KR20230062684A - 소변 및 기타 샘플에서의 무세포 dna의 분석 - Google Patents
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Abstract
특정 장기의 질환(예를 들어, 암)은 무세포 DNA를 분석함에 의해 검출될 수 있다. 일부 구현예는 예를 들어 소변, 타액, 혈액 및 대변 샘플에서 발생할 수 있는 바와 같이, 특정 장기로부터 나오거나 특정 장기를 통과하는 장기-관련 샘플을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 무세포 DNA의 메틸화 수준이 샘플에서 측정될 수 있다. 조직-특이적 메틸화 패턴이 다른 조직 유형으로부터의 부분적 기여를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 장기-관련 무세포 DNA의 크기가 측정될 수 있다. 크기 프로파일의 통계적 척도는, 무세포 DNA 단편이 비-건강한 조직에 비교해 건강한 조직을 가진 대상체에 대해 예상되는 것보다 집합적으로 더 길다는 것을 나타낼 수 있다. 다른 구현예에서, 2개의 상이한 샘플을 분석하여 특정 장기가 암을 갖는지 여부를 결정할 수 있다. 혈액 샘플 및 장기-관련 샘플에서의 무세포 DNA는 둘 모두 복제 수 이상을 나타내는 염색체 영역을 확인하기 위해 분석될 수 있다.
Description
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본원은 2016년 11월 30일 출원된 "소변 및 기타 샘플에서의 무세포 DNA의 분석"의 명칭을 갖는 미국 가출원 번호 62/427,999로부터의 우선권을 주장하고, 그 전체 내용은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 편입된다.
인간 체액에서 발견된 세포외 DNA의 짧은 단편은 세포 죽음에서 세포자멸사 및 괴사 중에 방출된다 (1). 태아 (2), 종양 세포 (3) 및 이식동종 이식편 (4)으로부터 유래되는 순환 혈장 내 무세포 (cf) DNA의 분석은 비침습성 태아기 시험 (5), 종양 평가를 위한 '액체 생검' (6,7), 및 이식된 기관의 임상 상태의 모니터링 (8)의 발전을 가능하게 했다.
소변 분석은 진성으로 비침습성이며 뇨의 cfDNA의 기원을 이해하면 '액체 생검'의 형태로 그것의 임상적 용도를 안내하는 데 유용하다. 소변의 무세포 상청액으로부터 단리된 DNA는 이전-신장, 신장 또는 이후-신장 시스템에서 발생하는 것으로 광범위하게 분류될 수 있다. 모델 시스템으로 수혈 (9), 임신 (9-11), 조혈 줄기세포 이식 (12), 비-비뇨기과 악성 종양 (13,14), 신장 이식 (15) 및 방광암 (16,17)을 사용하면, 수많은 군이 뇨의 cfDNA의 비율이 체순환계, 신장 및 후-신장 요로상피에서 유래된다는 것을 실증했다.
이전의 연구는 동시에 관심 있는 단일 공급원으로부터 cfDNA 검출에 집중하며, 특정 공급원으로부터 유래된 뇨의 cfDNA의 양에 큰 변동이 있다. 총 뇨의 cfDNA에 대한 각 조직 공급원의 비례 기여도는 알려지지 않았으며, 일부 연구에서, 관심 대상 공급원으로부터의 cfDNA 농도가 매우 낮거나 또는 심지어 검출 불가능하다 ( 15,16,18 ). 따라서, 암이나 다른 질병을 발견하기 위해 소변 (또는 타액이나 대변 샘플과 같은 혈액 이외의 비-침습성 생검)을 사용하는 것이 어려웠다.
다른 기술은 이전에 암으로 진단된 환자를 모니터링하기 위해 점 돌연변이를 분석한다. 그러나, 그러한 기술은 무증상 환자의 광범위하게 적용가능한 스크리닝 기술을 암 진단을 위해 쉽게 수정할 수 없다. 특정 점 돌연변이는 암이 검출될 수 있기 전에 확인되어야 한다. 따라서 단지 잘 알려진 점 돌연변이에 대한 스크리닝만이 스크리닝을 위해 가능하거나, 이전의 검출기 종양에 대한 생체검사된 이전의 침습성을 통해 환자에 대한 특정 점 돌연변이가 확인되어야 한다.
구현예는 특정 장기의 질환 검출 (예를 들어, 암)에 대한 무세포 DNA를 분석할 수 있다. 일부 구현예는, 예를 들어 소변, 타액, 혈액 및 대변 샘플에서 발생할 수 있는 바와 같이, 특정한 장기로부터 유래되거나 특정한 장기를 통과하는 장기-관련 샘플을 사용할 수 있다. 분석은 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 무세포 DNA의 메틸화 수준이 샘플에서 측정될 수 있다. 조직-특이적 메틸화 패턴이 상이한 조직 유형으로부터 단편적 기여 또는 부분적 기여(fractional contribution)를 결정하는 데 사용될 수 있다. 한 조직 유형은 특정 장기의 특정 질환의 이환 조직 유형일 수 있다. 이환 조직 유형의 부분적 기여는 샘플에서 특정 질병의 수준 (분류)을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 메틸화 패턴을 사용하여 암성 방광 내벽 세포의 백분율을 결정할 수 있으며 백분율을 사용하여 암의 수준을 결정할 수 있다.
다른 구현예에서, 장기-관련 무세포 DNA의 크기가 측정될 수 있다. 방광에서 배출된 소변 샘플을 사용하는 예에서, 소변에서 자연적으로 발생하는 무세포 DNA 단편의 크기 프로파일이 측정될 수 있다. 크기 프로파일의 통계적 척도는 무세포 DNA 단편이 집합적으로 건강한 방광 조직을 가진 대상체에 대해 예상되는 것보다 더 길다는 것을 나타낼 수 있다. 더 긴 단편의 표시는 대상체에서 방광암을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 소변 샘플을 사용하는 또 다른 예에서, 소변 샘플은 신우로부터 회수될 수 있다. 신장에 염증이 있는지 여부에 대한 결정은, 비-염증성 신장을 가진 대상체에 대해 예상되는 것보다 무세포 DNA 단편이 집합적으로 길다는 통계적 척도에 기초하여 이루어질 수 있다.
다른 구현예에서, 2개의 상이한 샘플이 특정 장기가 암이 있는지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 혈액 샘플 및 장기-관련 샘플 (예를 들어, 소변, 타액 또는 대변 샘플)에서의 무세포 DNA 둘 모두는 복제 수 이상을 나타내는 염색체 영역을 확인하기 위해 분석될 수 있다. 혈액 샘플이 암을 나타내지 않고 장기-관련 샘플이 나타내면, 대상체는 샘플과 연관된 장기에서 암을 가진 것으로 확인될 수 있다. 예를 들어, 소변 샘플의 경우, 대상체는 방광암이 있는 것으로 확인될 수 있다. 다른 암들, 예컨대 요로 암, 요로상피로부터 발생하는 이행 세포 암종 및 신장 암이 또한 검출될 수 있다
다른 구현예는 본 명세서에서 기재된 방법과 관련된 시스템 및 컴퓨터 판독가능 매체에 대한 것이다.
본 발명의 구현예의 특성 및 이점의 보다 양호한 이해는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면과 관련하여 얻어질 수 있다.
도 1은 본 발명의 구현예에 따라 신장, 요로 상피, B-세포, T-세포, 및 중성구로부터 확인된 19,418개의 차별적으로 메틸화된 영역에서 메틸화 밀도를 나타낸다. 각각의 수직선은 메틸화 밀도에 기초하여 색상-코드화된 단일 차별적으로 메틸화된 영역을 나타낸다. 높은 메틸화 밀도를 갖는 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)은 적색으로 표시되는 반면, 낮은 메틸화 밀도를 갖는 유전자좌는 황색으로 표시된다.
도 2는 본 발명의 구현예에 따른 방광 종양, B-세포, 요로 상피, 신장, 중성구, 및 T-세포에서 27,371개의 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)의 메틸화 밀도를 나타내는 히트 맵이다.
도 3은 본 발명의 구현예에 따른 31개의 소변 샘플에서 혈구 및 신장과 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) (삼각형) 및 신장 이식 (둥근 점) 환자로부터 유래된 cfDNA의 비례 기여도를 도시한다.
도 4A-4C는 본 발명의 구현예에 따른 정상 요로상피 세포 (도 4A), 단일 조직-특이적 메틸화 패턴으로 요로상피 및 방광암 세포 (도 4B), 및 별개의 조직-특이적 메틸화 패턴으로 요로상피 및 방광암 세포 (도 4C)를 포함하는 방광암 사례 및 암이 없는 대조군에 대해 메틸화 디콘볼루션의 플롯을 도시한다.
도 5는 본 발명의 구현예에 따른 이환 조직 유형의 조직-특이적 메틸화 패턴을 사용하여 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법 (500)을 예시하는 순서도이다.
도 6A는 본 발명의 구현예에 따른 6개의 방광암 사례 및 6개 대조군에 대한 소변의 밀리리터 당 게놈 동등 (GE)에서의 총 cfDNA 농도를 도시한다.
도 6B는 본 발명의 구현예에 따른 6개의 방광암 사례 및 6개 대조군에 대한 방광 종양 GE 지수값를 도시한다.
도 7A 및 7B는 본 발명의 구현예에 따른 대표적인 HSCT 환자 (도7A) 및 신장 이식 환자 (도 7B)로부터의 수령체 및 공여체 DNA의 뇨의 cfDNA 크기 프로파일을 도시한다.
도 8A 및 8B는 본 발명의 구현예에 따른 좌측 신장으로부터의 배뇨 소변과 돌에 기인하여 차단된 우측 신장의 신장 골반으로부터의 cfDNA의 크기 프로파일을 도시한다.
도 9A 및 9B는 본 발명의 구현예에 따른 37℃에서 시험관내 인큐베이션의 0, 3 및 6시간에서 신우으로부터의 소변으로부터 cfDNA의 크기 프로파일이다.
도 10A 및 10B는 본 발명의 구현예에 따른 (a) 3시간 및 (b) 6시간 동안 인큐베이션된 신장 골반 소변의 것과 비교된 배뇨 소변의 크기 프로파일을 도시한다.
도 11A 및 11B는 본 발명의 구현예에 따른 31개 HSCT와 신장이식 소변 샘플에 대한 cfDNA 단편 크기 파라미터 간의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 12A 및 12B는 본 발명의 구현예에 따른 신우로부터의 소변 (도 12A) 및 배뇨된 소변 (도 12B)에 대한 37℃ 시험관내 인큐베이션 실험 동안 뇨의 cfDNA의 농도를 도시한다.
도 13A-13D는 본 발명의 구현예에 따른 37℃에서 0 내지 12시간 동안 시험관내 인큐베이션으로 배뇨된 소변 cfDNA의 크기 프로파일이다.
도 14는 본 발명의 구현예에 따른 장기 손상 (예를 들어, 염증 수준)의 정도를 결정하기 위해 유기체의 신장의 신우로부터 소변 샘플을 분석하는 방법 (1400)의 순서도이다.
도 15A 및 15B는 본 발명의 구현예에 따른 근육 침습성 방광암의 2가지 사례로부터의 수술전 및 수술후 소변 샘플의 크기 프로파일을 도시한다.
도 16A-16C는 본 발명의 구현예에 따른 방광암 환자로부터 3개 배뇨 소변 샘플에 대한 크기 프로파일을 도시한다.
도 17A-17C는 본 발명의 구현예에 따른 TURBT를 받은 비-근육 침습성 방광암이 있는 3명의 환자로부터 3개 수술전 소변 샘플의 크기 프로파일을 도시한다.
도 18은 본 발명의 구현예에 따른 뇨의 cfDNA의 크기를 사용하여 방광암을 검출하기 위한 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법 (1800)의 순서도를 도시한다
도 19A 및 19B는 본 발명의 구현예에 따른, 대조군, Ta-T1 질환이 있는 방광암 환자, 및 T2-T4 질환이 있는 방광암 환자에서 70 bp보다 더 긴 뇨의 cfDNA 단편 (P>70 bp)의 비율에 대한 상자 그림을 도시한다.
도 20은 본 발명의 구현예에 따른 뇨의 cfDNA와 방광암 조직 사이의 전반적인 메틸화 및 복제 수 이상에서 일치도를 나타내는 Circos 플롯을 도시한다.
도 21A-21E는 본 발명의 구현예에 따른 5명의 방광암 환자 (A-E)로부터 뇨의 cfDNA의 전반적인 메틸화 및 복제 수 이상의 Circos 플롯을 도시한다.
도 22A 및 22B는 본 발명의 구현예에 따른 T22에 대한 방광암 종양 (19A) 및 cf 소변 (19B)에 대한 Circos 플롯을 도시한다.
도 23A는 본 발명의 구현예에 따른 방광암 사례 및 대조군에서 전체적인 과메틸화 밀도의 상자그림을 도시한다.
도 23B는 본 발명의 구현예에 따른 암을 검출하기 위해 과메틸화 밀도를 사용하기 위한 수신자 수술 특성 (ROC) 곡선을 도시한다
도 24A-24D는 본 발명의 구현예에 따른 라디칼 방광적출술 (T22 및 T23)을 당한 2명의 방광암 환자의 수술전 (도 24A 및 도 24C) 및 수술후 (도 24B 및 도 24D) cf 소변을 도시한다.
도 25A-25D는 본 발명의 구현예에 따른 2명의 환자에 대한 전반적인 메틸화 및 CNA에 대한 수술전 및 수술후 Circos 플롯을 도시한다.
도 26은 본 발명의 구현예에 따른 낮은 악성 잠재성 (PUNLMP)을 갖는 비침습성 (Ta) 유두상 요상피 신생물이 있는 방광암 환자에서 메틸화 및 복제 수 이상을 도시하는 Circos 플롯이다.
도 27A 및 27B는 본 발명의 구현예에 따른 동일한 소변 배출물로부터 수득된 방광암 환자 (T23)로부터의 cf 소변 (도 27A) 및 소변 펠릿 (도 27B)에 대한 Circos 플롯 을 도시한다.
도 28A-28D는 본 발명의 구현예에 따른 2명의 방광암 환자 (T22 및 T23)로부터 cf 소변 (도 28A 및 도 28C) 및 혈장 (도 28B 및 도 28D)에 대한 Circos 플롯을 도시한다.
도 29A 및 29B는 본 발명의 구현예에 따른 2명의 방광암 사례인, T22 및 T23에 대해 CNA 또는 저메틸화의 입증을 나타내는 게놈에 걸친 1MB 빈의 백분율을 도시한다.
도 30은 본 발명의 구현예에 따른 대상체의 소변 샘플 및 혈액 샘플을 분석하여 대상체의 방광암을 확인하는 방법을 나타내는 순서도이다.
도 31A-31C는 본 발명의 구현예에 따른 46명의 방광암 환자 및 39명의 대조군에 대한 저메틸화를 갖는 1mb 빈의 백분율, 복제 수 이상을 갖는 1mb 빈의 백분율 및 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여에 대한 상자그림을 도시한다.
도 31D-31F는 본 발명의 구현예에 따른 저메틸화, CNA, 및 방광 종양 기여에 대한 수신자 수술 특성 (ROC) 곡선을 도시한다.
도 32A-32C는 본 발명의 구현예에 따른 비침습성 (Ta) 저등급 질환이 있는 17명의 방광암 환자 및 39명의 대조군에 대한 저메틸화를 갖는 1mb 빈의 백분율, 복제 수 이상을 갖는 1mb 빈의 백분율 및 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여에 대한 상자그림을 도시한다.
도 32D-32F는 본 발명의 구현예에 따른 저메틸화, CNA, 및 방광 종양 기여에 대한 수신자 수술 특성 (ROC) 곡선을 도시한다.
도 33은 본 발명의 구현예에 따른 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법을 도시한다.
도 34A는 본 발명의 구현예에 따른 49명의 방광암 사례 및 39명의 대조군에서 하나의 불일치를 갖는 판독 백분율에 대한 상자그림이다.
도 34B는 본 발명의 구현예에 따른 도 34A에 대해 상응하는 ROC 곡선 분석이다
도 35는 본 발명의 구현예에 따른 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법을 도시한다.
도 36은 본 발명의 구현예에 따른 3명의 방광암 사례 및 5명의 대조군에 대한 상이한 미생물종의 상대 존재비를 나타내는 히트 맵이다.
도 37은 본 발명의 구현예에 따른 인간의 소변 샘플을 분석하는 방법을 도시한다.
도 38은 본 발명의 구현예에 따른 시스템 (3800)을 예시한다.
도 39는 본 발명의 구현예에 따른 시스템 및 방법으로 사용 가능한 컴퓨터 시스템 예의 블록선도를 도시한다.
도 2는 본 발명의 구현예에 따른 방광 종양, B-세포, 요로 상피, 신장, 중성구, 및 T-세포에서 27,371개의 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)의 메틸화 밀도를 나타내는 히트 맵이다.
도 3은 본 발명의 구현예에 따른 31개의 소변 샘플에서 혈구 및 신장과 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) (삼각형) 및 신장 이식 (둥근 점) 환자로부터 유래된 cfDNA의 비례 기여도를 도시한다.
도 4A-4C는 본 발명의 구현예에 따른 정상 요로상피 세포 (도 4A), 단일 조직-특이적 메틸화 패턴으로 요로상피 및 방광암 세포 (도 4B), 및 별개의 조직-특이적 메틸화 패턴으로 요로상피 및 방광암 세포 (도 4C)를 포함하는 방광암 사례 및 암이 없는 대조군에 대해 메틸화 디콘볼루션의 플롯을 도시한다.
도 5는 본 발명의 구현예에 따른 이환 조직 유형의 조직-특이적 메틸화 패턴을 사용하여 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법 (500)을 예시하는 순서도이다.
도 6A는 본 발명의 구현예에 따른 6개의 방광암 사례 및 6개 대조군에 대한 소변의 밀리리터 당 게놈 동등 (GE)에서의 총 cfDNA 농도를 도시한다.
도 6B는 본 발명의 구현예에 따른 6개의 방광암 사례 및 6개 대조군에 대한 방광 종양 GE 지수값를 도시한다.
도 7A 및 7B는 본 발명의 구현예에 따른 대표적인 HSCT 환자 (도7A) 및 신장 이식 환자 (도 7B)로부터의 수령체 및 공여체 DNA의 뇨의 cfDNA 크기 프로파일을 도시한다.
도 8A 및 8B는 본 발명의 구현예에 따른 좌측 신장으로부터의 배뇨 소변과 돌에 기인하여 차단된 우측 신장의 신장 골반으로부터의 cfDNA의 크기 프로파일을 도시한다.
도 9A 및 9B는 본 발명의 구현예에 따른 37℃에서 시험관내 인큐베이션의 0, 3 및 6시간에서 신우으로부터의 소변으로부터 cfDNA의 크기 프로파일이다.
도 10A 및 10B는 본 발명의 구현예에 따른 (a) 3시간 및 (b) 6시간 동안 인큐베이션된 신장 골반 소변의 것과 비교된 배뇨 소변의 크기 프로파일을 도시한다.
도 11A 및 11B는 본 발명의 구현예에 따른 31개 HSCT와 신장이식 소변 샘플에 대한 cfDNA 단편 크기 파라미터 간의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 12A 및 12B는 본 발명의 구현예에 따른 신우로부터의 소변 (도 12A) 및 배뇨된 소변 (도 12B)에 대한 37℃ 시험관내 인큐베이션 실험 동안 뇨의 cfDNA의 농도를 도시한다.
도 13A-13D는 본 발명의 구현예에 따른 37℃에서 0 내지 12시간 동안 시험관내 인큐베이션으로 배뇨된 소변 cfDNA의 크기 프로파일이다.
도 14는 본 발명의 구현예에 따른 장기 손상 (예를 들어, 염증 수준)의 정도를 결정하기 위해 유기체의 신장의 신우로부터 소변 샘플을 분석하는 방법 (1400)의 순서도이다.
도 15A 및 15B는 본 발명의 구현예에 따른 근육 침습성 방광암의 2가지 사례로부터의 수술전 및 수술후 소변 샘플의 크기 프로파일을 도시한다.
도 16A-16C는 본 발명의 구현예에 따른 방광암 환자로부터 3개 배뇨 소변 샘플에 대한 크기 프로파일을 도시한다.
도 17A-17C는 본 발명의 구현예에 따른 TURBT를 받은 비-근육 침습성 방광암이 있는 3명의 환자로부터 3개 수술전 소변 샘플의 크기 프로파일을 도시한다.
도 18은 본 발명의 구현예에 따른 뇨의 cfDNA의 크기를 사용하여 방광암을 검출하기 위한 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법 (1800)의 순서도를 도시한다
도 19A 및 19B는 본 발명의 구현예에 따른, 대조군, Ta-T1 질환이 있는 방광암 환자, 및 T2-T4 질환이 있는 방광암 환자에서 70 bp보다 더 긴 뇨의 cfDNA 단편 (P>70 bp)의 비율에 대한 상자 그림을 도시한다.
도 20은 본 발명의 구현예에 따른 뇨의 cfDNA와 방광암 조직 사이의 전반적인 메틸화 및 복제 수 이상에서 일치도를 나타내는 Circos 플롯을 도시한다.
도 21A-21E는 본 발명의 구현예에 따른 5명의 방광암 환자 (A-E)로부터 뇨의 cfDNA의 전반적인 메틸화 및 복제 수 이상의 Circos 플롯을 도시한다.
도 22A 및 22B는 본 발명의 구현예에 따른 T22에 대한 방광암 종양 (19A) 및 cf 소변 (19B)에 대한 Circos 플롯을 도시한다.
도 23A는 본 발명의 구현예에 따른 방광암 사례 및 대조군에서 전체적인 과메틸화 밀도의 상자그림을 도시한다.
도 23B는 본 발명의 구현예에 따른 암을 검출하기 위해 과메틸화 밀도를 사용하기 위한 수신자 수술 특성 (ROC) 곡선을 도시한다
도 24A-24D는 본 발명의 구현예에 따른 라디칼 방광적출술 (T22 및 T23)을 당한 2명의 방광암 환자의 수술전 (도 24A 및 도 24C) 및 수술후 (도 24B 및 도 24D) cf 소변을 도시한다.
도 25A-25D는 본 발명의 구현예에 따른 2명의 환자에 대한 전반적인 메틸화 및 CNA에 대한 수술전 및 수술후 Circos 플롯을 도시한다.
도 26은 본 발명의 구현예에 따른 낮은 악성 잠재성 (PUNLMP)을 갖는 비침습성 (Ta) 유두상 요상피 신생물이 있는 방광암 환자에서 메틸화 및 복제 수 이상을 도시하는 Circos 플롯이다.
도 27A 및 27B는 본 발명의 구현예에 따른 동일한 소변 배출물로부터 수득된 방광암 환자 (T23)로부터의 cf 소변 (도 27A) 및 소변 펠릿 (도 27B)에 대한 Circos 플롯 을 도시한다.
도 28A-28D는 본 발명의 구현예에 따른 2명의 방광암 환자 (T22 및 T23)로부터 cf 소변 (도 28A 및 도 28C) 및 혈장 (도 28B 및 도 28D)에 대한 Circos 플롯을 도시한다.
도 29A 및 29B는 본 발명의 구현예에 따른 2명의 방광암 사례인, T22 및 T23에 대해 CNA 또는 저메틸화의 입증을 나타내는 게놈에 걸친 1MB 빈의 백분율을 도시한다.
도 30은 본 발명의 구현예에 따른 대상체의 소변 샘플 및 혈액 샘플을 분석하여 대상체의 방광암을 확인하는 방법을 나타내는 순서도이다.
도 31A-31C는 본 발명의 구현예에 따른 46명의 방광암 환자 및 39명의 대조군에 대한 저메틸화를 갖는 1mb 빈의 백분율, 복제 수 이상을 갖는 1mb 빈의 백분율 및 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여에 대한 상자그림을 도시한다.
도 31D-31F는 본 발명의 구현예에 따른 저메틸화, CNA, 및 방광 종양 기여에 대한 수신자 수술 특성 (ROC) 곡선을 도시한다.
도 32A-32C는 본 발명의 구현예에 따른 비침습성 (Ta) 저등급 질환이 있는 17명의 방광암 환자 및 39명의 대조군에 대한 저메틸화를 갖는 1mb 빈의 백분율, 복제 수 이상을 갖는 1mb 빈의 백분율 및 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여에 대한 상자그림을 도시한다.
도 32D-32F는 본 발명의 구현예에 따른 저메틸화, CNA, 및 방광 종양 기여에 대한 수신자 수술 특성 (ROC) 곡선을 도시한다.
도 33은 본 발명의 구현예에 따른 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법을 도시한다.
도 34A는 본 발명의 구현예에 따른 49명의 방광암 사례 및 39명의 대조군에서 하나의 불일치를 갖는 판독 백분율에 대한 상자그림이다.
도 34B는 본 발명의 구현예에 따른 도 34A에 대해 상응하는 ROC 곡선 분석이다
도 35는 본 발명의 구현예에 따른 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법을 도시한다.
도 36은 본 발명의 구현예에 따른 3명의 방광암 사례 및 5명의 대조군에 대한 상이한 미생물종의 상대 존재비를 나타내는 히트 맵이다.
도 37은 본 발명의 구현예에 따른 인간의 소변 샘플을 분석하는 방법을 도시한다.
도 38은 본 발명의 구현예에 따른 시스템 (3800)을 예시한다.
도 39는 본 발명의 구현예에 따른 시스템 및 방법으로 사용 가능한 컴퓨터 시스템 예의 블록선도를 도시한다.
용어들
"생물학적 샘플"은 대상체 (예를 들어, 인간, 예컨대 임신한 여성, 암이 있는 사람, 또는 암이 있는 것으로 의심되는 사람, 장기 (예를 들어, 심근경색증이 있는 심장, 또는 뇌졸중이 있는 뇌, 또는 빈혈이 있는 조혈시스템)를 포함한 질환 진행을 갖는 것으로 의심되는 장기 이식 수령체 또는 대상체)로부터 채취되고 관심 있는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 함유하는 임의의 샘플을 지칭한다. 생물학적 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 질액, 음낭수종 (예를 들어 고환)으로부터의 유체, 질 세정 유체, 늑막 유체, 복수액, 뇌척수액, 타액, 땀, 눈물, 가래, 기관지폐포 세척 유체, 유두로부터 배출 유체, 신체의 상이한 부분 (예를 들어 갑상선, 유방)으로부터의 흡인 유체, 등일 수 있다. 대변 샘플이 또한 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 무세포 DNA가 풍부한 생물학적 샘플 (예를 들어, 원심분리 프로토콜을 통해 수득된 혈장 샘플)에서의 다수의 DNA는 무세포일 수 있고, 예를 들어, DNA의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 이상이 무세포일 수 있다. 원심분리 프로토콜은, 예를 들어, 3,000 g x 10분을 포함할 수 있어, 유체 일부를 수득하고, 그리고, 예를 들어, 30,000 g에서 또 다른 10분 동안 재-원심분리하여 잔존 세포를 제거한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자좌" 또는 그것의 복수 형태 "유전자좌들"은 게놈에 걸쳐 편차가 있는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 (또는 염기쌍)의 위치 또는 주소이다. "서열 리드 또는 서열 판독치(sequence read)"는 핵산 분자의 임의의 일부 또는 전부로부터 서열 분석된 뉴클레오타이드의 문자열을 지칭한다. 예를 들어, 서열 리드는 핵산 단편으로부터 서열분석된 뉴클레오타이드의 짧은 문자열 (예를 들어, 20-150), 핵산 단편의 하나 또는 둘 모두 단부에서의 뉴클레오타이드의 짧은 문자열 또는 생물학적 샘플에 존재하는 전체 핵산 단편의 서열분석일 수 있다. 서열 리드는 다양한 방식으로, 예를 들어, 서열분석 기술을 사용하거나 또는 프로브를 사용하여, 예를 들어, 하이브리드화 배열 또는 포착 프로부, 또는 증폭 기술, 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 단일 프라이머 또는 등온증폭을 사용한 선형 증폭에서 수득될 수 있다.
용어 "크기 프로파일"은 일반적으로 생물학적 샘플에서 DNA 단편의 크기에 관한 것이다. 크기 프로파일은 다양한 크기에서의 DNA 단편의 양의 분포를 제공하는 히스토그램일 수 있다. 다양한 통계적인 파라미터 (또한 일명 크기 파라미터 또는 단지 파라미터)를 사용하여 하나의 크기 프로파일을 다른 것으로 구별할 수 있다. 하나의 파라미터는 모든 DNA 단편에 대해 또는 또 다른 크기 또는 범위의 DNA 단편에 대한 특정 크기 또는 크기의 범위의 DNA 단편의 백분율이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "분류"는 샘플의 특정한 특성과 관련된 임의의 수(들) 또는 다른 특성(들)을 지칭한다. 예를 들어, "+" 기호 (또는 단어 "양성")는 샘플이 결실 또는 증폭을 갖는 것으로서 분류된다는 것을 의미할 수 있다. 분류는 2원 (예를 들어, 양성 또는 음성)일 수 있거나 더 많은 분류 수준을 가질 수 있다 (예를 들어, 1 내지 10 또는 0 내지 1의 규모).
용어들 "컷오프" 및 "역치"는 조작에서 사용된 사전 결정된 수를 지칭한다. 예를 들어, 컷오프 크기는 단편이 배제되는 그 이상의 크기를 지칭할 수 있다. 역치 값은 특정 분류가 적용되는 그 이상 또는 이하의 값일 수 있다. 이들 용어들 중 어느 하나는 이들 상황 중 어느 하나에서 사용될 수 있다.
포유동물 게놈에서 "DNA 메틸화"는 전형적으로 CpG 디뉴클레오타이드 중에 시토신 잔기의 5' 탄소 (즉 5-메틸시토신)에 메틸기의 첨가를 지칭한다. DNA 메틸화는 다른 상황, 예를 들어 H가 아데닌, 시토신 또는 티민인 CHG 및 CHH에서의 시토신에서 일어날 수 있다. 시토신 메틸화는 또한 5-하이드록시메틸시토신의 형태로 될 수 있다. 비-시토신 메틸화, 예컨대 N6-메틸아데닌이 또한 보고되었다.
"부위"는, 예를 들어, CpG 부위와 같이, 단일 염기 위치 또는 상관된 염기 위치의 군일 수 있는 단일 부위에 상당한다. "유전자좌"는 다중 부위를 포함하는 영역에 상당할 수 있다. 유전자좌는 그 문맥에서의 부위에 동등한 유전자좌를 만들 수 있는 단지 하나의 부위를 포함할 수 있다.
"메틸롬"은 게놈 내 복수의 부위 또는 유전자좌에서 DNA 메틸화의 양의 척도를 제공한다. 메틸롬은 모든 게놈, 게놈의 실질적인 일부, 또는 게놈의 비교적 작은 부분(들)에 상응할 수 있다. "종양 메틸롬"은 유기체 (예를 들어, 인간)의 종양의 메틸롬에 상응한다. 종양 메틸롬은 모계 혈장에서 종양 조직 또는 무세포 종양 DNA를 사용하여 결정될 수 있다. 관심 있는 조직-특이적 메틸롬의 다른 예는 체액 (예를 들어 혈장, 혈청, 땀, 타액, 소변, 생식기 분비, 정액, 대변 유체, 설사 유체, 뇌척수액, 위장관의 분비물, 복수액, 늑막유체, 안구내 유체, 음낭수종 (예를 들어 고환)으로부터의 유체, 담낭으로부터의 유체, 췌장 분비물, 장내 분비물, 가래, 눈물, 유방 및 갑상선으로부터의 흡인 유체, 등) 안으로 DNA를 제공할 수 있는 기관의 메틸롬 (예를 들어 뇌세포, 뼈, 폐, 심장, 근육 및 신장, 등의 메틸롬)이다.
"조직"은 동일한 유형의 세포 군에 상응한다. 조직의 상이한 유형은 상이한 유형의 세포 (예를 들어, 간세포, 폐포세포 또는 혈구)로 구성될 수 있을 뿐만 아니라 상이한 유기체 (모체 대 태아) 또는 건강한 세포 대 종양 세포로부터의 조직에 상응할 수 있다. "참조 조직"은 조직-특이적 메틸화 수준을 결정하기 위해 사용된 조직에 상응한다. 상이한 개체로부터 동일한 조직 유형의 다중 샘플을 사용하여 그 조직 유형의 조직-특이적 메틸화 수준을 결정할 수 있다.
각각의 게놈 부위 (예를 들어, CpG 부위)에 대한 "메틸화 지수"는 그 부위를 커버하는 리드의 총수에 대해 상기 부위에서 메틸화를 나타내는 서열 리드의 비율을 지칭한다. 영역의 "메틸화 밀도"는 영역 내의 부위를 커버하는 리드의 총수로 나누어진 메틸화를 나타내는 영역 내에서의 부위에서 리드의 수이다. 상기 부위는 특정한 특성을 가질 수 있고, 예를 들어, CpG 부위일 수 있다. 따라서, 영역의 "CpG 메틸화 밀도"는 영역 내 CpG 부위 (예를 들어, 특정 CpG 부위, CpG 섬 또는 보다 큰 영역 내의 CpG 부위)를 커버하는 리드의 총수로 나누어진 CpG 메틸화를 나타내는 리드의 수이다. 예를 들어, 인간 게놈 내 각각의 100-kb 빈에 대한 메틸화 밀도는 100-kb 영역에 대해 맵핑된 서열 리드에 의해 커버되는 모든 CpG 부위의 비율로 CpG 부위에서 (메틸화된 시토신에 상응하는) 바이설파이트 처리 후 전환되지 않은 시토신의 총수로부터 결정될 수 있다. 이 분석은 또한 다른 빈 크기, 예를 들어 50-kb 또는 1-Mb, 등에 대해 수행될 수 있다. 영역은 전체 게놈 또는 염색체 또는 염색체의 일부 (예를 들어 염색체 암)일 수 있다. CpG 부위의 메틸화 지수는 영역이 단지 그 CpG 부위를 포함하는 경우 영역에 대한 메틸화 밀도와 동일하다. "메틸화된 시토신의 비율"은 분석된 시토신 잔기의 총 수, 즉 영역에서 CpG 배경의 외부의 시토신을 포함한 총 수에 대해 메틸화된 것으로 나타난 (예를 들어 바이설파이트 전환 후 비전환된), 시토신 부위인 "C's"의 수를 지칭한다. 메틸화 지수, 메틸화 밀도 및 메틸화된 시토신의 비율은 "메틸화 수준"의 예이다.
용어 "질환의 수준" 또는 "병태의 수준 "은 질환 (예를 들어, 암)이 존재하는지 여부, 질환이 암인 경우 질환의 단계, 및 종양의 크기, 전이가 있는지 여부, 신체의 총 종양 부담 및/또는 질환의 중증도의 다른 척도를 지칭할 수 있다. 질환의 수준은 수 또는 다른 표시, 예컨대 기호, 알파벳 문자, 및 색상일 수 있다. 상기 수준은 제로일 수 있다. 암의 수준은 또한 돌연변이 또는 수많은 돌연변이와 관련된 악성 이전 또는 전암성 병태 (상태)를 포함한다. 질환의 수준은 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 스크리닝은 질환을 이미 갖는 것으로 알려지지 않은 사람에서 질환이 존재하는지를 점검할 수 있다. 평가는 질환이 있는 것으로 진단받은 사람을 조사하여 경시적으로 질환의 진행 상황을 모니터하고 치료 효과를 연구하거나 예후를 결정할 수 있다. 일 구현예에서, 예후는 환자가 질환으로 죽을 확률 또는 특정 기간 또는 시간 후에 질환이 진행될 확률 또는 암이 전이될 확률로 표현될 수 있다. 검출은 '스크리닝'을 의미할 수 있거나 질환의 암시적 특징 (예를 들어 증상 또는 기타 양성 검사)을 가진 사람이 질환을 앓고 있는지 확인하는 것을 의미할 수 있다.
유전자 좌위 (마커) "유형"은 조직 유형에 걸친 유전자좌에 대한 특정한 속성에 상응한다. 주어진 유형의 유전자좌는 조직 유형에 걸친 메틸화 수준에서 특정한 통계적인 변형을 가질 수 있다. 유전자 좌위 (마커)에 대한 "카테고리"는 동일한 조직 유형에 대한 상이한 개체에 걸친 유전자좌에 대한 메틸화 수준에서 특정한 변형에 상응한다. 유전자 좌위 (마커)의 세트는 다양한 유형 및/또는 카테고리의 유전자좌의 임의의 수로 구성될 수 있다. 따라서, 유전자좌의 세트는 특정한 측정에 대해 선택된 유전자좌에 상당하고 본 세트 내 유전자좌의 임의의 특정한 특성을 암시하지 않는다. 상세한 설명은 주로 유형 I 유전자좌 및 유형 II 유전자좌를 지칭한다. 게놈 부위의 세트는 특정한 조직 유형에 대한 특정 메틸화 서명을 가지지 않을 수 있고, 예를 들어, 특정 조직 유형에서 단지 또는 우세하게 메틸화되지 않을 수 있다. 그와 같은 세트는 유형 II 부위로 지칭된다. 이들 게놈 부위는 유형 I 부위로 지칭되는, 특정한 서명을 갖지 않는 게놈 부위와 함께 사용될 수 있다.
"장기-관련된 샘플"은, 예를 들어 소변, 타액, 늑막 유체, 혈액 및 대변 샘플에서 나타날 수 있는 것과 같은, 특정한 장기에 의해 만들어진 샘플 (예를 들어, 신장에 의해 만들어진 소변)또는 특정한 장기를 통과한 샘플 (예를 들어, 방광을 통과한 소변)을 지칭할 수 있다. 이 샘플은 무세포 DNA를 포함하며 무세포 및 세포 DNA의 혼합물일 수 있다.
요로상피 (또는 오줌상피)는 "과도기적 상피"의 예이다. 이것은 신우, 요관, 방광, 및 요도의 일부를 포함한 대부분의 요로를 덮는 상피의 유형이다.
상세한 설명
뇨의 무세포 (cf) DNA, 뿐만아니라 다른 장기-관련된 샘플, 예컨대 대변 샘플은 액체 생검, 또는 다른 비-침습성 생검의 완전히 비침습성 형태로서 큰 가능성을 보유한다. 기원 조직에 의한 cfDNA의 조성에 대한 지식은 그것의 임상적 사용을 유도하는데 유용하다. 그러나, 그러한 샘플의 조성은 매우 가변성일 수 있고 그렇게 함으로써 생검으로 사용하기 위한 광범위한 적용 가능성을 제한한다. 예를 들어, 임의의 특정 장기로부터의 신장을 통한 DNA 양은 샘플마다 다양할 수 있으므로, 신장으로부터 얻은 무세포 DNA의 백분율도 매우 다양하다.
CpG 부위 메틸화는 후성유전적 조절의 중요한 형태이고 메틸화 서명은 상이한 조직 (19,20) 및 세포 유형 (21)에 대해 확인될 수 있다. 본 발명자들은 상이한 조직으로부터 혈장 cfDNA의 비례 기여가 전체 게놈 바이설파이트 서열분석 및 서열분석 데이터의 디콘볼루션 분석을 사용하여 확인될 수 있다는 것을 최근에 실증하였다 (22).
본 개시내용은 상이한 조직으로부터의 뇨의 cfDNA의 비례 기여를 추론하기 위해 조직-특이적 메틸화 패턴 (또한 소위 참조 패턴)을 사용하는, 메틸화 디콘볼루션을 이용함에 의해 뇨의 cfDNA의 조성을 분석한다. 그와 같은 분석은 질환 조직 유형, 예를 들어, 암성 요로상피 세포의 메틸화 패턴을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 디콘볼루션을 사용하는 기술은 관련된 질환의 수준을 결정할 수 있다. 결과는 방광 종양으로부터 유래하는 cfDNA의 증가된 비율을 확인하기 위해 메틸화 디콘볼루션을 사용하는 것에 대한 방광암 환자로부터의 뇨의 cfDNA의 분석을 나타낸다.
단편 크기, 종양-관련된 복제 수, 및 메틸화 수준에서의 다른 변화가 또한 분석되었다. 예를 들어, 배뇨된 소변의 크기 프로파일을 사용하여 대상체가 방광암이 있는지 여부를 확인한다. 또한, 신우로부터의 소변의 크기 프로파일을 사용하여 신장이 염증성인지 여부를 확인한다.
추가로, 예를 들어, 전체적으로 참고로 편입되는 미국 특허 번호 8,741,811에 기재된 바와 같이, 혈액을 사용하여 암을 검진하기 위해 복제 수 이상이 사용될 수 있다. 그러나, 혈액이 많은 기관으로부터의 조직을 포함하고 따라서 많은 기관과 관련되기 때문에 어느 장기가 종양을 갖는지 밝혀지지 않을 수 있다. 전형적으로 보다 적은 기관으로부터의 조직을 갖는 소변 또는 다른 샘플이 분석될 수 있으나, 복제 수 이상을 갖는 신장을 통한 DNA는 여전히 다양한 기관으로부터 될 수 있다. 따라서, 종양을 갖는 특정한 장기를 확인하는 것을 어려울 수 있다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 방법은 장기-관련된 샘플 (예를 들어, 타액, 늑막 유체, 소변 또는 대변 샘플)과 혈액 샘플의 무세포 DNA의 복제 수 분석이 암의 수준의 별개의 결정을 얻는 본 명세서에서 기재된 기술을 포함한다. 혈액 샘플이 암을 나타내지 않고 배출된 샘플이 나타나면, 암은 배출된 샘플과 관련된 장기로부터 확인될 수 있는데, 예를 들어 소변에 대한 방광암이다.
I. 이환 조직 참조 패턴을 사용한 디콘볼루션
샘플 (예를 들어, 혈액 및 소변)은 각각이 무세포 DNA의 상이한 분획에 기여하는 다중 조직 유형을 포함할 수 있다. 조직의 상이한 유형의 DNA가 전형적으로 상이한 메틸화 패턴을 가지기 때문에, 특정한 샘플에서 측정된 메틸화 수준은 샘플 내 각각의 복수의 조직 유형의 부분적 기여를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 디콘볼루션의 과정은, 예를 들어, 전체적으로 참고로 편입되는 미국 특허 공보 2016/0017419에서 기재된 바와 같이, 부분적 기여를 결정하기 위해 조직-특이적 메틸화 패턴을 사용할 수 있다.
부분적 기여에서의 변화는 비정상을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 특정 샘플이, 예를 들어, 소변에서 부분적 기여에서 높은 가변성을 갖는 경우 문제가 발생할 수 있다. 일부 구현예는 장기의 건강한 조직으로부터 결정된 메틸화 패턴을 사용하는 것과는 대조적으로, 구체적으로 이환 조직에 상응하는 조직-특이적 메틸화 패턴을 사용함에 의해 이 문제를 해결할 수 있다. 먼저, 샘플로서 소변에 대한 문제뿐만 아니라 디콘볼루션에 대한 세부 사항을 논의한다.
A. 샘플로서 소변
조혈세포가 상대적으로 안정한 농도로 존재하는 혈장 cfDNA에 대해 일관되게 우세한 원인제공자인 반면 (22,27), 뇨의 cfDNA의 양 및 조성은 아주 가변성이다. 예를 들어, cfDNA에 대한 신장 기여는 임상적으로 안정한 신장 이식 환자에서 4.2 - 94%, 또는 104-3,970 GE/소변 mL로 다변할 수 있다. 조성 변형의 이 정도는 소변에서 총 cfDNA의 농도에서의 변형 (이식 환자로부터의 225-25,710 GE/소변 mL)을 형성하고 그리고 왜 단일 공급원으로부터의 cfDNA의 민감성 검출만을 목적으로 한 검정이 검출불가능한 수준을 갖는 샘플과 충돌하는가를 설명할 수 있다. 이것은 항상성 평형상태로 유지되는 혈장의 내용물 사이에서의 차이를 강조할 수 있으며, 배뇨된 소변의 내용물은 비뇨기계를 통한 단방향 경로인, 1회 후에 항상성 요건의 배설 부산물이다. 다양한 수화 상태가 전체 cfDNA 농도에 영향을 미치는 것으로 상상할 수 있지만, 희석의 효과는 각각의 조직에서의 비례 기여의 변화를 설명할 수 없다.
뇨의 cfDNA의 조사는 다수의 뇨의 cfDNA 단편은 짧고 (<100bp) 그리고 DNaseI인, 주요 분비성 DNA-가수분해 효소가 신장 및 방광에서 고도로 발현되고 (https://www.proteinatlas.org/) 소변 내에 존재하고 (Ito et al. 1984) 그리고 고활성이다 (Nadano et al. 1993)는 사실에 의해 더욱 복잡하다. 각각의 조직 공급원으로부터 검출가능한 cfDNA 양에서의 변화는 조직의 기원에 의한 뇨의 cfDNA 조성과 또한 이것이 요로를 빠져나옴에 따라 cfDNA가 겪을 수 있는 변화에 대한 향상된 이해를 요한다.
따라서, 소변 내 cfDNA의 조성을 결정하는데 있어서의 어려움은 뇨의 cfDNA가 혈장에서의 것보다 짧다 (소변에서 약 50개 염기 및 혈장에서 150개 염기)는 것과 뇨의 DNA는 요로를 통과하면서 계속적으로 분해된다는 사실에 있다. 또한 소변에서 무세포 DNA의 추출은 DNaseI의 존재로 인해 혈장으로부터의 것보다 더 어렵다. 따라서, 메틸화 디콘볼루션이 그렇게 너무 짧은 단편에도 효과가 있을지는 명확하지 않다.
본 발명자들은 혈구, 신장, 및 요로상피 각각이 소변으로 cfDNA의 신장-이전, 신장, 및 신장-이후 방출에 대한 주요 원인제공자이다는 것을 가정했다. 혈장 내 cfDNA의 대략 80%는 조혈세포로부터의 것이고 (27) 따라서 만일 혈장 cfDNA의 상당한 양이 신장을 통해 소변으로 여과될 수 있다면, 이들 DNA 단편은 조혈세포의 특성을 가지기 쉽다. 그러나, 다양한 조직으로부터 신장을 통한 DNA의 조성은 소변에서 가변성이다.
본 발명자들은 전체 게놈 바이설파이트 서열분석을 사용하여 뇨의 cfDNA 조성물의 전반적인 조사를 수행했다. DNA 단편은 왓슨과 및 크릭 가닥 상으로 맵핑하였다. 샘플당 하나의 레인을 사용하여, 본 발명자들은 게놈에 걸친 CpG 부위에서 평균 서열분석 깊이 2.42를 갖는 8천만 개의 고유하게 매핑 가능하고 중복되지 않는 리드의 중앙을 얻었다. 본 발명자들은 조직 특이적 메틸화 서명 및 메틸화 디콘볼루션을 사용하여 각각의 조직으로부터 비례 기여를 추론했다.
본 발명자들은 소변 내 무세포 및 세포 DNA의 비례 기여를 결정할 수 있다는 것을 본 발명자들이 입증한다. 메틸화 디콘볼루션으로부터 유래된 비례 기여는 조혈줄기 세포 및 신장이식 수용체의 소변에서 동종이식편-유래된 공여체-특이적 유전자 마커를 사용하여 계산된 것과 매우 상관된다. 본 발명자들은 상이한 조직으로부터 비례 기여의 큰 변화를 발견하였다. 신우로부터 수득된 소변으로부터의 cfDNA는 배뇨된 소변과 비교하여 더 긴 단편의 더 높은 비율을 가진다. 생체내 열화를 모방하기 위해 37℃에서 뇨의 cfDNA의 시험관내 인큐베이션은 뇨의 cfDNA의 절대 농도가 3.5-4.9시간의 반감기로 감소했다는 것을 밝혔다. 생체내 열화에도 불구하고, 신장 및 골수 이식 환자의 배뇨 소변을 사용한 검증은 메틸화 디콘볼루션과 공여체-특이적 SNP 사이의 비례 기여에서 높은 상관관계를 보였다.
무세포 소변 및 소변 펠릿으로부터 DNA 메틸화는 요로를 구성하는 조직을 포함한, 상이한 정상 및 병리적 조직으로부터의 참조 메틸롬과 비교된다. 방광암 환자로부터의 뇨의 cfDNA의 메틸화 디콘볼루션은 암으로부터 증가된 비례 기여를 확인했다. 그와 같은 뇨의 cfDNA는 또한 크기 프로파일, 복제 수, 및 전반적인 저메틸화 및/또는 과메틸화에서 이상을 나타냈다.
뇨의 cfDNA의 이 전반적인 조사는 요로 내 cfDNA의 조성, 열화, 및 변형에 대한 우리의 이해를 심오하게 하고 분자 진단 도구로서 전체게놈 뇨의 cfDNA 서열분석의 사용에 대한 토대를 마련했다.
B. 메틸화 디콘볼루션
메틸화 디콘볼루션의 원리는 유기체로부터 DNA 혼합물의 조성을 결정하기 위한 단일 메틸화 게놈 부위 (메틸화 마커)를 사용하여 설명될 수 있다. 유기체는 포유동물 또는 인간을 포함한 동물일 수 있다. 조직 A가 게놈 부위에 대해 완전히 메틸화된, 즉 100%의 메틸화 밀도 (MD)이고, 조직 B는 완전히 비메틸화된, 즉 0%의 MD인 것을 가정한다. 이 실시예에서, 메틸화 밀도는 관심 있는 영역에서 메틸화된 CpG 디뉴클레오타이드와 관련한 시토신 잔기의 백분율을 지칭한다.
만일 DNA 혼합물 C가 조직 A 및 조직 B로 구성되고 DNA 혼합물 C의 전체적인 메틸화 밀도가 60%이면, 본 발명자들은 하기식에 따라 DNA 혼합물 C에 조직 A 및 B의 비례 기여를 추론할 수 있다:
여기서, MDA, MDB, MDC는 각각 조직 A, 조직 B 및 DNA 혼합물 C의 MD를 나타내고; a 및 b는 DNA 혼합물 C에 대한 조직 A 및 B의 비례 기여이다. 이 특정 실시예에서, 조직 A 및 B는 DNA 혼합물의 단지 2개 구성성분인 것이 추정된다. 따라서, a + b = 100%. 따라서, 조직 A 및 B는 DNA 혼합물에 각각 60% 및 40% 기여한다는 것이 계산된다.
조직 A 및 조직 B에서 메틸화 밀도는 유기체의 샘플 또는 동일한 유형의 다른 유기체로부터의 샘플 (예를 들어, 다른 인간, 잠재적으로 동일한 하위모집단)로부터 수득될 수 있다. 만일 다른 유기체로부터의 샘플이 사용된다면, 조직 A의 샘플의 메틸화 밀도의 통계적인 분석 (예를 들어, 평균, 중앙, 기하 평균)을 사용하여 메틸화 밀도 MDA 및 유사하게 MDB를 얻을 수 있다
게놈 부위는 최소 개별간 변형, 예를 들어 변형의 특정한 절대적인 양 미만을 가지거나 또는 시험된 게놈 부위의 가장 낮은 부분 내에 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 최저 부분의 경우, 구현예는 시험된 게놈 부위의 군 중에서 최저 10%의 변형을 갖는 게놈 부위만을 선택할 수 있다. 다른 유기체는 건강한 사람뿐만 아니라 특정 생리적 조건 (예를 들어 임산부 또는 연령이 다른 사람 또는 특정 성별의 사람들)이 있는 이들에서 취해질 수 있으며, 현재 시험중인 유기체를 포함하는 특정 하위 모집단에 해당할 수 있다.
하위 모집단의 다른 유기체 또한 다른 병리적 병태 (예를 들어 간염 또는 당뇨병, 등이 있는 환자)를 가질 수 있다. 그와 같은 하위 모집단은 다양한 조직에 대해 변경된 조직-특이적 메틸화 패턴을 가질 수 있다. 이러한 질환 상태 하에서 조직의 메틸화 패턴은 정상 조직의 메틸화 패턴을 사용하는 것에 부가하여 디콘볼루션 분석을 위해 사용될 수 있다. 이 디콘볼루션 분석은 이들 병태를 갖는 그와 같은 하위모집단으로부터의 유기체를 테스트할 때 더 정확할 수 있다. 예를 들어 간경변 간이나 섬유성 신장은 각각 정상적인 간 및 정상적인 신장과 비교하여 다른 메틸화 패턴을 가질 수 있다. 따라서 간경변증 환자가 다른 질환에 대해 선별검사를 받은 경우 다른 조직 유형의 건강한 조직과 함께 혈장 DNA에 DNA를 제공하는 후보 중 하나로 간경변 간을 포함시키는 것이 더 정확할 수 있다.
더 많은 게놈 부위 (예를 들어, 10 또는 그 초과)가 보다 많은 잠재적인 후보 조직이 있는 경우에 DNA 혼합물의 구성을 결정하는데 사용될 수 있다. DNA 혼합물의 비례하는 조성의 추정의 정확도는 게놈 부위의 수, 특정 조직에 대한 게놈 부위 ("부위들"이라고도 함)의 특이성 및 참조 조직-특이적 수준을 결정하기 위해 사용된 상이한 후보 조직 및 상이한 개체에 걸친 부위의 가변성을 포함한 수많은 인자에 의존한다. 조직에 대한 부위의 특이성은 특정한 조직과 다른 조직 유형 사이의 게놈 부위의 메틸화 밀도에서의 차이를 지칭한다.
그것의 메틸화 밀도 사이의 차이가 클수록, 그 특정한 조직에 대한 부위가 있을 수 있는 부위에 보다 특이적이다. 예를 들어, 부위가 간에서 완전히 메틸화되고 (메틸화 밀도 = 100%) 모든 다른 조직에서 완전히 비메틸화된 경우 (메틸화 밀도 = 0%), 이 부위는 간에 대해 고도로 특이적일 것이다. 반면에, 상이한 조직에 걸쳐 부위의 가변성은, 예를 들어, 비제한적으로, 조직의 상이한 유형에서 부위의 메틸화 밀도의 범위 또는 표준 편차에 의해 반영될 수 있다. 범위가 더 넓거나 표준 편차가 더 높으면 DNA 혼합물에 대한 상이한 기관의 상대적 기여를 수학적으로보다 정밀하고 정확하게 결정할 수 있다. 후보 조직의 DNA 혼합물에 대한 비례 기여를 추정하는 정확도에 대한 이들 인자의 영향은 본 출원의 후반부에서 설명된다.
여기서, 본 발명자들은 DNA 혼합물에 대한 상이한 기관의 비례 기여의 공제를 설명하기 수학적 방정식을 사용한다. DNA 혼합물 내의 상이한 부위의 메틸화 밀도와 상이한 조직에서의 상응하는 부위의 메틸화 밀도 사이의 수학적 관계는 다음과 같이 표현될 수 있다:
여기서 
는 DNA 혼합물 내 부위 i의 메틸화 밀도를 나타내고; p k 는 DNA 혼합물에 조직 k의 비례 기여를 나타내고; MD ik 는 조직 k 내의 부위 i의 메틸화 밀도를 나타낸다. 부위의 번호가 동일하거나 또는 장기의 수보다 큰 경우, 각각의 p k 의 값이 결정될 수 있다. 조직-특이적 메틸화 밀도는 다른 개체로부터 수득될 수 있으며, 상기 언급된 바와 같이 부위는 최소의 개체 간 변화를 가지도록 선택될 수 있다.
추가의 기준은 정확도를 개선하기 위해 알고리즘에 포함될 수 있다. 예를 들어, 모든 조직의 총 기여는 100%로 제한될 수 있다, 즉
게다가, 모든 기관의 기여는 음이 아닌 것이 요구될 수 있다:
생물학적 변형에 기인하여, 관측된 전체적인 메틸화 패턴은 조직의 메틸화로부터 추론된 메틸화 패턴에 완전히 동일하지 않을 수 있다. 그와 같은 상황에서, 수학적 분석은 개별 조직의 가장 공산이 큰 비례 기여를 결정하는 데 요구된다. 이와 관련하여, DNA에서 관찰된 메틸화 패턴과 조직으로부터 추론된 메틸화 패턴 사이의 차이를 W로 나타낸다.
여기서 O는 DNA 혼합물에 대해 관측된 메틸화 패턴이고, 
는 개별 조직 k의 메틸화 패턴이다. 
는 DNA 혼합물에 대한 조직 k의 비례 기여이다. 각각의 
의 가장 공산이 큰 값은 관찰된 메틸화 패턴과 추론된 메틸화 패턴 사이의 차이인 W를 최소화함으로써 결정될 수 있다. 이 방정식은 비제한적으로, 이차방정식 프로그래밍, 선형/비선형 회귀, 기대-최대화 (EM) 알고리즘, 최대 가능성 알고리즘, 최대 후천적 추정 및 최소자승 제곱을 사용함에 의해 수학적 알고리즘을 사용하여 해결될 수 있다.
C. 뇨의 cfDNA 조직 맵핑을 위한 차별적으로 메틸화된 영역의 확인
참조 메틸롬은 공개적으로 이용가능한 메틸롬, 또한 상이한 조직으로부터 얻어진 정상 및 병리적 샘플의 전체 게놈 바이설파이트 서열분석에 기초하여 조립될 수 있다. 샘플 조직은 비제한적으로 신장 피질, 신장 수질, 요관, 방광 요로상피, 방광 근육, 전립선 (내강, 중추, 및 말초), 및 정낭을 포함하는 조직으로부터 유래될 수 있다. 샘플의 조직 및 세포 조성은 수술 사이에 얻어질 수 있으며 전체 절개를 통해 확인될 수 있다.
본 발명자들은 혈구 (중성구, T-세포 및 B-세포), 신장, 및 요로상피의 메틸롬을 특징화하여 이들 조직 사이에서 분화할 수 있는 메틸화 서명을 확인하는 것을 목적으로 하였다. 본 발명자들은 혈구에 대한 공공연하게 이용가능한 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석 데이터 (인간 에피게놈 지도, www.genboree.org/epigenomeatlas/index.rhtml, (28))를 사용하였고 본 발명자들은 35 - 40X 적용범위로 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석을 수행하기 위해, 신장 이식 또는 비뇨기 수술을 한 환자로부터 신장 및 요상피 조직을 수득하였다.
다중 CpG 부위에 걸쳐 유사한 메틸화 밀도를 갖는 조직이 함께 그룹화될 수 있고 정보제공을 하는 차별적으로 메틸화된 영역이 또한 확인될 수 있다. 신장, 요로상피, 중성구, B-세포, 및 T-세포를 사용하여, 19,418 DMR이 메틸화 마커로서의 용도에 대해 확인되었다. 이것은 DMR에서 메틸화 밀도가 다른 4개 조직과 비교하여 하나의 조직에서 상당히 상이한 (Z-스코어>3) 3,549 1형 마커와, 메틸화 밀도가 상이한 조직에 걸쳐 변화를 보이는 15,869 2형 마커를 포함한다.
도 1은 중성구, B-세포, T-세포, 신장 및 요로상피에서 19,418 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)에서 메틸화 밀도를 나타내는 히트 맵이다. 각각의 수직선은 DMR을 나타내고, 높은 것부터 낮은 메틸화 밀도는 적색 (예를 들어, 부문 102)에서 황색 (예를 들어, 부문 104)으로 표시되어 있다. 계층적 클러스터링은 혈구에서 이들 DMR에서의 메틸화 패턴이 신장과 요로상피에서의 메틸화 패턴과 크게 다르다는 것을 보여준다.
뇨의 cfDNA는 바이설파이트 처리 후 서열분석되었고, DMR에서의 cfDNA 단편 내에서 관측된 메틸화 패턴은 이전에 기재된 바와 같이 메틸화 디콘볼루션 알고리즘을 사용하여 5개의 참조 조직에서의 메틸화서명과 비교되었다 (22). 본 발명자들은 그런 다음 중성구, B-세포, T-세포, 신장 및 요로상피의 비례 기여를 추론했다. 도 1은 혈구, 신장, 및 요로상피가 정상 뇨의 cfDNA의 조성 내에 있다는 것을 도시한다.
본 발명자들은 41 x 2 쌍으로 된 말단 바이설파이트 서열분석을 사용하여 독특하게 맵핑가능한 리드 29.2 M의 중앙에 대해 총 46개 방광암 사례 및 39개 대조군을 서열분석했다. 방광암 사례는 비-침습성 극저등급 (Ta PUNLMP)부터 T4 고등급 질환까지 다양했다. 모든 대조군은 요실금이나 총 혈뇨인 혈액을 가졌다. 8개의 대조군은 그것의 일상적인 임상 진료의 일환으로 요실금이나 총 혈뇨에서 지속성 혈액을 위한 유연한 방광경검사를 받았으며 악성 종양에 음성인 것으로 확인되었다. 15개의 대조군을 사용하여 메틸화 및 복제 수의 기준선 수준을 확립하였다. 나머지 24개의 대조군은 시험 군에서 사용되었다.
도 2는 방광 종양, B-세포, 요로상피, 신장, 중성구, 및 T-세포에서 27,371 차별적으로 메틸화된 영역 (DMR)의 메틸화 밀도를 나타내는 히트 맵이다. 각각의 수직선은 메틸화 밀도에 기초한 DMR 색상 코드를 나타낸다. 도 2에서의 DMR은 도 1에서의 DMR과 약간 상이하다. 수직선은 메틸화 수준으로 정렬된다. 상염색체의 DMR 만 포함된다. 저메틸화는 적색 (예를 들어, 부문 202)으로 착색되고 과메틸화는 황색 (예를 들어, 부문 204)으로 착색된다. 이들 DMR은 각각의 소변 샘플에서 방광 종양에서 기인한 뇨의 cfDNA의 비율을 확인하기 위한 메틸화 디콘볼루션에 사용된다. 방광 종양 조직을 메틸화 디콘볼루션을 위한 DMR을 확인하기 위해 반수체 게놈의 8.5 X 적용 범위에 대해 서열 분석하였다. 도 2는 방광 종양 DNA가 검출될 수 있음을 도시한다. 비정상적인 메틸롬을 가진 임의의 조직은 다른 생리적 또는 병리적 병태에서 검출될 수 있다
전체 게놈 바이설파이트 서열분석이 수술 전 및 수술 후 소변 샘플에 의해 입증된 바와 같은 방광암 환자를 종방향으로 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
D. 조혈줄기 세포 및 신장 이식 환자에서의 메틸화 디콘볼루션 및 공여체-특이적 유전자형을 사용한 검증
본 발명자들은 각각 신장 및 HSCT 이식 환자로부터 26개 및 5개 소변 샘플로부터 cfDNA에 대한 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석을 수행했다. 게놈에 걸쳐 19,418 DMR에서의 메틸화 밀도는 본 발명자들에게 신장, 요로상피, B-세포, T-세포, 및 중성구로부터 유래된 DNA의 비율을 결정하는 것을 가능하게 했다. 공여체 특이적 SNP는 본 발명자들에게 각각의 소변 샘플 내 신장 및 혈구로부터의 DNA 단편의 비율을 확인하는 것을 가능하게 했고 메틸화 디콘볼루션의 정확도는 공여체 특이적 SNP에 의해 결정된 황금률과 비교되었다. 메틸화 디콘볼루션으로부터의 혈구의 비례 기여는 B-세포, T-세포, 및 중성구의 합산이었다.
본 발명자들은 HSCT 및 신장 이식 환자에 대한 Illumina의 OMNI 2M SNP 어레이를 사용하여 공여체 및 수령체 생식계열 유전자형 정보를 확인하였다. 본 발명자들은 바이설파이트 서열분석을 위해 31개 소변 샘플을 수집했다. 본 발명자들은 각각의 샘플에 대해 평균 8천만 개의 독특하게 맵핑된 리드를 얻었으며 공여체 및 수령체-특이적 SNP가 있는 단편의 확인을 통해 공여체 조직에서 cfDNA 단편의 비율의 정확한 계산이 가능하였다.
도 3은 본 발명의 구현예에 따른 31개의 소변 샘플에서 혈구 및 신장과 HSCT (삼각형) 및 신장 이식 (둥근 점) 환자로부터 유래된 cfDNA의 비례 기여도를 도시한다. x 축은 공여체-특이적 SNP로부터 계산된 공여체 장기로부터의 기여 백분율을 표시하고, y 축은 메틸화 디콘볼루션에 의해 추론된 공여체 장기의 기여 백분율을 표시한다. 메틸화 디콘볼루션에 의해 결정된 공여체 조직의 비례 기여와 공여체 및 수령체 특이적 유전자형을 사용하여 결정된 비율은 고도로 상관되었다 (R2=0.97).
이들 결과는 양호한 동적 범위에 걸쳐 뇨의 cfDNA 안으로 상이한 조직의 비례 기여를 결정하는 메틸화 디콘볼루션의 능력을 실증했다. 공여체-특이적 SNP를 사용하면, 뇨의 cfDNA에 대한 공여체 조혈세포 기여의 비율은 6-78%로 다양하였고, 공여체 신장 기여의 비율은 1-94%로 다양하였다. 31개 이식 소변 샘플에 대한 전체 뇨의 cfDNA 메틸화 디콘볼루션 결과는 표 1에 열거되어 있다.
표 1. 31개 HSCT 및 신장 이식 샘플에 대한 메틸화 디콘볼루션 결과. 신장, 요로상피, 중성구, T 세포 및 B 세포로부터의 기여 백분율은 각각의 샘플에 대해 표시된다.
이들 결과는 혈구, 신장, 및 요로상피의 기여는 상이한 샘플 사이에서 극히 가변성이었다는 것을 실증했다. 일부 샘플에서, 상이한 날 (예를 들어 T45 및 T86)에 취해진 동일한 개체로부터의 소변 샘플에서 특정한 조직으로부터 비례 기여도에서 큰 변화가 있었다. 각각의 이들 조직의 비례 기여는 0%로 낮을 수 있으며, 혈구, 신장 및 요로상피 각각에 대해 93%, 100% 및 64%까지 상승할 수 있다. 31개의 소변 샘플에 걸쳐, 혈구, 신장 및 요로상피에 대해 메틸화 디콘볼루션을 사용하여 측정된 비례 기여의 중앙값과 사분위수 범위는 각각 52% (0-84%), 32% (7-100%) 및 5% (0-12%)였다.
E. 메틸화 디콘볼루션을 사용한 암의 결정
이 부문은 요로상피 및 방광 종양 DNA의 메틸롬을 사용한 뇨의 cfDNA의 메틸화 디콘볼루션을 기술한다. 본 디콘볼루션은 상이한 조직으로부터 DNA의 절대적인 양에서의 가변성을 고려할 수 있다. 그러나, 상기에 기재된 바와 같이, 소변에서 상이한 조직의 기여에서 높은 가변성이 있다. 따라서 한 공급원으로부터의 기여가 낮거나 높은 경우, 반드시 이상은 아니다.
도 4A-4C는 정상 요로상피 세포 (도 4A), 단일 조직-특이적 메틸화 패턴으로 요로상피 및 방광암 세포 (도 4B), 및 별개의 조직-특이적 메틸화 패턴으로 요로상피 및 방광암 세포 (도 4C)를 포함하여, 상이한 조직-특이적 메틸화 패턴 (또한 일명 참조 패턴)을 사용하여 정의된 분획에 대한 방광암 사례 및 암이 없는 대조군에 대해 메틸화 디콘볼루션의 플롯을 도시한다. 메틸화 디콘볼루션으로부터 유래된 비례 기여는 y 축 상에 표시되어 있다.
1. 참조로서 정상 요로상피의 사용
방광암의 대다수는 요상피 세포로부터 발생 이행 세포 암종이다. 그러나, 방광 종양 유래된 DNA의 메틸화는 정상 요로상피에 유사하거나, 또는 심하게 상이하고 구별되는 메틸화 패턴을 나타낼 수 있다. 본 발명자들은 방광암 환자로부터 뇨의 cfDNA로의 요로상피의 비례 기여를 암이 없는 대조군과 비교하여 연구하여, 방광 종양이 증가된 세포 턴오버를 가질 수 있고 정상적인 요로상피와 유사한 cfDNA 단편을 방출할 수 있다고 추론했다.
도 4A는 조직-특이적 메틸화 패턴이 메틸화 디콘볼루션에 신장, 정상 요로상피, B-세포, T-세포, 및 중성구를 포함할 때 정상 요로상피의 부분적 기여를 도시한다. 비-암 및 방광암 사례에서 정상 요로상피의 기여 백분율은 두 군 사이에 유의차 없이 가변성을 가지고 크게 중첩한다 (Mann-Whitney U 테스트 p=0.15). 따라서, 메틸화 디콘볼루션은 방광암 환자와 종양이 없는 대조군 사이에 요상피 기여에서의 유의차는 없다는 것을 밝혀냈다. 이것은 방광암이 있는 환자의 소변에서 정상 요로상피를 닮은 cfDNA에서의 현저한 증가는 없다는 것을 시사한다.
2. 정상과 암 사이의 공동 메틸화를 갖는 부위의 사용
방광암은 악성 변화를 겪은 요상피로부터 발생하는 것으로 생각되기 때문에, 본 발명자들은 방광 종양과 정상 요로상피의 메틸롬 간의 유사점과 차이점을 확인하기 위해 8.5X 적용범위로 방광 종양 샘플을 서열분석했다. 본 발명자들은 메틸화 밀도가 방광 종양과 정상 요로상피 사이에 유사한 (<10% 차이) 7,201 DMR을 확인했다. 본 발명자들은 그런 다음 신장, B-세포, T-세포 및 중성구와 함께 요로상피의 이 정의로 메틸화 디콘볼루션을 수행했다.
도 4B는 조직-특이적 메틸화 패턴이 본 발명의 구현예에 따른 방광암에 보존된 신장, B-세포, T-세포, 중성구, 및 요상피 마커를 포함하는 경우 요로상피의 부분적 기여를 도시한다. 정상 요로상피 및 방광암에서 보존된 DMR에 의해 정의된 바와 같이, 요상피 기여는 비-암 (0-67%) 및 방광암 환자 (13-86%)에서 아주 가변성이다. 정상 요로상피 및 방광암에 보존된 메틸화 마커를 사용하면, 대조군과 비교하여 방광암 대상체로부터의 증가된 요상피 기여가 있었다 (Mann-Whitney U 테스트 P=0.003). 대조군과 비교하여 방광암 대상체로부터 요상피 기여 중앙값에서 4.5 배수 증가가 있었다. 대조군에 대한 중앙값은 10.34였고 방광암 대상체에 대한 중앙값은 48.9였다.
3. 별개의 참조로서 종양 요로상피의 사용
마지막으로, 본 발명자들은 중성구, T-세포, B-세포, 신장, 및 정상 요로상피와 함께 별개의 참조 패턴으로 방광 종양 메틸롬을 포함했다. 따라서, 정상 및 종양 요상피는 별개의 조직으로 처리된다. 종양 요상피는 생체검사된 종양을 기반으로 결정되었다. 종양 참조 패턴은 하나 또는 다수의 그러한 생체검사된 종양에 기초하여 결정될 수 있다. 다중 생검을 사용할 때, 종양 참조 패턴은 생검의 전체 또는 명시된 백분율 (예를들어, 50% 초과)에서 발생하는 DMR로 제한될 수 있다. 다른 종양 생검은 다른 참조 패턴을 갖는 별개의 조직으로 또한 간주되어 종양 세포의 특정 그룹을 분류할 수 있다. 본 발명자들은 6개의 세포/조직에 걸쳐 DMR을 확인하고 메틸화 디콘볼루션에서 확인된 DMR을 사용했다.
도 4C는 조직-특이적 메틸화 패턴이 본 발명의 구현예에 따른 신장, 요로상피, B-세포, T-세포, 중성구, 및 방광암을 포함하는 경우 방광 종양 세포의 부분적 기여를 도시한다. 본 발명자들은 방광암이 있는 사례가 방광 종양 기여 중앙값에 14-배수 증가를 가진 반면 비-암 대조군은 아주 낮은 수준의 방광 종양 기여를 가졌다는 것을 밝혀냈다. 비-암 사례는 초저 방광 종양 기여 (0-11%)를 가진 반면 방광암 사례는 최대 84%의 상승된 방광 종양 기여를 갖는다. Mann-Whitney U 테스트는 2개의 군 상이에 유의차가 있었다는 것을 나타냈다 (p=0.0002). 대조군에 대한 기여 중앙값은 4.13이고 방광암 대상체에 대한 기여 중앙값은 57.45이다.
따라서, 약 20의 컷오프 값이 암의 수준의 정확한 분류를 제공할 것이다. 20 근처의 다른 값들은 유사한 민감도와 특이성을 제공할 것이다. 다른 질환이나 암의 경우, 특정 컷오프 값이 다를 수 있다.
방광암 환자 대 정상 대조군의 소변에서 방광 종양의 기여 백분율 사이의 유의차는 방광 종양 기여가 비-암 대조군으로부터 방광암 환자를 구별하는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 방광암 메틸롬은 방광 종양으로부터의 DNA를 기반으로 결정되었기 때문에, 이것은 다른 환자로부터의 방광암 DNA에서 공유되는 메틸화 패턴이 있음을 시사한다.
근원적 방광 절제를 받은 근육-침습성 방광암의 두 사례에 대해, 방광 대신에 소변 배출 및 저장을 위해 소장의 부문이 회장 도관 또는 신생방광을 형성하기 위해 사용되었다. 소장과 소변이 직접 접촉한 상태에서, 본 발명자들은 수술 전 및 수술 후 소변 샘플에서 방광 종양 및 소장과의 메틸화 디콘볼루션를 수행하여 본 발명자들이 방광 종양 기여에서의 감소 및 소장 기여에서의 증가를 감지할 수 있는지 알아보았다. 수술 후 방광암 샘플 둘 모두는 정상 대조군에서 관찰된 수준에 대한 방광 종양 기여에서의 현저한 감소를 보였다 (표 2). 수술 후 샘플에서, 소장뿐만 아니라 중성구로부터의 기여에서 유의미한 증가가 또한 있었다.
표 2. 수술 전 및 수술 후 소변 샘플에서 참조로서 중성구, T-세포, B-세포, 신장, 요로상피, 방광 종양, 및 소장을 사용하여, 비례하는 조직 기여를 나타내는 메틸화 디콘볼루션 결과. 두 환자 A 및 B는 각각 도 15A 및 15B에서의 크기 프로파일에 상응한다.
수술 전 및 수술 후 결과를 비교하면, 방광 종양으로부터의 기여에서의 감소 및 소장 및 중성구로부터의 기여에서의 증가가 있다. 중성구에서의 증가는 수술 직후에 예상된다. 따라서, 5명의 방광암 환자로부터 수술 전 샘플에서, 구현예는 방광 종양 세포에서 소변 내로의 cfDNA 기여의 유의미한 증가를 검출하기 위해 메틸화 디콘볼루션을 사용할 수 있었지만, 암 사례와 정상 대조군 사이의 정상 요상피 기여에서의 유의한 차이가 없었다. 이는 방광 종양 메틸롬이 정상적인 요상피 세포의 것과 크게 다르다는 것과, 구현예는 단일 방광 종양 참조 메틸롬을 사용하여 다른 방광암 환자로부터의 뇨의 cfDNA에서 증가된 종양 기여를 확인할 수 있다는 것을 시사한다. 현행 결과는 대표적인 방광암 메틸롬이 증가된 기여를 탐지하는 참조으로 사용될 수 있음을 보여준다.
질환 검출 및 모니터링을 위한 '액체생검'으로서 사용되는 뇨의 cfDNA의 경우, 뇨의 cfDNA의 기원과는 요로에서 겪게 되는 변화를 이해하는 것이 유용하다. 여기에서 본 발명자들은 뇨의 cfDNA의 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석은 다른 조직의 특징인 메틸화 서명의 인식을 허용하고 따라서 조직 유형에 의한 뇨의 cfDNA의 조성에 대한 전반적인 조사를 허용한다는 것을 입증한다. 이전의 연구는 일반적으로 단일 공급원으로부터의 뇨의 cfDNA를 확인하는데 집중되었지만, 소변 샘플의 cfDNA에 대한 전반적인 조사는 각각의 조직 유형의 비례 기여를 보여 주며 다른 소변 샘플에서의 상이한 조직 기여를 동시에 비교할 수 있게 한다. cfDNA의 기원을 검출하기 위한 메틸화 서명의 사용은 공여체 특이적 대립유전자에 대한 사전 지식 또는 각각의 환자에게 고유할 수 있는 종양 특이적 체세포 돌연변이를 필요로 하는 유전적 변형에 기반한 방법에 비해 이점을 갖는다.
F. 참조로서 이환 조직을 사용하여 질환을 결정하는 방법
도 5는 본 발명의 구현예에 따른 이환 조직 유형의 조직-특이적 메틸화 패턴을 사용하여 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법 (500)을 예시하는 순서도이다. 생물학적 샘플은 제1 조직 유형을 포함하는 복수의 조직 유형으로부터의 무세포 DNA 분자의 혼합물을 포함한다. 방법 (500)은 특정 장기에서 질환의 수준을 결정하는데 사용될 수 있는데, 예를 들어 그 장기의 이환 세포에 상응하는 조직-특이 적 메틸화 패턴이 디콘볼루션에서 사용된다. 방법 (500)은 컴퓨터 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
블록 (510)에서, 분석을 위해 N 게놈 부위가 확인되고, 여기서 N은 정수이다. N 게놈 부위는, 예를 들어, 유형 I 및 유형 II 게놈 부위를 기술하는 II 부문에서보다 상세히 기술된 바와 같이 다양한 속성을 가질 수 있다. 예로서, N 게놈 부위는 유형 I 또는 유형 II 부위만 또는 양자의 조합을 포함할 수 있다. 게놈 부위는 하나 이상의 다른 샘플의 분석에 기반하여, 예를 들어, 다양한 개체에서 측정된 메틸화 수준에 대한 데이터베이스로부터 수득된 데이터에 기반하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, N 게놈 부위 중 적어도 10개는 유형 II이다. N 게놈 부위는 또한 유형 I 부위를 포함할 수 있다 (예를 들어, 적어도 10).
유전자 좌위의 이들 메틸화 특성은 하나의 샘플 또는 샘플의 세트에 대해 측정될 수 있다. 샘플 세트는 시험되는 바로 그 유기체를 포함하는 유기체의 하위모집단, 예를 들어, 바로 그 유기체와 공유되는 특정 형질을 갖는 하위모집단일 수 있다. 이들 다른 샘플은 참조 조직으로 언급될 수 있으며, 상이한 참조 조직은 상이한 샘플로부터 사용될 수 있다.
블록 (520)에서, N 조직-특이적 메틸화 수준은 M 조직 유형의 각각에 대한 N 게놈 부위에서 수득된다. N은 M보다 크거나 같기 때문에 조직-특이적 메틸화 수준을 디콘볼루션에서 사용하여 분율(%)을 결정할 수 있다. 조직-특이적 메틸화 수준은 M에 의한 치수 N의 매트릭스 A를 형성할 수 있다. 매트릭스 A의 각각의 컬럼은 특정 조직 유형에 대한 메틸화 패턴에 상응할 수 있으며, 여기서 패턴은 N 게놈 부위에서의 메틸화 수준의 것이다.
장기의 특정 질환의 검출의 경우, M 조직 유형 중 하나는 제1 장기의 제1 질환에 상응하는 제1 이환 조직 유형에 대응할 수 있다. M 조직 유형 중 제2 조직 유형은 제1 장기의 건강한 조직에 상응할 수 있다. 다양한 구현예에서, 조직-특이적 메틸화 패턴은 공공 데이터베이스(들) 또는 이전의 연구로부터 검색될 수 있다. 이들 조직-특이적 메틸화 패턴은 디콘볼루션 분석에 사용될 N 게놈 부위를 확인하는 데 사용될 수 있다.
블록 (530)에서, M 조직 유형으로부터의 무세포 DNA 분자의 혼합물을 포함하는 생물학적 샘플이 수신된다. 생물학적 샘플은 다양한 방식으로 환자 유기체로부터 얻을 수 있다. 그러한 샘플을 얻는 방법은 비-침습성이거나 침습성일 수 있다. 비-침습성으로 수득된 샘플의 예로는 특정 유형의 유체 (예를 들어 혈장 또는 혈청 또는 소변) 또는 대변을 포함한다. 예를 들어, 혈장과 소변은 여러 장기 조직으로부터의 무세포 DNA 분자를 포함하고 따라서 하나의 샘플을 통해 여러 장기를 분석하는 데 유용하다.
일부 사례에서, 생물학적 샘플은 세포 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 소변 샘플로, 생물학적 샘플은 소변 펠릿으로부터의 세포 DNA가 포함될 수 있다. 세포 DNA는 일반적으로 무세포 DNA보다 길며, 초음파 처리와 같은 단편화 공정을 사용하여 짧은 리드 서열분석을 위한 짧은 단편을 생성할 수 있다.
블록 (540)에서, 생물학적 샘플로부터의 무세포 DNA 분자가 유기체에 상응하는 참조 게놈 내에 이들의 위치를 식별하기 위해 분석된다. 예를 들어, 무세포 DNA 분자는 서열 리드를 얻기 위해 서열분석될 수 있고, 서열 리드는 참조 게놈에 대해 매핑 (정렬)될 수 있다. 유기체가 인간이라면, 참조 게놈은 특정 하위모집단으로부터 잠재적으로 참조 인간 게놈이 될 수 있다. 또 다른 예로서, 무세포 DNA 분자는 (예를 들어, PCR 또는 다른 증폭 후) 상이한 프로브로 분석될 수 있으며, 여기서 각각의 프로브는 상이한 게놈 부위에 상응한다. 일부 구현예에서, 무세포 DNA 분자의 분석은 무세포 DNA 분자에 상응하는 서열 리드 또는 다른 실험적 데이터를 수신하고 그다음 실험적데이터를 분석함에 의해 수행될 수 있다.
무세포 DNA 분자의 통계적으로 상당한 수가 M 조직 유형으로부터의 부분적 기여를 결정하기 위한 정확한 디콘볼루션을 제공하기 위해 분석될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 1,000개의 무세포 DNA 분자가 분석된다. 다른 구현예에서, 적어도 10,000 또는 50,000 또는 100,000 또는 500,000 또는 1,000,000 또는 5,000,000개 또는 그 초과의 무세포 DNA 분자가 분석될 수 있다. 분석할 총 분자 수는 M 및 N과 원하는 정확성 (정확도)에 따라 달라질 수 있다.
블록 (550)에서, N 혼합물 메틸화 수준은 참조 게놈의 N 게놈 중 어느 하나에 각각 위치하는 무세포 DNA 분자의 제1 그룹 (세트)를 이용하여 N 게놈 부위에서 측정된다. N 혼합물 메틸화 수준은 생물학적 샘플의 혼합물에서의 메틸화 수준을 지칭한다. 예로서, 혼합물로부터의 무세포 DNA 분자가 N 게놈 부위 중 하나에 위치하면, 그 부위에서의 그 분자에 대한 메틸화 지수가 그 부위에 대한 전체적인 메틸화 밀도에 포함될 수 있다. N 혼합물 메틸화 수준은 길이 N의 메틸화 벡터 b를 형성할 수 있으며, 여기서 b는 조직 유형의 부분적 기여가 이로부터 결정될 수 있는 관측된 값에 상응한다.
일 구현예에서, DNA 혼합물에서의 게놈 부위에 대한 메틸화 수준은 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석을 사용하여 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, 게놈 부위에 대한 메틸화 수준은 메틸화 마이크로 어레이 분석, 예컨대 Illumina HumanMethylation450 시스템을 사용하거나, 또는 메틸화 면역침강 (예를 들어 항-메틸시토신 항체를 사용) 또는 메틸화-결합 단백질로 처리 후 이어서 마이크로어레이 분석 또는 DNA 서열분석을 사용함에 의해, 또는 메틸화-민감성 제한효소 처리 후 이어서 마이크로어레이 또는 DNA 서열분석을 사용함에 의해, 또는 메틸화 인지 서열분석 예를 들어 단일분자 서열분석 방법을 사용함에 의해 (예를 들어, 나노포어 서열분석 (Schreiber et al., Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915)에 의하거나 또는 Pacific Biosciences의 단일 분자 실시간 분석 (Flusberg et al., Nat Methods 2010; 7: 461-465)에 의해) 결정될 수 있다. 조직-특이적 메틸화 수준은 동일한 방법으로 측정될 수 있다. 다른 예로, 표적화된 바이설파이트 서열분석, 메틸화-특정 PCR, 비-바이설파이트 기반 메틸화-인지 서열분석 (예를 들어, 단일 분자 서열분석 플랫폼에 의함 (Powers et al., Efficient and accurate whole genome assembly and methylome profiling of E. coli, BMC Genomics, 2013;14:675)이 혈장 DNA 메틸화 디콘볼루션 분석을 위한 혈장 DNA의 메틸화 수준의 분석을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 메틸화-인지 서열분석 결과는 다양한 방식으로 수득될 수 있다.
블록 (560)에서, 혼합물 내의 제1 이환 조직 유형의 부분적 기여는 N개의 제1 메틸화 수준 및 M개의 조직 유형의 각각의 N개 조직-특이적 메틸화 수준을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 조성물 벡터의 M 값이 결정될 수 있다. 각각의 M 값은 DNA 혼합물에 대한 M개 조직 유형의 특정 조직 유형의 부분적 기여에 상응한다. 조성물 벡터의 M 값이 해결될 수 있어 N x M 조직-특이적 메틸화 수준이 주어진 경우 N개 혼합물 메틸화 수준 (예를 들어, 메틸화 벡터 b)을 제공할 수 있다. M 부분적 기여는 Ax = b를 해결함에 의해 결정되는 벡터 x에 해당할 수 있으며, 이는 당해 분야의 숙련가에 의해 인정되는 바와 같은 다양한 방식 (예를 들어, 행렬 인수 분해 및/또는 역변환 또는 최적화 과정에 의해)으로 해결될 수 있다. N이 M보다 클 때, 해결은, 예를 들어, 최소 자승법을 사용한, 오류의 최소화를 포함할 수 있다
조성물 벡터는 혼합물 내 M 조직유형의 각각의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 조성물 벡터의 M 값은 M 조직 유형의 부분적 기여로서 직접적으로 취할 수 있다. 일부 실행에서 M 값은 백분율로 변환될 수 있다. 에러 용어들을 사용하여 M 값을 더 높거나 낮은 값으로 변경할 수 있다. 조성물 벡터의 각각의 값은 성분으로 간주될 수 있고, 특정 성분은 특정 조직 유형에 상응할 수 있다.
블록 (570)에서, 제1 이환 조직 유형의 부분적 기여를 사용하여 유기체의 제1 장기에 대한 제1 질환의 수준을 결정하였다. 부분적 기여는 컷오프 값 (역치)과 비교될 수 있다. 예를 들어, 도 4C에서, 컷오프 값은 20일 수 있다. 컷오프 값은 조직 유형에 대해 건강하고 조직 유형에 병이 있는 유기체로부터의 샘플을 사용하여 결정할 수 있다. 샘플은 제1 질환을 가지거나 가지지 않는 외에도 다양한 수준의 제1 질환을 가질 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 제1 질환의 알려진 수준을 갖는 샘플로부터 측정된 데이터에 기초하여 원하는 컷오프 값을 결정하는 방법을 이해할 것이다.
제1 장기의 예는 신장 (예를 들어, 소변이 샘플인 경우), 방광 (예를 들어, 소변이 샘플인 경우), 간 (예를 들어, 혈장 또는 혈청이 샘플인 경우), 또는 타액샘 (예를 들어, 타액이 샘플인 경우)일 수 있다. 제1 질환의 예는 암, 제1 장기가 신장인 경우 사구체신염, 또는 제1 장기가 신장인 경우 신장 증후군일 수 있다.
일부 구현예에서, 참조 패턴이 잠재적으로 동일한 장기 또는 다른 장기로부터, 다중 이환 조직에 대해 사용될 수 있다. 이런 식으로 다중 질환 유형이 동시에 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 부분적 기여는 컷오프 값에 비교될 수 있는 지수 값을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 부분적 기여는 특정 범위로 제한되고, 기여의 합은 100%이다. 따라서, 기여가 증가하는 경우, 다른 기여가 감소하게 된다. 지수 값은 더 넓은 범위를 가질 수 있으며 다른 조직 유형의 기여에 의존하지 않는다. 지수 값은, 일명 방광 종양 GE 지수인, 소변의 밀리리터 당 총 cfDNA 게놈 등가 (GE)를 곱한 부분적 기여일 수 있다.
도 6A에서 나타낸 바와 같이, 6개의 사례와 6개 대조군은 GE/mL로 측정된 소변 내 총 무세포 DNA 농도 간에 통계적인 차이를 나타내지 않았다. 도 6B에서 나타낸 바와 같이, 방광 종양 조직의 결정된 부분적 기여가 총 GE/mL (방광 종양 GE 지수)를 곱하여 지수 값을 계산할 때, 본 지수 값은 대조군에 비교하여 방광암 사례에서 상당히 더 높았다.
일부 구현예에서, 부분적 기여는 새로운 지수 값을 계산하기 위해 소변에서 확인된 저메틸화 및/또는 CNA의 수와 크기를 조절하는데 사용될 수 있다
II. 뇨의 CFDNA의 크기
cfDNA 단편의 길이는 전체의 게놈 서열분석을 사용하는 단일 염기쌍 분할로 확인될 수 있다. 구체적으로, 뇨의 cfDNA의 길이는 쌍으로 된 말단 대규모 병렬 서열분석을 사용하여 단일 염기쌍 분할에서 결정될 수 있고 상이한 단편 길이에서 빈도의 크기 프로파일 플롯에서 시각화될 수 있다. 뇨의 cfDNA 단편의 대부분은 상대적으로 짧다. 정상 대조군의 배뇨 소변에서 cfDNA 단편 길이 중앙은 65-80bp이다. 크기 프로파일 분석에서 다른 길이의 cfDNA 단편의 빈도를 가시화는 cfDNA 단편 <100bp에서 뚜렷한 10bp 주기성을 밝히고, 여기서 피크의 빈도는 최저점의 것에 최대 3배이다.
아래에 논의된 바와 같이, 신우 및 배뇨된 소변으로부터의 쌍으로 된 샘플로부터 데이터는 상부 요로 내에 긴 cfDNA 단편의 보다 큰 비율이 있다는 것을 시사한다. 시험관내 인큐베이션 실험은 cfDNA가 1차 동력학하에서 요로에서 분해된다는 것을 시사한다. 이것은 50-80bp 범위에서 10bp 주기성의 강화와 긴 단편의 감소된 비율에 의해 크기 프로파일에 반영된다. 뇨의 cfDNA에서 관측된 10bp 주기성은 혈장에 비해 소변에서 큰 진폭에도 불구하고, 혈장에서 관찰된 것을 연상하게 한다 (36,37). 이 분해 과정은 전반적인 메틸화 밀도에 영향을 미치며 메틸화 디콘볼루션 결과에 변동을 일으키지만, 이식 환자의 배뇨된 소변에서 관찰되는 높은 상관 관계는 메틸화 디콘볼루션 과정이 생체 내 분해에도 강력함을 시사한다.
A. HSCT 및 신장 이식 환자에서 뇨의 cfDNA의 크기
본 발명자들의 이전의 연구는 태아-유래된 뇨의 cfDNA 단편이 모계로-유래된 단편보다 짧았다는 것을 나타냈다 (Tsui et al. PLos One 2012). 여기서, 본 발명자들은 이식 소변 cfDNA 단편의 크기, 특히 동종이식편-유래된 cfDNA가 수령체 유래된 단편에 비교하여 상이한 크기 프로파일로 되는가를 조사하였다.
도 7A 및 7B는 본 발명의 구현예에 따른 대표적인 HSCT 환자 (도 7A) 및 신장 이식 환자 (도 7B)로부터의 수령체 및 공여체 DNA의 뇨의 cfDNA 크기 프로파일을 도시한다. x-축은 단일 염기쌍 분할에서의 크기를 나타내고 y-축은 각각의 길이에서 빈도를 도시한다. 공여체 및 수령체 크기 프로파일은 각각 청색 및 적색으로 착색되어 있다.
31명 HSCT 및 신장 이식 환자로부터의 소변 샘플은 10의 배수인 길이, 특히 50-80bp에서 구별되는 10bp 주기성과 81bp의 중앙 길이를 갖는 유사한 패턴을 나타낸다. HSCT (도 7A) 및 신장 이식 (도 7B) 환자로부터 공여체 및 수령체 특정 크기 프로파일의 분리 후, 수령체 조직과 비교하여 공여체 조혈 및 신장 조직으로부터 유래된 뇨의 cfDNA의 크기 간에 관찰 가능한 차이가 없었다. 따라서, 동종이계 조혈세포 및 신장으로부터 공여체 특이적 cfDNA의 크기 프로파일은 수령체로부터의 cfDNA의 크기 프로파일과 거의 동일하다.
이것은 조혈 및 신장 조직으로부터 방출된 cfDNA가 수령체 조직과 유사한 크기의 것이다는 것과 또는 요로의 분해적 환경이 상이한 조직으로부터 방출된 cfDNA를 특정 기간 후 일반적인 크기 프로파일을 가정하도록 야기한다는 것을 시사할 수 있다. 조혈적으로-유래된 및 태아-유래된 cfDNA 둘 모두가 혈장의 신장 여과를 통해 소변에 기여하지만, 요로에 있는 조혈 세포는 소변 안으로 직접적으로 cfDNA에 기여할 수 있어, 그것의 크기 프로파일 간의 차이를 고려한다.
B. 신우 대 배뇨된 소변에서 뇨의 cfDNA의 크기 및 조성
혈장 cfDNA의 크기 및 조성은 순환 동안 평형을 달성하는 것으로 나타나고 말초 혈액의 반복 샘플링으로 크게 일관성을 유지한다. 그에 반해서, 소변은 신장에서 생성되며, 방광 안으로 요관을 통해 단방향으로 하강하여, 여기서 이것은 배출되기 전에 저장된다.
DNaseI은 신장 및 방광에서 고도로 발현되고 (https://www.proteinatlas.org/) 소변에 존재하고 (29) 고활성 (30)이기 때문에, 본 발명자들은 cfDNA 단편이 배뇨된 소변과 비교하여 신우에서 다른 크기인지 여부를 조사했다. 본 발명자들은 우측 비뇨기계를 완전히 막고 신우로부터 소변을 직접적으로 배출시키는 경피적 신장절제술 (소변이 형성된 신장 골반 안에 튜브)의 삽입을 필요로 하는 2cm 요로결석을 앓은 환자로부터 소변 샘플을 얻었다. 왼쪽 편 신장은 정상적으로 소변을 생성하여 요로를 통해 배출하였다. 결석은 오른쪽의 완전한 막힘을 야기했다. 본 발명자들은 두 차례에 걸쳐 오른쪽 신장의 신우로부터의 소변과 배뇨된 소변을 동시에 수집하여 신우에서 나오는 소변이 긴 단편의 비율이 더 높다는 사실을 발견했다. 제2 경우는 신장 골반에서 염증이 감소한 후에 있었다.
도 8A 및 8B는 본 발명의 구현예에 따른 좌측 신장으로부터의 배뇨 소변과 결석에 기인하여 차단된 우측 신장의 신장 골반으로부터의 cfDNA의 크기 프로파일을 도시한다. 뇨의 cfDNA의 크기 프로파일은 37일 간격으로 두 번 경우에서 신우 및 배뇨된 소변으로부터의 쌍으로 된 샘플로부터의 것이다. 도 8A는 경피골 절제술 (PCN) 삽입 후 5일째 수집된 신장 골반 및 배뇨 소변을 나타낸다. 도 8B는 환자가 회복된 후 PCN 삽입 42일 후에 수집된 소변 샘플을 나타낸다. X-축은 단일 염기 쌍 분할에서의 크기를 표시하고 Y-축은 특정 길이에서 고유하게 맵핑가능한 단편의 빈도를 나타낸다. 라인 802 및 806은 좌측 신장에 의해 생성된 배뇨된 소변을 나타낸다. 라인 804 및 808은 동시에 수집된 우측 신우에서 나오는 소변을 나타낸다.
두 경우에서, 배뇨 소변과 비교하여 신장 골반 소변에서 긴 뇨의 cfDNA 단편의 보다 큰 비율과 50-80bp 범위에서 주기성의 감소된 진폭이 있다. 또한, 초기 샘플 (도 8A)에 대한 뇨의 cfDNA 단편의 평균 길이는, 우측 신장에서 염증이 감소된 후에 발생하는 추후 샘플 (도 8B)에 대한 뇨의 cfDNA 단편의 평균 길이보다 더 길다.
신장 골반 및 배뇨 소변에 대한 메틸화 디콘볼루션 결과는 배뇨 소변과 비교하여 신장 골반 소변에 더 높은 비례 기여로, 모두 4개의 소변 샘플에서 중성구로부터 상당한 기여가 있다는 것을 도시한다 (표 3). 중성구의 메틸화 서명을 담지하는 cfDNA 단편은 혈장으로부터, 또는 신장 골반에서의 백색 세포 응집체로부터의 신장-이전 기원의 것 중 어느 하나일 수 있다. 배뇨된 소변과 비교하여 신장 골반 소변에서 CpG 부위에 걸쳐 더 높은 전반적인 메틸화 밀도가 또한 있다.
표 3.
표 3은 신장 골반 및 배뇨 소변으로부터 cfDNA에 대한 CpG 부위에서 메틸화 디콘볼루션 및 전반적인 메틸화 밀도에 의한 각각의 조직으로부터 비례 기여를 나타낸다. A 및 B는 도 8A 및 8B에서 표시된 쌍으로 된 우측 신장 골반 및 배뇨 소변 샘플에 상응한다.
C. 경시적으로 신우로부터 뇨의 cfDNA의 크기 프로파일에서의 변화
요로의 상이한 부분으로부터의 소변을 샘플링함에 의해, 본 발명자들은 신장 골반에 긴 cfDNA 단편의 큰 비율이 있다는 것을 발견했다. 소변이 요로를 내려감에 따라, cfDNA의 절대 농도에서의 감소와 50-80bp 사이에서 가장 확연한 특징적인 10 염기쌍 (bp) 주기성을 갖는 짧은 단편의 비율에서의 증가가 있다.
1. 경시적으로 인큐베이션된 신우 소변
신장 골반 소변과 배뇨 소변 사이에서 관측된 차이의 일부는 cfDNA의 생체내 열화에 기인할 수 있다. 제1 경우 (도8A)에서, 제2 수집 (도8B)에 대해 신장 골반과 배뇨 소변 간의 차이를 관찰한 후, 본 발명자들은 더 많은 양의 신장 골반 소변을 수집하고 추가 소변을 밀폐 용기에 넣고 37℃에서 배양했다. 신장 골반 소변의 시험관내 배양은 요로에서의 소변의 생체내 통로 및 방광에서의 저장을 모방한다. 소변을 용기에서 꺼내 3시간, 6시간 및 24시간 동안 배양했다.
도 9A 및 9B는 37℃에서 시험관내 인큐베이션의 0, 3 및 6시간에서 신우으로부터의 소변으로부터 cfDNA의 크기 프로파일이다. 도 9A는 각각의 염기쌍 길이에서 빈도를 나타내고, 도 9B는 누적 빈도를 나타낸다. 라인 902 및 908은 수집시에 cfDNA의 크기 프로파일을 나타낸다. 라인 904 및 910은 3시간 인큐베이션 후에 크기 프로파일을 나타낸다. 라인 906 및 912는 6시간 인큐베이션 후에 크기 프로파일을 나타낸다. 이들 그래프는 시험관내 인큐베이션으로 10 bp 주기성의 진폭에서의 증가와 긴 cfDNA 단편의 비율에서의 감소를 설명한다. 알 수 있는 바와 같이, 3 및 6시간의 인큐베이션 후, 이들 샘플의 크기 프로파일은 50-80 bp 영역에서 긴 단편의 비율에서의 점진적인 감소 및 10 bp 주기성의 진폭에서의 증가를 나타냈다. 신장 골반으로부터의 소변에서 cfDNA의 이 시험관내 인큐베이션은 요로와의 접촉이 없는 경우에도 37℃에서 인큐베이션은 cfDNA의 농도에서의 감소, 짧은 cfDNA의 큰 비율 및 증가된 10bp 주기성을 야기한다는 것을 나타낸다. 신장 골반 소변의 크기 프로파일은 37℃에서 3시간에서 6시간 동안 배양한 후 배뇨 소변의 것에 유사하다.
도 10A 및 10B는 (a) 3시간 및 (b) 6시간 동안 인큐베이션된 신장 골반 소변의 것과 비교된 배뇨 소변의 크기 프로파일을 도시한다. 라인 1002는 3시간 동안 인큐베이션된 신장 골반 소변을 나타낸다. 라인 1004 및 1008은 배뇨된 소변을 나타낸다. 라인 1006은 6시간 동안 인큐베이션된 신장 골반 소변을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 배뇨 소변의 크기 프로파일은 3 및 6시간 동안 인큐베이션된 신장 골반의 것에 매우 유사하다. 이들 데이터는 신장 골반으로부터 요로 아래 소변의 생체내 통과 동안 cfDNA의 농도를 감소시키고 cfDNA 단편의 길이를 짧게 하는 분해 과정이 일어나기 쉽다는 것을 시사한다.
2. 서로에 대해 상이한 크기 파라미터의 관계
단일 소변 샘플로부터 뇨의 cfDNA 단편의 길이, 및 따라서 뇨의 cfDNA의 분해도는 몇 개의 정량적 척도인: 중앙 길이, 70bp보다 더 긴 단편 (P>70bp로 표시됨)의 비율, 및 단편화 (주기성) 지수를 사용하여 특성규명될 수 있다. 70bp보다 더 긴 단편 (P>70bp)의 비율은 70bp보다 더 긴 단편의 수를 단편의 총 수로 나누고 백분율로 표시함에 따라 결정될 수 있다.
10bp 주기성은 50과 80bp 사이에서 가장 확연하고, 그리고 주기성의 진폭은 50, 60, 및 70bp에서의 피크 길이와 55, 65, 및 75bp에서의 트러프 길이 사이의 빈도에서의 차이로 표시될 수 있다. 이것은 주기성 지수 (PI)로 표시될 수 있다. 주기성 지수는 크기 프로파일에서 복수의 트러프 길이에서의 DNA 단편의 빈도로부터 크기 프로파일에서 복수의 피크 길이에서의 DNA 단편의 빈도의 차이를 나타낼 수 있다. 복수의 피크 길이는 규칙적인 크기 간격으로 존재할 수 있다. 복수의 트러프 길이는 복수의 피크 길이로부터 오프셋된 규칙적인 크기 간격으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 규칙적 크기 간격은 10bp일 수 있지만, 트러프 길이는 피크 길이가 5bp만큼 오프셋 (또는 위상차) 될 수 있다. 주기성 지수의 예는 아래와 같이 계산될 수 있다:
PI = (F(50) + F(60) + F(70)) - (F(55) + F(65) + F(75))
여기서 F50, F60 F70, F55, F65, 및 F75는 그 특정 길이에서 cfDNA 단편의 빈도를 나타낸다. 높은 주기성 지수는 최저점과 비교할 때 피크에서 cfDNA 단편 사이의 빈도에의 큰 차이를 나타내고 따라서 주기성의 보다 큰 진폭을 나타낸다. 도 10A 및 10B에서 나타낸 바와 같이, 10 bp 주기성은 50 내지 80 bp 사이에서 가장 두드러졌으며, 주기성의 진폭은 50, 60 및 70 bp에서의 피크 길이 사이의 빈도의 합과 55, 65, 및 75 bp에서 트러프 길이의 합에서의 차이로 표시된 수 있다.
도 11A 및 11B는 31개 HSCT와 신장 이식 소변 샘플에 대한 cfDNA 단편 크기 파라미터 간의 관계를 나타내는 그래프이다. 파라미터는 중앙 (bp), 비율 > 70 bp (P>70) 및 주기성 지수 (PI)이다. 도 11A는 중앙 길이와 P>70 사이에 강한 양성 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 도 11B는 중앙과 PI, 그리고 따라서 또한 P>70bp와의 사이에 음성 (역) 상관관계가 있음을 도시한다. 이 후자의 관찰은 cfDNA 단편의 길이와 주기성이 관련되어 있으며 각각의 샘플의 분해 정도를 나타낸다는 개념을 강화한다.
크기 프로파일에서 관찰된 인큐베이션한 신장 골반 소변에서 관찰된 변화는 감소하는 중앙, 감소하는 P>70bp 및 PI에서의 증가에 의해 반영된다 (표 4). 신장 골반 소변의 중앙, P>70bp 및 PI는 3-6 시간 동안 인큐베이션 후 쌍으로 된 배뇨 소변의 것에 매우 비교할만하다.
표 4
표 4는 37℃ 시험관내 인큐베이션 동안 신우와 쌍으로 된 배뇨된 소변으로부터 뇨의 cfDNA에 대한 염기쌍 (bp)에서의 중앙, 70 bp 초과 단편 (P>70)의 비율, 및 주기성 지수 (PI)의 형태로 요약 크기 통계를 나타낸다. 신장 골반 소변, 배뇨 소변 및 3 및 6시간 동안 37℃에서 시험관내 인큐베이션된 신장 골반 소변 간의 비교는 신장 골반 소변이 배뇨 소변과 비교하여 더 높은 중앙, P>70 및 보다 낮은 FI를 가진다는 것을 나타낸다. 신장 골반 소변은 37℃에서 유지하면 분해되어 보다 짧은 단편의 비율이 증가하고 보다 확연한 주기성이 50-75bp에서 피크와 골 사이에서 큰 차이로 관찰된다. 신우로부터의 소변은 시험관내 인큐베이션 동안 단편화되기 때문에, 중앙 P>70에서의 진행성 감소와 PI에서의 증가가 있었다.
시험관내 인큐베이션 결과는 배뇨 소변에서 통상적으로 관측된 크기 프로파일을 설명하고, cfDNA 단편의 단편화가 요로에서 일어난다는 증거를 제공한다. 이것은 뇨의 cfDNA의 크기와 농도가 i) 소변 수집의 부위, 및 ii) 소변이 생체내에 있는 기간에 영향을 받을 수 있음을 알려준다.
3. 경시적인 메틸화 및 조성
흥미롭게도, 전반적인 CpG 부위 메틸화 밀도는 배뇨 소변에 비하여 신장 골반 소변에서 더 높고, 신장 골반이 37℃에서 인큐베이션됨에 따라 전반적인 CpG 부위 메틸화 밀도에서의 점진적인 감소가 있다. 시험관내 인큐베이션 동안 뇨의 cfDNA의 절대 농도, 단편 크기 및 전반적인 CpG 부위 메틸화 밀도에서의 변화를 고려하여, 본 발명자들은 이들 인자가 메틸화 디콘볼루션에 영향을 주는지 평가했다. 신우에서의 뇨의 cfDNA의 메틸화 디콘볼루션에 의한 상이한 조직에 의한 전체적인 메틸화 밀도 및 비례 기여는 37℃에서 시험관내 인큐베이션 동안 변동하지만, 혈구, 신장 및 요로상피로부터의 비례 기여는 순위의 관점에서 일정하게 유지한다 (표 5).
표 5. 신장 골반 소변, 37℃ 시험관내 인큐베이션 동안 신장 골반 소변 및 쌍으로 된 배뇨 소변에서 중성구, T-세포, B-세포, 신장 및 요로상피의 비례 기여에 대한 메틸화 디콘볼루션.
표 5는 37℃에서 시험관내 인큐베이션 동안 cfDNA에 대한 CpG 부위에서 메틸화 디콘볼루션 및 전반적인 메틸화 밀도에 의해 각각의 조직으로부터 비례 기여를 나타낸다. 전반적인 메틸화 밀도는 6시간에 걸쳐 74.1로부터 68.9%로 감소했고, 메틸화 디콘볼루션 기여에서 변화가 있었다. 그러나, 혈구 (중성구, T-세포, 및 B-세포), 신장, 및 요로상피로부터의 비례 기여는 순위의 관점에서 일정하게 유지한다.
시험관내 인큐베이션 동안 신장 골반 소변에 대한 메틸화 디콘볼루션 결과는 혈구 (중성구)가 상이한 조직으로부터의 기여 백분율에서 약간의 변동으로, 0, 3, 6시간의 우세한 원인제공자였다는 것을 나타냈다. 쌍으로 된 배뇨된 소변에 대한 메틸화 디콘볼루션 결과는 또한 신장 골반 소변 샘플과 비교하여 요로상피로부터의 약간 더 높은 기여로 우세한 중성구 기여를 보였다. 더 높은 요로상피 기여는 요로의 더 긴 신장으로부터 요상피 cfDNA를 얻는 소변을 반영할 수 있다.
D. 경시적으로 뇨의 cfDNA의 농도에서의 변화
신장 골반에서의 뇨의 cfDNA 단편의 크기 프로파일은 더 긴 단편의 더 높은 비율을 가지기 때문에, 본 발명자들은 37℃에서 신장 골반 소변의 시험관내 인큐베이션의 효과를 조사하였다. 신장 골반 소변을 PCN을 통해 수집하고 37℃에서 유지하고, qPCR에 의한 절대 cfDNA 농도 및 각각의 시점으로부터의 크기 프로파일을 또한 확인하기 위해 상이한 시점에서 분취액을 취했다.
신장 골반 소변 cfDNA의 농도는 62bp LEP 유전자 영역에 대해 qPCR을 사용하여 정량하고, 정량화는 제로 시간에서 그리고 각각의 인큐베이션 시점에 대해 수행하였다. 시간이 지남에 따라 총 DNA의 농도가 감소하고, 초기 기간 동안 더 큰 감소가 있다 (도 12A). 지수형 감쇠 곡선이 적정되면, 뇨의 cfDNA는 반감기는 4.9시간이고 평균 수명은 7.0시간을 갖는 것으로 추정된다.
본 발명자들은 그런 다음 신장 골반 소변에서 관찰된 열화 및 단편화 패턴이 37℃로 유지되는 경우에 대조군 배뇨 소변에서도 또한 관찰될 수 있는지를 평가하였다. 본 발명자들은 하루의 두 번째 소변 배출물에서 약 200 ml의 소변을 수집하고 상기 소변을 최대 12시간 동안 37℃에서 시험관내에서 인큐베이션했다. 정상 대조군에서 cfDNA의 농도는 다양하다. 여기에서, 본 발명자들은 최고 cfDNA 농도를 갖는 대조군 소변 샘플에 대한 소변 인큐베이션의 결과를 표시한다. 배뇨 소변에서의 cfDNA의 농도는 신장 골반 소변에 유사한 방식으로 시간이 지남에 따라 감소하고, 지수형 감쇠 곡선은 3.5시간의 추정된 반감기 및 5.1시간의 평균 수명으로 0.92의 R2에 적합화될 수 있다 (도 12B).
따라서, 시험관내 인큐베이션 동안 cfDNA 단편의 단축은 또한 qPCR에 의해 정량화될 때 경시적으로 cfDNA 농도의 감소에 반영된다 (도 12A). 지수 감소의 유사한 패턴이 정상 대상체의 배뇨된 소변의 시험관내 인큐베이션에서 관측되어 (도 12B), cfDNA는 3.5-4.9시간의 반감기로 시간 의존 방식으로 단편화된다는 것을 시사한다.
도 12A 및 12B는 신우로부터의 소변 (도 12A) 및 배뇨된 소변 (도 12B)에 대한 37℃ 시험관내 인큐베이션 실험 동안 뇨의 cfDNA의 농도를 도시한다. x-축은 로그 눈금 단위로 표시된 GE/mL 소변으로 cfDNA의 농도이고, y-축은 시간단위로 인큐베이션 시간이다. cfDNA는 3.5-4.9시간의 반감기로 신우 및 배뇨 소변 둘 모두에서 1차 동력학하에서 분해되는 것으로 나타났다. 분해의 속도는 개체 간에 다양할 수 있다.
E. 경시적으로 배뇨된 뇨의 cfDNA에서의 크기 변화
경시적으로 배출된 뇨의 cfDNA에서의 크기 변화를 조사하였다. 비-바이설파이트 서열분석을 위해 3시간 간격으로 적절한 DNA를 수집했다. 놀랍게도, 0 내지 12시간까지의 cfDNA의 순차적인 크기 프로파일은 배뇨된 소변의 것에 거의 변화 없고 전형적인 것으로 유지한다. 대조군 대상체로부터 배뇨된 cfDNA의 크기 프로파일이 37℃에서 최대 12시간의 인큐베이션 동안 일정하게 유지한다는 사실은 특정 시점 이후에도 안정한 크기 프로파일이 유지된다는 것을 시사한다. 이 안정한 크기 프로파일은 배뇨된 소변 샘플에서 가장 일반적으로 관찰되는 패턴이다.
도 13A-13D. 37℃에서 0 내지 12시간 동안 시험관내 인큐베이션으로 배뇨된 소변 cfDNA의 크기 프로파일. 소변은 3시간 간격으로 인큐베이션 용기로부터 분취되고 가공된다. 도 13A-13D는 qPCR에 의해 측정될 때 cfDNA 농도에서 동반 감소를 도시한다. 도 13A는 0 및 3시간에서의 크기 프로파일을 도시한다. 도 13B는 3 및 6 시간에서의 크기 프로파일을 도시한다. 도 13C는 6 및 9 시간에서의 크기 프로파일을 도시한다. 도 13D는 9 및 12 시간에서의 크기 프로파일을 도시한다. 도 12B에서의 cfDNA 농도에서 관찰된 지수형 감쇠에도 불구하고, 이들 소변 샘플의 크기 프로파일은 12시간 인큐베이션에 걸쳐 일정하게 유지한다.
따라서, 신장 골반 소변의 인큐베이션에서 평행한 크기 프로파일은 긴 단편의 비율에서의 감소와 10 bp 주기성의 강화 (도 9A)를 나타낸다. 그러나, 배뇨 소변의 인큐베이션의 평행한 크기 프로파일은 전형적인 배뇨 소변 크기 프로파일 (도 13A-13D)이 안정한 종점을 나타내는 것으로 나타났다는 것을 보여준다. 이 시점 이후, 상이한 길이의 cfDNA 단편은 유사한 비율로 분해되고 크기 프로파일은 총 cfDNA의 연속적인 감소에도 불구하고 일정하게 된다.
F. 긴 단편으로부터 염증을 결정하는 방법
이미지형성은 신장 결석을 식별할 수도 있지만, 이미지형성, 예를 들어, MRI 또는 CT 스캔으로부터 신장에서 염증의 수준을 결정하는 것은 어렵다.
도 14는 본 발명의 구현예에 따른 장기 손상 (예를 들어, 염증 수준)의 정도를 결정하기 위해 유기체의 신장의 신우로부터 소변 샘플을 분석하는 방법 (1400)의 순서도이다. 적어도 일부의 DNA는 소변 샘플에서 무세포이다. 방법 (1400)은 본 명세서에 기재된 특정 다른 방법들처럼 컴퓨터 시스템으로 전체적으로 또는 부분적으로 수행될 수 있다.
방법 (1400)은 염증의 수준 (예를 들어 병태의 수준)을 결정하는 크기 분포를 사용할 수 있다. 혈장 DNA의 크기 분포는, 예를 들어, 비제한적으로, 실시간 PCR, 전기영동 및 질량 분광분석법 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 다양한 구현예에서, 측정된 크기는 길이, 분자량, 또는 길이 또는 질량에 비례하는 측정된 파라미터, 예컨대 전기이동도에서의 이동도 및 전기영동 또는 질량 분광분석기에서의 고정된 거리를 이동하는데 요구된 시간이다. 또 다른 예에서, 삽입작용 형광 염료, 예를 들어 에티듐 브로마이드 또는 SYBR 녹색으로의 DNA를 염색할 수 있고, 여기서 결합된 염료의 양은 DNA 분자의 길이에 비례할 것이다. UV 광이 샘플에 조사되면 방출된 형광의 강도에 의해 결합된 염료의 양이 결정될 수 있다.
블록 (1410)에서, 다양한 크기에 상응하는 DNA 단편의 양이 측정된다. 복수의 크기의 각각의 크기에 대하여, 그 크기에 상응하는 소변 샘플로부터의 복수의 DNA 단편의 양이 측정될 수 있다. 예를 들어, 140 염기의 길이를 갖는 DNA 단편의 수가 측정될 수 있다. 양은 히스토그램으로 저장될 수 있다. 일 구현예에서, 생물학적 샘플로부터의 복수의 핵산 각각의 크기가 측정되며, 이는 개체 기준 (예를 들어, 참조에 대해 단일 분자 서열분석 또는 쌍으로 된-말달 서열분석 및 정렬에 의해) 또는 그룹 기준 (예를 들어, 전기 영동을 통해)으로 수행될 수 있다. 크기는 범위에 해당할 수 있다. 따라서, 특정 범위 내의 크기를 갖는 DNA 단편에 대한 양이 될 수 있다.
복수의 DNA 단편이 랜덤하게 선택될 수 있다. 예를 들어, DNA 단편은 무작위로 서열분석될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 단편으로부터 유래된 한 쌍의 서열 리드는 DNA 단편의 길이를 결정하기 위해 대상체 (예를 들어, 참조 인간 게놈)에 상응하는 게놈에 정렬될 수 있다. 다양한 구현예에서, 크기는 질량, 길이 또는 다른 적절한 크기 척도일 수 있다. 측정은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, DNA 단편의 쌍으로된-말단 서열분석 및 정렬이 수행될 수 있거나 전기 영동이 사용될 수 있다. 통계적으로 상당한 수의 DNA 단편을 측정하여 생물학적 샘플의 정확한 크기 프로파일을 제공할 수 있다. 통계적으로 상당한 수의 DNA 단편의 예는 100,000 초과; 1,000,000; 2,000,000 또는 기타 적절한 값을 포함하며, 요구된 정확도에 따라 달라질 수 있다.
일 구현예에서, 물리적 측정, 예컨대 쌍으로된-말단 서열분석 또는 전기영동으로부터 수득된 데이터는 컴퓨터에서 수신될 수 있고 DNA 단편의 크기의 측정을 수행하기 위해 분석될 수 있다. 예를 들어, 쌍으로된-말단 서열분석으로부터 서열 리드를 분석하여 (예를 들어, 정렬에 의해) 크기를 결정할 수 있다. 또 다른 예로서, 전기영동으로부터 기인하는 전기이동그림을 분석하여 크기를 결정할 수 있다. 일 실행에서, DNA 단편의 분석은 서열분석의 실제 과정 또는 DNA 단편을 전기영동으로 처리하는 것을 포함하지만, 다른 실행은 결과 데이터의 분석만을 수행할 수 있다.
블록 (1420)에서, 제1 파라미터의 제1 값은 여러 크기의 DNA 단편의 양에 기초하여 계산된다. 한 양태에서, 제1 파라미터는 생물학적 샘플에서 DNA 단편의 크기 프로파일 (예를 들어, 히스토그램)의 통계적 척도를 제공한다. 본 파라미터는 복수의 DNA 단편의 크기로부터 결정되기 때문에 크기 파라미터로서 언급될 수 있다. 일 구현예에서, 제1 파라미터는 DNA 단편의 크기가 증가함에 따라 증가한다.
제1 파라미터는 다양한 형태일 수 있다. 그와 같은 파라미터는 총 단편 수로 나눈 특정 크기에서의 수많은 DNA 단편으로, 히스토그램 (특정 크기에서의 단편의 절대적 또는 상대적 카운트를 제공하는 임의의 데이터 구조)으로부터 수득될 수 있다. 또 다른 예로서, 파라미터는 또 다른 크기 또는 범위의 수많은 단편에 의해 나누어진 특정 크기에서 또는 특정 범위 내에서의 수많은 단편일 수 있다. 분할은 다른 샘플에 대해 분석되는 상이한 수의 DNA 단편을 설명하기 위한 정규화의 역할을 할 수 있다. 정규화는 각각의 샘플에 대해 동일한 수의 DNA 단편을 분석함으로써 달성될 수 있으며, 이는 분석된 단편의 총 수로 나누는 것과 동일한 결과를 효과적으로 제공한다. 파라미터의 다른 예는 미국 특허 공보 2013/0237431에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에서 전체적으로 참고로 편입된다.
블록 (1430)에서, 제1 값은 기준값과 비교된다. 기준값의 예는 정상 값과, 정상 값으로부터 소정 거리 (예를 들어, 표준 편차 단위)인 컷오프 값을 포함한다. 기준값은 동일한 유기체로부터의 상이한 샘플으로부터 결정될 수 있다 (예를 들어 유기체가 건강하다고 알려진 경우). 따라서, 기준값은 유기체가 염증이 없는 것으로 추정되는 경우 샘플로부터 결정된 제1 파라미터의 값에 상응할 수 있다. 일 구현예에서, 생물학적 샘플은 처리 후 유기체로부터 수득되며 기준값은 처리 전의 샘플로부터 결정된 제1 파라미터의 값에 상응한다. 기준값은 또한 다른 건강한 유기체의 샘플으로부터 결정될 수 있다.
블록 (1440)에서, 신장에서의 염증 수준의 분류는 비교에 기초하여 결정된다. 다양한 구현예에서, 분류는 수치, 텍스트 또는 임의의 다른 지표일 수 있다. 분류는, 예를 들어, 초기 시간에서 유기체의 이전의 분류에 대비하여 절대 값 또는 상대 값일 수 있는 염증, 개연성 또는 다른 스코어에 대한 예 또는 아니오의 2원 결과를 제공할 수 있다. 일 실행에서, 분류는 신장이 염증을 갖지 않거나 또는 염증 수준이 감소한다는 것이다. 또 다른 실행에서, 분류는 신장이 염증을 가지고 있거나 또는 염증 수준이 증가한다는 것이다. 일 구현예에서, 제1 값이 기준값보다 클 때 제1 신장이 염증성인 것으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 염증의 수준은 염증의 존재를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 값이 초과하는지 여부(예를 들어, 제1 파라미터가 정의되는 방식에 따른 초과 또는 미만)는 염증이 존재하는지 또는 적어도 가능성 (예를 들어, 백분율 가능성)이 있는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 역치를 넘는 범위는 증가할 가능성을 제공할 수 있어, 다중 역치의 사용으로 이어질 수 있다. 추가로, 위의 정도는 다른 수준의 염증에 상당할 수 있다. 따라서, 구현예는 신장에서 염증 수준의 진행을 진단, 단계화, 예지 또는 모니터링할 수 있다
신장에서 염증의 수준에 기초하여, 치료 계획이 책정될 수 있다. 염증은 약물, 식이요법, 치료 또는 수술로 치료될 수 있다. 일부 경우에는 염증의 존재가 일찍 검출될 수 있기 때문에 염증은 본 명세서에서 기술된 방법 없이 일찍 치료될 수 있다. 검출 방법의 결과로 사망을 포함한 합병증의 위험이 감소될 수 있다.
III. 뇨의 cfDNA의 크기를 사용한 방광암 검출
암으로부터 방출된 cfDNA는 비-암성 세포로부터 방출된 cfDNA와 비교해 상이한 길이 것으로 입증되었다 (31, 32). 본 발명자들은 근육 침습성 방광암의 2가지 사례를 선정하여, 하부 요로 종양으로부터 다량의 cfDNA의 방출은 상이한 크기의 충분한 cfDNA 단편이 배뇨된 소변의 전체적인 크기 프로파일을 교란시키는데 기여할 수 있다고 추론했다. 본 발명자들은 이들 샘플에서 크기와 메틸화 패턴을 평가하기 위해 게놈-전체 바이설파이트 서열분석을 위해 라디칼 방광 적출술을 받는 이들 두 환자에 대한 수술전 및 수술후 소변 샘플을 수집했다. 결과는 방광암 사례가 긴 단편의 더 큰 비율을 갖는 뇨의 cfDNA를 가지고 있음을 보여준다.
A. 분석
도 15A 및 15B는 근육 침습성 방광암의 2가지 사례로부터의 수술전 및 수술후 소변 샘플의 크기 프로파일을 도시한다. 수술전 샘플은 라인 1502 및 1506에 의해 표시된다. 수술후 샘플은 라인 1504 및 1508에 의해 표시된다. 수술전 샘플 둘 모두는 긴 단편의 큰 비율을 갖는 비정상적인 크기 프로파일을 보이고, 크기 프로파일은 수술후 샘플에서는 정상이다. 이것은 또한 도 15A의 수술전 샘플: 중앙 131 bp, P>70 90.1%, PI 0.10; 도 15B의 수술전 샘플: 중앙 143bp, P>70 96.2%, PI 0.04; 도 15A에서 수술후 샘플: 중앙 80bp, P>70 60.0%, PI 1.6; 및 도 15B에서 수술후 샘플: 중앙 93bp, P>70 72.7%, PI 1.61과 함께 요약 크기 통계에 반영된다.
P>70 이외에도, 긴 cfDNA 단편>100 bp 또는 다른 길이의 비율이 사용될 수 있다. 도 15A 및 15B는 크기 파라미터가 암이 있는 샘플 (수술전)과 암이 없는 샘플 (수술후) 간을 구별하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
수술 후 소변에서 크기 프로파일의 정규화는 수술 전에 관찰된 긴 단편의 큰 비율이 절제된 종양에서 유래한 것을 제안하였다. 이것은 수술전 샘플에서 관찰된 큰 단편이 방광암 샘플에서 나온 것임을 시사한다. cfDNA 단편의 56.2%와 78.8%가 수술전 샘플에서 방광 종양으로부터 기인한다는 것을 보여주는 메틸화 디콘볼루션으로부터 추가의 암시를 알 수 있다. 따라서, 긴 DNA 단편의 비율은 방광암을 스크리닝하거나 재발을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 수술후 방광 종양 기여는 도 15A 및 15B에 대해 각각 4.9% 및 3.1%였는데, 이것은 긴 DNA 단편과 종양 기여 간의 관계를 확인한다.
도 16A-16C는 방광암 환자로부터 3개 배뇨 소변 샘플에 대한 크기 프로파일을 도시한다. 세 환자 모두는 근육-침습성 방광암이 있다. 3개 샘플 모두에 대해 긴 단편의 증가된 비율이 있고, 이것은 또한 크기 요약 통계 (도 16A) 중앙 131, P>70 90.1%, FI 0.10; (도 16B) 중앙 143, P>70 96.2%, FI 0.04; 및 (도 16C) 중앙 114, P>70 83.7%, FI 0.16으로 반영된다. 방광암이 있는 환자의 소변 크기 프로파일은 114-143bp의 중앙, 83-96%의 F>70 및 0.2 미만의 FI를 갖는다. 이것은 방광암 환자로부터의 소변이 긴 cfDNA 단편의 큰 비율을 가지고 크기 프로파일은 일반적으로 50-75bp 범위에서 관찰된 주기성을 결한다는 것을 반영한다.
본 발명자들은 또한 방광 종양의 경요도 절제 (TURBT)를 받은 비-근육 침습성 질환이 치료된 추가의 세 명의 방광암 사례의 수술전 소변을 서열분석했다. 한 사례는 더 긴 단편을 가진 대단히 비정상적인 크기 프로파일을 나타냈고, 반면 다른 두 사례는 정상 크기 프로파일을 보였다.
도 17A-17C는 TURBT를 받은 비-근육 침습성 방광암이 있는 3명의 환자로부터 3개 수술전 소변 샘플의 크기 프로파일을 도시한다. TBR413에서 긴 단편의 증가된 비율이 있다. 요약 크기 통계는: 중앙 114bp, P>70 83.7%, PI 0.16이다. 다른 두 개 뇨의 크기 프로파일 (TBR406 및 TBR 419)은 배뇨된 소변에 전형적인 크기 프로파일을 나타낸다. TBR413은 수술전으로 비-근육 침습성을 갖는 것으로 생각되었으나, TURBT, 및 후속적으로 요구된 라디칼 방광 적출술 후 근육-침습성 질환을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 암의 유형이 차별화될 수 있고, 비정상적인 크기 프로파일 (예를 들어, 긴 단편에 대한 통계적인 값이 역치 이상임)은 보다 진전된 질환을 시사할 수 있다. 도 17A는 도 16C와 동일한 샘플에 상당한다.
비정상적인 크기 프로파일을 갖는 경우 (TBR413)는 후속적으로 라디칼 방광 적출술을 요하는, 근육 침습이 높은 등급인 크기가 14cm의 방대한 방광 종양을 갖는 것으로 밝혀졌다. 2개의 다른 사례 (TBR406 및 409)는 TURBT 후 질환 재발이 없는 비-근육 침습성 질환을 갖는 것으로 조직학적으로 확진되었다. 이들 결과는 큰 종양 부하를 가진 근육 침습성 방광암이 비정상적인 뇨의 크기 프로파일을 발생시키기에 충분한 종양 DNA를 더 많이 분비할 가능성이 있음을 시사한다.
B. 긴 뇨의 cfDNA를 사용하여 방광암을 검출하는 방법
도 18은 본 발명의 구현예에 따른 뇨의 cfDNA의 크기를 사용하여 방광암을 검출하기 위한 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법 (1800)의 순서도를 도시한다. 소변 샘플은 정상세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포로부터 유래하는 DNA를 포함한다. 소변 샘플에서의 DNA의 적어도 일부는 무세포이다.
블록 (1810)에서, 다양한 크기에 상응하는 DNA 단편의 양이 측정된다. 복수의 크기의 각각의 크기에 대하여, 그 크기에 상응하는 소변 샘플로부터의 복수의 DNA 단편의 양이 측정될 수 있다. 블록 (1810)은 도 14의 블록(1410)과 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
블록 (1820)에서, 제1 파라미터의 제1 값은 여러 크기의 DNA 단편의 양에 기초하여 계산된다. 일 양태에서, 제1 파라미터는 생물학적 샘플에서 DNA 단편의 크기 프로파일의 통계적 척도(예를 들어, 히스토그램)를 제공한다. 일 구현예에서, 제1 파라미터는 DNA 단편의 크기가 증가함에 따라 증가한다. 크기는 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120 bp보다 큰 단편을 포함할 수 있다. 블록 (1820)은 도 14의 블록(1420)과 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
블록 (1830)에서, 제1 값은 기준값과 비교된다. 블록 (1830)은 도 14의 블록 (1430)과 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
블록 (1840)에서, 방광암의 수준의 분류가 비교에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 유기체는 제1 값이 기준값보다 클 때 방광암이 있는 것으로 결정될 수 있다. 결정은 암의 특정한 수준, 예를 들어 암이 근육 침습성인지 여부일 수 있다.
상기 결과에서 나타낸 바와 같이, 뇨의 cfDNA의 크기 프로파일 분석은 긴 단편의 예상외로 큰 비율을 갖는 소변 샘플을 확인할 수 있고 메틸화 디콘볼루션은 cfDNA 단편의 기원을 확인할 수 있다. 요상피암의 사례에서, 본 발명자들은 큰 cfDNA 단편을 확인할 수 있었고, 메틸화 디콘볼루션은 이러한 요상피암의 사례에 대한 요상피 종양 기원의 단편에서의 증가가 있다는 것을 확인하기 위해 사용되었다.
암의 수준에 기초하여, 치료 계획이 책정될 수 있다. 암은 화학요법, 약물, 식이요법, 치료 및/또는 수술로 치료될 수 있다. 일부 경우에는 암의 존재가 일찍 검출될 수 있기 때문에 암은 본 명세서에서 기술된 방법 없이 일찍 치료될 수 있다. 검출 방법의 결과로 사망을 포함한 합병증의 위험이 감소될 수 있다. 방광암은 원발성 종양의 수술적 절제 후 최대 70%의 재발율을 보인다. 비침습성 소변 검사를 정기적으로 시행하는 경우, 검사는 재발을 초기에 발견할 수 있으며, 또한 요로감염의 불편 및 위험과 관련된 감시 방광경검사의 필요성 또는 빈도를 줄일 수 있다.
C. 진전된 침습성 종양을 확인하기 위해 cfDNA 단편 크기를 사용하는 것
방광암을 검출하는 것 이외에도, cfDNA 단편의 크기는 종양 단계를 나타내기 위해 분석될 수 있다. 침습성 고등급 요상피암은 긴 단편의 큰 비율과 관련된다.
도 19A는 대조군, 비-근육 침습성 Ta-T1 질환이 있는 방광암 환자, 및 근육침습성 T2-T4 질환이 있는 방광암 환자에서 70 bp보다 더 긴 뇨의 cfDNA 단편 (P>70 bp)의 비율에 대한 상자 그림을 도시한다. 대조군과 Ta-T1 질환이 있는 방광암 환자에서 P>70 bp 사이의 유의차가 없었다. T2-T4 질환이 있는 방광암 환자는 긴 뇨의 cfDNA 단편의 큰 비율을 보였다 (Mann Whitney U 테스트 P=0.03). 그러므로, 70 bp보다 더 긴 단편의 비율은 T2-T4 질환이 있는 이들과 본 질환이 없는 이들 간을 구별하기 위해 사용될 수 있다.
도 19B는 대조군, Ta-T1 질환이 있는 방광암 환자, 및 T2-T4 질환이 있는 방광암 환자에서 105 bp보다 더 긴 뇨의 cfDNA 단편 (P>105 bp)의 비율에 대한 상자 그림을 도시한다. 대조군과 비-근육 침습성 (Ta-T1) 질환이 있는 방광암 환자에서 P>105 bp 사이의 유의차가 없었다. 근육 침습성 방광 (T2-T4) 질환은 긴 뇨의 cfDNA 단편의 큰 비율을 보였다 (Mann Whitney U 테스트 P=0.005). 따라서, 105 bp보다 더 긴 단편의 비율은 T2-T4 질환이 있는 이들과 본 질환이 없는 이들 간을 구별하기 위해 사용될 수 있다.
IV. 혈장 및 소변에서 이상의 비교
암은 전반적인 저메틸화 (33) 및 복제 수 이상 (34)에 의해 특징되어 질 수 있으며, 이들 변화는 암 환자의 혈장에서 검출되었다 (7). 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석은 1MB 빈 (또는 사전 결정된 길이 및/또는 위치를 가질 수 있는 다른 크기의 영역)에 걸친 메틸화 밀도를 결정할 수 있고 그리고 게놈에 걸친 유전자좌에 매핑된 단편의 수를 기반으로 복제 수 변화가 있는지를 결정할 수 있다. 정상 대조군에서의 메틸화 밀도 및 복제 수는 암이 없는 샘플로부터 cfDNA를 서열분석한 것을 기초로 하여 결정될 수 있다. CNA 및 메틸화 변화는 대조군과 비교하여 3보다 큰 Z-스코어 차이 (또는, 예를 들어, 원하는 감수도 및 특이성에 기초하여 선택된 다른 값)가 있는 경우에 유의성이 있다고 간주될 수 있다. 특정 역치는 다른 샘플, 예를 들어, 혈장에 대한 역치와 다른 소변 샘플에 대해 결정될 수 있다.
A. 소변에서의 이상은 종양에서의 메틸화 및 CNA 변화를 반영한다
본 발명자들은 근육 침습성 질환이 있는 방광암 환자로부터 쌍으로 된 종양 조직 및 배뇨된 소변을 수득했다. 전반적인 저메틸화가 뇨의 cfDNA 및 일차 방광 종양 둘 모두에서 나타났다. 방광 종양은 또한 게놈에 걸친 복제 수 이상을 나타냈다. 뇨의 cfDNA에서 이득과 손실의 위치는 종양에서 보이는 것과 거울상이다 (도 20). 이들 결과는 뇨의 cfDNA에서 관찰할 수 있는 저메틸화와 복사 수 이상이 일차 방광암에서 나타나는 이상을 대표한다고 제안했다.
도 20은 본 발명의 구현예에 따른 뇨의 cfDNA와 방광암 조직 사이의 전반적인 메틸화 및 복제 수 이상에서 일치도를 나타내는 Circos 플롯을 도시한다. 염색체 위치는 시계 방향으로 오름차순으로 표시된다. 중심으로부터 주변으로 4개의 고리는: 1) 방광 종양 메틸화 (고리 2002), 2) 뇨의 cfDNA 메틸화 (고리 2004), 3) 방광 종양 복제 수 (고리 2006), 및 4) 뇨의 cfDNA 복제 수 (고리 2008)를 나타낸다. 1Mb 빈에서의 전반적인 메틸화 밀도는 고리 2002와 고리 2004에, 각각 적색과 녹색 점으로 표시되는 상당한 저메틸화 및 과메틸화로 표시된다. 이들 샘플에 과메틸화는 없다. 복제 수 변화는 두 개의 외부 고리에서 나타난다. 복제 수 손실은 적색 점 (예를 들어, 점 2010)으로 표시되며 고리의 중심을 향해 놓여있다. 복제 수 이득은 녹색 점 (예를 들어, 점 2012)으로 표시되며 고리의 중심에서 멀리 떨어져 있다. 회색 점들 (예를 들어, 점 2014)은 대조군으로부터 상당한 편차를 나타내지 않는다.
도 21A-21E는 본 발명의 구현예에 따른 5명의 방광암 환자 (A-E)로부터 뇨의 cfDNA의 전반적인 메틸화 및 복제 수 이상의 Circos 플롯을 도시한다. 내부 고리 (예를 들어, 고리 2102)는 메틸화 밀도를 나타내고, 외부 고리 (예를 들어, 고리 2104)는 복제 수 변화를 나타낸다. 저메틸화 및 복제 수 손실은 적색 (예를 들어, 점 2106)으로 착색되며 고리의 중심을 향해 놓여있는 반면, 과메틸화 및 복제 수 이득은 녹색 (예를 들어, 점 2108)으로 착색되며 고리의 중심에서 멀리 떨어져 있다. 회색 점들 (예를 들어, 점 2110)은 대조군으로부터 상당한 편차를 나타내지 않는다. 도 21A에서의 데이터는 도 20에서의 뇨의 cfDNA 고리에서의 데이터에 상응한다.
본 발명자들은 4개의 샘플에서 뇨의 cfDNA에서의 전반적인 저메틸화 (도 21A, 21B, 21D 및 21E) 및 5개 샘플 모두에서의 복제 수 이상에서의 입증을 발견했다. 주목할 것은, 수술전으로 근육 침습성 질환이 갖는 것으로 확인된 2 사례는 염색체의 절반 초과에서 큰 복제 수 변화를 보였다 (도 21A 및 21B). 도 21B는 또한 저메틸화에 부가하여 과메틸화를 나타낸다. TURBT 후에 광범위한 근육 침습성 질환을 갖는 것으로 후속적으로 확인된 사례 (도 21D)는 또한 염색체 1q, 9 및 10q에서 명백한 전반적인 저메틸화 및 큰 복제 수 이득과 손실을 나타냈다. 도 21A는 도 15A에서의 수술전 크기 프로파일에 상응하는 환자 T22로부터의 결과를 도시한다. 도 21B는 도 15B에서의 수술전 크기 프로파일에 상응하는 환자 T23로부터의 결과를 도시한다. 도 21C는 도 17B에서의 TBR406이 있는 환자로부터의 결과를 도시한다. 도 21D는 도 17A에서의 TBR413이 있는 환자로부터의 결과를 도시한다. 도 21E는 도 17C에서의 TBR419가 있는 환자로부터의 결과를 도시한다. 도 21C, 도 21D, 및 도 21E는, 비-근육 침습성 질환이 있는 3가지 사례로, 수와 진폭의 관점에서 복제 수 이상의 상대적으로 미세한 입증과 온화한 저메틸화를 나타냈다.
전체 게놈 바이설파이트 서열분석은 방광암과 관련된 비정상적인 cfDNA 크기 프로파일, 복제 수, 및 전반적인 메틸화 변화의 동시 분석을 가능하게 한다. 바이설파이트 전환 동안 생체내 분해 및 cfDNA 손실에도 불구하고, 뇨의 cfDNA에서 검출된 전반적인 저메틸화 및 복제 수 이상은 원발성 종양 조직에서 보이는 변화와 밀접하게 일치한다. 따라서 이 접근법은 방광 종양을 나타내는 메틸화 상태 및 복제 수 변화를 평가하는 비침습성 방법을 제공한다.
복제 수 이상은 방광암에서 통상적으로 관측된다 (38). 이들 변화는 방광암 환자로부터의 5개 소변 샘플 모두에서 관측가능하였다. 복제 수 이상은 또한 매우 낮은 등급 질환도 검출할 수 있다.
게다가, 근육 침습성 질환 및 높은 종양 부하를 가진 사례는 크기 프로파일, 복제 수, 및 전반적인 저메틸화의 두드러진 작은 변화를 나타낼 가능성이 더 크다. 단일 바이설파이트 서열분석 수행으로부터의 이들 분석의 조합의 가능화는 방광암 사례의 검출을 용이하게 할 수 있고 또한 보다 진행성 질환이 있는 사례를 구별할 수 있다. 방광 종양 및 소장 기여에서의 상응하는 변화를 검출하기 위한 메틸화 디콘볼루션의 능력은 또한 이 방법이 다른 비뇨기, 신장 또는 전신 병태의 검출을 위해 뚜렷한 메틸롬 패턴을 갖는 cfDNA를 방출하는 세포로부터의 증가된 기여의 검출에 대해 연장될 수 있음을 시사한다.
본 발명자들은 소변으로부터의 cfDNA, 및 또한 방광 종양 (등급 3 요상피암종, T3)으로부터 추출된 DNA를 서열분석했고, 그리고 소변에서 관찰된 CNA 및 전반적인 1MB 저메틸화가 방광 종양의 변화와 매우 유사하다는 것을 발견하였다.
도 22A 및 22B는 T22에 대한 방광암 종양 (22A) 및 cf 소변 (22B)에 대한 Circos 플롯을 도시한다. 내부 고리 (예를 들어, 고리 2202)는 메틸화 밀도를 나타내고, 외부 고리 (예를 들어, 고리 2204)는 복제 수 변화를 나타낸다. 저메틸화 및 복제 수 손실은 적색 (예를 들어, 점 2206)으로 착색되며 고리의 중심을 향해 놓여있는 반면, 과메틸화 및 복제 수 이득은 녹색 (예를 들어, 점 2208)으로 착색되며 고리의 중심에서 멀리 떨어져 있다. 회색 점들 (예를 들어, 점 2210)은 대조군으로부터 상당한 편차를 나타내지 않는다. 방광암 종양과 cf 소변의 circos 플롯을 비교하면, 둘 모두에서 전반적인 저메틸화가 있다. 또한 방광 종양과 소변에 다수의 CNA가 있으며 이 이상의 위치는 둘 모두에서 거의 동일하다. 유사성의 결과로, cf 소변 이상이 방광 종양을 검출하는 데 사용될 수 있다. 도 22B는 도 20에 대해 사용된 동일한 샘플에 상응한다.
B. 방광암으로 상승된 과메틸화
과메틸화에 대한 cfDNA를 분석하여 암을 검출하는 것은 통상적인 것이 아니지만, 본 발명자들은 과메틸화가 암의 수준의 분류를 결정하는 데 또한 사용될 수 있음을 발견했다. 본 발명자들은 뇨의 cfDNA에 기여하는 정상 조직 (혈구, 신장, 요로상피)에서 일관되게 비메틸화된 (예를 들어, <2%) 1,082,774 CpG 부위를 확인했다. 비메틸화는 2%, 5%, 또는 10% 미만으로 메틸화된 부위를 지칭할 수 있다. 이들 부위는 종양에서 보다 통상적으로 메틸화되고 따라서 정상 조직에 비교하여 과메틸화된다. 예로서, 과메틸화된 부위는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 초과로 메틸화될 수 있다. 본 발명자들은 방광암 사례 및 대조군으로부터의 소변 샘플에서 이들 CpG 부위에서의 전체적인 메틸화 밀도를 계산했다.
도 23A는 이들 1,082,774 CpG 부위에서 방광암 사례 및 대조군에서 전체적인 과메틸화 밀도의 상자그림을 도시한다. 방광암 사례는 대조군과 비교하여 더 높은 전체적인 메틸화 밀도를 나타냈다. 도 23B는 암을 검출하기 위해 과메틸화 밀도를 사용하기 위한 ROC 곡선을 도시한다. AUC는 0.814였다.
C. 수술전 소변에서의 CNA 및 저메틸화는 수술후 소변에서 사라진다
도 24A-24D는 라디칼 방광 적출술 (T22 및 T23)을 당한 2명의 방광암 환자의 수술전 (도 24A 및 도 24C) 및 수술후 (도 24B 및 도 24D) cf 소변을 도시한다. 내부 고리 (예를 들어, 고리 2402)는 메틸화 밀도를 나타내고, 외부 고리 (예를 들어, 고리 2404)는 복제 수 변화를 나타낸다. 저메틸화 및 복제 수 손실은 적색 (예를 들어, 점 2406)으로 착색되며 고리의 중심을 향해 놓여있는 반면, 과메틸화 및 복제 수 이득은 녹색 (예를 들어, 점 2408)으로 착색되며 고리의 중심에서 멀리 떨어져 있다. 회색 점들 (예를 들어, 점 2410)은 대조군으로부터 상당한 편차를 나타내지 않는다. 방광암과 관련된 CNA 및 저메틸화는 수술전 소변에서 분명히 관측가능한 반면 (도 24A 및 24C) 수술후 샘플에서 cf 소변 (도 24B 및 24D)은 암이 없는 대조군과 비교할만한 복제 수 및 메틸화 수준으로 정상화한다.
도 25A-25D는 2명의 환자에 대한 전반적인 메틸화 및 CNA에 대한 수술전 및 수술후 Circos 플롯을 도시한다. 도 25A 및 도 25B는 3cm T1HG 질환이 있는 환자에 대해 수술전 및 수술후 circos 플롯이다. 수술후 Circos 플롯은 수술전 샘플에서 나타난 전반적인 저메틸화 및 CNA의 청소능을 도시한다. 병리학은 요상피 종양에 대한 명확한 증거를 확인하였고 수술후 샘플이 수득된 환자에서 재발을 전개하지 않았다.
도 25C 및 도 25D는 T3a HG 질환이 있는 환자에 대해 수술전 및 수술후 circos 플롯이다. 수술후 circos 플롯은 전반적인 저메틸화 및 CNA의 지속됨을 도시한다. 병리학 보고는 절제 가장자리에 존재하는 종양이 있는 근육 침습성 질환의 존재와 잔존 질환의 존재를 확인했다. 따라서, 전체 게놈 바이설파이트 서열분석은 잔존 질환의 존재를 찾기 위해 이용될 수 있으며 방광암 치료를 받는 환자에서 종양 유래된 cfDNA에 대한 종방향 모니터링에 사용될 수 있다.
메틸화 수준 및 복제 수 이상의 분석은 암 치료 (수술 포함)의 성공 여부를 평가하는 데 도움이 될 수 있다. 또한, 본 분석은 암의 차도, 진행 또는 중증도를 모니터링할 수 있다.
D. CNA 및 저메틸화는 무세포 소변 및 소변 펠릿에서 검출될 수 있다
도 26은 낮은 악성 잠재성 (PUNLMP)을 갖는 비침습성 (Ta) 유두상 요상피 신생물이 있는 방광암 환자에서 메틸화 및 복제 수 이상을 도시하는 Circos 플롯이다. 내부 고리는 메틸화 밀도를 나타내고, 외부 고리는 복제 수 변화를 나타낸다. 저메틸화 및 복제 수 손실은 적색으로 착색되며 고리의 중심을 향해 놓여있는 반면, 과메틸화 및 복제 수 이득은 녹색으로 착색되며 고리의 중심에서 멀리 떨어져 있다. 회색 점들은 대조군으로부터 상당한 편차를 나타내지 않는다. 도면에서의 데이터는 환자의 소변을 서열분석한 것으로부터 수득되었다. 염색체 10에서 복제수 이득 (부문 2602)이 낮은 등급 조직학으로 매우 저등급 질환이 있는 이 환자에서 관찰될 수 있었다. 그러므로, 저등급 질환 또는 조기 암이 복제 수 이상을 사용하여 확인될 수 있다.
소변 샘플은 원심 분리에 의해 세포 및 무세포 부분으로 분리될 수 있으며, 무세포 부분은 추가로 여과된다. 대부분의 소변 샘플에는 작지만 가시적인 소변 펠릿으로, 이 소변에서 DNA가 추출될 수 있다. 소변 펠릿은 3000 x g에서의 원심분리 후 튜브의 바닥에 있는 내용물일 수 있으며, 세포물질을 포함할 수 있다. 본 발명자들은 방광암 소변 샘플에서 DNA를 추출하여 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석을 수행했다.
도 27A 및 27B는 동일한 소변 배출물로부터 수득된 방광암 환자 (T23)로부터의 cf 소변 (도 27A) 및 소변 펠릿 (도 27B)에 대한 Circos 플롯 을 도시한다. 내부 고리 (예를 들어, 고리 2702)는 메틸화 밀도를 나타내고, 외부 고리 (예를 들어, 고리 2704)는 복제 수 변화를 나타낸다. 저메틸화 및 복제 수 손실은 적색 (예를 들어, 점 2706)으로 착색되며 고리의 중심을 향해 놓여있는 반면, 과메틸화 및 복제 수 이득은 녹색 (예를 들어, 점 2708)으로 착색되며 고리의 중심에서 멀리 떨어져 있다. 회색 점들 (예를 들어, 점 2710)은 대조군으로부터 상당한 편차를 나타내지 않는다. 현재로 실질적인 양으로 DNA가 추출될 때, 소변 펠릿이 서열분석되어 방광암을 반영하는 전반적인 저메틸화 및 CNA을 나타낼 수 있다. 소변 펠릿에서 저메틸화 및 CNA의 위치는 cf 소변에서 관찰된 변화와 비교할만하다.
소변 펠릿 크기는 상이한 샘플 간에 다양하다. 일부 소변 샘플은 원심분리 후 가시적인 소변 펠릿이 없다 (즉, 낮은 세포 함량). 도 27A 및 27B에서, 소변 펠릿에서 저메틸화와 CNA의 진폭은 무세포 DNA와 비교하여 더 높았으며, 이는 펠릿 기반 CNA가 특정 경우에 더 민감할 수 있음을 시사한다. 소변 펠렛이 존재할 때, 종양 세포로부터의 비례 기여는 일부 경우에서 더 높을 수 있다.
소변 펠릿 분석은 정상적으로 세포학에 의해 분석된다. 구현예들에서, 소변 펠릿은 서열분석될 수 있다. 소변 펠렛은 cfDNA와 유사하게 서열분석될 수 있다. 일부 사례에서, 소변 펠릿 DNA는 cfDNA와 동일하거나 유사한 기술에 의해 서열분석되는 더 작은 크기의 DNA를 형성하기 위해 단편화 (예를 들어, 초음파 처리)될 수 있다. 따라서, 소변 펠릿의 분석은 cf 소변과 같이 질환을 검출하기 위해 동일하거나 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 소변 펠렛의 분석은 cf 소변의 분석과 조합할 때 특이성 및/또는 민감성을 증가시킬 수 있다.
E. CNA 및 전반적인 저메틸화는 소변에서 검출될 수 있지만 혈장에서는 그렇지 않다
전이의 입증이 없는 방광암이 있는 2명의 환자에서, CNA 및 저메틸화가 혈장의 cfDNA에서가 아닌 소변의 cfDNA에서 검출되었다.
도 28A-28D는 2명의 방광암 환자 (T22 및 T23)로부터 cf 소변 (도 28A 및 도 28C) 및 혈장 (도 28B 및 도 28D)에 대한 Circos 플롯을 도시한다. 내부 고리는 메틸화 밀도를 나타내고, 외부 고리는 복제 수 변화를 나타낸다. 저메틸화 및 복제 수 손실은 적색으로 착색되며 고리의 중심을 향해 놓여있는 반면, 과메틸화 및 복제 수 이득은 녹색으로 착색되며 고리의 중심에서 멀리 떨어져 있다. 회색 점들은 대조군으로부터 상당한 편차를 나타내지 않는다. 소변 및 혈장 샘플은 동시에 수득되었다. 이들 도면은, 메틸화 수준 및 복제 수 이상은 혈장에서 나타나지 않거나 분명히 나타나지 않기 때문에 메틸화 수준 또는 복제 수에 기초하여 방광암을 검출하는 것은 혈장의 cfDNA에 비교하여 소변의 cfDNA에서 더 쉬울 것이라는 것을 도시한다.
도 29A 및 29B는 2명의 방광암 사례인, T22 및 T23에 대해 CNA 또는 저메틸화의 입증을 나타내는 게놈에 걸친 1MB 빈의 백분율을 도시한다. T23의 경우, 예를 들어 염색체 5p에서, 혈장에서 CNA의 입증이 있다. 이 복제 수 이득은 또한 소변의 cfDNA에서는 가시적이지만, 다른 CNA 및 전반적인 저메틸화는 혈장과 비교하여 소변에서 훨씬 더 분명하다. T23은 네오-아쥬반트 화학요법의 과정을 완료했지만 라디칼 방광 적출술 후 후속적으로 ~6개월 후에 뇌 전이를 일으켰다. 이들 그래프는 또한 보다 많은 빈이 혈장보다 소변에서의 CNA 또는 저메틸화를 나타내기 때문에 혈장의 cfDNA에 비해 소변의 cfDNA에서 메틸화 수준 또는 복제 수를 기준으로 한 방광암을 검출하는 것이 더 쉬울 것이라는 것을 보여준다.
F. 특정 장기에서 암을 확인하는 방법
도 30은 본 발명의 구현예에 따른 대상체의 제1 샘플 및 혈액 샘플을 분석하여 대상체의 제1 장기에서 암을 확인하는 방법을 나타내는 순서도이다. 제1 샘플은 제1 장기로부터의 것이거나 또는 제1 샘플이 유기체를 빠져나올 때 제1 장기를 통과하며 혈액 샘플과 다르다. 제1 샘플과 혈액 샘플은 모두 정상 세포에서 유래된 DNA와 잠재적으로 암과 관련된 세포로부터 유래된 DNA를 포함한다. 제1 샘플과 혈액 샘플 둘 모두에서 적어도 일부의 DNA는 무세포이다. 제1 샘플의 예는 소변, 타액 또는 대변이다.
블록 (3010)에서, 생물학적 샘플로부터의 다수의 DNA 분자가 분석된다. DNA 분자의 분석은 유기체의 게놈에서 DNA 분자의 위치를 확인하는 것과 선택적으로 DNA 분자가 하나 이상의 부위에서 메틸화되어 있는지 여부를 결정하는 것 (예를 들어, 메틸화 분석이 수행될 때)을 포함할 수 있다. 메틸화 상태는 특정 시토신 잔기가 5-메틸시토신인지 또는 5-하이드록시메틸시토신인지 여부를 포함할 수 있다.
분석은 메틸화-인지 서열분석으로부터 서열 리드를 수령함으로써 수행될 수 있으며, 따라서 DNA로부터 이전에 수득된 데이터에 대해서만 분석이 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 분석은 실제 서열분석 또는 데이터를 얻는 다른 활성 단계를 포함할 수 있다. 서열 리드는 다양한 서열분석 기술, PCR 기술, 어레이 및 단편의 서열을 확인하기 위한 다른 적합한 기술로부터 얻을 수 있다. 서열 리드 부위의 메틸화 상태는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 얻어질 수 있다.
메틸화-인지 서열분석의 한 예는 아황산수소 나트륨으로 DNA를 처리하고 그 다음 DNA 서열분석을 수행하는 것을 포함한다. 또 다른 예로서, DNA 분자 (N6-메틸아데닌, 5-메틸시토신 및 5-하이드록시메틸시토신을 포함함)의 메틸화 상태가 바이설파이트 전환 없이 직접적으로 밝혀 질 수 있는 단일 분자 서열분석 플랫폼을 사용 (AB Flusberg et al. 2010 Nat Methods; 7: 461-465; J Shim et al., 2013 Sci Rep; 3: 1389, doi: 10.1038/srep01389)하거나; 또는 메틸화된 시토신 (예를 들어, 메틸시토신에 대한 항체를 사용함에 의하거나 또는 메틸화된 DNA 결합 단백질 또는 펩타이드를 사용함에 의함 (LG Acevedo et al. 2011 Epigenomics; 3: 93-101)의 면역 침강과 이어서 서열분석을 통하거나; 또는 메틸화-민감성 제한효소의 사용과 이어서 서열분석을 통해, 아황산수소 나트륨을 사용하지 않고 메틸화-인지 서열분석이 수행될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 어레이, 디지털 PCR 및 질량 분광분석법과 같은 비-서열 분석기술이 사용된다.
블록 (3020-3050)은 대상체의 복수의 염색체 영역의 각각의 염색체 영역에 대해 반복된다. 복수의 염색체 영역은 중첩되지 않을 수 있다. 게놈은 길이가 1 메가염기 (Mb)인 영역 또는 500Kb 또는 2Mb와 같은 다른 분절 길이로 분리될 수 있다. 영역은 크기가 1Mb이거나 일부 다른 동등-크기일 수 있다. 전체 게놈은 그런 다음 약 3,000개의 영역을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 사전 결정된 크기 및 위치일 수 있다. 또한, 상기에서 언급된 바와 같이, 이러한 사전 결정된 영역은 특정 염색체의 길이 또는 사용되는 특정 수의 영역 및 본 명세서에 언급된 임의의 다른 기준을 수용하도록 변할 수 있다. 영역이 상이한 길이를 갖는 경우, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 이러한 길이를 사용하여 결과를 정규화할 수 있다.
블록 (3020)에서, 염색체 영역이 복제 수 이상 또는 저메틸화의 비정상을 나타내는지 여부의 분류가 제1 샘플 및 혈액 샘플 각각에 대해 결정된다. 블록 (3020)은 블록 (3030-3050)을 수행함에 의해 시행될 수 있다. 복제 수 이상 또는 저메틸화의 검출에 대한 추가의 세부사항은 아래에서 발견될 수 있다: 전체적으로 참고로 편입된, 미국 특허 번호 8,741,811 및 9,121,069, 및 PCT 공개공보 WO2014/043763.
블록 (3030)에서, 각각의 샘플로부터의 DNA 분자의 각각의 그룹은 확인된 위치에 기초하여 염색체 영역으로부터 존재하는 것으로 확인된다. 각각의 그룹은 염색체 영역의 각각의 복수의 유전자좌에 위치한 적어도 하나의 DNA 분자를 포함한다. 일 구현예에서, 본 그룹은, 예를 들어, 전체적으로 참고로 편입된, 미국 특허 번호 9,121,069에 기재된 바와 같이 염색체 영역의 특정 일배체형에 정렬되는 단편일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 그룹은, 예를 들어 미국 특허 번호 9,121,069에 또한 기재된 바와 같이 염색체 영역에 정렬하는 임의의 단편의 것일 수 있다.
블록 (3040)에서, 컴퓨터 시스템은 각각의 DNA 분자 군의 각각의 값을 계산한다. 각각의 값은 각각의 그룹의 DNA 분자의 특성을 정의한다. 본 특성은 메틸화 수준, 제1 각 그룹의 DNA 분자의 양 또는 제1 각 그룹의 DNA 분자의 크기 프로파일의 통계적인 값일 수 있다. 양의 예로서, 각각의 값은 또한 정규화된 값, 예를 들어, 샘플에 대한 총 태그 카운트의 수 또는 참조 영역에 대한 태그 카운트의 수로 나눠진 영역의 태그 카운트일 수 있다. 각각의 값은 또한 또 다른 값 (예를 들어, 다른 일배체형에 대한 값)과의 차이 또는 비율일 수 있으며, 이에 따라 영역에 대한 차이의 특성을 제공할 수 있다.
블록 (3050)에서, 각각의 값은 제1 염색체 영역이 비정상, 예를 들어, 결실 또는 증폭의 복제 수 이상, 저메틸화 또는 과메틸화의 메틸화 비정상, 또는 불일치를 나타내는지 여부의 분류를 결정하기 위해 기준값과 비교된다. 이 기준값은 본 명세서에 기재된 임의의 역치 또는 기준값일 수 있다. 예를 들어, 기준값은 정상 샘플에 대해 결정된 역치일 수 있다. 일배체형 간의 차이가 사용될 때, 각각의 값은 2개의 일배체형에 대한 태그 카운트의 차이 또는 비율 일 수 있고, 기준값은 통계적으로 상당한 편차가 존재하는지를 결정하기 위한 역치일 수 있다. 또 다른 예로서, 기준값은 또 다른 일배체형 또는 영역에 대한 태그 카운트 또는 크기 값일 수 있으며, 비교는 차이 또는 비율 (또는 그와 같은 함수)을 취한 다음 그 차이 또는 비율이 역치 값보다 큰지 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
기준값은 다른 영역의 결과에 기초하여 변할 수 있다. 예를 들어, 인접하는 영역들이 편차 (비록 하나의 역치, 예를 들어, 3의 z-점수와 비교하여 작지만)를 나타내면, 더 낮은 역치가 사용될 수 있다. 예를 들어, 세 개의 연속적인 영역이 모두 제1 역치보다 높으면, 암이 더 많이 발생할 수 있다. 따라서,이 제1 역치는 비-연속적인 영역으로부터 암을 확인하는데 필요한 또 다른 역치보다 낮을 수 있다. 더욱 작은 편차를 갖는 3개의 영역 (또는 3개 초과)을 갖는 것은 민감성 및 특이성이 보존될 수 있는 기회 효과의 낮은 충분한 개연성을 가질 수 있다.
블록 (3060)에서, 제1 수준의 암은 제1 샘플에 대한 비정상을 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제1 양이 제1 역치 이상인지의 여부에 기초하여 결정된다. 예로서, 제1 수준의 암에 상응하는 분류는 유기체가 암, 암의 단계 및 암의 예후를 갖는지의 여부일 수 있다. 일 구현예에서, 모든 비정상적인 영역이 카운트되고 단일 역치 값이 영역이 어디에서 나타나는지에 무관하게 사용된다. 또 다른 구현예에서, 역치 값은 카운트된 영역의 위치 및 크기에 기초하여 변할 수 있다. 예를 들어, 특정 염색체 또는 염색체의 암 상의 영역의 양은 그 특정 염색체 (또는 암)에 대한 역치와 비교될 수 있다. 여러 역치가 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 염색체 (또는 암) 상의 비정상적인 영역의 양은 제1 역치 값보다 커야하고, 게놈 내의 비정상적인 영역의 총량은 제2 역치 값보다 커야 한다.
블록 (3070)에서, 제2 수준의 암은 혈액 샘플에 대한 비정상을 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제2 양이 제2 역치 이상인지의 여부에 기초하여 결정된다. 블록 (3070)은 블록 (3060)과 유사한 방식으로 수행될 수 있다.
블록 (3080)에서, 제1 수준의 암이 대상체가 암을 갖는 것을 나타내고 제2 수준의 암이 대상체가 암을 갖지 않는다는 것을 나타낼 때 대상체는 제1 장기의 암을 갖는다고 결정된다. 그와 같은 시나리오는 도 28A-28D에 예시되어있다. 따라서, 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석은 또한 요상피암 환자의 무세포 소변 및 소변 펠릿에서 전반적인 저메틸화 및 복제 수 이상 (CNA)을 또한 확인할 수 있다. 이들 변화는 방광 종양에서 볼 수 있는 변화와 일치하며, 체순환계에서는 검출 불가능하다.
암의 결정 후, 치료 계획이 책정될 수 있다. 암은 화학 요법, 약물, 식이요법, 치료 및/또는 수술로 치료될 수 있다. 일부 경우에 암의 존재가 일찍 검출될 수 있기 때문에 암은 본 명세서에서 기술된 방법 없이 일찍 치료될 수 있다. 검출 방법의 결과로 사망을 포함한 합병증의 위험이 감소될 수 있다.
G. CNA에 대한 암의 수준 결정
블록 (3060 및 3070) 내의 영역의 양에 대한 역치 값은 카운트된 영역에 대한 불균형이 얼마나 강한 지에 의존할 수 있다. 예를 들어, 암의 분류를 결정하기 위한 역치로 사용되는 영역의 양은 각각의 영역에서의 비정상을 검출하는 데 사용되는 특이성 및 민감성 (비정상적인 역치)에 의존할 수 있다. 예를 들어, 비정상적인 역치가 낮다면 (예를 들어, 2의 z-점수), 역치 양이 높게 (예를 들어, 150)되도록 선택될 수 있다. 그러나, 비정상적인 역치가 높다면 (예를 들어, 3의 z-점수), 역치 양이 낮게 (예를 들어, 50)될 수 있다. 비정상을 나타내는 영역의 양은 가중치가 될 수도 있고, 예를 들어, 높은 불균형을 나타내는 일 영역은 단지 약간 불균형을 나타내는 영역보다 높게 가중될 수 있다 (즉, 비정상에 대해 단지 양성 및 음성보다 더 많은 분류가 있음).
따라서, 정규화된 태그 카운트 (또는 그룹의 특성에 대해 다른 각각의 값)의 상당한 과대- 또는 과소-발현을 나타내는 염색체 영역의 (수 및/또는 크기를 포함할 수 있는) 양은 질환의 중증도를 반영하기 위해 사용될 수 있다. 비정상적인 정규화된 태그 카운트를 갖는 염색체 영역의 양은 종양 조직에서의 염색체 이상의 수 (또는 크기) 및 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈장)에서의 종양-유래된 DNA의 분획 농도인, 2가지 인자에 의해 결정될 수 있다. 더 진행된 암은 더 많은 (그리고 더 큰) 염색체 이상을 나타내는 경향이 있다. 그러므로, 보다 암-관련된 염색체 이상이 샘플 (예를 들어, 혈장)에서 잠재적으로 검출될 수 있다. 보다 진행된 암이 있는 환자의 경우, 종양 부하가 높을수록 혈장 내 종양-유래된 DNA의 분획 농도가 높아질 것이다. 그 결과, 종양-관련된 염색체 이상이 혈장 샘플에서보다 쉽게 검출될 수 있다.
암 스크리닝 또는 검출의 맥락에서, 정규화된 태그 카운트 (또는 다른 값)의 과대- 또는 과소-발현을 나타내는 염색체 영역의 양은 시험된 대상체가 암을 가질 가능성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. ±2 (즉 z-점수>2 또는 <-2)의 컷오프를 사용하면, 시험된 영역의 대략 5%가 단지 우연히 대조군 대상체의 평균에서 크게 벗어나는 z-점수를 제공할 것으로 기대된다. 전체 게놈을 1Mb 분절로 나누면, 전체의 게놈에 대해 대략 3,000개의 분절이 있게 될 것이다. 따라서 약 150개의 분절은 >2 또는 <-2의 z-점수를 가질 것으로 기대될 것이다.
따라서, z-점수 >2 또는 <-2를 갖는 분절의 수에 대한 150의 컷오프 (역치) 값은 암이 존재하는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 비정상 z-점수를 갖는 분절의 수에 대한 다른 컷오프 값 (예를 들어, 100, 125, 175, 200, 250, 및 300)은 진단 목적에 적합하도록 선택될 수 있다. 낮은 컷오프 값, 예를 들어 100은 더 민감한 검사를 초래하지만 특이성이 낮아지고, 그리고 더 높은 컷오프 값은 보다 구체적이지만 덜 민감하다. 가-양성 분류의 수는 z-점수의 컷오프 값을 증가시킴으로써 감소될 수 있다. 예를 들어, 컷오프 값을 3으로 증가시키면 분절의 0.3% 만 가성으로 양성으로 될 것이다. 이 상황에서 비정상적인 z-점수를 갖는 3개 초과의 분절이 암의 존재를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 다른 진단 목적에 맞추기 위해, 예를 들어 1, 2, 4, 5, 10, 20, 및 30 같은 다른 컷오프 값들이 또한 선택될 수 있다. 그러나, 암-관련된 염색체 이상을 검출하는 민감성은 진단을 내리는 데 필요한 비정상적인 분절의 수가 증가함에 따라 감소할 것이다.
특이성을 희생시키지 않고 민감성을 향상시키는 하나의 가능한 접근법은 인접한 염색체 분절의 결과를 고려하는 것이다. 일 구현예에서, z-점수에 대한 컷오프는 >2 및 <-2로 유지한다. 그러나, 염색체 영역은 단지 2개의 연속적인 분절이 동일한 유형의 이상을 나타내는 경우, 예를 들어 양 분절이 >2의 Z-점수를 가지는 경우에만 잠재적으로 비정상적인 것으로 분류될 것이다. 정규화된 태그 카운트의 편차가 임의 오류인 경우, 두 개의 연속적인 분절이 동일한 방향으로 가성으로 양성이 될 개연성은 0.125% (5% x 5%/2)일 것이다. 다른 한편으로, 염색체 이상이 두 개의 연속적인 분절을 포함한다면, 보다 낮은 컷오프 값은 혈장 표본에서의 분절의 과대- 또는 과소-발현의 검출을 더욱 민감하게 만들 것이다. 대조군 대상체의 평균으로부터의 정규화된 태그 카운트 (또는 다른 값)의 편차가 무작위 오차로 인한 것이 아니기 때문에, 연속적인 분류 요건은 민감성에 대해 상당한 효과를 미치지 않을 것이다. 다른 구현예에서, 인접하는 분절의 z-점수는 더 높은 컷오프 값을 사용하여 함께 첨가될 수 있다. 예를 들어, 세 개의 연속적인 분절의 z-점수가 합산될 수 있고 5의 컷오프 값이 사용될 수 있다. 이 개념은 세 개 초과의 연속적인 분절로 확장될 수 있다.
양과 비정상적인 역치의 조합은 또한 분석의 목적 및 유기체에 대한 임의의 사전 지식 (또는 그 부족)에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 암에 대한 정상적인 건강한 모집단을 스크리닝하는 경우, 잠재적으로 영역의 양 (즉, 영역의 수에 대한 높은 역치)과 영역이 이상을 갖는 것으로 식별된 경우의 비정상적인 역치 둘 모두에서 전형적으로 높은 특이성이 사용될 것이다. 그러나 위험이 더 높은 환자 (예를 들어, 혹이나 가족력, 흡연자, HPV 바이러스, 간염 바이러스 또는 다른 바이러스를 호소하는 환자)에서 더 높은 민감성 (더 적은 거짓 음성)을 갖도록 하기 위해 역치가 낮아질 수 있다.
일 구현예에서, 염색체 이상을 검출하기 위한 종양-유래된 DNA의 6.3%의 더 낮은 검출 한계와 1-Mb 분할을 사용하는 경우, 각각의 1-Mb 분절 내 분자의 수는 60,000일 필요가 있다. 이것은 전체 게놈에 대해 대략 1억8천만 (60,000 리드/Mb x 3,000 Mb) 정렬가능 리드로 번역된다.
H. 메틸화에 대한 암의 수준 결정
메틸화에 대해, 양태는 CNA와 동일할 수 있다. 일 구현예에서, 모든 영역에 대한 메틸화 수준이 결정되고 역치 값과 비교될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 메틸화 수준은 메틸화 수준이 기준값을 초과하는 다수의 영역에 상응할 수 있다. 예를 들어, 유기체의 게놈의 복수의 영역이 식별될 수 있다. 영역은 본 명세서에 언급된 기준, 예를 들어 특정 길이 또는 특정 수의 부위를 사용하여 식별될 수 있다. 하나 이상의 부위 (예를 들어, CpG 부위)가 각각의 영역 내에서 식별될 수 있다. 영역 메틸화 수준은 각각의 영역에 대해 계산될 수 있다. 제1 메틸화 수준은 제1 영역에 대한 것이다. 영역 메틸화 수준의 각각은 영역 간에 동일하거나 다를 수 있는 각각의 영역 컷오프 값과 비교된다. 제1 영역에 대한 영역 컷오프 값이 제1 컷오프 값이다. 각각의 영역 컷오프 값은 참조 메틸화 수준으로부터 명시된 양 (예를 들어, 0.5) 일 수 있어, 그렇게함으로써 비-암 대상체로부터 결정될 수 있는, 참조로부터 유의차가 있는 영역만을 계수한다.
영역 메틸화 수준이 각각의 영역 컷오프 값을 초과하는 영역의 제1 수가 결정될 수 있고, 역치 값과 비교되어 분류를 결정할 수 있다. 일 실행에서, 역치 값은 백분율이다. 제1 수를 역치 값과 비교하는 것은, 예를 들어 정규화 과정의 일부로서 역치 값과 비교하기 전에 제1 수의 영역을 제2 수의 영역 (예를 들어, 모든 영역)으로 나누는 것을 포함할 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 생물학적 샘플 중의 종양 DNA의 분획 농도는 제1 컷오프 값을 계산하는데 사용될 수 있다. 본 분획 농도는 간단하게 최소값보다 큰 것으로 추정될 수 있는 반면, 최소값보다 낮은 분획 농도를 갖는 샘플은, 예를 들어 분석에 적합하지 않은 것으로 표시될 수 있다. 최소값은 참조 메틸화 수준에 대한 종양의 메틸화 수준에서의 예상되는 차이에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 차이가 0.5 (예를 들어, 컷오프 값으로 사용된 바와 같음)인 경우, 특정 종양 농도는 이 차이를 알 만큼 충분히 높아야 할 필요가 있다.
V. CNA, 전반적인 메틸화, 및 종양 기여의 조합
전체 게놈 바이설파이트 서열분석은 전반적인 메틸화 상태, 복제 수 이상 (CNA), 및 메틸화 디콘볼루션에 의한 방광 종양 기여의 동시 평가를 가능하게 한다. 본 발명자들은 46명의 방광암 환자 및 39명의 대조군에서 방광 암을 검출하는 이들 분석 방법에 대한 능력을 평가했다. 본 발명자들은 대조군의 평균값에 기초한 정상인 상한치 플러스 3개 표준편차를 확립했다. 대조군은 이들 기준을 사용하여 양성인 것으로 시험되지 않아, 100%의 특이성을 제공했다.
A. 파라미터 조합에 대한 민감성 및 특이성 결과
도 31A-31C는 46명의 방광암 환자 및 39명의 대조군에 대한 저메틸화를 갖는 1mb 빈의 백분율, 복제 수 이상을 갖는 1mb 빈의 백분율 및 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여에 대한 상자그림을 각각 도시한다. 도 31D-31F는 저메틸화에 대한 상응하는 ROC 곡선을 도시하고, 여기서 도 31D는 도 31A에 상응하는 ROC 곡선을 도시하고, 도 31E는 도 31B에 상응하는 ROC 곡선을 도시하고, 그리고 도 31F는 도 31C에 상응하는 ROC 곡선을 도시한다. 방광 종양 기여는 상이한 조직에 걸쳐 다양한 조직-특이적 메틸화 서명 및 또한 비-조직-특이적 메틸화 서명을 사용하여 유래되었다.
저메틸화 (도 31A), CNA (도 31B), 및 방광 종양 기여 (도 31C)를 갖는 1mb 빈의 비율은 대조군과 비교하여 방광암 사례에서 상당히 더 높았다 (Mann Whitney U 테스트 P<0.001). 대조군의 평균 플러스 3개 표준편차를 정상인 상한치로 사용하여, 양성으로 시험된 대조군은 없었다. 동일한 컷오프를 사용하여, 3개 파라미터 중 적어도 하나로 46명의 방광암 사례 중 43명이 확인될 수 있었다.
상당한 저메틸화를 갖는 1 mb 빈의 백분율을 사용하여, 본 발명자들은 71.7%의 감수성 (ROC AUC=0.93)으로 방광암을 검출할 수 있었다 (도 31D). 상당한 CNA를 갖는 1 mb 빈의 백분율을 사용하여, 본 발명자들은 63.0% (ROC AUC=0.90)로 방광암을 검출할 수 있었다 (도 31E). 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여를 사용하여, 본 발명자들은 78.3%의 감수성 (ROC AUC=0.93)으로 방광암을 검출할 수 있었다. 세 가지 파라미터 중 하나가 암을 나타내면 암이 검출된 것으로 고려하여 세 가지 파라미터는 조합될 수 있다. 세 가지 파라미터를 모두 합하면, 세 가지 파라미터 중 적어도 하나에 대해 양성 반응을 보인 방광암 사례의 경우에 대해 민감성이 93.4%로 증가되었다. 특이성은 100%였다. 세 가지 파라미터를 모두 합하면, 높은 등급 또는 침습성 질환 (T1 이상)을 가진 29개 모든 사례가 검출될 수 있었다.
파라미터의 임의의 조합이라도 암을 나타낼 경우 암이 검출된 것을 고려함에 의해 파라미터가 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 최소 수의 파라미터가 암의 검출에 필요할 수 있다. 예를 들어, 2개, 3개 또는 그 초과 파라미터가 필요할 수 있다. 일부 구현예는 암이 검출되기 위해 암을 나타내는 특정 파라미터 (예를 들어, CNA, 저메틸화, 또는 디콘볼루션)를 요할 수 있다. 표 6은 파라미터 조합시 검출 결과를 보여준다.
표 6. 파라미터의 상이한 조합을 사용한 감수성 결과.
이들 결과는 현재의 관리 기준인 소변 세포학과 비교될 수 있다. 46명의 방광암 환자 중 42명이 정기적인 관리의 일환으로 비뇨기 수술 전 6개월 이내에 소변 세포검사를 위해 1 내지 3개의 소변 샘플을 보내왔다. 42명의 방광암 환자 중 4명 (9.5%)만이 양성 소변 세포검사를 받았다. 양성 소변 세포검사를 가진 4개 사례는 침습성 (T2b-4) 고등급 질환이었다. 소변 세포검사는 저메틸화, CNA 및/또는 방광 종양 기여를 사용하는 것보다 방광암을 검출하는데 덜 정확했다.
예로서, 본 발명자들은 비침습성 저등급 질환 (Ta LG)을 갖는 17개 방광암 사례를 서열분석했다. 본 발명자들은 저등급 질환을 검출하는 분석 방법에 대한 능력을 평가했다.
도 32A-32C는 비침습성 (Ta) 저등급 질환이 있는 17명의 방광암 환자 및 39명의 대조군에 대해, 각각 저메틸화를 갖는 1mb 빈의 백분율, 복제 수 이상을 갖는 1mb 빈의 백분율 및 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여에 대한 상자그림을 도시한다. 도 32D는 도 32A에 대해 상응하는 ROC 곡선 도시한다. 도 32E는 도 32B에 대한 상응하는 ROC 곡선을 도시한다. 도 32F는 도 32C에 대한 상응하는 ROC 곡선을 도시한다. 3가지 파라미터 중 적어도 하나를 사용하여, 비침습성 저등급 질환을 갖는 17명의 환자 중 14명이 확인될 수 있었다.
상당한 저메틸화를 갖는 1 mb 빈의 백분율을 사용하여, 본 발명자들은 41.1%의 감수성 (ROC AUC=0.89)으로 방광암을 검출할 수 있었다 (도 32D). 상당한 CNA를 갖는 1 mb 빈의 백분율을 사용하여, 본 발명자들은 17.6% (ROC AUC=0.78)로 방광암을 검출할 수 있었다 (도 32E). 메틸화 디콘볼루션으로부터 방광 종양 기여를 사용하여, 본 발명자들은 47.0%의 감수성 (ROC AUC=0.81)으로 방광암을 검출할 수 있었다 (도 32F). 세 가지 파라미터를 모두 합하면, 세 가지 파라미터 중 적어도 하나에 대해 양성 반응을 보인 방광암 사례의 경우에 대해 민감성이 82.4%로 증가되었다. 특이성은 100%였다.
3가지 초과의 파라미터가 또한 사용될 수 있다. 표 7은 최대 5가지 파라미터: 저메틸화, CNA, 디콘볼루션, 과메틸화, 상이한 컷오프를 사용하여 1 불일치를 사용한 돌연변이 하중 및 조합에서의 감수성 및 특이성을 도시한다. 실증된 컷오프는 대조군의 평균 플러스 3개 표준편차 (SD) 및 대조군의 평균 플러스 2개 SD이다. 파라미터는 '또는' (파라미터 중 적어도 하나에서 양성이면 테스트 양성) 또는 '및' (5가지 파라미터 모두에서 양성이면 테스트 양성)을 사용하여 조합될 수 있다.
표 7. 5가지 파라미터의 상이한 조합을 사용한 감수성 결과.
컷오프로서 대조군의 평균 플러스 2개 SD를 사용하고 '또는'을 사용하여 5가지 파라미터를 조합하여, 95.7%의 민감성과 82.1%의 특이성이 달성될 수 있다. 대안적으로, 로지스틱 회귀 모델을 사용하여, 1개 남기는 분석을 기반으로 91.3%의 민감성과 89.7%의 특이성이 달성될 수 있다.
로지스틱 회귀 모델의 성능을 테스트하기 위해 1개 남기는 분석이 사용될 수 있다. 이러한 분석에서 하나의 샘플이 테스트 샘플로 사용된다. 다른 모든 샘플은 로지스틱 회귀 모델에 적합하도록 트레이닝 세트로서 사용되며, 이에 따라 모델의 파라미터 (예를 들어, 계수 및 역치)를 얻는다. 그런 다음 제2 샘플을 테스트 샘플로 사용하고 다른 모든 샘플을 계수를 결정하는 트레이닝 세트로 사용한다. 이 절차는 각각의 샘플마다 차례로 반복된다.
일부 구현예에서, 암을 갖는 것에 대한 컷오프로서 0.5의 개연성에 기초하여 로지스틱 회귀를 사용하면, 암이 있는 개연성 = 1- 1/(1+exp[-(-0.4413124 * 저메틸화 - 0.68652846 * CNA - 0.44981374 * 종양의 부분적 기여 + 1.02332221 * 과메틸화 + 0.07711755 * 불일치 장입 + 1.35436873)]).
컷오프를 평균 플러스 3개 SD로 조정함으로써, 95.7%의 민감성 및 100%의 특이성이 달성될 수 있다. 다른 구현예에서, 다른 분류 알고리즘이 사용될 수 있고, 그 예는 비제한적으로, 결정 트리, 서포터 벡터 기계, 미접촉 베이스 분류기, K-최근접 이웃, 랜덤 포레스트 트리 및 모든 다른 기계 학습 알고리즘이다. 따라서, 본 명세서에 기술된 분석 방법은 저등급 질환을 검출하는데 사용될 수 있다.
B. CNA, 전반적인 메틸화, 및 종양 기여를 사용하여 소변 샘플을 분석하는 방법
도 33은 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법 (3300)을 도시한다. 유기체는 본 명세서에 기재된 임의의 유기체일 수 있다. 소변 샘플은 정상 세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포에서 유래된 DNA를 포함할 수 있다. 적어도 일부의 DNA는 소변 샘플에서 무세포일 수 있다.
블록 (3310)에서, 소변 샘플로부터의 다수의 DNA 분자가 분석된다. DNA 분자를 분석하는 것은 유기체의 게놈에서 DNA 분자의 위치를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 위치를 확인하는 것은 컴퓨터 시스템에 의한 것일 수 있다.
블록 (3320)에서, 유기체의 복수의 염색체 영역의 각 염색체 영역에 대한 염색체 영역이 복제 수 이상 또는 메틸화 비정상 중 적어도 하나의 이상을 나타내는 지의 분류가 결정된다. 메틸화 이상은 저메틸화 또는 과메틸화일 수 있다. 일부 구현예에서, 이상은 저메틸화 또는 과메틸화 중 하나만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이상은 복제 수 이상 또는 저메틸화 중 적어도 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, 염색체 영역이 불일치의 이상을 나타내는 지의 분류가 결정된다.
블록 (3330)에서, 분류는 확인된 위치에 기초하여 염색체 영역으로부터 나오는 소변 샘플로부터의 DNA 분자의 그룹을 식별함에 의해 결정될 수 있다. 본 그룹은 염색체 영역의 복수의 유전자좌 각각에 위치한 적어도 하나의 DNA 분자를 포함할 수 있다.
블록 (3340)에서, 분류는 또한 컴퓨터 시스템을 사용하여 DNA 분자의 그룹의 값을 계산함에 의해 결정될 수 있다. 각각의 값은 각각의 그룹의 DNA 분자의 특성을 한정할 수 있다. 본 특성은 복사 수 또는 메틸화 수준 중 적어도 하나일 수 있다. 선택적으로, 본 특성은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 불일치 돌연변이 장입일 수 있다.
블록 (3350)에서, 분류는 그 값을 기준값과 비교함으로써 추가로 결정될 수 있다. 기준값은 이상으로부터 정상값 사이의 컷오프를 결정할 수 있다. 기준값은 3의 z-점수에 기초할 수 있다. 예를 들어, 기준값은 복제 수 이상을 고려한 복제 수의 값일 수 있다. 일부 예에서, 기준 값은 그 영역이 과메틸화 또는 저메틸화로 간주되는 메틸화 수준의 값일 수 있다.
블록 (3360)에서, 소변 샘플에 대한 복제 수 이상을 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제1 양이 제1 역치 이상인지의 여부에 기초하여 제1 수준의 암이 결정될 수 있다. 제1 역치는 암을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있는 유기체로부터 암이 있는 것으로 알려진 유기체로 나눌 수 있다. 다른 구현예에서, 제1 역치는 암을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있는 유기체로부터 암이 없는 것으로 알려진 유기체로 나눌 수 있다.
블록 (3370)에서, 소변 샘플에 대한 저메틸화 또는 과메틸화를 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제2 양이 제2 역치 이상인 것에 기초하여 제2 수준의 암dl 결정될 수 있다. 제2 역치는 제2 역치가 복제 수 대신 메틸화 수준을 적용할 수 있다는 것을 제외하면 제1 역치와 유사할 수 있다.
블록 (3380)에서, 종양 조직의 부분적 기여가 제3 역치 이상인지의 여부에 기초하여 제3 수준의 암이 결정될 수 있다. 방법 (3300)은 종양 조직의 부분적 기여를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 부분적 기여는 종양 특이적 체세포 돌연변이, 종양 특이적 메틸화 서명, 종양 특이적 단편 말단 패턴 또는 단편 크기 분석 (예를 들어, 종양 DNA는 비-종양 DNA보다 통계적으로 더 길다)을 사용하여 결정될 수 있다. 종양 특이적 체세포 돌연변이를 사용하여 부분적 기여를 결정하는 것에 대한 더 상세한 사항은 미국 특허 공보 번호 2014/0100121에 기재되어 있다. 종양 특이적 메틸화 서명을 사용하는 것에 대한 더 상세한 사항은 미국 특허 공보 번호 2014/0080715 및 2016/0017319 및 PCT 특허 공보 번호 WO2014/043763에 기재되어 있다. 종양 특이적 단편 말단 패턴을 사용하는 것에 대한 더 상세한 사항은 미국 특허 공보 번호 2017/0024513에 기재되어 있다. 단편 크기 분석을 사용하는 것에 대한 더 상세한 사항은 미국 특허 공보 번호 2016/0201142에 기재되어 있다. 이들 특허 출원의 모든 내용은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고로 편입된다. 종양 조직의 부분적 기여는 또한 본 명세서에서 기재된 디콘볼루션 방법에 의해 결정될 수 있다. 제3 역치는 제3 역치가 복제 수 또는 메틸화 수준 대신에 부분적 기여에 적용할 수 있다는 것을 제외하고는 제1 역치 또는 제2 역치 중 어느 하나에 유사할 수 있다.
추가의 역치는 추가의 암의 수준일 수 있다. 예를 들어, 암의 수준은 불일치를 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 양이 역치 이상인지 여부에 기초하여 결정될 수 있다.
블록 (3390)에서, 유기체는 제1 수준의 암, 제2 수준의 암 또는 제3 수준의 암 중 적어도 하나가 유기체가 암을 갖는다는 것을 나타내면 암을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 유기체가 수준 중 적어도 2가지 또는 수준 중 3가지가 유기체가 암을 갖는다는 것을 나타내면 암을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 추가의 암의 수준이 사용될 수 있다. 유기체는 수준 중 적어도 하나가 유기체가 암을 갖는다는 것을 나타내면 암을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 유기체는 모든 수준이 유기체가 암을 갖는다는 것을 나타내면 암을 갖는 것으로 결정될 수 있다. 다른 구현예에서, 유기체는 수준 중 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상이 유기체가 암을 갖는다는 것을 나타내면 암을 갖는 것으로 결정될 수 있다.
방법 (3300)은 본 명세서에서 기재된 임의의 방식으로 유기체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
VI. 불일치 및 얕은 깊이 서열분석을 사용한 종양 장입 추정
본 발명자들은 얕은 깊이 서열분석을 사용하여 종양 장입을 추정하기 위해 하나의 불일치를 갖는 리드의 비율을 이용했다. 이것은 방광암 사례를 정상 대조군과 구별하는 데 사용될 수 있다. 요상피 암종은 체세포 돌연변이의 축적이 특징이다. 방광암은 높은 비율의 체세포 돌연변이 (메가염기 당 약 8개 돌연변이)를 가질 수 있다 (Glaser et al., Nat. Rev. Urol., 2017). 방광암 환자의 방광 종양에서 유래된 뇨의 cfDNA는 참조 게놈과 비교하여 불일치가 나타나는 단편의 증가된 비율을 가질 수 있다. 참조 게놈과의 비교하여 불일치는 생식계열 변형, 체세포 돌연변이, 또는 서열분석 오류로 인해 발생할 수 있다. 인간 게놈의 1 X 적용범위보다 적은 전체 게놈 바이설파이트 서열분석은 참고 게놈에 비교해 불일치가 있는 리드의 수를 평가할 수 있지만 체세포 돌연변이를 정확하게 식별하기에는 불충분하다. 방광암 사례 및 대조군의 뇨의 cfDNA는 공통적인 생식계열 변형을 포함할 것이며, 이는 참조 게놈에 대한 불일치로 검출될 수 있다. 또한 방광암 사례에서의 체세포 돌연변이의 더 높은 발병률은 인간 참조 게놈과 비교하여 단일 불일치를 갖는 리드의 보다 큰 비율에 기인할 수 있다.
도 34A는 49명의 방광암 사례 및 39명의 대조군에서 하나의 불일치를 갖는 리드의 백분율에 대한 상자그림이다. 본 상자그림는 방광암 사례가 대조군과 비교하여 하나의 불일치를 갖는 리드의 더 높은 백분율을 가진다는 것을 도시한다 (Mann Whitney U 테스트 P<0.001). 도 34B는 ROC 곡선이 0.79의 AUC를 갖는다는 것을 도시한다. 불일치를 갖는 리드의 비율은 방광암을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
도 35는 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법 (3500)을 도시한다. 생물학적 샘플은 정상 세포 및 암과 관련된 세포에서 유래한 DNA를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플에서 적어도 일부의 DNA는 무세포일 수 있다. 생물학적 샘플은 소변 샘플일 수 있다.
블록 (3510)에서, 생물학적 샘플의 DNA 분자에 상응하는 다수의 서열 리드가 수신된다. 본 서열 리드는 전체 게놈 바이설파이트 서열분석으로부터의 것일 수 있다. 본 서열 리드는 1X 미만, 1X 내지 2X, 2X 내지 3X, 3X 내지 5X, 또는 5X 내지 10X의 깊이 적용범위에 있을 수 있다. 복수의 서열 리드는 5천만 개 미만의 고유한 표시 가능한 리드, 4천만 개 미만의 고유한 표시 가능한 리드, 3천만 개 미만의 고유한 표시 가능한 리드 또는 2,000만 개 미만의 고유한 표시 가능한 리드를 포함하여 8,000만 개 미만의 고유한 표시 가능한 리드일 수 있다.
블록 (3520)에서, 서열 리드에 대한 게놈 위치가, 예를 들어, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 결정된다. 예를 들어, 게놈 위치는 참조 게놈에 기초한 컴퓨터를 사용하여 결정될 수 있다. 참조 게놈은 유기체 (예를 들어, 인간)에 상응하는 모집단 또는 대표적인 것에 대한 참조 게놈일 수 있다. 다른 구현예에서, 참조 게놈은 유기체에 대한 생식계열 (체질학적) 게놈을 포함함으로써 대상체에 특이적일 수 있다.
블록 (3530)에서, 서열 리드는 참조 게놈과 비교되어 참조 게놈과 하나의 불일치를 갖는 서열 리드를 결정한다. 예로서, 불일치는 체세포 돌연변이, 서열분석 오류, 또는 자연적 불일치 (예를 들어, 대상체의 생식계열 게놈과 참조 게놈의 차이로부터 기인한 다형성)의 결과일 수 있다. 서열 리드 당 여러 개의 불일치가 사용될 수 있지만 성능은 단 하나의 불일치만 사용하는 것보다 더 나쁠 수 있다. 각각의 DNA 분자는 일반적으로 100 bp 미만이며 짧은 DNA 스트레치에서 두 개 이상의 실제 체세포 돌연변이를 관찰할 확률은 낮다.
블록 (3540)에서, 파라미터는 참조 게놈과 하나의 불일치를 갖는 서열 리드의 카운트에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 서열 리드의 카운트는 하나 이하의 불일치만 갖는 서열 리드일 수 있다. 다른 구현예에서, 서열 리드의 카운트는 하나 이상의 불일치, 예를 들어 2, 3 또는 그 초과의 불일치를 갖는 서열 리드를 포함할 수 있다. 파라미터는 하나의 불일치를 갖는 서열 리드의 정규화된 카운트일 수 있다. 예를 들어, 파라미터는 하나의 불일치를 갖는 서열 리드의 밀도, 농도 또는 백분율일 수 있다. 일부 경우에서, 파라미터는 하나의 불일치를 갖는 서열 리드의 개수와 동일할 수 있다.
블록 (3550)에서, 파라미터는 역치 값과 비교된다. 역치 값은 건강한 유기체에 대한 불일치에 관한 데이터 및/또는 암을 가진 유기체에 대한 불일치에 관한 데이터를 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 역치 값은 건강한 유기체의 모집단에 대한 평균 파라미터보다 1, 2 또는 3 표준 편차 이상으로 설정될 수 있다.
블록 (3560)에서, 암의 수준의 분류는 역치 값에 대한 파라미터의 비교를 사용하여 결정된다. 파라미터가 역치 값보다 높으면, 암의 수준의 분류는 유기체가 암이 있다는 것일 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같은 추가의 분류가 사용될 수 있다. 예를 들어, 암의 수준의 다른 분류는 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 결정될 수 있는 복제 수 이상, 저메틸화, 과메틸화, 또는 종양 기여를 사용할 수 있다. 예를 들어, 암을 검출하는 것은 불일치에 기반으로 하는 것 이외의 파라미터를 포함할 수 있다.
방법 (3500)은 불일치가 서열 오류인지를 결정하는 것을 배제할 수 있다. 불일치에 대한 원인을 결정하지 않으면, 암의 수준의 분류를 결정하는 것이 정확성에서 실질적인 감소 없이 보다 효율적일 수 있다.
방법 (3500)은 본 명세서에서 기재된 임의의 기술로 암을 치료하는 것을 포함할 수 있다.
VII. 소변 메타게놈 분석은 방광암 사례와 대조군을 식별할 수 있다
비뇨기 미생물총의 연구는 요로 감염 외에 요로에서의 미생물이 비뇨기 질환과 관련되어 있다고 제안하고 있다. 본 발명자들은 인간 게놈에 매핑되지 않은 서열분석된 cfDNA 리드의 메타게놈 분석을 수행했다. 매핑되지 않은 리드는 병원체에 존재하는 1M 마커 유전자의 참조에 매핑되었다. 병원체는 ~13,500개의 박테리아 및 고세균 게놈 및 ~3,500개의 바이러스 게놈을 포함할 수 있으며 BSMap을 사용하여 매핑될 수 있다. 샘플당 평균 25,000개의 리드가 마커 유전자 참조에 매핑될 수 있었다. Metaphlan2는 존재도 종 테이블에서 다른 미생물로부터의 비례 기여를 확인하는 데 사용되었다.
도 36은 3명의 방광암 사례 및 5명의 대조군에 대한 상이한 미생물종의 상대 존재비를 나타내는 히트 맵이다. 상대 존재비는 특정종에 맵핑된 리드 / 특정 미생물Х 1e9 (RPKM)의 크기로 나누어진 메타게놈 데이터 베이스에 맵핑된 리드의 총 수로 정의될 수 있다. 3개의 방광암 사례는 T188, T179, 및 TBR1875였다. 5개의 대조군은 TBR532, T159, T56, T59, 및 T29였다. 각각의 수직선은 단일 종을 나타낸다. 색상은 적색 (예를 들어, 부문 3602)은 높은 비례 기여를 나타내고 청색 (예를 들어, 부문 3604)은 낮은 비례 기여를 나타내도록 각각의 종에 대한 로그 백분율 존재도를 나타낸다. 도 36은 방광암 사례 및 대조군이 분리될 수 있다는 것을 도시한다. 대조군에서보다 방광암 사례에서 더욱 풍부한 종은 하기를 포함한다: 할로노티우스, 써모코쿠스, 니트로소푸밀루스 및 악티노마이세스. 방광암 사례에서보다 대조군에서 더욱 풍부한 종은 하기를 포함한다: 브레비박테리움 및 노카르디오이데스. 그 결과, 인간 게놈에 대해 매핑하지 않는 cfDNA 리드는 방광암을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
대조군과 비교된 방광암 사례에서 차별적인 상대 존재비를 나타내는 최상부 미생물은 하기 박테리아를 포함한다: 그래뉼리셀라, 악티노배큘럼샤알리이, 마이코박테리움 투베르쿨로시스/보비스/아프리카늄/카네티이, 악티노박테리움, 일루마토박터 콕씨네우스, 칸디다투스 코리박터, 모빌룬쿠스쿠르티시, 악시디마이크로비움 페로옥시단스, 칸디다투스 클로르악시도박테리움 써모필룸, 칸디다투스 코랄캐움 크립토 필룸, 메타노박테리움, 살리니스포라 패시피카, 메타노셀라 콘라디이, 브레비박테리움, 및 마이코박테리움.
최상부 미생물은 또한 하기 고세균을 포함한다: 메타노쿨레우스, 메타노칼도코쿠스, 메탄올리네아 타르다, 써모플라즈마 볼캐니움, 메타노스패룰라 팔루스트리스, 설포로버스 악시도칼다리우스, 메타노스파에라 스타드트마나에, 메타노플라누스 페트롤래리우스, 메타노셀라 아르보리자에, 메타노폴리스 리미나탄스, 및 메타노코커스 아에올리쿠스.
도 37은 인간의 소변 샘플을 분석하는 방법 (3700)을 도시한다. 소변 샘플은 정상 세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포에서 유래된 DNA를 포함할 수 있다. 소변 샘플에서 적어도 일부의 DNA는 무세포일 수 있다.
블록 (3710)에서, 소변 샘플의 DNA 분자에 상응하는 다수의 서열 리드가 얻어진다. 블록 (3710)은 본 명세서에서 기술된 다른 샘플 측정 단계와 유사한 방식으로 수행될 수 있다
블록 (3720)에서, 복수의 서열 리드의 각각의 서열 리드에 대해, 서열 리드는 컴퓨터 시스템에 의해 인간 참조 게놈에 정렬될 수 있다. 서열 리드가 인간 참조 게놈에 정렬될 때, 서열 리드는 인간 리드로 분류된다. 서열 리드는 리드당 2개 이하의 불일치가 존재할 때 정렬된 것으로 간주될 수 있다. 일부 사례에서, 많은 수의 불일치가 허용될 수 있다. 인간 참조 게놈은 소변 샘플을 제공한 인간의 동일한 민족 또는 인종 그룹 (예를 들어, 동아시아, 유럽)으로부터 온 것일 수 있다. 참조 게놈은 공공 데이터베이스 (예를 들어, NCBI또는UCSC)로부터 유래될 수 있다. 참조 게놈은 또한 소변 샘플을 얻은 인간을 위한 새로운 어셈블리일 수 있다. 환언하면, 인간이 암이 없는 것으로 알려진 경우 개인 참조 게놈이 사용될 수 있다.
블록 (3730)에서, 복수의 서열 리드의 각각의 서열 리드에 대해, 서열 리드는 컴퓨터 시스템에 의해 제1 병원체의 종 또는 속에 상응하는 제1 병원체 참조 게놈에 정렬될 수 있다. 서열 리드가 제1 병원체 참조 게놈에 정렬될 때, 서열 리드는 제1 병원체 리드로서 분류된다. 박테리아, 바이러스성, 및 고세균 참조 게놈을 포함하여 다수의 병원체 참조 게놈이 시험될 수 있다. 사용하는 특정 병원체 참조 게놈은 특정 종이나 속의 유병률, 그리고 다른 종들이 방광암의 다른 분류를 나타내는지 여부에 의존할 수 있다. 예를 들어, 종들이 모두 방광암을 나타내며 유병률이 상대적으로 낮으면, 속 참조는 속의 종으로부터의 게놈의 상동성 부분으로부터 구축될 수 있다.
방법 (3700)은 두 개 또는 그 초과의 상이한 유형의 병원체 리드에 상응하는 것으로서 서열 리드를 분류하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열 리드는 제1 박테리아 참조 게놈에 정렬될 수 있고 또한 제2 박테리아 참조 게놈에 정렬될 수 있다. 1 초과의 병원체 참조 게놈에 대한 그러한 정렬은 유전자가 상이한 병원체 사이에서 상동성인 결과 초래할 수 있다. 정렬 및 분류는 상이한 유형의 박테리아, 고세균, 또는 바이러스성 참조 게놈에 대한 것일 수 있다. 다양한 구현예에서, 서열 리드가 다수의 병원체에 정렬되면, 최상의 정렬을 갖는 병원체가 선택될 수 있다. 서열 리드가 다수의 병원체에 동등하게 정렬되면, 서열 리드는 폐기되거나, 각각의 병원체에 분배되거나, 병원체를 포함한 속에 배정될 수 있다.
방법 (3700)은 복수의 유형의 병원체 리드에 대한 복수의 서열 리드를 분류하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 복수의 서열 리드의 제1 서열 리드는 제1 고세균 참조 게놈과 정렬할 수 있어, 그렇게함으로써 서열 리드를 제1 병원체 리드로 분류할 수 있고, 그리고 복수의 서열 리드의 제2 서열 리드는 제2 고세균 참조 게놈과 정렬할 수 있어, 그렇게함으로써 서열 리드를 제2 병원체 리드로 분류할 수 있다. 병원체 참조 게놈에 정렬되는 임의의 서열 리드는 비-인간 리드로 분류될 수 있다.
블록 (3740)에서, 방법 (3700)은 병원체 리드의 양에 기초하여 파라미터를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 리드의 양은, 예를 들어 다중 병원체 참조 게놈에 정렬되는 이중 계수 서열 리드 없이, 병원체 참조 게놈 (예를 들어, 제1 병원체 리드, 제2 병원체 리드)에 정렬되는 총 모든 리드일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 병원체 리드의 양은 특정 병원체 참조 게놈에 정렬된 서열 리드의 양일 수 있다. 예를 들어, 파라미터는 제1 병원체 리드의 가공하지 않은 계수, 농도, 분획 또는 백분율일 수 있다.
방법 (3700)은 상이한 병원체 참조 게놈에 정렬된 판독에 대한 제2 병원체 리드의 제2 양에 기초한 제2 파라미터를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 예로서, 제2 파라미터는 제2 병원체 리드의 가공하지 않은 계수, 농도, 분획 또는 백분율일 수 있다. 제2 파라미터는 제1 파라미터와 같은 상응하는 방법으로 계산된 파라미터일 수 있다. 병원체 참조 게놈은 할로노티우스, 써모코쿠스, 니트로소푸밀루스, 악티노마이세스, 또는 본 명세서에서 기재된 임의의 병원체를 포함할 수 있다. 또한, 병원체 참조 게놈은 본 명세서에 기재된 임의의 병원체로부터 임의의 게놈을 배제할 수 있다. 병원체 참조 게놈은 박테리아 게놈, 바이러스 게놈 및 고세균 게놈을 포함 또는 배제할 수 있다.
병원체 참조 게놈은 마이코박테리움, 할로박테리움, 악티노마이세스, 코라이네박테리움, 또는 칸디다투스 중 적어도 하나로부터의 참조 게놈을 포함할 수 있다. 참조 게놈은 마이코박테리움, 할로박테리움, 악티노마이세스, 코라이네박테리움, 또는 칸디다투스 중 임의의 1, 2, 3, 또는 4개를 포함할 수 있다.
블록 (3750)에서, 방법 (3700)은 파라미터를 컷오프 값과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 리드의 상이한 유형의 양에 기초하여 여러 유형의 파라미터가 결정되는 경우, 각각의 유형의 양을 하나 이상의 컷오프 값과 비교할 수 있다. 예를 들어, 몇 가지 유형의 파라미터의 각각의 파라미터는 단일 컷오프 값과 비교될 수 있다. 다른 예에서, 파라미터의 각각의 유형은 파라미터의 유형에 대해 특이적인 컷오프 값에 비교된다. 일부 예에서, 상이한 유형의 파라미터에 의해 지정된 좌표를 갖는 다차원 점은 선, 평면 또는 더 고차원 평면인 컷오프 값에 대해 비교될 수 있다. 컷오프 값 또는 값들은 방광암을 갖는 제1 참조 샘플의 제1 세트 및 방광암을 갖지 않는 대조군 샘플의 제2 세트로부터 결정될 수 있다.
블록 (3760)에서, 방법 (3700)은 비교를 사용하여 방광암의 수준의 분류를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법 (3700)은 제1 병원체의 양이 컷오프 값 이상이면 인간이 방광암이 있다는 것으로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 리드의 양의 상이한 유형에 기반하여 몇 개의 파라미터가 결정되면, 다중 파라미터가 하나 이상의 컷오프 값보다 큰 경우 인간이 방광암이 있다고 판단할 수 있다. 일부 구현예에서, 파라미터들의 특정 백분율 (예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%)이 하나 이상의 컷오프 값들을 초과하면 방광암이 결정될 수 있다. 암의 중증도는 파라미터가 컷오프 값과 비교하여 얼마나 높은지에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 암의 중증도는 얼마나 많은 파라미터가 하나 이상의 컷오프 값보다 큰지에 의해 결정될 수 있다.
방법 (3700)은 본 명세서에서 기재된 암에 대한 임의의 치료를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, 방법 (3700)은 소변 샘플뿐만 아니라 생물학적 샘플에도 적용할 수 있다. 일부 사례에서, 방법 (3700)은 방광암뿐만 아니라 암의 수준을 결정하는 것을 포함할 수 있다
VIII. 물질 및 방법
위에 제공된 특정 결과에 대해 특정 기술이 아래에서 기재되어 있다. 하나의 예에 대해 사용된 이러한 기술은 다른 예들에 대해 사용될 수 있다.
A. 이식 환자를 위한 샘플 수집 및 처리
이식 데이터를 위해, 임상적으로 안정한 11명의 신장 이식 및 2명의 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 환자로부터 소변 샘플이 수집되었다. 소변 샘플은 또한 신장 결석 환자와 방광암 환자 5명으로부터 수집되었다. 소변 샘플은 아침 클리닉에서 또는 수술 전 아침에 수집했으며 가능하면 이른 아침 소변 샘플을 채취했다. 30-50 mL의 소변을 평범한 무균 병에 수집하여 4℃에서 보관하고 이전에 기재된 바와 같이 수집 한 시간 이내에 처리했다 (12, 23). 소변의 무세포 부분은 원심 분리 및 상청액의 여과에 의해 분리되었다.
B. 라이브러리 제조, 바이설파이트 전환 및 대량의 평행한 DNA 서열분석
DNA 라이브러리는 제조사의 지침 (7)에 따라 KAPA HTP 라이브러리 제조 키트 (Kapa Biosystems)를 사용하여 최대 500ng의 뇨의 cfDNA로 제조하였다. 바이설파이트 및 비-바이설파이트 DNA 서열분석은 75 bp 쌍으로 된 말단 방식을 사용하는 Illumina HiSeq 2500 시퀀서를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (24, 25). 염기 호출 및 품질 관리 이후, 데이터는 메틸화 데이터 분석 파이프 라인 Methy-Pipe (26)에 의해 가공되었다.
최대 500ng의 뇨의 cfDNA를 라이브러리 제조를 위해 사용하였다. DNA 라이브러리는 KAPA HTP 라이브러리 제조 키트 (Kapa Biosystems)를 사용하여 제조사의 지침 (7)에 따라 제조되었다. 바이설파이트 및 비-바이설파이트 DNA 서열분석은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (24, 25). 바이설파이트 서열분석을 위한 불충분한 DNA가 있을 때만 크기 프로파일 분석을 위해 비-바이설파이트 서열분석을 사용했다. DNA 라이브러리는 75 bp 쌍으로 된 말단 방식을 사용하여 Illumina HiSeq 2500 시퀀서를 사용하여 서열분석되었다. 염기 호출 후에, 어댑터 서열 및 낮은 품질 염기 (즉, 품질 점수 < 5)가 제거되었다. FASTQ 형식에서의 트리밍된 리드는 메틸화 데이터 분석 파이프 라인 Methy-Pipe (26)에 의해 가공되었다. 소변 샘플당 한 레인의 서열분석을 사용하여, 본 발명자들은 인간 참조 게놈에 매핑된 8천만 개의 특유의 중복되지 않은 리드의 중앙 값을 수득했다.
C. 추출 및 정량화
뇨의 cfDNA의 추출 및 정량화를 위해, 뇨의 cfDNA를 이전에 기재된 바와 같이 추출하고 정량화하였다 (11, 12, 23). 시험관내 인큐베이션 실험에는 대부분의 샘플에 대해 30-50 mL의 소변과 최대 250 mL가 필요했다. 간단히 말해, 신선한 소변을 평범한 멸균 병에서 수집하고, 분취액을 Siemens Multistix 10SG 시스템을 사용하여 시험하고, Roche Cobas 8000을 사용하여 크레아티닌 농도에 대해 분석하였다. 나머지 소변 샘플의 경우, 0.5 mol/L EDTA, pH 8 (Invitrogen)을 10 mmol/L의 최종 EDTA 농도로 첨가하여 뉴클레아제 활성을 억제하였다 (9). EDTA는 에틸렌디아민테트라아세트산에 상응한다.
소변은 그 다음 4℃에서 10 분간 원심분리되고, 상청액은 0.45-㎛ 필터 (Milex-GV; Millipore)를 통해 여과하여 무세포 성분을 분리하였다. 무세포 소변은 그 다음 -80℃에서 보관되거나 또는 즉시 추출되었다. 본 발명자들은 처리된 소변 10 mL마다 15 mL의 6 mol/L 구아니딘 티오시아네이트 (Sigma-Aldrich) 15mL와 1 mL의 수지 (Wizard Plus Minipreps DNA Purification System, Promega)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 수지-DNA 복합체는 그런 다음 제조사의 지침에 따라 Wizard Plus Minipreps DNA 정제 시스템을 사용하여 단리, 세정 및 용출되었다. 수집된 소변 10 mL마다 뇨의 cfDNA를 용출하는데 대략 100 μL를 사용하였다.
추출된 cfDNA는 LEP유전자를 표적화하는 62 bp 앰플리콘으로 실시간 qPCR을 사용하여 정량화되었다 (11). 절대적인 DNA 농도는 1.25 내지 4000 GE/uL의 범위에 이르는 11-포인트 DNA 표준을 사용하여 결정되었고, 모든 뇨의 cfDNA 농도는 GE/소변의 mL의 관점에서 표시된다.
말초 혈액 백혈구 및 조직으로부터 게놈 DNA의 추출 및 정량화는 아래와 같이 수행될 수 있다. 버피 코트 샘플은 Qiagen DNA 혈액 미니 키트를 사용하여 가공되었고 조직 샘플은 제조자 지침에 따라 Qiagen DNA 미니 키트를 사용하여 가공되었다.
D. SNP 어레이를 사용한 공여체 및 수령체 특이적 유전자형의 결정
모든 신장 이식 및 HSCT 환자에 대해, ~2.5 백만 공여체 및 수령체 SNP을 제조자의 지침에 따라 Illumina Omni 2.5 SNP 어레이를 사용하여 조사했다. 공여체 및 수령체 생식계열 DNA는 버피 코트, 협측 면봉 또는 신장 조직으로부터 얻어졌다. 이것은 본 발명자들이 각각의 이식 사례에 대한 공여체 및 수령체 특이적 SNP를 확인할 수 있게 했다. 공여체 및 수령체 특이적 대립유전자에 대한 지식은 대규모 병렬 서열분석 결과와 함께 사용되어 소변에서 공여체 및 수령체 특이적 cfDNA 단편의 비율을 정확하게 확인할 수 있었다.
E. 뇨의 DNA 조직 맵핑을 위한 메틸화 마커로서 차별적으로 메틸화된 영역의 확인.
상이한 인간 조직으로부터의 전체 게놈 바이설파이트 서열분석 데이터를 사용하여 메틸화 디콘볼루션을 위한 참조 메틸롬을 구축하였다. 본 발명자들은 정상 샘플에서의 뇨의 cfDNA에 대한 주요 원인제공자는 혈구 (혈장 cfDNA의 주요 구성성분, 그리고 또한 신장 시스템 이후에서 방출될 수 있음), 신장, 및 전체 요로를 라이닝하는 요로 상피일 것이다고 가정했다. 중성구, B-세포 및 T-세포에 대한 전체의 게놈 바이설파이트 서열분석 데이터는 공개적으로 이용가능한 자원 (Human Epigenome Atlas, www.genboree.org/epigenomeatlas/index.rhtml), (28)으로부터 수득되었다. 본 발명자들은 이 연구를 시작했을 때 신장이나 요로상피에 대한 전체 게놈 메틸화 데이터는 이용가능하지 않았고; 따라서 본 발명자들은 사체 신장 이식 사례로부터 조직과 신장-요관절제 및 라디칼 방광 적출술을 받은 환자로부터 인접한 정상 조직을 수득함에 의해 우리 자신의 참조 메틸롬을 만들었다. 신장 참조는 6명의 환자로부터 얻은 피질 및 수질 신장 조직으로부터의 바이설파이트 서열분석 데이터를 사용하여 컴파일링하고 35X 반수체 게놈 적용범위로 서열분석했다. 요상피 참조는 40X 반수체 게놈 적용범위에 대해 서열분석된 6명 환자의 요관 및 방광으로부터 수득된 요로상피로 구성된다. 방광암 참조는 라디칼 방광 적출술 동안 수득된 방광 종양에 기반되어 8.5X 반수체 게놈 적용범위에 대해 서열분석되었다.
메틸화 마커는 이전에 기재된 바와 같이 선택되었다 (22). 상염색체 CpG 해도형 및 해안을 비-중첩 500 bp 단위로 세분하고 각각의 단위의 메틸화 밀도를 각각의 참조 조직에 대해 결정하였다. 차별적으로 메틸화된 영역을 사용하여 유형 I 및 유형 II 마커를 확인하였다. 유형 I 마커는 다른 모든 참조 조직의 평균 수준과 비교한 하나의 조직에서 3개 SD가 더 높거나 더 낮은 메틸화 밀도를 갖는 임의의 유전자좌위를 지칭했다. 유형 II 마커는 모든 조직 유형에 걸쳐 매우 다양하게 메틸화 밀도를 실증한 게놈 유전자좌위였다. 유전자좌는 (A) 가장 과메틸화된 조직의 메틸화 밀도가 가장 저메틸화된 것의 메틸화 밀도보다 적어도 20% 더 높았을 때; 및 (B) 그룹의 평균 메틸화 밀도에 의해 분할될 때 모든 조직 유형에 걸친 메틸화 밀도의 SD (즉, 변동 계수)가 적어도 0.25일 때 매우 가변적이라고 고려되었다.
F. 뇨의 cfDNA에서 상이한 조직의 비례 기여의 결정을 위한 메틸화 디콘볼루션
메틸화 디콘볼루션의 목적은 뇨의 cfDNA에서 각각의 조직의 비례 기여를 결정하는 것이었다. 메틸화 디콘볼루션은 Sun et al (22)에 의해 설명대로 수행되었다. 간단히 말해, 특정 마커에서 관측된 메틸화 밀도는 각각의 조직의 비례 기여 및 각각의 조직에서의 마커의 메틸화 밀도에 의해 영향을 받았다.
동시 방정식을 풀기 위해 이차 프로그래밍 (39)이 사용되었다. 매트릭스는 유형 I 및 유형 II 마커의 조합된 목록에 대한 각각의 메틸화 마커 (총 19,418 마커)에 대한 그것의 상응하는 메틸화 밀도와 조직의 패널을 포함하여 컴파일링되었다. 참조 메틸롬은 신장, 요로상피, 중성구, 및 림프구로 구성되어 있으며 모든 조직으로부터 비례 기여는 100%로 합계될 것이다. 이들 조직 유형은 요로상피와는 별도로 이들 중 각각으로 선택되었고 신장 이식이나 HSCT에 의해 확인될 수 있었다. 방광암 환자의 수술전 및 수술후의 소변 샘플을 평가할 때, 방광암에서 유래한 메틸화 마커와 소장 메틸롬을 참조 세트에 추가했다.
G. 뇨의 cfDNA에서 저메틸화 및 복제 수 이상의 확인
8명의 정상 대조군으로부터의 뇨의 cfDNA 데이터를 사용하여 1 Mb 빈에 의한 전체 게놈 메틸화 밀도 및 복제 수가 결정되었다. 메틸화 밀도 또는 복제 수에서 유의미한 증가 또는 감소는 정상 대조군의 평균과 비교하여 3 초과의 z-점수로 정의되었다. 전반적인 메틸화 밀도 및 복제 수 변화는 circos 플롯을 사용하여 표시되었다 (35).
IX. 실시예 시스템
도 38은 본 발명의 일 구현예에 따른 시스템 (3800)을 예시한다. 도시된 바와 같은 시스템은 물리적 특징의 신호 (3815)를 제공하도록 샘플 (3805)이 검정 (3808)과 접촉할 수 있는 샘플홀더 (3810) 내의 샘플 (3805), 예컨대 무세포 DNA 분자를 포함한다. 샘플 홀더의 예는 검정의 프로브 및/또는 프라이머를 포함하는 유동전지 또는 액적이 (검정을 포함하는 액적으로) 이를 통해 이동하는 튜브일 수 있다. 샘플로부터 물리적 특징 (3815), 예컨대 형광 강도 값은 검출기 (3820)에 의해 검출된다. 검출기는 데이터 신호를 구성하는 데이터 포인트를 얻기 위해 간격 (예를 들어 주기적 간격)으로 측정을 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 아날로그 대 디지털 변환기는 검출기로부터의 아날로그 신호를 복수의 시간에 디지털 형태로 변환한다. 데이터 신호 (3825)는 검출기 (3820)로부터 로직 시스템 (3830)으로 보내진다. 데이터 신호 (3825)는 국부 메모리 (3835), 외부 메모리 (3840) 또는 저장 장치 (3845)에 저장될 수 있다.
로직 시스템 (3830)은 컴퓨터 시스템, ASIC, 마이크로프로세서, 등일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다. 이것은 또한 디스플레이 (예를 들어, 모니터, LED 디스플레이, 등) 및 사용자 입력 장치 (예를 들어, 마우스, 키보드, 버튼 등)를 포함할 수 있거나 이들과 연결될 수 있다. 로직 시스템 (3830) 및 다른 구성 요소는 독립형 또는 네트워크 접속 컴퓨터 시스템의 일부일 수 있거나 또는 열 순환 장치에 직접 부착되거나 통합될 수 있다. 로직 시스템 (3830)은 또한 프로세서 (3850)에서 실행되는 최적화 소프트웨어를 포함할 수 있다.
본 명세서에 언급된 임의의 컴퓨터 시스템은 임의의 적합한 수의 하위시스템을 이용할 수 있다. 이와 같은 하위시스템의 예는 도 39에서 컴퓨터 시스템 (10)으로 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 단일 컴퓨터 장치를 포함하며, 여기서 하위시스템은 컴퓨터 장치의 성분일 수 있다. 다른 구현예에서, 컴퓨터 시스템은 내부 성분과 함께, 각각 하위시스템인, 다수의 컴퓨터 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 데스크탑 및 랩탑 컴퓨터, 태블렛, 이동 전화 및 다른 모바일 장치를 포함할 수 있다.
도 39에 도시된 하위시스템은 시스템 버스 (75)를 통해서 서로 연결되어 있다. 추가의 하위시스템 예컨대 프린터 (74), 키보드 (78), 저장 장치(들) (79), 디스플레이 어댑터 (82)에 커플링된 모니터 (76), 및 기타가 도시되어 있다. 주변 및 입력/출력 (I/O) 장치는 I/O 컨트롤러 (71)에 커플링되어, 입력/출력 (I/O) 포트 (77)와 같이 당 업계에서 공지된 임의의 수의 수단 (예를 들어, USB, FireWire®)에 의해 컴퓨터 시스템에 연결될 수 있다. 예를 들어, I/O 포트 (77) 또는 외부 인터페이스 (81) (예를 들어, 이더넷, 와이-파이 등)을 사용하여 컴퓨터 시스템 (10)을 인터넷, 마우스 입력 장치, 또는 스캐너와 같은 광역 네트워크에 연결할 수 있다. 시스템 버스 (75)를 통한 상호연결은 중앙 프로세서 (73)가 각각의 하위시스템과 통신하도록 하고 시스템 메모리 (72) 또는 저장 장치(들) (79) (예를 들어, 고정 디스크, 예컨대 하드드라이브, 또는 광디스크)로부터 다수의 명령어의 실행, 뿐만아니라 하위시스템들 사이의 정보의 교환을 조절할 수 있도록 한다. 시스템 메모리 (72) 및/또는 저장 장치(들) (79)는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 구현할 수 있다. 또 다른 하위시스템은 데이터 수집 장치 (85), 예컨대 카메라, 마이크로폰, 가속도계 및 기타 동종의 것이다. 본 명세서에 언급된 임의의 데이터는 하나의 성분으로부터 또 다른 성분으로 출력될 수 있고, 사용자에게 출력될 수 있다.
컴퓨터 시스템은 예를 들어, 외부 인터페이스 (81)에 의해 또는 내부 인터페이스에 의해 또는 일 성분으로부터 또 다른 성분으로 연결되고 제거될 수 있는 제거 가능 저장장치를 통해 함께 연결된, 다수의 동일한 성분 또는 하위시스템을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 컴퓨터 시스템, 하위시스템, 또는 장치는 네트 워크에 걸쳐 통신할 수 있다. 그와 같은 사례에서, 하나의 컴퓨터는 클라이언트로 고려될 수 있고 또 다른 컴퓨터는 서버로 고려될 수 있으며, 여기서 각각은 동일한 컴퓨터 시스템의 부분일 수 있다. 클라이언트 및 서버는 각각 다중 시스템, 하위시스템, 또는 성분을 포함할 수 있다.
구현예의 양태는 하드웨어 (예를 들어, 적용 특이적인 집적회로 또는 필드 프로그램 가능한 게이트 어레이)를 사용하여 및/또는 모듈러 또는 집적 방식으로 일반적으로 프로그램 가능한 프로세서가 장착된 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 제어 논리 형태로 실시될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 프로세서는 단일-코어 프로세서, 동일한 집적 칩 상의 다중-코어 프로세서, 또는 단일 회로기판 또는 네트워크 상의 다중 프로세싱 장치를 포함한다. 본 명세서에 제공된 개시 내용과 교시를 기반으로, 당해 분야의 숙련가는 하드웨어 및 하드웨어와 소프트웨어의 조합을 사용하여 본 발명의 구현예를 실시하기 위한 다른 방식 및/또는 방법을 알고 인지할 것이다.
본원에 기재된 임의의 소프트웨어 성분 또는 기능은 예를 들어, 종래의 또는 대상 지향한 기술을 사용하는, 예를 들어, 자바, C, C++, C#, 오브젝티브-C, 스위프트, 또는 스크립팅 언어, 예컨대 펄 또는 파이톤과 같은 임의의 적합한 컴퓨터 언어를 사용하여 프로세서에 의해 실행될 소프트웨어 암호로서 시행될 수 있다. 소프트웨어 코드는 저장 및/또는 전송을 위해 컴퓨터 판독 가능 매체 상에 일련의 지시 또는 명령들로서 저장될 수 있다. 적합한 비-일시적 컴퓨터 판독가능 매체는 랜덤 액세스 메모리 (RAM), 읽기 전용 메모리 (ROM), 자기 매체 예컨대 하드-드라이브 또는 플로피 디스크, 또는 광학 매체 예컨대 컴팩트 디스크 (CD) 또는 DVD (디지털 다기능 디스크), 플래시 메모리, 및 기타 동종의 것을 포함할 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체는 이러한 저장 또는 전송 장치의 임의의 조합일 수 있다.
이러한 프로그램은 또한 인터넷을 비롯한, 각종 프로토콜에 따른 유선, 광학 및/또는 무선 네트워크를 통한 전송을 위해 적합한 매개체 신호를 사용하여 암호화되고 전송될 수 있다. 이와 같이, 컴퓨터 판독 가능 매체는 이러한 프로그램으로 암호화된 데이터 신호를 사용하여 생성될 수 있다. 프로그램 암호로 암호화된 컴퓨터 판독 가능 매체는 호환 장치와 함께 패키징될 수 있거나 (예를 들어, 인터넷 다운로드를 통해) 다른 장치로부터 별도로 제공될 수 있다. 임의의 이러한 컴퓨터 판독 가능 매체는 단일 컴퓨터 제품 (예를 들어, 하드 드라이브, CD, 또는 전체 컴퓨터 시스템) 상에 또는 그 내에 속할 수 있고, 시스템 또는 네트워크 내의 상이한 컴퓨터 제품에 또는 제품 내에 존재할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 모니터, 프린터, 또는 본 명세서에 언급된 결과 중 임의의 것을 사용자에게 제공하기에 적합한 다른 디스플레이를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 기재된 임의의 방법은 단계를 수행하기 위해 구성될 수 있는, 하나 이상의 프로세서를 포함하는 컴퓨터 시스템으로 전체적으로 또는 부분적으로 수행될 수 있다. 따라서, 구현예는 잠재적으로 각각의 단계 또는 각각의 단계의 군을 수행하는 상이한 부품과 함께, 본 명세서에 기술된 임의의 방법의 단계를 수행하기 위해 구성된 컴퓨터 시스템에 대한 것일 수 있다. 번호 매긴 단계로서 제공되더라도, 본 명세서의 방법의 단계는 동시에 또는 상이한 순서로 수행될 수 있다. 추가로, 이들 단계의 일부는 다른 방법으로부터의 다른 단계의 일부와 함께 사용될 수 있다. 또한, 단계의 모두 또는 일부는 선택적일 수 있다. 추가로, 임의의 방법 중 임의의 단계는 이들 단계를 수행하기 위한 모듈, 단위, 회로, 또는 다른 수단과 함께 수행될 수 있다.
특정 구현예의 구체적인 세부사항은 본 발명의 구현예들의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 구현예는 각각의 개별 양태에 관한 구체적인 구현예, 또는 이들 개별 양태의 구체적인 조합에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 예시적 구현예들의 상기 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제공된다. 본 발명을 기술된 정확한 형태로 철저하게 하거나 제한하는 것을 의도하지 않으며, 많은 변형 및 변화가 상기 교시의 측면에서 가능할 수 있다.
이전의 설명에서, 설명의 목적으로, 다수의 세부 사항은 본 기술의 다양한 구현예의 이해를 제공하기 위해 설명되었다. 그러나, 특정 구현예는 이들 세부 사항 중 일부 또는 추가 세부 사항없이 실시될 수 있음은 당해 분야의 숙련가게 명백할 것이다.
여러 구현예를 설명하였지만, 이는 다양한 변형, 대안적인 구조 및 등가물이 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고 사용될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 것이다. 또한, 본 발명을 불필요하게 모호하게 하는 것을 피하기 위해 다수의 공지된 프로세스 및 요소가 설명되지 않았다. 추가로, 임의의 특정 구현예의 세부 사항은 그 구현예의 변형에 항상 존재하지 않을 수도 있고 다른 구현예에 추가될 수도 있다.
값들의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 그 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 단위의 1/10까지 각각의 중간값이 또한 구체적으로 개시된다는 것을 이해해야 한다. 명시된 범위의 임의의 명시된 값 또는 중간값 사이의 각각의 더 작은 범위와 그 명시된 범위의 임의의 다른 명시된 값 또는 중간 값이 포함된다. 이들보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에서 포함 또는 배제될 수 있으며, 어느 한 범위, 모두 아니거나 또는 두 범위 모두가 더 작은 범위에 포함되는 각각의 범위는 또한 명시된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계로 되는 본 발명 내에 포함된다. 명시된 범위가 한도의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한도의 어느 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 또한 포함된다.
관사 또는 단수형태의 인용은 반대로 구체적으로 나타내지 않은 한, "하나 이상"을 의미하는 것으로 의도된다. "또는"의 사용은 반대로 구체적으로 나타내지 않는 한 "배타적인 또는"이 아니라 "포괄적인 또는"을 의미하는 것으로 의도된다. "제1" 성분에 대한 언급은 반드시 제2 성분이 제공될 것을 요구하지 않는다. 또한 "제1" 또는 "제2" 성분에 대한 언급은 명시적으로 언급하지 않는 한 참조된 성분을 특정 위치로 제한하지 않는다. "에 기반한" 용어는 "적어도 부분적으로 기반한다"는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허출원, 공보, 및 설명은 모든 목적을 위해서 전체적으로 참고로 포함된다. 어느 것도 선행 기술인 것으로 허용되지 않는다.
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Claims (62)
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상기 생물학적 샘플은 제1 조직 유형을 포함하는 복수의 조직 유형으로부터의 무세포 DNA 분자의 혼합물을 포함하고, 상기 방법은
N 게놈 부위를 확인하는 단계로서, N은 10 이상의 정수인 단계;
각각의 M 조직 유형에 대해, 상기 N 게놈 부위에서 N 조직-특이적 메틸화 수준을 획득하는 단계로서, N은 M 이상이고, 상기 조직-특이적 메틸화 수준은 N 곱하기 M 차원의 매트릭스 A를 형성하고, 상기 M 조직 유형 중 하나는 제1 장기의 제1 질환에 상응하는 제1 이환 조직 유형에 상당하는 것인 단계;
컴퓨터 시스템에 의해, 생물학적 샘플로부터의 복수의 무세포 DNA 분자를 분석하는 단계로서, 상기 복수의 무세포 DNA 분자는 적어도 1,000개의 무세포 DNA 분자이고, 여기서 무세포 DNA 분자를 분석하는 단계는 상기 유기체에 상응하는 참조 게놈에서의 무세포 DNA 분자의 위치를 확인하는 단계를 포함하는 것인 단계;
N 게놈 부위 중 임의의 하나에 각각 위치한 복수의 무세포 DNA 분자의 세트를 확인하는 단계;
복수의 무세포 DNA 분자의 세트를 사용하여 N 게놈 부위에서 N 혼합물 메틸화 수준을 측정하는 단계;
컴퓨터 시스템에 의해, 각각의 M 조직 유형의 N 혼합물 메틸화 수준 및 N 조직-특이적 메틸화 수준을 사용하여 혼합물에서의 제1 이환 조직 유형의 제1 부분적 기여를 결정하는 단계; 및
제1 이환 조직 유형의 제1 부분적 기여를 이용하여, 유기체에서의 제1 장기에 대한 제1 질환의 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 M 조직 유형 중 제2 조직 유형이 제1 장기의 제2 질환에 상응하는 제2 이환 조직 유형에 상응하고, 상기 방법은 추가로
컴퓨터 시스템에 의해, 각각의 M 조직 유형의 N 혼합물 메틸화 수준 및 N 조직-특이적 메틸화 수준을 사용하여 혼합물에서의 제2 이환 조직 유형의 제2 부분적 기여를 결정하는 단계; 및
제2 이환 조직 유형의 제2 부분적 기여를 이용하여, 유기체에서의 제1 장기에 대한 제2 질환의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 M 조직 유형 중 제2 조직 유형이 제2 장기의 제2 질환에 상응하는 제2 이환 조직 유형에 상응하고, 상기 방법은 추가로
컴퓨터 시스템에 의해, 각각의 M 조직 유형의 N 혼합물 메틸화 수준 및 N 조직-특이적 메틸화 수준을 사용하여 혼합물에서의 제2 이환 조직 유형의 제2 부분적 기여를 결정하는 단계; 및
제2 이환 조직 유형의 제2 부분적 기여를 이용하여, 유기체에서의 제2 장기에 대한 제2 질환의 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 M 조직 유형 중 제2 조직 유형은 제1 장기의 건강한 조직에 상응하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 제1 장기로부터 유래하거나 또는 생물학적 샘플이 유기체를 빠져 나올 때 제1 장기를 통과하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 소변이고, 상기 제1 장기는 방광인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 소변이고, 상기 제1 장기는 신장인 방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 제1 질환은 사구체신염 또는 신장증후군인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 타액이고 상기 제1 장기는 침샘인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제1 질환은 암인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 소변 샘플이고, 상기 방법은
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 첨가함으로써 소변 샘플을 제조하는 단계를 더 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 샘플에서의 무세포 DNA 및 세포 DNA의 비례 기여를 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 N 게놈 부위는 역치량 미만의 개체간 변이를 가지는 부위를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 M 조직 유형은 신장, 요로상피, 중성구, B-세포, 및 T-세포를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 N 게놈 부위는 정상 요로상피의 메틸롬에서의 부위를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 N 게놈 부위는 정상 요로상피의 메틸롬 및 종양 메틸롬에 공통인 부위를 포함하는 것인 방법.
- 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법으로서, 상기 소변 샘플은 정상 세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포로부터 유래되는 DNA를 포함하고, 상기 DNA 중 적어도 일부는 소변 샘플에서 무세포이고, 상기 방법은
복수의 크기의 각각의 크기에 대해
크기에 상응하는 소변 샘플로부터의 DNA 단편의 양을 측정하는 단계;
복수의 크기에서의 DNA 단편의 양에 기초하여 제1 파라미터의 제1 값을 계산하는 단계로서, 상기 제1 파라미터는 소변 샘플에서의 DNA 단편의 크기 프로파일의 통계적 척도를 제공하고, 상기 제1 파라미터는 DNA 단편의 크기가 증가함에 따라 증가하는 것인 단계;
상기 제1 값을 기준값에 비교하는 단계; 및
상기 비교하는 단계에 기초하여 방광암의 수준의 분류를 결정하는 단계를 포함하는, 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법. - 청구항 17에 있어서, 상기 기준값은 방광암이 있는 및/또는 방광암이 없는 것으로 각각 알려진 샘플로부터 결정되는 것인 방법.
- 청구항 17에 있어서,
상기 제1 파라미터는 주기성 지수를 포함하고, 상기 주기성 지수는 크기 프로파일에서의 복수의 피크에서의 DNA 단편의 양과 크기 프로파일에서의 복수의 골에서의 DNA 단편의 양에서의 차이를 사용하여 계산되고,
상기 복수의 피크는 규칙적 크기 간격으로 존재하고,
상기 복수의 골은 복수의 피크로부터 오프셋된 규칙적 크기 간격으로 존재하는 것인 방법. - 청구항 17에 있어서, 상기 방광암의 수준의 분류를 결정하는 단계는 제1 값이 기준값보다 클 때 유기체가 방광암을 가진 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 방광암의 수준은 방광암의 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 17에 있어서, 상기 기준값은 유기체의 방광으로부터 종양을 제거하는 수술 전 유기체로부터 결정되는 것인 방법.
- 유기체의 신장의 신우로부터의 소변 샘플을 분석하는 방법으로서,
상기 소변 샘플은 DNA를 포함하고, 상기 DNA 중 적어도 일부는 무세포이고, 상기 방법은
복수의 크기의 각각의 크기에 대해, 크기에 상응하는 소변 샘플로부터의 DNA 단편의 양을 측정하는 단계;
복수의 크기에서의 DNA 단편의 양에 기초하여 제1 파라미터의 제1 값을 계산하는 단계로서, 상기 제1 파라미터는 소변 샘플에서의 DNA 단편의 크기 프로파일의 통계적 척도를 제공하는 것인 단계;
상기 제1 값을 기준값에 비교하는 단계; 및
상기 비교하는 단계에 기초하여 신장에서의 염증의 수준의 분류를 결정하는 단계를 포함하는, 유기체의 신장의 신우로부터의 소변 샘플을 분석하는 방법. - 청구항 23에 있어서, 상기 제1 파라미터는 DNA 단편의 크기가 증가함에 따라 증가하는 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 제1 값이 기준값보다 클 때 신장이 염증성인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 소변 샘플을 신장의 신우로부터 얻는 단계를 더 포함하는 방법.
- 청구항 23에 있어서,
상기 제1 파라미터는 주기성 지수를 포함하고, 상기 주기성 지수는 크기 프로파일에서의 복수의 피크에서의 DNA 단편의 양과 크기 프로파일에서의 복수의 골에서의 DNA 단편의 양에서의 차이를 사용하여 계산되고,
상기 복수의 피크는 규칙적 크기 간격으로 존재하고,
상기 복수의 골은 복수의 피크로부터 오프셋된 규칙적 크기 간격으로 존재하는 것인 방법. - 청구항 23에 있어서, 상기 제1 파라미터는 역치 크기를 갖는 DNA 단편의 중앙값 또는 비율을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 23에 있어서, 상기 기준값은 유기체가 건강한 것으로 알려져 있을 경우 유기체로부터 결정되는 것인 방법.
- 유기체의 제1 샘플 및 혈액 샘플을 분석함으로써 유기체의 제1 장기에서의 암을 확인하는 방법으로서,
상기 제1 샘플 및 혈액 샘플 둘 모두는 정상 세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포로부터 유래된 DNA를 포함하고, 상기 제1 샘플은 제1 장기로부터 유래하거나 제1 샘플이 유기체를 빠져 나올 때 제1 장기를 통과하며 상기 혈액 샘플과는 상이하고, 그리고 DNA 중 적어도 일부는 제1 샘플 및 혈액 샘플 둘 모두에서 무세포이고,
상기 방법은
상기 제1 샘플 및 혈액 샘플로부터의 복수의 DNA 분자를 분석하는 단계로서, 여기서 DNA 분자를 분석하는 단계는 유기체의 게놈 내 DNA 분자의 위치를 확인하는 단계, 및 선택적으로 상기 DNA 분자가 하나 이상의 부위에서 메틸화되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 단계;
유기체의 복수의 염색체 영역의 각각의 염색체 영역에 대해,
확인된 위치에 기초하여, 상기 각각의 샘플로부터의 DNA 분자의 각각의 그룹을 염색체 영역으로부터 유래하는 것으로서 확인하는 단계로서, 상기 각각의 그룹은 염색체 영역의 각각의 복수의 유전자좌에 위치한 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 것인 단계,
컴퓨터 시스템으로, DNA 분자의 각각의 그룹의 각각의 값을 계산하는 단계로서, 상기 각각의 값은 각각의 그룹의 DNA 분자의 특성을 정의하고, 상기 특성은 복제 수 또는 메틸화 수준 중 적어도 하나인 단계, 및
상기 각각의 값을 기준값에 비교하는 단계
에 의해 제1 샘플 및 혈액 샘플 각각에 대한 염색체 영역이 복제 수 이상 또는 메틸화 이상 중 적어도 하나의 이상을 나타내는지 여부의 분류를 결정하는 단계;
제1 샘플에 대해 이상을 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제1 양이 제1 역치보다 높은지 여부에 기초하여 암의 제1 수준을 결정하는 단계;
혈액 샘플에 대해 이상을 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제2 양이 제2 역치보다 높은지 여부에 기초하여 암의 제2 수준을 결정하는 단계; 및
암의 제1 수준이 유기체가 암을 가진 것을 나타내고 암의 제2 수준이 유기체가 암을 갖지 않는 것을 나타내는 경우 유기체가 제1 장기의 암을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 유기체의 제1 샘플 및 혈액 샘플을 분석함으로써 유기체의 제1 장기에서의 암을 확인하는 방법. - 청구항 30에 있어서, 상기 메틸화 이상은 저메틸화 또는 과메틸화를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 제1 샘플은 소변, 타액, 또는 대변인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 복수의 염색체 영역은 중첩하지 않는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 혈액 샘플은 혈장 또는 혈청인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 DNA 분자를 분석하는 단계는 상기 DNA 분자가 하나 이상의 부위에서 메틸화되었는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 기준값은 정상 샘플에 대해 결정되는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 각각의 염색체 영역에 대한 기준값은 인접하는 염색체 영역에 대한 기준값에 대한 각각의 값의 비교에 의존하는 것인 방법.
- 청구항 30에 있어서, 상기 DNA 분자가 하나 이상의 부위에서 메틸화되었는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 이상은 저메틸화이고,
상기 특성은 메틸화 수준인 방법. - 청구항 30에 있어서,
상기 이상은 복제 수 이상이고,
상기 특성은 복제 수인 방법. - 청구항 30에 있어서,
상기 각각의 값은 복제 수 및 메틸화 수준 둘 모두를 사용하여 계산되는 것인 방법. - 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법으로서,
상기 소변 샘플은 정상 세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포로부터 유래된 DNA를 포함하고, 상기 DNA 중 적어도 일부는 소변 샘플에서 무세포이고, 상기 방법은
상기 소변 샘플로부터의 복수의 DNA 분자를 분석하는 단계로서, 상기 DNA 분자를 분석하는 단계는 유기체의 게놈에서의 DNA 분자의 위치를 확인하는 단계를 포함하는 것인 단계;
상기 유기체의 복수의 염색체 영역의 각각의 염색체 영역에 대해,
확인된 위치에 기초하여, 상기 소변 샘플로부터의 DNA 분자의 그룹을 염색체 영역으로부터 유래하는 것으로서 확인하는 단계로서, 상기 그룹은 염색체 영역의 각각의 복수의 유전자좌에 위치한 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 것인 단계,
컴퓨터 시스템으로, DNA 분자의 그룹의 값을 계산하는 단계로서, 상기 값은 그룹의 DNA 분자의 특성을 정의하고, 상기 특성은 복제 수 또는 메틸화 수준 중 적어도 하나인 단계, 및
상기 값을 기준값에 비교하는 단계에 의해 상기 염색체 영역이 복제 수 이상 또는 메틸화 이상 중 적어도 하나의 이상을 나타내는지 여부의 분류를 결정하는 단계;
소변 샘플에 대해 복제 수 이상을 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제1 양이 제1 역치보다 높은지 여부에 기초하여 암의 제1 수준을 결정하는 단계;
소변 샘플에 대해 메틸화 이상을 나타내는 것으로 분류된 염색체 영역의 제2 양이 제2 역치보다 높은지 여부에 기초하여 암의 제2 수준을 결정하는 단계;
종양 조직의 부분적 기여가 제3 역치보다 높은지 여부에 기초하여 암의 제3 수준을 결정하는 단계; 및
암의 제1 수준, 암의 제2 수준 또는 암의 제3 수준 중 적어도 하나가 유기체가 암을 갖는 것을 나타내는 경우 유기체가 암을 갖는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 유기체의 소변 샘플을 분석하는 방법. - 청구항 41에 있어서, 상기 메틸화 이상은 저메틸화 또는 과메틸화를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 41에 있어서, 종양 조직의 부분적 기여를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 43에 있어서, 상기 종양 조직의 부분적 기여를 결정하는 단계는 종양 특이적 체세포 돌연변이, 종양 특이적 메틸화 서명, 종양 특이적 단편 말단 패턴, 또는 단편 크기 분석을 이용함에 의한 것인 방법.
- 청구항 43에 있어서, 상기 종양 조직의 부분적 기여를 결정하는 단계는 게놈 부위에서 수득된 조직-특이적 메틸화 수준 및 측정된 메틸화 수준으로부터 종양 조직의 부분적 기여를 추정함에 의한 것인 방법.
- 청구항 43에 있어서, 상기 종양 조직의 부분적 기여를 결정하는 단계는 하기 단계에 의한 것인 방법:
N 게놈 부위를 확인하는 단계로서, N은 10 이상의 정수인 단계;
각각의 M 조직 유형에 대해, 상기 N 게놈 부위에서 N 조직-특이적 메틸화 수준을 획득하는 단계로서, N은 M 이상이고, 상기 조직-특이적 메틸화 수준은 N 곱하기 M 차원의 매트릭스 A를 형성하고, 상기 M 조직 유형 중 하나는 방광의 암에 상응하는 종양 조직에 상당하는 것인 단계;
컴퓨터 시스템에 의해, 소변 샘플로부터의 복수의 무세포 DNA 분자를 분석하는 단계로서, 상기 복수의 무세포 DNA 분자는 적어도 1,000개 무세포 DNA 분자이고, 상기 무세포 DNA 분자를 분석하는 단계는 유기체에 상응하는 참조 게놈에서의 무세포 DNA 분자의 위치를 확인하는 단계를 포함하는 것인 단계;
N 게놈 부위 중 임의의 하나에 각각 위치한 복수의 무세포 DNA 분자의 세트를 확인하는 단계;
복수의 무세포 DNA 분자의 세트를 사용하여 N 게놈 부위에서 N 혼합물 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
컴퓨터 시스템에 의해, 각각의 M 조직 유형의 N 혼합물 메틸화 수준 및 N 조직-특이적 메틸화 수준을 사용하여 혼합물에서의 종양 조직의 부분적 기여를 결정하는 단계. - 청구항 41에 있어서, 암의 제1 수준, 암의 제2 수준, 또는 암의 제3 수준 중 적어도 2종이 유기체가 암을 갖는 것을 나타내거나 또는 암의 제1 수준, 암의 제2 수준, 및 암의 제3 수준이 유기체가 암을 갖는 것을 나타내는 경우 유기체는 암을 갖는 것으로 결정하는 것인 방법.
- 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법으로서,
상기 생물학적 샘플은 정상 세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포로부터 유래된 DNA를 포함하고, 상기 DNA 중 적어도 일부는 생물학적 샘플에서 무세포이고, 상기 방법은
상기 생물학적 샘플의 DNA 분자에 상응하는 복수의 서열 리드(sequence read)를 받는 단계;
상기 서열 리드에 대한 게놈 위치를 결정하는 단계;
상기 서열 리드를 참조 게놈에 비교하여, 참조 게놈과 하나의 불일치를 가지는 서열 리드를 결정하는 단계;
참조 게놈과 하나의 불일치를 갖는 서열 리드의 계수에 기초하여, 파라미터를 결정하는 단계;
상기 파라미터를 역치 값과 비교하는 단계; 및
상기 역치 값에 대한 파라미터의 비교를 사용하여 암의 수준의 분류를 결정하는 단계를 포함하는, 유기체의 생물학적 샘플을 분석하는 방법. - 청구항 48에 있어서, 복수의 불일치가 체세포 돌연변이 및 서열분석 오류로부터 발생하는 것인 방법.
- 청구항 48에 있어서, 상기 서열 리드의 계수는 정확히 하나의 불일치를 갖는 서열 리드의 것인 방법.
- 청구항 48에 있어서, 상기 암의 수준의 분류를 결정하는 단계는 복제 수 이상, 저메틸화, 과메틸화, 또는 종양 기여 중 적어도 하나를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 인간의 소변 샘플을 분석하는 방법으로서,
상기 소변 샘플은 정상 세포 및 잠재적으로 암과 관련된 세포로부터 유래된 DNA를 포함하고, 상기 DNA 중 적어도 일부는 소변 샘플에서 무세포이고, 상기 방법은
상기 소변 샘플의 DNA 분자에 상응하는 복수의 서열 리드를 얻는 단계;
복수의 서열 리드의 각각의 서열 리드에 대해,
컴퓨터 시스템에 의해 상기 서열 리드가 인간 참조 게놈에 정렬할 때 상기 서열 리드를 인간 리드로 분류하는 단계, 또는
상기 서열 리드가 제1 병원체의 종 또는 속에 상응하는 제1 병원체 참조 게놈에 정렬할 때 상기 서열 리드를 제1 병원체 리드로 분류하는 단계;
제1 병원체 리드의 양에 기초하여 파라미터를 결정하는 단계;
상기 파라미터를 컷오프 값에 비교하는 단계로서, 상기 컷오프 값은 방광암을 가진 참조 샘플의 제1 세트 및 방광암을 갖지 않는 대조군 샘플의 제2 세트로부터 결정되는 것인 단계; 및
상기 비교를 사용하여 방광암의 수준의 분류를 결정하는 단계를 포함하는, 인간의 소변 샘플을 분석하는 방법. - 청구항 52에 있어서, 서열 리드를 상기 제1 병원체 리드로 분류하는 단계는 상기 서열 리드를 하나 이상의 박테리아 참조 게놈에 정렬하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 52에 있어서, 상기 제1 병원체는 박테리아인 방법.
- 청구항 54에 있어서, 상기 박테리아는 할로노티우스, 써모코쿠스, 니트로소푸밀루스, 또는 악티노마이세스를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 52에 있어서, 추가로
상기 파라미터는 제1 파라미터이고,
상기 컷오프 값은 제1 컷오프 값이고,
복수의 서열 리드의 각각의 서열 리드에 대해,
상기 서열 리드가 제2 병원체의 종 또는 속에 상응하는 제2 병원체 참조 게놈에 정렬할 때 상기 서열 리드를 제2 병원체 리드로 분류하는 단계;
제2 병원체 리드의 제2 양에 기초하여 제2 파라미터를 결정하는 단계;
상기 제2 파라미터를 제2 컷오프 값에 비교하는 단계; 및
제1 컷오프 값에 대한 제1 파라미터의 비교 및 제2 컷오프 값에 대한 제2 파라미터의 비교를 사용하여 방광암의 수준의 분류를 결정하는 단계를 포함하는 방법. - 청구항 52에 있어서, 상기 제1 병원체는 마이코박테리움, 할로박테리움, 악티노마이세스, 코라이네박테리움, 또는 칸디다투스를 포함하는 것인 방법.
- 상기 방법 중 어느 하나의 연산을 수행하도록 컴퓨터 시스템을 제어하는 복수의 명령을 저장하는 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함하는 컴퓨터 제품.
- 청구항 58의 컴퓨터 제품; 및
컴퓨터 판독 가능 매체 상에 저장된 명령을 실행하기 위한 하나 이상의 프로세서를 포함하는, 시스템. - 상기 방법 중 어느 하나를 수행하기 위한 수단을 포함하는 시스템.
- 상기 방법 중 어느 하나를 수행하도록 구성된 시스템.
- 상기 방법 중 어느 하나의 단계를 각각 수행하는 모듈을 포함하는 시스템.
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