KR20220153516A

KR20220153516A - 항-gitr 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220153516A
Application number: KR1020220057513A
Authority: KR
Inventors: 강유회; 조홍석
Original assignee: 메디맵바이오 주식회사
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2022-05-10
Publication date: 2022-11-18
Also published as: KR20220166248A; JP2024517319A; KR102475255B1; AU2022272117A1; WO2022240161A1; CN117813327A; EP4339209A1

Abstract

신규한 항-GITR 항체 및 이의 면역증강, 항암 및 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

항-GITR 항체 및 이의 용도{Anti-GITR antibodies and uses thereof}

암 면역요법은 체내 면역작용을 이용해서 암을 치료하는 방법으로, 화학요법, 외과요법, 방사선 요법에 이어 암의 제4 치료법으로 불린다. 암 면역요법은 면역계를 활성화시켜 종양 세포에 대한 인식 및 반응을 증가시키는 메커니즘을 필요로 한다. 면역계 활성화는 항원-특이적 반응의 개시에 중요한 항원-제시 세포 및 종양 세포 파괴를 담당하는 이펙터(effector) 세포 등과 같은 다양한 세포의 기능을 수반하는 복잡한 메카니즘이다.

한편, GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein)은 Tumor necrosis factor receptor(TNFR) superfamily의 일원으로, T 세포를 활성화하여 면역반응을 촉진하는 역할을 한다.

따라서, GITR 작용을 활성화하여 면역증진 효과를 가지는 약물의 개발이 요구된다.

GITR에 결합하는 항-GITR　항체 또는 이의 항원결합단편, 및 이의 의약 용도가 제공된다.

본 명세서에서 제공되는 항-GITR　항체 또는 이의 항원결합단편은 GITR에 대하여 효능제(agonist)로서 작용하는 것일 수 있다.

일 예는 GITR에 결합하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.

상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은,

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성결정부위(Complementarity Determining　Regions; CDRs) 또는 상기 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성결정부위 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역

을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1)는 서열번호 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2)는 서열번호 10, 11, 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은,

서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및

서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역

을 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역증강제 또는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편을 유효성분으로 포함하는 항암제 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역증강 용도 또는 면역증강제 제조를 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도 또는 암의 예방 및/또는 치료용 약물의 제조를 위한 용도를 제공한다.

다른 예는 항-GITR 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 예는 항-GITR 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자 및 항-GITR 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 하나의 벡터 함께 포함하거나 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 상기 핵산 분자의 발현을 위한 발현벡터일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.

다른 예는 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 생산 방법을 제공한다. 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 방법은 상기 발현시키는 단계 이후에 배지로부터 항체를 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서, GITR에 결합하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편, 및 이들의 의약 용도가 제공된다. 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은 GITR에 대하여 효능제(agonist)로서 작용함으로써, 면역을 활성화(e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가지며, 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein)"는　GITR　리간드(GITR-L)에 결합하는 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 구성원 중 하나의 수용체를 지칭한다.　GITR은 또한 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 18(TNFRSF18), AITR 및　CD357로도 지칭될 수 있다. 상기 GITR은 세포에 의해 자연 발현되는　GITR 뿐 아니라, 이의 임의의 변이체 또는 이소형을 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 GITR는 인간　GITR 또는 이의 이소형일 수 있으며, 예컨대, UniProt Accession No. Q9Y5U5-1 (NCBI Accession No. NP_004186.1; NM_004195.3에 의하여 암호화 됨), NCBI Accession No. NP_683699.1(NM_148901.2에 의하여 암호화 됨), NCBI Accession No. NP_683700.1(NM_148902.1에 의하여 암호화 됨) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 보다 상세히 설명한다.

항체 또는 항원결합단편

상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은,

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1),

서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2),

서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3),

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1),

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및

서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)

를 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은,

서열번호 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1),

서열번호 10, 11, 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및

를 포함하는 것일 수 있다.

구체예에서, 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은,

(1) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3;

(2) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는

(3) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3

를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 상보성결정부위(CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된다.

일 구체예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 6개 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3)을 아래의 표 1에 정리하였다:

	서열	서열번호
CDR-H1	GYWIX(X = E, N, or D)	1
CDR-H1	GYWIE	7
CDR-H1	GYWIN	8
CDR-H1	GYWID	9
CDR-H2	EILPGSGATYYSENFKG	2
CDR-H3	KGGYYAMDY	3
CDR-L1	TASSSVSSSYFH	4
CDR-L2	STSNLXS(X = A, Q, or E)	5
CDR-L2	STSNLAS	10
CDR-L2	STSNLQS	11
CDR-L2	STSNLES	12
CDR-L3	HLYHRSPRT	6

(상기 표 1에서, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3는 중쇄 상보성결정부위를 의미하고, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3는 경쇄 상보성결정부위를 의미한다)일 예에서, 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은,

서열번호 1(예컨대, 서열번호 7, 8, 또는 9)의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3를 포함하는 중쇄 가변영역, 및

서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5(예컨대, 서열번호 10, 11, 또는 12)의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3를 포함하는 경쇄 가변영역

을 포함하는 것일 수 있다.

(1) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변영역;

(2) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는

(3) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변영역, 및

서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변영역.

일 예에서, 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은,

을 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은 다음을 포함하는 것일 수 있다:

서열번호 13의 중쇄 가변영역 및 서열번호 19의 경쇄 가변 영역;

서열번호 14의 중쇄 가변영역 및 서열번호 20의 경쇄 가변 영역;

서열번호 15의 중쇄 가변영역 및 서열번호 21의 경쇄 가변 영역;

서열번호 16의 중쇄 가변영역 및 서열번호 22의 경쇄 가변 영역;

서열번호 17의 중쇄 가변영역 및 서열번호 23의 경쇄 가변 영역; 또는

서열번호 18의 중쇄 가변영역 및 서열번호 24의 경쇄 가변 영역.

경우에 따라서(예컨대, 재조합적으로 제작시), 상기 중쇄 가변영역 및/또는 경쇄 가변영역은 N 말단에 적절한 신호서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편에 포함 가능한 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 예시하였다:

	아미노산 서열(N→C)	서열번호
중쇄가변영역	QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKTTGYRFT GYWIE WVKQRPGHGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KATFTADTSSNTAYMQVSSLTTGDSAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTSVTVSS	13
중쇄가변영역	QVQLVQSGAELKKPGASVKLSCKTTGYRFT GYWIE WVRQPPGKGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KATITADTSTNTAYMEVSSLRSGDSAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTSVTVSS	14
중쇄가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKTTGYRFT GYWIE WVRQPPGKGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KATITADTSTNTAYMEVSSLRSEDTAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTLVTVSS	15
중쇄가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTTGYRFT GYWIE WVRQPPGKGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTLVTVSS	16
중쇄가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTTGYRFT GYWIN WVRQPPGKGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTLVTVSS	17
중쇄가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTTGYRFT GYWID WVRQPPGKGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTLVTVSS	18
경쇄가변영역	QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTC TASSSVSSSYFH WYQQKPGSSPKLWIY STSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSSLEAEDAATYYC HLYHRSPRT FGGGTTLDIK	19
경쇄가변영역	QIVLTQSPAIMSASLGERVTMSC TASSSVSSSYFH WYQQKPGSAPKLWIY STSNLAS GVPDRFSGSGSGTDYTLTVSSLQAEDVATYYC HLYHRSPRT FGGGTTVDIK	20
경쇄가변영역	QIVLTQSPATLSLSPGERATMSC TASSSVSSSYFH WYQQKPGSAPKLWIY STSNLAS GVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYC HLYHRSPRT FGGGTKVEIK	21
경쇄가변영역	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC TASSSVSSSYFH WYQQKPGSAPKLWIY STSNLAS GVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYC HLYHRSPRT FGGGTKVEIK	22
경쇄가변영역	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC TASSSVSSSYFH WYQQKPGKAPKLWIY STSNLQS GVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYC HLYHRSPRT FGGGTKVEIK	23
경쇄가변영역	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC TASSSVSSSYFH WYQQKPGKAPKLWIY STSNLES GVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYC HLYHRSPRT FGGGTKVEIK	24

(표 2에서, 밑줄로 표시된 영역은 순서대로 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 나타냄)

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은 GITR 단백질, 예컨대, 인간 GITR 단백질(서열번호 33의 아미노산 잔기 26-241 영역; 아미노산 잔기 1-25는 신호서열임)의 아미노산 잔기 92 내지 132 영역 내 하나 이상의 아미노산에 결합하는 것이 수 있으며, 예컨대, 아미노산 잔기 92-96(SGTFS, 서열번호 34), 107-116(TDCTQFGFLT, 서열번호 35), 및 122-132(KTHNAVCVPGS, 서열번호 36) 중에서 선택된 하나 이상의 영역 및/또는 상기 영역 내 하나 이상의 아미노산에 결합하는 것일 수 있으며, 적어도, 92S(92번째 아미노산 잔기인 Ser(S), 이하 동일하게 해석), 96S, 107T, 110T, 116T, 122K 및 132S로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(상기 인간 GITR의 아미노산 잔기 위치는 신호서열(1-25)을 제외한 26번째 아미노산 잔기부터 기산함).

[인간 GITR (UniProt Q9Y5U5-1, 서열번호 33, 아미노산 잔기 1-25 영역(이탤릭체)은 신호서열임)]

MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPLGWLTVVLLAVAACVLLLTSAQLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV

본 명세서에서 "항체"라 함은, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 단백질을 총칭하는 것으로서, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 단백질 또는 이를 화학적 합성 또는 재조합적으로 제조한 단백질일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 비자연적으로 생성된 것, 예컨대, 재조합적 또는 합성적으로 생성된 것일 수 있다. 상기 항체는 동물 항체(예컨대, 마우스 항체 등), 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 프레임워크 부위, 및/또는 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다. 일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체는 인간 IgG형 항체, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 형태의 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

완전한 항체(예컨대, IgG형)는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체는 중쇄 불변영역으로서 IgG의 불변영역, 경쇄 불변영역으로서 카파 불변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 상기 IgG(예컨대, 인간 IgG1)의 불변영역은 야생형일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 IgG의 불변영역은, 인간 IgG1을 기준으로, N298A(298번째 아미노산인 N이 A로 치환됨)의 변이를 포함하는 변이형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미하는 것으로, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

본 명세서에 기재된 상보성결정부위(CDR)는 kabat system에 따른 CDR 정의를 기준으로 결정된 것이다.

본 명세서에서 항체는, 특별한 언급이 없는 한, 항원 결합능을 보유하는 항체의 항원결합단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

용어, "항원결합단편"은 항원이 결합할 수 있는 부분(예컨대, 본 명세서에서 정의된 6개의 CDR)을 포함하는 모든 형태의 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항원결합단편 중, Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다.

F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.

상기 항원결합단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

본 명세서에서 제공되는　항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 상기 항체는 통상의 방법에 의하여 동물(예컨대, 마우스) 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.

한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 GITR의 수용체 결합 도메인과의 결합능에 기초하여 개별 단클론 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해GITR의 수용체 결합 도메인에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정할 수 있다.

최종 선택된 항체들은 항원결합부위를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체의 항원결합단편은 상기 항-GITR 항체에서 유래하고 항원(GITR)에 대한 결합력을 보유하는 단편을 의미하는 것으로, 상기한 항-GITR 항체의 6개의 CDR을 포함하는 임의의 폴리펩타이드, 예를 들어 scFv, scFv-Fc, scFv-Ck(카파 불변영역), scFv-Cλ(람다 불변영역), (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 항원결합단편은 scFv, 또는 scFv가 면역글로불린(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등)의 Fc 부위와 융합된 융합 폴리펩타이드(scFv-Fc) 또는 경쇄의 불변 영역(예컨대, 카파 또는 람다)와 융합된 융합 폴리펩타이드(scFv-Ck 또는 scFv-Cλ)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 항체(예컨대, CDR, 가변영역, 또는 중쇄/경쇄, 항원결합단편 등)가 "특정 아미노산 서열을 포함한다, 또는 특정 아미노산 서열로 이루어진다 또는 표현된다" 함은 상기 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 경우, 및 상기 아미노산 서열에 항체 활성(예컨대, 항원 친화도, 약리적 활성 등)에 유의한 영향이 없는 무의미한 변이(예컨대, 아미노산 잔기의 치환, 결실, 및/또는 추가)가 도입된 경우를 모두 의미하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은 GITR(e.g., 인간 GITR)에 대한 결합 친화도(K_D)가, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance, SPR; 예: Biacore)으로 측정된 경우를 기준으로, 10mM 이하, 5 mM 이하, 1mM 이하, 0.5mM 이하, 0.2mM 이하, 0.1mM 이하, 0.05mM 이하, 0.01mM 이하, 0.005mM 이하, 또는 0.001mM 이하일 수 있으며, 예를 들어, 0.0001nM 내지 10mM, 0.0005nM 내지 10mM, 0.001nM 내지 10mM, 0.005nM 내지 10mM, 0.01nM 내지 10mM, 0.05nM 내지 10mM, 0.1nM 내지 10mM, 0.5nM 내지 10mM, 1nM 내지 10mM, 0.0001nM 내지 5mM, 0.0005nM 내지 5mM, 0.001nM 내지 5mM, 0.005nM 내지 5mM, 0.01nM 내지 5mM, 0.05nM 내지 5mM, 0.1nM 내지 5mM, 0.5nM 내지 5mM, 1nM 내지 5mM, 0.0001nM 내지 1mM, 0.0005nM 내지 1mM, 0.001nM 내지 1mM, 0.005nM 내지 1mM, 0.01nM 내지 1mM, 0.05nM 내지 1mM, 0.1nM 내지 1mM, 0.5nM 내지 1mM, 1nM 내지 1mM, 0.0001nM 내지 0.5mM, 0.0005nM 내지 0.5mM, 0.001nM 내지 0.5mM, 0.005nM 내지 0.5mM, 0.01nM 내지 0.5mM, 0.05nM 내지 0.5mM, 0.1nM 내지 0.5mM, 0.5nM 내지 0.5mM, 1nM 내지 0.5mM, 0.0001nM 내지 0.2mM, 0.0005nM 내지 0.2mM, 0.001nM 내지 0.2mM, 0.005nM 내지 0.2mM, 0.01nM 내지 0.2mM, 0.05nM 내지 0.2mM, 0.1nM 내지 0.2mM, 0.5nM 내지 0.2mM, 1nM 내지 0.2mM, 0.0001nM 내지 0.1mM, 0.0005nM 내지 0.1mM, 0.001nM 내지 0.1mM, 0.005nM 내지 0.1mM, 0.01nM 내지 0.1mM, 0.05nM 내지 0.1mM, 0.1nM 내지 0.1mM, 0.5nM 내지 0.1mM, 1nM 내지 0.1mM, 0.0001nM 내지 0.05mM, 0.0005nM 내지 0.05mM, 0.001nM 내지 0.05mM, 0.005nM 내지 0.05mM, 0.01nM 내지 0.05mM, 0.05nM 내지 0.05mM, 0.1nM 내지 0.05mM, 0.5nM 내지 0.05mM, 1nM 내지 0.05mM, 0.0001nM 내지 0.01mM, 0.0005nM 내지 0.01mM, 0.001nM 내지 0.01mM, 0.005nM 내지 0.01mM, 0.01nM 내지 0.01mM, 0.05nM 내지 0.01mM, 0.1nM 내지 0.01mM, 0.5nM 내지 0.01mM, 또는 1nM 내지 0.01mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 예에서, 앞서 설명한 항-GITR 항체의 중쇄 상보성 결정 부위(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, 또는 이들의 조합), 경쇄 상보성 결정 부위(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, 또는 이들의 조합), 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다.

상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 전구체로서 항체 제작에 사용될 수 있을 뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체(protein scaffold; 예컨대 펩티바디, 나노바디, 등), 이중 특이 항체, 다중 특이 항체의 구성 성분(예컨대, CDR 또는 가변영역)으로 포함될 수 있다.

용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다. 여기서 앞서 설명한 1종 이상의 펩타이드가 항원 결합 부위(중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변 영역)로서 작용할 수 있다.

용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체(single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하고, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량(약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.

용어 "다중 결합 항체"(이중 결합 항체를 포함하는 의미임)는 2개 또는 그 이상의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 앞서 설명한 GITR에 결합하는 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원결합단편을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에 제공되는 GITR에 결합하는 폴리펩타이드, 항체, 또는 항원결합단편은 유용한 중합체, 표지물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상과 접합된 접합체(conjugate) 형태로 사용될 수 있다.

상기 유용한 중합체는, 예를 들어, 폴리펩타이드, 항체, 및/또는 항원결합단편의 체내 반감기를 증가시켜 주는, 단백질 이외의 중합체일 수 있으며, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa의 분자량을 갖는 PEG), 덱스트란, 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 친수성 중합체를 예시할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

상기 표지물질은, 희토류 킬레이트제, 플루오레스세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레스카민,　152Eu, 댄실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 아에쿠오린 표지, 2,3-디히드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 안정한 유리 라디칼 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형광 또는 화학발광성 소분자 화합물(chemical), 방사성동위원소 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

의약 용도

본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은 GITR에 대하여 효능제(agonist)로서 작용(GITR 활성화)하여 면역을 활성화(e.g., 이펙터 T 세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 갖는다. 따라서, 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은 면역증강, 면역관련 질병의 예방 및/또는 치료, 특히 암의 예방 및/또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역증강을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역증강 방법을 제공한다. 상기 면역증강 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역증강을 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 면역 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 예는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 약학적 유효량을 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은, 상기 투여하는 단계 이전에, 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "면역증강(또는 면역강화)"은 항원에 대한 초기 면역반응을 유도하거나 기존의 면역반응을 증가시키는 것을 의미할 수 있으며, 면역자극, 면역강화, 면역활성화 등의 용어와 동등한 의미로 호환될 수 있다. 일 예에서, 면역증강은 면역세포(이펙터 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포; CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등) 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T 세포(Treg) 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인 등) 생산 및/또는 분비 증가 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "면역 관련 질병"은 면역계의 장애 및/또는 불충분한 활성에 의하여 유발되는 모든 질병을 포괄하는 것으로, 예를 들어, 암, 감염질환, 자가면역질환, 염증성질환 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 폐암(예컨대, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암 등), 복막암, 피부암, 흑색종(예컨대, 피부 또는 안구내 흑색종 등), 직장암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간암, 위암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 유방암, 대장암(예컨대, 결장암, 직장암, 결장직장암 등), 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포의 발생 및/또는 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등으로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.

상기 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환은 앞서 설명한 면역 강화(예컨대, 면역세포(이펙터 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포; CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등) 기능 강화(활성화) 및/또는 증식, 조절 T 세포(Treg) 활성 억제 및/또는 소거(depletion), 면역단백질(예컨대, 사이토카인(IL-2, IFN-gamma 등) 등) 생산 및/또는 분비 증가 등)에 의하여 치료, 완화, 및/또는 예방 가능한 모든 감염성 질환, 자가면역 질환, 및 염증성 질환 중에서 선택된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 진균, 기생충과 같이　질병을 일으키는 병원체가 생물체(예, 인간을 포함하는 동물) 내에 전파, 침입하여 발생하는 질병을 총칭하는 것으로, 바이러스, 세균, 진균, 기생충 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 병원체의 감염 또는 상기 감염으로 인한 질병(감염증)일 수 있다. 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트 증후군, 루푸스, 쇼그랜 증후군, 중증근무력증, 경피증, 갑상선기증저하증, 갑상선기능항진증, 건선, 백반증, 다발성경화증, 자가면역성 간염, 자가면역성 신장염, 자가면역성 췌장염, 자가면역성 뇌염, 사이토카인 폭풍 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 염증성 질환은 염증(예, 만성 염증 또는 급성 염증) 또는 염증으로 인한 질병을 총칭하는 것으로, 예를 들어, 심장 염증(예, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색, 심장막염, 심근염 등), 혈관 염증(예, 죽상경화증, 혈관염, 파종성혈관내응고(DIC), 면역성혈소판감소자반증(ITP), 혈전성혈소판감소자반증(TTP), 빈혈 등), 상기도 염증(예, 급성 비인두염, 알레르기비염, 부비동염, 인두염, 편도염, 후두염 등), 하기도 및/또는 폐 염증(예, 기관지염, 기관지확장증, 천식, 만성폐홰성폐질환(COPD), 폐렴, 간질성 폐질환, 결핵 등), 상부 위장관 염증(예, 위염, 식도염 등), 하부 위장관 염증(예, 소장염, 궤양성 대장염, 크론병, 셀리악병, 게실염, 과민성대장증후군, 맹장염, 치루 등), 간, 담도 및/또는 췌장 염증(예, 간염, 지방간, 담관염, 담낭염, 췌장염, 제1형 당뇨병 등), 신장(상부요로) 염증(예, 신우신염, 사구체신염, 요로감염증 등), 하부요로 염증(예, 요로감염증, 요관염, 요도염, 방광염, 전립선염/만성골반통증후군 등), 갑상선 및/또는 부갑상선 염증(예, 갑상선염, 부갑상선염 등), 부신 염증(예, 부신염 등), 생식기관 염증(예, 골반내 염증성 질환, 난소염, 고환염, 부고환염 등), 뼈 및/또는 관절 염증(예, 골관절염, 류마티스 관절염, 골수염, 활막염 등), 피부 염증(예, 피부: 연조직염, 단독(Erysipelas), 어루러기, 무좀, 여드름 등), 근육 염증(예, 근염 등), 뇌 염증(예, 뇌염, 주요우울장애 등), 신경 염증(예, 눈, 귀 등 다양한 부위의 신경염, 복합부위 통증 증후군, 길랑-바레 증후군 등), 눈 염증(예, 다래끼, 포도막염, 결막염 등), 귀 염증(예, 중이염, 유양돌기염 등), 구강 염증(예, 구내염, 치주염, 치은염 등), 전신성 염증(예, 전신성 염증반응 증후군(패혈증 등), 대사증후군 관련 질환 등), 복막염, 재관류 손상, 이식거부반응, 과민반응 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 제공되는 항-GITR 항체, 이의 항원결합단편, 및/또는 이를 포함하는 약학 조성물의 투여 대상은 모든 동물 또는 세포일수 있으며, 예컨대, 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스, 등의 설치류 등을 포함하는 포유류에서 선택되는 동물, 또는 상기 동물로부터 유래하는(분리된) 세포, 조직, 체액(예컨대, 혈청), 또는 이의 배양물일 수 있으며, 예컨대, 인간 또는 인간으로부터 분리된 세포, 조직, 체액(예컨대, 혈청)일 수 있다.

상기 약학적 조성물은, 유효성분으로서의 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 단백질 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 항-GITR 항체, 이의 항원결합단편 및/또는 약학 조성물의 투여는 경구 또는 비경구 경로를 통할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다.

또한, 상기 항-GITR 항체, 이의 항원결합단편 및/또는 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제, 주사제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물 내의 유효성분인 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 유효성분(항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편)을 기준으로 0.00001 내지 1000㎎/kg, 0.00001 내지 500㎎/kg, 0.00001 내지 100㎎/kg, 0.00001 내지 50㎎/kg, 0.0001 내지 1000㎎/kg, 0.0001 내지 500㎎/kg, 0.0001 내지 100㎎/kg, 0.0001 내지 50㎎/kg, 0.001 내지 1000㎎/kg, 0.001 내지 500㎎/kg, 0.001 내지 100㎎/kg, 0.001 내지 50㎎/kg, 0.01 내지 1000㎎/kg, 0.01 내지 500㎎/kg, 0.01 내지 100㎎/kg, 0.01 내지 50㎎/kg, 0.1 내지 1000㎎/kg, 0.1 내지 500㎎/kg, 0.1 내지 100㎎/kg, 또는 0.1 내지 50㎎/kg 범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 본 명세서에서 약학적 유효량은 유효성분이 목적하는 약학적 활성을 나타낼 수 있는 유효성분의 양을 의미하는 것으로, 상기한 투여량 범위일 수 있다.

폴리뉴클레오타이드, 발현벡터, 및 항체의 제조

다른 예는 항-GITR 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 중쇄 가변영역 또는 중쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일 예에서, 상기 핵산분자는 서열번호 8 또는 서열번호 12의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

다른 예는 항-GITR 항체의 경쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 가변영역 또는 경쇄를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 일 예에서, 상기 핵산분자는 서열번호 10 또는 서열번호 14의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 핵산 분자는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들어, pL^λ프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, CHO S, CHO DXB11, CHO GS-KO, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

다른 예는 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편의 생산 방법을 제공한다. 상기 핵산 분자를 숙주세포에서 발현시키는 단계는 상기 핵산 분자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 제조 방법은, 상기 배양하는 단계 이후에, 임의로, 배양 배지로부터 항체 또는 항원결합단편을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 상기 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편은 GITR에 대하여 효능제(agonist)로서 작용하여 면역을 활성화(e.g., 이펙터 T세포 기능 강화, Treg 활성 제어, 사이토카인 분비 증가 등)시키는 기능을 가지며, 다양한 면역 활성화제 및/또는 면역 치료제로서 적용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 일 실시예에 따른 키메라 및 인간화 항체의 중쇄(1a) 및 경쇄(1b)의 서열정렬 결과를 보여준다.
도 2는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 에피토프 맵핑 결과를 보여준다.
도 3a는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 항원(인간 GITR)에 대한 결합력을 보여주는 그래프이다.
도 3b는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 인간 primary 면역세포에서의 GITR에 대한 결합도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 GITR 작용성 효능을 보여주는 그래프이다.
도 5a 내지 5d는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체 처리시의 human primary T cells의 사이토카인 생산 수준을 보여주는 그래프로서, 도 5a는 CD4+ T 세포에서의 IL-2 수준, 5b는 CD4+ T 세포에서의 IFN-gamma 수준, 5c는 CD8+ T 세포에서의 IL-2 수준, 5d는 CD8+ T 세포에서의 IFN-gamma 수준을 각각 보여준다.
도 6은 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 인간 T 세포에서의 사이토카인 생산 증가 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7a 및 7b는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 NK 세포 증식효과를 보여주는 것으로, 7a는 분리된 NK 세포의 증식 수준, 7b는 NK 세포 함유 PBMC의 증식 수준을 각각 보여준다.
도 8은 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 T 세포 증식 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9a는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체 처리시의 NK 세포 표면에서의 CD107a 발현수준을 보여주는 그래프이다.
도 9b는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체 처리시의 Treg 세포수를 보여주는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 종양세포(난소암 세포) 사멸 효과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 대장암 환자로부터 분리된 T 세포에서의 사이토카인 생산 증가 효과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 폐암 환자로부터 분리된 T 세포에서의 사이토카인 생산 증가 효과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 일 실시예에 따른 항-GITR 항체의 간암 환자로부터 분리된 T 세포에서의 사이토카인 생산 증가 효과를 보여주는 그래프이다.
도 14는 일 실시예에 따른 항-GITR 항체 처리시의 종양 동물 모델에서의 종양 크기 변화를 보여주는 그래프이다.

이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.

실시예 1: 항-GITR 항체의 제작

1.1. 항-GITR 단클론 항체의 생성

10 mice(5 Balb/c and 5 C57/bl6)를 면역원(GITR protein, >90% purity, mammalian expressed; Genscript)으로 면역화시켰다.

면역화 스케쥴은 다음과 같다:

Primary Immunization: s.c. injection 50 ug human GITR protein(Q9Y5U5-1) per animal;

1stBoost: T= 14 days i.p. injection 25 ug human GITR protein per animal;

2ndBoost: T= 28 days s.c. injection 25 ug human GITR protein per animal; 및

Final Boost: T= 56±7 days i.p. injection 25 ug human GITR protein per animal.

세포 융합 및 스크리닝

상기 면역화된 마우스의 비장으로부터 B 림프구를 수집하고 이를 SP2/0 골수종 세포와 융합시켜(Cell fusion) 하이브리도마를 제작하였다. 상기 세포 융합은 electro fusion에 의하여 수행하였다. 상기 융합 효율은 대략 1 hybridoma/3000 B cells 정도로 관찰되었다. 각각의 세포 융합에서 얻어진 모든 융합된 세포를 96-well plates에 플레이팅하였다. 각 융합에서 최대 50개 플레이트를 사용하였다.

그 후, 단백질 1차 스크리닝 및 FACS 확인 스크리닝을 수행하였다. 상기 단백질 1차 스크리닝은 면역화 항원(가용성 GITR 단백질)에 대한 ELISA에 의하여 수행하였다. GITR를 안정적으로 발현하는 세포주(Genscript)를 사용하여 FACS를 수행하여, 상기 1차 스크리닝 결과로부터 positive supernatants를 스크리닝하였다.

그 후, 리간드 결합 스크리닝을 수행하였다. 상기 스크리닝된 positive clones을 ELISA에 의하여 스크리닝하여, 상기 클론이 GITR이 GITRL에 결합하는 것을 차단하거나 촉진하는지 여부를 체크하였다. 특정 specific positive clones을 선정하여 다음의 one-round subcloning에 사용하였다.

Subcloning & expansion

One round subcloning 및 하이브리도마 배양 상청액 수집: 상기 선정된 클론(parental clones) 각각의 모노클로날 세포를 시험 시료용으로 선정하였다. 24-well plate로부터 각각의 확장 클론(expanded clone)의 배양 상청액을 1 ml의 양으로 수집하고, 배양 상청액 중의 항체 농도를 측정하였다.

Subcloning: 선택된 각각의 융합으로부터 얻어진 positive primary clones을 limiting dilution에 의하여 서브클로닝하여 상기 서브클론들이 단일 모세포로부터 유래한 것임을 확실히 하였다. 상기 클론들을 최대 3세대까지 전달하였다.

Subcloning screening: 상기 서브클로닝된 서브클론들을 ELISA 또는 HTP FACS에 의하여 스크리닝 하였다.

하이브리도마 조직 배양의 상청액을 2 round의 간접 ELISA(indirect ELISA)를 사용하여 면역원(Genscript)에 대해 스크리닝하였다. 양성 클론들에 대하여 간접 ELISA를 사용하는 competition assay를 통하여 리간드 결합 억제를 추가로 시험하였다. 선택된 클론을 GITR 과발현 CHO 세포와 함께 배양하고 FACS를 수행하여 GITR 결합을 시험하였다.

Complete subcloning: 각 세포 융합으로부터 얻어진 선별된 모노클론에 대하여 서브클로닝을 추가로 two rounds 진행하여 안정한 서브클론을 얻었다.

항체 서열 시퀀싱

TRIzol® Reagent(Ambion, Cat.15596-026)를 사용하여 제조자 기술지침에 따라서 하이브리도마세포로부터 total RNA를 분리하였다. 그 후, PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara, Cat.6110A)를 사용하여 제조자 기술지침에 따라서 universal primers 또는 isotype-specific anti-sense primers를 사용하여 total RNA를 cDNA로 역전사하였다. 중쇄 및 경쇄의 항체 단편을 증폭하고 각각 standard cloning vector에 클로닝하였다. Colony PCR을 수행하여 정확한 크기의 삽입체(insert)를 가지는 클론들을 선별하였다.

상기 선별된 클론들을 대표하여, 항-GITR 단클론 항체 클론 51B의 경쇄 및 중쇄의 가변영역의 DNA 서열 및 아미노산 서열 분석 결과를 아래의 표 3에 나타내었다:

가변영역	아미노산 서열(N→C) 또는 핵산서열(5'→3')	서열번호
중쇄가변영역	QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKTTGYRFT GYWIE WVKQRPGHGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KATFTADTSSNTAYMQVSSLTTGDSAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTSVTVSS	13
중쇄가변영역	CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGACTACTGGCTACAGATTCACT GGCTACTGGATAGAG TGGGTAAAACAAAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGA GAGATTTTACCTGGAAGTGGTGCTACTTACTACAGTGAGAACTTCAAGGGC AAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAAGTCAGCAGCCTGACAACTGGGGACTCTGCCATCTATTATTGTGCAAGA AAGGGGGGGTACTATGCTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA	27
경쇄가변영역	QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTC TASSSVSSSYFH WYQQKPGSSPKLWIY STSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSSLEAEDAATYYC HLYHRSPRT FGGGTTLDIK	19
경쇄가변영역	CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGC ACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTATTTTCAC TGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCACCCAAACTCTGGATTTAT AGCACTTCCAACCTGGCTTCT GGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAGTCAGCAGTTTGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGC CACCTGTATCATCGTTCCCCACGGACG TTCGGTGGAGGCACCACGCTGGATATCAAA	28
중쇄가변영역(신호 서열 포함)	MEWTWVFLFLLSVTAGVHSQVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKTTGYRFT GYWIE WVKQRPGHGLEWIG EILPGSGATYYSENFKG KATFTADTSSNTAYMQVSSLTTGDSAIYYCAR KGGYYAMDY WGQGTSVTVSS	29
중쇄가변영역(신호 서열 포함)	ATGGAATGGACCTGGGTCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGCTTTCCTGCAAGACTACTGGCTACAGATTCACT GGCTACTGGATAGAG TGGGTAAAACAAAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATCGGA GAGATTTTACCTGGAAGTGGTGCTACTTACTACAGTGAGAACTTCAAGGGC AAGGCCACATTCACTGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACATGCAAGTCAGCAGCCTGACAACTGGGGACTCTGCCATCTATTATTGTGCAAGA AAGGGGGGGTACTATGCTATGGACTAC TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA	30
경쇄가변영역(신호 서열 포함)	MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTMTC TASSSVSSSYFH WYQQKPGSSPKLWIY STSNLAS GVPARFSGSGSGTSYSLTVSSLEAEDAATYYC HLYHRSPRT FGGGTTLDIK	31
경쇄가변영역(신호 서열 포함)	ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCTAGGGGAACGGGTCACCATGACCTGC ACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTATTTTCAC TGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCACCCAAACTCTGGATTTAT AGCACTTCCAACCTGGCTTCT GGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAGTCAGCAGTTTGGAGGCTGAGGATGCTGCCACTTATTACTGC CACCTGTATCATCGTTCCCCACGGACG TTCGGTGGAGGCACCACGCTGGATATCAAA	32

(표 3에서, 밑줄로 표시된 영역은 순서대로 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 나타냄;

이탤릭체로 표시된 영역은 신호서열(signal sequence)을 나타냄)

1.2. 마우스 항-GITR 클론의 인간화

Swiss PDB를 사용하여 항체 가변영역(V regions)의 구조 모델을 생성하고, 항체의 결합 특성에 필수적일 가능성이 있는 V 영역의 중요한 "constraining" 아미노산을 확인하기 위한 분석을 수행하였다. 다수의 프레임워크 잔기와 함께 CDR(Kabat 및 Chothia 정의 모두 사용) 내에 포함된 대부분의 잔기가 중요한 것으로 평가되었다.

구조 분석을 기반으로 하여 인간화 변이체를 생성하는 데 사용할 수 있는 인간 서열 단편들을 선별하고, 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에 결합하는 펩타이드의 in silico 분석을 위해 iTope-AI technology(ABZENA plc)을 사용하여 분석하였다. CDR 외부 및 측면 영역의 경우, 광범위하게 선택된 인간 서열 단편들이 신규한 인간화 가변영역의 구성요소로서 사용 가능한 것으로 확인된 반면, CDR 영역의 경우에는 사용 가능한 서열의 선택 범위가 줄어든다. 가능한 경우, 인간 MHC 클래스 II에 대하여 유의미한 non-human germline binders로 확인된 서열 단편들은 폐기하였다. 이로 인해 단편들 세트가 감소하였고, 이들 조합을 상기 방법으로 다시 분석하여, 단편들 사이의 접합부가 잠재적 T 세포 에피토프를 포함하지 않음을 확인하였다.

유의미한 T 세포 에피토프가 없거나(가능한 경우) 감소된 완전한 가변영역 서열을 생성하기 위하여, 상기 선택된 서열 단편을 조립하였다. 5개의 중쇄(VH1 내지 VH5) 및 5개의 경쇄(VL1 내지 VL5) 서열은 포유동물 세포 발현용 유전자 합성 및 페어링를 위해 설계되었다(표 4).

하나의 키메라 항체(VH0/VL0) 및 25개 인간화 항체를 생성하기 위한 중쇄와 경쇄 조합을 하기의 표 4에 예시적으로 나타내었다:

		Heavy chain
		VH0	VH1	VH2	VH3	VH4	VH5
Light chain	VL0	○
	VL1		○	○	○	○	○
	VL2		○	○	○	○	○
	VL3		○	○	○	○	○
	VL4		○	○	○	○	○
	VL5		○	○	○	○	○

상기 표 3의 51B 클론에 상기 표 4의 조합을 적용한 키메라 항체(VH0xVL0) 및 인간화 항체의 서열을 표 5, 표 6, 및 도 1a 및 1b에 나타내었다. 서열을 표 5, 표 6, 및 도 1a(중쇄가변영역) 및 1b(경쇄가변영역)에서, Kabat 정의에 따라 아미노산 서열 넘버링 및 CDR 부위를 결정하고, 도 1a 및 1b에 상기와 같이 결정된 CDR 및 모 서열(VH0 또는 VL0)에서 변경된 아미노산 잔기를 음영으로 표시하였다.

중쇄(불변영역: human IgG1)

	아미노산 서열(N→C)	서열번호
51B_VH0 가변영역	QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKTTGYRFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGATYYSENFKGKATFTADTSSNTAYMQVSSLTTGDSAIYYCARKGGYYAMDYWGQGTSVTVSS	13
51B_VH1 가변영역	QVQLVQSGAELKKPGASVKLSCKTTGYRFTGYWIEWVRQPPGKGLEWIGEILPGSGATYYSENFKGKATITADTSTNTAYMEVSSLRSGDSAIYYCARKGGYYAMDYWGQGTSVTVSS	14
7A6_VH2 가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKTTGYRFTGYWIEWVRQPPGKGLEWIGEILPGSGATYYSENFKGKATITADTSTNTAYMEVSSLRSEDTAIYYCARKGGYYAMDYWGQGTLVTVSS	15
51B_VH3 가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTTGYRFTGYWIEWVRQPPGKGLEWIGEILPGSGATYYSENFKGKVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAIYYCARKGGYYAMDYWGQGTLVTVSS	16
51B_VH4 가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTTGYRFTGYWINWVRQPPGKGLEWIGEILPGSGATYYSENFKGKVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAIYYCARKGGYYAMDYWGQGTLVTVSS	17
51B_VH5 가변영역	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTTGYRFTGYWIDWVRQPPGKGLEWIGEILPGSGATYYSENFKGKVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAIYYCARKGGYYAMDYWGQGTLVTVSS	18
불변영역(공통)	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	25

경쇄(불변영역: kappa)

	아미노산 서열(N→C)	서열번호
51B_VL0가변영역	QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTVSSLEAEDAATYYCHLYHRSPRTFGGGTTLDIK	19
51B_VL1 가변영역	QIVLTQSPAIMSASLGERVTMSCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSAPKLWIYSTSNLASGVPDRFSGSGSGTDYTLTVSSLQAEDVATYYCHLYHRSPRTFGGGTTVDIK	20
51B_VL2 가변영역	QIVLTQSPATLSLSPGERATMSCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSAPKLWIYSTSNLASGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYCHLYHRSPRTFGGGTKVEIK	21
51B_VL3 가변영역	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSAPKLWIYSTSNLASGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYCHLYHRSPRTFGGGTKVEIK	22
51B_VL4 가변영역	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYFHWYQQKPGKAPKLWIYSTSNLQSGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYCHLYHRSPRTFGGGTKVEIK	23
51B_VL5 가변영역	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCTASSSVSSSYFHWYQQKPGKAPKLWIYSTSNLESGVPDRFSGSGSGTDYTLTISSLQAEDVATYYCHLYHRSPRTFGGGTKVEIK	24
불변영역(공통)	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	26

이하, 실시예에서, 동일한 경쇄 클론이 VL 또는 Vk로 모두 표시될 수 있으며, 예를 들어, VL0, VL1, VL2, VL3, VL4, 및 VL5는 각각 Vk0, Vk1, Vk2, Vk3, Vk4, 및 Vk5와 동일한 클론을 지칭한다.

상기 제작된 항체 중에서, 51B VH0/VL0 키메라 항체의 중쇄의 Fc 영역에 N298A 점변이를 도입하여 Fc-engineered 변이체를 제작하였다:

상기 Fc-engineered 변이체를 포함하는 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 표 7에 기재하였다:

	아미노산 서열(N→C)	서열번호
51B chimeric N298A_VH(중쇄)	QVQLQQSGAELMKPGASVKLSCKTTGYRFTGYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGATYYSENFKGKATFTADTSSNTAYMQVSSLTTGDSAIYYCARKGGYYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	27
51B chimeric N298A_VL(경쇄)	QIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTVSSLEAEDAATYYCHLYHRSPRTFGGGTTLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	28

(상기 표 7에서, 가변영역은 밑줄로 표시하고, Fc 영역의 변이된 아미노산은 굵은 글씨로 표시함)

1.3. 키메라 및 인간화 IgG1 항체의 임시 발현(Transient expression)

VH0/VL0 키메라 항체 코딩 DNA, 2개의 대조 항체 코딩 DNA, 및 인간화 중쇄 및 경쇄 코딩 DNA의 조합(총 25개 인간화 페어링)을 6-웰 플레이트에서 PEI 트랜스펙션 방법으로 HEK293 EBNA adherent cells(LGC Standards, Teddington, UK)에 임시 트랜스펙션시킨 후, 7일간 배양하였다. 샘플을 수집하고, 인간 IgG1 항체를 기준으로 하여, Protein A biosensors(Molecular Devices, Wokingham, Berkshire, UK)를 사용하여 Octet QK384 상에서 항체 농도를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 8에 나타내었다:

	Heavy Chain
Light chain		VH0	VH1	VH2	VH3	VH4	VH5
	VL0	7.4		-	-	-	-
	VL1		8.5	11.8	8.9	9.0	8.3
	VL2	-	6.0	6.2	6.4	6.3	5.6
	VL3	-	9.7	7.9	8.6	9.2	7. 5
	VL4	-	3.8	4.7	4.5	4.0	5.1
	VL5	-	4.0	5.3	5.9	5.5	5.2

상기 표 8은 키메라 항체(VH0/VL0) 및 25개 인간화 항체들의 HEK 세포에서의 발현 후의 상등액 내의 IgG 농도(μg/mL)를 보여준다

표 8에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 항체들이 대체적으로 잘 발현함을 확인하였다.

1.4. 키메라 및 인간화 항-GITR 항체의 Single cycle kinetic analysis

상기 선별된 모든 변이체(인간화 항체)의 인간 GITR 항원에 대한 결합을 평가하고 키메라(VH0/VL0) 항체에 가장 가까운 친화도를 갖는 선도 인간화 IgG 항체를 선별하기 위하여, 형질감염된 세포 배양물의 상등액에 대해 single cycle kinetic analysis를 수행하였다. 동역학 실험은 25°C 온도 조건 하에서 Biacore 8K Control software V3.0.12.15655 및 Biacore Insight Evaluation software V3.0.12.15655(Cytiva, Uppsala, Sweden)를 실행하는 Biacore 8K를 사용하여 수행하였다.

1% BSA w/v(Sigma, Dorset, UK)(reference surface에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위함) 보충된 HBS-P+(Cytiva, Uppsala, Sweden)를 running buffer로 사용하고, 리간드와 분석물의 희석에도 사용하였다. IgG를 포함하는 상등액을 running buffer에서 1 μg/mL로 희석하였다. 각 사이클의 개시시에, Protein A sensor chip(Cytiva, Little Chalfont, UK)의 channels 1-8 상의 Fc2에 로딩하였다. IgG 항체들을 10μl/min의 유속으로 포획하여, 고정 수준(immobilisation level; RL)이 ~130RU가 되도록 하였다. 그 다음, 표면을 안정화시켰다.

잠재적 질량전달효과(mass transfer effects)를 최소화하기 위하여 40μl/min 유속으로 주입된 재조합 인간 GITR(Cat No., 13643-H08H, Lot No. LC12JA2509, Sino Biological, Beijing, China)을 분석물(analyte)로 사용하여 Single cycle kinetic 데이터를 얻었다. 항원은 running buffer에 0.6125 nM 내지 10 nM 농도 범위에서 2배씩 희석(5개 지점)하고 각 농도 사이에 regeneration이 없게 하여 사용하였다. 항원 농도가 증가하는 5개 지점의 각각의 주입에 대해 200초 동안 association phases를 모니터링하고, 마지막 항원 주입 이후 600초 동안 single dissociation phase를 측정하였다10 mM 글라이신(pH 1.5)의 single injection에 의하여 센서칩 표면을 재생시켰다.

상기 double referenced sensorgrams은 Langmuir(1:1) binding model으로 피팅하였고, 실험 곡선과 fitted(관측 및 예상) 곡선 사이의 편차를 설명하는 Chi square value를 사용하여 모델에 대한 데이터의 정확도(closeness)를 평가하였다. 상기 fitting algorithm은 Chi square value을 최소화하도록 하였다.

상기 얻어진 결과를 표 9에 나타내었다:

Antibody	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)	Relative KD	Rmax(RU)	Chi²(RU²)
VH0/VL0	5.90E+05	3.34E-04	5.66E-10	1	22.7	0.061
VH0/VL1	6.42E+05	3.38E-04	5.27E-10	0.9	26.6	0.078
VH1/VL0	6.03E+05	6.54E-04	1.08E-09	1.9	21.4	0.101
VH1/VL1	7.21E+05	9.49E-04	1.32E-09	2.3	10.4	0.069
VH1/VL2	5.15E+05	5.95E-04	1.16E-09	2.0	23.2	0.065
VH1/VL3	5.21E+05	5.41E-04	1.04E-09	1.8	24.7	0.102
VH1/VL4	4.69E+05	6.16E-04	1.31E-09	2.3	20.6	0.036
VH1/VL5	4.45E+05	6.28E-04	1.41E-09	2.5	20.3	0.041
VH2/VL1	6.65E+05	7.34E-04	1.10E-09	1.9	17.9	0.064
VH2/VL2	5.48E+05	5.96E-04	1.09E-09	1.9	25.7	0.073
VH2/VL3	5.15E+05	6.30E-04	1.22E-09	2.2	28.7	0.053
VH2/VL4	5.02E+05	5.77E-04	1.15E-09	2.0	32.3	0.109
VH2/VL5	4.77E+05	6.35E-04	1.33E-09	2.3	24.8	0.063
VH3/VL1	7.84E+05	5.43E-04	6.93E-10	1.2	33.4	0.182
VH3/VL2	6.66E+05	4.91E-04	7.37E-10	1.3	25.9	0.081
VH3/VL3	6.37E+05	5.04E-04	7.91E-10	1.4	31.3	0.091
VH3/VL4	6.16E+05	4.67E-04	7.58E-10	1.3	29.9	0.095
VH3/VL5	5.54E+05	5.07E-04	9.16E-10	1.6	26.6	0.073
VH4/VL1	6.27E+05	6.60E-04	1.05E-09	1.9	23.6	0.092
VH4/VL2	5.35E+05	5.61E-04	1.05E-09	1.9	33.3	0.136
VH4/VL3	5.54E+05	5.66E-04	1.02E-09	1.8	31.2	0.104
VH4/VL4	5.37E+05	5.30E-04	9.87E-10	1.7	38.8	0.162
VH4/VL5	4.74E+05	5.99E-04	1.26E-09	2.2	25	0.082
VH5/VL1	3.82E+05	7.42E-04	1.94E-09	3.4	21.1	0.082
VH5/VL2	4.12E+05	9.61E-04	2.33E-09	4.1	17.8	0.072
VH5/VL3	3.84E+05	7.40E-04	1.93E-09	3.4	33	0.156
VH5/VL4	1.08E+06	1.49E-03	1.37E-09	2.4	18.7	0.095
VH5/VL5	2.94E+05	9.75E-04	3.32E-09	5.9	24.8	0.096

표 9는 Biacore 8K를 사용하여 측정된 인간 GITR 항원에 결합하는 키메라(VH0/VL0) 및 인간화 변이체(세포 배양 상등액으로 시험)의 Single cycle kinetic parameters를 보여준다. relative K_D는 인간화 변이체의 K_D를 동일한 실험에서 분석된 VH0/VL0 키메라 항체의 K_D로 나누어 계산하였다

표 9에 나타낸 바와 같이, 시험된 모든 인간화 변이체(항체)들의 인간 GITR에 대한 결합과 관련된 K_D 값은 VH0/VL0 대비 5.9 배 이내로 나타났다. 상대적 발현 수준, humanness의 퍼센티지, MHC 클래스 II 결합 리스크 및 상대적 K_D 값(상등액에 대한 Biacore single cycle kinetics analysis으로 얻어짐)을 고려하여, 6개 인간화 변이체(VH3/VL1, VH3/VL3, VH3/VL4, VH3/VL5, VH4/VL3, 및 VH4/VL4)를 선택하여 이후 열안정성 분석에 사용하였다.

1.5. 열안정성 평가(Thermal Stability assessment)

본래 상태에서 변성 상태로 언폴딩(unfolding)되는 온도로부터 항체의 열안정성 정보를 얻기 위하여, Thermal ramp stability experiment(Tm 및 Tagg)를 수행하였다. 이러한 언폴딩 과정은 좁은 온도 범위에서 발생하며, 이러한 전이의 중간 지점을 '용융 온도' 또는 'Tm'이라고 한다. 이 때 단백질이 형태적 변화를 겪으므로, Sypro Range(단백질의 노출된 소수성 영역에 결합함)의 형광을 측정하여, 단백질의 용융 온도를 결정하였다.

샘플들을 PBS에서 최종 시험 농도인 0.5mg/ml까지 희석하고, Sypro^TM Orange(160x Stock 용액; Sigma-Aldrich)를 20x solution의 최종 농도로 첨가하였다. 각 샘플 혼합물은 9μL씩 UNi microcuvettes에 두번씩 로딩하였다. 샘플에 대하여 15~95°C의 thermal ramp를 실시하였다(ramp rate of 0.3 °C/minute and excitation at 473 nm). 250 내지 720 nm에서 전체 방출 스펙트럼을 수집하였으며, 510 - 680 nm 사이의 곡선 아래 면적을 사용하여 전이 곡선의 변곡점(Tonset 및 Tm)을 계산하였다. 473 nm에서 static light scattering(SLS)을 모니터링하여 단백질 응집을 검출하였고, Tagg(응집 개시)는 결과 SLS 프로파일로부터 계산하였다. 데이터 분석은 UNcle™ software version 4.0(ABZENA)을 사용하여 수행하였다.

상기와 같이 UNcle biostability platform을 사용하여 얻어진 인간화 항체 및 키메라 항체의 열안정성 수치를 표 10에 나타내었다.

Antibody	Tm1(°C)		Tonset(°C)		Tagg(°C)(473nm)
	Average	SD	Average	SD	Average	SD
VH0/VL0	66.2	0.06	60.5	0.13	65.3	0.15
VH3/VL1	66.1	0.26	59	0.11	65.2	0.09
VH3/VL3	69.3	0.2	59.4	0.59	69.2	0.11
VH3/VL4	66.7	0.04	59.6	0.12	66	0.02
VH3/VL5	66.2	0.19	59.2	0.55	65.8	0.21
VH4/VL3	70	1.09	59.2	0.33	70	0.01
VH4/VL4	67.1	0.33	59.1	0.48	67.5	0.13

표 10에서 확인되는 바와 같이, 대부분의 인간화 항체들은 키메라 항체와 동등 이상의 열안정성을 나타내었다.

1.6. multi-cycle kinetic analysis을 이용한 인간화 변이체의 친화도 측정

키메라 항체와 6개 선도 인간화 변이체들(VH3/VL1, VH3/VL3, VH3/VL4, VH3/VL5, VH4/VL3, 및 VH4/VL4)의 인간 GITR 항원에 대한 결합 친화도를 측정하기 위하여, 정제된 단백질(항체)에 대한 multi-cycle kinetic analysis를 수행하였다. Kinetic experiments는 25°C에서 Biacore 8K Control software V3.0.12.15655 및 Biacore Insight Evaluation software V3.0.12.15655(Cytiva, Uppsala, Sweden)를 사용하여 수행하였다.

1% BSA w/v(Sigma, Dorset, UK)이 보충된 HBS-EP+(Cytiva, Uppsala, Sweden)를 running buffer로 사용하고, 리간드와 분석물 희석에도 사용하였다. 정제된 선도 항체들을 running buffer에서 1μg/mL까지 희석하고, 각 사이클의 개시 시에, Protein A sensor chip(Cytiva, Little Chalfont, UK)의 channels 1-8 상의 Fc2에 로딩하였다. 항체들을 10 μl/min 유속으로 캡쳐하여 고정화 수준(RL)이 ~120 RU가 되도록 하였다. 그 후, 표면이 안정화되도록 두었다.

잠재적 mass transfer effect를 최소화하기 위하여 30μl/min 유속으로 주입된 재조합 인간 GITR(Sino Biological, Beijing, China)을 analyte로 사용하여 Multi-cycle kinetic 데이터를 얻었다. 항원(GITR)은 running buffer에 1.25 nM 내지 40nM 농도 범위에서 2배씩 희석(6개 지점)하였다. 각 농도에서, 210초 동안 association phases를 모니터링하고, 1200초 동안 dissociation phase를 측정하였다. 10mM 글라이신(pH 1.5)을 1회 injection하여 사이클 사이에 센서칩 표면 재생을 수행하였다. kinetic cycles에 걸쳐 표면과 analyte 모두의 안정성을 확인하기 위하여, blank의 다회 반복 및 2개 농도의 analyte의 반복을 kinetic run으로 프로그래밍하였다.

상기 얻어진 결과 중 키메라 항체(VH0/VL0)와 6개 선도 항체에 대한 결과를 표 11에 나타내었다:

Antibody	ka(1/Ms)	kd(1/s)	KD(M)	Relative KD	Rmax(RU)	Chi²(RU²)
VH0/VL0	5.52E+05	3.14E-04	5.70E-10	1.00	27.2	3.83E-02
VH3/VL1	7.96E+05	4.82E-04	6.06E-10	1.06	25.1	2.59E-01
VH3/VL3	6.63E+05	4.26E-04	6.43E-10	1.13	25.0	1.41E-01
VH3/VL4	6.36E+05	4.30E-04	6.75E-10	1.19	24.8	1.42E-01
VH3/VL5	5.86E+05	4.56E-04	7.78E-10	1.37	26.1	1.75E-01
VH4/VL3	6.26E+05	5.07E-04	8.10E-10	1.42	18.3	1.34E-01
VH4/VL4	5.90E+05	4.88E-04	8.29E-10	1.45	23.6	2.41E-01

상기 표 11은 Biacore 8K를 사용하여 측정한 정제된 6개의 인간화 항체 및 키메라 항체(VH0/VL0)의 인간 GITR 항원에 대한 결합 파라미터를 보여준다.

표 11에 나타난 바와 같이, 시험된 항체 모두 인간 GITR에 대한 결합력이 우수하게 나타났으며, 인간화 항체들은 모두 VH0/VL0 키메라 항체 대비 1.5배 이내의 높은 결합력을 보였다.

1.7. 에피토프 맵핑

고해상도로 GITR/51B 복합체의 에피토프를 결정하기 위해 단백질 복합체를 deuterated cross-linkers와 함께 인큐베이션하고, 다중 효소 절단(multi-enzymatic cleavage)을 수행하였다. 이와 같이 cross-linking된 펩타이드를 강화한 후, 샘플을 고분해능 질량분석기(nLC-Q-Exactive MS)로 분석하고 생성된 데이터를 XQuest 및 Stavrox 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

상기 분석은 nLC 크로마토그래피를 Q-Exactive mass spectrometry와 함께 사용하여 수행하였다.

hGITR(His tag 포함; Cat. GIR-H5228, Acrobiosystems) 및 51B 항체의 혼합물을 다음의 농도로 준비하였다:

	GITR		Antibodies		GITR/ Antibodies
Mixtures	Volume	Conc.	Volume	Conc.	Volume	Conc.
GITR/51B	10μl	2 μM	10μl	1.1 μM	20μl	1 μM/0.55μM

상기와 같이 준비된 GITR/51B 혼합물 20μL를 실온에서 180분 배양 시간 전에 DSS d0/d12(2mg/mL, DMF) 2μL와 혼합한 후, 실온에서 180분동안 배양하였다. 배양 후, Ammonium Bicarbonate 1μL(최종농도 20mM)를 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 실온에서 1시간 배양하였다. 그 후, 상기 용액을 speedvac으로 건조시킨 후, H2O 8M urea suspension(20μL)을 수행하였다. 혼합 후, DTT(500mM) 2 μl을 상기 용액에 첨가하였다. 그 후, 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 그 후, iodoacetamide(1M) 2 μl을 첨가한 후, 암실 및 실온 조건에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 단백질 버퍼 80 μl을 첨가하였다. 상기 단백질 버퍼에 있어서, 트립신 버퍼(trypsin buffer)는 50mM Ambic pH 8.5 및 5% acetonitrile를 포함하고; 키모트립신 버퍼(Chymotrypsin buffer)는 Tris HCl 100mM 및 CaCl2 10mM pH 7.8를 포함하고; ASP-N buffer는 Phosphate buffer 50mM pH 7.8를 포함하고; elastase buffer는 Tris HCl 50mM pH 8.0를 포함하고; thermolysin buffer는 Tris HCl 50mM 및 CaCl2 0.5mM pH 9.0를 포함한다.

단백질분해 효소 반응을 다음과 같이 수행하였다:

- 트립신 단백질분해(Trypsin Proteolysis)

상기 준비된 reduced/alkyled GITR/51B 혼합물 100μl를 트립신(Promega) 0.7μl과 1/100의 비율로 혼합하였다. 상기 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

- 키모트립신 단백질분해(Chymotrypsin Proteolysis)

상기 준비된 reduced/alkyled GITR/51B 혼합물 100μl를 키모트립신(Promega) 0.5μl과 1/200의 비율로 혼합하였다. 상기 단백질 분해 혼합물을 25℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

- ASP-N Proteolysis

상기 준비된 reduced/alkyled GITR/51B 혼합물 100μl를 ASP-N(Promega) 0.5μl과 1/200의 비율로 혼합하였다. 상기 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

- 엘라스타제 단백질분해(Elastase Proteolysis)

상기 준비된 reduced/alkyled GITR/51B 혼합물 100μl를 엘라스타제(Promega) 0.7μl과 1/100의 비율로 혼합하였다. 상기 단백질 분해 혼합물을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

- Thermolysin Proteolysis

상기 준비된 reduced/alkyled GITR/51B 혼합물 100μl를 thermolysin(Promega) 1.4μl과 1/50의 비율로 혼합하였다. 상기 단백질 분해 혼합물을 70℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

상기 분해 후, 포름산을 최종 농도 1%(v/v)의 양으로 첨가하였다.

Cross-linked 펩타이드를 Xquest version 2.0를 사용하여 분석하였다.

단백질 복합체 GITR/51B의 트립신, 키모트립신, ASP-N, 엘라스타제, 및 Thermolysin 단백질 분해(with deuterated d0d12) 후, nLC-orbitrap MS/MS 분석을 통하여 GITR과 51B 사이에 12개의 cross-linked 펩티드를 검출하였다.

분석 결과, GITR 아미노산 서열(서열번호 33의 26-241 부위의 아미노산 서열)의 92S(서열번호 33의 26번째 아미노산부터 기산하여, 92번째 아미노산 잔기인 Ser(S), 이하 동일하게 해석), 96S, 107T, 110T, 116T, 122K 및 132S는 51B 항체와 특이적으로 cross-linking된 것을 확인하였고, 다음 아미노산 서열을 GITR 상의 에피토프로 확인하였다;

1) 아미노산 잔기 92-96(SGTFS, 서열번호 34)

2) 아미노산 잔기 107-116(TDCTQFGFLT, 서열번호 35)

3) 아미노산 잔기 122-132(KTHNAVCVPGS, 서열번호 36)

상기 확인된 GITR 상의 에피토프 영역을 도 2에 나타내었다. 도 2는 GITR와 51B 간 상호작용 부위를 보여준다. GITR PDB 구조 7KHD에 있어서 에피토프 부위를 진한 음영으로 표시하였다. GITR 단백질 구조에서 진한 음영으로 표시된 아미노산은 GITR 서열의 92-96(SGTPS, 서열번호 34), 107-116(TDCTQFGFLT, 서열번호 35), 및 122-132(KTHNAVCVPGS, 서열번호 36)에 해당한다. 도 2에서, A, B, C, D, E는 각각 전면도(A), 후면도(B), 측면도 1(C), 측면도 2(D) 및 평면도(E)의 ribbon/surface representation를 나타내고, F, G, H, I, 및 J는 각각 정면도(F), 후면도(G), 측면도 1(H), 측면도 2(I), 및 평면도(J)의 ribbon representation를 나타낸다.

1.8. 항-GITR 항체의 인간 GITR 단백질에 대한 특이성 및 결합 친화도 측정

1.8.1. 항-GITR 항체의 인간 GITR(hGITR) 단백질에 대한 결합력 분석(by ELISA)

ELISA 플레이트를 1μg/ml 농도의 재조합 인간 GITR 단백질(in PBS)로 코팅하고 4C에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 차단 완충액(3% skim milk in PBS)으로 1시간 동안 차단하고, 연속 희석된 항-GITR 51B VH0/Vk0(키메라 aGITR 51B mAb) 및 항-GITR 51B VH3/Vk4(인간화 항-GITR 51B mAb) 항체(출발농도 3μg /ml; 1:3 연속 희석)을 상기 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 항-마우스/인간 IgG-HRP 항체(Abcam)(1:10000 희석)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트에 TMB 용액을 첨가하고, 1N HCl로 중지시켰다. OD 값은 450nM에서 GloMax® Explorer Full Loaded로 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 시험된 항-GITR 51B VH0/Vk0 키메라 항체 및 항-GITR 51B VH3/Vk4 인간화 항체의 hGITR 단백질 결합의 특이성을 확인하였다. 키메라 및 인간화 항체 모두 용량 의존적 방식으로 hGITR 단백질에 대한 상당한 결합을 나타내었다.

1.8.2. 인간 primary immune cells에서의 항-GITR 항체의 hGITR에 대한 특이성 및 결합 친화도

T 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 human primary lymphocytes에서 발현되는 GITR 분자에 대한 항-GITR 항체 결합을 측정하기 위하여, APEX™ antibody labeling kit(Invitrogen)를 사용하여 제조자 지침에 따라서 항-GITR 51B VH0/Vk0(키메라 mAb) 및 51BVH3/Vk4(인간화 mAb)를 각각 Alexa Fluor® 488(AF488)와 접합시켰다. 건강한 공여자로부터 분리된 인간 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 StemCell technologies로부터 구입하고, 1μg/ml의 항-CD3 단클론 항체(BD Biosciences) 및 1μg/ml의 항-CD28 단클론 항체(BD Biosciences)의 존재 하에서 10%(v/v) FBS 및 400U/ml의 인간 IL-2를 포함하는 PRMI1640 배지와 함께 5% CO₂ 및 37℃ 조건에서 2일 동안 배양하였다. 배양하는 동안, IL-2 400U/ml 및 IL-15 20ng/ml를 2 또는 3일마다 첨가하였다. 배양 후, 상기 세포를, T 세포 표면 마커(CD3, CD4 및 CD8) 및 NK 또는 NKT 세포 표면 마커(CD56)에 대한 fluorophore-conjugated 항체 및 다양한 용량(50, 250, 750, 1250, 및 2500 ng/ml)의 AF488-표지된 항-GITR 항체로 염색하였다. 세포를 유세포 분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 분석하고, 데이터는 Flowjo software(BD)를 사용하여 분석하였다. 전체 T 세포(CD3⁺), CD4⁺ T 세포(CD3⁺CD4⁺CD8^-), CD8⁺ T 세포(CD3⁺CD8⁺CD4^-), CD56⁺ NK 세포(CD3^-CD56⁺) 및 NKT 세포(CD3⁺CD56⁺)에서의 항-GITR 항체의 GITR 결합을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 3b에 나타내었다. 항 GITR 51B 키메라 및 인간화 항체는 용량 의존적으로 primary T 세포, NK 및 NKT 세포에 결합하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 면역 세포에서 발현된 GITR 단백질에 대한 항-GITR 51B 항체의 특이성을 보여준다.

실시예 2. cell-based reporter assay를 통한 항-GITR 항체의 생물학적 활성(항-GITR agonist 활성) 시험

Promega GITR bioassay kit를 Promega Corporation(Madison, WI, USA)에서 구입하여 사용하였다. GITR 이펙터 세포(Promeg) 한 바이알(0.5mL)을 assay buffer(99% RPMI, 1% FBS) 9.5mL에 첨가하고, 상기 세포 현탁액(50μL)을 96웰 흰색의 flat-bottom assay plates(Greiner Bio-one, Chonburi, Thailand)에 옮겨 담았다. assay buffer를 사용하여 항-GITR 항체의 연속 희석액(출발농도: 5μg/ml)을 제조한 다음, 최종 항체 농도 0.0032768μg/ml까지 assay buffer으로 2.5배씩 추가로 희석하였다. 상기 희석된 항-GITR 항체 25μL를 assay plates에 첨가하였다. 37℃ 및 5% CO2 조건에서 6시간 인큐베이션 후, Bio-Glo Reagent을 첨가하고 주위온도(ambient temperature)에서 10분 동안 인큐베이션 하였다. 발광성은 Promega™ GloMax® Plate Reader를 사용하여 발광수준(Luminescence)을 측정하였다. RLU versus Log₁₀[항체] 및 fold induction versus Log₁₀[antibody] 데이터를 그래프로 표시하였다. Fit curves와 항체 반응성의 EC50 value는 curve fitting software(such as GraphPad Prism® software)를 사용하여 측정하였다. 상기 에세이를 통하여, GITR 작용성 항체(시험 항체) 첨가 후에 검출되는 GITR-매개 발광수준을 측정하고, 시험 항체의 작용제 활성을 확인하였다. 비교항체로서, 항-GITR 28F3 항체(BMS; WO 2015/187835 참조), 항-GITR 110416(R&D Systems; “ Heine et al. Oncoimmunology 2017 and Schmiedel et al, Molecular Therapy 2013” 참조) 및 양성 대조군 항-GITR 항체(Promega Cat.# K1171)를 사용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 항-GITR 51B VH3/Vk5 항체(anti-GITR 51B로 표시)의 crosslinking에 의하여 상기 항-GITR 항체의 작용제 활성을 통해 T 세포 활성화 신호전달이 증가됨을 확인하였다. 이러한 효능은 비교항체들 대비 상당히 우수하게 나타났다.

실시예 3: 항-GOTR 항체의 사이토카인 생산 효과

3.1. human primary T cells에서의 항-GITR 항체의 용량 의존적 항종양 사이토카인 생산 유도 확인

사이토카인 생산을 위하여, 인간 PBMC(실시예 1.8.2 참조)를 96웰 둥근 바닥 플레이트 내의 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS), 100 U/ml penicillin, 및 100 μg/ml streptomycin 보충된 RPMI 1640 배지에서 0.5x10⁶ 세포/웰의 양으로 배양하였다. 항-GITR 항체(키메라 상체 및 6종의 선도 인간화 항체, 각각 10μg/ml 및 20μg/ml)의 존재 하에서, 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 상기 세포를 항-CD3 단클론항체 0.2 μg/ml 및 항-CD28 단클론항체 1 μg/ml로 19시간 동안 활성화시켰다. 비교항체로서 항-GITR 항체 110416(R&D Systems)을 사용하고, 배지 단독(항체 무첨가)은 음성 대조군으로 사용하였다. 상기 공동 자극 항체(항-CD3 항체 및 항-CD28 항체) 처리된 세포에 Brefeldin A를 첨가하여 사이토카인 분비를 차단하였다. 수확한 세포를 Zombie Aqua fixable dead cell dye(Invitrogen)로 염색하여 실온에서 20분 동안 세포의 생존력을 측정하였다. 세포를 30분 동안 얼음 위에서 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8 각각에 대한 fluorophore-접합 항체로 표지된 항체(모두 Biolegend에서 입수)로 염색하였다. eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit(Thermofisher)로 세포 고정 및 투과화(permeabilization) 후 세포내 사이토카인 염색을 수행하였다. 이어서, permeabilization buffer에서 세포내 염색을 위한 IL-2 및 IFN-γ 각각에 대한 fluorophore-접합 항체(모두 Biolegend에서 입수)를 사용하여 실온에서 30분 동안 상기 세포를 염색하였다. 그 후, 세포를 유세포 분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 측정하고, 데이터는 flowjo software(BD)를 사용하여 분석하였다. 비교 항체로서 상기한 항-GITR 110416(R&D Systems)를 사용하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5a(CD4+ T 세포에서의 IL-2 수준), 5b(CD4+ T 세포에서의 IFN-gamma 수준), 5c(CD8+ T 세포에서의 IL-2 수준), 및 5d(CD8+ T 세포에서의 IFN-gamma 수준)에 나타내었다. 도 5a 내지 5d에서, 각 항체에 대한 두 개의 결과 중 왼쪽은 항체 농도가 10μg/ml인 경우의 결과, 오른쪽은 항체 농도가 20μg/ml인 경우의 결과를 각각 보여준다.

도 5a 내지 5d에서 보여지는 바와 같이, 시험된 모든 항 GITR 51B 항체(키메라 및 인간화)는 면역 세포 표면의 GITR과의 cross-linking을 통해 CD4+ 및 CD8+T 세포에서의 Th1/Tc1 사이토카인 생산을 증가(upregulating)시켰으며, 이를 통하여 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 항 GITR 51B 항체 처리시의 사이토카인(IL-2 및 IFN-gamma)의 수준은 비교항체(클론 110416, R&D System) 대비 현저하게 높게 나타났다. 이러한 결과는 시험된 모든 항-GITR 51B 항체가 강력하고 용량 의존적으로 T 세포 기능을 향상시킴을 보여준다.

3.2. human T cells에서의 항-GITR 항체의 사이토카인 생산 증가 효과 확인

인간 PBMC(실시예 1.8.2 참조)에서의 사이토카인 생산을 측정하였다. 세포(500,000 cells/reaction)를 항-GITR 51B VH3/Vk4-IgG1 인간화 항체(시험항체, 10ug/ml)의 존재 하에 항-CD3 단클론 항체(BD Biosciences, cat no. 555336; 0.2ug/ml) 및 항-CD28 단클론 항체 (BD Biosciences, cat no 555725; 1ug/ml)와 함께 배양하였다. 비교항체로서 앞서 기재한 항-GITR 항체 28F3(BMS)를 시험항체와 동일한 용량(10ug/ml)으로 사용하였다. 배양 후, 세포를 4℃에서 10분 동안 400xg로 스핀다운하고, CD4+ T 세포 내의 사이토카인 수준을 측정하였다. 이를 위하여 다음의 방법으로 세포 내 사이토카인을 염색하였다: 세포를 Zombie Aqua fixable dead cell dye solution(Invitrogen)으로 염색하고, 30분 동안 얼음 위에서 CD4+와 CD8+ T 세포 표면 마커에 대한 플루오로포어(fluorophore)-접합 항체로 표지하였다(항-CD3 항체(Biolegend), 항-CD4 항체(Biolegend), 및 항-CD8 항체(Biolegend)를 사용해서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 표면을 염색함). eBioscience™ Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent kit(ThermoFisher)를 사용하여 제조자 지침에 따라서 세포를 고정화하고 침투화시켰다(permeabilized). 상기 세포를 세포 내 IL-2 및 IFNγ에 대한 플루오로포어-접합 항체로 염색하였다. 상기 세포들을 유세포분석기(CytoFLEX, Beckman Coulter)로 분석하고, 데이터는 Flowjo software(BD)로 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 보여지는 바와 같이, 항 GITR 51BVH3/Vk4-IgG1 항체는 CD4+ T 세포에서 Th1/Tc1 사이토카인 생산을 증가(upregulation)시켰고, 이를 통해 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 또한, 항 GITR 51BVH3/Vk4-IgG1 항체의 사이토카인 생산 수준은 비교항체인 28F3과 비교하여 높게 나타났다. 이러한 결과는 항-GITR 51BVH3/Vk5-IgG1 항체가 비교항체 28F3보다 상당히 강력하게 이펙터 T 세포 기능을 증가시킴을 시사한다.

실시예 4. 항-GITR 항체의 면역세포 증식 효과

4.1. IL-15에 대한 반응에 있어서 GITR crosslinking에 의한 NK 세포 증식 강화

ELISA 플레이트를 항-GITR 51B 인간화 항체(VH3/Vk1, VH3/Vk3, VH3/Vk4) 10μg/ml로 코팅하였다. NK 세포는 NK 분리 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 제조자 지침에 따라 인간 PBMC(실시예 1.8.2 참조)로부터 분리하고 cell tracker violet(BioLegend)으로 37℃에서 20분 동안 염색하였다. 분리된 NK 세포(도 7a 참조) 또는 NK 세포를 함유하는 PBMC(도 7b 참조, 500,000cells/reaction)를 항-GITR 항체 코팅된 플레이트에 첨가한 후, IL-15(5ng/ml)와 함께 6일 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 live/dead reagent(ThermoFisher LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit), CD3(Biolegend), CD56(Biolegend) 항체로 염색하고, 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman Coulter)로 분석하였다. 이어서, 데이터를 Flowjo software(BD)로 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 7a(분리된 NK 세포) 및 7b(NK 세포를 함유하는 PBMC)에 나타내었다. GITR이 crosslinked 될 때, IL-15-유도 증식은 분리된 NK 세포(A) 및 PBMC 내의 NK 세포(B)에서 증가한다. 시험된 모든 항-GITR 항체는 human primary T 세포에서 NK 세포 증식을 증가시켰다. 이러한 결과는 항-GITR 항체가 GITR와의 cross-linking을 통하여 강화된 면역 기능을 가짐을 입증하며, 이로 인하여 항종양 활성을 가질 수 있음을 시사한다.

4.2. 항-GITR 항체의 CD8+ T 세포 증식 강화 효과

Miltenyi kits를 사용하여 제조자 지침에 따라 인간 PBMC(실시예 1.8.2 참조)로부터 CD8+ T 세포, Treg, 및 NK 세포를 분리하였다(Miltenyi kits(Miltenyi Biotec): CD8+ T Cell Isolation Kit, human(130-096-495), CD4+ CD25+ CD127-dim Treg cell isolation kit II(130-094-775), 및 NK Cell Isolation Kit, human(130-092-657)). 분리된 Treg 세포의 수는 trypan blue exclusion을 통하여 측정하였으며, LUNA-II™ Automated Cell Counter를 사용하였다. NK 세포:CD8 세포:Treg 세포의 비율이 4:4:1이 되도록 세포를 시딩하고, 항-GITR 항체 51B VH0/Vk0, VH3/Vk5, VH4/Vk3, 및 VG4/Vk4를 각각 10μg/mL의 양으로 웰에 첨가하였다. 상기 준비된 세포 및 항-GITR 항체의 혼합물을 IL-2(50ng/ml)의 존재 하에 CD3/CD28 Dynabeads(ThermoFisher)와 함께 96시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포를 CD3, CD8, CD4 및 live/dead 마커에 대해 염색한 다음, 4℃에서 20분 동안 CytoFix/CytoPerm(BD n. 554722)을 사용하여 고정 및 투과화 하였다. 그런 다음, Ki67의 검출을 위해 Ki67 항체로 세포내 염색을 수행하고, 세포를 유세포 분석기(CytoFlex, Beckman Coulter)로 분석하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 보여지는 바와 같이, 항-GITR 항체는 human primary PBMCs에서 CD8+ T 세포 증식을 증가시켰으며, 이는 항-GITR 항체에 의해 인간의 면역 세포 기능이 향상될 수 있음을 시사한다.

4.3. 항-GITR 항체에 의한 T 조절세포(T regulatory cells) 및 NK 세포의 면역 조절(Immunomodulation)

항-GITR 51BVH3/Vk4 항체와 함께 PBMC(실시예 1.8.2 참조)를 인큐베이션한 후 NK 세포에서 CD107a를 측정하여 NK 세포 활성화를 측정하고(도 9a 참조), Treg 제거(depletion)에 대한 항-GITR 항체의 효과를 평가하였다(도 9b 참조). 보다 구체적으로, 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체(5ug/ml 및 10ug/ml)를 CD3 및 CD28 항체의 존재 하에서 인간 PBMC와 공동 배양하고, Treg 세포의 빈도를 유세포 분석으로 평가하였다. 항-GITR 미처리군을 대조군으로 하여 Treg 세포 수를 비교하였다.

상기 얻어진 결과(항체 농도 10ug/ml)를 도 9a(CD107a 수준) 및 9b(Treg depletion)에 나타내었다. 항-GITR 51BVH3/Vk4 항체를 통한 GITR crosslinking은 CD107a의 NK 세포 표면 발현을 유도한다. 따라서, 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체는 NK 세포를 유의하게 활성화시킨다(도 9a 참조). 또한, 항-GITR 항체(항-GITR 51B VH3/Vk4)와 인간 PBMC의 공동 배양에 의하여 Treg 수가 감소하였으며(도 9b 참조), 이는 항-GITR 항체의 GITR와의 crosslinking에 의하여 NK 세포에 의한 Treg 제거를 유도함을 시사한다. 따라서, 항-GITR 항체는 NK 세포 활성화를 유도하고 Treg에 대한 NK 세포의 Treg 세포독성을 촉진한다. 종양 미세 환경에서, Treg 세포의 수와 기능이 증가하면 면역 기능을 억제하여 항종양 효과를 억제함을 고려할 때, 시험된 항-GITR 항체는 Treg 세포수를 감소시켜 항종양 효과를 향상시킬 수 있다.

실시예 5. 항-GITR 항체의 암세포 사멸 효과

항-GITR 항체 인간화 변이체(항-GITR 51B VH3/Vk4 및 51B VH3/Vk3 항체)의 SKOV-3 난소암 세포에 대한 세포독성을 시험하였다. 이를 위하여, 이펙터 세포와 타겟 세포 비율(E:T)이 10:1이 되도록 SKOV-3 cells(ATCC, 2.5X10⁴ cells/well)와 PBMCs(실시예 1.8.2 참조)를 상기 항-GITR 51B 항체(각 10μg/mL)와 함께 공배양하였다. T 세포를 활성화시키기 위하여, Cytostim(Miltenyi)을 각 웰에 첨가하였다. 비교항체로서, 앞서 설명한 항-GITR 항체 110416(R&D System)를 사용하여 동일한 방식으로 시험하였다. IncuCyte native software를 사용하여 타겟 세포를 계수하였다.

상기 얻어진 결과(항-GITR 51B VH3/Vk4 항체)를 도 10a 및 10b에 나타내었다. 시험된 모든 항-GITR 51B 항체의 종양세포 사멸 효과는 대조군, cytostim 처리군, 및 비교항체 처리군에 비해 유의하게 더 높았다. 시험항체 항-GITR 51BVH3/Vk4 및 항-GITR 51BVH3/Vk3 처리에 의해 난소암 세포 사멸 정도가 증가하였으며, 이는 항-GITR 51B 작용 항체(시험항체)가 강력한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 시사한다. 항-GITR 51B 항체(시험항체)에 의한 GITR crosslinking에 의하여, 비교항체와 비교하여, SKOV3 세포주(난소암)에 대해 더 높은 세포독성을 유도한다.

실시예 6. 암환자의 인간 T 세포에서의 항-GITR 항체의 강력한 항종양 사이토카인 유도 효과

6.1. 대장암(colorectal cancer; CRC) 환자의 T 세포에서의 사이토카인 생산 증가 효과

GITR 발현 면역 세포가 암환자에서 기능 장애를 일으키므로, 항-GITR 항체 치료가 암(CRC) 환자에서 면역 반응을 향상시켜 항종양 효과를 유도할 수 있는지 알아보았다.

암 환자의 사이토카인 생산에 대한 항-GITR 항체의 효과를 확인하기 위하여, 대장암(colorectal cancer; CRC) 환자에서 유래한 인간 PBMC(500,000 cells/reaction)를 항-GITR 51 BVH3/Vk4 항체(10μg/mL) 또는 동일한 용량의 비교항체(항-GITR 28F3; BMS)의 존재 하에서 항-CD3 항체(0.2ug/ml, BD Biosciences) 및 항-CD28 항체(1ug/ml, BD Biosciences)와 함께 배양하였다. CRC 환자의 PBMC는 Cureline, Inc.에서 입수하였다. 세포 내 사이토카인 생산은 실시예 3을 참조로 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다(Background: cells only (CD3/CD28항 체와 anti-GITR 항체 모두 무처리), Stimulated: CD3/CD28 항체 처리 및 anti-GITR 항체 무처리). 도 11에 나타난 바와 같이, 시험 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체(51B VH3/Vk4 로 표시)는 비교항체인 28F3(ref-28F3)에 비해 CRC 환자의 PBMC에서 더 높은 수준으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 사이토카인 생산을 증가시켰다. IL-2 및 IFN-γ는 NK 및 T 세포의 증식 및 종양 사멸 활성을 증가시켜 면역계의 핵심 기능을 갖는 사이토카인이다. 따라서, 상기 결과는 시험 항-GITR 항체가 암(CRC) 환자에 대하여 우수한 항암 효능을 가짐을 보여준다.

6.2. 폐암(non-small-cell lung carcinoma; NSCLC) 환자의 T 세포에서의 사이토카인 생산 증가 효과

GITR 발현 면역 세포가 암환자에서 기능 장애를 일으키므로, 항-GITR 항체 치료가 암(NSCLC) 환자에서 면역 반응을 향상시켜 항종양 효과를 유도할 수 있는지 알아보았다.

암 환자의 사이토카인 생산에 대한 항-GITR 항체의 효과를 확인하기 위하여, 비소세포폐암(non-small-cell lung carcinoma; NSCLC) 환자에서 유래한 인간 PBMC PBMC(500,000 cells/reaction)를 항-GITR 51 BVH3/Vk4 항체(10μg/mL) 또는 동일한 용량의 비교항체(항-GITR 28F3; BMS)의 존재 하에서 항-CD3 항체(0.2ug/ml, BD Biosciences) 및 항-CD28 항체(1ug/ml, BD Biosciences)와 함께 배양하였다. NSCLC 환자의 PBMC는 Cureline, Inc.에서 입수하였다. 세포 내 사이토카인 생산은 실시예 3을 참조로 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다(Background: cells only (CD3/CD28항 체와 anti-GITR 항체 모두 무처리), Stimulated: CD3/CD28 항체 처리 및 anti-GITR 항체 무처리). 도 12에 나타난 바와 같이, 시험 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체(51B VH3/Vk4 로 표시)는 비교항체인 28F3(ref-28F3)에 비해 NSCLC 환자의 PBMC에서 더 높은 수준으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 사이토카인 생산을 증가시켰다. IL-2 및 IFN-γ는 NK 및 T 세포의 증식 및 종양 사멸 활성을 증가시켜 면역계의 핵심 기능을 갖는 사이토카인이다. 따라서, 상기 결과는 시험 항-GITR 항체가 암(NSCLC) 환자에 대하여 우수한 항암 효능을 가짐을 보여준다.

6.3. 간암(Hepatocellular carcinoma; HCC) 환자의 T 세포에서의 사이토카인 생산 증가 효과

GITR 발현 면역 세포가 암환자에서 기능 장애를 일으키므로, 항-GITR 항체 치료가 암(HCC) 환자에서 면역 반응을 향상시켜 항종양 효과를 유도할 수 있는지 알아보았다.

암 환자의 사이토카인 생산에 대한 항-GITR 항체의 효과를 확인하기 위하여, 간세포암종(hepatocellular carcinoma; HCC) 환자에서 유래한 인간 PBMC(500,000 cells/reaction)를 항-GITR 51 BVH3/Vk4 항체(10μg/mL) 또는 동일한 용량의 비교항체(항-GITR 28F3; BMS)의 존재 하에서 항-CD3 항체(0.2ug/ml, BD Biosciences) 및 항-CD28 항체(1ug/ml, BD Biosciences)와 함께 배양하였다. HCC 환자의 PBMC는 Cureline, Inc.에서 입수하였다. 세포 내 사이토카인 생산은 실시예 3을 참조로 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 13에 나타내었다(Background: cells only (CD3/CD28항 체와 anti-GITR 항체 모두 무처리), Stimulated: CD3/CD28 항체 처리 및 anti-GITR 항체 무처리). 도 13에 나타난 바와 같이, 시험 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체(51B VH3/Vk4 로 표시)는 비교항체인 28F3(ref-28F3)에 비해 HCC 환자의 PBMC에서 더 높은 수준으로 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서의 사이토카인 생산을 증가시켰다. IL-2 및 IFN-γ는 NK 및 T 세포의 증식 및 종양 사멸 활성을 증가시켜 면역계의 핵심 기능을 갖는 사이토카인이다. 따라서, 상기 결과는 시험 항-GITR 항체가 암(HCC) 환자에 대하여 우수한 항암 효능을 가짐을 보여준다.

상기 결과에서 확인되는 바와 같이, 시험 항-GITR 항체는 광범위한 암 환자의 인간 T 세포에서 강력한 항종양 사이토카인 생산을 유도한다.

실시예 7. MC38 대장암(colon carcinoma) 모델에서의 항-GITR 항체의 항암 효능 확인(in vivo)

MC38 종양 세포(Biocytogen)를 공기 중 5% CO₂ 및 37°C 조건에서 10%(v/v) fetal bovine serum(FBS) 보충된 DMEM + 4ug/ml 퓨로마이신 배지에서 시험관내(in vitro) 유지시켰다. 대수기(exponential growth phase)의 세포를 수확하고, 종양 접종 전에 세포 계수기로 세포수를 측정하였다.

C57BL6 hGITR knock-in 마우스(Jiangsu Biocytogen Co., Ltd.)의 오른쪽 후방 옆구리 부위에 5x10⁵개의 종양 세포(in 0.1mL of PBS solution)를 피하 접종하여 종양을 발생시켰다. 평균 종양 크기가 100-150 mm³에 도달할 때 무작위화(Randomization)를 수행하였다. 각 그룹은 8마리의 마우스로 구성하였다. 무작위화 날짜를 0일(Day 0)로 기록하였다.

종양 세포 접종 후 동물의 병적상태(morbidity), 사망률, 및 체중 증가/감소를 매일 확인하였다(무작위화 후 체중은 주당 3회 측정). 사망률 및 관찰된 임상 징후는 개별 동물에 대해 자세히 기록하였다. 종양 부피는 무작위화 후 주당 3회씩 caliper를 사용하여 2차원으로 측정하였고, 부피는 다음 수식을 사용하여 mm³로 계산하였다:

V =(L x W x W)/2

[V는 종양 부피(mm³), L은 종양 길이(종양의 장축 길이), W는 종양 넓이(L의 수직 중 가장 긴 길이)].

투여량 및 종양 및 체중 측정은 Laminar Flow Cabinet에서 수행하고, 체중 및 종양 부피는 StudyDirector^TM software(version 3.1.399.19)를 사용하여 측정하였다.

그루핑 직후 치료를 시작하였다. 대조군(그룹 1)은 비히클(PBS 용액)로 처리하고, CHO 세포에서 생성된 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체 및 INCAGN1876(Biocytogen)를 그룹 2 및 그룹 3에 각각 20mg/kg 용량으로 처리하였다(표 13 참조).

Group	Treatment	Dose Level (mg/kg)	Dosing Volume (μL/g)	ROA	Dosing Frequency & Duration
1	Vehicle(PBS)	-	10	i.v.	BIW x 3 weeks
2	Anti-GITR 51B VH3/Vk4	20	10	i.v.	BIW x 3 weeks
3	INCAGN1876	20	10	i.v.	BIW x 3 weeks

BIW: Bi-weekly(twice a week)

i.v.: 정맥내 투여

상기 측정된 종양 크기(부피)를 도 14에 나타내었다. 도 14에서 보여지는 바와 같이, 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체(그룹 2)는 PBS 처리된 그룹 1(대조군)과 비교하여 상당한 종양 성장 억제 효과를 나타내었다. 예를 들어, 24일째에, 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체 처리 시험군(그룹 2)은 대조군(그룹 1)과 비교하여 종양 크기가 유의하게 감소하였다. 또한, 비교항체(INCAGN1876) 처리 시험군(그룹 3)과 비교하여도, 항-GITR 51B VH3/Vk4 항체 처리 시험군(그룹 2)에서 현저히 높은 종양 감소 효능이 나타났다.

또한, 하기 수식으로 종양성장억제(ΔTGI)를 계산하였다:

ΔTGI(Mean % ΔInhibition) =((mean(C)-mean(C0)) -(mean(T)-mean(T0))) /(mean(C)-mean(C0)) * 100%

[T - current group value / T0 - current group initial value / C - control group value / C0 - control group initial value]

[T: 시험군의 측정 시점의 종양 크기,

T0: 시험군의 최초 종양 크기,

C: 대조군의 측정 시점의 종양 크기,

C0: 대조군의 최초 종양 크기]

항-GITR 51B VH3/Vk4 항체의 종양 성장 억제(ΔTGI)는 64.8%로 INCAGN1876 유사체(ΔTGI=44.7%)과 비교하여 상승된 억제 효과를 나타내었다.

본 실시예에 사용된 시험 동물들은 항체의 20mg/kg 용량 투여(i.v.)에 관용적이었으며, 연구 기간 동안 BWL이 관찰되지 않았다.

통계처리

통계적 유의성은 ordinary one-way ANOVA(a paired and unpaired Student’s tests using GraphPad Prism 9 software)로 평가하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다. **** p<0.0001, ***p<0.001, **p<0.01, *p<0.05, ns = not significant.

<110> MediMabBio Inc. <120> Anti-GITR antibodies and uses thereof <130> DPP20221178KR <150> 10-2021-0060012 <151> 2021-05-10 <160> 36 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1, wherein X is E, N, or D <400> 1 Gly Tyr Trp Ile Xaa 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 2 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 3 Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 4 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2, wherein X is A, Q, or E <400> 5 Ser Thr Ser Asn Leu Xaa Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 6 His Leu Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 7 Gly Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 8 Gly Tyr Trp Ile Asn 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 9 Gly Tyr Trp Ile Asp 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 10 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 11 Ser Thr Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 12 Ser Thr Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 13 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 16 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 18 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Asp Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 19 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Asp Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 20 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 21 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 22 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region <400> 25 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region <400> 26 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 27 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 51B chimeric N298A_VH (Heavy chain) <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser Glu Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 28 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 51B chimeric N298A_VL (Light chain) <400> 28 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Val Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Leu Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 29 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 51B heavy chain variable region comprising signal sequence, wherein the amino acid sequecen of 1-19 is signal sequence <400> 29 Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Arg Phe 35 40 45 Thr Gly Tyr Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ser 65 70 75 80 Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Val Ser Ser Leu Thr Thr Gly Asp Ser Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Lys Gly Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 30 <211> 411 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding 51B heavy chain variable region comprising signal sequence <400> 30 atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60 gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagctttcc 120 tgcaagacta ctggctacag attcactggc tactggatag agtgggtaaa acaaaggcct 180 ggacatggcc ttgagtggat cggagagatt ttacctggaa gtggtgctac ttactacagt 240 gagaacttca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agcctacatg 300 caagtcagca gcctgacaac tggggactct gccatctatt attgtgcaag aaaggggggg 360 tactatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411 <210> 31 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 51B light chain variable region comprising signal sequence, wherein the amino acid sequecen of 1-22 is signal sequence <400> 31 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Val Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His 100 105 110 Leu Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Asp 115 120 125 Ile Lys 130 <210> 32 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding 51B light chain variable region comprising signal sequence <400> 32 atggattttc aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60 agaggacaaa ttgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcatctct aggggaacgg 120 gtcaccatga cctgcactgc cagctcaagt gtaagttcca gttattttca ctggtaccag 180 cagaagccag gatcctcacc caaactctgg atttatagca cttccaacct ggcttctgga 240 gtcccagctc gcttcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac agtcagcagt 300 ttggaggctg aggatgctgc cacttattac tgccacctgt atcatcgttc cccacggacg 360 ttcggtggag gcaccacgct ggatatcaaa 390 <210> 33 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human GITR, wherein the aminno acid sequence of amino acids 1-25 is signal sequence <400> 33 Met Ala Gln His Gly Ala Met Gly Ala Phe Arg Ala Leu Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ser Leu Gly Gln Arg Pro Thr Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Cys Gly Pro Gly Arg Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Asp Ala Arg 35 40 45 Cys Cys Arg Val His Thr Thr Arg Cys Cys Arg Asp Tyr Pro Gly Glu 50 55 60 Glu Cys Cys Ser Glu Trp Asp Cys Met Cys Val Gln Pro Glu Phe His 65 70 75 80 Cys Gly Asp Pro Cys Cys Thr Thr Cys Arg His His Pro Cys Pro Pro 85 90 95 Gly Gln Gly Val Gln Ser Gln Gly Lys Phe Ser Phe Gly Phe Gln Cys 100 105 110 Ile Asp Cys Ala Ser Gly Thr Phe Ser Gly Gly His Glu Gly His Cys 115 120 125 Lys Pro Trp Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr Val Phe Pro 130 135 140 Gly Asn Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser Pro Pro Ala 145 150 155 160 Glu Pro Leu Gly Trp Leu Thr Val Val Leu Leu Ala Val Ala Ala Cys 165 170 175 Val Leu Leu Leu Thr Ser Ala Gln Leu Gly Leu His Ile Trp Gln Leu 180 185 190 Arg Ser Gln Cys Met Trp Pro Arg Glu Thr Gln Leu Leu Leu Glu Val 195 200 205 Pro Pro Ser Thr Glu Asp Ala Arg Ser Cys Gln Phe Pro Glu Glu Glu 210 215 220 Arg Gly Glu Arg Ser Ala Glu Glu Lys Gly Arg Leu Gly Asp Leu Trp 225 230 235 240 Val <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope region on human GITR <400> 34 Ser Gly Thr Phe Ser 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope region on human GITR <400> 35 Thr Asp Cys Thr Gln Phe Gly Phe Leu Thr 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope region on human GITR <400> 36 Lys Thr His Asn Ala Val Cys Val Pro Gly Ser 1 5 10

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H1),
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H2),
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-H3),
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L1),
서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L2), 및
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 (CDR-L3)
를 포함하는, 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편.
제1항에 있어서,
서열번호 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H1),
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H2),
서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-H3),
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L1),
서열번호 10, 11, 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및
서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(CDR-L3)
를 포함하는, 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편.
제1항에 있어서,
(1) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3;
(2) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3; 또는
(3) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
를 포함하는, 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편.
제1항에 있어서,
서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역
을 포함하는, 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편.
제1항에 있어서, GITR 단백질의 아미노산 잔기 92-132 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에 결합하는, 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편.
제1항에 있어서, 상기 항-GITR 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 또는 인간화 항체인, 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편.
제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항-GITR 항체의 scFv, scFv-Fc, (scFv)2, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인, 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
제10항에 있어서, 면역 세포 활성화, 조절 T 세포 억제, 및 면역단백질 생산 증가 중 선택된 하나 이상의 활성을 가지는, 면역 증강용 약학 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-GITR 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하는, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 면역관련 질병은 감염성 질환, 염증성 질환, 또는 자가면역질환인, 면역관련 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.