KR20220027940A - 액체 단백질 제제의 안정화를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

액체 단백질 제제의 안정화를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20220027940A
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앤서니 톰린슨
이시드로 안젤로 엘르아살 자라가
바르텔레미 루크 데뮬
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 개시는 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 액체 제제를 제공한다. 특히, 본 개시는 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 액체 제제를 개시하고, 상기 계면활성제의 약 70%(wt%) 이상이 이소소르비드 폴리옥시에틸렌(POE) 지방산 에스테르이다. 본 발명은 또한 상기 액체 제제의 제조 방법, 상기 액체 제제를 포함하는 제조 물품, 및 상기 액체 제제로 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

액체 단백질 제제의 안정화를 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 28일에 제출한 미합중국 가출원 특허 제62/868,615호에 우선권 이익을 주장하며, 그 전체가 본원에 원용된다.
본 개시는 일반적으로 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 안정적인 액체 약학적 제제 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
생물 약제학적 단백질 제제 내에서 일반적으로 사용되는 계면활성제인 폴리소르베이트(PS)는 화학적 가수분해, 산화, 및 효소 가수분해를 포함한 다양한 분해 경로에 민감한 것으로 나타났다. PS의 분해는 장기간 보관하는 동안 단백질 내 아미노산 잔기(예컨대, 메티오닌)를 후속적으로 산화시키는 다양한 과산화물의 생성으로 이어질 수 있다. Levine et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1996) 93, 15036-15040. 상기 아미노산 잔기의 산화는 단백질의 생물학적 활성에 잠재적으로 부정적인 영향을 미치므로써 단백질 제제에서 PS의 보호 효과를 제한한다. 또한, 폴리소르베이트는 불균질 혼합물이기 때문에 분해 패턴이 각기 다른 경로 간에 현저하게 상이할 수 있다. 따라서, 약학적 단백질 제제의 개발에서 계면활성제를 위한 보다 효율적인 부형제가 여전히 필요하다.
본 개시는 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 액체 제제를 제공하고, 상기 계면활성제의 약 70%(wt%) 이상이 이소소르비드 폴리옥시에틸렌(POE) 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 5 내지 30 POE 단위를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 20 POE 단위를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르, 디에스테르, 또는 이들의 혼합물이다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 이소소르비드 POE 모노라우레이트, 이소소르비드 POE 모노미리스테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미테이트, 이소소르비드 POE 모노스테아레이트, 및 이소소르비드 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 화학식(I)의 화합물이고:
Figure pct00001
(I);
여기서:
a 및 b는 독립적으로 2 내지 28의 정수이고, 단 a 및 b의 합은 5 내지 30의 정수이고;
R1 및 R2는 수소 및 -C(O)R"로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, R"은 선택적으로 치환된 C3-27알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이며; 및
R3 및 R4는 독립적으로 수소이다.
일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 9이다. 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 20이다. 일부 구현예들에서, R1은 H이고 R2는 -C(O)R"이다. 일부 구현예들에서, R2는 H이고 R1는 -C(O)R"이다. 일부 구현예들에서, R1 및 R2 둘 다는 -C(O)R"이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C3-27알킬이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C11알킬이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C3-27알케닐이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C17알케닐이다.
일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 80%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 85% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 90%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 POE 지방산 에스테르는 POE 모노라우레이트, POE 모노미리스테이트, POE 모노팔미테이트, POE 모노스테아레이트, 및 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 20% 미만이 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 10% 미만이 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 상기 액체 제제에서 약 0.0005% 내지 0.2%(w:v)이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르보다 더 많은 양의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 소르비탄 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만 또는 약 1% 미만은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 단백질이다. 일부 구현예들에서, 상기 단백질은 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 및 항체 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체의 농도는 약 0.001 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 재구성된 동결건조 제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 약 0.001 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 농도의 주입 용액으로 추가로 희석된다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 실질적으로 응집체가 없다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 유리 지방산 입자 형성을 덜 포함한다.
본원에 기재된 임의의 액체 제제를 넣는 용기를 포함하는 제품이 본원에 또한 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 용기는 IV 주머니이다. 일부 구현예들에서, 상기 IV 주머니는 주사 장치를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 IV 주머니는 주입 용액을 포함한다. 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 동결건조 제제로서, 상기 계면활성제의 약 70%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르인, 제제가 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 동결건조 제제는 본원에 개시된 임의의 액체 제제를 동결건조함으로써 제조된다.
폴리펩티드 및 계면활성제를 수용액에 첨가하는 단계를 포함하는 액체 제제의 제조 방법으로서,
상기 계면활성제의 70%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르인, 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 5 내지 30 POE 단위를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 20 POE 단위를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르, 디에스테르, 또는 이들의 혼합물이다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 이소소르비드 POE 모노라우레이트, 이소소르비드 POE 모노미리스테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미테이트, 이소소르비드 POE 모노스테아레이트, 및 이소소르비드 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 화학식(I)의 화합물이고:
Figure pct00002
(I);
여기서:
a 및 b는 독립적으로 2 내지 28의 정수이고, 단 a 및 b의 합은 5 내지 30의 정수이고;
R1 및 R2는 수소 및 -C(O)R"로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, R"은 선택적으로 치환된 C3-27알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이며; 및
R3 및 R4는 독립적으로 수소이다.
일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25이다. 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 9이다. 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 20이다. 일부 구현예들에서, R1은 H이고 R2는 -C(O)R"이다. 일부 구현예들에서, R2은 H이고 R1은 -C(O)R"이다. 일부 구현예들에서, R1 및 R2 둘 다는 -C(O)R"이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C3-27알킬이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C11알킬이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C3-27알케닐이다. 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C17알케닐이다.
일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 80%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 85% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 POE 지방산 에스테르를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 POE 지방산 에스테르는 POE 모노라우레이트, POE 모노미리스테이트, POE 모노팔미테이트, POE 모노스테아레이트, 및 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 20% 미만이 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 10% 미만이 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 상기 액체 제제에서 약 0.0005% 내지 0.2%(w:v)이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르보다 더 많은 양의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 소르비탄 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 10% 미만, 약 8% 미만, 약 5% 미만, 약 3% 미만 또는 약 1% 미만은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 단백질이다. 일부 구현예들에서, 상기 단백질은 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 및 항체 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 항체의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 300 mg/mL이다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 재구성된 동결건조 제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 약 0.1 mg/mL 내지 약 2 mg/mL의 농도의 주입 용액으로 추가로 희석된다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 동결건조 제제를 제조하기 위해 추가로 동결건조된다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 실질적으로 응집체가 없다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 유리 지방산 입자 형성을 덜 포함한다.
본원에 기재된 다양한 구체예의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 구체예를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본원의 이들 및 다른 양상들은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 구체예는 하기 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
도 1a 및 도 1b는 폴리소르베이트 20 분획(도 1a) 및 폴리소르베이트 80 분획(도 1b)의 순도 및 특성에 대한 UPLC 분석을 도시한다.
도 2a 및 도 2b는 형광 염료 N-페닐나프탈렌-1-아민(NPN)을 사용한 폴리소르베이트 20 분획(도 2a) 및 폴리소르베이트 80 분획(도 2b)의 임계 미셀 농도(CMC)를 도시한다.
도 3a 및 도 3b는 폴리소르베이트 20 분획(도 3a) 및 폴리소르베이트 80 분획(도 3b)에 대한 시간에 따른 표면 장력을 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 각각의 분획이 1 중량%의 농도를 가진 폴리소르베이트 20 분획(도 4a) 및 폴리소르베이트 80 분획(도 4b)의 미셀 크기를 도시한다.
도 5는 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 항체 제제의 이미지를 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 항체 제제의 이미지를 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B 및 mAB C의 항체 제제에 대한 HIAC 결과를 도시한다.
도 8a, 도 8b, 도 9a, 및 도 9b는 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B 및 mAB C의 항체 제제에 대한 HIAC 결과를 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 다양한 시간 동안 40ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 항체 제제의 이미지를 도시한다.
도 11a, 및 도 11b는 40ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAB B 및 mAb C의 항체 제제에 대한 HIAC 결과를 도시한다.
도 12a, 도 12b, 도 13a, 및 도 13b는 40ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B 및 mAb C의 항체 제제에 대한 SEC-HPLC 결과를 도시한다.
도 14b는 40ºC에서 보관된 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B의 항체 제제에 대한 IEC 결과를 도시한다.
도 15a 및 도 15b는 다양한 시간 동안 25ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 항체 제제의 이미지를 도시한다.
도 16a, 및 도 16b는 25ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B 및 mAb C의 항체 제제에 대한 HIAC 결과를 도시한다.
도 17a, 도 17b, 도 18a, 및 도 18b는 25ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B 및 mAb C의 항체 제제에 대한 SEC-HPLC 결과를 도시한다.
도 19는 25ºC에서 보관된 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B의 항체 제제에 대한 IEC 결과를 도시한다.
도 20a 및 도 20b는 다양한 시간 동안 5ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 항체 제제의 이미지를 도시한다.
도 21a, 및 도 21b는 5ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B 및 mAb C의 항체 제제에 대한 HIAC 결과를 도시한다.
도 22a, 도 22b, 도 23a, 및 도 23b는 5ºC에서 보관된 다양한 농도의 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B 및 mAb C의 항체 제제에 대한 SEC-HPLC 결과를 도시한다.
도 24는 5ºC에서 보관된 폴리소르베이트 20 분획을 함유하는 mAb B의 항체 제제에 대한 IEC 결과를 도시한다.
도 25는 2.5 U/mL의 농도의 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia, PCL)로부터의 리파아제 효소에 의한 PS20 및 F2a(각각 pH = 6.0에서 제제 완충액 내에서)의 강제 분해에 대한 HIAC 결과를 도시한다.
본 개시는 폴리소르베이트의 특정 분획이 약학적 단백질 제제에서 강력한 보호 효과를 제공한다는 발견을 기초로 한다. 구체적으로, 동일한 보호 효과를 위해 더 적은 계면활성제를 사용할 수 있으므로 폴리소르베이트의 분해로 인한 단백질의 생물학적 활성에 대한 부정적인 영향을 최소화한다. 일 양태에서, 본 개시는 상기 하나 이상의 폴리소르베이트 분획을 포함하는 단백질 제제를 제공한다. 본원에 기재된 단백질 제제는 제제 내에서 단백질 안정성의 증가를 입증하였다. 또한, 발명의 설명에서는 단백질 제제를 만들기 위한 키트 및 방법을 제공한다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 본원에 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공보들은 그 전체가 본원에 원용된다. 본 섹션에 제시된 정의가 본원에 원용된 특허, 출원 또는 기타 공보에 제시된 정의와 상반되거나 그렇지 않으면 일치하지 않는 경우 상기 섹션에 제시된 정의가 본원에 원용된 정의보다 우선한다.
명료함을 위해 별도의 구현예들의 맥락에서 기재된 본 개시의 특정한 특징은 단일 구현예와 조합하여 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 이와 반대로, 간결함을 위해 단일 구현예의 맥락에서 기재된 본 개시의 다양한 특징은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로도 제공될 수 있다. 특정 방법 단계, 시약 또는 조건과 관련된 구현예들의 모든 조합은 본 개시에 구체적으로 포함되며, 마치 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 "하나(a 또는 an)" 및 "그것(the)"은 문맥에서 달리 명확하게 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에서 "약" 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 지시된 변화형을 포함(및 기재)한다. 예를 들어, “약 X”에 대해 언급하는 설명은 "X"에 대한 설명을 포함한다.
용어 "약학적 제제"는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 상기 제제가 투여되는 대상체에게 허용 가능하지 않은 독성이 있는 추가 성분들은 함유하지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 멸균이다.
"재구성된" 제제는 단백질이 재구성된 제제 내에 분산되도록 동결건조된 단백질 또는 항체 제제를 희석제 내에 용해시켜 제조한 것이다. 재구성된 제제는 관심이 되는 단백질로 치료받을 환자에 대한 투여(예컨대, 비경구 투여)에 적합하고, 본 발명의 특정 구현예들에서 피하 투여에 적합한 것일 수 있다.
용어 “단백질”, “폴리펩티드” 및 “펩티드”는 임의의 길이를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 상기 중합체는 직쇄이거나 또는 분지쇄일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산이 끼어들 수 있다. 상기 용어들은 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분으로 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 전형적으로, 본원에서의 사용을 위한 단백질은 적어도 약 5-20 kD, 대안적으로는 적어도 약 15-20 kD, 또는 적어도 약 20 kD의 분자량을 가지게 된다. 또한, 상기 정의 내에는 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비자연적인 아미노산 등을 포함) 뿐만 아니라 당해 분야에서 공지된 다른 변형들을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에서 상기 정의 내에 포함되는 단백질의 예는 포유류 단백질, 예컨대 예를 들어, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 렙틴; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; TNF 연관 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL); B 세포 성숙 항원(BCMA); B 림프구 자극인자(BLyS); 증식 유도 리간드(APRIL); 엔케팔리나아제; RANTES(활성화 시에 조절된 정상적으로 T 세포 발현 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮤에레리안 억제 물질; 렐락신 A 사슬; 렐락신 B 사슬; 프로렐락신; 마우스 성선자극호르몬 연관 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타락타마아제; DN 분해효소; IgE; 세포독성 T 림프구 연관 항원(CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF); 혈관 내피 성장 인자 계열 단백질(예컨대, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGFD, 및 PlGF); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 계열 단백질(예컨대, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, 및 이들의 이량체); 섬유모세포 성장 인자(FGF) 계열, 예컨대 aFGF, bFGF, FGF4 및 FGF9; 표피 성장 인자(EGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 예컨대 VEGF 수용체(들)(예컨대, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3), 표피 성장 인자(EGF) 수용체(들)(예컨대, ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4 수용체), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 수용체(들)(예컨대, PDGFR-α 및 PDGFR-β), 및 섬유모세포 성장 인자 수용체(들); TIE 리간드(안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2); 안지오포이에틴 수용체, 예컨대 TIE1 및 TIE2; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자, 예컨대 뼈 유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함한 TGF-베타; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBPs); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질(BMP); 케모킨, 예컨대 CXCL12 및 CXCR4; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자(CSFs), 예컨대, M-CSF, GM-CSP 및 G-CSF; 사이토킨, 예컨대 인터류킨(ILs), 예컨대 IL-1 내지 IL-10; 미드킨; 초과산화물 디스무타아제; T 세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들어, AIDS 외피의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 에프린; Bv8; 델타 유사 리간드 4(DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; 폴리스타틴; 간세포 성장 인자(HGF)/산란 인자(SF); Alk1; Robo4; ESM1; 퍼레칸; EGF 유사 도메인, 멀피플(multiple) 7(EGFL7); CTGF 및 이의 계열 구성요소; 트롬보스폰딘, 예컨대 트롬보스폰딘1 및 트롬보스폰딘2; 콜라겐, 예컨대 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII; 뉴로필린, 예컨대 NRP1 및 NRP2; 플레이오트로핀(PTN); 프로그래눌린; 프로리페린; 노치 단백질, 예컨대 노치1 및 노치4; 세마포린, 예컨대 세마3A, 세마3C 및 세마3F; 종양 연관 항원, 예컨대 CA125(난소암 항원) 또는 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 면역부착소; 및 상기 열거된 단백질 중 임의의 것의 단편 및/또는 변이체뿐만 아니라 예를 들어, 임의의 상기 열거된 단백질을 포함한 하나 이상의 단백질에 결합하는 항체 및 항체 단편을 포함한다.
본원의 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 구체적으로 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포괄한다.
"분리된" 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 식별, 분리, 및/또는 회수된 항체이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 연구, 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리(Lowry) 법으로 결정시 항체의 95 중량% 초과까지, 일부 구현예들에서는, 99 중량% 초과까지; (2) 예를 들어, 회전 컵 서열분석 장치를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용한 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 균질성에 도달하도록 정제된다. 분리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에, 재조합 세포 내에서 인시튜(in situ) 항체를 포함한다. 하지만, 통상적으로 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
"고유 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 연결의 수는 상이한 면역글로불린 동형의 중쇄 중에서 가변된다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적 간격의 사슬내 이황화 가교를 가진다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다; 상기 경쇄의 불변 도메인은 상기 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되며, 상기 경쇄 가변 도메인은 상기 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인들 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
본원에서 사용된 용어 "전장 항체", "원형 항체" 및 "전체 항체"는 하기에 정의된 바와 같은 항체 단편이 아니라, 이의 실질적으로 원형인 형태의 항체를 상호교환적으로 지칭한다. 이들 용어는 특히, Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
“항체 단편”은 원형 항체의 일부를 포함하고, 선택적으로 이의 항원 결합 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 동종 항체의 군으로부터 수득한 항체를 지칭하며, 예컨대 상기 군을 포함하는 개별 항체는 가능한 돌연변이, 예컨대 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 별개 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 특정 구현예들에서, 상기 단일클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 상기 표적 결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 수득하였다. 예를 들어, 상기 선택 공정은 복수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 고유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 개선하고, 표적 결합 서열을 인간화하고, 세포 배양에서 이의 생성을 개선하고, 생체내 면역원성을 감소시키고, 다중특이적 항체 등을 생성하기 위해 추가로 변경될 수 있으며, 상기 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 단일클론 항체이 됨을 이해하여야 한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 제제의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정기에 대해 지향된다. 이들의 특이성 이외에도, 단일클론 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "단클론"은 실질적으로 동종 항체 군으로부터 수득한 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생성을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원의 단일클론 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄 부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 반면, 나머지 사슬(들)은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체뿐만 아니라, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 항체의 단편들을 또한 포함한다(예컨대, 미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855 (1984)를 참조). 키메라 항체에는 PRIMATIZED® 항체가 포함되며, 상기 항체의 항원 결합 영역은, 예컨대 관심 항원으로 짧은꼬리(macaque) 원숭이를 면역화하여 생성된 항체로부터 유도된다.
비인간(예컨대, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 가진 비인간 종, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 또는 비인간 영장류의 HVR(공여자 항체)의 잔기들로 대체되는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우들에서, 상기 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 상기 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 상기 간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가적인 세부사항에 대해서는, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)를 참조한다. 또한, 예컨대 Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); 및 미국 특허 제6,982,321호 및 제7,087,409호를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고 및/또는 본원에 개시된 인간 항체를 제조하는 임의의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 상기 인간 항체의 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 구체적으로 배제한다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하여 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생성될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mal. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mal. Biol., 222:581 (1991). 또한, 인간 단일클론 항체의 제조를 위해, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)에 기재된 방법들도 입수 가능하다. 또한, van Dijk 및 van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)를 참조한다. 인간 항체는 항원 유발접종에 반응하여 상기 항체를 생성하기 위해 개질되었지만, 그 내인성 유전자좌가 불활성화된 형질전환(transgenic) 동물, 예컨대 면역화된 제노마우스(예컨대, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 대한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호를 참조)에 항원을 투여함으로써 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:3557-3562 (2006)를 참조한다.
“안정적인” 제제는 내부의 단백질이 보관시 이의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 보관시 이의 물리적 및 화학적 안정성뿐만 아니라 생물학적 활성을 본질적으로 유지한다. 보관 기간은 일반적으로 제제의 의도된 보관 수명에 근거하여 선택된다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기법이 당해 분야에서 입수 가능하고, 예를 들어 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에서 검토된다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 양의 광 노출 및/또는 온도에서 계측될 수 있다. 안정성은 응집체 형성의 평가(예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 사용, 탁도 측정 및/또는 육안 검사에 의함); ROS 형성의 평가(예를 들어, 가벼운 스트레스 분석 또는 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판) 디히드로클로라이드(AAPH) 스트레스 분석을 사용함); 단백질의 특정 아미노산 잔기(예를 들어, 단일클론 항체의 Trp 잔기 및/또는 Met 잔기)의 산화; 양이온 교환 크로마토그래피, 이미지 모세관 등전점 초점(icIEF) 또는 모세관 구역 전기영동을 사용한 전하 이질성의 평가; 아미노 말단 또는 카르복시 말단 서열 분석; 질량 분광 분석; 환원된 항체와 원형 항체를 비교하기 위한 SDS-PAGE 분석; 펩티드 지도(예컨대, 트립신 또는 LYS-C) 분석; 단백질의 생물학적 활성 또는 표적 결합 기능(예컨대, 항체의 항원 결합 기능)의 평가; 등을 포함한 여러 상이한 방법으로 정성적 및/또는 정량적으로 평가할 수 있다. 불안정성은 응집, 탈아미드화(예컨대, Asn 탈아미드화), 산화(예컨대, Met 산화 및/또는 Trp 산화), 이성질체화(예컨대, Asp 이성질체화), 절단/가수분해/단편화(예컨대, 힌지 영역 단편화), 숙신이미드 형성, 쌍을 이루지 않은 시스테인(들), N 말단 연장, C 말단 가공, 글리코실화 차이, 부형제의 분해, 미립자 형성(예컨대, 유리 지방산 입자) 등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
단백질은, 만약 색상 및/또는 선명도의 육안 검사 시에, 또는 UV 광 산란에 의해 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정할 때 응집, 침전 및/또는 변성의 징후를 거의 또는 전혀 나타내지 않는 경우, 약학적 제제 내에서 “물리적 안정성을 유지한다”.
단백질은, 만약 주어진 시간에 화학적 안정성이 단백질이 하기에 정의된 바와 같이 이의 생물학적 활성을 여전히 유지하는 것으로 간주되는 경우, 약학적 제제 내에서 “화학적 안정성을 유지한다.” 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변형된 형태를 검출 및 정량함으로써 평가할 수 있다. 화학적 변형은, 예를 들어 트립신 펩티드 맵핑, 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC/MS)을 사용하여 평가할 수 있는 단백질 산화를 포함할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변형은, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 icIEF로 평가할 수 있는 단백질의 전하 변화를 포함한다.
단백질은, 만약 주어진 시간에 단백질의 생물학적 활성이, 예를 들어 단일클론 항체의 항원 결합 분석에서 결정된 바와 같이, 약학적 제제가 제조된 시간에 나타나는 생물학적 활성의 약 10% 이내(상기 분석의 오류 내에서)인 경우, 약학적 제제 내에서 “생물학적 활성을 유지한다.” 본원에서 사용된 단백질의 “생물학적 활성”은 단백질이 이의 표적에 결합하는 능력, 예를 들어 단일클론 항체가 항원에 결합하는 능력을 지칭한다. 이는 시험관내 또는 생체내에서 측정할 수 있는 생물학적 반응을 추가로 포함할 수 있다. 상기 활성은 길항적 또는 작용적일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리에틸렌글리콜", "PEG", "폴리에틸렌옥사이드", "PEO", "폴리옥시에틸렌" 및 "POE"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 2개 이상의 에틸렌 산화물 소단위로 구성된 폴리에테르 화합물을 지칭한다. "폴리에틸렌 글리콜"은 에틸렌 옥사이드 올리고머(예컨대, 2 내지 9개의 에틸렌 옥사이드 단량체 소단위를 가짐) 또는 에틸렌 옥사이드 중합체(예컨대, 10개 이상의 9개 에틸렌 옥사이드 단량체 소단위를 가짐)로 구성될 수 있다.
"지방산"은 긴사슬 탄화수소 측기를 가진 카르복실산이다. 이는 메틸기가 알코올, 알데히드, 그 다음 산으로 산화되는 등가에 의해 탄화수소에서 유래되는 유기 일염기산으로 구성된다. 지방산은 포화 또는 불포화될 수 있다. 불포화 지방산의 경우, 시스(Z) 또는 트랜스(E) 배열 또는 이 둘의 조합을 가질 수 있다.
"알킬"은 지시된 탄소수, 예를 들어 탄소수 1 내지 20, 또는 탄소수 1 내지 8, 또는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 및 분지쇄 탄소 사슬을 포함한다. 예를 들어, C1-6알킬은 탄소수 1 내지 6의 직쇄 및 분지쇄 알킬을 모두 포함한다. 특정 탄소수를 갖는 알킬 잔기가 명명될 때, 상기 탄소수를 갖는 모든 분지쇄 및 직쇄 버전이 포함되도록 의도되고; 따라서, 예를 들어 "프로필"은 n-프로필 및 이소프로필을 포함하며; "부틸"은 n-부틸, sec-부틸, 이소부틸 및 t-부틸을 포함한다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 2-헥실, 3-헥실 및 3-메틸펜틸을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 값의 범위가 주어지면(예컨대, C1-6알킬), 상기 범위 내의 각각의 값 뿐만 아니라 모든 중간 범위가 포함된다. 예를 들어, “C1-6알킬”은 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C1-6, C2-6, C3-6, C4-6, C5-6, C1-5, C2-5, C3-5, C4-5, C1-4, C2-4, C3-4, C1-3, C2-3, 및 C1-2알킬을 포함한다.
"알케닐"은 지시된 탄소수(예컨대, 탄소수 2 내지 8, 또는 2 내지 6) 및 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 분지쇄 또는 직쇄 알킬기를 지칭한다. 상기 기는 상기 이중 결합(들)에 대해 시스 또는 트랜스 배열(Z 또는 E 배열)에 있을 수 있다. 알케닐기는 에테닐, 프로페닐(예컨대, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일(알릴), 프로프-2-엔-2-일), 및 부테닐(예컨대, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치환된"은 명시된 기 또는 모이어티가 치환기들, 예컨대 알콕시, 아실, 아실옥시, 알콕시카르보닐, 카르보닐알콕시, 아실아미노, 아미노, 아미노아실, 아미노카르보닐아미노, 아미노카르보닐옥시, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴옥시, 시아노, 아지도, 할로, 히드록실, 니트로, 카르복실, 티올, 티오알킬, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴, 아르알킬, 아미노술포닐, 술포닐아미노, 술포닐, 및 옥소 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 하나 이상의 치환기를 포함함을 의미한다. 용어 “비치환된”은 명시된 군이 그 어떤 치환기도 함유하지 않음을 의미한다. 용어 "치환된"이 구조 시스템을 설명하는 데 사용되는 경우, 상기 치환은 상기 시스템 상의 임의의 원자가 허용 위치에서 발생하는 것을 의미한다. 기 또는 모이어티가 1개 초과의 치환기를 포함할 때, 상기 치환기는 서로 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 이해된다. 일부 구현예들에서, 치환된 기 또는 모이어티는 1 내지 5개의 치환기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 치환된 기 또는 모이어티는 1개의 치환기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 치환된 기 또는 모이어티는 2개의 치환기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 치환된 기 또는 모이어티는 3개의 치환기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 치환된 기 또는 모이어티는 4개의 치환기를 포함한다. 일부 구현예들에서, 치환된 기 또는 모이어티는 5개의 치환기를 포함한다.
용어 “선택적” 또는 “선택적으로”는 후속 설명된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 상기 설명은 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 알킬"은 본원에 정의된 "알킬" 및 "치환된 알킬" 둘 다를 포함한다. 당업자는 하나 이상의 치환기를 함유하는 임의의 기와 관련하여 상기 기가 입체적으로 비실용적이고, 합성적으로 실현가능하지 않고/거나 본질적으로 불안정한 임의의 치환 또는 치환 패턴을 도입하도록 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 기 또는 모이어티가 선택적으로 치환되는 경우, 본 개시는 상기 기 또는 모이어티가 치환된 구현예 및 상기 기 또는 모이어티가 비치환된 구현예 둘 다를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
“무균” 제제는 무균이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이들의 포자가 없거나 본질적으로 없다.
II. 폴리펩티드 제제
폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 제제가 본원에 제공되며, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트의 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 액체 제제이다. 일부 구현예들에서, 상기 제제는 동결건조 제제이다.
계면활성제
생물 약제학적 제제는 통상적으로 계면 스트레스로부터 활성 약학적 성분을 보호하기 위해 계면활성제와 함께 제제화된다. 계면, 특히 공기-물과의 상호 작용은 교반 또는 장기 보관 중에 치료 단백질의 응집을 유발하는 것으로 나타났다. 폴리소르베이트는 생물 약제학에서 상기 유형의 상호작용을 방지하기 위해 통상적으로 사용되는 계면활성제이다. 폴리소르베이트는 일반적으로 높은 표면 활성, 낮은 임계 미셀 농도(CMC), 및 낮은 독성으로 인해 선택된다. 하지만, 상기 계면활성제는 서로 조합하여 생물 약제학적 제제에 필요한 고유한 특성을 부여하는 관련 화합물들의 불균질한 혼합물이다.
폴리소르베이트(PS)는 지방산으로 에스테르화된 에톡실화 소르비탄으로서 정식 기재되는 유화제 부류이다. PS는 여러 층의 이질성을 가진 관련 화합물의 혼합물이다. 제1 층은 지방산 에스테르 꼬리 길이이다. USP 및 EP 논문에서는 PS20에 대한 상기 에스테르의 분포가 40-60% 라우레이트(C12) 에스테르, 14-25% 미리스테이트(C14) 에스테르, 7-15% 팔미테이트(C16) 에스테르에 더하여 최대 1% 카프로에이트(C6) 에스테르, 10% 카프릴레이트(C8) 에스테르, 10% 카프레이트(C10) 에스테르, 7% 스테아레이트(C18) 에스테르, 11% 단일불포화 C18 에스테르, 및 3% 이중불포화 C18 에스테르이어야 하는 것으로 지시한다. 추가적인 이질성은 POE 사슬의 길이 뿐만 아니라 디에스테르 및 트리에스테르의 존재에서 유래된다. 또한, 소르비톨에서 소르비탄을 합성하는 동안 이소소르비드가 또한 형성되어 4개가 아닌 2개의 POE 팔을 갖는 일련의 자체 PS20 유사 화합물을 생성할 수 있다. 표 1를 또한 참조한다. 다양한 성분이 현저하게 상이한 용액 및 계면 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 특히, 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 성분은 폴리펩티드에 대한 더 큰 보호 특성을 갖는다. 따라서, 폴리소르베이트 내에서의 농도보다 더 높은 농도의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르(예컨대, 70%(wt%) 이상)를 사용하면(예컨대, EP 또는 USP 논문에서 설명된 바와 같이), 더 적은 양의 계면활성제를 사용하면서도 액체 제제 내에서 폴리펩티드에 대한 더 큰 보호를 제공할 수 있다.
제제 내에서 폴리펩티드를 보호하는 데 효율적인 폴리소르베이트의 특정 성분과 함께 계면활성제를 포함하는 생물 약제학적 제제가 본원에서 제공된다. 일부 구현예들에서, 상기 성분들은 계면활성제를 덜 사용하게 하지만, 더 큰 안정성을 제공한다. 일부 구현예들에서, 사용되는 계면활성제의 양이 적을수록 유리 지방산 입자가 덜 형성된다. 일부 구현예들에서, 상기 성분들은 상기 유리 지방산 입자에 맞서 폴리펩티드에 대한 더 큰 보호를 제공한다.
일 양태에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 지방산 에스테르를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르를 포함한다.
일부 구현예들에서, 각각의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 각각의 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 약 5-10 POE 단위, 약 10-15 단위, 약 15-20 POE 단위, 약 20-25 POE 단위, 약 25-30 POE 단위, 약 15-30 POE 단위를 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 및 각각의 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 5 POE 단위, 6 POE 단위, 7 POE 단위, 8 POE 단위, 9 POE 단위, 10 POE 단위, 11 POE 단위, 12 POE 단위, 13 POE 단위, 14 POE 단위, 15 POE 단위, 16 POE 단위, 17 POE 단위, 18 POE 단위, 19 POE 단위, 20 POE 단위, 21 POE 단위, 22 POE 단위, 23 POE 단위, 24 POE 단위, 25 POE 단위, 26 POE 단위, 27 POE 단위, 28 POE 단위, 29 POE 단위, 30 POE 단위 또는 이들의 조합를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 5-10 POE 단위, 약 10-15 단위, 약 15-20 POE 단위, 약 20-25 POE 단위, 약 25-30 POE 단위, 약 15-30 POE 단위를 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 5 POE 단위, 6 POE 단위, 7 POE 단위, 8 POE 단위, 9 POE 단위, 10 POE 단위, 11 POE 단위, 12 POE 단위, 13 POE 단위, 14 POE 단위, 15 POE 단위, 16 POE 단위, 17 POE 단위, 18 POE 단위, 19 POE 단위, 20 POE 단위, 21 POE 단위, 22 POE 단위, 23 POE 단위, 24 POE 단위, 25 POE 단위, 26 POE 단위, 27 POE 단위, 28 POE 단위, 29 POE 단위, 30 POE 단위 또는 이들의 조합를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 20 POE 단위를 갖는다. 일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르 둘 다는 약 5-30 POE 단위를 갖는다. 일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르 둘 다는 약 20 POE 단위를 갖는다.
일부 구현예들에서, 각각의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 각각의 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 및 선택적으로 치환된 알키닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 지방산 사슬을 독립적으로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 알킬은 직쇄이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 비치환된 C4-28알킬이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 아실, 히드록실, 시클로알킬, 알콕시, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 니트로, 할로, 티올, 티오알킬, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로시클릴로 이루어진 군에서 선택된 치환기로 치환된 C4-28알킬이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 비치환된 C4-28알케닐이다. 일부 구현예들에서, 상기 알케닐은 직쇄 또는 분지쇄이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 하나 이상의 이중 결합을 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 이중 결합은 시스(cis) 배열을 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 이중 결합은 트랜스(trans) 배열을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 아실, 히드록실, 시클로알킬, 알콕시, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 니트로, 할로, 티올, 티오알킬, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로시클릴로 이루어진 군에서 선택된 치환기로 치환된 C4-28알케닐이다.
일부 구현예들에서, 각각의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 1, 2, 3 또는 4개의 POE 팔을 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 2개의 POE 팔을 갖는다.
일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 하기의 화학식(I)의 구조를 갖고:
Figure pct00003
(I);
여기서:
a 및 b는 독립적으로 2 내지 28의 정수이고, 단 a 및 b의 합은 5 내지 30의 정수이고;
R1 및 R2는 수소 및 -C(O)R"로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, R"은 선택적으로 치환된 C3-27알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이며; 및
R3 및 R4는 독립적으로 수소이다.
화학식(I)의 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 약 5-10, 약 10-15, 약 15-20, 약 20-25, 약 25-30, 또는 약 15-30이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30이다. 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 9이다. 일부 구현예들에서, a 및 b의 합은 20이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 수소가 아니다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R1 및 R2 둘 다는 -C(O)R"이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 선택적으로 치환된 C3-27알킬이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C3-27알킬이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, 상기 C3-27알킬은 직쇄이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, 상기 C3-27알킬은 분지쇄이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C5알킬, C7알킬, C9알킬, C11알킬, C13알킬, C15알킬, C17알킬, C19알킬, C21알킬, 또는 C23알킬이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C11알킬이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C3-27알케닐이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, 상기 C3-27알케닐은 직쇄이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 비치환된 C5알케닐, C7알케닐, C9알케닐, C11알케닐, C13알케닐, C15알케닐, C17알케닐, C19알케닐, C21알케닐, 또는 C23알케닐이다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 2개 이상의 이중 결합을 갖는다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, 상기 2개 이상의 이중 결합은 시스(cis) 구성을 갖는다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, 상기 2개 이상의 이중 결합은 트랜스(trans) 배열을 갖는다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 시스(cis) 배열을 갖는 1개의 이중 결합을 갖는다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 트랜스(trans) 배열을 갖는 1개의 이중 결합을 갖는다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 -(CH2)7CH=CH(CH2)3CH3, -(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3, -(CH2)4CH=CH(CH2)8CH3, -(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3, -(CH2)9CH=CH(CH2)5CH3,
-(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3, -(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH3,
-(CH2)3CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3 및
-(CH2)11CH=CH(CH2)7CH3으로 이루어진 군에서 선택된다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 -(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3이고 상기 이중 결합은 시스(cis) 배열을 갖는다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 -(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3이고 상기 두 이중 결합은 시스(cis) 배열을 갖는다. 화학식(I)의 일부 구현예들에서, R"은 -(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3이고 상기 두 이중 결합은 트랜스(trans) 배열을 갖는다.
일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99%(wt%) 이상은 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 70%(wt%) 이상은 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 80%(wt%) 이상은 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 90%(wt%) 이상은 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 95%(wt%) 이상은 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다.
일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르, 디-에스테르, 트리-에스테르, 테트라-에스테르 및 이들의 조합에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르이다. 일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 모노에스테르는 이소소르비드 POE 모노카프로에이트, 이소소르비드 POE 모노카프릴레이트, 이소소르비드 POE 모노카프레이트, 이소소르비드 POE 모노라우레이트, 이소소르비드 POE 모노미리스테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미톨레이트, 이소소르비드 POE 모노스테아레이트, 이소소르비드 POE 모노올레이트, 이소소르비드 POE 모노리놀레에이트, 이소소르비드 POE 모노리놀레네이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 디-에스테르이다. 일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 디-에스테르는 이소소르비드 POE 디카프로에이트, 이소소르비드 POE 디카프릴레이트, 이소소르비드 POE 디카프레이트, 이소소르비드 POE 디라우레이트, 이소소르비드 POE 디미리스테이트, 이소소르비드 POE 디팔미테이트, 이소소르비드 POE 디팔미톨레이트, 이소소르비드 POE 디스테아레이트, 이소소르비드 POE 디올레이트, 이소소르비드 POE 디리놀레에이트, 이소소르비드 POE 디리놀레네이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 화학식(I)의 화합물이다.
일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르는 동일한 지방산 사슬을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르는 상이한 지방산 사슬을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 POE 지방산 에스테르는 POE 모노카프로에이트, POE 모노카프릴레이트, POE 모노카프레이트, POE 모노라우레이트, POE 모노미리스테이트, POE 모노팔미테이트, POE 모노팔미톨레이트, POE 모노스테아레이트, POE 모노올레이트, POE 모노리놀레이트, POE 모노리놀레네이트, POE 디카프로에이트, POE 디카프릴레이트, POE 디카프레이트, POE 디라우레이트, POE 디미리스테이트, POE 디팔미테이트, POE 디팔미톨레이트, POE 디스테아레이트, POE 디올레이트, POE 디리놀레이트, POE 디리놀레네이트 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노라우레이트 및 POE 모노라우레이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노팔미테이트 및 POE 모노팔미테이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노미리스테이트 및 POE 모노미리스테이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노올레이트 및 POE 모노올레이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노리놀레이트 및 POE 모노리놀레이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르보다 더 많은 양의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 7.5% 미만, 약 5%, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 약 0.75% 미만, 약 0.5% 미만, 또는 약 0.1%(wt%) 미만은 POE 지방산 에스테르이다.
다른 양태에서, 상기 계면활성제는 소르비탄 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 약 5-10 POE 단위, 약 10-15 단위, 약 15-20 POE 단위, 약 20-25 POE 단위, 약 25-30 POE 단위, 약 15-30 POE 단위를 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 5 POE 단위, 6 POE 단위, 7 POE 단위, 8 POE 단위, 9 POE 단위, 10 POE 단위, 11 POE 단위, 12 POE 단위, 13 POE 단위, 14 POE 단위, 15 POE 단위, 16 POE 단위, 17 POE 단위, 18 POE 단위, 19 POE 단위, 20 POE 단위, 21 POE 단위, 22 POE 단위, 23 POE 단위, 24 POE 단위, 25 POE 단위, 26 POE 단위, 27 POE 단위, 28 POE 단위, 29 POE 단위, 30 POE 단위 또는 이들의 조합를 갖는다.
일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 및 선택적으로 치환된 알키닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 지방산 사슬을 독립적으로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 알킬은 직쇄이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 비치환된 C4-28알킬이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 아실, 히드록실, 시클로알킬, 알콕시, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 니트로, 할로, 티올, 티오알킬, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로시클릴로 이루어진 군에서 선택된 치환기로 치환된 C4-28알킬이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 비치환된 C4-28알케닐이다. 일부 구현예들에서, 상기 알케닐은 직쇄 또는 분지쇄이다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 하나 이상의 이중 결합을 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 이중 결합은 시스(cis) 배열을 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 이중 결합은 트랜스(trans) 배열을 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 지방산 사슬은 아실, 히드록실, 시클로알킬, 알콕시, 아실옥시, 아미노, 아미노아실, 니트로, 할로, 티올, 티오알킬, 알킬, 알케닐, 알키닐 또는 헤테로시클릴로 이루어진 군에서 선택된 치환기로 치환된 C4-28알케닐이다.
일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 2, 3 또는 4개의 POE 팔을 갖는다. 일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 4개의 POE 팔을 갖는다.
일부 구현예들에서, 상기 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 하기의 화학식(II)의 구조를 갖고:
Figure pct00004
(II);
여기서:
w, z, y, 및 x는 독립적으로 2 내지 24의 정수이고, 단 w, z, y, 및 x의 합은 15 내지 30의 정수이고;
R5, R6, R7 및 R8은 수소 및 -C(O)R'로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, R'은 선택적으로 치환된 C3-27알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이며; 및
R9는 수소이다.
화학식(II)의 일부 구현예들에서, w, z, y, 및 x의 합은 약 15-20, 약 20-25, 약 25-30, 또는 약 15-30이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, w, z, y, 및 x의 합은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R5, R6, R7 및 R8 중 적어도 하나는 수소가 아니다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R5, R6, R7 및 R8 중 적어도 2개는 수소가 아니다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R5, R6, R7 및 R8 중 각각의 하나는 -C(O)R'이 아니다. 일부 구현예들에서, R5, R6 및 R7은 H이고 R8은 -C(O)R'이다. 일부 구현예들에서, R5 및 R6은 H이고 R3 및 R4는 -C(O)R'이다. 일부 구현예들에서, R6은 H이고 R5, R7 및 R8은 -C(O)R'이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 선택적으로 치환된 C3-27알킬이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 비치환된 C3-27알킬이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, 상기 C3-27알킬은 직쇄이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, 상기 C3-27알킬은 분지쇄이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 비치환된 C5알킬, C7알킬, C9알킬, C11알킬, C13알킬, C15알킬, C17알킬, C19알킬, C21알킬, 또는 C23알킬이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 비치환된 C11알킬이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 비치환된 C3-27알케닐이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, 상기 C3-27알케닐은 직쇄이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 비치환된 C5알케닐, C7알케닐, C9알케닐, C11알케닐, C13알케닐, C15알케닐, C17알케닐, C19알케닐, C21알케닐, 또는 C23알케닐이다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 2개 이상의 이중 결합을 갖는다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, 상기 2개 이상의 이중 결합은 시스(cis) 배열을 갖는다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, 상기 2개 이상의 이중 결합은 트랜스(trans) 배열을 갖는다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 시스(cis) 배열을 갖는 1개의 이중 결합을 갖는다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 트랜스(trans) 배열을 갖는 1개의 이중 결합을 갖는다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 -(CH2)7CH=CH(CH2)3CH3, -(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3, -(CH2)4CH=CH(CH2)8CH3,
-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3, -(CH2)9CH=CH(CH2)5CH3,
-(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3, -(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH3,
-(CH2)3CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3 및
-(CH2)11CH=CH(CH2)7CH3으로 이루어진 군에서 선택된다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 -(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3이고 상기 이중 결합은 시스(cis) 배열을 갖는다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 -(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3이고 상기 두 이중 결합은 시스(cis) 배열을 갖는다. 화학식(II)의 일부 구현예들에서, R'은 -(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3이고 상기 두 이중 결합은 트랜스(trans) 배열을 갖는다.
일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1%(wt%) 미만은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 1%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 5%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 10%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 15%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다.
일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 모노에스테르, 디-에스테르, 트리-에스테르, 테트라-에스테르이다. 일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 소르비탄 POE 모노카프로에이트, 소르비탄 POE 모노카프릴레이트, 소르비탄 POE 모노카프레이트, 소르비탄 POE 모노라우레이트, 소르비탄 POE 모노미리스테이트, 소르비탄 POE 모노팔미테이트, 소르비탄 POE 모노팔미톨레이트, 소르비탄 POE 모노스테아레이트, 소르비탄 POE 모노올레이트, 소르비탄 POE 모노리놀레이트, 소르비탄 POE 모노리놀레네이트, 소르비탄 POE 디카프로에이트, 소르비탄 POE 디카프릴레이트, 소르비탄 POE 디카프레이트, 소르비탄 POE 디라우레이트, 소르비탄 POE 디미리스테이트, 소르비탄 POE 디팔미테이트, 소르비탄 POE 디팔미톨레이트, 소르비탄 POE 디스테아레이트, 소르비탄 POE 디올레이트, 소르비탄 POE 디리놀레이트, 소르비탄 POE 디리놀레네이트, 소르비탄 POE 트리카프로에이트, 소르비탄 POE 트리카프릴레이트, 소르비탄 POE 트리카프레이트, 소르비탄 POE 트리라우레이트, 소르비탄 POE 트리미리스테이트, 소르비탄 POE 트리팔미테이트, 소르비탄 POE 트리팔미톨레이트, 소르비탄 POE 트리스테아레이트, 소르비탄 POE 트리올레이트, 소르비탄 POE 트리리놀레이트, 및 소르비탄 POE 트리리놀레네이트로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 화학식(II)의 화합물이다.
다른 양태에서, 본원에 개시된 계면활성제는 약 0.001%, 약 0.002%, 약 0.003%, 약 0.004%, 약 0.005%, 약 0.006%, 약 0.007%, 약 0.008%, 약 0.009%, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 또는 약 0.1%(w:v) 초과의 임계 미셀 농도(CMC)를 갖는다. 다른 양태에서, 상기 계면활성제는 약 20 mN/m, 약 25 mN/m, 약 30 mN/m, 약 35 mN/m, 약 40 mN/m, 약 45 mN/m, 약 50 mN/m, 약 55 mN/m, 또는 약 60 mN/m 미만의 표면 장력을 갖는다.
폴리펩티드
본원의 개시는 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 액체 제제에 관한 것이다. 일부 구현예들에서, 본원에 기재된 액체 제제 내 폴리펩티드는 본질적으로 순수하다. 일부 구현예들에서, 본원에 기재된 액체 제제 내 폴리펩티드는 본질적으로 균질하다(즉, 오염 단백질이 없음). “본질적으로 순수한” 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 90 중량% 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 의미한다. 일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 95 중량% 이상이다. “본질적으로 균질한” 폴리펩티드는 조성물의 총 중량을 기준으로 약 99 중량% 이상의 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 의미한다.
일부 구현예들에서, 상기 폴리펩티드는 항체이다. 본원의 항체는 관심 “항원”에 대해 지향된다. 일부 구현예들에서, 상기 항원은 생물학적으로 중요한 단백질이고 질병 또는 장애를 앓는 포유동물에 대한 항체의 투여는 상기 포유동물에서 치료적 이점을 가질 수 있다. 일부 구현예들에서, 비단백질 항원(예컨대, 종양 연관 당지질 항원; 예컨대, 미국 특허 제5,091,178호를 참조)에 대한 항체가 또한 고려된다. 상기 항원이 단백질인 경우, 이는 막관통 분자(예컨대, 수용체) 또는 리간드, 예컨대 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원은 본원에 기재된 임의의 단백질을 포함한다. 일부 구현예들에서, 본 개시에 포함되는 항체에 대한 분자 표적은 CD 폴리펩티드들, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; HER 수용체 계열의 구성요소들, 예컨대 EGF 수용체(HER1), HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 인터루킨(ILs), 예컨대 IL-1 내지 IL-10; 세포 부착 분자들, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 av/b3 인테그린(이의 a 또는 b 소단위들 중 하나를 포함, 예컨대 항 CD11a, 항 CD18 또는 항 CD11b 항체); VEGF와 같은 성장 인자들; IgE; 혈액형 항원들; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1); 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1); 폴리펩티드 C 등을 포함한다. 임의적으로 다른 분자들에 접합된 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용할 수 있다. 막관통 분자들, 예컨대 수용체들에 대하여, 이의 단편들(예컨대, 수용체의 세포외 도메인)은 면역원으로서 사용할 수 있다. 대안적으로, 막관통 분자를 발현하는 세포는 면역원으로 사용할 수 있다. 상기 세포들은 천연 공급원(예컨대, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 막관통 분자를 발현하기 위해 재조합 기술에 의해 형질전환되는 세포일 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 항체는 다클론, 단일클론, 인간화, 인간, 이중특이적, 다중특이적, 키메라, 및 이종접합체 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 항체 단편 및 전체 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편으로 이루어진 군에서 선택된다.
제제 내의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드를 부호화하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하는 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하거나, 또는 합성 기술(예컨대, 재조합 기술 및 펩티드 합성 또는 상기 기술들의 조합)을 통해 제조할 수 있거나, 또는 폴리펩티드의 내인성 공급원으로부터 분리될 수 있다.
A. 단백질 제조
재조합 수단에 의한 본 개시의 방법에 의해 제제화될 단백질의 제조는 발현 또는 클로닝 벡터로 적합한 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시킴으로써, 그리고 프로모터의 유도, 형질전환체의 선택 또는 원하는 서열을 부호화하는 유전자의 증폭에 적절하게 변형된 종래의 영양 배지 내에서 배양함으로써 달성할 수 있다. 배지, 온도 및 pH 등과 같은 배양 조건은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 극대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실용적인 기술은 Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, Ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press에서 찾을 수 있다. 형질감염 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 CaPO4 및 CaCl2 형질감염, 전기천공, 미세주입 등을 포함한다. 적합한 기술 또한Sambrook et al., supra에 기재되어 있다. 추가적인 형질감염 기술이 Shaw et al., Gene 23: 315 (1983); WO 89/05859; Graham et al., Virology 52: 456-457 (1978) 및 U.S.P. 4,399,216에 기재되어 있다.
본 방법에 따른 제제화를 위해 원하는 단백질을 부호화하는 핵산은 클로닝 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내에 삽입될 수 있다. 적합한 벡터는 공개적으로 입수 가능하며 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태를 취할 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 표지자 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 성분들 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 당업자에게 공지된 표준 결찰 기술을 사용한다.
제제화될 단백질의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막에 결합된 경우, 적합한 계면활성제를 사용하거나 또는 효소 절단을 통해 막에서 분리할 수 있다. 발현을 위해 사용된 세포는 또한 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있다.
제제화될 단백질의 정제는 당업계에 공지된 임의의 적합한 기술, 예컨대 예를 들어 이온 교환 컬럼 상의 분획법, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 또는 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피(예컨대, DEAE), 크로마토 초점 맞춤, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전, IgG와 같은 오염 물질의 제거를 위한 단백질 A 세파로오스 컬럼(예컨대, 세파덱스(Sephadex)® G-75)을 사용한 겔 여과, 및 에피토프 태그 형태를 결합하기 위한 금속 킬레이트성 컬럼에 의해 실시될 수 있다.
B. 항체 제조
본 발명의 특정 구현예들에서, 선택된 단백질은 항체이다. 다클론, 단일클론, 인간화, 이중특이적 및 이종접합체 항체를 포함한 항체 생성 기술은 하기와 같다.
1. 다클론 항체
다클론 항체는 일반적으로 관련 항원 및 보조제의 다중 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물 내에서 생성된다. 상기 관련 항원을 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 접합하는 것이 유용할 수 있다. 사용할 수 있는 보조제의 예는 프로인트 완전 보조제 및 MPL-TDM 보조제(모노포스포릴 지질 A, 합성 트레할로스 디코리노마이콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다.
1개월 후, 상기 동물들은 다수의 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 완전 보조제 내 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10로 강화(boost)된다. 7 내지 14일 후, 상기 동물들을 채혈하고 혈청을 항체 역가에 대하여 분석한다. 동물들은 역가가 정체 상태를 유지할 때까지 강화된다. 일부 구현예들에서, 상기 동물은 동일한 항원의 접합체로 강화되지만, 상이한 단백질에 및/또는 상이한 가교결합 시약을 통해 접합된다. 접합체들은 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양에서 제조할 수 있다. 또한, 응집제, 예컨대 명반은 면역 반응을 증진시키기 위해 적합하게 사용된다.
2. 단일클론 항체
단일클론 항체는 실질적으로 동종 항체들의 군으로부터 수득하고, 즉 상기 군을 포함하는 개별 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 별개 항체들의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다.
예를 들어, 상기 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터는 면역화에 이용된 단백질에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 또는 생성할 수 있는 림프구를 이끌어 내기 위해 상기 기재된 바와 같이 면역화된다. 대안적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 그런 다음, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합 작용제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포주와 융합된다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
면역화제는 전형적으로 제제화될 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 바람직한 경우 말초 혈액 림프구("PBL")가 사용되거나, 또는 비인간 포유류 공급원이 바람직한 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 그런 다음, 림프구는 하이브리도마 세포를 형성하기 위해 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합한다. Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103.
불멸화 세포주는 일반적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 비융합된 모골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 선택적으로 함유하는 적합한 배양 배지 내에서 분주하고 성장한다. 예를 들어, 상기 모 골수종 세포에 효소 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 전달효소(HGPRT 또는 HPRT)가 부족하면, 하이브리도마에 대한 배양 배지는 전형적으로 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것인데, 이들 물질은 HGPRT 결함성 세포의 성장을 방지한다.
적합한 불멸화 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하며, 배지, 예컨대 HAT 배지에 민감한 것이다. 일부 구현예들에서, 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예컨대 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 살크 인스티튜트 세포분배센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것, 및 미국 버지니아주 머내서스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수 가능한 SP-2 세포(및 이의 유도체, 예컨대 X63-Ag8-653)이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 또한 인간 단일클론 항체의 생성을 위해 기재되었다(Kozbor, J. lmmunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대한 단일클론 항체의 생성에 대해 분석된다. 일부 구현예들에서, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정(RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정된다.
하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 다시 원하는 항원에 대한 단일클론 항체의 존재에 대해 분석될 수 있다. 일부 구현예들에서, 단일클론 항체의 결합 친화성 및 특이성은 면역침강 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정(RIA) 또는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 상기 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 단일클론 항체의 결합 친화성은, 예를 들어 Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)의 스캐차드(Scatchard) 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석 절차에 의해 하위클로닝되고 표준 방법에 의해 성장할 수 있다(Goding, supra). 상기 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 상기 하이브리도마 세포는 동물 내에 복수 종양으로서 생체 내에서 성장할 수 있다.
하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 종래의 면역글로불린 정제 절차, 예컨대 예를 들어 단백질 A-세파로오스, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기이동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
단일클론 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호 및 상기 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체를 부호화하는 DNA는 쉽게 단리되고, 종래의 절차를 사용하여(예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 부호화하는 유전자에 구체적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 서열분석할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, 상기 DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있으며, 그런 다음 이들 벡터는 재조합 숙주 세포 내에서 원하는 단일클론 항체의 합성하기 위해 숙주 세포, 예컨대 대장균(E. coli) 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 만약 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염된다. 항체를 부호화하는 DNA의 박테리아 내 재조합 발현에 관한 검토 논문은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 및 Pliickthun, Immunol. Revs. 130: 151-188 (1992)를 포함한다: .
추가 구현예에서, 항체는 McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mal. Biol., 222:581-597 (1991)은 파지 라이브러리를 사용하여 각각 뮤린 및 인간 항체의 분리를 설명한다. 후속 간행물은 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 전략으로서 사슬 셔플링(Marks et al., Bio/I'echnology, 10:779-783 (1992)) 뿐만 아니라 조합 감염 및 생체내 제조합에 의한 고친화성(nM 범위) 인간 항체의 생성을 기재한다(Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). 따라서, 상기 기술은 단일클론 항체의 분리를 위한 전통적인 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행 가능한 대안이다.
DNA는 또한, 예를 들어 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 부호화 서열을 대체함으로써(미국 특허 제4,816,567호; Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) 또는 면역글로불린 부호화 서열에 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 부호화 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합함으로써 변형될 수 있다. 전형적으로, 상기 비면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인에 대해 치환되거나, 또는 항체의 하나의 항원 결합 부위의 가변 도메인에 대해 치환됨으로써 항원에 대해 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성한다.
본원에 기재된 단일클론 항체는 1가일 수 있으며, 이의 제조는 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄 가교를 방지하기 위해 중쇄는 일반적으로 Fc 영역 내 임의의 지점에서 절단된다. 대안적으로, 관련 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있거나, 또는 가교를 방지하기 위해 결실될 수 있다. 시험관내 방법은 또한 1가 항체를 제조하는 데 적합하다. 이의 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 항체의 소화는 당업계에 공지된 통상적인 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교제를 포함하는 것을 포함하여 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화 교환 반응을 사용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 구성할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
3. 인간화 항체.
본 발명의 항체는 인간화 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 인간화 형태의 비인간(예컨대, 뮤린) 항체는 비인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열)이다. 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)이고, 여기서 상기 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기들은 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자 항체)의 CDR으로부터의 잔기들에 의해 대체된다. 일부 경우들에서, 인간 면역글로불린의 FR 프레임워크 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체 내에서나 이입된 CDR 또는 프레임워크 서열 내에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비인간 면역글로불린의 것에 대응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 상기 인간화 항체는 또한 최적으로 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함하게 된다. Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) 및 Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
비인간 항체를 인간화하기 위한 방법이 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된다. 상기 비인간 아미노산 잔기는 “이입” 잔기로서 종종 지칭되는데, 이는 전형적으로 “이입” 가변 도메인으로부터 수득된다. 인간화는 Winter 및 동료들, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)의 방법에 따라서 및 인간 항체의 상응하는 서열에 대하여 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환함으로써 본질적으로 실시할 수 있다. 이에 따라, 상기 “인간화” 항체는 원형 인간 가변 도메인의 실질적으로 더 적은 부분이 비인간 종으로부터 대응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체(미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 아마도 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는 데 이용되는 인간 가변 도메인(경쇄 및 중쇄 둘 모두)의 선택은 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 소위 “최고 적합” 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별검사된다. 그런 다음, 설치류의 것과 가장 가까운 인간 서열은 인간화 항체에 대한 인간 프레임워크(FR)로서 받아들여진다. Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mal. Biol., 196:901 (1987). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 여러 상이한 인간화 항체에 사용될 수 있다. Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993).
항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 우호적인 생물학적 성질을 유지하면서 인간화되는 것이 또한 중요하다. 상기 목표를 달성하기 위해, 일부 구현예들에서, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모형은 통상적으로 입수 가능하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 입수 가능하다. 상기 전시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 예상 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 상기 방식으로, FR 잔기는 수용자 및 이입 서열로부터 선택되고 조합되어, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성이 달성될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미치는데 관여한다.
다양한 형태의 인간화 항체가 고려된다. 예를 들어, 상기 인간화 항체는 면역접합체를 생성하기 위해 선택적으로 하나 이상의 세포독성제(들)와 접합되는 Fab와 같은 항체 단편일 수 있다. 대안적으로, 상기 인간화 항체는 원형 IgG1 항체와 같은 원형 항체일 수 있다.
4. 인간 항체.
인간화의 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 동물(예컨대, 생쥐)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 저해를 유발하는 것으로 기재되었다. 상기 생식계열 돌연변이체 마우스 내에 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 공격 시에 인간 항체의 생성을 유발할 것이다. 예컨대, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 1:33 (1993); 미국 특허 제5,591,669호 및 WO 97/17852를 참조한다.
대안적으로, 파지 디스플레이 기술은 면역화되지 않은 공여자의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성하는 데 사용될 수 있다. McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Hoogenboom and Winter, J. Mal. Biol. 227: 381 (1991). 상기 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 사상 박테리오파지의 주 또는 부 외피 단백질 유전자 내로 프레임 내 클로닝되고 파지 입자 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 표시된다. 사상 입자는 파지 유전체의 단일 가닥 DNA 복제를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 상기 특성을 나타내는 항체를 부호화하는 유전자의 선택을 초래한다. 따라서, 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는, 예컨대 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993)에서 검토된 다양한 형식으로 실시될 수 있다. V 유전자 분절의 여러 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 항 옥사졸론 항체 배열을 분리하였다. 면역되지 않은 인간 공여자로부터 V 유전자의 레퍼토리가 구성될 수 있고 다양한 항원 배열(자가 항원 포함)에 대한 항체는 Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)에서 기재한 기술에 따라 본질적으로 단리될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,565,332호및 제5,573,905호를 참조한다.
Cole 등 및 Boerner 등의 기술은 또한 인간 단일클론 항체의 제조에 입수 가능하다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991)). 유사하게, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 형질전환 동물, 예컨대 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내에 도입함으로써 제조될 수 있다. 유발(challenge) 시에, 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 면에서 인간에서 볼 수 있는 것과 매우 유사한 인간 항체 생성이 관찰된다. 상기 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호 및 하기의 과학 간행물: Marks et al., Bio/I'echnology 10:779-783 (1992); Lenberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) 및 Lenberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)에 기재되어 있다.
마지막으로, 인간 항체는 또한 활성화된 B 세포에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호를 참조).
5. 항체 단편
특정 환경에서는 전체 항체보다 항체 단편을 이용하는 것이 이점이 있다. 단편의 크기가 작을 수록 신속한 청소가 가능하고 고형 종양에 대한 접근이 개선될 수 있다.
항체 단편을 생성하기 위한 다양한 기술들이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 원형 항체의 단백분해 소화를 통해 유도되었다(예컨대, Morimoto et al., J Biochem Biophys. Method. 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)를 참조). 하지만, 상기 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있다. Fab, Fv, 및 ScFv 항체 단편은 모두 대장균에서 발현되고 분비될 수 있으며, 이로써 상기 단편들을 많은 양으로 용이하게 생성할 수 있다. 항체 단편은 상기 논의한 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab’-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab’)2 단편을 형성할 수 있다(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab’)2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 생체내 반감기가 증가하는 Fab 및 F(ab')2는 미국 특허 제5,869,046호에 기재되어 있다. 다른 구현예들에서, 선택된 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호 및 미국 특허 제5,587,458호를 참조한다. 상기 항체 단편은 또한, 예컨대 미국 특허 제5,641,870에 기재된 바와 같이 "선형 항체"일 수 있다. 상기 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
6. 이중특이적 및 다중특이적 항체.
이중특이적 항체(BsAb)는 동일하거나 다른 단백질 상의 것을 포함하여 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 대안적으로, 한 팔은 표적 항원에 결합하도록 무장될 수 있고, 다른 팔은 백혈구, 예컨대 T 세포 수용체 분자(예컨대, CD3) 또는 IgG(FcγR), 예컨대 FcγR1(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)에 대한 Fc 수용체 상의 촉발 분자에 결합하는 팔과 조합되어, 표적 항원 발현 세포에 세포 방어 기작을 집중시키고 국소화할 수 있다. 상기 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예컨대, F(ab’)2 이중특이적 항체)으로서 유래될 수 있다.
이중특이적 항체는 또한 표적 항원을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 원하는 항원에 결합하는 하나의 팔 및 세포독성제(예컨대, 사포린, 항 인터페론-α, 빈카 알콜로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)에 결합하는 다른 팔을 보유한다. 공지된 이중특이적 항체의 예는 항 ErbB2/항 FcgRIII(WO 96/16673), 항 ErbB2/항 FcgRI(U.S.P. 5,837,234), 항 ErbB2/항 CD3(U.S.P. 5,821,337)을 포함한다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법들은 당해 분야에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적 생성은 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기반으로 하며, 상기 두 사슬은 상이한 특이성을 갖는다. Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열 때문에, 상기 하이브리도마(쿼드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이들 중 오직 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 보통 친화성 크로마토그래피 단계에 의하여 실시되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물 산출량이 낮다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)에 개시되어 있다.
상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인들(항체-항원 결합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열들에 융합된다. 일부 구현예들에서, 상기 융합은 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖고, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 일부 구현예들에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 상기 융합들 중 적어도 하나에 존재한다. 상기 면역글로불린 중쇄 융합 및, 원하는 경우, 상기 면역글로불린 경쇄를 부호화하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내에 공동 형질감염된다. 이는 구성에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등 비가 최적의 수율을 제공하는 경우, 구현예들에서 상기 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정함에 있어 큰 가요성을 제공한다. 하지만, 균등 비에서 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 산출하는 경우, 또는 상기 비가 특별한 유의성이 없는 경우, 한 발현 벡터에서 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 부호화 서열을 삽입하는 것이 가능하다.
일부 구현예들에서, 이중특이적 항체는 하나의 팔에 제1 결합 특이성을 가진 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 팔에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공)으로 구성된다. 이중특이적 분자의 단지 1/2 내의 면역글로불린 경쇄의 존재가 분리의 용이한 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터의 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 상기 접근법은 WO 94/04690에 개시된다. 이중특이적 항체의 생성에 관한 추가적인 세부사항은, 예를 들어 Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986)을 참조한다.
WO 96/27011 또는 U.S.P. 5,731,168에 기재된 다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수된 이종이량체의 비율을 최대화하도록 조작될 수 있다. 일부 구현예들에서, 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 상기 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더욱 큰 측쇄(예컨대, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 동일한 또는 유사한 크기의 보상성 “공동”은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예컨대, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 생성된다. 이는 동종이량체와 같은 다른 원치 않는 최종 생성물에 비하여 이종이량체 수율을 증가시키기 위한 기전을 제공한다.
항체 단편들로부터 이중특이적 항체들을 생성하기 위한 기술들이 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체들은 화학적 연결을 사용하여 제조할 수 있다. Brennan et al., Science 229:81 (1985)은 원형 항체가 F(ab’)2 단편을 생성하기 위하여 단백질가수분해적으로 절단되는 절차를 설명한다. 상기 단편들은 이웃한 디티올을 안정화하고 분자간 이황화 형성을 방지하기 위하여 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재하에서 환원된다. 그런 다음, 생성된 Fab’ 단편들은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 그런 다음, Fab'-TNB 유도체 중 하나가 Fab'-TNB 유도체로 재전환되어 이중특이적 항체를 형성한다. 상기 생성된 이중특이적 항체들은 효소의 선택적 고정화를 위한 제제로서 사용될 수 있다.
Fab' 단편은 대장균으로부터 직접 회수될 수 있고 화학적으로 결합되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있다. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab’)2 분자의 생성을 기재한다. 각 Fab’ 단편은 대장균으로부터 별도로 분비되고, 시험관 내에서 지시된 화학적 커플링이 이루어져 이중특이적 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 유래된 이중특이적 항체 단편들을 제조하고 분리하는 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 2가 이종이량체들은 류신 지퍼를 사용하여 생성되었다. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질 유래의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab’ 부분에 연결되었다. 항체 동종이량체들은 힌지 영역에서 환원되어 단량체들을 형성한 후, 재산화되어 항체 이종이량체들을 형성하였다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)에 의해 기재된 “디아바디” 기술은 이중특이적/2가 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 상기 단편들은 동일한 사슬 상의 두 도메인 간 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 이에 따라, 한 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하도록 유도되어 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적/2가 항체 단편을 제조하기 위한 다른 전략이 또한 보고되었다. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)를 참조한다.
2개를 초과하는 원자가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).
예시적인 이중특이적 항체는 주어진 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 대안적으로, 항단백질 팔은 백혈구, 예컨대 T 세포 수용체 분자(예컨대, CD2, CD3, CD28 또는 B7) 또는 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR), 예컨대 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16) 상에 촉발 분자에 결합하는 팔과 조합되어 특정 단백질을 발현하는 세포에 세포 방어 기작을 집중시킬 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 특정 단백질을 발현하는 세포에 세포독성제를 국소화하는데 사용될 수 있다. 상기 항체는 단백질 결합 팔 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이트제, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA에 결합하는 팔을 보유한다. 관심의 다른 이중특이적 항체는 관심의 단백질에 결합하고 조직 인자(TF)에 추가로 결합한다.
제제
폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 액체 제제가 본원에서 제공된다. 본원에 기재된 임의의 계면활성제는 액체 제제에 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 계면활성제는 약 0.0005% 내지 0.2%, 약 0.0005% 내지 0.001%, 약 0.001% 내지 0.002%, 약 0.002% 내지 0.003%, 약 0.003% 내지 0.004%, 약 0.004% 내지 0.005%, 약 0.005% 내지 0.006%, 약 0.006% 내지 0.007%, 약 0.007% 내지 0.008%, 약 0.008% 내지 0.009%, 약 0.009% 내지 0.01%, 약 0.01% 내지 0.015%, 약 0.015% 내지 0.02%, 약 0.02% 내지 0.025%, 약 0.025% 내지 0.03%, 약 0.03% 내지 0.035%, 약 0.035% 내지 0.04%, 약 0.04% 내지 0.045%, 약 0.045% 내지 0.05%, 약 0.05% 내지 0.055%, 약 0.055% 내지 0.06%, 약 0.06% 내지 0.065%, 약 0.065% 내지 0.07%, 약 0.07% 내지 0.075%, 약 0.075% 내지 0.08%, 약 0.08% 내지 0.085%, 약 0.085% 내지 0.09%, 약 0.09% 내지 0.095%, 약 0.095% 내지 0.1%, 약 0.1% 내지 0.11%, 약 0.11% 내지 0.12%, 약 0.12% 내지 0.13%, 약 0.13% 내지 0.14%, 약 0.14% 내지 0.15%, 약 0.15% 내지 0.16%, 약 0.16% 내지 0.17%, 약 0.17% 내지 0.18%, 약 0.18% 내지 0.19%, 약 0.19% 내지 0.2%, 약 0.0005% 내지 0.01%, 약 0.01% 내지 0.02%, 약 0.02% 내지 0.03%, 약 0.03% 내지 0.04%, 약 0.04% 내지 0.05%, 약 0.05% 내지 0.06%, 약 0.06% 내지 0.07%, 약 0.07% 내지 0.08%, 약 0.08% 내지 0.09%, 약 0.09% 내지 0.1%, 약 0.1% 내지 0.12%, 약 0.12% 내지 0.14%, 약 0.14% 내지 0.16%, 약 0.16% 내지 0.18%, 약 0.18% 내지 0.2%, 또는 약 0.0005% 내지 0.02%(w:v) 농도의 액체 제제를 갖는다.
일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 0.00035% 내지 0.2%, 약 0.00035% 내지 0.0005%, 약 0.0005% 내지 0.001%, 약 0.001% 내지 0.002%, 약 0.002% 내지 0.003%, 약 0.003% 내지 0.004%, 약 0.004% 내지 0.005%, 약 0.005% 내지 0.006%, 약 0.006% 내지 0.007%, 약 0.007% 내지 0.008%, 약 0.008% 내지 0.009%, 약 0.009% 내지 0.01%, 약 0.01% 내지 0.015%, 약 0.015% 내지 0.02%, 약 0.02% 내지 0.025%, 약 0.025% 내지 0.03%, 약 0.03% 내지 0.035%, 약 0.035% 내지 0.04%, 약 0.04% 내지 0.045%, 약 0.045% 내지 0.05%, 약 0.05% 내지 0.055%, 약 0.055% 내지 0.06%, 약 0.06% 내지 0.065%, 약 0.065% 내지 0.07%, 약 0.07% 내지 0.075%, 약 0.075% 내지 0.08%, 약 0.08% 내지 0.085%, 약 0.085% 내지 0.09%, 약 0.09% 내지 0.095%, 약 0.095% 내지 0.1%, 약 0.1% 내지 0.11%, 약 0.11% 내지 0.12%, 약 0.12% 내지 0.13%, 약 0.13% 내지 0.14%, 약 0.14% 내지 0.15%, 약 0.15% 내지 0.16%, 약 0.16% 내지 0.17%, 약 0.17% 내지 0.18%, 약 0.18% 내지 0.19%, 약 0.19% 내지 0.2%, 약 0.00035% 내지 0.01%, 약 0.01% 내지 0.02%, 약 0.02% 내지 0.03%, 약 0.03% 내지 0.04%, 약 0.04% 내지 0.05%, 약 0.05% 내지 0.06%, 약 0.06% 내지 0.07%, 약 0.07% 내지 0.08%, 약 0.08% 내지 0.09%, 약 0.09% 내지 0.1%, 약 0.1% 내지 0.12%, 약 0.12% 내지 0.14%, 약 0.14% 내지 0.16%, 약 0.16% 내지 0.18%, 약 0.18% 내지 0.2%, 또는 약 0.00035% 내지 0.14%(w:v) 농도의 액체 제제를 갖는다.
액체 제제 중 폴리펩티드의 농도는 저장 구성 및 원하는 투여 경로(예컨대, 피하, 근육내 또는 유리체내 투여, 정맥내 주사 또는 주입 등)에 따라 가변될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 폴리펩티드는 약 0.1 mg/mL 내지 300 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 0.5 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 1 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 1.5 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 2.5 mg/mL, 약 2.5 mg/mL 내지 3 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 3.5 mg/mL, 약 3.5 mg/mL 내지 4 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 4.5 mg/mL, 약 4.5 mg/mL 내지 5 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 3 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 4 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 5 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 10 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 15 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 20 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 30 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 40 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 100 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 150 mg/mL, 약 150 mg/mL 내지 200 mg/mL, 약 200 mg/mL 내지 250 mg/mL, 약 250 mg/mL 내지 300 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 150 mg/mL, 약 150 mg/mL 내지 200 mg/mL, 또는 200 mg/mL 내지 300 mg/mL의 농도를 가진다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 폴리펩티드의 농도는 약 0.5 mg/mL이다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 폴리펩티드는 약 50 mg/mL 초과, 약 150 mg/mL 초과, 약 200 mg/mL 초과, 약 250 mg/mL 초과 또는 약 300 mg/mL 초과의 농도를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제가 희석되어 폴리펩티드의 농도를 약 1-5배, 약 5-10배, 약 10-15배, 약 15-20배, 약 20-30배, 약 30-40배, 약 40-50배, 약 50-100배, 약 100-150배, 약 150-200배, 약 200-300배, 약 300-400배, 약 400-500배, 약 500-600배, 약 600-700배, 약 700-800배, 약 800-900배, 약 900-1000배, 약 1000-1500배, 약 1500-2000배, 약 2000-2500배, 약 2500-3000배, or 약 3000-5000배 만큼 감소시킬 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 주입 용액으로 희석된다. 일부 구현예들에서, 상기 주입 용액은 덱스트로스 함유 용액, 젖산 링거 용액, 식염수, 반 식염수 또는 완충 식염수를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 생리 식염수(약 0.9%(w:v))이다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 등장성 식염수이다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 인산염 완충 식염수 또는 크렙스 링거(Krebs-Ringer's) 용액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 완충 식염수이다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 대상체로부터의 혈액의 삼투압 농도와 등장성 또는 대략 등장성이다. 상기 식염수는 염, 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 또는 염화칼슘을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 하나 이상의 완충액, 예컨대 인산 완충액(예컨대, 인산나트륨 또는 인산칼륨), 탄산나트륨, 또는 HEPES를 포함한다. 완충 식염수가 사용될 때, 특히 안정성이 pH 의존적일 경우, pH는 폴리펩티드의 치료 효과를 최적화하는 범위로 유지된다.
A. 동결건조 제제
일부 구현예들에서, 본원에 기재된 액체 제제는 또한 재구성된 동결건조 제제로서 제조될 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드는 동결건조된 후 재구성되어 액체 제제를 생성할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 기재된 바와 같은 관심 단백질을 제조한 후, "사전 동결건조된 제제"가 생성된다. 일부 구현예들에서, 상기 재구성된 제제의 폴리펩티드 농도는 사전 동결건조된 제제보다 높다. 일부 구현예들에서, 상기 재구성된 제제의 폴리펩티드 농도는 사전 동결건조된 제제보다 낮다. 사전 동결건조된 액체 제제 및 재구성된 액체 제제 내에 존재하는 폴리펩티드의 농도는 원하는 용량 부피, 투여 방식 등을 고려하여 결정된다.
1. 동결건조 제제의 제조
동결건조 제제를 제조할 때, 제제화될 단백질은 일반적으로 용액 내에 존재한다. 예를 들어, 본 발명의 증가된 이온 강도 감소된 점도 제재에서, 단백질은 약 4-8, 바람직하게는 약 5-7의 pH의 pH 완충 용액 내에 존재할 수 있다. 완충액 농도는, 예를 들어 완충액 및 제제(예컨대, 재구성된 제제)의 원하는 장성(tonicity)에 따라 약 1 mM 내지 약 20 mM, 대안적으로 약 3 mM 내지 약 15 mM일 수 있다. 예시적인 완충액 및/또는 염은 "약학적으로 허용가능한" 산, 염기 또는 완충액에 정의된 것과 같이 약학적으로 허용가능하고 적합한 산, 염기 및 이의 염으로부터 생성될 수 있는 것들이다.
일부 구현예들에서, 동결보호제가 사전 동결건조된 제제에 첨가된다. 사전 동결건조된 제제에서 동결보호제의 양은 일반적으로 재구성 시 생성된 제제가 등장성이 되도록 하는 양이다. 하지만, 고장성 재구성 제제도 적합할 수 있다. 또한, 동결보호제의 양은 동결건조시 허용할 수 없는 양의 단백질 분해/응집이 발생하지 않도록 너무 낮아서는 안 된다. 하지만, 사전 동결건조된 제제에서 예시적인 동결보호제 농도는 약 10 mM 내지 약 400 mM, 대안적으로 약 30 mM 내지 약 300 mM, 대안적으로 약 50 mM 내지 약 100 mM이다. 예시적인 동결보호제는 수크로스, 만노스, 트레할로스, 글루코스, 소르비톨, 및 만니톨과 같은 당 및 당 알코올을 포함한다. 하지만, 특정 상황들에서 특정 동결보호제는 제제의 점도 증가에 기여할 수도 있다. 이와 같이, 상기 효과를 최소화하거나 중화하는 특정 동결보호제를 선택하도록 주의를 기울여야 한다. 추가의 동결보호제는 "동결보호제"의 정의 하에 상기 기재되어 있으며, 또한 본원에서 "약학적으로 허용가능한 당"으로도 지칭된다.
동결보호제에 대한 단백질의 비율은 각각의 특정 단백질 또는 항체 및 동결보호제 조합에 따라 가변될 수 있다. 높은 단백질 농도를 갖는 등장성 재구성 제제를 생성하기 위한 동결보호제로서 선택되는 단백질로서의 항체 및 당(예컨대, 수크로스 또는 트레할로스)의 경우, 동결보호제 대 항체의 몰비는 약 100 내지 약 1500몰의 동결보호제 대 1몰의 항체, 또는 약 200 내지 약 1000몰의 동결보호제 대 1몰의 항체, 예를 들어 약 200 내지 약 600몰의 동결보호제 대 1몰의 항체일 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료되는 특정 징후에 대해 필요에 따라 하나를 초과하는 단백질, 예컨대 다른 단백질에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 단일 제제 내 원하는 표적(예컨대, 수용체 또는 항원)에 결합하는 2개 이상의 항체를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 단백질은 의도하는 목적에 효과적인 양으로 병용하여 적합하게 존재한다.
생체내 투여에 사용될 제제는 멸균이어야 한다. 이는 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 대안적으로, 전체 혼합물의 멸균은, 예를 들어 약 120℃에서 약 30분 동안 단백질을 제외한 성분들을 고압멸균함으로써 달성될 수 있다.
단백질 이후에, 선택적인 동결보호제 및 기타 선택적 성분들을 함께 혼합하고, 상기 제제를 동결건조한다. 많은 상이한 동결 건조기들, 예컨대 훌(Hull)50TM(미국 소재의 훌) 또는 GT20TM(독일 소재의 레이볼드-헤라우스(Leybold-Heraeus)) 동결 건조기가 상기 목적으로 입수 가능하다. 동결건조는 제제를 동결한 다음 1차 건조에 적합한 온도에서 동결된 내용물로부터 얼음을 승화시켜 달성된다. 상기 조건하에서, 생성물 온도는 공융점(eutectic point) 또는 제제의 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 1차 건조를 위한 저장 온도는 전형적으로 약 50 내지 250 mTorr에 이르는 적합한 압력에서 (생성물이 1차 건조 동안 동결된 채로 유지된다면) 약 -30 내지 25°C 범위를 갖는다. 시료를 보유하는 용기의 조성, 크기 및 종류(예컨대, 유리 바이알) 및 액체의 부피는 주로 건조에
필요한 시간을 지시하게 되며, 이는 수시간 내지 수일(예컨대, 40 내지 60시간)의 범위일 수 있다. 선택적으로, 생성물 중 원하는 잔류 수분 수준에 따라 2차 건조 단계가 실시될 수도 있다. 2차 건조가 실시되는 온도는 주로 용기의 종류 및 크기 및 사용되는 단백질의 유형에 따라 약 0~40℃ 범위에 이른다. 예를 들어, 동결건조의 전체 수분 제거 단계에 걸쳐 저장 온도는 약 15~30℃(예컨대, 약 20 °C)일 수 있다. 2차 건조에 필요한 시간 및 압력은 적합한 동결건조 케익을 생성하는 시간 및 압력일 것이며, 이는, 예컨대 온도 및 다른 매개변수들에 의존적이다. 2차 건조 시간은 생성물 내 원하는 잔류 수분 수준에 의해 결정되며, 전형적으로는 적어도 약 5시간(예컨대, 10~15시간)이 소요된다. 압력은 1차 건조 단계 동안 사용되는 압력과 동일할 수 있다. 동결건조 조건은 제제 및 바이알 크기에 따라 가변될 수 있다.
2. 동결건조 제제의 재구성
환자에게 투여하기 전에, 동결건조된 제제를 약학적으로 허용가능한 희석제로 전형적으로 재구성하여, 재구성된 제제 중 단백질의 농도가 약 50 mg/ml 이상, 예를 들어 약 50 mg/ml 내지 약 400 mg/ml, 대안적으로 약 80 mg/ml 내지 약 300 mg/ml, 대안적으로 약 90 mg/ml 내지 약 150 mg/m가 되게 한다. 재구성된 제제에서 이러한 높은 단백질 농도는 재구성된 제제의 피하 전달이 의도되는 경우에 특히 유용한 것으로 간주된다. 하지만, 정맥내 투여와 같은 다른 투여 경로들의 경우, 재구성된 제제에서 보다 낮은 농도의 단백질이(예를 들어, 재구성된 제제에서 약 0.1~2 mg/ml, 약 2~10 mg/ml, 또는 약 10~50 mg/ml의 단백질) 바람직할 수 있다. 특정 구현예들에서, 재구성된 제제의 단백질 농도는 사전 동결건조된 제제의 단백질 농도보다 유의적으로 높다. 특정 구현예들에서, 재구성된 제제의 단백질 농도는 사전 동결건조된 제제의 단백질 농도보다 유의적으로 낮다.
재구성은 일반적으로 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25°C의 온도에서 실시하지만, 원하는 경우 다른 온도를 사용할 수도 있다. 재구성에 필요한 시간은, 예컨대 희석제의 유형, 부형제(들) 및 단백질의 양에 따라 달라지게 된다. 예시적 희석제는 멸균수, 세균증식억제 주사용수(BWFI), pH 완충 용액(예컨대, 인산 완충 식염수), 멸균 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 상기 희석제는 선택적으로 보존제를 포함한다. 예시적인 보존제가 상기에 기재되었으며, 벤질 또는 페놀 알콜과 같은 방향족 알콜이 바람직한 보존제이다. 사용된 보존제의 양은 단백질과의 호환성 및 보존제 효능 시험을 위해 상이한 방부제 농도들을 평가하여 결정한다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알코올(예컨대, 벤질 알코올)인 경우, 보존제는 약 0.1~2.0%, 또는 약 0.5~1.5%, 또는 약 1.0~1.2%의 양으로 존재할 수 있다.
일부 구현예들에서, 재구성된 액체 제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 액체 제제는 응집체가 실질적으로 없다. 일부 구현예들에서, 재구성된 액체 제제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 액체 제제는 유리 지방산 입자 형성을 덜 포함한다.
III. 액체 제제의 제조 방법
폴리펩티드 및 계면활성제를 수용액에 첨가하는 단계를 포함하는 액체 제제의 제조 방법이 또한 본원에 제공되며, 여기서 상기 계면활성제는 폴리소르베이트의 하나 이상의 성분을 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 지방산 에스테르를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르는 독립적으로 약 5-30 POE 단위를 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 및 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 지방산 사슬을 독립적으로 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 화학식(I)의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99%(wt%) 이상은 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 이소소르비드 POE 모노카프로에이트, 이소소르비드 POE 모노카프릴레이트, 이소소르비드 POE 모노카프레이트, 이소소르비드 POE 모노라우레이트, 이소소르비드 POE 모노미리스테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미톨레이트, 이소소르비드 POE 모노스테아레이트, 이소소르비드 POE 모노올레이트, 이소소르비드 POE 모노리놀레에이트, 이소소르비드 POE 모노리놀레네이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 POE 지방산 모노에스테르는 POE 모노카프로에이트, POE 모노카프릴레이트, POE 모노카프레이트, POE 모노라우레이트, POE 모노미리스테이트, POE 모노팔미테이트, POE 모노팔미톨레이트, POE 모노스테아레이트, POE 모노올레이트, POE 모노리놀레에이트, POE 모노리놀레네이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노라우레이트 및 POE 모노라우레이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노팔미테이트 및 POE 모노팔미테이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노미리스테이트 및 POE 모노미리스테이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노올레이트 및 POE 모노올레이트를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 이소소르비드 POE 모노리놀레이트 및 POE 모노리놀레이트를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 계면활성제는 소르비탄 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 지방산 사슬을 독립적으로 갖는다. 일부 구현예들에서, 상기 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 화학식(II)의 화합물이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1%(wt%) 미만은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 1%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 5%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 10%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다. 일부 구현예들에서, 상기 계면활성제의 15%(wt%) 이상은 소르비탄 POE 지방산 에스테르이다.
일부 구현예들에서, 각각의 소르비탄 POE 지방산 에스테르는 소르비탄 POE 모노카프로에이트, 소르비탄 POE 모노카프릴레이트, 소르비탄 POE 모노카프레이트, 소르비탄 POE 모노라우레이트, 소르비탄 POE 모노미리스테이트, 소르비탄 POE 모노팔미테이트, 소르비탄 POE 모노팔미톨레이트, 소르비탄 POE 모노스테아레이트, 소르비탄 POE 모노올레이트, 소르비탄 POE 모노리놀레이트, 소르비탄 POE 모노리놀레네이트, 소르비탄 POE 디카프로에이트, 소르비탄 POE 디카프릴레이트, 소르비탄 POE 디카프레이트, 소르비탄 POE 디라우레이트, 소르비탄 POE 디미리스테이트, 소르비탄 POE 디팔미테이트, 소르비탄 POE 디팔미톨레이트, 소르비탄 POE 디스테아레이트, 소르비탄 POE 디올레이트, 소르비탄 POE 디리놀레이트, 소르비탄 POE 디리놀레네이트, 소르비탄 POE 트리카프로에이트, 소르비탄 POE 트리카프릴레이트, 소르비탄 POE 트리카프레이트, 소르비탄 POE 트리라우레이트, 소르비탄 POE 트리미리스테이트, 소르비탄 POE 트리팔미테이트, 소르비탄 POE 트리팔미톨레이트, 소르비탄 POE 트리스테아레이트, 소르비탄 POE 트리올레이트, 소르비탄 POE 트리리놀레이트, 및 소르비탄 POE 트리리놀레네이트로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다.
본원에 기재된 임의의 계면활성제는 액체 제제를 제조하는 방법에 사용될 수 있다.
일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 계면활성제는 약 0.0005% 내지 0.2%, 약 0.0005% 내지 0.001%, 약 0.001% 내지 0.002%, 약 0.002% 내지 0.003%, 약 0.003% 내지 0.004%, 약 0.004% 내지 0.005%, 약 0.005% 내지 0.006%, 약 0.006% 내지 0.007%, 약 0.007% 내지 0.008%, 약 0.008% 내지 0.009%, 약 0.009% 내지 0.01%, 약 0.01% 내지 0.015%, 약 0.015% 내지 0.02%, 약 0.02% 내지 0.025%, 약 0.025% 내지 0.03%, 약 0.03% 내지 0.035%, 약 0.035% 내지 0.04%, 약 0.04% 내지 0.045%, 약 0.045% 내지 0.05%, 약 0.05% 내지 0.055%, 약 0.055% 내지 0.06%, 약 0.06% 내지 0.065%, 약 0.065% 내지 0.07%, 약 0.07% 내지 0.075%, 약 0.075% 내지 0.08%, 약 0.08% 내지 0.085%, 약 0.085% 내지 0.09%, 약 0.09% 내지 0.095%, 약 0.095% 내지 0.1%, 약 0.1% 내지 0.11%, 약 0.11% 내지 0.12%, 약 0.12% 내지 0.13%, 약 0.13% 내지 0.14%, 약 0.14% 내지 0.15%, 약 0.15% 내지 0.16%, 약 0.16% 내지 0.17%, 약 0.17% 내지 0.18%, 약 0.18% 내지 0.19%, 약 0.19% 내지 0.2%, 약 0.0005% 내지 0.01%, 약 0.01% 내지 0.02%, 약 0.02% 내지 0.03%, 약 0.03% 내지 0.04%, 약 0.04% 내지 0.05%, 약 0.05% 내지 0.06%, 약 0.06% 내지 0.07%, 약 0.07% 내지 0.08%, 약 0.08% 내지 0.09%, 약 0.09% 내지 0.1%, 약 0.1% 내지 0.12%, 약 0.12% 내지 0.14%, 약 0.14% 내지 0.16%, 약 0.16% 내지 0.18%, 약 0.18% 내지 0.2%, 또는 약 0.0005% 내지 0.02%(w:v) 농도의 액체 제제를 갖는다.
액체 제제 중 폴리펩티드의 농도는 저장 구성 및 원하는 투여 경로(예컨대, 피하, 근육내 또는 유리체내 투여, 정맥내 주사 또는 주입 등)에 따라 가변될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 폴리펩티드는 약 0.1 mg/mL 내지 300 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 0.5 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 1 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 1.5 mg/mL, 약 1.5 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 2.5 mg/mL, 약 2.5 mg/mL 내지 3 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 3.5 mg/mL, 약 3.5 mg/mL 내지 4 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 4.5 mg/mL, 약 4.5 mg/mL 내지 5 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 3 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 4 mg/mL, 약 4 mg/mL 내지 5 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 10 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 15 mg/mL, 약 15 mg/mL 내지 20 mg/mL, 약 20 mg/mL 내지 30 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 40 mg/mL, 약 40 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 100 mg/mL, 약 100 mg/mL 내지 150 mg/mL, 약 150 mg/mL 내지 200 mg/mL, 약 200 mg/mL 내지 250 mg/mL, 약 250 mg/mL 내지 300 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 2 mg/mL, 약 50 mg/mL 내지 150 mg, 약 150 mg/mL 내지 200 mg/mL, 또는 200 mg/mL 내지 300 mg/mL의 농도를 가진다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 폴리펩티드의 농도는 약 0.5 mg/mL이다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제 중 폴리펩티드는 약 50 mg/mL 초과, 약 150 mg/mL 초과, 약 200 mg/mL 초과, 약 250 mg/mL 초과 또는 약 300 mg/mL 초과의 농도를 갖는다.
일부 구현예들에서, 상기 방법은 액체 제제를 희석하여 폴리펩티드의 농도를 약 1-5배, 약 5-10배, 약 10-15배, 약 15-20배, 약 20-30배, 약 30-40배, 약 40-50배, 약 50-100배, 약 100-150배, 약 150-200배, 약 200-300배, 약 300-400배, 약 400-500배, 약 500-600배, 약 600-700배, 약 700-800배, 약 800-900배, 약 900-1000배, 약 1000-1500배, 약 1500-2000배, 약 2000-2500배, 약 2500-3000배, or 약 3000-5000배 만큼 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 방법은 액체 제제를 주입 용액으로 희석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 주입 용액은 덱스트로스 함유 용액, 젖산 링거 용액, 식염수 또는 완충 식염수를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 생리 식염수(약 0.9%(w:v))이다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 등장성 식염수이다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 인산염 완충 식염수 또는 크렙스 링거(Krebs-Ringer's) 용액을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 완충 식염수이다. 일부 구현예들에서, 식염수는 대상체로부터의 혈액의 삼투압 농도와 등장성 또는 대략 등장성이다. 상기 식염수는 염, 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 또는 염화칼슘을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 식염수는 하나 이상의 완충액, 예컨대 인산 완충액(예컨대, 인산나트륨 또는 인산칼륨), 탄산나트륨, 또는 HEPES를 포함한다. 완충 식염수가 사용될 때, 특히 안정성이 pH 의존적일 경우, pH는 폴리펩티드의 치료 효과를 최적화하는 범위로 유지된다. 일부 구현예들에서, 상기 액체 제제는 대상체에게 투여하기 전에 희석된다.
액체 제제가 동결건조된 제제를 재구성함으로써 제조될 때, 상기 재구성은 일반적으로 완전한 수화를 보장하기 위해 약 25°C의 온도에서 발생하지만, 원하는 경우 다른 온도를 사용할 수도 있다. 재구성에 필요한 시간은, 예컨대 희석제의 유형, 부형제(들) 및 단백질의 양에 따라 달라지게 된다. 예시적인 희석제는 멸균수, 세균증식억제 주사용수(BWFI), pH 완충 용액(예컨대, 인산 완충 식염수), 멸균 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 상기 희석제는 선택적으로 보존제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 상기 방법에 사용된 폴리펩티드는 항체이다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 다클론, 단일클론, 인간화, 인간, 이중특이적, 다중특이적, 키메라, 또는 이종접합체 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 항체는 항체 단편 및 전체 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편으로 이루어진 군에서 선택된다.
다른 양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 액체 제제를 제조하는 데 사용될 수 있다.
IV. 제품
액체 제제를 넣는 용기를 포함하는 제품이 제공되며, 상기 액체 제제는 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하고, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트의 하나 이상의 성분을 포함한다.
상기 제품은 용기를 포함한다. 적합한 용기는 병, 바이알(예컨대, 이중 챔버 바이알), 주사기(예컨대, 단일 또는 이중 챔버 주사기), 시험관, 및 정맥내 요법(IV) 주머니를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 IV 주머니는 주입 용액을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 주입 용액은 덱스트로스 함유 용액, 젖산 링거 용액, 식염수 또는 완충 식염수를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리, 금속 합금(예컨대, 스테인리스 강), 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 상기 액체 제제를 담는 용기 상에 있거나 이와 관련된 라벨은 재구성 및/또는 사용에 대한 지침을 나타낼 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 라벨은 제제가 피하 투여에 유용하거나 의도된 것임을 추가로 나타낼 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 라벨은 상기 제제가 정맥내 투여에 유용하거나 의도됨을 추가로 나타낼 수 있다(예컨대, 일시주사로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 또는 경막내 투여). 일부 구현예들에서, 상기 라벨은 제제가 유리체내 투여에 유용하거나 의도된 것임을 추가로 나타낼 수 있다. 상기 제제를 담는 용기는 상기 액체 제제의 반복 투여(예컨대, 2~6회 투여)를 허용하는 다용도 바이알일 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제품은 약 0.1 mg/mL 내지 약 300 mg/mL 농도의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 제품은 적합한 희석제(예컨대, 물, 제제 완충액, 계면활성제 용액, 및 주입 용액, 예컨대 덱스트로스 함유 용액, 식염수, 젖산 링거 용액 및 BWFI)를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 희석제 및 상기 액체 제제의 혼합 시, 희석된 제제의 최종 단백질 농도는 일반적으로 적어도 0.001 mg/mL일 것이다. 일부 구현예들에서, 상기 희석제는 동결건조 제제와 혼합되어 재구성된 액체 제제를 형성한다. 일부 구현예들에서, 상기 재구성된 액체 제제를 포함한 상기 액체 제제 중 최종 단백질 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 2 mg/mL이다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용설명서를 갖는 포장 삽입물을 포함하여 상업적 관점 및 이용자 관점에서 바람직한 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 제품은 정맥내 투여용 주사기 또는 장비, 및/또는 투여용 동결건조 조성물을 제조하기 위한 멸균 완충 용액을 함유한다.
다른 양태에서, 상기 제품은 본원에 기재된 임의의 액체 제제를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 제품은 본원에 기재된 임의의 제조 방법에 따라 제조된 액체 제제를 함유할 수 있다.
V. 액체 제제를 사용한 약제 및 치료 방법
또한, 본원에 기재된 액체 제제의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 액체 제제 내의 폴리펩티드로 치료를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 본원에 기재된 액체 제제의 사용이 제공된다. 또한, 액체 제제 내의 폴리펩티드로 치료를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 본원에 기재된 액체 제제가 제공된다. 또한, 유효량의 액체 제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자를 치료하기 위한 본원에 기재된 액체 제제가 제공된다.
상기 제제 내 항체가 HER2에 결합하는 경우, 현탁액 제제가 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 상기 암은 일반적으로 본원의 HER2 항체가 암 세포에 결합할 수 있도록 HER2 발현 세포를 포함할 것이다. 따라서, 상기 구현예에서 본 발명은 HER2 항체 약학적 제제를 암을 치료하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 HER2 발현 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 HER2 항체(예컨대, 트라스투주맙 또는 퍼투주맙)로 치료될 예시적인 암은 HER2 양성 유방암 또는 위암이다.
상기 제제 내의 항체가 CD20과 같은 B 세포 표면 표지자에 결합하는 경우, 상기 제제는 NHL 또는 CLL과 같은 B 세포 악성종양, 또는 자가면역 질환(예컨대, 류마티스 관절염 또는 혈관염)을 치료하는데 사용될 수 있다.
상기 제제 내의 항체가 VEGF(예컨대, 베바시주맙)에 결합하는 경우, 상기 제제는 혈관신생을 억제하고 암(예컨대, 결장직장, 비소세포폐(NSCL), 교모세포종, 유방암 및 신세포 암종)을 치료하거나, 또는 연령 관련 황반 변성(AMD) 또는 황반 부종을 치료하는데 사용될 수 있다.
적응증이 암인 경우, 환자는 현탁 제제 및 화학요법제의 조합으로 치료될 수 있다. 병용 투여는 별개의 제제 또는 단일 약학적 제제를 이용한 공동투여, 및 어느 한 순서로 연속 투여를 포함하는데, 여기서 두(또는 모든) 활성제가 이의 생물학적 활성을 동시에 나타내는 기간이 존재한다. 따라서, 화학요법제는 조성물의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 화학요법제의 적어도 1회 투여 및 상기 제제의 적어도 1회 투여 사이의 타이밍은 대략 1개월 이하, 또는 대략 2주 이하이다. 대안적으로, 상기 화학요법제 및 상기 제제는 단일 제제 또는 개별 제제로 상기 환자에게 동시에 투여된다.
상기 현탁 제제로 치료하면 질병 또는 장애의 징후 또는 증상이 개선될 것이다. 또한, 상기 화학요법제 및 상기 항체 제제의 조합을 사용한 치료는 상기 환자에게 상승적이거나 부가적인 것보다 더 큰 치료 이익을 발생시킬 것이다.
일부 구현예들에서, 본원에 기재된 액체 제제는 정맥내 투여된다. 일부 구현예들에서, 본원에 기재된 액체 제제는 투여가 적어도 약 30분 이상에 걸쳐 발생하도록 제어된 투여 속도와 함께 정맥내 주사에 의해 투여된다. 투여 일정 및 실제 투여되는 용량은 감염의 성질 및 중증도, 연령, 체중, 환자의 전반적인 건강 및 치료할 질병 또는 장애와 같은 요인에 따라 가변될 수 있으며, 의료 전문가가 확인할 수 있다. 상기 액체 제제는 적합하게는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에게 투여된다. 질환의 유형과 심각도에 따라서, 약 1 μg/kg 내지 50 mg/kg(예컨대, 0.1-20 mg/kg)의 항체는 예를 들어, 1회 또는 그 이상의 별개의 투여에 의하는 지에 상관없이, 상기 환자에게 투여를 위한 초기 후보 용량이다. 상기 항체의 투여량은 일반적으로 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg일 것이다. 화학요법제는 만약 투여되면, 일반적으로 공지된 용량에서 투여되거나, 또는 선택적으로 약물의 통합 작용 또는 상기 화학요법제의 투여에 기인한 부정적인 부작용으로 인해 용량이 줄어든다.
실시예
하기의 실시예들은 본원 청구범위 발명을 제한하는 것이 아니라 이를 예시하기 위하여 제공된다. 당업자는 하기의 절차가 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 수정될 수 있음을 인식할 것이다.
물질
단일 클론 항체 A 내지 D는 제넨텍 사(Genentech, Inc.)(미국 캘리포니아주, 샌프란시스코 소재)에서 제조하였다. ~99% 라우레이트 에스테르를 함유하는 폴리소르베이트 20은 BASF SE(독일 루트비히스하펜 소재)에 의해 합성되었다. 폴리소르베이트 80 HX2 초순도 등급(~98% 올레이트 에스테르 함유)은 NOF 어메리카 사(NOF America Corp.)(캘리포니아 어바인 소재)에서 합성하였다. 모든 폴리소르베이트 샘플은 사용하지 않을 때 2-8°C에서 질소 오버레이와 함께 보관되었다. 아세토니트릴 및 메탄올(HPLC 등급)은 아반토 퍼포먼스 머티리얼즈 사(Avantor Performance Materials, Inc.)(뉴저지주, 필립스버그 소재)에서 구입하였다.
실시예 1 폴리소르베이트 분획법 및 분석
폴리소르베이트 분획법
폴리소르베이트(PS)의 분획법은 길손(Gilson) PLC-2050 프렙(Prep) HPLC 시스템을 사용하여 실시하였다. 모든 PS 샘플에 대해, 2 g의 폴리소르베이트 20(PS20) 또는 폴리소르베이트 80(PS80)을 >18 MΩ cm 물 8 mL에 용해시키고 워터스 X 브리지(Waters X-Bridge) BEH C4 컬럼(30x100 mm)에 주입하였다. 그런 다음, 샘플을 >18 MΩ·cm 물(이동상 A) 및 아세토니트릴(이동상 B)의 구배를 사용하여 분획화하였다. 구배 조건은 하기와 같다: 0.0-3.0분, 5% B; 3.0-20.0분, 5-100% B; 20.0-27.0분, 100% B; 27-27.1분, 100-5% B; 27.1-30.0분, 5% B. 유속은 40 mL/분이었고 총 실행 시간은 30분이었다. 상기 실행 전체에 걸쳐 25 mL 분획을 수집하였다. 그런 다음, 상기 분획을 하전된 에어로졸 검출(RP-UHPLC-CAD)이 포함된 역상 초고성능 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 분석하였으며, 이는 후속 섹션에서 설명된다. 상기 분석 후, 분획을 모아 회전증발기를 사용하여 건조시켰다.
폴리소르베이트 분획 순도 분석
써모 코로나 울트라(Thermo Corona Ultra) CAD 검출기가 장착된 워터스 어퀴티 UPLC H-클라스(Waters Acquity UPLC H-Class) 시스템을 사용하여 분획화된 PS 샘플을 풀링 및 순도에 대해 평가하였다. 사용된 컬럼은 워터스 어퀴티 BEH C8 컬럼(2.1 x 50 mm, 120
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, 2.5 μm 입자 크기)이었다. 구배는 하기와 같다: 0.0-0.5분, 5% B; 0.5-5.0분, 5-100% B; 5.0-6.0분, 100% B; 6.0-6.1분, 100-5% B; 6.1-8.0분, 5% B. CAD는 10 Hz에서의 데이터 수집 및 30°C에서의 분무기 온도로 실시하였다.
결과
PS20 및 PS80 분획을 정제하고 회전증발기로 건조시켰다. RP-UHPLC-CAD에 의해 결정된 상대적 순도는 하기의 표 1에 나타내었다. 3개의 분획을 정제하고 각 PS 유형에서 분석하였다. PS20의 경우, 상기 분획은 하기와 같았다: POE-소르비탄 모노라우레이트("분획 1 또는 F1a"), POE-이소소르비드 모노라우레이트 및 POE 모노라우레이트(N~10)("분획 2 또는 F2a"), 및 POE-소르비탄 디라우레이트("분획 3 또는 F3a"). PS80의 경우, 상기 분획은 하기와 같았다: POE-소르비탄 모노올리에이트("분획 1 또는 F1b"), POE-이소소르비드 모노올리에이트 및 POE 모노올리에이트(N~10)("분획 2 또는 F2b"), 및 POE-소르비탄 디올리에이트("분획 3 또는 F3b"). 각 분획의 특성은 LC-MS 분석으로 확인하였다. 역상 UHPLC-CAD 분석은 폴리소르베이트 에스테르 분획의 가장 소수성이 F3이고, 그 다음으로 F2, F1이 최소 소수성임을 확인하였다(도 1a 및 도 1b).
산 PS20 PS80
USP/EP
내역		 모든 라우레이트 PS20(맞춤 소재) USP/EP
내역		 공급원 B의 모든 올리에이트 PS80
카프로산(C6) ≤ 1.0% NT - -
카프릴산(C8) ≤ 10.0% NT - -
카프르산(C10) ≤ 10.0% NT - -
라우르산(C12) 40.0-60.0% >99% - -
미리스트산(C14) 14.0-25.0% NT ≤ 5.0% NT
팔미트산(C16) 7.0-15.0% NT ≤ 16.0% NT
팔미톨레인산(C16:1) - NT ≤ 8.0% NT
스테아르산(C18) ≤ 7.0% NT ≤ 6.0% NT
올레산(C18:1) ≤ 11.0% NT ≥ 58.0% 98.9%
리놀레산(C18:2) ≤ 3.0% NT ≤ 18.0% NT
리놀렌산(C18:3) - - ≤ 4.0% NT
*NT: 결정되지 않음
실시예 2: 임계 미셀 농도(CMC) 결정
정제된 PS 분획은 형광 염료 N-페닐나프탈렌-1-아민(NPN)을 사용하여 임계 미셀 농도(CMC)에 대해 평가하였다. 상기 분석은 pH 8.0에서 0.15 M 염화나트륨, 0.05 M 트리스(TRIS), 5% ACN, 5 μM N-페닐-1-나프틸아민 및 15 ppm 브리지(Brij)35로 구성된 희석제로 2배 연속 희석액을 제조하여 실시하였다. 샘플은 350 nm에서 여기 및 420 nm에서 방출로 몰레큘라 디바이시즈 스펙트라맥스(Molecular Devices Spectramax) M5 형광 플레이트 판독기에서 즉시 분석하였다.
PS20의 경우, CMC가 증가하는 순서는 F3a > F2a > F1a로 소수성 순서와 일치하였다. CMC는 F1a의 경우 ~0.1 중량%, F2a의 경우 ~0.015 중량%, F3a의 경우 ~0.001 중량%로 광범위하게 분리되었으며, 이는 기준선에서 약 500개의 형광 단위 변화에 해당한다(도 2a). 이와 대조적으로, PS80 에스테르 CMC는 유사한 순서를 보였지만, 값의 범위는 0.001 내지 0.003 중량%에 걸쳐 훨씬 더 좁았다(도 2b).
실시예 3 분획된 PS 샘플의 표면 활성
PS의 정제된 분획의 표면 활성은 거친 백금 윌헤미(Wilhemy) 플레이트를 사용하는 크뤼스(Kr
Figure pct00006
ss)(독일 함부르크 소재) K100 표면 장력계(Force Tensiometer)를 사용하여 결정하였다. 샘플은 증발을 방지하기 위해 >70% 상대 습도로 실온(20-25°C)에서 측정하였다. PS20의 정제된 분획은 시험 전에 정제수에 각각 0.2 mg/mL로 용해하였다. 3 밀리리터의 샘플을 기포가 유입되지 않도록 특히 주의하여 샘플 홀더에 넣었다. 각 샘플의 표면 장력 변화는 60분에 평형이 될 때까지 초당 1회 측정으로 측정하였다. PS80 분석에 대해서도 동일한 절차를 따랐다.
표면 장력 결과는 평형 상태에서 0.02 중량%의 동일한 농도에 대해 PS20 F3a 및 F2a 분획이 덜 소수성인 F1a 분획보다 표면 장력을 낮추는 데 훨씬 더 효과적이라는 것을 보여주었다(도 3a). 유사한 경향이 PS80 F1b에서 F3b 분획에 대해 나타난다(도 3b). 흥미롭게도, PS20 분획 F3a의 표면 장력은 F2a와 거의 동일하고, PS80 분획 F3b의 표면 장력도 F2b와 마찬가지로 유사하다. 또한, 모든 에스테르 분획을 함유하는 미분획 PS20은 F3a 또는 F2a 분획보다 훨씬 더 표면 장력을 낮췄다(도 3a). 이와 대조적으로, 미분획 PS80은 F1b 및 F3b 분획 사이의 표면 장력을 나타내었다(도 3b).
실시예 4 미셀 크기의 동적 광산란
동적 광산란(DLS)은 맬번(매사추세츠 주의 웨스트버러 소재) 제타사이저 나노(Zetasizer Nano) 기기에서 실시하였다. 측정은 각 분획 샘플을 물에 10 mg/mL의 최종 농도로 희석하여 실시함으로써, 각 분획에 대한 CMC를 초과하도록 하였다.
미셀 반경 또는 유체역학적 반경(Rh)은 동적 광산란(DLS)을 사용하고 연구된 모든 에스테르 분획의 CMC보다 훨씬 높은 1 중량%의 분획 농도를 사용하여 수득하였다. PS20의 경우, 미분획 PS20의 Rh는 약 4 nm이고, F2a 및 F3a 분획은 약 3.9 nm이었다. F1a 모노에스테르의 Rh는 약 3.5 nm로 약간 더 작다(도 4a). PS80의 경우, 미셀 크기는 약 4.5 nm에서 Rh가 유사한 F2b 및 F3b 분획과 비교하여 미분획 PS80 샘플(Rh ~ 4.8 nm)의 경우 마찬가지로 약간 더 크다. F1b의 Rh는 F1a와 마찬가지로 PS80 샘플 세트에서 가장 작지만, Rh ~ 4.3 nm에서는 그다지 크지 않다(도 4b).
실시예 5 교반 보호 연구
정제된 분획은 교반 연구의 사용을 통해 표면 유도 응집을 방지하는 능력에 대해 시험하였다. mAb A는 10 mL PETG 바이알에서 PS20 분획(F1a, F2a 및 F3a 0.0001% 내지 0.01%, w:v)의 각각 다양한 양으로 0.9% 염수에서 0.5 mg/mL로 희석하였다. 상기 바이알을 주위 온도에서 2시간 동안 180 RPM으로 회전 진탕기에서 교반하였다. 교반 후, 샘플은 10배 확대 및 회전으로 보쉬(Bosch) APK 시스템을 사용하여 관찰하였다.
교반 연구 동안, F2a는 교반 시 눈에 보이는 입자 형성을 방지하기 위해 가장 낮은 농도를 요구했으며 F1a는 가장 높은 농도를 요구하는 것으로 관찰되었다. F3a 및 모든 라우레이트 PS20은 유사한 결과를 산출하였다(도 5). F2a는 F3a 및 모든 라우레이트 PS20에 대해 더 높은 CMC 및 유사한 평형 표면 장력 영향을 가졌지만, 교반 스트레스 및 입자 형성에 대해 mAb를 가장 잘 보호하였다.
실시예 6 IV 주머니 교반 모델 연구
정제된 분획은 교반 연구의 사용을 통해 표면 유도 응집을 방지하는 능력에 대해 시험하였다. mAb B 및 mAb C는 5 mL PETG 바이알에서 PS20 분획(F1a, F2a 및 F3a 0.0001% 내지 0.01%, w:v)의 각각 다양한 양으로 0.9% 염수 중의 완충액으로 0.5 mg/mL까지 희석하였다. 상기 샘플을 주위 온도에서 2시간 동안 180 RPM으로 회전 진탕기에서 교반하였다. 교반 후, 샘플은 10배 확대 및 회전으로 보쉬(Bosch) APK 시스템을 사용하여 관찰하였다. 샘플에 대하여 또한 제제 내에서 SVP(비가시적 입자)를 정량화하기 위해 HIAC(고정밀도 유체 입자 계수)를 처리하고, HMWF(고분자량 분획) 및 제제 내 활성 항체의 농도를 정량화하기 위해 SEC-HPLC(크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피)를 처리하였다. SEC 및 IEC는 바이너리 펌프 및 다이오드 배열 검출기가 있는 애질런트(Agilent) 1260 HPLC 상에서 실시하였다. 비가시적 입자의 측정은 로이코(Royco)의 HIAC 9703+ 약학적 입자 계수기 상에서 실시하였다.
관찰 결과는 시험된 모든 분획이 mAb B(도 6a) 및 mAb C(도 6b)에 대해 보호적임을 시사하였다. mAb B(도 7a) 및 mAb C(도 7b)에 대한 HIAC의 결과는 모든 분획이 비가시적 입자의 수를 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 더 낮은 수준의 응집을 나타내었다. F2a는 응집의 수준을 낮추는 데 HP 또는 모든 라우레이트 PS20과 같거나 더 좋다. SEC-HPLC 분석의 결과는 모든 분획이 %HMWF(도 8a 및 도 8b)를 낮추고 교반 중에 mAb B(도 8a 및 도 9a) 및 mAb C(도 8b 및 도 9b) 둘 모두의 항체 제제의 가용성 분획(도 9a 및 도 9b)을 더 잘 보존함을 나타내었다. F2a는 낮은 계면활성제 농도에서 특히 효과적이다(도 8a, 도 8b, 도 9a, 및 도 9b). 모든 계면활성제는 단백질의 분해를 성공적으로 완화하였다.
실시예 7 안정성 연구
제제의 장기간 안정성은 단백질 mAb C 및 mAb D(각각 30 mg/mL)를 갖는 PS20 및 F2a(각각 0.02% w/v)의 제제에 대해 시험하였다. 상기 제제를 5ºC, 25ºC, 및 40ºC에서 보관하고, 다양한 간격으로 육안 검사(APK), HIAC, 및 SEC-HPLC로 처리하였다. PS20 및 F2a의 제제를 또한 5ºC, 25ºC, 및 40ºC에서 IEC도 처리하였다.
40ºC에서 보관된 제제에 대한 육안 검사는 두 계면활성제 모두 40ºC에서 최대 1개월 동안 mAb C(도 10a) 및 mAb D(도 10b)의 제제 내에서 입자 형성을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다.
40ºC에서 보관된 제제에 대한 HIAC 결과는 두 계면활성제 모두 40ºC에서 최대 1개월 동안 보관할 때에도 mAb C(도 11a) 및 mAb D(도 11b)의 제제 내에서 비가시적 입자 형성을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다.
40ºC에서 보관된 제제에 대한 SEC-HPLC 결과는 두 계면활성제 모두 mAb C(도 12a) 및 mAb D(도 12b)의 제제 내에서 응집을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다. SEC 결과는 또한 두 계면활성제 모두 40ºC에서 최대 1개월 동안 mAb C(도 13a) 및 mAb D(도 13b)의 제제 내에서 활성 항체 농도를 유지하는데 효과적임을 나타내었다.
40ºC에서 보관된 제제에 대한 IEC 데이터는 두 계면활성제 모두 40ºC에서 1개월 동안 유사한 효과로 mAb C의 분해를 제한하였음을 나타내었다(도 14).
25ºC에서 보관된 제제에 대한 육안 검사 데이터는 두 계면활성제 모두 최대 3개월 동안 mAb C(도 15a) 및 mAb D(도 15b)의 제제 내에서 응집을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다.
25ºC에서 보관된 제제에 대한 HIAC 결과는 두 계면활성제 모두 25ºC에서 최대 3개월 동안 보관할 때에도 mAb C(도 16a) 및 mAb D(도 16b)의 제제 내에서 비가시적 입자 형성을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다.
25ºC에서 보관된 제제에 대한 SEC-HPLC 결과는 두 계면활성제 모두 mAb C(도 17a) 및 mAb D(도 17b)의 제제 내에서 응집을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다. SEC 결과는 또한 두 계면활성제 모두 25ºC에서 최대 3개월 동안 mAb C(도 18a) 및 mAb D(도 18b)의 제제 내에서 활성 항체 농도를 유지하는데 효과적임을 나타내었다.
25ºC에서 보관된 제제에 대한 IEC 데이터는 두 계면활성제 모두 25ºC에서 3개월 동안 유사한 효과로 mAb C의 분해를 제한하였음을 나타내었다(도 19).
5ºC에서 보관된 제제에 대한 육안 검사 데이터는 두 계면활성제 모두 최대 3개월 동안 mAb C(도 20a) 및 mAb D(도 20b)의 제제 내에서 응집을 방지하는 데 효과적임을 나타내었다.
5ºC에서 보관된 제제에 대한 HIAC 결과는 두 계면활성제 모두 5ºC에서 최대 3개월 동안 보관할 때에도 mAb C(도 21a) 및 mAb D(도 21b)의 제제 내에서 비가시적 입자 형성을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다.
5ºC에서 보관된 제제에 대한 SEC-HPLC 결과는 두 계면활성제 모두 mAb C(도 22a) 및 mAb D(도 22b)의 제제 내에서 응집을 제한하는 데 효과적임을 나타내었다. SEC 결과는 또한 두 계면활성제 모두 5ºC에서 최대 3개월 동안 mAb C(도 23a) 및 mAb D(도 23b)의 제제 내에서 활성 항체 농도를 유지하는데 효과적임을 나타내었다.
5ºC에서 보관된 제제에 대한 IEC 데이터는 두 계면활성제 모두 5ºC에서 3개월 동안 유사한 효과로 mAb C의 분해를 제한하였음을 나타내었다(도 24).
실시예 8 강제 분해 연구
PS20 및 F2a(각각 pH = 6.0의 제제 완충액 내에 있음)는 2.5 U/mL 농도에서 슈도모나스 세파시아(PCL)의 리파아제 효소에 의해 강제 분해되었다. 생성된 혼합물을 HIAC로 처리하여 비가시적 입자 및 원형 계면활성제의 백분율을 정량화하였다. 결과는 F2a가 효소에 의한 더 많은 분해에도 불구하고 더 적은 SVP를 생성함을 나타내었다(도 25).
요약
F2a는 일반적으로 사용되는 계면활성제 부형제인 PS20과 비교할 때 생물 약제학적 제품을 동일하게 또는 더 많이 보호하는 것으로 나타났다. 상기 계면활성제는 PS20 및 PS80과 같은 기존의 폴리소르베이트에 대한 좋은 대안이 될 수 있는 매력적인 특성을 가지고 있다.
교반 스트레스 연구에서, F2a는 APK를 사용하여 시험할 때 mAb A에 대한 입자 형성으로부터 더 보호적인 것으로 밝혀졌다. 별도의 연구에서, F2a는 APK에 의한 입자 시험, HIAC에 의한 비가시적 입자 개수, SEC-HPLC에 의한 %HMWF, 및 SEC-HPLC에 의해 시험된 가용성 항체의 농도에 기초하여 F2a 및 HP PS20 사이에 mAbs B 및 C에 대한 교반 스트레스로부터 유사한 보호를 나타내었다.
안정성 연구에서, F2a는 2개의 mAb, mAb C 및 mAb D에 대해 APK 및 HIAC에 의한 입자 형성을 방지하는 데 HP PS20과 유사하게 효과적인 것으로 관찰되었다. F2a는 또한 5°C, 25°C 및 40°C에서 보관 시 mAb C 및 mAb D 모두에 대해 SEC-HPLC에 의한 HMWF 방지에 대해 HP PS20과 유사한 보호를 보였다.
강제 분해 연구에서, F2a는 비가시적 및 가시적 지방산 입자를 형성하기 전에 HP PS20보다 더 효소적으로 분해될 수 있음을 나타내었다. 이는 상기 유형의 지방산 연관 입자 형성에 덜 취약한 계면활성제로서의 F2a의 이점을 제시한다.

Claims (82)

  1. 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 액체 제제이며,
    상기 계면활성제의 약 70%(wt%) 이상이 이소소르비드 폴리옥시에틸렌(POE) 지방산 에스테르인 액체 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 5 내지 30 POE 단위를 포함하는 것인 액체 제제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 20 POE 단위를 포함하는 것인 액체 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함하는 것인 액체 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르인 액체 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 모노에스테르는 이소소르비드 POE 모노라우레이트, 이소소르비드 POE 모노미리스테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미테이트, 이소소르비드 POE 모노스테아레이트 및 이소소르비드 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택되는 것인 액체 제제.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르, 디에스테르, 또는 이들의 혼합물인 액체 제제.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 화학식(I)의 화합물이고:
    Figure pct00007
    (I)
    여기서:
    a 및 b는 독립적으로 2 내지 28의 정수이고, a 및 b의 합은 5 내지 30의 정수이고,
    R1 및 R2는 수소 및 -C(O)R"로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, R"은 선택적으로 치환된 C3-27알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이며,
    R3 및 R4는 독립적으로 수소인 액체 제제.
  9. 제8항에 있어서, a 및 b의 합은 9인 액체 제제.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, R1은 H이고 R2는 -C(O)R"인 액체 제제.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, R1은 -C(O)R”이고 R2는 H인 액체 제제.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서, R1 및 R2는 둘 다 -C(O)R"인 액체 제제.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R"은 비치환된 C3-27알킬인 액체 제제.
  14. 제13항에 있어서, R"은 비치환된 C11알킬인 액체 제제.
  15. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, R"은 비치환된 C3-27알케닐인 액체 제제.
  16. 제15항에 있어서, R"은 비치환된 C17알케닐인 액체 제제.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제의 약 80%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르인 액체 제제.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함하는 것인 액체 제제.
  19. 제18항에 있어서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르보다 많은 양의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르를 포함하는 것인 액체 제제.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함하는 것인 액체 제제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 POE 지방산 에스테르는 POE 모노라우레이트, POE 모노미리스테이트, POE 모노팔미테이트, POE 모노스테아레이트 및 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택되는 것인 액체 제제.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제의 약 20%(wt%) 미만이 POE 지방산 에스테르인 액체 제제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 상기 액체 제제의 약 0.0005% 내지 0.2%(w:v)인 액체 제제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 소르비탄 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함하는 것인 액체 제제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 단백질인 액체 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 단백질은 항체인 액체 제제.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 액체 제제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 액체 제제.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 300 mg/mL인 액체 제제.
  30. 제29항에 있어서, 상기 항체의 농도는 약 100 mg/mL 내지 약 300 mg/mL인 액체 제제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 재구성된 동결건조 제제인 액체 제제.
  32. 제29항 또는 제30항에 있어서, 주입 용액을 사용하여 약 0.001 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리펩티드 농도로 추가 희석되는 액체 제제.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 응집체가 없는 액체 제제.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 유리 지방산 입자 형성을 덜 포함하는 액체 제제.
  35. 제18항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제의 약 80%(wt%) 이상이 이소소르비드 폴리옥시에틸렌(POE) 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르인 액체 제제.
  36. 제18항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제의 약 90%(wt%) 이상이 이소소르비드 폴리옥시에틸렌(POE) 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르인 액체 제제.
  37. 폴리펩티드 및 계면활성제를 포함하는 동결건조 제제이며,
    상기 계면활성제의 약 70%(wt%) 이상이 이소소르비드 폴리옥시에틸렌(POE) 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르이고,
    상기 동결건조 제제는 제18항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따른 액체 제제를 동결건조함으로써 제조되는 동결건조 제제.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 액체 제제를 넣은 용기를 포함하는 제품.
  39. 제38항에 있어서, 상기 용기는 IV 주머니인 제품.
  40. 제39항에 있어서, 상기 IV 주머니는 주사 장치를 포함하는 것인 제품.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 IV 주머니는 주입 용액을 포함하는 것인 제품.
  42. 제38항에 있어서, 상기 용기는 바이알 또는 사전 충전형 주사기인 제품.
  43. 제38항에 있어서, 희석제를 넣은 제2 용기를 추가로 포함하는 제품.
  44. 제37항의 동결건조 제제를 넣은 용기를 포함하는 제품.
  45. 제44항에 있어서, 희석제를 넣은 제2 용기를 추가로 포함하는 제품.
  46. 폴리펩티드 및 계면활성제를 수용액에 첨가하는 단계를 포함하는 액체 제제의 제조 방법이며,
    상기 계면활성제의 70%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 5 내지 30 POE 단위를 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 약 20 POE 단위를 포함하는 것인 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함하는 것인 방법.
  50. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 모노에스테르는 이소소르비드 POE 모노라우레이트, 이소소르비드 POE 모노미리스테이트, 이소소르비드 POE 모노팔미테이트, 이소소르비드 POE 모노스테아레이트, 및 이소소르비드 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  52. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 모노에스테르, 디에스테르, 또는 이들의 혼합물인 방법.
  53. 제46항에 있어서,
    상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 화학식(I)의 화합물이고:
    Figure pct00008
    (I)
    여기서:
    a 및 b는 독립적으로 2 내지 28의 정수이고, 단 a 및 b의 합은 5 내지 30의 정수이고,
    R1 및 R2는 수소 및 -C(O)R"로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고, R"은 선택적으로 치환된 C3-27알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-27알케닐이며,
    R3 및 R4는 독립적으로 수소인 방법.
  54. 제53항에 있어서, a 및 b의 합은 9인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, R1은 H이고 R2는 -C(O)R"인 방법.
  56. 제53항 또는 제54항에 있어서, R2은 -C(O)R”이고 R1는 H인 방법.
  57. 제53항 또는 제54항에 있어서, R1 및 R2는 둘 다 -C(O)R"인 방법.
  58. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, R"은 비치환된 C3-27알킬인 방법.
  59. 제56항에 있어서, R"은 비치환된 C11알킬인 방법.
  60. 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, R"은 비치환된 C3-27알케닐인 방법.
  61. 제60항에 있어서, R"은 비치환된 C17알케닐인 방법.
  62. 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 계면활성제의 약 80%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르인 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 계면활성제의 약 90%(wt%) 이상이 이소소르비드 POE 지방산 에스테르 및 POE 지방산 에스테르인 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 POE 지방산 에스테르보다 더 많은 양의 이소소르비드 POE 지방산 에스테르를 포함하는 것인 방법.
  66. 제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 POE 지방산 에스테르는 선택적으로 치환된 C4-28알킬 및 선택적으로 치환된 C4-28알케닐로 이루어진 군에서 선택된 지방산 사슬을 포함하는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 POE 지방산 에스테르는 POE 모노라우레이트, POE 모노미리스테이트, POE 모노팔미테이트, POE 모노스테아레이트, 및 POE 모노올레이트로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  68. 제62항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제의 약 20%(wt%) 미만이 POE 지방산 에스테르인 방법.
  69. 제46항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 소르비탄 POE 지방산 에스테르를 추가로 포함하는 것인 방법.
  70. 제46항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제는 상기 액체 제제의 약 0.0005% 내지 0.2%(w:v)인 방법.
  71. 제46항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 단백질인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 단백질은 항체인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 및 항체 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 300 mg/mL인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 항체의 농도는 약 100 mg/mL 내지 약 300 mg/mL인 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 상기 액체 제제는 주입 용액을 사용하여 약 0.1 mg/mL 내지 약 2 mg/mL의 농도로 추가로 희석되는 것인 방법.
  78. 제46항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 제제를 제조하기 위해 상기 액체 제제를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 제46항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 제제는 실질적으로 응집체가 없는 것인 방법.
  80. 제46항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 제제는 유리 지방산 입자 형성을 덜 포함하는 것인 방법.
  81. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 이소소르비드 POE 모노라우레이트인 액체 제제.
  82. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이소소르비드 POE 지방산 에스테르는 이소소르비드 POE 모노라우레이트인 방법.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4149421A1 (en) * 2020-05-15 2023-03-22 F. Hoffmann-La Roche AG Prevention of visible particle formation in parenteral protein solutions

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
DE3889546T2 (de) 1987-12-21 1994-09-08 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
DE69127627T2 (de) 1990-08-29 1998-02-19 Genpharm Int Produktion und Nützung nicht-menschliche transgentiere zur Produktion heterologe Antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE503496T1 (de) 1992-02-06 2011-04-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Biosynthetisches bindeprotein für tumormarker
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
AU4289496A (en) 1994-12-02 1996-06-19 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
US20120294866A1 (en) * 2010-01-19 2012-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical formulation for proteins
EP2934582B1 (en) * 2012-12-21 2019-11-27 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti her2 antibody formulation
WO2017117311A1 (en) * 2015-12-30 2017-07-06 Genentech, Inc. Formulations with reduced degradation of polysorbate
CN108421046A (zh) * 2018-04-16 2018-08-21 江苏保易制药有限公司 一种新型高纯度药用辅料聚山梨酯及其制备方法

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