KR20200083524A - 타우 펩타이드 면역원 작제물 - Google Patents

타우 펩타이드 면역원 작제물 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 타우병증의 치료 및/또는 예방을 위해 타우 단백질의 일부분을 표적화하는 개별 펩타이드 면역원 작제물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물, 상기 펩타이드 면역원 작제물을 제조하고 사용하는 방법, 및 상기 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체에 관한 것이다.

Description

타우 펩타이드 면역원 작제물
본 출원은 2017년 10월 27일자로 출원한 미국 가출원 일련 번호 62/578,124의 이익을 주장하는 PCT 국제 출원이며, 상기 가출원은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 편입된다.
발명의 분야
본 개시내용은 타우병증(tauopathy)의 예방 및 치료를 위한 타우(Tau) 단백질의 일부분을 기반으로 한 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형에 관한 것이다.
타우 단백질(또는 τ단백질, 해당 이름으로 그리스 문자를 땀)은 미세소관을 안정화시키는 단백질이다(웹사이트: en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein 참조). 타우 단백질은 중추 신경계의 뉴런에 풍부하고 다른 곳에서는 덜 흔하지만, 또한 CNS 성상교세포 및 희소돌기아교세포에서 매우 낮은 수준으로 발현된다. 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 신경계의 병리 및 치매는, 결함이 있게 되고 더 이상 적절하게 미세소관을 안정화시키지 않는 타우 단백질과 연관이 있다.
타우 단백질은 인간에서 MAPT(미세소관-연관 단백질 타우)로 지정되고 염색체 17번에 위치하는 단일 유전자로부터의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 산물이다. 타우 단백질은 1975년에 미세소관 조립에 필수적인 열 안정성 단백질로 동정되었고, 그 이후로 본질적으로 무질서한 단백질로 특징지어졌다.
타우 단백질은 매우 가용성인 미세소관-연관 단백질(MAP)이다. 인간에서, 이들 단백질은 비-뉴런 세포에 비교하여 대부분 뉴런에서 발견된다. 타우의 주요 기능 중 하나는 신경돌기 미세소관의 안정성을 조절하는 것이다. 뇌 발달에서 이상을 보이지 않는 타우 녹아웃 마우스에 의해 시사된 바와 같이, 다른 신경계 MAP는 유사한 기능을 수행할 수 있는데, 이는 아마도 다른 MAP에 의한 타우 결핍의 보상때문일 수 있다. 타우는 수상돌기에 존재하지 않으며, 주로 미세소관의 안정화뿐만 아니라 필요에 따라 유연성도 제공하는 축삭돌기의 원위 부분에서 주로 활성적이다. 이는 축삭돌기의 근위 부분에 있는 MAP6(STOP) 단백질과 대조적이며, 상기 단백질은 본질적으로 수상돌기의 미세소관을 안정화시키는 MAP2 및 미세소관을 제재한다.
타우 단백질은 튜불린과 상호작용하여 미세소관을 안정화시키고 튜불린 집합체를 미세소관으로 촉진시킨다. 타우에는 미세소관 안정성을 제어하는 2가지 방법, 즉 동형단백질(isoform) 및 인산화가 있다.
길이가 352 내지 441개 범위의 아미노산을 갖는 6가지 타우 동형단백질이 성인 인간 뇌에서 발현되며; 이들은 MAPT로부터 전사체의 mRNA 선택적 스플라이싱에 의해 생성된다(Fitzpatrick, et al., 2017; UniProtKB - P10636).
동형단백질은 결합 도메인의 수에 의해 구별된다. 3가지 동형단백질은 3개의 결합 도메인을 갖고, 다른 3가지는 4개의 결합 도메인을 갖는다. 결합 도메인은 단백질의 카복시-말단에 위치하며, 양으로 하전되어 있다(이는 단백질이 음으로 하전된 미세소관에 결합할 수 있게 함). 4개의 결합 도메인을 갖는 동형단백질은 3개의 결합 도메인을 갖는 것보다 미세소관을 안정화시키는 것이 더 우수하다. 동형단백질은 N-말단 절반에서 29개 또는 58개 아미노산의 삽입물의 존재 또는 부재, 및 C-말단 절반에서 MAPT의 엑손 10에 의해 인코딩된 31개 아미노산 미세소관-결합 반복부의 포함 또는 부재에서 상이하다. 엑손 10의 포함은 각각 4개의 반복부(4R)를 갖는 3가지 타우 동형단백질의 생성을 초래하고, 이의 배제는 각각 3개의 반복부(3R)를 갖는 추가의 3가지 동형단백질을 초래한다. 4개의 반복부(R1 내지 R4)는 441개 아미노산 타우 동형단백질에서 잔기 244 내지 368을 포함한다.
타우는 가장 긴 타우 동형단백질 상에 79개의 잠재적인 세린(Ser) 및 트레오닌(Thr) 인산화 부위를 갖는 인단백질이다. 인산화는 정상적인 타우 단백질에서 이들 부위 중 대략 30개에서 보고되었다. 타우의 인산화는 PKN, 세린/트레오닌 키나제를 포함한 다수의 키나제에 의해 조절된다. PKN이 활성화되면, PKN은 타우를 인산화시켜, 미세소관 조직의 붕괴를 초래한다. 타우의 인산화는 또한 발달적으로 조절된다. 예를 들어, 태아의 타우는 성인 타우보다 배아 CNS에서 보다 고도로 인산화된다. 6가지 모든 동형단백질에서 인산화의 정도는 포스파타제의 활성화로 인해 나이가 들면서 감소한다. 키나제와 마찬가지로, 포스파타제 역시 타우의 인산화를 조절하는 역할을 한다. 예를 들어, PP2A 및 PP2B는 둘 다 인간 뇌 조직에 존재하며, Ser396을 탈인산화시키는 능력을 갖는다. 타우에 대한 이들 포스파타제의 결합은 MT와 타우의 회합에 영향을 미친다.
타우 단백질(타우 내포물, p타우)의 과인산화는 쌍나선(paired helical) 필라멘트 및 연속 필라멘트(straight filament)의 엉킴(tangle)의 자기조립을 초래할 수 있으며, 이는 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 및 다른 타우병증의 병인에 관여한다. 6가지 타우 동형단백질은 모두 알츠하이머병 뇌 유래의 쌍나선 필라멘트에 종종 과인산화된 상태로 존재한다. 다른 신경퇴행성 질환에서, 특정 타우 동형단백질이 농축된 응집체의 침착이 보고되었다. 잘못 접히면, 달리 이렇게 매우 가용성인 단백질은 다수의 신경퇴행성 질환에 기여하는 매우 불용성인 응집체를 형성할 수 있다.
최근 연구는, 타우가 알츠하이머병에서 엑소좀-기반 메커니즘에 의해 세포외로 방출될 수 있음을 시사한다. 인간 뇌의 상이한 영역에 걸친 성별-특이적 타우 유전자 발현은 최근 타우병증에 대한 징후 및 위험에서 성별 차이에 관련이 있다. 질환이 작용하는 방법에 대한 일부 양태는 질환이 프리온 단백질과 일부 유사성이 있음을 시사한다.
필라멘트성 타우 내포물이 풍부한 신경퇴행성 질환은 타우병증으로 지칭된다. 알츠하이머병 이외에, 이들 질환은 엉킴-유일 치매(tangle-only dementia), 만성 외상성 뇌병증(chronic traumatic encephalopathy: CTE), 호은성 입자 질환(argyrophilic grain disease), 진행성 핵상 마비, 피질기저 핵변성, 구형 아교 타우병증(globular glial tauopathy) 및 피크병(Pick's disease)을 포함한다. 알츠하이머병과 달리, 이들 다른 질환에는 아밀로이드-β 플라크가 없다. 알츠하이며병, 엉킴-유일 치매 및 만성 외상성 뇌병증에서, 6가지 모든 타우 동형단백질(3R 및 4R)은 질환 필라멘트에 존재한다. 호은성 입자 질환, 진행성 핵상 마비, 피질기저 핵변성, 및 구형 아교 타우병증에서, 4R 타우 동형단백질만이 발견되는 반면, 피크병에서는 단지 3R 타우 내포물만 존재한다. 별개의 필라멘트 형태를 갖는 인간 타우병증의 발생은 응집된 타우의 상이한 분자 형태이성질체(conformer)가 존재한다는 생각으로 이어졌다. 다수의 분자 형태이성질체의 발생은 또한 마우스 뇌에서 타우 병리를 유도함에 있어서 알츠하이머가 있는 개체의 뇌로부터의 필라멘트가 재조합 단백질의 시험관 내에서 조립된 필라멘트보다 더 효과적인 이유를 설명할 수 있었다.
반복적인 경증 외상성 뇌손상(traumatic brain injury: TBI)은 이제 접촉 스포츠, 특히 미식 축구, 및 군사적 공격의 진동력에서 뇌 손상의 중심 요소로서 인식되고 있다. 이는 과인산화된 타우의 섬유성 엉킴으로 특징지어지는 만성 외상성 뇌병증(CTE)으로 이어질 수 있다. 뇌를 씻어내는 유체 중 높은 수준의 타우 단백질은 두부 외상 후 회복 불량과 관련이 있다.
타우 가설은, 타우의 과도하거나 비정상적인 인산화가 정상적인 성인 타우의 PHF-타우(쌍나선 필라멘트) 및 NFT(신경섬유 엉킴)로 형질전환을 초래하는 것을 말한다. 타우 단백질은 매우 가용성인 미세소관-연관 단백질(MAP)이다. 타우 단백질의 동형단백질 및 인산화를 통해, 타우 단백질은 튜불린과 상호작용하여 미세소관 집합체를 안정화시킨다. 타우 단백질은 352 내지 441개 범위의 아미노산을 갖는 6가지 동형단백질의 패밀리를 구성한다. CNS에서 가장 긴 동형단백질은 4개의 반복부(R1, R2, R3 및 R4) 및 2개의 삽입부을 갖는 반면(총 441개의 아미노산), 가장 짧은 동형단백질은 3개의 반복부(R1, R3 및 R4)를 가지고 삽입부가 없다(총 352개의 아미노산). 6가지 타우 동형단백질은 모두 AD 유래의 쌍나선 필라멘트에 종종 과인산화된 상태로 존재한다.
타우의 기능 및 동형단백질 발현을 변경시키는 돌연변이는 과인산화로 이어진다. 돌연변이의 부재 시 타우 응집 과정은 알려져 있지 않지만, 증가된 인산화, 프로테아제 작용 또는 다가음이온, 예컨대 글리코사미노글리칸에의 노출에 기인한 것일 수 있다. 과인산화된 타우는 미세소관을 분해하고 정상적인 타우, MAP 1(미세소관 연관 단백질 1), MAP 2, 및 유비퀴틴을 PHF의 엉킴 내로 격리시킨다. 이러한 불용성 구조는 세포질 기능을 손상시키고 축삭돌기 수송을 방해하여, 세포 사멸로 이어질 수 있다.
현재까지, 타우병증을 앓고 있는 환자의 비용 효과적인 치료를 위해 부위-특이적(site-directed) 펩타이드 면역원 및 이의 제형을 개발하는 미충족 수요가 아직 존재한다.
"Tau protein," Wikipedia, The Free Encyclopedia, 웹사이트 주소: en.wikipedia.org/wiki/Tau_protein (2017년 9월 29일 접속함). Fitzpatrick, AWP, et al., "Cryo-EM structures of Tau filaments from Alzheimer's disease" Nature, 547(7662):185-190 (2017).
본 개시내용은 타우병증의 치료 및/또는 예방을 위해 타우 단백질의 일부분을 표적화하는 개별 펩타이드 면역원 작제물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물, 상기 펩타이드 면역원 작제물을 제조하고 사용하는 방법, 및 상기 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체에 관한 것이다.
개시된 펩타이드 면역원 작제물은 약 15개 이상의 아미노산을 함유한다. 펩타이드 면역원 작제물은 표 8에 나타낸 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 인간 타우 단백질(젠뱅크(GenBank): AGF19246.1)의 가장 긴 동형단백질의 일부분 유래의 B 세포 에피토프를 함유한다. B 세포 에피토프는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 병원체 단백질로부터 유래된 이종성 T 헬퍼 세포(Th)에 연결될 수 있다. 개시된 펩타이드 면역원 작제물은 타우에 대하여 유도된 매우 특이적인 항체의 생성을 자극한다. 개시된 펩타이드 면역원 작제물은 타우병증을 앓고 있는 환자에 대한 면역요법으로서 사용될 수 있다.
펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프 일부분은 전장 타우 단백질 유래의 아미노산 서열을 갖는다(서열번호 100). 일부 실시형태에서, B 세포 에피토프는 표 1에 나타낸 바와 같은 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124 중 임의의 것을 함유하는 서열을 갖는다.
본 개시내용의 펩타이드 면역원 작제물은 표 2에 나타낸 바와 같은 병원성 단백질로부터 유래된 이종성 Th 에피토프 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 22 내지 50)을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이종성 Th 에피토프는 천연 병원균, 예컨대 디프테리아 독소(서열번호 26), 열대열말라리아원충(서열번호 27), 콜레라 독소(서열번호 29)로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 이종성 Th 에피토프는 단일 서열 또는 조합 서열(서열번호 33, 32 및 34)의 형태로 홍역 바이러스 융합 단백질(MVF 1 내지 5) 또는 B형 간염 표면 항원(HBsAg 1 내지 3)으로부터 유래된 최적화된 인공 Th 에피토프이다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 면역원 작제물은 선택적인 이종성 스페이서를 통해 이종성 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 연결된 타우 유래의 B 세포 에피토프를 함유한다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 면역원 작제물은 선택적인 이종성 스페이서를 통해 병원성 단백질로부터 유래된 이종성 Th 에피토프(서열번호 22 내지 50)에 연결된 타우 유래의 아미노산 서열(서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124)을 갖는 B 세포 항원 부위를 함유한다. 일부 실시형태에서, 선택적인 이종성 스페이서는 2개의 아미노산 및/또는 펩타이드를 함께 연결할 수 있는 분자 또는 화학 구조이다. 특정 실시형태에서, 스페이서는 천연 발생 아미노산, 비-천연 발생 아미노산, 또는 이들의 조합이다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 면역원 작제물은 표 3에 나타낸 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155의 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시내용은 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 개시된 조성물은 하나 초과의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하여 타우 유래의 다수의 B 에피토프를 포괄한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 병원성 단백질로부터 유래된 하나 초과의 이종성 Th 에피토프를 갖는 타우 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물(예를 들어, 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155의 임의의 조합)을 함유하여 환자에서 광범위한 유전적 배경을 포괄한다. 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물을 함유하는 조성물은 단일 Th 펩타이드 면역원 작제물만을 함유하는 조성물에 비하여 타우병증의 치료에 있어서 면역화시 반응률에 있어서 더 높은 백분율을 야기할 수 있다.
본 개시내용은 또한 타우병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 CpG 올리고머를 펩타이드 면역원 복합체를 함유하는 조성물과 혼합함으로써 정전기적 회합을 통해 형성된 안정화된 면역자극성 복합체의 형태로 개시된 펩타이드 면역원 작제물을 함유한다. 이와 같은 안정화된 면역자극성 복합체는 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성을 추가로 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 알럼 겔(ALHYDROGEL), 인산알루미늄(ADJUPHOS)을 포함한 미네랄 염, 또는 몬타나이드(MONTANIDE) ISA 51 또는 720을 포함한 유중수 에멀션과 같은 아쥬반트를 함유한다.
본 개시내용은 또한 개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용의 펩타이드 면역원 작제물은 대상체에게 투여될 때 타우 아미노산 서열(서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124)과 교차 반응성인 매우 특이적인 항체의 생성을 자극할 수 있다. 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성되는 매우 특이적인 항체는 재조합 타우-함유 단백질과 교차 반응성이다. 개시된 항체는 많지는 않지만 존재하는 경우 면역원성 향상에 이용되는 이종성 Th 에피토프로 유도되는 타우에 높은 특이성으로 결합하는데, 이는 이와 같은 펩타이드 항원성 향상에 사용되는 통상적인 단백질 또는 다른 생물학적 담체와 극명하게 대조적이다.
본 개시내용은 또한 개시된 펩타이드 면역원 작제물 및/또는 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 항체를 사용하여 타우병증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 타우병증을 치료 및/또는 예방하는 방법. 특정 실시형태에서, 본 방법에서 이용되는 조성물은 정전기적 회합을 통해 음으로 하전된 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 올리고머와 안정적인 면역자극성 복합체의 형태로 개시된 펩타이드 면역원 작제물을 함유하며, 상기 복합체는 타우병증이 있는 환자에게 투여하기 위하여 선택적으로 아쥬반트로서 미네랄 염 또는 오일로 추가로 보충된다. 개시된 방법은 또한 타우병증의 위험이 있거나 타우병증이 있는 숙주에게 펩타이드 면역원 작제물을 투여하기 위한 투약 요법, 투약 형태, 및 경로를 포함한다.
도 1a - 타우의 항원 영역에 대하여 분석될 때 비-인산화된 타우 펩타이드에 대한 초기 주사 후 6주째(초기 주사후 주수(week post initial injection): wpi)에 다수의 타우 면역원 작제물로부터 수득한 면역 혈청에 대하여 Log10 역가로 표현한 ELISA 결과.
도 1b - 타우의 항원 영역에 대하여 분석될 때 인산화된 타우 펩타이드에 대한 초기 주사 후 6주째(wpi)에 다수의 타우 면역원 작제물로부터 수득한 면역 혈청에 대하여 Log10 역가로 표현한 ELISA 결과.
도 2 - 타우 단백질의 단량체, 이량체, 삼량체 및 올리고머를 함유하는 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석 결과. 다양한 레인은 각각의 레인 위에 나타낸 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 IgG 항체를 나타낸다(좌측). 이들 펩타이드 면역원 작제물은 표 3에 나타낸 작제물에 해당한다. 각각의 항체에 대한 결합 프로파일을 분석하고 막대 그래프로 요약하였다(우측). 타우 면역원 작제물에 대한 대표적인 면역 혈청은 타우의 다종(단량체, 이량체, 삼량체, 올리고머 및 중합체)에 대한 결합 반응성을 입증하였다.
도 3a - 면역이전혈청 유래의 항체와 비교하여 각각의 그래프 위에 나타낸 0 내지 5㎍/㎖ 범위의 농도에서 인산화된 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 다양한 항체에의 노출 후 전장 타우(타우441 아미노산)의 수준을 나타내는 그래프. 응집체의 티오플라빈-T(ThT) 염색에 의해 타우 응집 수준을 측정하였다.
도 3b - 인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물 및 시험관 내에서 타우를 분해하는 것으로 알려져 있는 메틸렌 글루(glue)(양성 대조군으로 사용함)에 대하여 유도된 항체의 5㎍/㎖의 존재 하에 시험관 내 타우 응집 수준을 나타내는 막대 그래프.
도 4 - 각각의 그래프 위에 나타낸 바와 같이, 인산화 또는 비-인산화 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체에의 노출 후 타우 응집 수준을 나타내는 그래프. 응집체의 티오플라빈-T(ThT) 염색에 의해 타우 응집 수준을 측정하였다. 인산화 또는 비-인산화 타우 면역원에 대하여 유도된 항체에 대하여 다양한 정도의 억제를 발견하였다.
도 5 - 각각의 그래프 아래에 나타낸 바와 같이, 대표적인 인산화 또는 비-인산화 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체에의 노출 시 미리 형성된 인공 타우 피브릴(fibril)의 타우 분해 수준을 나타내는 그래프. 응집체의 티오플라빈-T(ThT) 염색에 의해 타우 응집 수준을 측정하였다. 대표적인 인산화 또는 비-인산화 타우 면역원으로부터 유래된 면역 혈청 유래의 항체를 이용하여 다양한 정도로의 분해를 발견하였다.
도 6 - 좌측에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 타우 펩타이드 면역원에 의해 생성된 항-인산화-타우 및 항-비-인산화-타우 IgG의 웨스턴 블롯 분석 결과(변성 조건 하). 우측 패널 상에 나타낸 바와 같이, 본 개시내용의 대표적인 타우 펩타이드 면역원에 의해 생성된 항-인산화-타우 및 항-비-인산화-타우 IgG의 점 블롯(dot blot) 분석 결과(비-변성 조건 하). 인산화-타우 펩타이드 면역원에 의해 유도된 항체는 타우의 피브릴 및 올리고머에 우선적으로 결합하는 것으로 나타났다.
도 7 - 본 개시내용의 인산화-타우 펩타이드 면역원 및 비-인산화-타우 펩타이드 면역원 둘 다에 의해 생성된 대표적인 항체에 의한 면역조직화학적 염색 결과. 좌측 패널은 알츠하이머병-특이적 대 정상적인 뇌 절편에 대한 결합 프로파일을 나타내는 한편; 우측 패널은 정상적인 조직에서 교차 반응성이 없음을 나타낸다.
도 8a - 본 개시내용의 인산화-타우 펩타이드 면역원 및 비-인산화-타우 펩타이드 면역원 둘 다에 의해 생성된 대표적인 항체에 의한 피브릴 타우에 대한 뉴런의 보호를 나타내는 조직 염색 결과.
도 8b - 본 개시내용의 인산화-타우 펩타이드 면역원 및 비-인산화-타우 펩타이드 면역원 둘 다에 의해 생성된 대표적인 항체에 의한 피브릴 타우에 대한 뉴런의 보호를 정량화한 그래프.
본 개시내용은 알츠하이머병 및/또는 타우병증의 치료 및/또는 예방을 위해 타우 단백질의 일부분을 표적화하는 개별 펩타이드 면역원 작제물에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물, 상기 펩타이드 면역원 작제물을 제조하고 사용하는 방법, 및 상기 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체에 관한 것이다.
개시된 펩타이드 면역원 작제물은 약 15개 이상의 아미노산을 함유한다. 펩타이드 면역원 작제물은 표 8에 나타낸 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 인간 타우 단백질(젠뱅크: AGF19246.1)의 가장 긴 동형단백질의 일부분 유래의 B 세포 에피토프를 함유한다. B 세포 에피토프는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 병원체 단백질로부터 유래된 이종성 T 헬퍼 세포(Th)에 연결될 수 있다. 개시된 펩타이드 면역원 작제물은 타우에 대하여 유도된 매우 특이적인 항체의 생성을 자극한다. 개시된 펩타이드 면역원 작제물은 알츠하이며병 및/또는 타우병증을 앓고 있는 환자에 대한 면역요법으로서 사용될 수 있다.
펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프 일부분은 전장 타우 단백질 유래의 아미노산 서열을 갖는다(서열번호 100). 일부 실시형태에서, B 세포 에피토프는 표 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124 중 임의의 것을 함유하는 서열을 갖는다.
본 개시내용의 펩타이드 면역원 작제물은 표 2에 나타낸 바와 같은 병원성 단백질로부터 유래된 이종성 Th 에피토프 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 22 내지 50)을 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이종성 Th 에피토프는 천연 병원균, 예컨대 디프테리아 독소(서열번호 26), 열대열말라리아원충(서열번호 27), 콜레라 독소(서열번호 29)로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 이종성 Th 에피토프는 단일 서열 또는 조합 서열(서열번호 33, 32, 및 34)의 형태로 홍역 바이러스 융합 단백질(MVF 1 내지 5) 또는 B형 간염 표면 항원(HBsAg 1 내지 3)으로부터 유래된 최적화된 인공 Th 에피토프이다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 면역원 작제물은 선택적인 이종성 스페이서를 통해 이종성 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 연결된 타우 유래의 B 세포 에피토프를 함유한다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 면역원 작제물은 선택적인 이종성 스페이서를 통해 병원성 단백질로부터 유래된 이종성 Th 에피토프(서열번호 22 내지 50)에 연결된 타우 유래의 아미노산 서열(서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124)을 갖는 B 세포 항원 부위를 함유한다. 일부 실시형태에서, 선택적인 이종성 스페이서는 2개의 아미노산 및/또는 펩타이드를 함께 연결할 수 있는 분자 또는 화학 구조이다. 특정 실시형태에서, 스페이서는 천연 발생 아미노산, 비-천연 발생 아미노산, 또는 이들의 조합이다. 특정 실시형태에서, 펩타이드 면역원 작제물은 표 4에 나타낸 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155의 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시내용은 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 개시된 조성물은 하나 초과의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하여 타우 유래의 다수의 B 에피토프를 포괄한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 병원성 단백질로부터 유래된 하나 초과의 이종성 Th 에피토프를 갖는 타우 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물(예를 들어, 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155의 임의의 조합)을 함유하여 환자에서 광범위한 유전적 배경을 포괄한다. 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물을 함유하는 조성물은 단일 Th 펩타이드 면역원 작제물만을 함유하는 조성물에 비하여 알츠하이머병 및/또는 타우병증의 치료에 있어서 면역화시 반응률에 있어서 더 높은 백분율을 야기할 수 있다.
본 개시내용은 또한 알츠하이머병 및/또는 타우병증의 치료 및/또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 CpG 올리고머를 펩타이드 면역원 복합체를 함유하는 조성물과 혼합함으로써 정전기적 회합을 통해 형성된 안정화된 면역자극성 복합체의 형태로 개시된 펩타이드 면역원 작제물을 함유한다. 이와 같은 안정화된 면역자극성 복합체는 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성을 추가로 향상시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 알럼 겔(ALHYDROGEL), 인산알루미늄(ADJUPHOS)을 포함한 미네랄 염, 또는 MONTANIDE ISA 51 또는 720을 포함한 유중수 에멀션과 같은 아쥬반트를 함유한다.
본 개시내용은 또한 개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 개시내용의 펩타이드 면역원 작제물은 대상체에게 투여될 때 타우 아미노산 서열(서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124)과 교차 반응성인 매우 특이적인 항체의 생성을 자극할 수 있다. 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성되는 매우 특이적인 항체는 재조합 타우-함유 단백질과 교차 반응성이다. 개시된 항체는 많지는 않지만 존재하는 경우 면역원성 향상에 이용되는 이종성 Th 에피토프로 유도되는 타우에 높은 특이성으로 결합하는데, 이는 이와 같은 펩타이드 항원성 향상에 사용되는 통상적인 단백질 또는 다른 생물학적 담체와 극명하게 대조적이다.
본 개시내용은 또한 개시된 펩타이드 면역원 작제물 및/또는 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 항체를 사용하여 알츠하이머병 및/또는 타우병증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 개시된 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 알츠하이머병 및/또는 타우병증을 치료 및/또는 예방하는 방법. 특정 실시형태에서, 본 방법에서 이용되는 조성물은 정전기적 회합을 통해 음으로 하전된 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 올리고머와 안정적인 면역자극성 복합체의 형태로 개시된 펩타이드 면역원 작제물을 함유하며, 상기 복합체는 알츠하이머병 및/또는 타우병증이 있는 환자에게 투여하기 위하여 선택적으로 아쥬반트로서 미네랄 염 또는 오일로 추가로 보충된다. 개시된 방법은 또한 알츠하이머병 및/또는 타우병증의 위험이 있거나 타우병증이 있는 숙주에게 펩타이드 면역원 작제물을 투여하기 위한 투약 요법, 투약 형태, 및 경로를 포함한다.
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달리 설명되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어("a", "an", 및 "the")는 문맥이 달리 분명하게 나타내지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 유사하게, 용어 "또는"은 문맥이 달리 분명하게 나타내지 않는 한, "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 폴리펩타이드에 대해 제공된 모든 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이며, 설명을 위해 제공된 것임이 추가로 이해되어야 한다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 개시된 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조문헌은 전문이 참조에 의해 편입된다. 상충되는 경우, 용어의 설명을 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 추가적으로, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것으로 의도되지 않는다.
타우 펩타이드 면역원 작제물
본 개시내용은 직접적으로 또는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 이종성 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 공유적으로 연결된 타우 유래의 아미노산 서열을 갖는 B 세포 에피토프를 함유하는 펩타이드 면역원 작제물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 어구 "타우 펩타이드 면역원 작제물" 또는 "펩타이드 면역원 작제물"은 (a) 가장 긴 타우 동형단백질의 전장 서열(서열번호 100) 유래의 약 15개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프; (b) 이종성 Th 에피토프; 및 (c) 선택적인 이종성 스페이서를 함유하는 펩타이드를 말한다.
특정 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물은 하기 화학식으로 표현될 수 있다:
(Th)m-(A)n-(타우 단편)-X
또는
(타우 단편)-(A)n-(Th)m-X
여기서
Th는 이종성 T 헬퍼 에피토프이고;
A는 이종성 스페이서이며;
(타우 단편)은 서열번호 100 유래의 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
m은 1 내지 약 4이고;
n은 0 내지 약 10이다.
개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물의 다양한 성분이 하기 기재되어 있다.
a. 타우 단편
개시된 펩타이드 면역원 작제물은 약 15개 이상의 아미노산을 함유한다. 펩타이드 면역원 작제물은 표 8에 나타낸 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 인간 타우 단백질(젠뱅크: AGF19246.1)의 가장 긴 동형단백질의 일부분 유래의 B 세포 에피토프를 함유한다. B 세포 에피토프는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 병원체 단백질로부터 유래된 이종성 T 헬퍼 세포(Th)에 연결될 수 있다. 개시된 펩타이드 면역원 작제물은 타우에 대하여 유도된 매우 특이적인 항체의 생성을 자극한다. 개시된 펩타이드 면역원 작제물은 알츠하이머병 및/또는 타우병증을 앓고 있는 환자에 대한 면역요법으로서 사용될 수 있다.
펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프 일부분은 전장 타우 단백질 유래의 아미노산 서열을 갖는다(서열번호 100). 일부 실시형태에서, B 세포 에피토프는 표 1에 나타낸 바와 같은 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124 중 임의의 것을 함유하는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 타우 단편은 표 1에 나타낸 바와 같은 비-인산화된 아미노산(예를 들어, 서열번호 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21)을 함유한다. 다른 실시형태에서, 타우 단편은 표 1에 나타낸 바와 같은 인산화된 세린 및/또는 트레오닌 아미노산(예를 들어, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20)을 함유한다. 표 1의 펩타이드에 나타낸 타우 단편뿐만 아니라 인산화 부위는 예시적이며, 본 개시내용은 서열번호 100의 전장 타우 단백질의 임의의 다른 단편 및/또는 인산화 부위를 포함한다.
b. 이종성 T 헬퍼 세포 에피토프 ( Th 에피토프 )
본 개시내용은 직접적으로 또는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 이종성 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 공유적으로 연결된 타우 유래의 B 세포 에피토프를 함유하는 펩타이드 면역원 작제물을 제공한다.
타우 펩타이드 면역원 작제물에서 이종성 Th 에피토프는 타우 단편의 면역원성을 향상시키며, 이는 합리적인 설계를 통해 최적화된 표적 B 세포 에피토프(즉, 타우 단편)에 대하여 유도된 특이적 고역가 항체의 생성을 용이하게 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "이종성"은 타우의 야생형 서열의 일부가 아니거나 이와 상동성인 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 말한다. 따라서, 이종성 Th 에피토프는 타우에서 천연적으로 발견되지 않는 아미노산 서열로부터 유래된 Th 에피토프이다(즉, Th 에피토프는 Th에 대해 자가성이 아님). Th 에피토프는 타우에 대하여 이종성이므로, 타우의 천연 아미노산 서열은 이종성 Th 에피토프가 타우 단편에 공유적으로 연결될 때 N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
본 개시내용의 이종성 Th 에피토프는 타우에서 천연적으로 발견되는 아미노산 서열을 갖지 않는 임의의 Th 에피토프일 수 있다. Th 에피토프는 임의의 종(예를 들어, 인간, 돼지, 소, 개, 래트, 마우스, 기니피그 등)으로부터 유래된 아미노산 서열을 가질 수 있다. Th 에피토프는 또한 다수 종의 MHC 클래스 II 분자에 대하여 무차별적인 결합 모티프를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, Th 에피토프는 다수의 무차별적인 MHC 클래스 II 결합 모티프를 포함하여 T 헬퍼 세포의 최대 활성화를 가능하게 하여, 면역 반응의 개시 및 조절을 초래한다. Th 에피토프는 바람직하게는 스스로 면역침묵성(immunosilent)이며, 즉 존재하는 경우 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체의 소수만 Th 에피토프로 향하게 되어, 타우 단편의 표적화된 B 세포 에피토프에 대한 매우 집중된 면역 반응을 가능하게 할 것이다.
본 개시내용의 에피토프는 표 2(서열번호 22 내지 50)에 예시된 바와 같이, 외래 병원체로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, Th 에피토프는 최적화된 인공 Th 에피토프 및 조합된 최적화된 인공 Th 에피토프(서열번호 23 및 30 내지 36)를 포함한다. 조합 서열(예를 들어, 서열번호 31 내지 34)로 제시된 이종성 Th 에피토프 펩타이드는 특정 펩타이드에 대한 상동체의 가변 잔기에 기초하여 펩타이드 프레임워크 내의 특정 위치에서 나타난 아미노산 잔기의 혼합물을 함유한다. 조합 펩타이드의 집합체는 합성 과정 동안 명시된 위치에서 하나의 특정 아미노산 대신에 지정된 보호된 아미노산의 혼합물을 첨가함으로써 하나의 공정으로 합성될 수 있다. 이와 같은 조합 이종성 Th 에피토프 펩타이드 집합체는 다양한 유전적 배경을 갖는 동물에 대하여 광범위한 Th 에피토프 커버리지를 가능하게 한다. 이종성 Th 에피토프 펩타이드의 대표적인 조합 서열은 표 2에 나타낸 서열번호 31 내지 34를 포함한다. 본 발명의 Th 에피토프 펩타이드는 유전적으로 다양한 집단으로부터의 동물 및 환자에게 광범위한 반응성 및 면역원성을 제공한다.
Th 에피토프를 포함하는 타우 펩타이드 면역원 작제물은 타우 단편과 함께 단일 고상 펩타이드 합성에서 동시에 생성된다. Th 에피토프는 또한 Th 에피토프의 면역학적 유사체를 포함한다. 면역학적 Th 유사체는 면역-향상 유사체, 교차 반응성 유사체 및 타우 단편에 대한 면역 반응을 향상시키거나 자극시키기에 충분한 이들 Th 에피토프의 임의의 절편을 포함한다.
Th 에피토프 펩타이드의 기능적 면역학적 유사체는 또한 효과적이며 본 발명의 부분으로서 포함된다. 기능적 면역학적 Th 유사체는 Th 에피토프의 Th-자극 기능을 본질적으로 변형시키지 않는, Th 에피토프 중 1 내지 약 5개의 아미노산 잔기의 보존적 치환, 첨가, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 보존적 치환, 첨가, 및 삽입은 타우 단편에 대하여 상기 기재한 바와 같이 천연 또는 비-천연 아미노산을 이용하여 달성될 수 있다. 표 2는 Th 에피토프 펩타이드에 대하여 기능적 유사체의 또 다른 변형을 식별한다. 구체적으로, MvF1 및 MvF2 Th의 서열번호 23 및 30은, N-말단 및 C-말단에서 각각 2개 아미노산의 결실(서열번호 23 및 30) 또는 포함(서열번호 33 및 35)에 의해 아미노산 프레임이 상이하다는 점에서 MvF4 및 MvF5의 서열번호 33 및 35의 기능적 유사체이다. 이들 2가지 일련의 유사체 서열 간의 차이는 이들 서열 내에 함유된 Th 에피토프의 기능에 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 기능적 면역학적 Th 유사체는 홍역 바이러스 융합 단백질 MvF1-4 Th(서열번호 23, 30, 31, 33, 및 35) 및 간염 표면 단백질 HBsAg 1 내지 3 Th(서열번호 32, 34, 및 36)로부터 유래된 Th 에피토프의 여러 형태를 포함한다.
타우 펩타이드 면역원 작제물에서 Th 에피토프는 타우 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에서 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, Th 에피토프는 타우 펩타이드의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 다른 실시형태에서, Th 에피토프는 타우 펩타이드의 C-말단에 공유적으로 연결된다. 특정 실시형태에서, 하나 초과의 Th 에피토프가 타우 단편에 공유적으로 연결된다. 하나 초과의 Th 에피토프가 타우 단편에 연결될 때, 각각의 Th 에피토프는 동일한 아미노산 서열 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 추가적으로, 하나 초과의 Th 에피토프가 타우 단편에 연결될 때, Th 에피토프는 임의의 순서로 배열될 수 있다. 예를 들어, Th 에피토프는 타우 단편의 N-말단에 연속적으로 연결될 수 있거나, 타우 단편의 C-말단에 연속적으로 연결될 수 있거나, Th 에피토프는 타우 단편의 N-말단에 공유적으로 연결될 수 있는 한편 별개의 Th 에피토프는 타우 단편의 C-말단에 공유적으로 연결된다. 타우 단편과 관련하여 Th 에피토프의 배열에는 제한이 없다.
일부 실시형태에서, Th 에피토프는 타우 단편에 직접 공유적으로 연결된다. 다른 실시형태에서, Th 에피토프는 하기에 보다 상세히 기재된 이종성 스페이서를 통해 타우 단편에 공유적으로 연결된다.
c. 이종성 스페이서
개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물은 선택적으로 타우 유래의 B 세포 에피토프를 이종성 T 헬퍼 세포(Th) 에피토프에 공유적으로 연결하는 이종성 스페이서를 함유한다.
상기 논의한 바와 같이, 용어 "이종성"은 타우의 야생형 서열의 일부가 아니거나 상기 서열과 상동성이 아닌 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 말한다. 따라서, 이종성 스페이서는 타우 서열과 이종성이기 때문에 이종성 스페이서가 타우 유래의 B 세포 에피토프에 공유적으로 연결될 때 타우의 천연 아미노산 서열은 N-말단 또는 C-말단 방향으로 연장되지 않는다.
스페이서는 2개의 아미노산 및/또는 펩타이드를 함께 연결할 수 있는 임의의 분자 또는 화학 구조이다. 스페이서는 적용에 따라 길이 또는 극성이 변할 수 있다. 스페이서 부착은 아마이드-연결 또는 카복실-연결을 통한 것일 수 있지만 다른 작용기도 또한 가능하다. 스페이서는 화학적 화합물, 천연 발생 아미노산, 또는 비-천연 발생 아미노산을 포함할 수 있다.
스페이서는 타우 펩타이드 면역원 작제물에 구조적 특징을 제공할 수 있다. 구조적으로, 스페이서는 타우 단편의 B 세포 에피토프로부터 Th 에피토프의 물리적 분리를 제공한다. 스페이서에 의한 물리적 분리는 Th 에피토프를 B 세포 에피토프에 결합시킴으로써 생성되는 임의의 인공 2차 구조를 파괴할 수 있다. 추가적으로, 스페이서에 의한 에피토프의 물리적 분리는 Th 세포 및/또는 B 세포 반응 사이의 간섭을 제거할 수 있다. 또한, 스페이서는 펩타이드 면역원 작제물의 2차 구조를 생성 또는 변형하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 가요성 힌지로서 작용하도록 설계되어 Th 에피토프 및 B 세포 에피토프의 분리를 향상시킬 수 있다. 가요성 힌지 스페이서는 또한 제시된 펩타이드 면역원과 적절한 Th 세포 및 B 세포 사이의 보다 효율적인 상호작용을 가능하게 하여 Th 에피토프 및 B 세포 에피토프에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 가요성 힌지를 인코딩하는 서열의 예는 면역글로불린 중쇄 힌지 영역에서 발견되며, 가요성 힌지는 종종 프롤린이 풍부하다. 스페이서로서 사용될 수 있는 특히 유용한 가요성 힌지 한 가지는 서열 Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(서열번호 101)에 의해 제공되며, 여기서 Xaa는 임의의 아미노산, 바람직하게는 아스파르트산이다.
스페이서는 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물에 기능적 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 타우 펩타이드 면역원 작제물의 전체적인 전하를 변화시키도록 설계될 수 있으며, 이는 펩타이드 면역원 작제물의 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 추가적으로, 타우 펩타이드 면역원 작제물의 전체적인 전하를 변화시키는 것은 다른 화합물 및 시약과 회합하는 펩타이드 면역원 작제물의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 하기에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 타우 펩타이드 면역원 작제물은 정전기적 회합을 통해 고도로 하전된 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 CpG 올리고머와의 안정적인 면역자극성 복합체로 형성될 수 있다. 타우 펩타이드 면역원 작제물의 전체적인 전하는 이러한 안정적인 면역자극성 복합체의 형성에 중요하다.
스페이서로서 사용될 수 있는 화학적 화합물은 (2-아미노에톡시) 아세트산(AEA), 5-아미노발레르산(AVA), 6-아미노카프로산(Ahx), 8-아미노-3,6-다이옥사옥탄산(AEEA, 미니-PEG1), 12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데칸산(미니-PEG2), 15-아미노-4,7,10,13-테트라옥사펜타-데칸산(미니-PEG3), 트라이옥사트라이데칸-석시남산(Ttds), 12-아미노-도데칸산, Fmoc-5-아미노-3-옥사펜탄산(O1Pen) 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
천연-발생 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린을 포함한다.
비-천연 발생 아미노산은 ε-N 리신, ß-알라닌, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 타이록신, γ-아미노부티르산, 호모세린, 시트룰린, 아미노벤조산, 6-아미노카프로산(Aca; 6-아미노헥산산), 하이드록시프롤린, 머캅토프로피온산(MPA), 3-나이트로-타이로신, 피로글루탐산 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
타우 펩타이드 면역원 작제물에서 스페이서는 Th 에피토프 및 타우 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에서 공유적으로 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서는 Th 에피토프의 C-말단 및 타우 펩타이드의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 타우 펩타이드의 C-말단 및 Th 에피토프의 N-말단에 공유적으로 연결된다. 특정 실시형태에서, 하나 초과의 Th 에피토프가 펩타이드 면역원 작제물에 존재할 때, 하나 초과의 스페이서가 사용될 수 있다. 하나 초과의 스페이서가 사용될 때, 각각의 스페이서는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 추가적으로, 하나 초과의 Th 에피토프가 펩타이드 면역원 작제물에 존재할 때, Th 에프토프는 스페이서를 이용하여 분리될 수 있으며, 상기 스페이서는 Th 에피토프를 B 세포 에피토프로부터 분리하는 데 사용되는 스페이서와 동일하거나 상이할 수 있다. Th 에피토프 또는 타우 단편과 관련하여 스페이서의 배열에는 제한이 없다.
특정 실시형태에서, 이종성 스페이서는 천연 발생 아미노산 또는 비-천연 발생 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 하나 초과의 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산을 함유한다. 특정 실시형태에서, 스페이서는 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102)이다.
d. 타우 면역원 작제물의 구체적인 실시형태
타우 펩타이드 면역원 작제물은 하기 화학식으로 표현될 수 있다:
(Th)m-(A)n-(타우 단편)-X
또는
(타우 단편)-(A)n-(Th)m-X
여기서
Th는 이종성 T 헬퍼 에피토프이고;
A는 이종성 스페이서이며;
(타우 단편)은 서열번호 100의 전장 타우 단백질 유래의 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
m은 1 내지 약 4이고;
n은 0 내지 약 10이다.
특정 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물의 이종성 Th 에피토프는 표 3에 나타낸 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155 중 임의의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 구체적인 실시형태에서, Th 에피토프는 서열번호 30 내지 36 중 임의의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물은 하나 초과의 Th 에피토프를 함유한다.
특정 실시형태에서, 선택적인 이종성 스페이서는 Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102), 및 이들의 조합 중 임의의 것으로부터 선택된다. 구체적인 실시형태에서, 이종성 스페이서는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102)이다.
특정 실시형태에서, 타우 단편은 서열번호 100의 전장 타우 단백질 유래의 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, 타우 단편은 표 1에 나타낸 바와 같은, 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124로 표현되는 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물은 표 3에 나타낸 바와 같은, 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155 중 임의의 것으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
a. 변이체 , 상동체 , 및 기능적 유사체
타우 단백질의 바람직한 에피토프에 대한 항체를 유도 및/또는 상기 항체와 교차 반응하는 상기 면역원 펩타이드의 변이체 및 유사체가 또한 사용될 수 있다. 대립유전자, 종, 및 유도된 변이체를 포함하는 유사체는, 종종 보존적 치환에 의해 전형적으로 1개, 2개, 또는 몇 개의 위치에서 천연 발생 펩타이드와 상이하다. 유사체는 전형적으로 천연 펩타이드와 적어도 80 또는 90% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 유사체는 또한 1개, 2개, 또는 몇 개의 위치에서 N-말단 또는 C-말단 아미노산의 변형 또는 비-천연 아미노산을 포함한다.
기능적 유사체인 변이체는 아미노산 위치에서 보존적 치환; 전체적인 전하의 변화; 또 다른 모이어티에의 공유 부착; 또는 아미노산 첨가, 삽입, 또는 결실; 및/또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
보존적 치환은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 경우이다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하며; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 85% 동일성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 기능적 유사체는 원래 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는다.
변이체는 또한 인산화된 잔기에 대한 변이를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 인산화된 펩타이드 내에 상이한 잔기를 포함할 수 있다. 변이체 면역원 타우 펩타이드는 또한 의사-인산화된(pseudo-phosphorylated) 펩타이드를 포함할 수 있다. 의사-인산화된 펩타이드는 타우 펩타이드의 하나 이상의 인산화된 세린, 트레오닌, 및 타이로신 잔기를 산성 아미노산 잔기, 예컨대 글루탐산 및 아스파르트산으로 치환함으로써 생성된다.
조성물
본 개시내용은 또한 개시된 타우 면역원 작제물을 포함하는 조성물을 제공한다.
a. 펩타이드 조성물
개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 조성물은 액체 또는 고체 형태일 수 있다. 액체 조성물은 물, 완충제, 용매, 염, 및/또는 타우 펩타이드 면역원 작제물의 구조적 또는 기능적 특성을 변경시키지 않는 임의의 다른 허용가능한 시약을 포함할 수 있다. 펩타이드 조성물은 하나 이상의 개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유할 수 있다.
b. 약제학적 조성물
본 개시내용은 또한 개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 전달 시스템 중에 담체 및/또는 다른 첨가제를 함유할 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 및/또는 다른 부형제, 예컨대 희석제, 첨가제, 안정화제, 보존제, 가용화제, 완충제 등과 함께 약학적 유효량의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유할 수 있다.
약제학적 조성물은 자체의 임의의 특이적 항원 효과를 갖지 않으면서 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대한 면역 반응을 가속화, 연장, 또는 향상시키는 작용을 하는 하나 이상의 아쥬반트를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물에 사용되는 아쥬반트는 오일, 알루미늄 염, 비로좀, 인산알루미늄(예를 들어, ADJU-PHOS®), 알루미늄 하이드록사이드(예를 들어, ALHYDROGEL®), 리포신(liposyn), 사포닌, 스쿠알렌, L121, Emulsigen®), 모노포스포릴 지질 A(MPL), QS21, ISA 35, ISA 206, ISA50V, ISA51, ISA 720뿐만 아니라, 다른 아쥬반트 및 유화제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 MONTANIDE™ ISA 51(유중수 에멀션의 제조를 위한 식물성 오일 및 만나이드 올레에이트로 구성된 오일 아쥬반트 조성물), Tween® 80(또한 폴리솔베이트(Polysorbate) 80 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 솔비탄 모노올레에이트로도 알려짐), CpG 올리고뉴클레오타이드, 및/또는 이들의 임의의 조합을 함유한다. 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 아쥬반트로서 에멀시겐 또는 에멀시겐 D를 포함하는 수중유중수(즉, w/o/w) 에멀션이다.
약제학적 조성물은 즉효성 또는 지효성 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 약제학적 조성물은 마이크로입자를 이용한 면역원 포획 및 공동 투여를 통해 전신성 또는 국소화된 점막의 면역력의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이와 같은 전달 시스템은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
약제학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조될 수 있다. 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 액체 비히클은 또한 주사 직전에 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 임의의 적합한 적용 방식, 예를 들어 i.d., i.v., i.p., i.m., 비강내, 경구, 피하 등에 의해, 그리고 임의의 적합한 전달 장치로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내, 피하, 피내, 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 경구 및 비강내 적용을 포함하여 다른 투여 방식에 적합한 약제학적 조성물이 또한 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 즉효성 또는 지효성 제형으로 제형화될 수 있다. 추가적으로, 약제학적 조성물은 마이크로입자를 이용한 면역원 포획 및 공동 투여를 통해 전신성 또는 국소화된 점막의 면역력의 유도를 위해 제형화될 수 있다. 이와 같은 전달 시스템은 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
약제학적 조성물은 또한 적합한 투약 단위 형태로 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 체중 ㎏ 당 약 0.5㎍ 내지 약 1 ㎎의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유한다. 약제학적 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지 여부를 포함한 다수의 상이한 요인에 따라 변한다. 보통, 환자는 인간이지만 유전자이식 포유동물을 포함한 비인간 포유동물이 또한 치료될 수 있다. 다중 용량으로 전달될 때, 약제학적 조성물은 투약 단위 형태 당 적절한 양으로 편리하게 나뉠 수 있다. 투여되는 용량은 치료 분야에 잘 알려진 바와 같이 대상체의 연령, 체중 및 전반적인 건강에 따라 달라질 것이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 하나 초과의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유한다. 작제물의 면역효능의 상승적 향상을 가능하게 하기 위하여 하나 초과의 타우 펩타이드 면역원 작제물의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물. 하나 초과의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약제학적 조성물은 광범위한 MHC 클래스 II 커버리지로 인해 더 큰 유전자 집단에서 보다 효과적일 수 있으며, 따라서 타우 펩타이드 면역원 작제물에 개선된 면역 반응을 제공한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155로부터 선택되는 타우 펩타이드 면역원 작제물뿐만 아니라, 이의 상동체, 유사체 및/또는 조합을 함유한다. 구체적 실시형태에서, 약제학적 조성물은 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155로부터 선택되는 타우 펩타이드 면역원 작제물, 및 이의 임의의 조합을 함유한다.
타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약제학적 조성물은 투여시 숙주에서 면역 반응을 유도하고 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
c. 면역자극성 복합체
본 개시내용은 또한 CpG 올리고뉴클레오타이드와 면역자극성 복합체의 형태로 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이와 같은 면역자극성 복합체는 구체적으로 아쥬반트로서 그리고 펩타이드 면역원 안정화제로서 작용하도록 조정된다. 면역자극성 복합체는 미립자의 형태이며, 이는 면역계의 세포에 타우 펩타이드 면역원을 효율적으로 제시하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 면역자극성 복합체는 비경구 투여를 위한 현탁액으로 제형화될 수 있다. 면역자극성 복합체는 또한 w/o 에멀션의 형태로, 비경구 투여 후 숙주의 면역계의 세포에 타우 펩타이드 면역원을 효율적으로 전달하기 위해 미네랄 염 또는 인시튜(in-situ) 겔화 중합체와 조합한 현탁액으로서 제형화될 수 있다.
안정화된 면역자극성 복합체는 정전기적 회합을 통해 타우 펩타이드 면역원 작제물을 음이온성 분자, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 이들의 조합과 복합체화함으로써 형성될 수 있다. 안정화된 면역자극성 복합체는 면역원 전달 시스템으로서 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물은 5.0 내지 8.0 범위의 pH에서 양으로 하전된 양이온성 일부분을 함유하도록 설계된다. 타우 펩타이드 면역원 작제물, 또는 작제물의 혼합물의 양이온성 일부분에 대한 순 전하는 각각의 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)에 대하여 +1 전하를 할당하고, 각각의 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E)에 대하여 -1 전하를 할당하며, 서열 내 다른 아미노산에 대하여 0의 전하를 할당함으로서 계산된다. 전하는 타우 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 일부분 내에서 합산되어 순 평균 전하로 표현된다. 적합한 펩타이드 면역원은 +1의 순 평균 양전하를 갖는 양이온성 일부분을 갖는다. 바람직하게는, 펩타이드 면역원은 +2보다 큰 범위의 순 양전하를 갖는다. 일부 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 일부분은 이종성 스페이서이다. 특정 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 부분은 스페이서 서열이 (α, ε-N)Lys, ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102)일 때 +4의 전하를 갖는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 "음이온성 분자"는 5.0 내지 8.0 범위의 pH에서 음으로 하전된 임의의 분자를 말한다. 특정 실시형태에서, 음이온성 분자는 올리고머 또는 중합체이다. 올리고머 또는 중합체에 대한 순 음전하는 올리고머 내 각각의 포스포다이에스터 또는 포스포로싸이오에이트 기에 대하여 -1을 할당함으로써 계산된다. 적합한 음이온성 올리고뉴클레오타이드는 CpG 모티프의 반복부 수가 1 내지 10의 범위인, 8 내지 64개의 뉴클레오타이드 염기를 갖는 단일-가닥 DNA 분자이다. 바람직하게는, CpG 면역자극성 단일-가닥 DNA 분자는 CpG 모티프의 반복부 수가 3 내지 8의 범위인, 18 내지 48개의 뉴클레오타이드 염기를 함유한다.
보다 바람직하게는, 음이온성 올리고뉴클레오타이드는 화학식 5' X1CGX2 3'으로 표현되며, 여기서 C 및 G는 메틸화되지 않은 것이고; X1은 A(아데닌), G(구아닌) 및 T(티민)로 이루어진 군으로부터 선택되며; X2는 C(사이토신) 또는 T(티민)이다. 또는, 음이온성 올리고뉴클레오타이드는 화학식 5' (X3)2CG(X4)2 3'으로 표현되며, 여기서 C 및 G는 메틸화되지 않은 것이고; X3은 A, T 또는 G로 이루어진 군으로부터 선택되며; X4는 C 또는 T이다.
생성된 면역자극성 복합체는 전형적으로 1 내지 50 미크론 범위의 크기를 갖는 입자의 형태이며, 상호작용 종의 분자량 및 상대 전하 화학량론을 포함하는 다수의 요인에 따른다. 미립화된 면역자극성 복합체는 생체 내 특이적 면역 반응의 상향조절 및 보조를 제공하는 이점을 갖는다. 추가적으로, 안정화된 면역자극성 복합체는 유중수 에멀션, 미네랄 염 현탁액 및 중합체 겔을 포함하는 다양한 공정에 의해 약제학적 조성물을 제조하는 데 적합하다.
항체
본 개시내용은 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체를 제공한다.
타우 단편, 이종성 Th 에피토프, 및 선택적인 이종성 스페이서를 포함하는 개시된 타우 펩타이드 면역원 작제물은 숙주에 투여될 때 면역 반응 및 항체의 생성을 유도할 수 있다. 타우 펩타이드 면역원 작제물의 설계는 자가 타우에 대한 내성을 파괴하고, 선형이 아닌 형태적 에피토프를 인식하는 부위-특이적 항체의 생성을 유도할 수 있다.
타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생성된 항체는 단량체, 이량체, 삼량체, 및 올리고머의 형태로 타우를 인식하고 이에 결합한다.
타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체는 놀랍게도 타우의 응집을 방지할 수 있고(항-응집 활성), 미리 형성된 타우 응집체를 분리시킬 수 있다(분해 활성).
본 발명의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 동물로부터 생성된 면역 반응은 단량체, 이량체, 삼량체, 및 올리고머 형태로 타우와 반응성인 강력한 부위-특이적 항체를 생성하는 작제물의 능력을 입증하였다.
방법
본 개시내용은 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물, 조성물, 및 약제학적 조성물을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
a. 타우 펩타이드 면역원 작제물을 제조하는 방법
본 개시내용의 타우 펩타이드 면역원 작제물은 당업자에게 잘 알려진 화학적 합성 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77] 참조). 타우 펩타이드 면역원 작제물은, 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 펩타이드 합성기 모델(Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model) 430A 또는 431에서 측쇄 보호된 아미노산을 사용하여 t-Boc 또는 F-moc 화학에 의해 보호된 α-NH2를 이용하는 고상 합성의 자동화된 메리필드(Merrifield) 기법을 사용하여 합성될 수 있다. Th 에피토프에 대한 조합 라이브러리 펩타이드를 포함하는 타우 펩타이드 면역원 작제물의 제조는 주어진 가변 위치에서 커플링하기 위한 대안적인 아미노산의 혼합물을 제공함으로써 달성될 수 있다.
원하는 타우 펩타이드 면역원 작제물의 완전한 조립 후, 표준 절차에 따라 수지를 처리하여 수지로부터 펩타이드를 절단하고 아미노산 측쇄 상의 작용기는 탈블록화될 수 있다. 자유 펩타이드는 HPLC에 의해 정제되고, 예를 들어 아미노산 분석 또는 서열결정에 의해 생화학적으로 특성화될 수 있다. 펩타이드에 대한 정제 및 특성화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
이러한 화학적 방법에 의해 생성된 펩타이드의 품질은 제어되고 한정될 수 있으며, 결과적으로 타우 펩타이드 면역원 작제물의 재현성, 면역원성 및 수율이 보장될 수 있다. 고상 펩타이드 합성을 통한 타우 펩타이드 면역원 작제물의 제조에 대한 상세한 설명은 실시예 1에 나타낸다.
의도된 면역학적 활성을 보유할 수 있는 구조적 가변성의 범위는 소분자 약물에 의한 특이적인 약물 활성 또는 원하는 활성 및 생물학적으로 유래된 약물과 함께 공동 생산되는 큰 분자에서 발견되는 원치 않는 독성의 유지를 가능하기 하는 구조적 가변성의 범위보다 훨씬 더 수용적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 의도된 펩타이드와 유사한 크로마토그래피 및 면역학적 특성을 갖는 결실 서열 부산물의 혼합물로서 합성 공정의 오류에 의해 필연적으로 생성되거나 의도적으로 설계된 펩타이드 유사체는 흔히 원하는 펩타이드의 정제된 제제만큼 효과적이다. 식별 QC 절차가 이러한 펩타이드를 이용하는 최종 제품의 재현성 및 효능을 보장하기 위해 제조 공정 및 제품 평가 공정을 둘 다 모니터링하기 위해 개발되는 한, 설계된 유사체 및 의도되지 않은 유사체 혼합물은 효과적이다.
타우 펩타이드 면역원 작제물은 또한 핵산 분자, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 포함하여 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이와 같이, 타우 펩타이드 면역원 작제물을 인코딩하는 핵산 분자 및 이의 면역학적 기능적 유사체는 또한 본 발명의 부분으로서 본 개시내용에 포함된다. 유사하게, 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터를 포함하는 벡터뿐만 아니라, 벡터를 함유하는 숙주 세포는 또한 본 발명의 부분으로서 본 개시내용에 포함된다.
다양한 예시적인 실시형태는 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 면역학적으로 기능성인 유사체를 제조하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 방법은 펩타이드 및/또는 유사체가 발현되는 조건 하에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물 및/또는 이의 면역학적으로 기능성인 유사체를 인코딩하는 핵산 분자를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 인큐베이션시키는 단계를 포함할 수 있다. 더 긴 합성 펩타이드 면역원은 잘 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 합성될 수 있다. 이와 같은 기법은 함께 잘 알려진 표준 매뉴얼에 상세한 프로토콜이 제공된다. 본 발명의 펩타이드를 인코딩하는 유전자를 구축하기 위해, 아미노산 서열은 역번역되어, 바람직하게는 유전자가 발현될 유기체에 대하여 최적인 코돈과 함께, 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 얻는다. 그 다음에, 합성 유전자는 전형적으로 필요한 경우 펩타이드 및 임의의 조절 요소를 인코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 제조된다. 합성 유전자는 적합한 클로닝 벡터에 삽입되고, 숙주 세포 내로 형질감염된다. 그 다음, 펩타이드는 선택된 발현 시스템 및 숙주에 적절한 적합한 조건 하에서 발현된다. 펩타이드는 표준 방법에 의해 정제되고 특성화된다.
b. 면역자극성 복합체의 제조 방법
다양한 예시적인 실시형태는 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물 및 CpG 올리고뉴클레오타이드(ODN) 분자를 포함하는 면역자극성 복합체를 생성하는 방법을 포함한다. 안정화된 면역자극성 복합체(ISC)는 타우 펩타이드 면역원 작제물 및 다가음이온성 CpG ODN 분자의 양이온성 부분으로부터 유래된다. 자가-조립 시스템은 전하의 정전기적 중화에 의해 구동된다. 타우 펩타이드 면역원 작제물의 양이온성 부분 대 음이온성 올리고머의 몰 전하 비율의 화학량론은 회합 정도를 결정한다. 타우 펩타이드 면역원 작제물 및 CpG ODN의 비-공유 정전기적 회합은 완전히 재현가능한 과정이다. 펩타이드/CpG ODN 면역자극성 복합체는 응집하며, 이는 면역계의 "전문적인" 항원 제시 세포(APC)에의 제시를 용이하게 하여, 복합체의 면역원성을 추가로 향상시킨다. 이러한 복합체는 제조 동안 품질 관리를 위해 용이하게 특성화된다. 펩타이드/CpG ISC는 생체 내에서 잘 용인된다. CpG ODN 및 타우 단편 유래 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 이러한 신규한 미립자 시스템은 CpG ODN 사용과 연관된 일반화된 B 세포 유사분열촉진성을 이용하면서도 균형잡힌 Th-1/Th-2 유형의 반응을 촉진하도록 설계되었다.
개시된 약제학적 조성물에서 CpG ODN은 반대 전하의 정전기적 중화에 의해 매개되는 공정에서 면역원에 100% 결합되어, 미크론 크기의 미립자를 형성한다. 미립자 형태는 CpG 아쥬반트의 통상적인 사용으로부터 CpG 용량의 현저한 감소를 가능하게 하고, 불리한 선천적 면역 반응에 대한 가능성이 더 적게 할 수 있으며, 항원-제시 세포(APC)를 포함한 대안적인 면역원 처리 경로를 용이하게 한다. 결과적으로, 이와 같은 제형은 개념적으로 신규하고 대안적인 메커니즘에 의해 면역 반응의 자극을 촉진시킴으로써 잠재적인 이점을 제공한다.
c. 약제학적 조성물 의 제조 방법
다양한 예시적인 실시형태는 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 유중수 에멀션 및 미네랄 염을 포함한 현탁액을 이용한다.
다수의 인구에 의해 사용되고 타우 응집 방지가 또한 투여 목표의 일부인 약제학적 조성물을 위하여, 안정성은 고려해야 할 또 다른 중요한 요인이 된다. 임상 시험에서의 다수 제형에 있어서 인간에서 유중수 에멀션을 사용함에도 불구하고, 알럼은 이의 안정성으로 인해 여전히 제형에서 사용하기 위한 주요 아쥬반트이다. 따라서, 알럼 또는 이의 미네랄 염인 인산알루미늄(ADJUPHOS)은, 임상 적용을 위한 제제에서 아쥬반트로서 자주 사용된다.
다른 아쥬반트 및 면역자극제는 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(MPL) 또는 3-DMP, 중합체 또는 단량체 아미노산, 예컨대 폴리글루탐산 또는 폴리리신을 포함한다. 이와 같은 아쥬반트는 다른 구체적인 면역자극제, 예컨대 뮤라밀 펩타이드(예를 들어, N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-아이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타민(노르-MDP), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-아이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1',2'-다이팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-아이소글루-L-Ala-다이팔미톡시 프로필아마이드(DTP-DPP) Theramide™), 또는 다른 박테리아 세포 벽 성분과 같이 또는 이들 없이 사용될 수 있다. 수중유 에멀션은, 마이크로플루다이저를 사용하여 서브미크론 입자로 제형화되는 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈(Tween) 80, 및 0.5% 스팬(Span) 85(선택적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유함)를 함유하는 MF59(반 네스트(Van Nest)외 다수의 WO 90/14837 참조, 상기 출원은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 편입됨); 서브미크론 에멀션으로 미세유체화되거나 와동되어 큰 입자 크기의 에멀션을 생성하는 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF; 및 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 모노포스포릴지질 A(MPL), 트레할로스 다이마이콜레이트(TDM), 및 세포벽 골격(CWS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아 세포 벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS(Detox™)를 함유하는 Ribi™ 아쥬반트 시스템(RAS)(리비 이뮤노켐(Ribi ImmunoChem), 미국 몬태나주 해밀턴 소재)을 포함한다. 다른 아쥬반트는 완전 프로인트 아쥬반트(CFA), 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA), 및 사이토카인, 예컨대 인터류킨(IL-1, IL-2, 및 IL-12), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함한다.
아쥬반트의 선택은 아쥬반트를 함유하는 면역원성 제형의 안정성, 투여 경로, 투약 스케쥴, 백신접종되는 종에 대한 아쥬반트의 효능에 따라 다르며, 인간에서, 약제학적으로 허용 가능한 아쥬반트는 관련 규제 기관에 의해 인간 투여용으로 승인되었거나 승인가능한 것이다. 예를 들어, 알럼, MPL 또는 불완전 프로인트 아쥬반트(문헌[Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32:173-186 (1998)], 상기 문헌은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 편입됨)는 단독으로 또는 선택적으로 이의 모든 조합이 인간 투여에 적합하다.
조성물은 약제학적으로 허용 가능한 비독성 담체 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 이는 동물 또는 인간 투여를 위해 약제학적 조성물을 제형화하는 데 일반적으로 사용되는 비히클로서 정의된다. 희석제는 조합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이와 같은 희석제의 예는 증류수, 생리적 인산염완충식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 및 행크 용액이다. 추가적으로, 약제학적 조성물 또는 제형은 또한 다른 담체, 아쥬반트, 또는 무독성, 비치료, 비면역원성 안정화제 등을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 크기가 크고 서서히 대사되는 거대분자, 예컨대 단백질, 키토산과 같은 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 공중합체(예를 들어, 라텍스 작용기화된 세파로스, 아가로스, 셀룰로스 등), 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 및 지질 응집체(예를 들어, 오일 액적 또는 리포좀)를 포함할 수 있다. 추가적으로, 이들 담체는 면역자극제(즉, 아쥬반트)로서 기능할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 적합한 전달 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 전달 비히클은 바이러스, 박테리아, 생분해성 마이크로스피어, 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 콜라겐 미니펠릿, 및 코킬레이트(cochleate)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
d. 약제학적 조성물 을 사용하는 방법
본 개시내용은 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약제학적 조성물을 사용하는 방법을 포함한다.
특정 실시형태에서, 타우 펩타이드 면역원 작제물을 함유하는 약제학적 조성물은 하기에 사용될 수 있다:
(a) 숙주에서 타우 응집의 억제;
(b) 숙주에서 미리 형성된 타우 응집체의 분해의 유도;
(c) 숙주에서 외인성 타우 응집체에 의해 촉발된 신경퇴행의 감소;
(d) 타우 과발현 세포에서 신경퇴행의 감소;
(e) 숙주에서 혈청 타우 수준의 감소;
(f) 숙주의 뇌에서 올리고머 타우 수준의 감소;
(g) 숙주에서 신경병리학의 감소 및 운동 활동의 회복; 등.
상기 방법은 약리학적 유효량의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 숙주에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "타오병증"은 뇌 내의 미세소관 단백질 타우의 병리학적 응집을 포함하는 임의의 신경퇴행성 질환을 포함한다. 따라서, 가족성 및 산발성 알츠하이머병에 추가적으로, 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 타우병증은 전두측두엽 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨증(FTDP-17), 진행성 핵상 마비, 피질기저 핵변성, 피크병, 진행성 피질하 신경교종, 엉킴 유일 치매, 석회화가 있는 확산 신경섬유 엉킴, 호은성 입자 치매, 근위축성 측색 경화증 파킨슨증-치매 복합, 권투선수 치매, 다운 증후군, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 할러버덴-스파츠병, 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, 니만-피크병 C형, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 과메니안이 아닌 사람의 신경섬유 엉킴이 있는 운동신경세포병, 뇌염후 파킨슨증, 만성 외상성 뇌병증을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체의 뇌로부터 타우 응집체의 소거를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상체의 뇌로부터 타우 응집체의 소거를 촉진시키는 데 효과적인 조건 하에서 대상체에게 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 하나 이상의 면역원성 타우 펩타이드, 또는 서열번호 1 내지 21, 101 내지 124, 51 내지 71 및 125 내지 155로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 타우 에피토프를 인식하는 하나 이상의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
타우 응집체의 소거는 신경섬유 엉킴 및/또는 신경섬유 엉킴에 대한 병리학적 타우 전구체의 소거를 포함한다. 신경섬유 엉킴은 종종, 예를 들어 산발성 및 가족성 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증, 호은성 입자 치매, 권투선수 치매, 만성 외상성 뇌병증, 석회화가 있는 확산 신경섬유 엉킴, 다운 증후군, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병, 할러버덴-스파츠병, 유전성 전두측두엽 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨증(FTDP-17), 봉입체 근염, 크로이츠펠트-야콥병, 다계통 위축증, 니만-피크병 C형, 피크병, 프리온 단백질 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 산발성 피질기저 핵변성, 진행성 핵상 마비, 아급성 경화성 범뇌염, 근긴장성 이영양증, 신경섬유 엉킴이 있는 운동신경세포병, 엉킴 유일 치매 및 진행성 피질하 신경교종을 포함한 신경퇴행성 질환과 연관된다.
본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체에서 타우-병리 관련 거동 표현형의 진행을 늦추는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 대상체에서 타우-병리 관련 거동 표현형을 늦추는 데 효과적인 조건 하에서 대상체에게 서열번호 1 내지 21, 101 내지 124, 51 내지 71 및 125 내지 155로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 임의의 하나 이상의 면역원성 타우 펩타이드, 또는 서열번호 1 내지 21, 101 내지 124, 51 내지 71 및 125 내지 155로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 면역원성 타우 에피토프를 인식하는 하나 이상의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 타우-병리 관련 거동 표현형은 인지기능장애, 초기 인격변환 및 탈억제, 무관심, 무의지증, 무언증, 행위상실증, 보속증, 상동적 운동장애/행동, 먹는 것에의 집착, 부조직화, 순차적 과제의 계획 또는 구조화 불능, 이기적/무감각, 반사회적 특성, 공감 결여, 더듬거림, 빈번한 착어증 오류가 있으나 이해력은 비교적 보존된 실문법적 말하기, 이해력 장애 및 낱말찾기 장애, 지연성 진행성 보행 불안정성, 후방돌진, 얼어붙음, 빈번한 넘어짐, 비-레보도파 반응성 축경직, 핵상 주시 마비, 사각파된 떨림, 느린 수직 단속적 운동, 가성구마비, 사지 실행증, 근육긴장이상, 피질 감각 상실, 및 떨림을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 개시내용의 방법에 따르면, 일 실시형태에서, 면역원성 타우 펩타이드 또는 면역원성 타우 펩타이드의 조합은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 타우 단백질의 적합한 면역원성 타우 펩타이드 단편은 타우 단백질의 병리학적 형태를 모방하는 하나 이상의 항원성 에피토프를 함유한다. 예시적인 면역원성 타우 에피토프는 타우의 병리학적 형태에서는 인산화되지만 타우의 정상적이거나 비-병리학적 형태에서는 인산화되지 않는 하나 이상의 아미노산에서 인산화된다.
일부 실시형태에서, 면역원성 타우 펩타이드의 투여는 대상체에서 면역원성 타우 펩타이드 및 타우의 병리학적 형태에 대한 활성 면역 반응을 유도함으로써, 관련 타우 응집체의 소거를 용이하게 하고, 타우-병리 관련 거동의 진행을 늦추며 기저 타우병증을 치료한다. 본 발명의 이러한 양태에 따르면, 면역 반응은 면역원성 타우 펩타이드에 대하여 유도된 유익한 체액성(항체 매개) 및/또는 세포성(항원-특이적 T 세포 또는 이의 분비 산물에 의해 매개됨) 반응의 발달을 포함한다.
체액성 면역 반응의 존재는 면역원성 타우 펩타이드에 대하여 유도된 항체의 존재에 대해 대상체로부터 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, CSF 또는 림프액)을 시험함으로써 결정되고 모니터링될 수 있다. 생물학적 샘플에서 항체를 검출하는 방법, 예를 들어 ELISA, 점 블롯, SDS-PAGE 겔 또는 ELISPOT은 당업계에 잘 알려져 있다. 세포-매개 면역 반응의 존재는 당업계에서 용이하게 공지되어 있는 증식 분석(CD4+ T 세포) 또는 CTL(세포독성 T 림프구)에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 단리된 면역원성 타우 펩타이드는 하기 표 1 및 표 3에 나타낸 서열번호 1 내지 21, 101 내지 124, 51 내지 71 및 125 내지 155의 아미노산 서열 중 임의의 하나를 포함한다. 인산화된 각각의 서열의 아미노산 잔기는 굵은체 및 밑줄로 표시된다. 표 1에서 펩타이드의 명칭은 표 8에 나타낸 바와 같은 서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 인간 타우 단백질의 가장 긴 동형단백질 내에서 이들 펩타이드의 아미노산 위치에 해당한다.
구체적인 실시형태
(1) 타우 펩타이드 면역원 작제물은 하기 화학식으로 표현될 수 있다:
(Th)m-(A)n-(타우 단편)-X
또는
(타우 단편)-(A)n-(Th)m-X
여기서
Th는 이종성 T 헬퍼 에피토프이고;
A는 이종성 스페이서이며;
(타우 단편)은 서열번호 100의 전장 타우 단백질 유래의 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
m은 1 내지 약 4이고;
n은 0 내지 약 10이다.
(2) (1)에 있어서, 상기 타우 단편은 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 상기 Th 에피토프는 서열번호 22 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(4) (1)에 있어서, 상기 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원.
(5) 서열번호 100의 전장 타우 단백질 서열 유래의 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프;
서열번호 22 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 T 헬퍼 에피토프; 및
아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, 및 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102)로 이루어진 군으로부터 선택되는 선택적인 이종성 스페이서를 포함하되,
상기 B 세포 에피토프는 직접적으로 또는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 T 헬퍼 에피토프에 공유적으로 연결되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(6) (5)에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(7) (5)에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 서열번호 22 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(8) (5)에 있어서, 상기 선택적인 이종성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102)인, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(9) (5)에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(10) (5)에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
(11) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 조성물.
(12) a. (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 따른 펩타이드 면역원 작제물; 및
b. 약제학적으로 허용 가능한 전달 비히클 및/또는 아쥬반트
를 포함하는, 약제학적 조성물.
(13) (12)에 있어서,
a. 상기 타우 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155로 이루어진 군으로부터 선택되고;
b. 상기 타우 펩타이드 면역원 작제물은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하는, 약제학적 조성물.
(14) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 타우 펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(15) (14)에 있어서, 상기 타우 펩타이드 면역원 작제물에 결합된, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(16) (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 따른 타우 펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
(17) (14) 내지 (16) 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는, 조성물.
실시예 1
비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체 및 결합 프로파일
a. 타우 단편의 합성 및 면역화
비-인산화 및 인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물의 개발 노력에 포함되는 설계된 타우 단편을 합성하는 방법은 상세한 설명에 기재되어 있다. 일반적으로, 혈청학적 분석을 위해서는 소규모로, 현장 또는 임상 연구를 위해서는 실험실 파일럿 규모로, 그리고 약제학적 조성물의 산업적/상업적 생산을 위해서는 대규모(킬로그램)로 펩타이드를 합성하였다. 타우 백신 제형에서의 사용을 위한 면역원성 및 기능적 시험에 대한 타우 펩타이드 면역원 작제물의 설계에 포함하기 위한 후보 B 세포 에피토프로서 광범위한 혈청학적 스크리닝 및 선택을 위해 길이가 대략 10 내지 대략 40개 아미노산 범위인 서열을 갖는 타우 관련 항원성 B 세포 에피토프 펩타이드의 대규모 레퍼토리를 설계하였다.
이러한 혈청학적 연구에서 재조합 단백질로서 사용되는 전장 타우(표 8)는 알펩타이드 컴퍼니(rPeptide Company)로부터 구입하였다(타우-441, T-1001-2). 다양한 혈청학적 분석에서 에피토프 맵핑에 이용된 타우 펩타이드 절편은 표 1에서 확인된다(서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124). 홍역 바이러스 융합 단백질(MVF), B형 간염 표면 항원 단백질(HBsAg) 인플루엔자, 파상풍균(Clostridium tetani), 및 엡스타인-바 바이러스(EBV)를 포함한 병원균 단백질로부터 유래된 주의깊게 설계된 헬퍼 T 세포(Th) 에피토프에 타우 펩타이드를 합성적으로 연결함으로써 선택된 타우 펩타이드를 타우 펩타이드 면역원 작제물로 제조하였다. 설계된 Th 에피토프는 표 2에 표시되어 있다(서열번호 22 내지 50).
유중수 에멀션을 이용하고 미네랄 염을 포함한 현탁액의 제형을 상세한 설명에 기재한 바와 같이 제조하였다. 질환을 예방할 목적으로 많은 집단에서 사용될 적절한 약제학적 조성물을 설계함에 있어서, 조성물의 안정성을 고려하는 것이 중요하다. 임상 시험에서의 다수의 약제학적 조성물에 있어서 인간에서 유중수 에멀션을 사용함에도 불구하고, 알럼은 이의 안정성으로 인해 여전히 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 주요 아쥬반트이다. 알럼 또는 이의 미네랄 염, 예컨대, ADJUPHOS(인산알루미늄)는 임상 적용을 위한 제제에서 아쥬반트로서 자주 사용된다. 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물을, 명시된 바와 같이 다양한 양의 펩타이드 작제물에서, (i) 인간 사용을 위한 승인된 오일인 세픽(Seppic) MONTANIDE™ ISA 51을 이용한 유중수 에멀션으로, 또는 (ii) 미네랄 염인 ADJUPHOS(인산알루미늄) 또는 ALHYDROGEL(알럼)과 혼합하여 제조하였다. 전형적으로 약 400㎍/㎖로 물에 타우 펩타이드 면역원 작제물을 용해시킴으로써 조성물을 제조하고, MONTANIDE™ ISA 51을 이용하여 유중수 에멀션(부피로 1:1)으로 또는 미네랄 염(부피로 1:1)을 이용하여 제형화하였다. 조성물을 실온에서 약 30분 동안 유지시키고, 면역화 전에 약 10 내지 15초 동안 와동으로 혼합하였다. 일부 동물을 1회 초과 용량의 특정 조성물을 이용하여 면역화시켰으며, 상기 동물은 0주째(프라임) 및 초기 면역화 후 3주째(wpi)(부스터)에, 그리고 선택적으로 제2 부스트를 위해 6 wpi에 근육내 경로로 투여받았다. 그 다음, 이들 면역화시킨 동물을 선택된 B 세포 에피토프 펩타이드(들)로 시험하여 제형에 존재하는 다양한 타우 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성뿐만 아니라, 관련 표적 펩타이드 또는 단백질과의 교차 반응성을 평가하였다. 그 다음, 면역화 프로토콜에 의해 지시된 바와 같이, 명시된 기간에 걸쳐 투약 요법에 대해 영장류에서 유중수 에멀션, 미네랄 염, 및 알럼-기반 제형 모두로 기니피그에서의 초기 스크리닝에서 강력한 면역원성을 갖는 이들 타우 펩타이드 면역원 작제물을 추가로 시험하였다.
광범위한 혈청학적 분석을 위해 수집된 면역 혈청을 이용하여 명시된 스케쥴로 용매(ISA 51 VG, CpG3 50㎍/㎖, 0.2% TWEEN®-80)에 용해한 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 52, 54, 56, 58, 61, 63, 65, 67, 69 및 71)을 기니피그에 주사하였다.
b. ELISA 분석 및 결과
면역화시킨 동물로부터 혈청을 초기 면역화 후 다양한 시점에 수집하고 초기에 결합 프로파일을 ELISA에 의해 분석하여 자체의 B 세포 에피토프 표적에 대하여 상응하는 작제물의 면역원성을 결정하였다. 다른 기능적 영역으로부터의 타우 펩타이드 사이의 혈청학적 교차-반응성의 평가를 표 9a 내지 표 9e에 나타낸 것으로부터 선택되는 상이한 펩타이드로 코팅된 플레이트를 이용하여 ELISA에 의해 광범위하게 평가하였다.
ELISA 프로토콜을 개발하여 면역 혈청 샘플을 평가하였으며, 이는 하기 실시예에 기재되어 있다. 간략하게, 2㎍/㎖(달리 언급되어 있지 않는 한)로 10mM NaHCO3 완충액(pH 9.5; 달리 언급되어 있지 않는 한) 중 표적 펩타이드 타우 단편 A145-P160, P172-P189, P182-P200, S195-P213, R209-L224, V228-L243, K257-K274, R379-L408, V275-K311, 및 V393-L425 펩타이드(각각 서열번호 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19 및 21) 100㎕를 이용하여 96웰 플레이트의 웰을 1시간 동안 37℃에서 개별적으로 코팅하였다. 펩타이드-코팅된 웰을 PBS 중 3 중량%의 젤라틴 250㎕와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단한 다음, 0.05 부피%의 TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 건조시켰다. 분석하고자 하는 혈청을 20 부피% 표준 염소 혈청, 1 중량% 젤라틴 및 0.05 부피% TWEEN® 20을 함유하는 PBS를 이용하여 1:20(달리 언급되어 있지 않는 한)으로 희석하였다. 100 마이크로리터(100㎕)의 희석된 시편(예를 들어, 혈청, 혈장)을 각각의 웰에 첨가하고, 60분 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 다음, 웰을 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 종(예를 들어, 마우스, 기니피그 또는 인간) 특이적 염소 항-IgG를 양성 웰에 형성된 항체/펩타이드 항원 복합체와 함께 결합하는 표지된 추적자로 사용하였다. 사전 적정된 최적 희석률로 그리고 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20을 포함하는 1 부피% 표준 염소 혈청 중 퍼옥시다제-표지 염소 항-IgG 100 마이크로리터(100㎕)를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 시트르산나트륨 완충액 중 0.04 중량% 3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 0.12 부피% 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100㎕와 추가 15분 동안 반응시켰다. 착색된 산물을 형성함으로써 이 기질 혼합물을 퍼옥시다제 표지를 검출하는 데 사용하였다. 100㎕의 1.0M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 정지시키고 450㎚에서 흡광도(A450)를 결정하였다. 다양한 타우 유래 펩타이드 면역원을 받은 면역화시킨 동물의 항체 역가를 결정하기 위하여, 1:100 내지 1:10,000의 혈청의 10배 연속 희석물을 시험하고, 컷오프 A450이 0.5로 설정된 A450의 선형회귀 분석으로 Log10으로 표현한 시험한 혈청의 역가를 계산하였다. 표 9a 내지 표 9e에 나타낸 ELISA 결과를 도 1a에 나타낸 바와 같이 막대 그래프에 플롯팅함으로써 추가로 분석하였다.
일반적으로 높은 면역원성은 그 자체의 B 세포 에피토프에 대해 시험될 때 선택된 타우 펩타이드 작제물 각각과 연관된 것으로 밝혀졌다(표 9a 내지 표 9e 및 도 1a). 서열번호 52, 54, 56, 58, 및 61의 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체에 의해 높은 교차-반응성이 발견되었다(도 1a 참조).
흥미롭게도, B 세포 에피토프 K257-K274(서열번호 15)를 함유하는 서열번호 65는 설계된 타우 펩타이드 작제물 중에서 높은 면역원성 서열인 것으로 밝혀졌지만, 이 작제물로부터 유도된 항체는 다른 B 세포 에피토프 중 임의의 것에 대하여 많은 교차-반응성 없이 가장 특이적이었다(도 1a 참조). 반대로, B 세포 에피토프 R379-L408(서열번호 17)을 함유하는 서열번호 67의 타우 펩타이드 면역원 작제물은 자체의 B 에피토프와 높은 반응성을 가지는 가장 면역원성이었지만, 또한 다른 타우 B 세포 에피토프와 상당한 교차-반응성을 가진다(도 1a 참조).
실시예 2
인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체 및 결합 프로파일
인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대해 생성된 항체를 초기 면역화 후 6주째(wpi)에 ELISA에 의해 인산화된 B 세포 에피토프에 결합하는 항체의 능력에 대하여 평가하였다.
a. 면역화
인산화된 타우 펩타이드 면역원(서열번호 51, 53, 55, 57, 59, 60, 62, 64, 66, 68, 및 70)을 제형화하고 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원에 대하여 실시예 1에서 논의된 동일한 조건 하에서 기니피그에 투여하였다. 인산화된 타우 펩타이드 면역원을 함유하는 제형을 0, 3, 및 6 wpi에 투여하였다.
b. ELISA 분석 및 결과
2㎍/㎖(달리 언급되어 있지 않는 한)로 10mM NaHCO3 완충액(pH 9.5; 달리 언급되어 있지 않는 한) 중 인산화된 타우 표적 펩타이드 단편 A145-P160, P172-P189, P182-P200, S195-P213, R209-L224, V228-L243, K257-K274, R379-L408, V275-K311 및 V393-L425 펩타이드(각각 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 18 및 20) 100㎕를 이용하여 96웰 플레이트의 웰을 1시간 동안 37℃에서 개별적으로 코팅하였다. 펩타이드-코팅된 웰을 PBS 중 3 중량%의 젤라틴 250㎕와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단한 다음, 0.05 부피%의 TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 건조시켰다. 분석하고자 하는 혈청을 20 부피% 표준 염소 혈청, 1 중량% 젤라틴 및 0.05 부피% TWEEN® 20을 함유하는 PBS를 이용하여 1:20(달리 언급되어 있지 않는 한)으로 희석하였다. 100 마이크로리터(100㎕)의 희석된 시편(예를 들어, 혈청, 혈장)을 각각의 웰에 첨가하고, 60분 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 다음, 웰을 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 종(예를 들어, 마우스, 기니피그, 또는 인간) 특이적 염소 항-IgG를 양성 웰에 형성된 항체/펩타이드 항원 복합체와 함께 결합하는 표지된 추적자로 사용하였다. 사전 적정된 최적 희석률로 그리고 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20을 포함하는 1 부피% 표준 염소 혈청 중 퍼옥시다제-표지 염소 항-IgG 100 마이크로리터(100㎕)를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 시트르산나트륨 완충액 중 0.04 중량% 3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 0.12 부피% 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100㎕와 추가 15분 동안 반응시켰다. 착색된 산물을 형성함으로써 이 기질 혼합물을 퍼옥시다제 표지를 검출하는 데 사용하였다. 100㎕의 1.0M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 정지시키고 450㎚에서 흡광도(A450)를 결정하였다. 다양한 타우 유래 펩타이드 면역원을 받은 면역화시킨 동물의 항체 역가를 결정하기 위하여, 1:100 내지 1:10,000의 혈청의 10배 연속 희석물을 시험하고, 컷오프 A450이 0.5로 설정된 A450의 선형회귀 분석으로 Log10으로 표현한 시험한 혈청의 역가를 계산하였다. 면역화시킨 동물로부터의 혈청을 주사 후 다양한 시점에 수집하고 결합 프로파일을 ELISA에 의해 분석하였다. ELISA 플레이트를 다양한 타우 단편으로 코팅하였으며 결과는 표 10a 내지 표 10d에 표시되어 있다.
표 10a 내지 표 10d에 나타낸 ELISA 결과를 도 1b에 나타낸 바와 같이 막대 그래프에 플롯팅함으로써 추가로 분석하였다. 인산화된 타우 펩타이드 작제물이 면역원으로서 사용될 때 B 세포 에피토프 사이의 교차-반응성을 포함하여 유사한 면역원성 및 혈청학적 프로파일이 발견되었다.
실시예 3
인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체 및 상기 항체의 비-인산화된 펩타이드 대응물에 대한 결합 프로파일
인산화된 타우 펩타이드에 대하여 생성된 항체를 하기에 보다 상세히 기재한 바와 같이 주사 후 6주째(wpi)에 ELISA에 의해 상기 항체의 상응하는 비-인산화된 대응물 펩타이드에 결합하는 상기 항체의 능력에 대하여 평가하였다.
a. 면역화
인산화된 타우 펩타이드 면역원(서열번호 51, 53, 55, 57, 59, 60, 62, 64, 66, 68, 및 70)을 제형화하고 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원에 대하여 실시예 1에 기재된 조건 하에서 기니피그에 투여하였다.
b. ELISA 분석 및 결과
2㎍/㎖(달리 언급되어 있지 않는 한)로 10mM NaHCO3 완충액(pH 9.5; 달리 언급되어 있지 않는 한) 중 표적 펩타이드 타우 단편 A145-P160, P172-P189, P182-P200, S195-P213, R209-L224, V228-L243, K257-K274, R379-L408, V275-K311 및 V393-L425 펩타이드(각각 서열번호 2, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 17, 19, 및 21) 100㎕를 이용하여 96웰 플레이트의 웰을 1시간 동안 37℃에서 개별적으로 코팅하였다. 펩타이드-코팅된 웰을 PBS 중 3 중량%의 젤라틴 250㎕와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 비-특이적 단백질 결합 부위를 차단한 다음, 0.05 부피%의 TWEEN® 20을 함유하는 PBS로 3회 세척한 후, 건조시켰다. 분석하고자 하는 혈청을 20 부피% 표준 염소 혈청, 1 중량% 젤라틴 및 0.05 부피% TWEEN® 20을 함유하는 PBS를 이용하여 1:20(달리 언급되어 있지 않는 한)으로 희석하였다. 100 마이크로리터(100㎕)의 희석된 시편(예를 들어, 혈청, 혈장)을 각각의 웰에 첨가하고, 60분 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 다음, 웰을 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 종(예를 들어, 마우스, 기니피그, 또는 인간) 특이적 염소 항-IgG를 양성 웰에 형성된 항체/펩타이드 항원 복합체와 함께 결합하는 표지된 추적자로 사용하였다. 사전 적정된 최적 희석률로 그리고 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20을 포함하는 1 부피% 표준 염소 혈청 중 퍼옥시다제-표지 염소 항-IgG 100 마이크로리터(100㎕)를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰을 PBS 중 0.05 부피% TWEEN® 20으로 6회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 시트르산나트륨 완충액 중 0.04 중량% 3', 3', 5', 5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 및 0.12 부피% 과산화수소를 함유하는 기질 혼합물 100㎕와 추가 15분 동안 반응시켰다. 착색된 산물을 형성함으로써 이 기질 혼합물을 퍼옥시다제 표지를 검출하는 데 사용하였다. 100㎕의 1.0M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 정지시키고 450㎚에서 흡광도(A450)를 결정하였다. 다양한 타우 유래 펩타이드 면역원을 받은 면역화시킨 동물의 항체 역가를 결정하기 위하여, 1:100 내지 1:10,000의 혈청의 10배 연속 희석물을 시험하고, 컷오프 A450이 0.5로 설정된 A450의 선형회귀 분석으로 Log10으로 표현한 시험한 혈청의 역가를 계산하였다. 면역화시킨 동물로부터의 혈청을 주사 후 다양한 시점에 수집하고 결합 프로파일을 ELISA에 의해 분석하였다.
ELISA 플레이트를 다양한 비-인산화된 타우 단편으로 코팅하였으며 결과는 표 11a 내지 표 11e에 표시되어 있다. 면역 혈청을 상응하는 비-인산화된 타우 B 세포 에피토프 펩타이드에 대하여 시험할 때, 인산화된 타우 펩타이드 작제물에 대하여 생성된 모든 항체에 대하여 유사한 혈청학적 결합 프로파일을 수득하였다. 실시예 1, 2 및 3에서 수행된 광범위한 면역원성 및 혈청학적 연구로부터, 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체가 유사한 특성을 나타내는 것이 명백하다. 이들 특성의 대부분은 아미노산 서열에 기인할 수 있다. 교차-반응성 연구를 사용한 입체 형태 평가는 펩타이드의 인산화에 의해 야기된 단지 미묘한 차이만 있음을 나타내며, 이는 상응하는 인산화된 펩타이드 면역원 작제물 대 비-인산화된 펩타이드 면역원 작제물에 의해 생긴 이들 면역 혈청의 유사한 기능적 특성이 있을 것임을 시사한다.
실시예 4
비-인산화된 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체의 결합 프로파일
a. 상이한 크기의 상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물로 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-비-인산화된 타우 항체의 특이성
기니피그를 실시예 1에 기재된 바와 같이 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다. 웨스턴 블롯을 사용하여, 상이한 크기의 타우 분자 복합체에 대한 결합 특이성에 대하여 상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-비-인산화된 타우 항체(항-비-p-타우 항체)를 스크리닝하였다. 다양한 형태(단량체, 이량체, 삼량체, 올리고머, 및 중합체)의 타우(20μM)를 12% 트리스(Tris)-글리신 SDS-PAGE에서 분리하고 나이트로셀룰로스(NC) 막으로 옮긴 후, 광-유도 가교(PICUP) 처리를 하였다. 막을 1㎍/㎖로 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-비-p-타우 항체와 함께 인큐베이션한 후, 당나귀 항-기니피그 항체 컨쥬게이트된 HRP(706-035-148, 잭슨(Jackson))와 함께 인큐베이션하였다. 화학발광 시약인 웨스턴 라이트닝 ECL 프로(Western Lightning ECL Pro; 퍼킨엘머(PerkinElmer))를 이용하여 블롯을 시각화하였다.
b. 결과
타우의 단량체, 이량체, 삼량체 및 올리고머를 함유하는 용해물의 웨스턴 블롯 결과는 도 2에 도시되어 있다(좌측 패널). 단량체 타우는 약 60 kDa인 것으로 나타났으며, 이량체, 삼량체뿐만 아니라 올리고머는 이들의 상응하는 분자량으로 나타났다. 시판 모노클로날 항체 Mab 타우 5 및 Mab 타우 46은 타우의 단량체 및 소량의 이량체 형태를 검출할 수 있었다(도 2의 레인 1 및 2). Mab 타우5를 전체 타우 마커로서 이용하였으며, 타우46은 타우 404-441에 대한 마커이다.
비-인산화된 펩타이드 면역원 작제물(서열번호 52, 54, 56, 58, 61, 63, 65, 67, 69 및 71)에 의해 유도된 IgG 항체는 상이한 효율로 타우 단량체, 이량체, 삼량체, 및 올리고머를 검출하였다(도 2의 레인 4 내지 13). 각각의 항체에 대한 결합 프로파일을 분석하였고 막대 그래프로 정량적으로 요약하였다(도 2의 우측 패널). 일반적으로, C-말단 영역으로부터의 타우 펩타이드 면역원 작제물로부터 유래된 항체는 N-말단 영역으로부터의 타우 펩타이드 면역원 작제물로부터 유래된 항체보다 더 높은 우선적 결합 프로파일을 갖는 항체를 유도할 수 있었다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 5
비-인산화된 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체는 타우 응집을 억제한다
a. 타우에 대한 면역화 및 노출
동물을 실시예 1에 기재된 바와 같은 비-인산화된 타우 면역원 구축물(서열번호 52, 54, 56, 58, 61, 63, 65, 67, 69 및 71), 또는 실시예 2에 기재된 바와 같은 인산화된 타우 면역원 구축물(서열번호 51, 53, 55, 57, 60, 62, 64, 66, 68, 및 70)을 이용하여 면역화시켰다.
그 후, 면역화로부터 생성된 항체를 타우 응집을 촉진시키는 조건 하에서 시판 전장 타우441 재조합 단백질을 함유하는 샘플에 노출시켰다. 10 유닛/㎖ 헤파린을 포함하는 100㎕ 1×PBS 중의 응집된 타우 60㎍을 사용하여 37℃에서 7일 동안 타우441 β-병풍구조(sheet) 피브릴을 생성한 후, 4℃에서 300 kDa 컷오프 필터(팔사(Pall))로 옮겨서 β-병풍구조 피브릴을 단리하였다. 티오플라빈-T(Thioflavin-T; ThT, 시그마(Sigma)) 형광에 의해 이러한 응집을 확인하였다.
5μM의 농도로 헤파린을 포함하는 200㎕의 PBS에서 타우 펩타이드 면역원 작제물로부터 유도된 IgG 항체를 이용하여 또는 상기 항체 없이 3일 동안 타우를 응집시켰다. 원심분리(13,000×g, 4℃, 30분), 후 타우 응집체를 수확하고, ThT 분석으로 확인하였다.
b. 결과
도 3a는 각각의 그래프 위에 나타낸 인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 항체의 존재 하에서 전장 타우(타우441) 응집 수준을 나타내는 그래프를 포함한다. 도 3a에 나타낸 점선은 면역전 IgG를 사용하여 타우 응집을 평가한 대조군 샘플을 나타낸다. 결과는 인산화된 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체 전부가 면역전 혈청 대조군 샘플과 비교하여 타우 응집을 억제하였음을 나타낸다. 항체는 상이한 비율로 타우 응집을 억제할 수 있었다.
도 3b는 막대 그래프 아래에 나타낸 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 항체의 존재 하에서 응집체의 ThT 염색에 의해 전장 타우(타우441) 응집의 수준을 정량화한다. 결과는 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체가 면역전 혈청 대조군 샘플과 비교하여 타우 응집을 억제하였음을 나타낸다. 항체는 상이한 비율로 타우 응집을 억제할 수 있었다.
결과는 타우의 C-말단 영역에 더 가까운 B 세포 에피토프를 갖는 타우 펩타이드 면역원 작제물을 사용할 때 타우 중합에 대한 더 큰 항-응집 능력이 있음을 시사한다.
실시예 6
타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체는 타우 응집을 억제한다
a. 타우에 대한 면역화 및 노출
동물을 실시예 1에 기재된 바와 같은 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다. 또한 동물을 실시예 2에 기재된 바와 같은 인산화된 타우 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다.
그 후, 면역화로부터 생성된 항체를 (a) 과인산화된 타우로서 오카다산(OKA) 처리된 뉴런 세포(SH-SY5Y 세포) 또는 (b) 비-인산화된 타우로서 무-OKA 뉴런 세포로부터의 세포 용해물에 노출시켰다. wpi 6 및 9에서 항-혈청의 존재 하에 100 nM의 최종 농도로 OKA를 배지에 3시간 동안 첨가하여 타우-응집에 대한 억제에 있어서 항-혈청 효과의 용량-의존적 효과를 결정하였다.
b. 결과
도 4는 각각의 그래프 위에 나타낸 타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체에 노출 후 다양한 용해물의 타우 응집 수준을 나타내는 그래프를 포함한다. 응집체의 ThT 염색에 의해 타우 응집 수준을 측정하였다. 또한, 인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물 또는 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물 둘 다로부터의 항체는 타우 응집을 억제할 수 있었으며, 이는 이전 실시예에 기재된 혈청학적 분석과 일치한다.
결과는 타우의 중심 및 C-말단 영역으로부터 유래된 타우 에피토프를 이용한 타우 중합에 대하여 더 큰 항-응집 능력이 있음을 시사한다.
실시예 7
타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체에의 노출 후 미리 형성된 타우 응집체의 분해
a. 미리 형성된 타우 응집체에 대한 면역화 및 노출
동물을 실시예 1에 기재된 바와 같은 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다. 또한 동물을 실시예 2에 기재된 바와 같은 인산화된 타우 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다.
그 후, 면역화로부터 생성된 항체를 미리 형성된 타우 피브릴에 노출시켰다. 그 후, 미리 형성된 타우 응집체를 2 및 4일 동안 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-p-타우 항체 또는 항-비-p-타우 항체와 함께 또는 이들 항체 없이 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 4℃에서 30분 동안 13,000×g로 원심분리 후 응집체를 수집한 다음, ThT 분석으로 정량화하였다.
b. 결과
도 5는 상기 도 5(우측 패널)에 나타낸 바와 같이, 타우 펩타이드 면역원(서열번호 66 및 67의 대표적인 펩타이드 작제물)에 대하여 유도된 항체에의 노출 후 타우 분해의 수준을 나타내는 그래프를 포함한다. 타우 응집 수준은 ThT 염색 및 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다.
웨스턴 블롯 및 ThT 분석 둘 다로부터의 데이터는 각각 서열번호 67 및 66에 의해 유도된 항-비-p/p-타우 379-408 IgG가 재조합 타우 피브릴의 응집을 방해하는 능력을 가짐을 나타낸다.
실시예 8
인산화된 타우 및 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물 둘 다에 의해 생성된 대표적인 항체에 의한 타우 피브릴 , 올리고머, 및 단량체의 비-변성 형태의 특이적 결합에 대한 점 블롯 분석.
a. 항- 타우 항체의 결합 프로파일의 면역화, 웨스턴 블롯 및 점 블롯 분석
동물을 실시예 1에 기재된 바와 같은 비-인산화된 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다. 또한 동물을 실시예 2에 기재된 바와 같은 인산화된 타우 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다.
실시예 5에 기재된 바와 같이 상이한 종의 타우 단백질(즉, α- 나선 단량체, β-병풍구조 단량체, β-병풍구조 올리고머 및 β-병풍구조 피브릴)을 제조하였다. 1차 항체로서 상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-p-타우 또는 항-비-p-타우 항체를 사용하여 상이한 종의 타우 단백질을 이용한 웨스턴 블롯 및 점 블롯 분석을 수행하였다. β-병풍구조 피브릴, 올리고머, 단량체, α- 나선 단량체, 및 다른 대조군 시약의 다양한 형태를 매우 특이적인 제어를 위해 블롯 상에서 점을 찍었다. 혈청학적 시험 및 평가를 위한 이들 시약의 제조에 대한 상세한 절차는 실시예 11에 추가로 기재되어 있다.
b. 결과
도 6(좌측 패널)은 타우 펩타이드 면역원(서열번호 59, 66, 및 70)에 의해 생성된 항-p-타우 IgG 및 타우 펩타이드 면역원(서열번호 67)에 의해 생성된 항-비-p-타우 IgG의 (변성 조건 하) 웨스턴 블롯 분석을 포함한다. 웨스턴 블롯 결과는 타우의 C-말단에 대하여 유도된 항-p-타우 IgG는 고분자량 타우 응집체를 특이적으로 인식하지만, 타우 단량체는 인식하지 못함을 나타낸다.
도 6(우측 패널)은 각각 서열번호 66 및 67의 타우 펩타이드 면역원에 의해 생성된 항-p-타우 및 항-비-p-타우 IgG의 (비-변성 조건 하) 점 블롯 분석을 포함한다. 결과는 항-비-p-/p-타우379-408 IgG 둘 다 다양한 형태의 타우에 특이적으로 결합하지만 다른 아밀로이드성 단백질(즉, Aβ1-42 및 알파-시누클레인)에는 결합하지 않음을 나타낸다. 또한, 타우의 비-C-말단 영역에 대한 모노클로날 항체 Mab 타우 5 및 또 다른 IgG와 비교할 때, 본 발명(각각 서열번호 66 및 67)으로부터 유래된 항-p/항-비-p-타우379-408 IgG는 단량체보다 피브릴 및 올리고머에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 추가적으로, 항-p-타우379-408 IgG는 β-병풍구조 단량체에 결합하지 않는다.
실시예 9
타우 펩타이드 면역원에 대하여 유도된 항체의 조직 결합 프로파일
a. 면역화 및 조직 염색
동물을 실시예 1에 기재된 바와 같은 비-인산화된 타우 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다. 또한 동물을 실시예 2에 기재된 바와 같은 인산화된 타우 면역원 작제물을 이용하여 면역화시켰다.
그 후, 면역화로부터 생성된 항체를 사용하여 건강한(정상) 뇌 및 알츠하이머병(AD) 뇌로부터의 조직을 염색하였다. 인간 조직의 패널(판토믹스(Pantomics))을 자일렌으로 탈파라핀화하고, 에탄올 중에서 재수화한 다음, PBS 중에 0.5% CaCl2를 포함하는 0.25% 트립신 용액으로 30분 동안 처리하고, 메탄올 중 1% 과산화수소에서 인큐베이션하여 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시킨 후, PBS 중 10% 블록 에이스(Block Ace, 시그마)와 함께 인큐베이션 한 다음, 항-타우 349-408(서열번호 66 또는 67) 또는 면역전 혈청을 조직에 적용하였다. 절편을 3-3'다이아미노벤지딘(DAB)으로 전개하고 헤마톡실린으로 대조염색한 후, 현미경으로 검사하였다.
b. 결과
도 7은 본 실험으로부터의 염색 이미지를 나타낸다. 비-인산화된 타우 379-408(서열번호 67) 및 인산화된 타우 379-408(서열번호 66)에 대하여 유도된 항체는 정상 조직으로부터의 단편과 교차-반응성을 갖지 않지만, 알츠하이머병 뇌 조직에 대해서는 교차-반응성이었다. 인산화된 펩타이드(서열번호 66)에 대하여 유도된 항체는 AD 뇌의 해마 영역에서 더 강한 결합을 나타내었다.
실시예 10
타우 펩타이드 면역원 작제물 및 이의 제형에 의해 유도된 항체: 외인성 타 우 피브릴에 의해 촉발되는 신경퇴행의 감소에 대한 신경보호 효과
상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-타우 항체의 신경보호 효과를 평가하기 위해, NGF-처리된, 뉴런-분화 PC12 세포 상의 미리 형성된 타우 응집체를 채택하였다.
NGF(100 ng/㎖)로 6일 동안 PC12 세포를 처리하여 뉴런 분화를 유도하였다. 뉴런-분화 세포의 형태를 확인하고 셀3 이미저 듀오스(cell3 iMager duos) 고처리량 이미징 시스템(스크린(Screen))에 의해 분석하였다. 플루오레세인 염료를 사용하여 세포 사멸을 표지화하고, 세포 계수 소프트웨어를 사용하여 세포를 계수하였다. 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항체는 세포 내로 들어가서 타우 응집체에 결합할 수 있었다(데이터는 나타내지 않음). 신경돌기 파생물에 반영된 NGF의 신경영양 효과 및 뉴런-분화된 세포의 수를 정량화하였다. 신경돌기 파생물의 수준 및 뉴런-분화된 세포의 수를 정규화 후 백분율로 나타내었다(평균 ± SEM). NGF 처리가 있거나 없는 PC12 세포의 신경돌기 길이를 각각 100% 및 0%로 취하였다. NGF 처리 6일째에 뉴런-분화된 PC12 세포의 수를 100%로 정규화하였다.
뉴런-분화된 PC12 세포에 대하여 헤파린에 의해 1주일 동안 37℃에서 처리한 외인성의 미리 형성된 타우 응집체에 의해 신경변성을 관찰하였다. 미리 형성된 타우 응집체의 존재 하에서, 신경돌기 길이가 단축되고, 뉴런-분화된 PC12 세포에서 세포의 수가 감소되었다. 이러한 타우 피브릴-구동 신경퇴행은 농도 의존적 방식으로 첨가된 외인성 타우 응집체의 양에 비례하였다. 상업적으로 이용가능한 항-타우 항체(예를 들어, Mab 타우5 및 Mab 타우46)는 타우-피브릴-구동 신경퇴행을 약화시켰지만, 나이브 기니피그로부터 정제된 항체는 그렇지 않았다. 이러한 모델은 상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-타우 항체가 농도-의존적 방식으로 뉴런 생존을 회복시키는 데 있어서 신경보호 효과를 갖는 것을 확인하기 위한 스크리닝 플랫폼으로서 채택되었다(도 8a 및 8b).
그 결과, 상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물의 절반 초과를 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-타우 항체는 신경돌기 성장을 회복시켰다. 타우 피브릴은 병변을 야기하도록 이전에 최적화된 농도인 5㎍/㎖로 제공되었다(도 8a). 인산화된 타우 펩타이드 작제물 또는 비-인산화된 타우 펩타이드 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-타우 항체는 타우 피브릴로 촉발된 뉴런 사멸로부터 뉴런-분화된 PC12 세포를 보호하였다. 도 8b는 서열번호 65, 67 및 69를 이용한 면역화로부터 수득한 항-비-p-타우 항체로부터의 데이터를 나타낸다.
도 8a 및 8b로부터의 결과는 항-타우 항체(예를 들어, 서열번호 65, 67 및 69)가 타우 피브릴의 신경독성에 대하여 뉴런을 보호할 수 있음을 입증한다. 배양물에서 생존한 세포의 수에 대한 셀3 이미저 듀오스 소프트웨어(cell3 imager duos software)(미테크랩(Miteklab))에 의한 계산을 통해 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항-타우 항체(서열번호 65, 67 및 69)의 항-신경퇴행 효과를 관찰하고 정량화하였다.
시험관내 기능 분석 평가를 통한 항-타우 항체에 의한 신경보호와 관련하여, 시험관내 타우 응집 시딩(seeding)은 문헌[Yanamandra, K, et al., Neuron 80:402-414, 2013]에 기록된 바와 같이, 병리를 현저하게 감소시키고 생체 내 인지를 개선시킬 수 있는 것으로 나타났다. 타우 단량체는 본래 구조화되지 않은 것으로 간주되어 타우 응집 및 관련 세포의 세포독성에서 많은 기능적 역할을 갖지 않을 수 있다. 최근 연구 결과는 병리학적 응집의 개시가 타우 단량체를 불활성 형태에서 시드-유능 형태로 전환하는 것으로 시작할 수 있음을 나타낸다(Mirbaha, H., et al., eLife 2018;7:e36584; doi: 10.7554/eLife.36584). 이러한 연구 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 시딩 활성을 감소시키는 능력에 대해 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 항-타우 항체를 시험하였다. 구체적으로, 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 항-타우 항체를 알츠하이머병(AD) 환자로부터의 뇌 파쇄액과 함께 인큐베이션하고, 이들 항체가 이와 같은 시딩 활성을 감소시키는 능력을 갖는 것을 발견하였다(데이터는 나타내지 않음). 본 발명자들의 광범위한 타우 면역원 설계, 면역원성 및 혈청학적 분석은 대단히 파괴적인 타우병증의 치료를 위한 분자 및 혈청학적 수준 둘 다에서 백신으로서 신경보호 중재의 개발을 용이하게 하였다.
실시예 11
추가적인 혈청학적 분석 및 시약
합성 펩타이드 작제물 및 이의 제형의 기능적 면역원성을 평가하기 위한 혈청학적 분석 및 시약이 하기에 상세히 기재되어 있다.
a. B 세포 에피토프 클러스터 펩타이드 -기반 ELISA 테스트에 의한 타우 단편에 대한 에피토프 맵핑 및 미세 특이성 분석
에피토프 맵핑에 의해 면역화시킨 숙주에서 항-타우 항체의 미세 특이성 분석을 결정하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트의 웰을 맵핑된 타우 275-311 영역(서열번호 19)로부터의 개별 타우 단편 펩타이드(서열번호 115 및 156 내지 171)로 웰당 0.1㎖당 0.5㎍으로 코팅한 후, 상기 기재된 항체 ELISA 방법의 단계 후 100㎕의 혈청 샘플(PBS 중 1:100 희석물)을 플레이트 웰에서 이중으로 배양하였다. 추가적 반응성 및 특이성 확인을 위하여, 또한 타우 펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프 및 면역화시킨 숙주에서 면역 혈청의 항-타우 항체의 관련 미세 특이성 분석을 스페이서 및 Th 서열이 없는 상응하는 타우 펩타이드(예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같은 서열번호 1 내지 21, 101 내지 124, 표 4 내지 7에 나타낸 바와 같은 서열번호 72 내지 99, 및 표 8에 나타낸 바와 같은 서열번호 100)를 이용하여 시험하였다.
b. 면역원성 평가
실험 면역 프로토콜에 따라 동물로부터 면역전 및 면역 혈청 샘플을 수집하고 56℃에서 30분 동안 가열하여 혈청 보체 인자를 불활성화시켰다. 타우 펩타이드 면역원 작제물의 투여 후, 프로토콜에 따라 혈액 샘플을 수득하고 특정 표적 부위(들)에 대한 면역원성을 평가하였다. 연속 희석된 혈청을 시험하고, 희석률 역수의 Log10으로 양성 역가를 표현하였다. 원하는 B 세포 반응의 향상을 제공하는 데 이용되는 "T 세포 에피토프"에 대해 낮은 정도 내지 무시할 수 있는 정도의 항체 반응성을 유지하면서 표적 항원 내 원하는 에피토프 특이성에 대하여 유도된 고역가 B 세포 항체 반응을 유도하는 능력에 의해 특정 타우 펩타이드 면역원 작제물의 면역원성을 평가하였다.
c. 재조합 타우 단백질을 이용한 타우 응집물 ( 이량체 , 삼량체 , 올리고머, 및 피브릴 )의 제조
응집된 타우를 제조하기 위하여, 100㎕ PBS/KCl 응집 완충액(1×PBS 중 2.5mM MgCl2, 50mM HEPES 및 150mM KCl, pH 7.4) 중 정제된 재조합 타우 단백질(0.1㎍/㎕)을 진탕없이 써모믹서(Thermomixer; 에펜도르프(Eppendorf))에서 7일 동안 37℃의 1.5㎖ 에펜도르프 튜브 중에서 인큐베이션하였다. 응집된 타우를 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 즉시 냉동시켰다.
d. 항 - 타우 항체의 정제
친화성 컬럼(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 록퍼드 소재)을 사용함으로써 상이한 서열(서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155)의 펩타이드를 함유하는 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그의 초기 면역화 후 3 내지 15주째(wpi)에 수집한 혈청으로부터 항-타우 항체를 정제하였다. 간략하게, 완충액(0.1M 포스페이트 및 0.15M 염화나트륨, pH 7.2) 평형화 후, 400㎕의 혈청을 냅 단백질 G 스핀(Nab Protein G Spin) 컬럼에 첨가한 다음, 10분 동안 빙글빙글 회전시켜 혼합하고 1분 동안 5,800×g에서 원심분리하였다. 결합 완충액(400㎕)으로 3회 컬럼을 세척하였다. 이어서, 용리 완충액(400㎕, 0.1M 글리신, pH 2.0)을 스핀 컬럼에 첨가하여 1분 동안 5,800×g에서 원심분리한 후 항체를 용리시켰다. 용리된 항체를 중화 완충액(400㎕, 0.1M 트리스 pH 8.0)과 혼합하고 이들 정제된 항체의 농도를 난-드롭(Nan-Drop)을 사용하여 OD280에서 측정하였으며, 이때 BSA(소혈청알부민)를 표준물로 하였다.
e. 상이한 크기의 상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항- 타우 항체의 특이성
웨스턴 블롯을 사용하여, 상이한 크기의 타우 분자 복합체에 대한 결합 특이성에 대하여 상이한 타우 펩타이드 면역원 작제물을 이용하여 면역화시킨 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-타우 항체를 스크리닝하였다. 다양한 형태의 타우(20μM)를 12% 트리스-글리신 SDS-PAGE에서 분리하고 나이트로셀룰로스(NC) 막으로 옮긴 후, 광-유도 가교(PICUP) 처리를 하였다. 막을 1㎍/㎖로 기니피그 항혈청으로부터 정제된 항-타우 항체와 함께 인큐베이션한 후, 당나귀 항-기니피그 항체 컨쥬게이트된 HRP(706-035-148, 잭슨)와 함께 인큐베이션하였다. 화학발광 시약인 웨스턴 라이트닝 ECL 프로(퍼킨엘머)를 이용하여 블롯을 시각화하였다. 단량체 타우는 약 60 kDa의 크기에서 블롯팅된 반면, 이량체, 삼량체, 또는 올리고머는 단량체 타우보다 몇 배 더 큰 각각의 분자량을 가졌다. 다양한 올리고머 종, 예컨대 이량체, 삼량체, 및 더 큰 올리고머, 예를 들어 Mab 타우 5 또는 Mab 타우 46을 검출할 수 있는 시판 항체를 양성 대조군으로 이용하였다.
f. 상이한 종의 아밀로이드성 단백질을 이용한 점 블롯 분석
Aβ1 -42, 타우, 및 α-Syn의 α- 나선 단량체, β-병풍구조 단량체, β-병풍구조 올리고머, 및 β-병풍구조 피브릴의 제조는 다음과 같이 기재된다.
1. Aβ 1 -42 α-나선 단량체: 20㎍의 Aβ1 -42 β-병풍구조 단량체(50㎕)를 20% 트라이플루오로아세트산 및 20% 헥사플루오로아이소프로판올을 함유하는 1×PBS(10㎕) 중에 첨가하고 4℃에서 24시간 동안 인큐베이션하여 α-나선 단량체를 형성하였다.
2. Aβ 1 -42 β-병풍구조 단량체: 37℃에서 24시간 동안 응집된 5% TFA를 함유하는 120㎕ 1×PBS 중 60㎍의 Aβ1 -42를 10 kDa 컷오프 필터(밀리포어(Millipore))로 옮겨 β-병풍구조 단량체를 회수하였다.
3. Aβ 1 -42 β-병풍구조 올리고머: 37℃에서 3일 동안 응집된 120㎕ 1×PBS 중 60㎍의 Aβ1 -42를 얼음 상에서 초음파 처리하고 10 및 30 kDa 컷오프 필터(밀리포어)로 옮겨 35 kDa 미만의 β-병풍구조 올리고머성 피브릴을 회수하였다.
4. Aβ 1 -42 β-병풍구조 피브릴: 37℃에서 3일 동안 응집된 120㎕ 1×PBS 중 60㎍의 Aβ1 -42를 얼음 상에서 초음파 처리하고 30 kDa 컷오프 필터(밀리포어)로 옮겨 β-병풍구조 피브릴을 단리하였다.
5. α- Syn α-나선 단량체: 40㎍의 새로 준비한 α-Syn을 4℃에서 차가운 100㎕ 1×PBS 중에 용해시키고 즉시 10 kDa 컷오프 필터(밀리포어)로 옮겨 α-나선 단량체를 회수하였다.
6. α- Syn β-병풍구조 단량체: 37℃에서 24시간 동안 100㎕ PBS/KCl 완충액 중에서 인큐베이션한 40㎍의 α-Syn을 10 kDa 컷오프 필터(밀리포어)로 옮겨 β-병풍구조 단량체를 회수하였다.
7. α- Syn β-병풍구조 올리고머: 37℃에서 8일 동안 100㎕ PBS/KCl 완충액 중에서 응집된 40㎍의 α-Syn을 얼음 상에서 초음파 처리한 후, 30 및 100 kDa 컷오프 필터로 옮겨 β-병풍구조 올리고머를 회수하였다.
8. α- Syn β-병풍구조 피브릴: 37℃에서 8일 동안 100㎕ PBS/KCl 완충액 중에서 응집된 40㎍의 α-Syn을 얼음 상에서 초음파 처리한 후, 30 및 100 kDa 컷오프 필터로 옮겨 β-병풍구조 피브릴을 단리하였다.
9. 타우441 α-나선 단량체: 4℃에서 100㎕ 1×PBS 중에서 준비된 60㎍의 타우를 100 kDa 컷오프 필터로 옮겨 α-나선 단량체를 회수하였다.
10. 타우441 β-병풍구조 단량체: 25℃에서 48시간 동안 10 유닛/헤파린 ㎖를 이용하여 100㎕ 1×PBS 중에서 응집된 60㎍의 타우를 4℃에서 100 kDa 컷오프 필터로 옮겨 β-병풍구조 단량체를 회수하였다.
11. 타우441 β-병풍구조 올리고머: 37℃에서 48시간 동안 10 유닛/헤파린 ㎖를 이용하여 100㎕ 1×PBS 중에서 응집된 60㎍의 타우를 4℃에서 100 및 300 kDa 컷오프 필터(팔사)로 옮겨 β-병풍구조 올리고머를 회수하였다.
12. 타우441 β-병풍구조 피브릴: 37℃에서 6일 동안 10 유닛/헤파린 ㎖를 이용하여 100㎕ 1×PBS 중에서 응집된 60㎍의 타우를 4℃에서 300 kDa 컷오프 필터(팔사)로 옮겨 β-병풍구조 피브릴을 단리하였다.
이러한 단량체 및 올리고머를 티오플라빈-T(ThT, 시그마) 형광 또는 PAGE(폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)에 의해 확인하였다. 표준물로서 시판 아밀로이드성 Aβ1-42 스톡을 이용한 나노-드롭(Nano-Drop)에 의해 아밀로이드성 단백질의 농도를 측정하였다. 이들 단량체 및 올리고머를 Aβ1 -42의 경우 3㎍, α-Syn의 경우 4㎍, 및 타우의 경우 7㎍의 양으로 PVDF 막 상에 개별적으로 스폿팅하였다. 막을 1차 항체로서 기니피그 항혈청(1:1,000 희석물)으로부터 정제된 항-타우 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 항-기니피그 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체(1:5,000; 벡터 라보라토리즈(Vector Laboratories))와 혼성화시켰다. 막을 루미나타 웨스턴(Luminata Western) HRP 기질(바이오-래드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘러스 소재)로 처리하고, 케미독-잇(ChemiDoc-It) 810 디지털 이미지 시스템(유브이피 인코포레이티드(UVP Inc.), 미국 캘리포니아주 업랜드 소재)을 이용하여 신호를 검출하였다.
실시예 12
면역원성 및 효능 연구에 사용된 동물
a. 기니피그 :
면역원성 연구를 성숙한 나이브 성인 수컷 및 암컷 던칸-하틀리(Duncan-Hartley) 기니피그(300 내지 350 g/BW)에서 수행하였다. 실험은 그룹당 적어도 3마리의 기니피그를 이용하였다. 던칸-하틀리 기니피그(8 내지 12주령; 코반스 리서치 라보라토리즈(Covance Research Laboratories), 미국 펜실베이니아주 덴버 소재)를 수반하는 프로토콜은 계약된 동물 시설뿐만 아니라 스폰서로서 유나이티드 바이오메디칼 인코포레이티드(United Biomedical, Inc.; UBI)에서 승인된 IACUC 신청서에 따라 수행하였다.
실시예 13
표적화된 B 세포 에피토프에 대한 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 집중된 항체 반응의 식별: 대표적인 연구
타우 275-311 영역(서열번호 19)에서 지시된 타우 펩타이드 면역원 작제물에 의해 유도된 특이적 잔기에 대한 항체 결합 부위(들)를 결정하기 위한 대표적인 미세 에피토프 맵핑 연구(표 16)에서, 이 영역(서열번호 115 및 156 내지 171)으로부터 길이를 증가시키면서 중첩되는 펩타이드를 합성하고 고상 면역흡착제로서 96-웰 미세정량판 웰 상에 개별적으로 코팅하였다. 펩타이드(웰당 0.1㎖당 0.5㎍)를 플레이트 상에 코팅한 다음, 상기 기재된 항체 ELISA 방법의 단계에 따라 100㎕ 혈청 샘플(PBS 중 1:100 희석물)을 이중으로 플레이트 웰에서 인큐베이션하였다.
서열번호 68의 타우 펩타이드 면역원 작제물에 대하여 유도된 풀링된 6 wpi 기니피그 항혈청을 2.0㎍/㎖로 이 영역으로부터의 타우 중첩 펩타이드로 코팅된 플레이트 웰에 시편 희석 완충액 중 1:100 희석으로 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 완충액으로 플레이트 웰을 세척한 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 단백질 A/G를 첨가하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 다시 PBS로 세척한 후, 450㎚에서 ELISA 플레이트 판독기로 흡광도를 측정하기 위해 웰에 기질을 첨가하고, 샘플을 이중으로 분석하였다. B 에피토프 면역원 작제물의 상응하는 긴 타우 펩타이드를 이용한 항혈청의 결합은 최대 결합을 나타낸다.
표 16에 나타낸 바와 같이, 풀링된 6 wpi 기니피그 면역 혈청은 길이에서 단지 2개의 아미노산이 상이하지만 서열번호 115가 더 긴 펩타이드인 서열번호 164 및 115를 갖는 2개의 타우 펩타이드는 이러한 과인산화 및 응집 영역으로부터 강한 타우 에피토프를 제시할 수 있는 고정밀 결합 프로파일을 나타내었다. 그러나, 풀링된 면역 혈청은 2개의 N-말단 아미노산(I297 및 K298)의 결실로 인해 서열번호 164의 펩타이드를 인식할 수 없으며, 이는 이들 2개의 아미노산이 면역우성 에피토프로서 이러한 영역을 제시하는 데 중요하다는 것을 나타낸다.
이 영역에는 면역원성 평가를 위해 301번 위치에서 프롤린의 트랜스 입체형태를 포함하는 펩타이드 면역원 작제물을 포함하여 표 12, 표 13a, 표 13b 및 표 15에 나타낸 바와 같이 면역원성 연구를 위하여 타우 펩타이드 작제물의 보다 신중한 설계가 적용되었다. 일반적으로, 이러한 과인산화 및 응집 영역에서 서열번호 128을 제외하고 서열번호 126 내지 132, 135, 136, 140 및 141의 신중하게 설계된 타우 면역원 펩타이드 작제물에서 높은 면역원성이 발견되었다.
타우 이성질체로부터 빈번하게 결실되는 N-말단 영역에 위치하는 타우의 "퍼지 코트(fuzzy coat)" 영역에 추가적인 타우 펩타이드 면역원 작제물 설계를 사용하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이 이러한 영역(서열번호 137 내지 139) 유래의 타우 펩타이드 면역원 작제물을 또한 설계하고 이의 상응하는 면역원성에 대하여 평가하였다.
표 14는 퍼지-코트 영역 유래의 타우 펩타이드 면역원 작제물이 매우 면역원성임을 나타낸다. 이러한 결과는 N-말단 퍼지-코트 영역 유래의 타우 펩타이드 면역원 작제물이, 타우 응집을 유도하는 단량체 타우 시딩의 개시에 있어서 잠재적인 감소에 추가적으로, 타우 응집을 방지하기 위한 항체를 유도하는 조성물에 혼입하는 데 유용할 수 있음을 시사한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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[표 9a]
Figure pct00012
[표 9b]
Figure pct00013
[표 9c]
Figure pct00014
[표 9d]
Figure pct00015
[표 9e]
Figure pct00016
[표 10a]
Figure pct00017
[표 10b]
Figure pct00018
[표 10c]
Figure pct00019
[표 10d]
Figure pct00020
[표 11a]
Figure pct00021
[표 11b]
Figure pct00022
[표 11c]
Figure pct00023
[표 11d]
Figure pct00024
[표 11e]
Figure pct00025
Figure pct00026
[표 13a]
Figure pct00027
[표 13b]
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
SEQUENCE LISTING <110> United Neuroscience <120> TAU PEPTIDE IMMUNOGEN CONSTRUCTS <130> WO2019/084488 <140> PCT/US2018/057840 <141> 2018-10-26 <150> US 62/578,124 <151> 2017-10-27 <160> 171 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> pTau peptide - aa145-160 (pT149/pT153) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 1 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Tau peptide - aa145-160 <400> 2 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 1 5 10 15 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> pTau peptide - aa172-189 (pT175/pT181/pS185) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> PHOSPHORYLATION <400> 3 Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu 1 5 10 15 Pro Pro <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Tau peptide - aa172-189 <400> 4 Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu 1 5 10 15 Pro Pro <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> pTau peptide - aa182-200 (pS184/pY197) <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> PHOSPHORYLATION <400> 5 Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr 1 5 10 15 Ser Ser Pro <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Tau peptide - aa182-200 <400> 6 Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr 1 5 10 15 Ser Ser Pro <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> pTau peptide - aa195-213 (pS198/pS208/pS210) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> PHOSPHORYLATION <400> 7 Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Tau peptide - aa195-213 <400> 8 Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> pTau peptide - aa 195-213 (pS199/pS202/pT205) <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> PHOSPHORYLATION <400> 9 Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> pTau peptide - aa209-224 (pT212/pS214/pT217) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> PHOSPHORYLATION <400> 10 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Tau peptide - aa209-224 <400> 11 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> pTau peptide - aa228-243 (pT231/pS235/pS238) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> PHOSPHORYLATION <400> 12 Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Tau peptide - aa228-243 <400> 13 Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> pTau peptide - aa257-274 (pS262) <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> PHOSPHORYLATION <400> 14 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Lys <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Tau peptide - aa257-274 <400> 15 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Lys <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> pTau peptide - aa379-408 (pS396/pS404) <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> PHOSPHORYLATION <400> 16 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(30) <223> Tau peptide - aa379-408 <400> 17 Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 20 25 30 <210> 18 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> pTau peptide - aa275-311 *P301->S (pS293/pS301) <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> PHOSPHORYLATION <400> 18 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Ser Gly Gly Gly Ser Val 20 25 30 Gln Ile Val Tyr Lys 35 <210> 19 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> Tau peptide - aa275-311 <400> 19 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val 20 25 30 Gln Ile Val Tyr Lys 35 <210> 20 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(33) <223> pTau peptide - aa393-425 (pS396/pS404/pS422) <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> PHOSPHORYLATION <400> 20 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10 15 Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln 20 25 30 Leu <210> 21 <211> 33 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(33) <223> Tau peptide - aa393-425 <400> 21 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 1 5 10 15 Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln 20 25 30 Leu <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 1 Th <400> 22 Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu 1 5 10 15 Leu <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF1 Th <400> 23 Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val 1 5 10 15 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Bordetella pertussis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(24) <223> Bordetella pertussis Th <400> 24 Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala 1 5 10 15 Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu 20 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Clostridium tetani 2 Th <400> 25 Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys 1 5 10 15 Thr <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> diphtheria bacilli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Diphtheria Th <400> 26 Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser 1 5 10 15 Ile Leu Pro Gly His Gly Cys 20 <210> 27 <211> 21 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Plasmodium falciparum Th <400> 27 Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe 1 5 10 15 Asn Val Val Asn Ser 20 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Schistosoma mansoni Th <400> 28 Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg 1 5 10 15 His <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Cholera Toxin <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Cholera Toxin Th <400> 29 Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser 20 25 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> MvF 2 Th <400> 30 Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile 1 5 10 15 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> KKKMvF 3 Th <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (19)..(19) <223> G or T <400> 31 Lys Lys Lys Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa 1 5 10 15 Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 20 <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 1 Th <220> <221> SITE <222> (1)..(1) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (2)..(2) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (3)..(3) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> F or K or R <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (9)..(9) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (10)..(10) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I or V or F <220> <221> SITE <222> (18)..(18) <223> D or R <400> 32 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Pro Xaa Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <400> 33 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 2 Th <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (5)..(5) <223> I or F <220> <221> SITE <222> (6)..(6) <223> T or L <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (11)..(11) <223> I or L <220> <221> SITE <222> (14)..(14) <223> P or I <220> <221> SITE <222> (15)..(15) <223> Q or T <220> <221> SITE <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (17)..(17) <223> L or I <400> 34 Lys Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Arg Ile Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Asp <210> 35 <211> 19 <212> PRT <213> Measles virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 5 Th <400> 35 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> HBsAg 3 Th <400> 36 Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr 1 5 10 15 Ile Asp <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza Matrix protein 1 _1 Th <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Influenza Matrix protein 1_1 Th <400> 37 Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Influenza Matrix protein 1_2 Th <400> 38 Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val 1 5 10 15 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> Influenza Non-structural protein 1 Th <400> 39 Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser 1 5 <210> 40 <211> 19 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> EBV BHRF1 Th <400> 40 Ala Gly Leu Thr Leu Ser Leu Leu Val Ile Cys Ser Tyr Leu Phe Ile 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Clostridium tetani TT1 Th <400> 41 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 42 <211> 20 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> EBV EBNA-1 Th <400> 42 Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu 1 5 10 15 Gln Thr His Ile 20 <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Clostridium tetani TT2 Th <400> 43 Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT3 Th <400> 44 Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe 1 5 10 15 <210> 45 <211> 16 <212> PRT <213> Clostridium tetani <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> Clostridium tetani TT4 Th <400> 45 Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys 1 5 10 15 <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> EBV CP Th <400> 46 Val Pro Gly Leu Tyr Ser Pro Cys Arg Ala Phe Phe Asn Lys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Leu <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Human cytomegalovirus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> HCMV IE1 Th <400> 47 Asp Lys Arg Glu Met Trp Met Ala Cys Ile Lys Glu Leu His 1 5 10 <210> 48 <211> 15 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> EBV GP340 Th <400> 48 Thr Gly His Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> EBV BPLF1 Th <400> 49 Lys Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Glu Lys Lys Leu Arg Gln 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Epstein-Barr virus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> EBV EBNA-2 Th <400> 50 Thr Val Phe Tyr Asn Ile Pro Pro Met Pro Leu 1 5 10 <210> 51 <211> 39 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(39) <223> pTau 145-P160 (pT149/pT153) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> PHOSPHORYLATION <400> 51 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr 20 25 30 Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 35 <210> 52 <211> 39 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(39) <223> Tau 145-160 <400> 52 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr 20 25 30 Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 35 <210> 53 <211> 41 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(41) <223> pTau 172-189 (pT175/pT181/pS185) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> PHOSPHORYLATION <400> 53 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys 20 25 30 Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro 35 40 <210> 54 <211> 41 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(41) <223> Tau 172-189 <400> 54 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys 20 25 30 Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro 35 40 <210> 55 <211> 42 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(42) <223> pTau 182-200 (pS184/pY197) <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> PHOSPHORYLATION <400> 55 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 20 25 30 Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro 35 40 <210> 56 <211> 42 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(42) <223> Tau 182-200 <400> 56 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 20 25 30 Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro 35 40 <210> 57 <211> 42 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(42) <223> pTau 195-213 (pS199/pS202/pT205) <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> PHOSPHORYLATION <400> 57 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro 35 40 <210> 58 <211> 42 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(42) <223> Tau 195-213 <400> 58 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro 35 40 <210> 59 <211> 42 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(42) <223> pTau 195-213 (pS198/pS208/pS210) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (37)..(37) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> PHOSPHORYLATION <400> 59 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro 35 40 <210> 60 <211> 39 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(39) <223> pTau 209-224 (pT212/pS214/pT217) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> PHOSPHORYLATION <400> 60 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Arg Ser Arg Thr Pro Thr Pro Gly Ser 20 25 30 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 35 <210> 61 <211> 39 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(39) <223> Tau 209-224 <400> 61 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Arg Ser Arg Thr Pro Thr Pro Gly Ser 20 25 30 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu 35 <210> 62 <211> 39 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(39) <223> pTau 228-243 (pT231/pS235/pS238) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> PHOSPHORYLATION <400> 62 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu 35 <210> 63 <211> 39 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(39) <223> Tau 228-243 <400> 63 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu 35 <210> 64 <211> 41 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(41) <223> pTau 257-274 (pS262) <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> PHOSPHORYLATION <400> 64 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn 20 25 30 Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys 35 40 <210> 65 <211> 41 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(41) <223> Tau 257-274 <400> 65 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn 20 25 30 Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys 35 40 <210> 66 <211> 53 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(53) <223> pTau 379-408 (pS396/pS404) <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> PHOSPHORYLATION <400> 66 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp 20 25 30 His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr 35 40 45 Ser Pro Arg His Leu 50 <210> 67 <211> 53 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(53) <223> Tau 379-408 <400> 67 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp 20 25 30 His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr 35 40 45 Ser Pro Arg His Leu 50 <210> 68 <211> 60 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(60) <223> pTau 275-311 (*P301->S301; pS293/pS301) <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> PHOSPHORYLATION <400> 68 Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp 20 25 30 Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His 35 40 45 Val Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 50 55 60 <210> 69 <211> 60 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(60) <223> Tau 275-311 <400> 69 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp 20 25 30 Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His 35 40 45 Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 50 55 60 <210> 70 <211> 56 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(56) <223> pTau 393-425 (pS396/pS404/pS422) <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> PHOSPHORYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> PHOSPHORYLATION <400> 70 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly 20 25 30 Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile 35 40 45 Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu 50 55 <210> 71 <211> 56 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(56) <223> Tau 393-425 <400> 71 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly 20 25 30 Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile 35 40 45 Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu 50 55 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Tau peptide, L215-V226 <400> 72 Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val 1 5 10 <210> 73 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> Tau peptide, T205-V226 <400> 73 Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10 15 Arg Glu Pro Lys Lys Val 20 <210> 74 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> Tau peptide, S195-V226 <400> 74 Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser 1 5 10 15 Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val 20 25 30 <210> 75 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> Tau peptide, S185-V226 <400> 75 Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro 1 5 10 15 Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro 20 25 30 Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val 35 40 <210> 76 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(52) <223> Tau peptide, T175-V226 <400> 76 Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys 1 5 10 15 Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro 20 25 30 Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu 35 40 45 Pro Lys Lys Val 50 <210> 77 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(62) <223> Tau peptide, Q165-V226 <400> 77 Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys 1 5 10 15 Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr 35 40 45 Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val 50 55 60 <210> 78 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(72) <223> Tau peptide, R155-V226 <400> 78 Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg 1 5 10 15 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 20 25 30 Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 35 40 45 Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 50 55 60 Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val 65 70 <210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Tau peptide, V287-K298 <400> 79 Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 1 5 10 <210> 80 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> Tau peptide, I277-K298 <400> 80 Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Lys Asp Asn Ile Lys 20 <210> 81 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> Tau peptide, K267-K298 <400> 81 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu 1 5 10 15 Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 20 25 30 <210> 82 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> Tau peptide, K257-K298 <400> 82 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 20 25 30 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 35 40 <210> 83 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(52) <223> Tau peptide, P247-K298 <400> 83 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 1 5 10 15 Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile 20 25 30 Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys 35 40 45 Asp Asn Ile Lys 50 <210> 84 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(62) <223> Tau peptide, S237-K298 <400> 84 Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp 1 5 10 15 Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His 20 25 30 Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu 35 40 45 Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 50 55 60 <210> 85 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(72) <223> Tau peptide, A227-K298 <400> 85 Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg 1 5 10 15 Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser 20 25 30 Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys 35 40 45 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 50 55 60 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 65 70 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Tau peptide, N359-K370 <400> 86 Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 1 5 10 <210> 87 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> Tau peptide, R349-K370 <400> 87 Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Lys Lys 20 <210> 88 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> Tau peptide, V339-K370 <400> 88 Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile 1 5 10 15 Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 20 25 30 <210> 89 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> Tau peptide, H329-K370 <400> 89 His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile 20 25 30 Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 35 40 <210> 90 <211> 52 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(52) <223> Tau peptide, T319-K370 <400> 90 Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val 20 25 30 Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly 35 40 45 Gly Asn Lys Lys 50 <210> 91 <211> 62 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(62) <223> Tau peptide, V309-K370 <400> 91 Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser 1 5 10 15 Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys 20 25 30 Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser 35 40 45 Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 50 55 60 <210> 92 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(72) <223> Tau peptide, H299-K370 <400> 92 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp 1 5 10 15 Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His 20 25 30 Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe 35 40 45 Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His 50 55 60 Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 65 70 <210> 93 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Tau peptide, E431-L441 <400> 93 Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 1 5 10 <210> 94 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Tau peptide, D421-L441 <400> 94 Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu 1 5 10 15 Ala Lys Gln Gly Leu 20 <210> 95 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> Tau peptide, V411-L441 <400> 95 Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala 1 5 10 15 Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 20 25 30 <210> 96 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(41) <223> Tau peptide, G401-L441 <400> 96 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 35 40 <210> 97 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(51) <223> Tau peptide, E391-L441 <400> 97 Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg 1 5 10 15 His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser 20 25 30 Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys 35 40 45 Gln Gly Leu 50 <210> 98 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(61) <223> Tau peptide, N381-L441 <400> 98 Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser 1 5 10 15 Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser 20 25 30 Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu 35 40 45 Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 50 55 60 <210> 99 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(71) <223> Tau peptide, I371-L441 <400> 99 Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr 1 5 10 15 Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp 20 25 30 Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp 35 40 45 Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala 50 55 60 Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 65 70 <210> 100 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(441) <223> Tau isoform with 4R and 2N (GenBank: AGF19246.1) <400> 100 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 101 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Tau peptide - aa131-141 <400> 101 Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys 1 5 10 <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Tau peptide - aa241-257 <400> 102 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 1 5 10 15 Lys <210> 103 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Tau peptide - aa243-259 <400> 103 Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser 1 5 10 15 Lys <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> Tau peptide - aa275-281 <400> 104 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys 1 5 <210> 105 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> Tau peptide - aa281-294 <400> 105 Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys 1 5 10 <210> 106 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(20) <223> Tau peptide - aa275-294 <400> 106 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser Lys 20 <210> 107 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Tau peptide - aa294-311 <400> 107 Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val 1 5 10 15 Tyr Lys <210> 108 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Tau peptide - aa294-311, P301 to S301 <400> 108 Lys Asp Asn Ile Lys His Val Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val 1 5 10 15 Tyr Lys <210> 109 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(18) <223> Tau peptide - aa294-311, p301 trans <400> 109 Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val 1 5 10 15 Tyr Lys <210> 110 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(37) <223> Tau peptide - aa275-311, p301 trans <400> 110 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val 20 25 30 Gln Ile Val Tyr Lys 35 <210> 111 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Tau peptide - aa297-311, p301 trans <400> 111 Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Tau peptide - aa22-34 <400> 112 Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp 1 5 10 <210> 113 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Tau peptide - aa18-34 <400> 113 Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln 1 5 10 15 Asp <210> 114 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Tau peptide - aa22-38 <400> 114 Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly 1 5 10 15 Asp <210> 115 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Tau peptide - aa297-311 <400> 115 Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 116 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(12) <223> Tau peptide - aa359-370 <400> 116 Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 1 5 10 <210> 117 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> Tau peptide - aa349-370 <400> 117 Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asn Lys Lys 20 <210> 118 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(32) <223> Tau peptide - aa339-370 <400> 118 Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile 1 5 10 15 Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 20 25 30 <210> 119 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(42) <223> Tau peptide - aa329-370 <400> 119 His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile 20 25 30 Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 35 40 <210> 120 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Tau peptide - aa329-349 <400> 120 His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu 1 5 10 15 Asp Phe Lys Asp Arg 20 <210> 121 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> Tau peptide - aa1-40 <400> 121 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp 35 40 <210> 122 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> Tau peptide - aa11-50 <400> 122 Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln 1 5 10 15 Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly 20 25 30 Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln Thr 35 40 <210> 123 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Tau peptide - aa1-34 <400> 123 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp <210> 124 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> Tau peptide - aa1-22 <400> 124 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp 20 <210> 125 <211> 34 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(34) <223> Tau S131-K141 <400> 125 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp 20 25 30 Lys Lys <210> 126 <211> 40 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(40) <223> Tau S241-K257 <400> 126 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro 20 25 30 Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys 35 40 <210> 127 <211> 40 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(40) <223> Tau L243-K259 <400> 127 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro 20 25 30 Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys 35 40 <210> 128 <211> 30 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(30) <223> Tau V275-K281 <400> 128 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys 20 25 30 <210> 129 <211> 37 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(37) <223> Tau K281-K294 <400> 129 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser 20 25 30 Lys Cys Gly Ser Lys 35 <210> 130 <211> 43 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(43) <223> Tau V275-K294 <400> 130 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp 20 25 30 Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys 35 40 <210> 131 <211> 41 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(41) <223> Tau K294-K311 <400> 131 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 35 40 <210> 132 <211> 41 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(41) <223> Tau K294-K311, P301 to S301 <400> 132 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Lys Asp Asn Ile Lys His Val Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 35 40 <210> 133 <211> 41 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(41) <223> Tau K257-K274 <400> 133 Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn 20 25 30 Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys 35 40 <210> 134 <211> 53 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF 4 Th (UBITh3) <220> <221> SITE <222> (4)..(4) <223> S or T <220> <221> SITE <222> (7)..(7) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (8)..(8) <223> G or T <220> <221> SITE <222> (12)..(12) <223> H or T <220> <221> SITE <222> (13)..(13) <223> K or R <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE 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epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(60) <223> Tau V275-K311, p301 trans <400> 136 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp 20 25 30 Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His 35 40 45 Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 50 55 60 <210> 137 <211> 36 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(36) <223> Tau D22-D34 <400> 137 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr 20 25 30 Met His Gln Asp 35 <210> 138 <211> 40 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(40) <223> Tau Y18-D34 <400> 138 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln 20 25 30 Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp 35 40 <210> 139 <211> 40 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(40) <223> Tau D22-D38 <400> 139 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr 20 25 30 Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp 35 40 <210> 140 <211> 38 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> 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Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser 20 25 30 Val Gln Ile Val Tyr Lys 35 <210> 143 <211> 35 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (21)..(35) <223> Tau I297-K311 <400> 143 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile 20 25 30 Val Tyr Lys 35 <210> 144 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(38) <223> Tau I297-K311 <400> 144 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser 20 25 30 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Ile Thr His Val 35 40 45 Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys 50 55 <210> 150 <211> 65 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(65) <223> Tau H329-K370 <400> 150 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val 20 25 30 Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys 35 40 45 Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys 50 55 60 Lys 65 <210> 151 <211> 44 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> MvF5 Th (UBITh1) <220> <221> SITE <222> (20)..(20) <223> epsilon-K <220> <221> PEPTIDE <222> (20)..(23) <223> epsilon K-KKK as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (24)..(44) <223> Tau H329-R349 <400> 151 Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr 1 5 10 15 Ile Leu Phe Lys Lys Lys Lys His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val 20 25 30 Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg 35 40 <210> 152 <211> 63 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> Tau M1-D40 <220> <221> SITE <222> (41)..(41) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (41)..(44) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (45)..(63) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 152 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr 35 40 45 Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 60 <210> 153 <211> 63 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(40) <223> Tau M11-T50 <220> <221> SITE <222> (41)..(41) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (41)..(44) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (45)..(63) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 153 Met Glu Asp His Ala Gly Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln 1 5 10 15 Gly Gly Tyr Thr Met His Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly 20 25 30 Leu Lys Glu Ser Pro Leu Gln Thr Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr 35 40 45 Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 60 <210> 154 <211> 57 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(34) <223> Tau M1-D34 <220> <221> SITE <222> (35)..(35) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (35)..(38) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (39)..(57) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 154 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile 35 40 45 Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 50 55 <210> 155 <211> 45 <212> PRT <213> Synthetic peptide <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(22) <223> Tau M1-D22 <220> <221> SITE <222> (23)..(23) <223> epsilon K <220> <221> PEPTIDE <222> (23)..(26) <223> KKK-epsilon K as a spacer <220> <221> PEPTIDE <222> (27)..(45) <223> MvF5 Th (UBITh1) <400> 155 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Lys Lys Lys Lys Ile Ser Ile Thr Glu Ile 20 25 30 Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe 35 40 45 <210> 156 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> Tau peptide - aa281-311 <400> 156 Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn 1 5 10 15 Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 20 25 30 <210> 157 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(29) <223> Tau peptide - aa283-311 <400> 157 Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys 1 5 10 15 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 20 25 <210> 158 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Tau peptide - aa285-311 <400> 158 Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 20 25 <210> 159 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(25) <223> Tau peptide - aa287-311 <400> 159 Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 20 25 <210> 160 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Tau peptide - aa289-311 <400> 160 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 20 <210> 161 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> Tau peptide - aa291-311 <400> 161 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val 1 5 10 15 Gln Ile Val Tyr Lys 20 <210> 162 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Tau peptide - aa293-311 <400> 162 Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile 1 5 10 15 Val Tyr Lys <210> 163 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> Tau peptide - aa295-311 <400> 163 Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr 1 5 10 15 Lys <210> 164 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> Tau peptide - aa299-311 <400> 164 His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 1 5 10 <210> 165 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Tau peptide - aa301-311 <400> 165 Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys 1 5 10 <210> 166 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(31) <223> Tau peptide - aa275-305 <400> 166 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 167 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(27) <223> Tau peptide - aa275-301 <400> 167 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro 20 25 <210> 168 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(23) <223> Tau peptide - aa275-297 <400> 168 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile 20 <210> 169 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(19) <223> Tau peptide - aa275-293 <400> 169 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys 1 5 10 15 Cys Gly Ser <210> 170 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> Tau peptide - aa275-289 <400> 170 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser 1 5 10 15 <210> 171 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> Tau peptide - aa275-285 <400> 171 Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser 1 5 10

Claims (17)

  1. 하기 화학식으로 표현될 수 있는, 타우 펩타이드 면역원 작제물:
    (Th)m-(A)n-(타우 단편)-X
    또는
    (타우 단편)-(A)n-(Th)m-X
    (여기서
    Th는 이종성 T 헬퍼 에피토프이고;
    A는 이종성 스페이서이며;
    (타우 단편)은 서열번호 100의 전장 타우 단백질 유래의 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프이고;
    X는 아미노산의 α-COOH 또는 α-CONH2이며;
    m은 1 내지 약 4이고;
    n은 0 내지 약 10임).
  2. 제1항에 있어서, 상기 타우 단편은 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Th 에피토프는 서열번호 22 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  5. 타우 펩타이드 면역원 작제물로서,
    서열번호 100의 전장 타우 단백질 서열 유래의 약 15 내지 약 40개의 아미노산 잔기를 갖는 B 세포 에피토프;
    서열번호 22 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 T 헬퍼 에피토프; 및
    아미노산, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (α, ε-N)Lys, 및 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102)로 이루어진 군으로부터 선택되는 선택적인 이종성 스페이서를 포함하되,
    상기 B 세포 에피토프는 직접적으로 또는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 T 헬퍼 에피토프에 공유적으로 연결되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 B 세포 에피토프는 서열번호 1 내지 21 및 101 내지 124로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 서열번호 22 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 선택적인 이종성 스페이서는 (α, ε-N)Lys, 또는 ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(서열번호 102)인, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  9. 제5항에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  10. 제5항에 있어서, 상기 T 헬퍼 에피토프는 선택적인 이종성 스페이서를 통해 B 세포 에피토프의 아미노 말단에 공유적으로 연결되는, 타우 펩타이드 면역원 작제물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 따른 펩타이드 면역원 작제물을 포함하는 조성물.
  12. 약제학적 조성물로서,
    a. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 따른 펩타이드 면역원 작제물; 및
    b. 약제학적으로 허용 가능한 전달 비히클 및/또는 아쥬반트
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    a. 상기 타우 펩타이드 면역원 작제물은 서열번호 51 내지 71 및 125 내지 155로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    b. 상기 타우 펩타이드 면역원 작제물은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)와 혼합되어 안정화된 면역자극성 복합체를 형성하는 것인,
    약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나에 따른 타우 펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 타우 펩타이드 면역원 작제물에 결합된, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나에 따른 타우 펩타이드 면역원 작제물의 B 세포 에피토프에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 하나에 따른 단리된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 포함하는, 조성물.
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