 수단을 사용하여 더 높은 분해가 제공될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표지" 또는 "표지된"은 항체에서 또 다른 분자의 혼입을 지칭한다. 한 구현예에서, 표지는 검출 가능 마커, 예를 들어 방사성표지된 아미노산의 혼입 또는 표지된 아비딘(예를 들어, 광학 또는 열량측정 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩티드에 대한 부착이다. 또 다른 구현예에서, 표지 또는 마커는 치료제, 예를 들어 약물 접합체 또는 독소일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법이 당분야에 알려져 있고 사용될 수 있다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종(예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 효소적 표지(예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광 마커, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인식되는 사전 결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 류신 지퍼) 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 자성 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트, 독소, 예컨대 백일해 독소, 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신 그리고 이의 유사체 또는 동족체. 일부 구현예에서, 표지는 잠재적인 입체 장애를 줄이기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착된다.
본원에 사용된 용어 "면역치료법"은 특정 종양 항원에 대한 고갈 항체를 사용한 치료; 항체-약물 접합체를 사용한 치료; 공동 자극 또는 공동 억제 분자(면역 체크포인트), 예컨대 PD-1, PD-L1, OX-40, CD137, GITR, LAG3, TIM-3 및 VISTA에 대한 효능, 길항 또는 차단 항체를 사용한 치료; 이중특이적 T 세포 연관 항체(BiTE®), 예컨대 블리나투모맙을 사용한 치료; 생물학적 반응 변형제, 예컨대 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ의 투여가 관여하는 치료; 치료용 백신, 예컨대 시푸류셀-T를 사용한 치료; 수지상 세포 백신 또는 종양 항원 펩티드 백신을 사용한 치료; 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포를 사용한 치료; CAR-NK 세포를 사용한 치료; 종양 침윤 림프구(TIL)를 사용한 치료; 차용 전달된 항종양 T 세포(생체외 확장 및/또는 TCR 트랜스제닉)를 사용한 치료; TALL-104 세포를 사용한 치료; 및 면역자극제, 예컨대 Toll-유사 수용체(TLR) 효능제 CpG 및 이미퀴모드를 사용한 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료를 지칭한다.
"약학 조성물"은 동물에서 약학적으로 사용하기 적합한 조성물을 지칭한다. 약학 조성물은 약리학적 유효량의 활성제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. "약리학적 유효량"은 의도된 약리학적 결과를 생성하는 데 효과적인 제제의 양을 지칭한다. "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 표준 약학 담체, 비히클, 완충제 및 부형제, 예컨대 인산염 완충 식염수 용액, 5% 덱스트로스 수용액, 및 에멀젼, 예컨대 오일/물 또는 물/오일 에멀전, 및 다양한 유형의 수화제 및/또는 보조제를 지칭한다. 적합한 약학 담체 및 제형물은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Ed. 2005, Mack Publishing Co, Easton)에 기재되어 있다. "약학적으로 허용 가능한 염"은 예를 들어 금속 염(나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등) 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는 약학적 사용을 위해 화합물로 제형화될 수 있는 염이다.
본원에 사용된 용어 HER2 또는 Trop-2를 발현하는 세포의 "성장 저해" 또는 "성장 억제"는 항-HER2/Trop-2 결합 분자, 예를 들어 항-HER2/Trop-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HER2/Trop-2 결합 분자가 항-HER2/Trop-2 결합 분자의 부재 하의 증식에 비해 HER2 또는 Trop-2를 발현하는 세포의 증식을 통계적으로 유의하게 감소시키는 능력을 지칭한다. 한 측면에서, HER2 또는 Trop-2를 발현하는 세포(예를 들어, 암 세포)의 증식은 세포가 항-HER2/Trop-2 결합 분자, 예를 들어, 항-HER2/Trop-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 HER2/Trop-2-결합 분자와 접촉될 때,항-HER2/Trop-2 결합 분자의 부재 하에 측정된 증식(대조군 조건) 대비 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 약 100% 감소될 수 있다. 세포 증식은 당분야에 알려진 다양한 방법에 따라, 예를 들어 생활성 세포의 수를 계수하고, 성장 마커의 마커 존재를 확인하고, 분자(예를 들어, 방사성 표지된 분자, 예컨대 H-티미딘)의 혼입을 측정하고, 종양의 크기(예를 들어, 부피 또는 중량 기준)을 측정하는 등에 의해 측정될 수 있다. 특정 측면에서, 성장 저해는 전이의 수, 크기 또는 분포의 감소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 변형, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료받는 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도의 임상적 개입을 지칭하며 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환의 개선 또는 경감, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 질환, 장애 또는 병태를 "완화시키는" 것은 질환, 장애 또는 병태의 증상 중증도 및/또는 발생 빈도의 감소를 의미한다. 또한, 본원에서 "치료"에 대한 언급은 근치적, 고식적 및 예방적 치료에 대한 언급을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 특정된 장애, 병태 또는 질환을 치료하기, 예컨대 그 증상 중 하나 이상을 개선, 경감, 절감 및/또는 지연하기 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암 또는 기타 원치 않는 세포 증식과 관련하여 유효량은 다음을 수행하기 충분한 양을 포함한다: (i) 암 세포의 수를 감소시키고; (ii) 종양 크기를 감소시키고; (iii) 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 어느 정도 억제, 연기, 둔화, 바람직하게는 중지시키고; (iv) 종양 전이를 억제하고(즉, 어느 정도 둔화, 바람직하게는 중지시키고); (v) 종양 성장을 억제하고; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발을 방지 또는 지연하고; 및/또는 (vii) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 해소함. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
어구 "투여하는" 또는 "투여되도록 유발하는"은 환자에 있어서 문제 시 제제(들)/화합물(들)의 투여를 제어하고/하거나 허용하는, 의료 전문가(예를 들어, 의사) 또는 환자의 의료 관리를 제어하는 사람이 취하는 행동을 지칭한다. 투여되도록 유발하는 것은 진단 및/또는 적절한 치료 요법의 결정 및/또는 환자를 위한 특정 제제(들)/화합물 처방이 관여할 수 있다. 이러한 처방은 예를 들어 처방전 작성, 의료 기록에 주석 달기 등을 포함할 수 있다. 투여가 본원에 기재되는 경우, "투여되도록 유발하는"이 또한 고려된다.
용어 "환자", "개체" 및 "대상체"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 포유동물, 바람직하게는 인간 또는 비인간 영장류뿐만 아니라 길들여진 포유동물(예를 들어, 개 또는 고양이), 실험실 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니피그), 및 농업용 포유동물(예를 들어, 말, 소, 돼지, 양)을 지칭한다. 다양한 구현예에서, 환자는 병원, 정신과 치료 시설, 외래 환자 또는 기타 임상 맥락에서 의사 또는 다른 의료 종사자의 관리 하에 있는 인간(예를 들어, 성인 남성, 성인 여성, 청소년기 남성, 청소년기 여성, 남성 아동, 여성 아동)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 환자는 면역손상된 환자 또는 원발성 면역 결핍증, AIDS; 특정 면역억제 약물을 복용 중인 암 및 이식 환자; 및 면역계에 영향을 미치는 유전 질환(예를 들어, 선천성 무감마글로불린혈증, 선천성 IgA 결핍증)을 갖는 환자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 약화된 면역계를 갖는 환자일 수 있다. 다양한 구현예에서, 환자는 방광암, 폐암, 흑색종, 및 높은 비율의 돌연변이를 갖는 것으로 보고된 다른 암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역원성 암을 갖는다(Lawrence 등, Nature, 499(7457): 214-218, 2013).
"내성 또는 불응성 암"은 예를 들어 화학치료법, 수술, 방사선 치료법, 줄기 세포 이식 및 면역치료법을 포함하는 이전 항암 치료법에 반응하지 않은 종양 세포 또는 암을 지칭한다. 종양 세포는 치료 시작 시 내성 또는 불응성일 수 있거나 치료 동안 내성 또는 불응성이 될 수 있다. 불응성 종양 세포는 치료 개시 시 반응하지 않거나 초기에 짧은 기간 동안 반응하지만 치료에 반응하지 않는 종양을 포함한다. 불응성 종양 세포는 또한 항암 치료법으로의 치료에 반응하지만 후속 회의 치료법에는 반응하지 않는 종양을 포함한다. 본 출원의 목적을 위해, 불응성 종양 세포는 또한 항암 치료법으로의 치료에 의해 억제되는 것으로 보이지만 치료가 중단된지 최대 5년, 때로는 최대 10년 이상 후에 재발하는 종양을 포괄한다. 항암 치료법은 화학치료제 단독, 방사선 단독, 표적화 치료법 단독, 수술 단독 또는 이의 조합을 사용할 수 있다. 제한이 아닌 설명의 편의를 위해, 불응성 종양 세포는 내성 종양과 상호교환 가능함이 이해될 것이다.
본원에 기재된 출원의 측면 및 구현예는 측면 및 구현예로 "구성된" 및/또는 "본질적으로 구성된" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 해당 값 또는 매개변수 자체에 관한 변형을 포함(및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "또는" 및 "the"는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 본원에 기재된 본 출원의 측면 및 변형은 측면 및 변형으로 "구성된" 및/또는 "본질적으로 구성된" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
HER2 항원
인간 표피 성장 인자 수용체 패밀리의 구성원인 HER2(CD340 또는 ERBB2로도 알려짐)는 주로 HER2 게놈 증폭으로 인해 유방암, 위암 및 폐암을 포함한 특정 악성종양에서 비정상적으로 발현된다. HER2 과발현은 이러한 암에서 재발 위험 증가 및 더 불량한 예후와 관련이 있다. HER2 양성 악성종양에서 이 단백질은 하류 RAS-RAF-ERK 및 PI3K-PTEN-AKT 신호전달을 자극하고 세포 증식에 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서 HER2는 암에서 선호되는 치료 표적이다. HER2를 표적화하는 수많은 항체가 개발되었다. 예를 들어, 항-HER2 모노클로날 항체, 예컨대 트라스투주맙 및 퍼투주맙 및 HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티닙은 생존을 개선하는 것으로 나타났으며 유방암 및 위암을 포함한 HER2 양성 암에 대한 표준 치료법으로 사용된다.
항HER2 모노클로날 항체, 링커 및 세포독성제 페이로드를 포함하는 ADC는 또한 HER2 양성 악성종양에 대한 표적화 치료법으로 사용된다. 튜불린 중합 억제제 DM1에 접합된 항-HER2 모노클로날 항체 트라스투주맙으로 구성된 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1)은 이미 HER2 양성 유방암 치료를 위해 사용되고 있다. 그 3상 임상 시험(EMILIA 연구)에서 T-DM1은 HER2 양성 유방암 환자의 생존 및 삶의 질을 개선하는 것으로 밝혀졌다. 또한 환자의 44%가 T-DM1 치료에 반응했다. 그러나 다른 사례에서는 그 유효성이 제한되며, 모든 환자에서 결국 T-DM1 내성이 발생한다. HER2 양성 암을 갖는 환자의 치료를 개선할 수 있는 이러한 제한의 기저 메커니즘을 더 잘 이해할 필요가 있다.
트라스투주맙 데룩스테칸(DS-8201a)은 강력한 토포이소머라제 I 억제제인 엑사테칸 유도체(DX-8951 유도체, DXd)를 갖는 신규 링커 페이로드 시스템을 사용하여 제조된 또 다른 HER2 표적화 ADC이다. 이는 HER2 발현이 높거나 낮은 T-DM1 비민감성 환자 유래 이종이식편 모델에 대해 효과적이었다. DS-8201a는 높은 막 투과성 페이로드로 인해 강력한 방관자 효과를 가지며 T-DM1에 반응하지 않는 HER2 이질성을 가진 종양을 치료하는 데 유익하다. DS-8201a는 최근 절제 불가능하거나 치료받은 적이 있는 전이성 HER2 양성 유방암에 대해 FDA의 승인을 받았다. 승인은 이전에 다른 HER2 치료법으로 치료받은 적이 있는 HER2 양성 유방암 환자를 포함하는 2상 DESTINY-Breast01 시험에 기반하였다. 전반적으로 60.9%의 환자가 이 새로운 HER2 ADC에 반응했다. 유방암 외에도 DS-8201a는 폐암 및 위암과 같은 다른 HER2 양성 암 유형에서 우수한 임상적 유효성을 실증했다. 높은 비의 오래가는 반응이 관찰되었지만 전체 생존에 대한 임상적 이익이 DS-8201a로 결정되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "HER2"는 인간 HER2(hHER2), hHER2의 변이체, 이소형 및 종 동족체, 및 hHER2와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 사용된 hHER2 폴리펩티드는 NCBI 참조 서열: NP_001005862에 제시된 아미노산 서열(서열 번호 1)을 포함할 수 있다:
MKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV(서열 번호 1)
다양한 구현예에서, HER2 폴리펩티드는 서열 번호 1의 인간 HER2 서열과, 예를 들어 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의, 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. HER2의 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 1의 223개 아미노산 서열에서 주어진 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 언급하여 본원에 기재될 수 있다. 따라서, 예를 들어 용어 "P21W"는 서열 번호 1의 위치 21에서 "P"(표준 단일 문자 코드에서 프롤린) 잔기가 "W"(표준 단일 문자 코드에서 트립토판)로 치환되었음을 표시한다.
Trop-2 항원
영양막 세포 표면 항원-2(Trop-2)(종양 관련 칼슘 신호 전달인자 2(TACSTD1), 막 구성요소 염색체 1 표면 마커 1(M1S1), 위장관 항원 733-1(GA733-1) 및 상피 당단백질-1(EGP-1)로도 알려짐)는 적어도 2개의 I형 막 단백질을 포함하는 TACSTD 패밀리에 속한다. Trop-2는 적어도 2개의 I형 막 단백질을 포함하는 TACSTD 패밀리에 속한다. 그것은 세포내 칼슘 신호를 전달하고 세포 표면 수용체로 작용한다. 그것은 하나의 큰 세포외 도메인, 하나의 단일 막횡단 도메인 및 짧은 세포질 꼬리로 이루어진 323개 아미노산을 갖는다.
Trop-2는 영양막 세포의 세포 표면 마커로 처음 발견되었지만 이후 보고에 따르면 Trop-2는 제한된 정상 조직, 예컨대 비강, 유방, 피부 및 기관지 상피 세포에서도 낮은 수준으로 발현된다. 추가 연구는 Trop-2가 구강암, 두경부암, 갑상샘암, 폐암, 유방암, 위암, 결장직장암, 췌장암, 신장암, 전립샘암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암 및 신경아교종을 포함하는 여러 상이한 암 유형에서 과발현됨을 제시하였다. 상승된 발현은 암 환자에서 질환 진행 및 불량한 예후와 관련이 있다. 암 세포에서 Trop-2의 과발현은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 종양 성장을 자극하는 것으로 나타났다. 유사하게, siRNA에 의한 Trop-2 발현의 억제는 종양 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 종양 성장에 중요한 것 외에도 Trop-2는 전이에도 관여된다. IGF, ErbB3, ERK, MAPK, Notch-Wnt 및 Raf 경로를 포함하여 Trop-2가 관여하는 적어도 6개의 주요 신호전달 경로가 있다. 그러나 이러한 경로에서의 그 정확한 역할 그리고 상이한 암 및 상이한 치료 접근에서 어느 하류 경로가 중요한지는 아직 규명되지 않았다.
종양 대 정상 조직에서의 그 차별적 발현, 종양 성장 및 전이의 촉진에서의 그 역할 및 음성적 예후 값에 기반하여, Trop-2는 유망한 진단/치료 표적으로 제안되었다. Trop-2 신호전달의 차단이 암을 치료하는 수단일 수 있다. Trop-2-표적화 항원 결합 단편(Fab)은 아폽토시스를 유도하고 유방암 세포 증식에 대한 억제 효과를 갖는 것으로 나타났다. 몇 가지 항-Trop-2 항체가 개발되었지만 네이키드 항체로 치료적 용도에 적합한 것은 없었다. Trop-2-표적화 항체-약물 접합체(ADC)가 최근 개발되었다. 사시투주맙 고비테칸(IMMU-132)은 인간화 항-Trop-2 항체 hRS7과 이리노테칸의 활성 대사물질인 SN-38의 접합체이다. 그것은 많은 전임상 연구에서 개발 및 시험되었으며 광범위한 종양의 성장을 억제할 수 있었다. 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 전이성 삼중 음성 유방암, 췌장암 환자에서의 초기 상 임상 시험에서도 고무적인 유효성을 나타내었다. II상 IMMU-132-01 임상 시험에서 IMMU-132는 기존 라인의 치료에 실패한 전이성 삼중 음성 유방암을 갖는 환자에서 33.3% 전체 반응률을 나타내었다. 반응 지속기간의 중앙값은 7.7개월이었다. 결과에 기반하여 IMMU-132는 최초의 FDA 승인을 받은 항 Trop-2 ADC가 되었다. 이 항-Trop-2-ADC는 우수한 임상 효과를 실증하지만, Trop-2 활성과 관련된 암 및 기타 질환의 치료를 위해 항-Trop-2 항체를 사용하는 개선된 치료제에 대한 요구가 남아 있다.
본원에 사용된 용어 "Trop-2"는 인간 Trop-2(hTrop-2), hTrop-2의 변이체, 이소형 및 종 동족체, 및 hTrop-2와 적어도 하나의 공통 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다. 다양한 구현예에서, 본원에 사용된 hTrop-2 폴리펩티드는 NCBI 참조 서열: NP_002344.2에 제시된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 포함할 수 있다:
MARGPGLAPPPLRLPLLLLVLAAVTGHTAAQDNCTCPTNKMTVCSPDGPGGRCQCALGSGMAVDCSTLTSKCLLLKARMSAPKNARTLVRPSEHALVDNDGLYDPDCDPEGRFKARQCNQTSVCWCVNSVGVRRTDKGDLSLRCDELVRTHHILIDLRHRPTAGAFNHSDLDAELRRLFRERYRLHPKFVAAVHYEQPTIQIELRQNTSQKAAGDVDIGDAAYYFERDIKGESLFQGRGGLDLRVRGEPLQVERTLIYYLDEIPPKFSMKRLTAGLIAVIVV VVVALVAGMAVLVITNRRKS GKYKKVEIKELGELRKEPSL(서열 번호 2)
다양한 구현예에서, Trop-2 폴리펩티드는 서열 번호 2의 인간 Trop-2 서열과, 예를 들어 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 관찰된 상동성을 공유하는 아미노산 서열을 포함한다. Trop-2의 폴리펩티드 변이체는 서열 번호 2의 223개 아미노산 서열에서 주어진 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 언급하여 본원에 기재될 수 있다. 따라서 예를 들어 용어 "P21W"는 서열 번호 2의 위치 21에서 "P"(표준 단일 문자 코드에서 프롤린) 잔기가 "W"(표준 단일 문자 코드에서 트립토판)로 치환되었음을 표시한다.
항체
항체는 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 이들은 단일 사슬 항체(소형 모듈식 면역약제 또는 SMIPs™ 포함), Fab 및 F(ab')2 단편 등으로 만들어질 수 있다. 항체는 인간화, 키메라화, 탈면역화되거나 완전 인간 항체일 수 있다. 수많은 간행물이 많은 유형의 항체 및 이러한 항체를 조작하는 방법을 제시한다. 예를 들어, U.S. 특허 번호 6,355,245; 6,180,370; 5,693,762; 6,407,213; 6,548,640; 5,565,332; 5,225,539; 6,103,889; 및 5,260,203을 참고한다.
인간 Trop-2에 결합하는 신규 항체를 생성하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 본 발명자들은 인간 Trop-2에 결합하는 신규 항체를 생성하였다. 간략하게, Trop-2에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 방법은 검출 가능 면역 반응을 자극하는 데 효과적인 양의 Trop-2를 포함하는 면역원성 조성물을 마우스에게 투여하는 단계, 마우스로부터 항체-생산 세포(예를 들어, 비장으로부터의 세포)를 얻고 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합하여 항체 생산 하이브리도마를 얻는 단계, 및 항체 생산 하이브리도마를 시험하여 Trop-2에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일단 얻어지면, 하이브리도마는 세포 배양에서, 임의로 하이브리도마 유래 세포가 Trop-2에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 배양 조건에서 증식될 수 있다. 모노클로날 항체는 세포 배양물으부터 정제될 수 있다. 키메라 항체는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. CDR 그래프팅 및 역돌연변이 방법이 인간화 항체를 제조하기 위해 사용되었다.
예를 들어, 라이브러리로부터 재조합 항체를 선택하는 방법, 또는 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)의 면역화에 의존하는 방법을 포함하는, 필수 특이성의 항체를 제조 또는 단리하는 다른 적합한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555, 1993; Jakobovits 등, Nature, 362:255-258, 1993; Lonberg 등, U.S. 특허 번호 5,545,806; Surani 등, U.S. 특허 번호 5,545,807)을 참고한다.
예시적인 작제물
본 출원은 HER2(예를 들어, 인간 HER2)에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 Trop-2(예를 들어, 인간 Trop-2)에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 작제물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 출원은 제1 중쇄 가변 영역(VH-1) 및 제1 경쇄 가변 영역(VL-1)을 포함하는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 제2 중쇄 가변 영역(VH-2) 및 제2 경쇄 가변 영역(VL-2)을 포함하는 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 작제물을 제공하고, 제1 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 7, 55, 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 및 전장 항체는 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 내의 VH 및 VL은 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25, 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, 작제물은 a) 서열 번호 14, 60, 또는 62에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체; b) 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 출원은 제1 중쇄 가변 영역(VH-1) 및 제1 경쇄 가변 영역(VL-1)을 포함하는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 제2 중쇄 가변 영역(VH-2) 및 제2 경쇄 가변 영역(VL-2)을 포함하는 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 작제물을 제공하고, 제1 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 7, 55, 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 및 전장 항체는 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 내의 VH 및 VL은 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25, 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, 작제물은 a) 서열 번호 16, 59, 또는 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체; 및 b) 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 출원은 제1 중쇄 가변 영역(VH-1) 및 제1 경쇄 가변 영역(VL-1)을 포함하는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 제2 중쇄 가변 영역(VH-2) 및 제2 경쇄 가변 영역(VL-2)을 포함하는 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 작제물을 제공하고, 제1 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 7, 55, 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 및 전장 항체는 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 내의 VH 및 VL은 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25, 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, 작제물은 a) 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체; 및 b) 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 출원은 제1 중쇄 가변 영역(VH-1) 및 제1 경쇄 가변 영역(VL-1)을 포함하는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 제2 중쇄 가변 영역(VH-2) 및 제2 경쇄 가변 영역(VL-2)을 포함하는 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 작제물을 제공하고, 제1 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv을 포함하고; 제2 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원-결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 7, 55, 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 및 전장 항체는 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 내의 VH 및 VL은 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, 작제물은 a) 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체; 및 b) 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 출원은 제1 중쇄 가변 영역(VH-1) 및 제1 경쇄 가변 영역(VL-1)을 포함하는 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인, 및 제2 중쇄 가변 영역(VH-2) 및 제2 경쇄 가변 영역(VL-2)을 포함하는 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 작제물을 제공하고, 제1 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인은 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원-결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, 제1 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 7, 55, 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인은 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 및 전장 항체는 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, scFv 내의 VH 및 VL은 링커(예를 들어, 펩티드 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 24, 25, 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 링커)와 융합된다. 일부 구현예에서, 작제물은 a) 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체; 및 b) 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄, 또는 적어도(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 단편은 임의로 IgG 불변 도메인(예를 들어, 서열 번호 12 포함)을 포함하는 중쇄 불변 도메인 및 임의로 카파 불변 영역 또는 람다 불변 영역(예를 들어, 서열 번호 13 포함)을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 작제물은 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편이거나 이를 포함하며, 임의로 이중특이적 항체는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 작제물은 화학식 Ab-(L-D)n을 갖는 항체-약물 접합체(ADC)를 포함하며, 식 중 Ab는 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편이고, L은 링커 또는 직접적 결합이고, D는 치료제이고, n은 1 내지 10으로부터의 정수이다.
이중특이적 항-HER2/Trop-2 결합 분자
한 측면에서, 본 출원은 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 작제물을 제공한다. 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 수용체에 대한 또 다른 항체 또는 리간드)에 결합되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 출원의 항체는 사실상 유도체화되거나 하나 초과의 다른 기능적 분자에 결합되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있다; 이러한 다중특이적 분자는 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄되는 것으로 의도된다. 본 출원의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 출원의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 이중특이적 분자가 제조되도록 하는 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 결합될 수 있다(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합에 의해 또는 다르게). 다양한 구현예에서, 본 출원은 FcγR 또는 FcαR 발현 효과기 세포(예를 들어, 단핵구, 대식구 또는 다형핵 세포(PMN)) 및 Trop-2를 발현하는 표적 세포 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 구현예에서, 이중특이적 분자는 Trop-2 발현 세포를 효과기 세포로 표적화하고 Fc 수용체-매개 효과기 세포 활성, 예를 들어 Trop-2 발현 세포의 식균작용, 항체 의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 사이토카인 방출, 또는 슈퍼옥사이드 음이온의 생성을 촉발한다. 본 출원의 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인 및 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 HER2 항체 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 면역글로불린 항원 결합 도메인은 Trop-2 항체 결합 부위에 특이적으로 결합한다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인 및 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인을 포함하고, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 Trop-2 항체 결합 부위에 특이적으로 결합하고, 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 HER2 항체 결합 부위에 결합한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 (a) VH 및 VL; (b) 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 VH, 및 경쇄 불변 영역(LC) 또는 이의 단편을 포함하는 VL; (c) 단일 사슬 Fv("scFv"); (d) 디아바디; (e) 미니바디; (f) F(ab')2; 및 (g) F(ab)를 포함하거나 이로 구성된다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 scFv 항체 단편을 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함한다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 항원 결합 도메인은 VH 및 VL을 포함하고, 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 scFv 항체 단편을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 또는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인은 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 VH 및 경쇄 불변 영역 또는 이의 단편을 추가로 포함하는 VL을 포함한다. 다양한 구현예에서, 중쇄 불변 영역 또는 이의 단편은 IgG 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, IgG 불변 영역 또는 이의 단편은 IgG1 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, LC 불변 영역은 카파 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 람다 불변 영역이다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 Fc 도메인을 포함할 수 있는 중쇄를 포함한다. 다양한 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 다양한 구현예에서, IgG1 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인이다.
다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 모노클로날 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 인간화 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 인간 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 키메라 항체이다. 다양한 구현예에서, 제1 또는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 친화도 최적화된 항체이다. 다양한 구현예에서, 인간 항체는 트랜스제닉 마우스에서 발현된다(예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된, Bruggemann, "Human antibody expression in transgenic mice, " Arch. Immunol. Therap. Exper. 49: 203-208, 2001 참고).
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 카복시-말단에 공유 결합된다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 카복시-말단 사이에 개재된 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 펩티드 링커 II는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함한다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인은 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 아미노-말단에 공유 결합된다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 중쇄의 아미노-말단 사이에 개재된 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 펩티드 링커 II는 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 scFv는 천연이든 아니든 임의의 적합한 공급원으로부터 수득가능하거나 이에 의해 생산되거나, 본 개시의 scFv의 요구되는 결합 특이성을 유지하는 한, 재조합 scFv, 합성 scFv, 반합성 scFv, 유도체화된 scFv, 발효 최적화된 scFv, 이의 융합 단백질 또는 동등물, 돌연변이체 및 유도체일 수 있다. 이들은 아미노산 치환을 갖거나 아미노산 작용기에 부착된 당 또는 다른 분자를 갖는 결합 특이성을 갖는 scFv를 포함한다. scFv와 관련하여 본원에 사용된 용어 "유도체" 또는 "유도체화된"은 scFv의 화학적 변형을 포함한다. 이러한 변형의 예는 알킬, 아실 또는 아미노기로의 수소 대체일 것이다.
링커
일부 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 2개의 모이어티 또는 도메인 사이(예를 들어, Trop2에 특이적으로 결합하는 scFv와 허셉틴의 전장 항체 사이, 예를 들어, 허셉틴 scFv와 Trop2에 결합하는 전장 항체 사이, 예를 들어, scFv에서 VH 또는 VL 사이)에 하나 이상의 링커를 포함한다. 작제물에서 사용된 링커(들)의 길이, 유연성 정도 및/또는 기타 특성은 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 친화도, 특이성 또는 결합력을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특성에 일부 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 2개의 인접한 도메인이 서로 입체적으로 간섭하지 않도록 보장하기 위해 더 긴 링커가 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커(예컨대 펩티드 링커)는 인접한 도메인이 서로에 대해 자유롭게 이동할 수 있도록 유연한 잔기(예컨대 글리신 및 세린)를 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 이중체가 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 비펩티드 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 절단 불가능 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 절단 가능 링커이다.
다른 링커 고려사항은 생성된 화합물의 물리적 또는 약동학적 특성, 예컨대 용해도, 친유성, 친수성, 소수성, 안정성(계획된 분해뿐만 아니라 더 또는 덜 안정한), 강성, 유연성, 면역원성, 항체 결합의 조절, 마이셀 또는 리포좀에 혼입되는 능력 등에 대한 효과를 포함한다.
펩티드 링커
펩티드 링커는 자연 발생 서열 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄 단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로 사용될 수 있다. 예를 들어 WO1996/34103을 참고한다.
펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 이상의 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 최대 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 이하의 아미노산 길이 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커의 길이는 약 1개 아미노산 내지 약 10개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 20개 아미노산, 약 1개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 15개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 25개 아미노산, 약 5개 아미노산 내지 약 30개 아미노산, 약 10개 아미노산 내지 약 30개 아미노산 길이, 약 30개 아미노산 내지 약 50개 아미노산, 약 50개 아미노산 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 1개 아미노산 내지 약 100개 아미노산 중 어느 하나이다.
이러한 펩티드 링커의 본질적인 기술적 특징은 상기 펩티드 링커가 임의의 중합 활성을 포함하지 않는다는 것이다. 2차 구조의 촉진 부재를 포함하는 펩티드 링커의 특성은 당분야에 알려져 있고, 예를 들어 문헌(Dall'Acqua 등 (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle 등 (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) 및 Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80))에 기재되어 있다. "펩티드 링커"와 관련하여 특히 바람직한 아미노산은 Gly이다. 또한, 임의의 2차 구조도 촉진하지 않는 펩티드 링커가 바람직하다. 서로에 대한 도메인의 결합은 예를 들어 유전적 조작에 의해 제공될 수 있다. 융합되고 작동가능하게 결합된 이중특이적 단일 사슬 작제물을 제조하고 이를 포유동물 세포 또는 박테리아에서 발현하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, WO 99/54440, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989 및 1994 또는 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001).
펩티드 링커는 프로테아제, 특히 매트릭스 메탈로프로티나제(MMP)에 의해 절단 불가능한, 안정한 링커일 수 있다.
링커는 가요성 링커일 수도 있다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체(G)n(서열 번호 48), 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n(서열 번호 49), (GSGGS)n(서열 번호 50), (GGGGS)n(서열 번호 51), 및 (GGGS)n(서열 번호 52)을 포함하고, n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 기타 당분야에 알려진 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화되지 않았으므로 구성요소 사이에서 중성 테더로 작용할 수 있다. 글리신은 심지어 알라닌보다 훨씬 더 많은 phi-psi 공간에 접근하고 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제약된다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992) 참고). 당업자는 항체 융합 단백질의 설계가 모두 또는 부분적으로 가요성 링커를 포함할 수 있음을 인식할 것이며, 이에 따라 링커는 가요성 링커 부분뿐만 아니라 원하는 항체 융합 단백질 구조를 제공하기 위해 덜 유연한 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다.
또한, 예시적 링커는 또한 n이 1 내지 8의 정수인, (GGGGS)n(서열 번호 51), 예를 들어 (GGGGS)3(서열 번호 46), (GGGGS)4(서열 번호 47), 또는 (GGGGS)6(서열 번호 53)과 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (GSTSGSGKPGSGEGS)n(서열 번호 54)의 아미노산 서열을 포함하며, n은 1 내지 3의 정수이다.
비펩티드 링커
2개의 모이어티의 커플링은 두 구성요소가 모두 이의 각각의 활성, 예를 들어 각각 본원에 기재된 작제물에서 HER2 및 Trop-2에 대한 결합을 유지하는 한, 2개의 분자를 결합시킬 임의의 화학 반응에 의해 달성될 수 있다. 이 결합은 많은 화학적 메커니즘, 예를 들어 공유 결합, 친화도 결합, 삽입, 배위 결합 및 복합체화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 기존 측쇄의 직접적 응축에 의해 또는 외부 가교 분자의 혼입에 의해 달성될 수 있다. 많은 2가 또는 다가 결합제가 이러한 맥락에서 단백질 분자를 커플링하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 대표적인 커플링제는 유기 화합물, 예컨대 티오에스테르, 카보디이미드, 숙신이미드 에스테르, 디이소시아네이트, 글루타르알데히드, 디아조벤젠 및 헥사메틸렌 디아민을 포함할 수 있다. 이 목록은 당분야에 알려진 다양한 클래스의 커플링제를 망라하도록 의도되는 것이 아니라, 보다 일반적인 커플링제의 예시이다(Killen 및 Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen 등, Immunological Reviews 62:185-216 (1982); 및 Vitetta 등, Science 238:1098 (1987) 참고).
본 출원에서 적용될 수 있는 링커는 문헌에 기재되어 있다(예를 들어 MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르)의 사용을 기재하는 Ramakrishnan, S. 등, Cancer Res. 44:201-208 (1984) 참고). 일부 구현예에서, 본원에 사용된 비펩티드 링커는 (i) EDC(1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드, (ii) SMPT(4-숙신이미딜옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-프리딜-디티오)-톨루엔(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G), (iii) SPDP(숙신이미딜-6[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도]헥사노에이트)(Pierce Chem. Co., Cat #21651G), (iv) 설포-LC-SPDP(설포숙신이미딜 6[3-(2-피리딜디티오)-프로피온아미드]헥사노에이트)(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); 및 (v) EDC에 접합된 설포-NHS(N-하이드록시설포-숙신이미드: Pierce Chem. Co., Cat. #24510)를 포함한다.
상기 기재된 링커는 상이한 속성을 갖는 구성요소를 함유하므로, 상이한 물리-화학적 특성을 갖는 이중특이적 항체를 야기할 수 있다. 예를 들어, 알킬 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르는 방향족 카복실레이트의 설포-NHS 에스테르보다 더 안정하다. NHS-에스테르 함유 링커는 설포-NHS 에스테르보다 용해도가 낮다. 또한, 링커 SMPT는 입체 장애 디설피드 결합을 함유하고, 안정성이 증가된 항체 융합 단백질을 형성할 수 있다. 디설피드 결합은 일반적으로 디설피드 결합이 시험관내 절단되어 이용 가능한 항체 융합 단백질을 적게 만들기 때문에 다른 결합보다 덜 안정하다. 특히 설포-NHS는 카보디미드 커플링의 안정성을 향상시킬 수 있다. 카보디이미드 커플링(예를 들어, EDC)은 sulfo-NHS와 함께 사용될 때 카보디이미드 커플링 반응 단독보다 가수분해에 더 강한 에스테르를 형성한다.
예시적인 구현예
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(서열 번호 3)
제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH:
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS(서열 번호 4)
및 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIK(서열 번호 5).
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH:
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSS(서열 번호 10)
및 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다:
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVDIK(서열 번호 11).
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSS(서열 번호 6)
제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(서열 번호 7)
및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(서열 번호 8).
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고:
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSS(서열 번호 9)
제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열 번호 14)
및 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함한다:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 15).
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCMSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICWNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPTEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCI.VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALRNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 22)
및 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함한다:
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTIIQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 23).
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASSRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGVNWIRQPPGKGLEWIGVMWAGGSTNYNSALMSRLTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDENWDGAWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열 번호 16)
및 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 17).
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 HER2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하며, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열 번호 20)
및 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 21).
본 출원의 다양한 구현예에서, 단리된 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 면역글로불린 항원-결합 도메인 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 면역글로불린 항원-결합 도메인을 포함하고, 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄(HC):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVDIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSS(서열 번호 18)
및 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄(LC)를 포함하고:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 번호 19)
제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 scFv를 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항체는 scFv 도메인, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체이고, scFv 도메인은 서열 번호 3, 6, 9에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 중쇄는 서열 번호 14, 16, 18, 20, 22에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 경쇄는 서열 번호 15, 17, 19, 21, 23에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 HC의 카복시-말단에 공유 결합된다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 HC의 카복시-말단 사이에 개재된 적어도 하나의 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나의 링커가 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 HC의 카복시-말단 사이에 개재된다.
다양한 구현예에서, 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인은 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 HC의 아미노 말단에 공유 결합된다. 다양한 구현예에서, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 HC의 아미노-말단 사이에 개재된 적어도 하나의 링커를 포함한다. 다양한 구현예에서, 하나의 링커가 제2 면역글로불린 항원 결합 도메인과 제1 면역글로불린 항원 결합 도메인의 HC의 아미노 말단 사이에 개재된다.
본 개시의 다양한 구현예에서 이중특이적 항체는 서열 번호 14, 16, 18, 20 및 22 중 어느 하나에 제시된 중쇄 서열을 포함하는 항체와 동일하거나 더 높은 항원-결합 친화도를 갖는 항-HER2/Trop-2 항체일 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 서열 번호 14, 16, 18, 20 및 22 중 어느 하나에 제시된 중쇄 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-HER2/Trop-2 항체일 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 서열 번호 14, 16, 18, 20 및 22 중 어느 하나에 제시된 중쇄 서열을 포함하는 항체와 경쟁하는 항-HER2/Trop-2 항체이다. 다양한 구현예에서, 항체는 서열 번호 14, 16, 18, 20 및 22 중 어느 하나에 제시된 경쇄 서열의 적어도 하나(예컨대 2개 또는 3개)의 CDR을 포함하는 항-HER2/Trop-2 항체일 수 있다.
본 개시의 다양한 구현예에서 이중특이적 항체는 서열 번호 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 하나에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체와 동일하거나 더 높은 항원-결합 친화도를 갖는 항-HER2/Trop-2 항체일 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 서열 번호 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 하나에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-HER2/Trop-2 항체일 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 서열 번호 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 하나에 제시된 경쇄 서열을 포함하는 항체와 경쟁하는 항-HER2/Trop-2 항체이다. 다양한 구현예에서, 항체는 서열 번호 15, 17, 19, 21 및 23 중 어느 하나에 제시된 경쇄 서열의 적어도 하나(예를 들어, 2개 또는 3개)의 CDR을 포함하는 항-HER2/Trop-2 항체일 수 있다.
본 출원의 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 당분야에 알려진 임의의 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 카파형 또는 람다형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마- 또는 뮤-유형 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgA-, IgD-, IgE-, IgG- 및 IgM-유형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 다양한 구현예에서, 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은 자연 발생 불변 영역의 절편, 유도체, 변이체 또는 뮤테인이다.
관심 항체로부터의 상이한 서브클래스 또는 이소형의 항체를 유도하기 위한 기술, 즉 서브클래스 스위칭이 알려져 있다. 따라서, IgG 항체는 예를 들어 IgM 항체로부터 유도될 수 있으며, 그 반대도 가능하다. 이러한 기술은 주어진 항체(모 항체)의 항원 결합 특성을 보유하지만 모 항체와 상이한 항체 이소형 또는 서브클래스와 관련된 생물학적 특성을 나타내는 새로운 항체의 제조를 허용한다. 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 특정 항체 폴리펩티드를 암호화하는 클로닝된 DNA, 예를 들어 원하는 이소형의 항체의 불변 도메인을 암호화하는 DNA가 이러한 절차에서 사용될 수 있다. 또한 문헌(Lanitto 등, Methods Mol. Biol. 178:303-16, 2002)을 참고한다.　
본 출원의 항체는 또한 이의 교차 반응성 측면에서 기재되거나 특정될 수 있다. 인간 HER2 및 Trop-2와 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 및 적어도 50% 동일성(당분야에 알려지고 본원에 기재된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는, HER2 및 Trop-2에 결합하는 항체가 또한 본 출원에 포함된다.
다양한 구현예에서, 본 출원의 항체는, 예를 들어 항체의 효과기 기능(들)을 변경하기 위해, 하나 또는 두 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의 하나 이상의 잔기를 변형시키거나 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체의 가변 영역은 프레임워크 서열을 사용하여 CDR 그래프팅을 수행함으로써 변형될 것이며 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌(예를 들어, 각각의 내용이 명시적으로 본원에 참조로 포함된, Tomlinson, I. M., 등, J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992; 및 Cox, J. P. L. 등, Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994)으로부터 얻어질 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 결합 친화도를 개선하고/하거나 면역원성을 감소시키는 돌연변이(들)를 VH 및/또는 VL에 도입하기 위해 부위 지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 사용하여 변형될 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 항체의 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원 의존적 세포성 세포독성을 변경할 목적으로 Fc 영역에서 변형될 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체는 항체의 글리코실화를 변형시킬 목적으로 변형될 수 있다. 본원에 기재된 각각의 변형 등을 수행하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
항원에 결합하는 이중특이적 항체의 특성규명
본 출원의 이중특이적 항체는 예를 들어 유세포 측정에 의해 세포 표면 상에서 발현된 인간 HER2 및 Trop-2에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 간략하게, FACS 완충액 중 세포에 항체를 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 후, 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한다. 그런 다음 beckman 유세포 측정 시스템을 사용하여 분석하기 전에 세포를 해리하고 얼음 위에서 30분 동안 형광-접합 2차 항체로 염색한다. 형광 강도 및 세포 결합 백분율은 Beckman 유세포 측정 소프트웨어로 분석할 수 있다.
약학 조성물
또 다른 측면에서, 본 개시는 상기 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 따라서 본 출원의 약학 조성물, 방법 및 용도는 또한 아래에 상세히 설명된 바와 같이 다른 활성제와의 조합(공동-투여)의 구현예를 포괄한다.
일반적으로, 본 출원의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 항체는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제(들)와 함께 제형물로 투여되기 적합하다. 용어 '부형제'는 본 출원의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 기재하기 위해 본원에서 사용된다. 부형제(들)의 선택은 상당한 정도로 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 투여형의 성질과 같은 요인에 의존할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한 부형제"는 생리학적으로 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 일부 예는 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등뿐만 아니라 이의 조합이다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 물질의 추가 예는 수화제 또는 소량의 보조 물질, 예컨대 항체의 유효 기간 또는 효과를 향상시키는, 수화제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제이다. 본 출원의 약학 조성물 및 이의 제조 방법은 당업자에게 쉽게 자명할 것이다. 이러한 조성물 및 이의 제조 방법은 예를 들어 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995))에서 찾을 수 있다. 약학 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다.　
본 출원의 약학 조성물은 단일 단위 용량으로서 또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에 투여될 활성 성분의 투여량 또는 이러한 투여량의 편리한 분량, 예를 들어 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 동일하다.　
당분야에서 허용되는 펩티드, 단백질 또는 항체를 투여하는 임의의 방법이 본 출원의 항체 및 부분에 대해 적합하게 사용될 수 있다.　
본 출원의 약학 조성물은 전형적으로 비경구 투여에 적합하다. 본원에 사용된 바와 같이, 약학 조성물의 "비경구 투여"는 대상체 조직의 물리적 파괴 및 조직의 파괴를 통한 약학 조성물의 투여를 특징으로 하는 임의의 투여 경로를 포함하며, 따라서 일반적으로 혈류, 근육 또는 내부 장기로의 직접 투여를 초래한다. 따라서 비경구 투여는 조성물의 주사, 외과적 절개를 통한 조성물의 적용, 조직 관통 비-외과적 상처를 통한 조성물의 적용 등에 의한 약학 조성물의 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특히, 비경구 투여는 피하, 복강내, 근육내, 흉골내, 정맥내, 동맥내, 척수강내, 심실내, 요도내, 두개내, 활막내 주사 또는 주입, 및 신장 투석 주입 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 고려된다. 다양한 구현예는 정맥내 및 피하 경로를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 약학 조성물의 제형물은 전형적으로 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 예컨대 멸균수 또는 멸균 등장성 식염수와 조합된 활성 성분을 포함한다. 이러한 제형물은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사제 제형물은 단위 투여형, 예컨대 보존제를 함유하는 앰플 또는 다중 용량 용기로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여용 제형물은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중 에멀젼, 페이스트 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 제형물은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형물의 한 구현예에서, 활성 성분은 재구성된 조성물의 비경구 투여 전에 적합한 비히클(예를 들어, 멸균, 발열원 비함유수)로의 재구성을 위한 건조(즉, 분말 또는 과립) 형태로 제공된다. 비경구 제형물은 또한 부형제, 예컨대 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 pH 3 내지 9)를 함유할 수 있는 수용액을 포함하지만, 일부 적용의 경우 멸균 비수성 용액 또는 멸균, 발열원 비함유수와 같은 적합한 비히클과 함께 사용될 건조 형태로 보다 적합하게 제형화될 수 있다. 예시적인 비경구 투여 형태는 멸균 수용액, 예를 들어 수성 프로필렌 글리콜 또는 덱스트로스 용액 중 용액 또는 현탁액을 포함한다. 이러한 제형물은 원하는 경우, 적합하게 완충될 수 있다. 유용한 다른 비경구로 투여 가능한 제형물은 활성 성분을 미세결정질 형태 또는 리포좀 조제물로 포함하는 것들을 포함한다. 비경구 투여용 제형물은 즉시 및/또는 변형 방출되도록 제형화될 수 있다. 변형 방출 제형물은 지연, 지속, 펄스화, 제어, 표적화 및 프로그램 방출을 포함한다.
예를 들어, 한 측면에서, 멸균 주사제 용액은 필요한 양의 이중특이적 항체를 필요에 따라 위에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입한 다음 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클로 활성 화합물을 혼입하여 제조된다. 멸균 주사제 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 원하는 임의의 추가 성분을 더한 활성 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들어 코팅제, 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사제 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 일으킬 수 있다.
본 출원의 항체는 비강내로 또는 전형적으로 건조 분말 흡입기로부터의 건조 분말 형태로(단독으로, 혼합물로, 또는 예를 들어 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합된, 혼합된 구성요소 입자로) 흡입에 의해, 가압 용기, 펌프, 스프레이, 분무기(바람직하게는 미세 미스트를 생성하기 위해 전기유체역학을 사용하는 분무기) 또는 네불라이저로부터의 에어로졸 스프레이로서, 적합한 추진제를 사용하거나 사용하지 않고, 또는 점비제로 투여될 수 있다.
가압 용기, 펌프, 분무기, 분무기 또는 네뷸라이저는 일반적으로 예를 들어 활성제를 분산, 가용화 또는 연장 방출하기 위해 적합한 제제, 용매로서 추진제(들)를 포함하는 본 출원의 항체의 용액 또는 현탁액을 함유한다.
건조 분말 또는 현탁 제형물에서 사용하기 전에 완제 의약품은 일반적으로 흡입에 의한 전달에 적합한 크기(전형적으로 5마이크론 미만)로 마이크론화된다. 이는 임의의 적절한 분쇄 방법, 예컨대 스파이럴 제트 밀링, 유동층 제트 밀링, 나노입자 형성을 위한 초임계 유체 처리, 고압 균질화 또는 분무 건조에 의해 달성될 수 있다.
흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐, 블리스터 및 카트리지는 적용 화합물, 적합한 분말 기재 및 성능 변형제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
적합한 향미제, 예컨대 멘톨 및 레보멘톨 또는 감미제, 예컨대 사카린 또는 사카린 나트륨이 흡입/비강내 투여를 위한 본 출원의 제형물에 첨가될 수 있다.　
흡입/비강내 투여를 위한 제형물은 즉시 방출 및/또는 변형 방출되도록 제형화될 수 있다. 변형 방출 제형물은 지연, 지속, 펄스화, 제어, 표적화 및 프로그램 방출을 포함한다.　
건조 분말 흡입기 및 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브에 의해 결정된다. 본 출원에 따른 단위는 전형적으로 본 출원의 항체의 계량된 용량 또는 "퍼프"를 투여하도록 배열된다. 전체 1일 용량은 전형적으로 단일 용량으로, 또는 보다 일반적으로는 하루에 걸쳐 분할된 용량으로 투여될 것이다.　
본 출원의 항체 및 항체 부분은 또한 경구 경로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여는 화합물이 위장관으로 들어가도록 삼키는 것, 및/또는 화합물이 입으로부터 직접 혈류로 들어가는 협측, 설측 또는 설하 투여가 관여할 수 있다.　
경구 투여에 적합한 제형물은 고체, 반고체 및 액체 시스템, 예컨대 정제; 다중- 또는 나노-미립자, 액체 또는 분말을 함유하는 연질 또는 경질 캡슐; 로젠지(액체 충전 포함); 츄; 젤; 신속 분산 투여형; 필름; 소란; 스프레이; 및 협측/점막접착성 패치를 포함한다.　
경구 사용을 위한 약학 조성물은 약학 조성물의 제조를 위해 당분야에 알려진 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며 이러한 조성물은 약학적으로 우아하고 맛 좋은 조제물을 제공하기 위해 감미제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 경구 전달 가능 정제를 제조하기 위해, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 약학 부형제와 혼합되고, 고체 제형물은 위장관으로의 전달을 위해 알려진 방법에 따라 정제를 형성하도록 압축된다. 정제 조성물은 전형적으로 첨가제, 예를 들어 당류 또는 셀룰로스 담체, 결합제, 예컨대 전분 페이스트 또는 메틸 셀룰로스, 충전제, 붕해제, 또는 전형적으로 의료 조제물의 제조에서 일반적으로 사용되는 기타 첨가제와 함께 제형화된다. 경구 전달 가능 캡슐을 제조하기 위해, DHEA는 적어도 하나의 약학 부형제와 혼합되고, 고체 제형물은 위장관으로의 전달에 적합한 캡슐 용기에 배치된다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물은 본원에 참조로 포함된, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) at Chapter 89)에 일반적으로 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.　
다양한 구현예에서, 약학 조성물은 정제 제조에 적합한 무독성의 약학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유하는 경구 전달 가능 정제로 제형화된다. 이들 부형제는 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨, 과립화제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나, 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시키기 위해 알려진 기술로 코팅되어 더 장기간 동안 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트가 단독으로 또는 왁스와 함께 사용될 수 있다.
다양한 구현예에서, 약학 조성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐로 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 수성 또는 유성 매질, 예를 들어 아라키스 오일, 땅콩 오일, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐로 제형화된다.
액체 제형물은 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이러한 제형물은 연질 또는 경질 캡슐(예를 들어, 젤라틴 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스로부터 제조됨)에서 충전제로 사용될 수 있으며, 전형적으로 담체, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 메틸셀룰로스 또는 적합한 오일, 및 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함한다. 액체 제형물은 또한 예를 들어 향낭으로부터 고체의 재구성에 의해 제조될 수 있다.　
치료적 용도
또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에 치료 유효량의 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을(단일치료법 또는 조합 치료법 요법으로) 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 장애는 고형 종양, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 영역의 암, 위암, 고환암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비호지킨 림프종, 식도암, 소장암, 내분비계의 암, 갑상샘암, 부갑상샘암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 만성 또는 급성 백혈병, 소아 고형 종양, 림프구성 림프종, 방광암, 신장암 또는 요관암, 신장 골반 암종, 중추 신경계(CNS) 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌하수체 샘종, 카포시 육종, 표피모양암, 편평세포암, T-세포 림프종, 및 상기 암의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다양한 구현예에서, 대상체는 이전에 항암 치료법으로의 치료에 반응했지만 치료법 중단 시 재발(이하 "재발성 암")을 겪었다. 다양한 구현예에서, 대상체는 내성 또는 불응성 암을 갖는다. 다양한 구현예에서, 암성 세포는 면역원성 종양(예를 들어, 종양 자체를 사용하는 백신접종이 종양 유발에 대한 면역성을 야기할 수 있는 종양)이다. 다양한 구현예에서, 암은 결장직장암(CRC), 신장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 전립샘암, 유방암, 난소암, 췌장암, 위암 및 신경아교종으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 전립샘암, 유방암, 결장암, 췌장암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 본 출원의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 생체내 암성 세포를 직접 사멸시키거나 제거하기 위해 이용될 수 있다. 직접적 사멸은 항체(임의로 세포독성 약물에 융합됨)를 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것이 관여한다. 다양한 구현예에서, 암은 필적하는 조직의 비암성 세포보다 더 높은 수준으로 Trop-2를 발현하는 암 세포를 포함한다. 항체가 암성 세포 상에서 Trop-2를 인식하므로, 항체가 결합하는 임의의 이러한 세포는 파괴된다. 항체가 암 세포를 사멸 또는 제거하기 위해 단독으로 사용되는 경우, 이러한 사멸 또는 제거는 내인성 숙주 면역 기능, 예컨대 CDC 및/또는 ADCC를 개시함으로써 영향을 받을 수 있다. 항체가 이러한 방식으로 세포를 사멸시키는지 여부를 결정하기 위한 검정은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
일부 구현예에서, 암은 Trop2 양성 및/또는 HER2 양성이다.
일부 구현예에서, 암은 Trop2 중발현 또는 고발현 및/또는 HER2 중발현 또는 고발현이다.
일부 구현예에서, 암은 Trop2 저발현 및/또는 HER2 저발현이다.
Trop2 또는 HER2의 발현 수준은 적합한 방법, 예컨대, 예를 들어 대상체로부터의 표본으로부터의 종양 절편 상에서의 면역조직화학(IHC) 염색을 통해 평가될 수 있고, Trop2 및/또는 HER2의 저발현, 중발현 및 고발현의 분류는 암의 유형 및/또는 당분야에서 널리 허용 가능한 기준, 예를 들어 문헌(Zhang 등, BMC Cancer. 2020 Aug 27;20(1):815; Ahn 등, J Pathol Transl Med. 2020 Jan; 54(1): 34-44; 및 Inamura 등, Oncotarget. 2017 Apr 25; 8(17): 28725-28735)에 예시된 것들에 기반한다.
일부 구현예에서, 암은 Colo205 세포 또는 BxPC-3 세포 상에서와 유사한 수준의 Trop 2 발현을 가질 때(예를 들어, Colo205 또는 BxPC3 상에서의 Trop 2 발현 수준의 25% 또는 50% 미만 또는 초과 이내) Trop2 저발현이다. 일부 구현예에서, 암은 NCI-N87 세포 또는 SK-BR-3 세포 상에서와 유사한 수준의 Trop 2 발현을 가질 때(예를 들어, NCI-N87 세포 또는 SK-BR-3 세포 상에서의 Trop 2 발현 수준의 25% 또는 50% 미만 또는 초과 이내) Trop 2 고발현이다. 일부 구현예에서, 암은 Colo205 또는 BxPC3 상에서의 Trop 2 발현 수준의 25%, 50%, 75% 또는 100% 초과보다 높고 NCI-N87 세포 또는 SK-BR-3 세포 상에서의 Trop 2 발현 수준의 100%, 75%, 50% 또는 25% 미만보다 낮을 때 Trop 2 중발현이다.
일부 구현예에서, 암은 Colo205 세포 상에서와 유사한 수준의 HER2 발현을 가질 때(예를 들어, Colo205 상에서의 HER2 발현 수준의 25% 또는 50% 미만 또는 초과 이내) HER2 저발현이다. 일부 구현예에서, 암은 NCI-N87 또는 MDA-MB-468 세포 상에서와 유사한 수준의 HER2 발현을 가질 때(예를 들어, NCI-N87 또는 MDA-MB-468 세포 상에서의 HER2 발현 수준의 25% 또는 50% 미만 또는 초과 이내) HER2 중발현이다. 일부 구현예에서, 암은 BxPC-3 세포 상에서와 유사한 수준의 HER2 발현을 가질 때(예를 들어, BxPC-3 세포 상에서의 HER2 발현 수준의 25% 또는 50% 미만 또는 초과 이내) HER2 고발현이다.
다양한 구현예에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 암성 종양 세포의 성장 억제 및/또는 증식을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 이들 방법은 예를 들어 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%와 같이, 상기 대상체의 암 세포의 성장을 억제하거나 방지할 수 있다. 그 결과, 암이 고형 종양인 경우, 조절은 고형 종양의 크기를 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시킬 수 있다.
암 세포 증식의 억제는 세포 기반 검정, 예컨대 브로모데옥시우리딘(BRDU) 혼입(Hoshino 등, Int. J. Cancer 38, 369, 1986; Campana 등, J. Immunol. Meth. 107:79, 1988; [3H]-티미딘 혼입(Chen, J., Oncogene 13:1395-403, 1996; Jeoung, J., J. Biol. Chem. 270:18367-73, 1995; 염료 알라마 블루(Alamar Blue)(Biosource International로부터 이용 가능)(Voytik-Harbin 등, In Vitro Cell Dev Biol Anim 34:239-46, 1998)에 의해 측정될 수 있다. 암 세포의 부착 비의존적 성장은 연성 한천 상의 콜로니 형성 검정에 의해, 예컨대 연성 한천 상부에 형성된 암 세포 콜로니 수를 계수함으로써 평가된다(실시예 및 Sambrook 등, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1989 참고).
대상체에서 암 세포 성장의 억제는 대상체, 예를 들어 동물 모델 또는 인간 대상체에서 암 성장을 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 하나의 예시적인 모니터링 방법은 종양형성 검정이다. 한 예에서, 이종이식편은 기존 종양 또는 종양 세포주로부터의 인간 세포를 포함한다. 종양 이종이식편 검정은 당분야에 알려져 있고 본원에 기재되어 있다(예를 들어, Ogawa 등, Oncogene 19:6043-6052, 2000 참고). 또 다른 구현예에서, 종양형성은 그 전체가 본원에 참조로 포함된, U.S. 특허 번호 5,698,413에 기재된 중공 섬유 검정을 사용하여 모니터링된다.
억제 백분율은 암 세포 증식, 부착 비의존적 성장, 또는 조절제 처리 하의 암 세포 성장을 음성 대조군 조건(전형적으로 조절제 처리 없음) 하의 것과 비교함으로써 계산된다. 예를 들어, 암 세포 또는 암 세포 콜로니 수(콜로니 형성 검정) 또는 PRDU 또는 [3H]-티미딘 혼입이 A(조절제의 처리 하에) 및 C(음성 대조군 조건 하에)인 경우, 억제 백분율은 (C-A)/Cx100%일 것이다.
인간 종양으로부터 유래되고 시험관내 및 생체내 연구에서의 사용에 이용 가능한 종양 세포주의 예는 백혈병 세포주(예를 들어, CCRF-CEM, HL-60(TB), K-562, MOLT-4, RPM1-8226, SR, P388 및 P388/ADR, H292, MV-411); 비-소세포 폐암 세포주(예를 들어, A549/ATCC, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H226, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460, NCI-H522 및 LXFL 529); 소세포 폐암 세포주(예를 들어, DMS 114 및 SHP-77); 결장암 세포주(예를 들어, COLO 205, HCC-2998, HCT-116, HCT-15, HT29, KM12, SW-620, DLD-1 및 KM20L2); 중추 신경계(CNS) 암 세포주(예를 들어, SF-268, SF-295, SF-539, SNB-19, SNB-75, U251, SNB-78 및 XF 498); 흑색종 세포주(예를 들어, LOX I MVI, MALME-3M, M14, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SK-MEL-5, UACC-257, UACC-62, RPMI-7951 및 M19-MEL); 난소암 세포주(예를 들어, IGROV1, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8 및 SK-OV-3); 신장암 세포주(예를 들어, 786-0, A498, ACHN, CAKI-1, RXF 393, SN12C, TK-10, UO-31, RXF-631 및 SN12K1); 전립샘암 세포주(예를 들어, PC-3 및 DU-145); 유방암 세포주(예를 들어, MCF7, NCI/ADR-RES, MDA-MB-231/ATCC, HS 578T, MDA-MB-435, BT-549, T-47D 및 MDA-MB-468); 및 갑상샘암 세포주(예를 들어, SK-N-SH)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.　
또 다른 측면에서, 본 출원은 대상체에 치료 유효량의 본 출원의 단리된 항체 또는 항원-결합 단편을(단일치료법으로서 또는 조합 치료법 요법에서) 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 구현예에서, 대상체는 병원성 바이러스에 의해 유발된 감염성 질환을 갖는다. 다양한 구현예에서, 대상체는 병원성 박테리아에 의해 유발된 감염성 질환을 갖는다. 다양한 구현예에서, 대상체는 병원성 진균에 의해 유발된 감염성 질환을 갖는다. 다양한 구현예에서, 대상체는 병원성 기생충에 의해 유발된 감염성 질환을 갖는다. 다양한 구현예에서, 대상체는 통상적인 백신을 사용하는 치료에 대해 내성이거나 이에 의해 비효과적으로 치료되는 감염성 질환을 갖는다.
"치료 유효량" 또는 "치료 유효 용량"은 치료되는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 해소시킬 투여되는 치료제의 양을 지칭한다.
치료 유효 용량은 IC50을 결정함으로써 세포 배양 검정으로부터 초기에 추정될 수 있다. 이어서 용량은 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장 중 수준은 예를 들어 HPLC에 의해 측정될 수 있다. 정확한 조성, 투여 경로 및 투여량은 대상체의 병태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다.
투여량 요법은 원하는 최적 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 몇몇 분할된 용량(다중 또는 반복 또는 유지)이 시간 경과에 따라 투여될 수 있으며 용량은 치료 상황의 위급성에 의해 표시된 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여량 단위 형태는 치료될 포유동물 대상체에 대한 단독 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약학 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 사전결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 개시의 투여량 단위 형태에 대한 사양은 주로 항체의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료 또는 예방 효과에 의해 지정될 것이다.
따라서, 당업자는 본원에 제공된 개시에 기반하여 치료 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 용량 및 투약 요법이 조정됨을 이해할 것이다. 즉, 최대 관용 용량이 쉽게 확립될 수 있고, 대상체에 검출 가능한 치료 이점을 제공하는 유효량이 또한 대상체에 검출 가능한 치료 이점을 제공하는 각 제제를 투여하기 위한 시간적 요구사항과 마찬가지로 결정될 수 있다. 따라서, 특정 용량 및 투여 요법이 본원에 예시되지만, 이들 예는 본 개시를 실시함에 있어서 대상체에 제공될 수 있는 용량 및 투여 요법을 결코 제한하지 않는다.　
투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 변할 수 있고 단일 또는 다중 용량을 포함할 수 있음이 주지되어야 한다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여량 요법은 개체의 필요성 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 의도가 아님이 추가로 이해되어야 한다. 또한, 본 개시의 조성물을 사용한 투여량 요법은 질환의 유형, 대상체의 연령, 체중, 성별, 의학적 병태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 사용된 특정 항체를 포함하는 다양한 요인에 기반할 수 있다. 따라서 투여량 요법은 다양하게 변할 수 있지만 표준 방법을 사용하여 일상적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 임상적 효과, 예컨대 독성 효과 및/또는 실험실 값을 포함할 수 있는 약동학적 또는 약력학적 매개변수에 기반하여 조정될 수 있다. 따라서, 본 개시는 당업자에 의해 결정되는 대상체내 용량 증량을 포괄한다. 적절한 투여량 및 요법의 결정은 관련 분야에 잘 알려져 있으며 일단 본원에 개시된 교시가 제공되면 당업자에 의해 포괄되는 것으로 이해될 것이다.　
인간 대상체로의 투여를 위해, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 총 월간 용량은, 물론 투여 방식에 따라, 대상체당 0.5-1200 mg, 대상체당 0.5-1100 mg, 대상체당 0.5-1000 mg, 대상체당 0.5-900 mg, 대상체당 0.5-800 mg, 대상체당 0.5-700 mg, 대상체당 0.5-600 mg, 대상체당 0.5-500 mg, 대상체당 0.5-400 mg, 대상체당 0.5-300 mg, 대상체당 0.5-200 mg, 대상체당 0.5-100 mg, 대상체당 0.5-50 mg, 대상체당 1-1200 mg, 대상체당 1-1100 mg, 대상체당 1-1000 mg, 대상체당 1-900 mg, 대상체당 1-800 mg, 대상체당 1-700 mg, 대상체당 1-600 mg, 대상체당 1-500 mg, 대상체당 1-400 mg, 대상체당 1-300 mg, 대상체당 1-200 mg, 대상체당 1-100 mg 또는 대상체당 1-50 mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 정맥내 월간 용량은 대상체당 약 1-1000 mg을 필요로 할 수 있다. 다양한 구현예에서, 본 개시의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 대상체당 약 1-200 mg, 대상체당 1-150 mg 또는 대상체당 1-100 mg으로 투여될 수 있다. 총 월간 용량은 단일 또는 분할된 용량으로 투여될 수 있으며, 의사의 재량에 따라 본원에 제공된 전형적인 범위를 벗어날 수 있다.　
일부 구현예에서, 작제물은 적어도 약 5 mg/kg의 용량으로 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 작제물은 마우스에서 적어도 5 mg/kg의 용량과 동등한 용량으로 인간에게 투여된다. 문헌(Nair, A. B., & Jacob, S. (2016). A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of basic and clinical pharmacy, 7(2), 27)을 참고한다.
수 일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 병태에 따라 원하는 증상의 저해가 발생할 때까지 또는 예를 들어 통증을 감소시키기 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투약 요법은 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 약 2 mg/kg의 초기 용량, 이어서 약 1 mg/kg의 주간 유지 용량, 또는 이어서 격주 약 1 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나 실시자가 달성하기 원하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여량 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 일주일에 1-4회 투약이 고려된다. 이 치료법의 진행은 통상적 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다. 투약 요법(사용된 HER2/Trop-2 길항제(들) 포함)은 경시적으로 변할 수 있다. 다양한 구현예에서, HER2/Trop-2 길항제 항체의 적절한 투여량은 사용되는 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체(또는 이의 조성물), 치료될 두통(예를 들어, 편두통)의 유형 및 중증도, 제제가 방지 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료법, 환자의 임상 이력 및 제제에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존한다. 전형적으로 임상의는 원하는 결과를 달성하는 투여량에 도달될 때까지 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 걸쳐 변할 수 있다.
투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있음이 주지되어야 한다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투여량 요법은 개인의 필요성 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 의도가 아님이 추가로 이해되어야 한다.
다양한 구현예에서, 투여되는 총 용량은 예를 들어 약 1 내지 1000 μg/ml, 약 1 내지 750 μg/ml, 약 1 내지 500 μg/ml, 약 1 내지 250 μg/ml, 약 10 내지 1000 μg/ml, 약 10 내지 750 μg/ml, 약 10 내지 500 μg/ml, 약 10 내지 250 μg/ml, 약 20 내지 1000 μg/ml, 약 20 내지 750 μg/ml, 약 20 내지 500 μg/ml, 약 20 내지 250 μg/ml, 약 30 내지 1000 μg/ml, 약 30 내지 750 μg/ml, 약 30 내지 500 μg/ml, 약 30 내지 250 μg/ml 범위의 혈장 항체 농도를 달성할 것이다.
본 출원의 약학 조성물의 독성 및 치료 지수는 예를 들어 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(집단의 50%에 대한 치료 유효 용량)을 결정하기 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 유효 용량 사이의 용량 비가 치료 지수이며 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 일반적으로 바람직하다.　
다양한 구현예에서, 약학 조성물의 단일 또는 다중 투여는 대상체에 의해 요구되고 관용되는 투여량 및 빈도에 따라 투여된다. 여하튼, 조성물은 대상체를 효과적으로 치료하기 충분한 양의 본원에 개시된 적어도 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공해야 한다. 투여량은 1회 투여될 수 있지만 치료 결과가 달성될 때까지 또는 부작용이 치료법의 중단을 정당화할 때까지 주기적으로 적용될 수 있다.
항체 또는 이의 항원 결합 단편 약학 조성물의 투약 빈도는 치료법의 성질 및 치료되는 특정 질환에 의존한다. 대상체는 원하는 치료 결과가 달성될 때까지 정기적 간격으로, 예컨대 매주 또는 매월 치료될 수 있다. 예시적인 투약 빈도는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 휴식 없이 매주 1회; 매주 1회, 격주로; 2주 1회; 3주 1회; 2주 동안 휴식 없이 약하게, 이어서 매월; 3주 동안 휴식 없이 약하게, 이어서 매월; 매월; 격월 1회; 3개월 1회; 4개월 1회; 5개월 1회; 또는 6개월 1회 또는 매년.
조합 치료법
본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 하나 이상의 다른 치료제를 지칭하는 본원에 사용된 용어 "공동-투여", "공동-투여된" 및 "조합으로"는 하기를 의미하는 것으로 의도되며, 이를 지칭하고 포함한다: 이러한 구성요소가 상기 구성요소를 상기 대상체에 실질적으로 동시에 방출하는 단일 투여형으로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료제(들)의 이러한 조합의 동시 투여; 이러한 구성요소가 상기 대상체에 의해 실질적으로 동시에 섭취되는 별도의 투여형으로 서로 떨어져 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 대한 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료제(들)의 이러한 조합의 실질적으로 동시 투여로서, 이 때 상기 구성요소는 상기 대상체에 대해 실질적으로 동시에 방출되는, 투여; 이러한 구성요소가 각각의 투여 사이에 상당한 시간 간격을 두고 상기 대상체에 의해 연속적 시간에 섭취되는 별도의 투여형으로 서로 떨어져서 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료제(들)의 이러한 조합의 순차적 투여로서, 이 때 상기 구성요소는 상기 대상체에 실질적으로 상이한 시간에 방출되는, 투여; 및 이러한 구성요소가 제어되는 방식으로 상기 구성요소를 방출하는 단일 투여형으로 함께 제형화될 때, 치료를 필요로 하는 대상체에 본 개시의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 치료제(들)의 이러한 조합의 순차적 투여로서, 이 때 이들은 상기 대상체에 동일한 및/또는 상이한 시간에 동시에, 연속적으로, 및/또는 중첩하여 방출되며, 각 부분은 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다.　
또 다른 측면에서, 대상체에 치료 유효량의 본 출원의 단리된 항체 또는 항원-결합 단편 및 b) 면역치료법, 화학치료법, 소분자 키나제 억제제 표적화 치료법, 수술, 방사선 치료법, 백신접종 프로토콜 및 줄기 세포 이식으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가 치료법을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위해 설계된 조합 치료법에 관한 것이고, 조합 치료법은 종양 세포의 증가된 세포 사멸을 제공하며, 즉 공동 투여될 때 단리된 항체 또는 항원 결합 단편과 추가 치료법 사이에 상승작용이 존재한다.
다양한 구현예에서, 면역치료법은 공동-자극 또는 공동-억제 분자(면역 체크포인트), 예컨대 PD-1, PD-L1, OX-40, CD137, GITR, LAG3, TIM-3 및 VISTA에 대한 효능, 길항 또는 차단 항체를 사용한 치료; 이중특이적 T 세포 연관 항체(BiTE®), 예컨대 블리나투모맙을 사용한 치료; 생물학적 반응 변형제, 예컨대 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ의 투여가 관여하는 치료; 치료용 백신, 예컨대 시푸류셀-T를 사용한 치료; 수지상 세포 백신 또는 종양 항원 펩티드 백신을 사용한 치료; 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포를 사용한 치료; CAR-NK 세포를 사용한 치료; 종양 침윤 림프구(TIL)를 사용한 치료; 차용 전달된 항-종양 T 세포(생체외 확장 및/또는 TCR 트랜스제닉)를 사용한 치료; TALL-104 세포를 사용한 치료; 및 면역자극제, 예컨대 Toll-유사 수용체(TLR) 효능제 CpG 및 이미퀴모드를 사용한 치료로 구성된 군으로부터 선택된다.
다양한 통상적 화합물이 항종양 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이들 화합물은 고형 종양을 수축시키거나, 전이 및 추가 성장을 방지하거나, 백혈병 또는 골수 악성종양에서 악성 T-세포의 수를 감소시키기 위해 화학치료법에서 약제로 사용되어 왔다. 화학 치료법이 다양한 유형의 악성 종양을 치료하는 데 효과적이었지만 많은 항-신생물 화합물은 원치 않는 부작용을 유도한다. 2개 이상의 상이한 치료가 조합될 때, 치료는 상승적으로 작용할 수 있고 각각의 치료법의 투여량 감소를 허용하여 더 높은 용량에서 각 화합물에 의해 가해지는 유해한 부작용을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다. 다른 경우에, 치료에 불응성인 악성종양은 둘 이상의 상이한 치료의 조합 치료법에 반응할 수 있다.
본원에 개시된 이중특이적 항체가 또 다른 통상적 항종양제와 조합으로 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 때, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 항-신생물제의 치료 효과를 향상시키거나 이러한 항-신생물제에 대한 세포 내성을 극복할 수 있다. 이는 항-신생물제의 투여량 감소를 허용하여 원치 않는 부작용을 감소시키거나 내성 T-세포에서 항-신생물제의 효과를 회복시킨다.
조합 항종양 치료법을 위해 사용될 수 있는 약학 화합물은, 단지 예시를 위해, 아미노글루테티미드, 암사크린, 아나스트로졸, 아스파라기나제, bcg, 비칼루타미드, 블레오마이신, 부세렐린, 부설판, 캄포테신, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 콜히친, 사이클로포스파미드, 시프로테론, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 디엔에스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 엑세메스탄, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 젬시타빈, 제니스테인, 고세렐린, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티닙, 인터페론, 이리노테칸, 이로노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로레타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 노코다졸, 옥트레오티드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카바진, 랄티트렉시드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 수라민, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스토스테론, 티오구아닌, 티오테파, 티타노센 디클로라이드, 토포테칸, 트라스투주맙, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈을 포함한다.
이러한 화학치료 항종양 화합물은 이의 작용 메커니즘에 따라 예를 들어 하기 그룹으로 분류될 수 있다: 항-대사물질/항암제, 예컨대 피리미딘 유사체(5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈 및 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 엽산 길항제 및 관련 억제제(머캅토푸린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신(클라드리빈)); 천연 산물, 예컨대 빈카 알칼로이드(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미세소관 파괴제, 예컨대 탁산(파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신(에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제(악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 메르클로레타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테르, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 에토포시드(VP16))를 포함하는 항증식/항유사분열제; 항생제, 예컨대 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신(아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신) 및 미토마이신; 효소(L-아스파라긴을 전신 대사하고 자신의 아스파라긴을 합성할 능력이 없는 세포를 박탈하는 L-아스파라기나제); 항혈소판제; 항증식/항유사분열 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드(메클로레타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민(헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 설포네이트-부설판, 니트로소우레아(카무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카바지닌(DTIC); 항증식/항유사분열 항대사물질, 예컨대 엽산 유사체(메토트렉세이트); 백금 배위 복합체(시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체(에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 바이칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 억제제(레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제(헤파린, 합성 헤파린 염 및 기타 트롬빈 억제제); 섬유소용해제(예컨대 조직 플라스미노겐 활성화제, 스트렙토키나제 및 유로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동억제제; 항분비제(브레벨딘); 면역억제제(사이클로스포린, 타크롤리무스(FK-506), 시롤리무스(라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 항혈관신생 화합물(TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제제(혈관 내피 성장 인자(VEGF) 억제제, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여체; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 항체(트라스투주맙); 세포 주기 억제제 및 분화 유도제(트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제(독소루비신(아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드(코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능장애 유도제 및 카스파제 활성화제; 및 염색질 파괴자.
다양한 구현예에서, 화학치료법은 다우노루비신, 닥티노마이신, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신, 질소 머스타드, 클로람부실, 멜팔란, 사이클로포스파미드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 벤다무스틴, 시타라빈(CA), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록수리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜히친, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 테니포시드, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 펜토스타틴, 클라드리빈, 시타라빈, 겜시타빈, 프랄라트렉세이트, 미톡산트론, 디에틸스틸베스트롤(DES), 플루라다빈, 이포스파미드, 하이드록시우레아탁산(예컨대 파클리탁셀 및 독세탁셀) 및/또는 안트라사이클린 항생제뿐만 아니라 DA-EPOCH, CHOP, CVP 또는 FOLFOX와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 제제의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 화학치료제를 포함한다.
다양한 구현예에서, 소분자 키나제 억제제 표적화 치료법은 브루톤(Bruton's) 티로신 키나제(BTK) 억제제, 포스파티딜이노시톨-3-키나제(PI3K) 억제제, SYK 억제제(예를 들어, 엔토스플레티닙), AKT 억제제, mTOR 억제제, Src 억제제, JAK/STAT 억제제, Ras/Raf/MEK/ERK 억제제 및 Aurora 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 소분자 키나제 억제제를 포함한다(D'Cruz 등, Expert Opin Pharmacother, 14(6): 707-21, 2013 참고).
다양한 구현예에서, 조합 치료법은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 하나 이상의 추가 치료법을 동시에 투여하는 것을 포함한다. 다양한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 조성물 및 하나 이상의 추가 치료법은 순차적으로 투여되며, 즉 항체 또는 이의 항원 결합 단편 조성물은 하나 이상의 추가 치료법의 투여 전 또는 후에 투여된다.
다양한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 조성물 및 하나 이상의 추가 치료법의 투여는 동시적이며, 즉 항체 또는 이의 항원 결합 단편 조성물 및 하나 이상의 추가 치료법의 투여 기간은 서로 중첩된다.
다양한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 조성물 및 하나 이상의 추가 치료법의 투여는 비동시적이다. 예를 들어, 다양한 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 조성물의 투여는 하나 이상의 추가 치료법이 투여되기 전에 종료된다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 추가 치료법의 투여는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 조성물이 투여되기 전에 종료된다.
본원에 개시된 이중특이적 항체가 하나 이상의 추가 치료법과 조합으로 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 때, 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하나 이상의 추가 치료법의 치료 효과를 향상시키거나 하나 이상의 추가 치료법에 대한 세포 내성을 극복할 수 있다. 이는 하나 이상의 추가 치료법의 감소된 투여량 또는 지속기간을 허용하여 원치 않는 부작용을 감소시키거나 하나 이상의 추가 치료법의 효과를 회복시킨다.
진단적 용도
또 다른 측면에서, 본 출원은 예를 들어 인간 HER2- 및 Trop-2-관련 장애를 진단하기 위한, 샘플에서 인간 HER2 및 Trop-2 펩티드의 존재를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법을 제공한다. 일부 방법에서, 이는 항체와 인간 HER2 및 Trop-2 사이의 복합체 형성을 허용하는 조건 하에서 이중특이적 항체인 대조군 샘플과 함께 시험될 샘플을 접촉시킴으로써 달성된다. 그런 다음 두 샘플에서 복합체 형성이 검출되고(예를 들어, ELISA를 사용하여) 샘플 간 복합체 형성의 통계적으로 유의한 차이는 시험 샘플에서 인간 HER2 및 Trop-2 항원의 존재를 표시한다.
다양한 구현예에서, 대상체에서 암을 검출하거나 암의 진단을 확인하는 방법이 제공된다. 이 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플을 본 출원의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및 샘플에 대한 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 대조군 샘플에 대한 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합과 비교하여 샘플에 대한 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합 증가는 대상체에서 암을 검출하거나 암의 진단을 확인시켜 준다. 대조군은 암을 갖지 않은 것으로 알려진 대상체로부터의 샘플 또는 표준 값일 수 있다. 샘플은 생검, 부검 및 병리학 표본으로부터의 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 조직의 절편, 예를 들어 조직학적 목적으로 채취된 냉동 절편을 포함한다. 생물학적 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 객담 및 척수액을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플에서 HER2 및 Trop-2를 검출하기 위한 키트가 제공된다. 폴리펩티드를 검출하기 위한 키트는 전형적으로 HER2 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 인간 항체, 예컨대 본원에 개시된 임의의 항체를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 항체 단편, 예컨대 Fv 단편이 키트에 포함된다. 생체내 사용을 위해 항체는 scFv 단편일 수 있다. 추가 구현예에서, 항체는 표지된다(예를 들어, 형광, 방사성 또는 효소 표지로).
한 구현예에서, 키트는 HER2 및 Trop-2에 특이적으로 결합하는 항체의 사용 수단을 개시하는 지침 자료를 포함한다. 지침 자료는 전자 형식(예컨대 컴퓨터 디스켓 또는 컴팩트 디스크)으로 작성될 수 있거나 시각적일 수 있다(예컨대 비디오 파일). 키트는 또한 키트가 설계된 특정 적용을 용이하게 하기 위해 추가 구성요소를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 키트는 표지를 검출하는 수단(예컨대 효소 표지를 위한 효소 기질, 형광 표지를 검출하기 위한 필터 세트, 적절한 2차 표지, 예컨대 2차 항체 등)을 추가로 함유할 수 있다. 키트는 특정 방법의 실시를 위해 일상적으로 사용되는 완충액 및 기타 시약을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 키트 및 적절한 내용물은 당업자에게 잘 알려져 있다.　
한 구현예에서, 진단 키트는 면역검정을 포함한다. 면역 검정의 상세사항은 사용된 특정 형식에 따라 다를 수 있지만, 생물학적 샘플에서 HER2 및 Trop-2를 검출하는 방법은 일반적으로 생물학적 샘플을 면역학적 반응성 조건 하에 HER2 및 Trop-2와 특이적으로 반응하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 항체는 면역학적 반응성 조건 하에 특이적으로 결합하여 면역 복합체를 형성할 수 있고, 면역 복합체(결합된 항체)의 존재가 직접적으로 또는 간접적으로 검출된다.
다양한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 진단 목적을 위해 표지되거나 표지되지 않을 수 있다. 전형적으로 진단 검정은 HER2 또는 Trop-2에 대한 항체의 결합으로 생성된 복합체의 형성을 검출하는 것을 수반한다. 항체는 직접적으로 표지될 수 있다. 방사성 핵종, 형광제, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 및 리간드(예를 들어, 비오틴, 합텐)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 표지가 사용될 수 있다. 여러 적절한 면역검정이 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, U.S. 특허 번호 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 및 4,098,876 참고). 표지되지 않을 때, 항체는 검정, 예컨대 응집 검정에서 사용될 수 있다. 표지되지 않은 항체는 또한 제1 항체(예를 들어, 항-개별특이형 항체 또는 표지되지 않은 면역글로불린에 특이적인 다른 항체) 또는 기타 적합한 시약(예를 들어, 표지된 단백질 A)와 반응성인 항체, 예컨대 표지된 항체(예를 들어, 제2 항체)를 검출하기 위해 사용될 수 있는 또 다른(하나 이상의) 적합한 시약과 조합으로 사용될 수 있다.
본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 또한 특정 질환에 대한 포유동물의 감수성을 검출하는 방법에서 사용될 수 있다. 예시하기 위해, 이 방법은 세포 상에 존재하는 HER2 및 Trop-2의 양 및/또는 포유동물에서 HER2- 및 Trop-2-양성 세포의 수에 기반하여 진행하는 질환에 대한 포유동물의 감수성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 본 출원은 종양에 대한 포유동물의 감수성을 검출하는 방법을 제공한다. 이 구현예에서, 시험될 샘플은 HER2 및 Trop-2 또는 이의 일부에 결합하는 항체의 결합에 적절한 조건 하에 상기 항체와 접촉되며, 샘플은 정상 개체에서 HER2 및 Trop-2를 발현하는 세포를 포함한다. 항체의 결합 및/또는 결합의 양이 검출되며, 이는 종양에 대한 개체의 감수성을 표시하고, 더 높은 수준의 수용체는 종양에 대한 개체의 증가된 감수성과 상관관계가 있다.
다양한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 검출될 수 있는 표지에 부착된다(예를 들어, 표지는 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있음). 활성 모이어티는 다음과 같은 방사성 제제일 수 있다: 방사성 중금속, 철 킬레이트, 예컨대 가돌리늄 또는 망간의 방사성 킬레이트, 산소, 질소, 철, 탄소 또는 갈륨의 양전자 방출체, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 123I, 125I, 131I, 132I, 또는 99Tc. 이러한 모이어티에 부착된 결합제는 조영제로 사용될 수 있고 포유동물, 예컨대 인간에서 진단적 용도를 위해 효과적인 양으로 투여되고 이어서 조영제의 편재 및 축적이 검출된다. 조영제의 편재 및 축적은 방사선섬광조영술, 핵 자기 공명 조영, 전산화 단층촬영 또는 양전자 방출 단층촬영에 의해 검출될 수 있다.
HER2 및 Trop-2에 대한 항체 또는 항원 결합 단편을 사용하는 면역섬광조영술은 암 및 맥관구조를 검출 및/또는 진단하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 99테크네튬, 111인듐 또는 125요오드로 표지된 HER2 및 Trop-2 마커에 대한 모노클로날 항체는 이러한 조영을 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 당업자에게 자명할 바와 같이, 투여될 방사성동위원소의 양은 방사성동위원소에 의존한다. 당업자는 활성 모이어티로 사용되는 주어진 방사성핵종의 비활성 및 에너지에 기반하여 투여될 조영제의 양을 쉽게 제형화할 수 있다. 전형적으로, 조영제 용량당 0.1-100밀리큐리, 또는 1-10밀리큐리, 또는 2-5밀리큐리가 투여된다. 따라서 개시된 조성물은 방사성 모이어티에 접합된 표적화 모이어티를 포함하는 영상화제로서 유용하며 0.1-100밀리큐리, 일부 구현예에서 1-10밀리큐리, 일부 구현예에서 2-5밀리큐리, 일부 구현예에서 1-5밀리큐리를 포함한다.
면역접합체
본 출원은 효과기 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 접합된(또는 결합된) 본 출원의 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 적어도 하나를 포함하는 면역접합체를 추가로 제공한다. 이와 관련하여, 용어 "접합된" 또는 "결합된"은 2개의 폴리펩티드를 하나의 인접 폴리펩티드 분자로 만드는 것을 지칭한다. 결합은 화학적 또는 재조합 수단에 의한 것일 수 있다. 한 구현예에서, 결합은 화학적이며, 항체 모이어티와 효과기 분자 사이의 반응이 두 분자 사이에 형성된 공유 결합을 생성하여 하나의 분자를 형성한다. 펩티드 링커(짧은 펩티드 서열)는 항체와 효과기 분자 사이에 임의로 포함될 수 있다. 다양한 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 효과기 분자에 연결된다. 다른 구현예에서, 효과기 분자에 연결된 항체 또는 항원-결합 단편은 지질, 단백질 또는 펩티드에 추가로 연결되어 체내에서 그 반감기를 증가시킨다. 따라서, 다양한 구현예에서, 본 개시의 항체는 다양한 효과기 분자를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
효과기 분자는 방사성동위원소, 방사성동위원소, 면역조절제, 사이토카인, 림포카인, 케모카인, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, siRNA, RNAi, 마이크로RNA, 광활성 치료제, 항혈관신생제, 친-아폽토시스제, 펩티드 지질, 탄수화물, 킬레이트제, 치료제 또는 화학치료제일 수 있다.
면역독소의 구체적인 비제한적 예는 아브린, 리신, 슈도모나스 외독소(PE, 예컨대 PE35, PE37, PE38 및 PE40), 디프테리아 독소(DT), 보툴리눔 독소, 콜릭스 독소, 또는 이의 변형된 독소, 또는 직접적으로 또는 간접적으로 세포 성장을 억제하거나 세포를 사멸시키는 다른 독성 제제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"사이토카인"은 세포간 매개체로서 또 다른 세포 상에 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질 또는 펩티드 클래스이다. 사이토카인은 면역 조절제로 작용할 수 있다. 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인, 성장 인자 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬을 포함한다. 따라서, 구현예는 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ); 종양 괴사 인자 슈퍼 패밀리(TNFSF) 구성원; 인간 성장 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 여포 자극 호르몬(FSH); 갑상샘 자극 호르몬(TSH); 황체 형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 프로스타글란딘, 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐, OB 단백질; TNF-α; TNF-β; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판 성장 인자; TGF-α; TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 대식구-CSF(M-CSF); 과립구-대식구-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL-1 내지 IL-21), kit-리간드 또는 FLT-3, 안지오스타틴, 트롬보스폰딘 또는 엔도스타틴을 이용할 수 있다. 이러한 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양으로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 동등물을 포함한다.　
케모카인이 또한 본원에 개시된 항체에 접합될 수 있다. 케모카인은 특정 백혈구 세포 서브타입의 화학유인물질 및 활성화제로서 주로 작용하는 작은(대략 약 4 내지 약 14 kDa) 유도성의 분비되는 친염증성 사이토카인의 한 슈퍼패밀리이다. 케모카인 생성은 염증성 사이토카인, 성장 인자 및 병원체 자극에 의해 유도된다. 케모카인 단백질은 보존된 아미노산 서열 모티프에 기반하여 서브패밀리(알파, 베타 및 델타)로 구분되며, 아미노 말단에 인접한 처음 두 시스테인의 위치에 기반하여 4개의 고도로 보존된 그룹--CXC, CC, C 및 CX3C으로 분류된다. 지금까지 50개 초과의 케모카인이 발견되었으며 적어도 18개의 인간 7-막횡단-도메인(7TM) 케모카인 수용체가 존재한다. 사용하는 케모카인은 RANTES, MCAF, MCP-1 및 프랙탈킨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
치료제는 화학치료제일 수 있다. 당업자는 사용하는 화학치료제를 쉽게 확인할 수 있다(예를 들어 Slapak 및 Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry 등, Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed.®. 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L., Berkery R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer D S, Knobf M F, Durivage H J (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993 참고). 면역접합체의 제조에 유용한 화학치료제는 아우리스타틴, 돌라스타틴, MMAE, MMAF, 튜불라이신, AFP, DM1, DM4, 칼리케아미신, 듀오카마이신, 피롤로벤조디아제핀, AEB, 독소루비신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 멜팔란, 클로람부실, 빈카 알칼로이드, 5-플루오로우리딘, 미토마이신-C, 탁솔, L-아스파라기나제, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 하이드록시우레아, 시타라빈, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니트로소우레아, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 다카바진, 프로카바진, 토포테칸, 질소 머스타드, 사이톡산, 에토포시드, BCNU, 이리노테칸, 캄프토테신, 블레오마이신, 이다루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신, 미톡산트론, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 파클리탁셀 및 도세탁셀 그리고 이의 염, 용매 및 유도체를 포함한다. 다양한 구현예에서, 화학치료제는 아우리스타틴 E(돌라스타틴-10으로도 당분야에 알려짐) 또는 이의 유도체뿐만 아니라 이의 약학적 염 또는 용매화물이다. 전형적인 아우리스타틴 유도체는 DM1, AEB, AEVB, AFP, MMAF 및 MMAE를 포함한다. 아우리스타틴 E 및 그 유도체뿐만 아니라 링커의 합성 및 구조는 예를 들어 U.S. 특허 출원 공개 번호 20030083263; U.S. 특허 출원 공개 번호 20050238629; 및 U.S. 특허 번호 6,884,869(각각 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.　다양한 구현예에서, 치료제는 아우리스타틴 또는 아우리스타틴 유도체이다. 다양한 구현예에서, 아우리스타틴 유도체는 도발린-발린-돌라이소류닌-돌라프로인-페닐알라닌(MMAF) 또는 모노메티아우리스타틴 E(MMAE)이다. 다양한 구현예에서, 치료제는 메이탄시노이드 또는 메이탄시놀 유사체이다. 다양한 구현예에서, 메이탄시노이드는 DM1 및 DM4 유도체이다. 다양한 구현예에서, 치료제는 칼리케아미신, 변이체 또는 유도체이다. 다양한 구현예에서, 치료제는 듀오카마이신, 변이체 또는 유도체이다.
효과기 분자는 당업자에게 알려진 임의의 수의 수단을 사용하여 본 출원의 항체 또는 항원-결합 단편에 결합될 수 있다. 공유 및 비공유 부착 수단 둘 모두가 사용될 수 있다. 효과기 분자를 항체에 부착하는 절차는 효과기 분자의 화학 구조에 따라 변한다. 폴리펩티드는 전형적으로 다양한 작용기, 예컨대 카복실산(COOH), 자유 아민(--NH2) 또는 설프하이드릴(--SH)기를 함유하며, 이는 항체 상의 적합한 작용기의 반응에 이용 가능하여 효과기 분자의 결합을 초래한다. 대안적으로, 항체는 추가적인 반응성 작용기를 노출시키거나 부착하기 위해 유도체화된다. 유도체화는 Pierce Chemical Company(Rockford, Ill.)로부터 이용 가능한 것들과 같은 임의의 여러 링커 분자의 부착이 관여할 수 있다. 링커는 항체를 효과기 분자에 연결하기 위해 사용되는 임의의 분자일 수 있다. 링커는 항체와 효과기 분자 둘 모두와 공유 결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커 또는 펩티드 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 항체 및 효과기 분자가 폴리펩티드인 경우, 링커는 이의 측면기를 통해(예를 들어, 시스테인에 대한 디설피드 결합을 통해) 구성 아미노산에 연결되거나 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노 및 카복실기에 연결될 수 있다.　
일부 환경에서는 면역접합체가 그 표적 부위에 도달했을 때 항체로부터 효과기 분자를 유리시키는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 상황에서, 면역접합체는 표적 부위 부근에서 절단 가능한 결합을 포함할 것이다. 항체로부터 효과기 분자를 방출하기 위한 링커의 절단은 효소 활성 또는 면역접합체가 표적 세포 내부 또는 표적 부위 부근에서 거치는 조건에 의해 촉진될 수 있다.　
항체를 효과기 분자로 접합하는 절차는 이전에 기재되었으며 당업자의 범위 내에 있다. 예를 들어, 면역독소의 효소 활성 폴리펩티드를 제조하는 절차는 WO84/03508 및 WO85/03508에 기재되어 있으며, 이의 구체적인 교시의 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다. 다른 기술은 각각은 이러한 기술의 교시 목적으로 본원에 참조로 포함된, 문헌(Shih 등, Int. J. Cancer 41:832-839 (1988); Shih 등, Int. J. Cancer 46:1101-1106 (1990); Shih 등, U.S. 특허 번호 5,057,313; Shih Cancer Res. 51:4192, 국제 공개 WO 02/088172; U.S. 특허 번호 6,884,869; 국제 특허 공개 WO 2005/081711; U.S. 공개 출원 2003-0130189 A; 및 US 특허 출원 번호 20080305044)에 기재되어 있다.
본 출원의 면역접합체는 항체 또는 항원-결합 단편의 면역반응성을 유지하며, 예를 들어 항체 또는 항원-결합 단편은 접합 전과 같이 접합 후에 항원에 결합하는 능력이 대략 동일하거나 약간만 감소되었다.
항체 약물 접합체(ADC)
본원에 사용된 바와 같이, 면역접합체는 항체 약물 접합체(ADC)로도 지칭된다. 본 출원의 한 구현예에 따른 항체 약물 접합체(ADC)는 화학식 Ab-(L-D)n을 가지며, Ab는 이중특이적 항-HER2/Trop-2 결합 항체이고, L은 링커이고, D는 면역독소, 약물 모이어티, 사이토카인, 케모카인, 치료제 또는 화학치료제인 효과기 분자이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로부터의 정수이다.
다양한 구현예에서, ADC는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치료 모이어티를 포함한다. 다양한 구현예에서, ADC는 2, 3 또는 4개의 치료 모이어티를 포함한다. 다양한 구현예에서, 모든 치료 모이어티는 동일하다. 다양한 구현예에서, 적어도 하나의 치료 모이어티는 나머지와 상이하다. 다양한 구현예에서, 모든 치료 모이어티는 상이하다.
폴리뉴클레오티드 및 항체 발현
본 출원은 항-HER2/Trop-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 유전 코드의 축퇴성 때문에 다양한 핵산 서열이 각 항체 아미노산 서열을 암호화한다. 본 출원은 인간 HER2 및 Trop-2에 결합하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같이 엄격한 또는 더 낮은 엄격성의 혼성화 조건 하에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
엄격한 혼성화 조건은 약 45℃에서 6xSSC 중 필터-결합 DNA에 대한 혼성화에 이어 약 50-65℃에서 0.2xSSC/0.1% SDS 중 1회 이상 세척, 매우 엄격한 조건, 예컨대 약 45℃에서 6xSSC 중 필터-결합된 DNA에 대한 혼성화에 이어 약 60℃에서 0.1xSSC/0.2% SDS 중 1회 이상 세척 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 엄격한 혼성화 조건(예를 들어, Ausubel, F. M. 등, eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley and Sons, Inc., NY, 6.3.1~6.3.6 및 2.10.3페이지 참고)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
당분야에 알려진 임의의 방법에 의해 폴리뉴클레오티드가 얻어지고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 알려진 경우, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있고(예를 들어, Kutmeier 등, BioTechniques 17:242 (1994)에 기재된 바와 같이) 여기에는 간략하게 항체를 암호화하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 결찰, 이어서 PCR에 의한 결찰된 올리고뉴클레오티드의 증폭이 관여한다. 한 구현예에서, 사용되는 코돈은 인간 또는 마우스에 전형적인 코돈을 포함한다(예를 들어, Nakamura, Y., Nucleic Acids Res. 28: 292 (2000) 참고).
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 또한 적합한 공급원으로부터의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론이 이용 불가능하지만 항체 분자의 서열이 알려진 경우 면역글로불린을 암호화하는 핵산은 화학적으로 합성되거나 적합한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리A+RNA)로부터 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화할 수 있는 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 또는 예를 들어, 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 확인하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용하는 클로닝에 의해 얻어질 수 있다. PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 당분야에 잘 알려진 임의의 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
본 출원은 또한 본 출원의 항-HER2/Trop-2 항체를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 원핵생물(박테리아) 및 진핵생물 발현 시스템(예컨대 효모, 배큘로바이러스, 식물, 포유동물 및 기타 동물 세포, 트랜스제닉 동물 및 하이브리도마 세포)뿐만 아니라 파지 디스플레이 발현 시스템을 포함하는 당분야에 알려진 매우 다양한 숙주 발현 시스템이 본 출원의 항체를 발현하기 위해 사용될 수 있다.　
본원의 이중특이적 항체는 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현하기 위해, 숙주 세포는 경쇄 및/또는 중쇄가 숙주 세포에서 발현되도록 항체의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질전환, 형질도입, 감염 등이 된다. 중쇄 및 경쇄는 하나의 벡터에서 작동 가능하게 결합된 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있거나, 대안적으로 중쇄 및 경쇄는 하나는 중쇄를 표현하고 다른 하나는 경쇄를 발현하는 2개의 벡터에서 이들이 작동 가능하게 결합된 상이한 프로모터로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 임의로, 중쇄 및 경쇄는 상이한 숙주 세포에서 발현될 수 있다.　
추가로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 경쇄 및/또는 중쇄의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 항체 경쇄 및/또는 중쇄 유전자는 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 프레임 내에서 작동 가능하게 결합되도록 벡터에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드일 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항체는 숙주 세포가 배양되는 배지로 분비되며, 이로부터 항체가 회수 또는 정제될 수 있다.　
HCVR을 암호화하는 단리된 DNA는 HCVR-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 결합시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당분야에 알려져 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 예를 들어 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 Kabat(상기 문헌)에 기재된 바와 같이 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgM 또는 IgD), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 또는 하위클래스의 불변 영역 및 이의 임의의 동종이형 변이체일 수 있다.
LCVR 영역을 암호화하는 단리된 DNA는 LCVR-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역을 암호화하는 또 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 결합시킴으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간뿐만 아니라 다른 포유동물의 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당분야에 알려져 있다. 이러한 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.　
항체 중쇄 및/또는 경쇄 유전자(들)에 더하여, 본 출원의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자(들)의 발현을 제어하는 조절 서열을 운반한다. 용어 "조절 서열"은 필요에 따라 항체 사슬 유전자(들)의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준과 같은 요인에 의존할 수 있다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위해 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 고수준의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 요소, 예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및/또는 폴리오마 바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다.　
추가로, 본 출원의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 하나 이상의 선별 마커 유전자를 운반할 수 있다. 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다. 예를 들어, 전형적으로 선별 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서 약물, 예컨대 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별 마커 유전자는 선택/증폭을 위한 GS-음성 세포주(예컨대 NSO)에서 디하이드로폴레이트 환원효소(dhfr) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr-마이너스 숙주 세포에서 사용하기 위한), neo 유전자(G418 선택용) 및 글루타민 합성효소(GS)를 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기술, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염, 형질도입, 감염 등에 의해 숙주 세포에 도입된다. 이론적으로 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본 출원의 항체를 발현하는 것이 가능하지만, 진핵생물 세포가 바람직하고, 포유동물 숙주 세포가 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문에 이러한 세포가 가장 바람직하다. 본 출원의 재조합 항체를 발현하기 위해 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)[예를 들어, 문헌(Kaufman 및 Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982)에 기재된 바와 같이, DHFR 선별 마커와 함께 사용되는, 문헌(Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980)에 기재된 바와 같은 dhfr 마이너스 CHO 세포 포함], NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2/0 세포를 포함한다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서 항체의 발현, 보다 바람직하게는 숙주 세포가 당분야에 알려진 적절한 조건 하에 성장되는 배양 배지 내로의 항체 분비를 허용하기 충분한 시기 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다. 항체는 표준 정제 방법을 사용하여 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.　
본 출원은 본 출원의 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 바람직하게는 본 출원의 숙주 세포는 본 출원의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터 또는 작제물을 포함한다. 예를 들어, 본 출원의 숙주 세포는 본 출원의 벡터가 도입된 세포이고, 상기 벡터는 본 출원의 항체의 LCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 출원의 HCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 출원은 또한 본 출원의 두 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공하며; 하나는 본 출원의 항체의 LCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 다른 하나는 본 출원의 항체에 존재하는 HCVR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 각각 인핸서/프로모터 조절 요소(예를 들어, SV40, CMV, 아데노바이러스 등으로부터 유래된, 예컨대 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소 또는 SV40 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소)에 작동 가능하게 결합되어 유전자의 고수준 전사를 유도한다.　
일단 발현되면, 본 출원의 온전한 항체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는 황산암모늄 침전, 이온 교환, 친화도(예를 들어, 단백질 A), 역상, 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피, 하이드로시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다. 치료용 항체의 정제를 위한 표준 절차는, 예를 들어 문헌(Feng L1, Joe X. Zhou, Xiaoming Yang, Tim Tressel, 및 Brian Lee, "Current Therapeutic Antibody Production and Process Optimization"라는 제목의 기사 (BioProcessing Journal, September/October 2005)(치료용 항체의 정제 교시를 목적으로 그 전체가 참조로 포함됨))에 기재되어 있다. 추가로, 재조합적으로 발현된 항체 조제물로부터 바이러스를 제거하기 위한 표준 기술도 당분야에 알려져 있다(예를 들어, Gerd Kern 및 Mani Krishnan, "Viral Removal by Filtration: Points to Consider" (Biopharm International, October 2006) 참고). 치료용 항체 조제물로부터 바이러스를 제거하기 위한 여과의 효과는 적어도 부분적으로 여과될 용액 중 단백질 및/또는 항체의 농도에 의존하는 것으로 알려져 있다. 본 출원의 항체에 대한 정제 공정은 하나 이상의 크로마토그래피 작업의 주류로부터 바이러스를 제거하기 위한 여과 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 바이러스를 제거하기 위한 약학 등급 나노필터를 통한 여과 전에, 본 출원의 항체를 함유하는 크로마토그래피 주류가 희석 또는 농축되어 약 1 g/L 내지 약 3 g/L의 총 단백질 및/또는 총 항체 농도를 제공한다. 훨씬 더 바람직하게는, 나노필터는 DV20 나노필터(예를 들어, Pall Corporation; East Hills, N.Y.)이다. 약학적 용도를 위해 적어도 약 90%, 약 92%, 약 94% 또는 약 96% 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고 약 98 내지 약 99% 이상의 균질성이 가장 바람직하다. 원하는 대로 부분적으로 또는 균질하게 정제되면, 이어서 멸균 항체가 본원에 지시된 바와 같이 치료적으로 사용될 수 있다.　
전술한 논의를 고려하여, 본 출원은 추가로 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이 발현되도록 본 출원의 항체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 포유동물, 식물, 박테리아, 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 숙주 세포를 배양하는 단계 및 임의로 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는 항체에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 출원은 하이브리도마 세포주뿐만 아니라 이들 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 모노클로날 항체를 제공한다. 개시된 세포주는 모노클로날 항체의 생산 이외의 용도를 갖는다. 예를 들어, 세포주는 추가 하이브리도마를 생성하기 위해 다른 세포(예컨대 적합하게 약물 표지된 인간 골수종, 마우스 골수종, 인간-마우스 이종골수종 또는 인간 림프모구 세포)와 융합될 수 있으며, 따라서 모노클로날 항체를 암호화하는 유전자의 전달을 제공한다. 또한, 세포주는 단리 및 발현될 수 있는, 항-HER2 면역글로불린 사슬을 암호화하는 핵산의 공급원으로 사용될 수 있다(예를 들어, 임의의 적합한 기술(예를 들어, Cabilly 등, U.S. 특허 번호 4,816,567; Winter, U.S. 특허 번호 5,225,539) 참고)을 사용하여 다른 세포로 전달 시). 예를 들어, 재배열된 항-HER2 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 클론이 단리될 수 있거나(예를 들어, PCR에 의해) cDNA 라이브러리가 세포주로부터 단리된 mRNA로부터 제조될 수 있고, 항-HER2 면역글로불린 사슬을 암호화하는 cDNA 클론이 단리될 수 있다. 따라서, 항체 또는 이의 부분의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산은 다양한 숙주 T 세포 또는 시험관내 번역 시스템에서 특정 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 변이체(예를 들어, 인간화 면역글로불린)의 생산을 위해 재조합 DNA 기술에 따라 얻어지고 사용될 수 있다. 예를 들어, 변이체, 예컨대 인간화 면역글로불린 또는 면역글로불린 사슬을 암호화하는 cDNA 또는 이의 유도체를 포함한 핵산이 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 벡터(예를 들어, 발현 벡터)에 배치되고 적절한 방법(예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염)에 의해 적합한 숙주 T-세포에 도입될 수 있어서, 핵산이 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동 가능하게 결합되도록 한다(예를 들어, 벡터 내에서 또는 숙주 T 세포 게놈 내로 통합됨). 생산을 위해, 숙주 T-세포는 발현에 적합한 조건 하에(예를 들어, 유도제, 적절한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충제 등으로 보충된 적합한 배지의 존재 하에) 유지될 수 있으며, 이로써 암호화된 폴리펩티드가 생산된다. 원하는 경우, 암호화된 단백질은 회수 및/또는 단리될 수 있다(예를 들어, 숙주 T-세포 또는 배지로부터). 생산 방법은 트랜스제닉 동물의 숙주 T-세포에서의 발현을 포괄함이 이해될 것이다(예를 들어, WO 92/03918, GenPharm International, 1992. 3. 19. 공개)(그 전체가 참조로 포함됨) 참고).
숙주 세포는 또한 통상적인 기술에 의해 온전한 항체의 일부 또는 단편, 예를 들어 Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포를 본 출원의 항체의 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 인간 HER2 및 Trop-2에 결합하는 데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자도 본 출원의 항체에 의해 포괄된다.　
대장균과 같은 박테리아로부터 단일 사슬 항체의 발현 및/또는 단일 사슬 항체를 포함하는 적절한 활성 형태로의 재폴딩 방법이 기재되었고 잘 알려져 있으며 본원에 개시된 항체에 적용 가능하다(예를 들어, 모두 본원에 참조로 포함된, Buchner 등, Anal. Biochem. 205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse 등, Science 246:1275, 1989 및 Ward 등, Nature 341:544, 1989 참고).　
종종 대장균 또는 다른 박테리아로부터의 기능적 이종 단백질은 봉입체로부터 단리되며 강력한 변성제를 사용한 가용화 및 후속 재폴딩을 필요로 한다. 가용화 단계 동안, 당분야에 잘 알려진 바와 같이, 디설피드 결합을 분리하기 위해 환원제가 존재해야 한다. 환원제를 포함하는 예시적인 완충액은 0.1 M 트리스 pH 8, 6 M 구아니딘, 2 mM EDTA, 0.3 M DTE(디티오에리트리톨)이다. 디설피드 결합의 재산화는 본원에 참조로 포함된 문헌(Saxena 등, Biochemistry 9: 5015-5021, 1970)에 기재된 바와 같이, 특히 상기 문헌(Buchner 등)에 의해 기재된 바와 같이 환원된 및 산화된 형태로 저분자량 티올 시약의 존재 하에 발생할 수 있다.
재생은 전형적으로 변성된 및 환원된 단백질의 재폴딩 완충액으로의 희석(예를 들어, 100배)에 의해 달성된다. 예시적인 완충액은 0.1 M 트리스, pH 8.0, 0.5 M L-아르기닌, 8 mM 산화된 글루타치온(GSSG) 및 2 mM EDTA이다.　
2-사슬 항체 정제 프로토콜에 대한 변형으로, 중쇄 및 경쇄 영역이 별도로 가용화되고 환원된 다음 재폴딩 용액 중 조합된다. 이들 두 단백질을 한 단백질이 다른 단백질 대비 5배 몰 과량을 초과하지 않도록 하는 몰 비로 혼합할 때 예시적인 수율이 얻어진다. 과량의 산화된 글루타치온 또는 기타 산화성 저분자량 화합물이 산화 환원-셔플링이 완료된 후 재폴딩 용액에 첨가될 수 있다.　
재조합 방법에 더하여, 본원에 개시된 항체, 표지된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 표준 펩티드 합성을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 작제될 수 있다. 약 50개 아미노산 미만 길이의 폴리펩티드의 고상 합성은 서열의 C-말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착한 후 서열에 남아있는 아미노산을 순차적으로 부가함으로써 달성될 수 있다. 고상 합성을 위한 기술은 문헌(Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield 등, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, 및 Stewart 등, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984)에 기재되어 있다. 더 긴 길이의 단백질은 더 짧은 단편의 아미노 및 카복실 말단의 축합에 의해 합성될 수 있다. 카복실 말단 단부의 활성화에 의해(예컨대 커플링 시약 N,N'-디실로헥실카보디이미드의 사용에 의해) 펩티드 결합을 형성하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다.　
하기 실시예는 본 출원을 보다 자세히 설명하기 위해 제공되지만 이의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 않다. 아래 제공된 특정 실시예에 상세히 기재된 바와 같이, 허셉틴 항체 또는 허셉틴 scFv를 항-Trop-2 항체 또는 항-Trop-2 scFv와 조합함으로써 매우 강력한 이중특이적 항체를 생성하였다. 다수의 상이한 이중특이적 항체 구성을 생성하고 시험하였다. 제공한 고유한 이중특이적 항체는 임의의 시험한 단일특이적 항-HER2 및 단일특이적 항-Trop-2 항체보다 더 우수한 생물학적 활성을 나타낸다. 많은 검정에서 이중특이적 항체는 또한 단일특이적 항-HER2 항체 대비 상승적 활성을 실증한다. 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체는 DM1 유도체 세포독성제와 접합될 때 더 우수한 시험관내 및 생체내 항종양 활성을 실증하였다. 이들 데이터는 이중특이적 항체가 현재 트라스투주맙, 퍼투주맙 또는 T-DM1로의 치료에 부적격인 환자를 포함하여, HER2 및/또는 Trop-2 수준을 발현하는 암의 치료를 위해, 특히 ADC 또는 ADCC 강화 항체로서, 치료적 용도를 가질 수 있음을 제시한다. 또한, 이중특이적 항체는 기존 항-HER2 및/또는 항-Trop-2 치료법에 실패한 암 환자의 치료를 위한 치료적 용도를 가질 수 있다.
추가의 예시적 구현예
1. 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 작제물.
2. 구현예 1에 있어서, 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인이 제1 중쇄 가변 영역(VH-1) 및 제1 경쇄 가변 영역(VL-1)을 포함하고/하거나, 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인이 제2 중쇄 가변 영역(VH-2) 및 제2 경쇄 가변 영역(VL-2)을 포함하는, 작제물.
3. 구현예 2에 있어서, 다음과 같은, 작제물:
a) VH-2가 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하고,
VL-2가 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하거나;
b) VH-2가 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하고,
VL-2가 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함함.
4. 구현예 2 또는 구현예 3에 있어서, 다음과 같은, 작제물:
VH-1이 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하고,
VL-1이 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함함.
5. 구현예 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 작제물:
a) 각각 서열 번호 7에 제시된 서열을 갖는 VH-1 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열 번호 8에 제시된 서열을 갖는 VL-1 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3; 및/또는
b1) 각각 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 VH-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열 번호 5에 제시된 서열을 갖는 VL-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3; 또는
b2) 각각 서열 번호 10에 제시된 서열을 갖는 VH-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열 번호 11에 제시된 서열을 갖는 VL-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3.
6. 구현예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원 결합 도메인 및/또는 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, scFv-scFv, 미니바디, 디아바디 또는 sdAb로 구성된 군으로부터 선택된, 작제물.
7. 구현예 6에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 Fc 단편을 포함하는 전장 항체를 포함하는, 작제물.
8. 구현예 7에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 VH-2 및 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하는, 작제물.
9. 구현예 8에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
10. 구현예 8에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체의 경쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
11. 구현예 9 또는 10에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 N-말단에 융합된, 작제물.
12. 구현예 9-11 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 C-말단에 융합된, 작제물.
13. 구현예 9-12 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 제1 링커를 통해 전장 항체에 융합된, 작제물.
14. 구현예 6에 있어서, 제1 항원-결합 도메인이 VH-1 및 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하는, 작제물.
15. 구현예 14에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 Fc 단편을 포함하는 전장 항체를 포함하는, 작제물.
16. 구현예 15에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
17. 구현예 15에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 경쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
18. 구현예 16 또는 17에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 N-말단에 융합된, 작제물.
19. 구현예 16-18 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 C-말단에 융합된, 작제물.
20. 구현예 16-19 중 어느 하나에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 제1 링커를 통해 전장 항체에 융합된, 작제물.
21. 구현예 13 또는 구현예 20에 있어서, 제1 링커가 서열 번호 24, 25, 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 GS 링커인, 작제물.
22. 구현예 8 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제1 항원-결합 도메인의 scFv의 VH-1 및 VL-1, 또는 제2 항원 결합 도메인의 scFv의 VH-2 및 VL-2가 제2 링커를 통해 서로 결합된, 작제물.
23. 구현예 22에 있어서, 제2 링커가 서열 번호 24, 25, 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 GS 링커인, 작제물.
24. 구현예 2 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 작제물:
a) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
b) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
c) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
d) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원-결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
e) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원-결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합됨.
25. 구현예 2 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 작제물:
a) VH-1이 서열 번호 7의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-1이 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고,
b) VH-2가 서열 번호 4의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-2가 서열 번호 5의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함함.
26. 구현예 2 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 작제물:
a) VH-1이 서열 번호 7의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-1이 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고,
b) VH-2가 서열 번호 10의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-2가 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함함.
27. 구현예 2 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 다음과 같은, 작제물:
a) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
b) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
c) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
d) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
e) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합됨.
28. 구현예 7-13 및 15-27 중 어느 하나에 있어서, Fc 단편이 임의로 IgG 불변 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인 및 임의로 카파 불변 영역 또는 람다 불변 영역을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함하는, 작제물.
29. 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는 작제물:
a) 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
b) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
c) 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
d) 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
e) 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
f) 서열 번호 60에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
g) 서열 번호 62에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
h) 서열 번호 59에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄; 또는
i) 서열 번호 61에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80%(예컨대 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나)의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄.
30. 구현예 1-29 중 어느 하나에 있어서, HER2- 및/또는 Trop-2-발현 세포에 특이적으로 결합하고 표적(들)에 결합 시 내재화를 유도하는 작제물.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편이거나 이를 포함하고, 임의로 이중특이적 항체는 인간화 항체인, 작제물.
32. 구현예 31에 있어서, 화학식 Ab-(L-D)n을 갖는 항체-약물 접합체(ADC)를 포함하고, Ab는 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편이고, L은 링커 또는 직접적 결합이고, D는 치료제이고, n은 1 내지 10으로부터의 정수인, 작제물.
33. 구현예 32에 있어서, 치료제가 세포독성제인, 작제물.
34. 구현예 33에 있어서, 세포독성제가 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE) 또는 B1-P203인, 작제물.
35. 구현예 33에 있어서, 세포독성제가 메이탄시노이드(DM1) 또는 그 유도체인, 작제물.
36. 인간 Trop2 및 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 작제물로서, 구현예 2-35 중 어느 하나의 작제물과 경쟁적으로 인간 HER2 및/또는 Trop2에 결합하는 작제물.
37. 구현예 1-36 중 어느 하나의 작제물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
38. 구현예 1-31 및 36 중 어느 하나의 작제물을 암호화하는 단리된 핵산.
39. 구현예 38의 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
40. 구현예 38의 단리된 핵산 또는 구현예 39의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
41. 다음을 포함하는, 작제물을 제조하는 방법:
a) 작제물 또는 이의 일부를 발현하기 효과적인 조건 하에 구현예 40의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 숙주 세포로부터 발현된 작제물 또는 이의 일부를 얻는 단계.
42. 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에 구현예 1-36 중 어느 하나의 작제물 또는 구현예 37의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
43. 구현예 42에 있어서, 질환 또는 병태가 암인, 방법.
44. 구현예 43에 있어서, 암이 Trop2 양성 및/또는 HER2 양성인, 방법.
45. 구현예 44에 있어서, 암이 Trop2 중발현 또는 고발현 및/또는 HER2 중발현 또는 고발현인, 방법.
46. 구현예 43에 있어서, 암이 Trop2 저발현 및/또는 HER2 저발현인, 방법.
47. 구현예 43-46 중 어느 하나에 있어서, 암이 전립샘암, 유방암, 결장암, 췌장암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
48. 구현예 41-47 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료법을 추가로 포함하고, 임의로 제2 치료법은 면역치료법, 화학치료법, 소분자 키나제 억제제 표적화 치료법, 수술, 방사선 치료법, 백신접종 프로토콜 및 줄기 세포 이식으로부터 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
실시예 1
이중특이적 항체 작제
본 출원에 기재된 항-HER2/Trop-2 이중특이적 항체 형식의 도식적 표현을 도 1-5에 제시한다. 이러한 작제물은 HER2 및 Trop-2 항원을 동시에 표적화하도록 설계하였다. 모든 항체 형식의 scFv 부분은 예를 들어 링커(예를 들어 합성 가요성 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 25에 제시된 링커 서열)를 사용하여 VH 도메인을 결합시킴으로써 작제하였다. scFv는 예를 들어 가요성 링커, 예를 들어 GS 링커, 예를 들어 서열 번호 25에 제시된 링커 서열을 통해 중쇄의 N-말단에 및 CH3 도메인의 C-말단에 공유 결합시켰다.
이중특이적 항체 HT2(도 1)를 생성하기 위해, 항-HER2 항체 허셉틴 scFv(서열 번호 3), 항-Trop-2 항체 A1,2X4 VH(서열 번호 4)를 함유하는 중쇄(HC)를 합성하고, IgG1 불변(CH) 영역을 합성하였다. scFv 및 VH는 GS 링커를 통해 결합시켰다. 생성된 scFv-VH-CH 융합체를 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-Trop-2 항체 A1,2X4 VL(서열 번호 5) 및 CL 영역을 함유하는 경쇄(LC)를 또한 합성하여 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음 HC 및 LC를 발현 벡터에 공동 형질감염시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 scFv로서 허셉틴 및 Fab로서 항-Trop2 항체 A1,2X4로 이루어지며, 허셉틴 scFv는 항-Trop-2 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합될 때 VK-링커-VH로 배향된다.
이중특이적 항체 TH2(도 2)를 생성하기 위해, 항-Trop-2 항체 A1,2X4 scFv(서열 번호 6) 및 항-HER2 항체 허셉틴 VH(서열 번호 7)을 함유하는 HC를 합성하고 IgG1 CH 영역을 합성하였다. scFv 및 VH를 GS 링커를 통해 결합시켰다. 생성된 scFv-VH-CH 융합체를 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-HER2 항체 허셉틴 VL(서열 번호 8) 및 CL(서열 번호 13) 영역을 함유하는 LC를 또한 합성하여 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음 HC 및 LC를 발현 벡터에 공동 형질감염시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 scFv로서 항-Trop-2 항체 A1,2X4 및 Fab로서 허셉틴으로 이루어지며, 항-Trop-2 scFv는 허셉틴 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합될 때 VK-링커-VH로 배향된다.
이중특이적 항체 HB1(도 3)을 생성하기 위해, 항-HER2 항체 허셉틴 VH(서열 번호 7) 및 IgG1 CH 영역을 함유하는 HC를 합성하고 항-Trop-2 항체 hRS7 scFv(서열 번호 9)를 합성하였다. VH 및 scFv를 GS 링커를 통해 연결시켰다. 생성된 VH-CH-scFv 융합체를 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-HER2 항체 허셉틴 VL(서열 번호 8) 및 CL 영역을 함유하는 LC를 또한 합성하여 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음 HC 및 LC를 발현 벡터에 공동 형질감염시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 Fab로서 허셉틴 및 scFv로서 항-Trop-2 항체 hRS7로 이루어지며, 항-Trop-2 scFv는 허셉틴의 두 중쇄의 C-말단에 융합될 때 VK-링커-CH로 배향된다.
이중특이적 항체 BH1(도 4)을 생성하기 위해, 항-HER2 항체 허셉틴 scFv(서열 번호 9)를 함유하는 HC를 합성하고 IgG1 불변 영역을 합성하였다. scFv 및 VH를 GS 링커를 통해 연결시켰다. 생성된 scFv-VH-CH 융합체를 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-Trop-2 항체 hRS7 VL(서열 번호 11) 및 CL 영역을 함유하는 LC를 또한 합성하여 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음 HC 및 LC를 발현 벡터에 공동 형질감염시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 scFv로서 허셉틴 및 Fab로서 항-Trop-2 항체 hRS7로 이루어지며, 항-허셉틴 scFv는 hRS7 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합될 때 VK-링커-VH로 배향된다.
이중특이적 항체 BH2(도 5)를 생성하기 위해, 항-HER2 항체 허셉틴 scFv(서열 번호 3) 및 항-Trop-2 항체 hRS7 VH(서열 번호 10)를 함유하는 중쇄(HC)를 합성하고 IgG1 CH 영역을 합성하였다. scFv 및 VH를 GS 링커를 통해 결합시켰다. 생성된 scFv-VH-CH 융합체를 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-Trop-2 항체 hRS7 VL(서열 번호 11) 및 CL 영역을 함유하는 LC를 또한 합성하여 pUC57 발현 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음 HC 및 LC를 발현 벡터에 공동 형질감염시켰다. 생성된 이중특이적 항체는 scFv로서 허셉틴 및 Fab로서 항-Trop2 항체 hRS7로 이루어지며, 허셉틴 scFv는 hRS7 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합될 때 VK-링커-VH로 배향된다.
모든 항체 작제물을 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현하였으며, 이는 HT2(HT002)의 경우 1.08 mg/mL, TH2(TH002)의 경우 0.55 mg/mL, HB1(HT001a)의 경우 0.695 mg/mL의 발현 수준을 초래하였다. 그 중에서도 HT2(HT002)의 발현 수준이 특히 유리하다.
모든 이중특이적 항체를 표준 단백질 A 정제에 의해 균질성(>90%)으로 정제하고 환원성 및 비환원성 SDS-PAGE에 의해 분석했다.
실시예 2
이중특이적 항체의 결합 친화도
정제된 항-HER2/Trop-2 이중특이적 항체의 결합 친화도를 FACS 분석에 의해 결정하였다. HER2를 갖지만 Trop-2 발현은 갖지 않는 전립샘암 세포 LNCap, Trop-2를 갖지만 HER2 발현을 갖지 않는 유방암 세포 MDA-MB-468, 그리고 HER2 및 Trop-2를 둘 모두 발현하는 결장암 세포 Colo205를 수확하고 0.5 - 1 x 106개 세포/ml로 FACS 완충액에 현탁했다. 그런 다음 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40 □g/ml로 항-HER2 항체 허셉틴, 항-Trop-2 항체 A1,2X4, 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 HT2(HT002) 및 TH2(TH001)를 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 세포를 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거했다. 그런 다음 세포를 해리하고 얼음 상에서 암소에서 30분 동안 20 □g/ml의 형광-접합 2차 항체로 염색한다. 인큐베이션 후 세포를 세척하고 염색 완충액에 재현탁한 후 backman 유세포 측정 시스템(BD Accuri C6)을 사용하여 분석한다. 형광 강도 중앙값(MFI)을 Beckman 유세포 측정 소프트웨어에 의해 분석했다. 평형 결합 상수 Kd는 GraphPad Prism 7의 "하나의 부위-특이적 결합" 분석 모델을 사용하여 얻었다. Kd는 평형에서의 최대 결합의 절반을 달성하는 데 필요한 방사성리간드 농도이다.
도 6b는 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 HB1에 대한 결과를 도시한다. Her2만 발현하는 LNCap 세포 및 세포 표면 상에서 Trop-2만 발현하는 MDA-MB-468 세포에서 HB1은 모 단일특이적 항체 허셉틴 또는 hRS7과 비교하여 더 적은 결합을 나타내었다. HER2 및 Trop-2를 둘 모두 발현하는 Colo205 세포에서 HB1은 모 항체와 비교하여 필적하는 결합 친화도를 가졌다.
도 6c는 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 BH1(TH001a) 및 BH2(TH001b)에 대한 결과를 도시한다. 세포 표면 상에 Her2만 발현하는 LNCap 세포에서, 이중특이적 항체 TH001b는 모 단일특이적 항체 허셉틴과 유사한 결합 친화도를 갖는 반면, 이중특이적 항체 TH001a는 허셉틴과 비교하여 중등도 결합 친화도를 가졌다. 세포 표면 상에 Trop-2만 발현하는 MDA-MB-468 세포에서, TH001a는 TH001b보다 모 단일특이적 항체 A1,2X4와 필적하는 더 우수한 결합을 나타내었다. 두 항원을 모두 발현하는 Colo205 세포에서, 이중특이적 항체는 모 단일특이적 항체와 필적하거나 더 우수한 결합을 실증하였다.
도 6a는 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 HT2(HT002) 및 TH2(TH002)에 대한 결과를 도시한다. 세포 표면 상에 Her2만 발현하는 LNCap 세포에서 HT002 및 TH002는 모 단일특이적 항체 허셉틴과 유사한 결합 친화도로 세포에 결합했다. 그러나, 두 이중특이적 항체는 모두 단일특이적 항체 A1,2X4와 비교하여 Trop-2만 발현하는 MDA-MB-468 세포에 대해 중등도 결합 친화도를 가졌다. 놀랍게도, 두 항원을 모두 발현하는 Colo205 세포에서 세포 표면 상에서 검출된 결합된 HT002 및 TH002 이중특이적 항체의 양은 단일특이적 항체 단독과 비교하여 극적으로 증가했다. 이러한 효과는 Trop2 양성이면서 HER2 양성인 암 세포를 갖는 환자를 치료하기 위해 특정 이점을 제공한다.
실시예 3
이중특이적 항체의 내재화
이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체의 내재화 및 분해를 유세포 측정에 의해 측정하였다. 이 연구에서 형광-접합 2차 항체를 사용하여 내재화 후 남아있는 1차 항체를 검출했다.
HER2 저발현/Trop-2 저발현 결장암 세포 Colo205, HER2 음성/Trop-2 고발현 유방암 세포 MDA-MB-468 및 HER2 고발현/Trop-2 중발현 난소암 세포 SK-BR-3을 1×105개 세포/웰로 접종하였다. 다음으로, 이중특이적 항체 또는 모 단일특이적 항체를 각각 400, 1000, 3000 또는 10000 ng/ml의 농도로 FACS 완충액 중 세포에 첨가하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 그런 다음 세포를 항체 내재화를 위해 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션했다. 2시간 후, 세포를 트립신으로 해리하고, 암소에서 얼음 상에서 30분 동안 형광-접합 염소 항-인간 IgG 2차 항체로 염색한 후 Beckman 유세포 측정 시스템을 사용하여 분석하였다. 각 시점에서 형광 강도 및 세포 결합 백분율을 Beckman 유세포 측정 소프트웨어에 의해 분석했다. 각 농도에서 세포로 내재화된 항체의 양은 하기 공식을 사용하여 결정하였다: (MFI4℃ - MFI37℃) x 103
도 7은 연구 결과를 도시한다. 결과는 본 출원의 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 HT2(HT002), BH1(TH001a) 및 BH2(TH001b)가 HER2 및/또는 Trop-2를 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있음을 표시한다. 내재화된 이중특이적 항체의 양은 Trop-2를 발현하지만 HER2 수준이 없는 Her2가 낮고 Trop을 발현하지 않는 MDA-MB-468 세포에서 그리고 Her2 저발현 및 Trop-2 저발현 Colo205 세포에서 모 항-Trop-2 항체 A1,2X4 또는 hRS7 및 항-HER2 항체 허셉틴의 양과 유사했다. 중간 수준 또는 고수준으로 HER2 및 Trop-2를 둘 모두 발현하는 SK-BR-3 세포에서 이중특이적 항체 HT2 및 BH2는 모 단일특이적 항체보다 강화된 내재화를 유도하는 반면, BH1은 단일특이적 항체와 비교하여 유사한 내재화를 가졌다. HT2와 BH2에 대한 내재화 양은 단일특이적 항체 허셉틴 및 A1,2X4의 합보다 컸다. 이러한 결과는 중간 수준 또는 고수준의 HER2 및/또는 Trop를 발현하는 암 세포를 갖는 환자를 치료하기 위해 HT2 또는 BH2를 사용하는 것의 특정 이점을 실증한다.
실시예 4
이중특이적 항체 약물 접합체(ADC)의 생성
본원에 기재된 작제물은 ADC를 형성하기 위해 BI-P203, DM1 또는 MMAE에 접합된 HT2(HT002) 및 HB1(HT001a)를 포함하는 항-HER2/Trop-2 이중특이적 항체를 포함하며 상이한 수준의 HER2 및 Trop-2를 발현하는 다중 암 세포주의 성장을 억제하는 이의 능력에 대해 평가하였다.
본 출원의 일부 구현예는 절단 불가능 링커를 통해 이중특이적 항체에 결합된 BI-P203 또는 DM1 또는 MMAE에 관한 것이다. 이 실시예에서 이중특이적 항-HER2/Trop-2 항체 HT2(HT002) 또는 HB1(HT001a)을 pH-조정 PBS EDTA 완충액에 용해시킨 TCEP(트리스(2-카복시에틸)포스핀)에 항체를 첨가하여 환원시켰다. 항체/TCEP 용액을 2-3시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 환원된 항체를 접합 반응 완충액으로 완충액을 교환하였다. 다양한 약물 대 항체 비(DAR)를 달성하기 위해 DMSO에 용해시킨 BI-P203, DM1 또는 MMAE 페이로드를 7 - 30:1의 페이로드/항체 비로 환원된 항-Trop-2 모노클로날 항체 용액에 첨가하였다. 환원된 항체가 말레이미드기를 통해 BI-P203 페이로드에 접합되는 동안 페이로드/항체 용액을 20℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 접합이 완료된 후, 반응 혼합물을 탈염 및 농축하여 항-HER2/Trop-2-BI-P203 ADC를 산출하였다. 생성된 ADC의 생화학적 특성을 크기 배제 크로마토그래피 고압 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 사용해서 특성규명하여 순도 및 응집 함량을 결정하고 소수성 상호작용 크로마토그래피 HPLC(HIC-HPLC)를 사용하여 약물 로딩(DAR)을 확인하였다. 접합 절차는 도 8에 예시한다. 최종 ADC 생성물은 4개 또는 6개 또는 7개의 BI-P203 및 DM1-링커 분자, 및 2개 또는 4개의 MMAE-링커 분자로 이루어진다. 접합 공정에서 사용되는 시스테인 접합 방법은 라이신 접합 방법과 비교하여 더 균일한 ADC를 생성한다.
실시예 5
이중특이적 ADC의 시험관내 활성
세포독성 페이로드를 함유하는 본 출원의 ADC는 표적 세포 사멸, 예컨대 암 세포 사멸을 위해 사용할 수 있다. HT2-BI-P203, HT2-MMAE 및 HB1-DM1 ADC를 시험관내 세포독성 검정에서 시험하였다. 네이키드 HT2 항체도 검정에 포함시켰다. HT2-BI-P203 시험관내 검정을 위해 BxPC-3 췌장암 세포, N87 위암 세포, MDA-MB-468 유방암 세포 및 A549 폐암 세포를 사용했다. BxPC-3 세포는 HER2 저발현 및 Trop-2 고발현을 가지며, NCI-N87 세포는 HER2 고발현 및 Trop-2 중발현을 갖고, MDA-MB-468 세포는 HER2는 발현하지 않지만 중간 수준의 Trop-2를 발현하고, A549 세포는 검출 불가능한 수준의 HER2 및 Trop-2를 가졌다. 모든 세포주를 5% CO2의 가습 인큐베이터 분위기로 37℃에서 적합한 배양 배지 중 배양되었다. 세포를 96-웰 편평 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 세포 접종 수는 500개 세포/100 ul/웰 내지 6,000개 세포/100 μl/웰의 범위였다. 세포를 5% CO2의 가습 분위기로 37℃에서 밤새 부착되도록 하였다. HT2-BI-P203 ADC 또는 HT2 항체를 스톡 용액으로부터 제조하고 세포 접종 24시간 후 적절한 작업 농도로 희석하였다. 7개 지점에 대한 일련의 10배 희석을 배양 배지로 수행했다. 최종 농도는 1000 nM 내지 0.001 nM 범위였다. 세포를 72시간 동안 ADC와 인큐베이션하였다. 세포 계수 키트-8 용액(Dojindo China Co., Ltd, lot#PL701)을 37℃에서 1-4시간 동안 웰에 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax M5, Molecular Devices) 및 SoftMax Pro5.4.1 소프트웨어를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정했다. 억제%를 하기 공식에 의해 계산했다: (처리된 샘플의 평균 흡광도/대조군 샘플의 평균 흡광도) × 100. 모든 세포 검정에 대해 GraphPad Prism 7 3-파라미터 곡선 피팅을 사용하여 용량-반응 곡선을 생성했다.
표 2는 BxPC-3, NCI-N87, MDA-MB-468 및 A549 세포에서의 HER2 및 Trop-2 발현 수준 및 시험한 각 항목에 대한 IC50을 요약한다. 사멸 곡선을 도 9a에 나타내었다. 결과는 항-HER2/Trop-2 이중특이적 항체 HT2-BI-P203이 상이한 수준의 HER2 및 Trop-2를 발현하는 모든 암 세포를 효과적으로 사멸시켰음을 실증한다. HER2- 및 Trop-2 음성 A549 세포에서 모든 HT2-BI-P203으로는 IC50을 계산할 수 없어서, 특이적 사멸 활성이 달성되지 않았음을 표시하였다. 네이키드 HT2 항체는 시험한 모든 세포주에서 특이적 사멸 활성을 갖지 않았다.
HT2-MMAE 시험관내 검정을 위해 MDA-MB-468 유방암 세포, LNCaP 전립샘암 세포, SK-BR-3 난소암 세포 및 A549 폐암 세포를 사용하였다. HT2(HT002)-MMAE를 모 단일특이적 항체 허셉틴- 및 A1,2X4-MMAE ADC와 일대일로 시험하였다. 시험관내 세포독성 검정은 위에서 기재된 절차에 따라 수행하였다.
표 3은 MDA-MB-468, SK-BR-3 및 A549 세포에서 HER2 및 Trop-2 발현 수준 및 시험한 각 항목에 대한 IC50을 요약한다. 사멸 곡선은 도 9b에 나타내었다. Trop-2만 발현하는 MDA-MB-468 세포에서 허셉틴-MMAE는 특이적 사멸을 나타내지 않은 반면, HT002-MMAE는 A1,2X4-MMAE와 비교하여 약한 세포독성을 가졌다. 세 가지 ADC 모두 HER2 및 Trop-2를 모두 발현하는 SK-BR-3 세포에 대해 강력했다.
결과는 항-HER2/Trop-2 이중특이적 항체 HT2-BI-P203이 상이한 수준의 HER2 및 Trop-2를 발현하는 모든 암 세포를 효과적으로 사멸시켰음을 실증한다. HER2- 및 Trop-2 음성 A549 세포에서 모든 HT2-BI-P203으로는 IC50을 계산할 수 없어서, 특이적 사멸 활성이 달성되지 않았음을 표시하였다. 네이키드 HT2 항체는 시험한 모든 세포주에서 특이적 사멸 활성을 갖지 않았다. HER2- 및 Trop-2 음성 A549 세포에서 IC50은 200 nM 초과였거나 세 가지 ADC 모두에서 계산할 수 없어서 특이적 사멸 활성이 달성되지 않았음을 표시하였다.
HB1-DM1 시험관내 검정을 위해 BxPC-3 췌장암 세포, MDA-MB-468 유방암 세포, LNCaP 전립샘암 세포 및 SK-BR-3 난소암 세포를 사용했다. MDA-MB-468 세포는 Trop-2만 발현하고, LnCaP 세포는 HER2만 발현하며, SK-BR-3 세포는 HER2 및 Trop-2 발현을 모두 갖는다. 시험관내 세포독성 검정은 위에서 기재된 절차에 따라 수행하였다.
표 4는 각 세포주에서 HB1-DM1에 대한 IC50을 요약한다. 사멸 곡선은 도 9c에 나타내었다. HB1-DM1 ADC는 SK-BR-3 세포에 대해 가장 강력하여 1 nM 미만의 IC50 값을 생성하였다.
실시예 6
이중특이적 ADC의 생체내 활성
마우스 대상체에서 Trop-2-양성/Her2-음성 MDA-MB-468 및 Trop-2-양성/Her2-양성 NCI-N87 이종이식편 모델을 사용하여 항-HER2/Trop-2 이중특이적 항체 HT002-BI-P203 ADC의 항종양 활성을 평가하였다. 500만 개의 BxPC3 또는 NCI-N87 세포를 배양 플라스크로부터 수확하여 6-7주령 BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식했다. 종양은 실험 과정에 걸쳐 1주 2회 측정하였으며, 종양 부피는 하기 공식을 사용하여 계산하였다: 종양 부피(mm3) = (길이 x 너비2)/2.
BxPC3 모델에서 시험한 ADC는 상이한 DAR로 접합하였다: A1,2X4-BI-P203의 DAR은 7.2였고, T-DM1의 DAR은 3.2였고, HT002-BI-P203의 DAR은 5.2였다. ADC는 단일 볼루스 용량으로 정맥내 투여하였다.
도 10a는 생체내 BxPC-3 이종이식편 연구의 결과를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 3 mg/kg에서 본 출원의 이중특이적 ADC의 단일 투여는 오래가는 안정한 질환을 유도한 반면, 3 mg/kg 용량의 단일특이적 항체 Trop-2 ADC 또는 T-DM1은 종양 성장 억제를 초래하였다. 도 10b에 나타낸 바와 같이 비히클 대조군 및 IgG 이소형 ADC 대조군과 비교하여 모든 ADC 처리에서는 유의한 체중 변화가 없었다.
이중특이적 ADC의 항종양 활성을 추가로 평가하기 위해, HT002-BI-P203을 N87 이종이식편 모델에서 1.5 및 5 mg/kg의 두 가지 용량 수준에서 시험했다. ADC는 단일 볼루스 용량으로 정맥내 투여하였다.
도 11a는 생체내 N87 이종이식편 연구의 결과를 도시한다. 결과는 이중특이적 ADC가 5 mg/kg 용량의 단일 투여로 오래가는 안정한 질환을 달성할 수 있었음을 표시한다. 도 11b에 나타낸 바와 같이, 비히클 대조군 및 IgG 이소형 ADC 대조군과 비교하여 모든 ADC 처리에서는 유의한 체중 변화가 없었다.
본원에 개시되고 청구된 모든 물품 및 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 출원의 물품 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 기재되었지만, 본 출원의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 변화가 물품 및 방법에 적용될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 현재 존재하든 나중에 개발되든 관계없이, 당업자에게 자명한 이러한 모든 변화 및 동등물이 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 출원의 정신 및 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 본 출원이 속하는 분야의 당업자 수준을 표시한다. 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 모든 목적을 위해 그리고 각각의 개별 간행물이 임의의 및 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 이의 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본원에 예시적으로 기재된 본 출원은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소(들) 없이 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 본 출원이 바람직한 구현예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념의 변형 및 변화는 당업자에 의해 이루어질 수 있으며, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 출원의 범위 내로 고려됨이 이해되어야 한다.
실시예 7
HT002-MMAE(DAR 3.5)를 BxPC-3 이종이식편 모델에서 T-DM1에 대해 시험하였다. 접합되지 않은 이중특이적 항체 HT002도 포함시켰다. 시험 물품을 제0일 및 제7일에 정맥내로 투여하였다.
도 12는 생체내 BxPC-3 이종이식편 연구의 결과를 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 5 mg/kg으로 본 출원의 이중특이적 ADC HT002의 투여는 연구 종료(제43일)까지 오래가는 종양 퇴행을 초래한 반면, 5 mg/kg 용량의 T-DM1은 종양 성장 억제를 유도하였다. 접합되지 않은 이중특이적 항체 HT002의 투여로 종양 성장 억제가 또한 관찰되었다.
실시예 8
이중특이적 항체 ADC인 HT002-MMAE를 모 항체 ADC인 A1,2X4-MMAE 및 허셉틴-MMAE와 함께 JIMT-1 유방암 세포에서 시험관내 세포독성 검정에서 시험하였다. 접합되지 않은 HT002 항체 및 허셉틴도 검정에 포함시켰다. JIMT-1 세포는 허셉틴 내성 유방암 환자로부터 유래되었으며 중등도 수준 내지 고수준의 Trop-2 및 HER2를 발현한다. 사멸 곡선을 도 13에 나타내었다. 결과는 이중특이적 항체 ADC HT002-MMAE가 각각 0.3874 및 0.5043 nM의 IC50 값을 갖는 2개의 모 항체 ADC와 유사하게 0.4301 nM의 IC50 값을 가지며 JIMT-1 세포 성장을 효과적으로 억제하였음을 실증한다. 접합되지 않은 이중특이적 항체 HT002 단독은 0.1853 nM의 IC50 값으로 JIMT-1 세포 성장을 억제할 수 있었다. 예상된 바와 같이 허셉틴은 이 세포주에서 최소 항증식 활성을 가졌다.
서열 표
SEQUENCE LISTING <110> Bionecure Therapeutics, Inc. <120> ANTI-HER-2/TROP-2 BISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 22736-20004.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/140,638 <151> 2021-01-22 <160> 63 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu 1 5 10 15 Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln 35 40 45 Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val 50 55 60 Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp 65 70 75 80 Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr 85 90 95 Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu 100 105 110 Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn 115 120 125 Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu 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Ser Ser Ala Ser Thr Lys 385 390 395 400 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 405 410 415 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 420 425 430 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 435 440 445 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 450 455 460 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 465 470 475 480 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 485 490 495 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 500 505 510 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 515 520 525 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 530 535 540 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 545 550 555 560 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 565 570 575 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 580 585 590 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 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Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 690 695 700 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 705 710 715 720 Lys <210> 61 <211> 741 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 61 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Asn Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 130 135 140 Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu 145 150 155 160 Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val 165 170 175 Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val 180 185 190 Met Trp Ala Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser Arg 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu 210 215 220 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp 225 230 235 240 Glu Asn Trp Asp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 245 250 255 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 275 280 285 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 290 295 300 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile 305 310 315 320 Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 325 330 335 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala 340 345 350 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn 355 360 365 Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 370 375 380 Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 385 390 395 400 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 405 410 415 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 420 425 430 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 435 440 445 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 450 455 460 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 465 470 475 480 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 485 490 495 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 500 505 510 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 515 520 525 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 530 535 540 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 545 550 555 560 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 565 570 575 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 580 585 590 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 595 600 605 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 610 615 620 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 625 630 635 640 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 645 650 655 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 660 665 670 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 675 680 685 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 690 695 700 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 705 710 715 720 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 725 730 735 Leu Ser Pro Gly Lys 740 <210> 62 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 62 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val 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Claims (48)

  1. 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는, 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인이 제1 중쇄 가변 영역(VH-1) 및 제1 경쇄 가변 영역(VL-1)을 포함하고/하거나, 인간 Trop-2에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인이 제2 중쇄 가변 영역(VH-2) 및 제2 경쇄 가변 영역(VL-2)을 포함하는, 작제물.
  3. 제2항에 있어서,
    a) VH-2가 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하고,
    VL-2가 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 31에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하거나;
    b) VH-2가 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하고,
    VL-2가 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는, 작제물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    VH-1이 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하고,
    VL-1이 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는, 작제물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3는 각각 서열 번호 7에 제시된 서열을 갖는 VH-1 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열 번호 8에 제시된 서열을 갖는 VL-1 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하고/하거나;
    b1) LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3는 각각 서열 번호 4에 제시된 서열을 갖는 VH-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열 번호 5에 제시된 서열을 갖는 VL-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하거나;
    b2) LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3는 각각 서열 번호 10에 제시된 서열을 갖는 VH-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열 번호 11에 제시된 서열을 갖는 VL-2 내의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 포함하는, 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인 및/또는 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, scFv-scFv, 미니바디, 디아바디 또는 sdAb로 구성된 군으로부터 선택되는, 작제물.
  7. 제6항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 Fc 단편을 포함하는 전장 항체를 포함하는, 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 VH-2 및 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하는, 작제물.
  9. 제8항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
  10. 제8항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체의 경쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 N-말단에 융합된, 작제물.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 C-말단에 융합된, 작제물.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원-결합 도메인이 제1 링커를 통해 전장 항체에 융합된, 작제물.
  14. 제6항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인이 VH-1 및 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하는, 작제물.
  15. 제14항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 Fc 단편을 포함하는 전장 항체를 포함하는, 작제물.
  16. 제15항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
  17. 제15항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 경쇄 중 하나 또는 둘 모두에 융합된, 작제물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 N-말단에 융합된, 작제물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원 결합 도메인이 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄 중 하나 또는 둘 모두의 C-말단에 융합된, 작제물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 항원 결합 도메인이 제1 링커를 통해 전장 항체에 융합된, 작제물.
  21. 제13항 또는 제20항에 있어서, 제1 링커가 서열 번호 24, 25, 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 GS 링커인, 작제물.
  22. 제8항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항원-결합 도메인의 scFv의 VH-1 및 VL-1, 또는 제2 항원 결합 도메인의 scFv의 VH-2 및 VL-2가 제2 링커를 통해 서로 결합된, 작제물.
  23. 제22항에 있어서, 제2 링커가 서열 번호 24, 25, 및 44-54로 구성된 군으로부터 선택된 GS 링커인, 작제물.
  24. 제2항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
    b) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 27에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 29에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 30에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 31에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
    c) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
    d) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원-결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
    e) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 32에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 33에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 34에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 35에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 37에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 38에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 39에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 40에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 41에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 42에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2 및 서열 번호 43에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원-결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되는, 작제물.
  25. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) VH-1이 서열 번호 7의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-1이 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고,
    b) VH-2가 서열 번호 4의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-2가 서열 번호 5의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는, 작제물.
  26. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) VH-1이 서열 번호 7의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-1이 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고,
    b) VH-2가 서열 번호 10의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하고; VL-2가 서열 번호 11의 아미노산 서열, 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는, 작제물.
  27. 제2항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
    b) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되거나,
    c) 제1 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 scFv를 포함하고, 제2 항원결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
    d) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 C-말단에 융합되거나,
    e) 제1 항원 결합 도메인이 1) 서열 번호 7, 55 또는 56에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-1, 및 2) 서열 번호 8 또는 57에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-1을 포함하는 scFv를 포함하고; 제2 항원-결합 도메인이 1) 서열 번호 10 또는 58에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VH-2, 및 2) 서열 번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 VL-2를 포함하는 Fc 단편을 갖는 전장 항체를 포함하고, 제1 항원 결합 도메인은 전장 항체의 두 중쇄의 N-말단에 융합되는, 작제물.
  28. 제7항 내지 제13항 및 제15항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 단편이 임의로 IgG 불변 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인 및 임의로 카파 불변 영역 또는 람다 불변 영역을 포함하는 경쇄 불변 도메인을 포함하는, 작제물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호 14에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
    b) 서열 번호 16에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
    c) 서열 번호 18에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 19에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
    d) 서열 번호 20에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 21에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
    e) 서열 번호 22에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 23에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
    f) 서열 번호 60에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
    g) 서열 번호 62에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 15에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄;
    h) 서열 번호 59에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄; 또는
    i) 서열 번호 61에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 중쇄; 서열 번호 17에 제시된 아미노산 서열 또는 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변이체를 포함하는 2개의 경쇄
    를 포함하는, 작제물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, HER2- 및/또는 Trop-2-발현 세포에 특이적으로 결합하고 표적(들)에 결합 시 내재화를 유도하는, 작제물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편이거나 이를 포함하고, 임의로 이중특이적 항체는 인간화 항체인, 작제물.
  32. 제31항에 있어서, 화학식 Ab-(L-D)n을 갖는 항체-약물 접합체(ADC)를 포함하고, Ab는 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편이고, L은 링커 또는 직접적 결합이고, D는 치료제이고, n은 1 내지 10의 정수인, 작제물.
  33. 제32항에 있어서, 치료제가 세포독성제인, 작제물.
  34. 제33항에 있어서, 세포독성제가 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE)인, 작제물.
  35. 제33항에 있어서, 세포독성제가 메이탄시노이드(DM1) 또는 그 유도체인, 작제물.
  36. 인간 Trop2 및 인간 HER2에 특이적으로 결합하는 작제물로서, 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항의 작제물과 경쟁적으로 인간 HER2 및/또는 Trop2에 결합하는, 작제물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 작제물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물.
  38. 제1항 내지 제31항 및 제36항 중 어느 한 항의 작제물을 암호화하는, 단리된 핵산.
  39. 제38항의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
  40. 제38항의 단리된 핵산 또는 제39항의 벡터를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  41. 다음을 포함하는, 작제물을 제조하는 방법:
    a) 작제물 또는 이의 일부를 발현하기에 효과적인 조건 하에 제40항의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 숙주 세포로부터 발현된 작제물 또는 이의 일부를 수득하는 단계.
  42. 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 작제물 또는 제37항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 질환 또는 병태가 암인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 암이 Trop2 양성 및/또는 HER2 양성인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 암이 Trop2 중발현 또는 고발현 및/또는 HER2 중발현 또는 고발현인, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 암이 Trop2 저발현 및/또는 HER2 저발현인, 방법.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 전립샘암, 유방암, 결장암, 췌장암 및 위암으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료법을 추가로 포함하고, 임의로 제2 치료법은 면역치료법, 화학치료법, 소분자 키나제 억제제 표적화 치료법, 수술, 방사선 치료법, 백신접종 프로토콜 및 줄기 세포 이식으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
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