KR20140067024A

KR20140067024A - 체외 수정의 성공을 예측하는 새로운 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20140067024A
Application number: KR1020147006102A
Authority: KR
Inventors: 더르크 잔 콕; 요셉 스테파너스 엘리자베스 라벤; 델샤드 마마 마그디드; 니콜 기어트제 마리아 베커스
Original assignee: 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2014-06-03
Also published as: JP2014522669A; SI2742359T1; BR112014003272B1; US20140322715A1; ES2669562T3; NO2742359T3; BR112014003272A2; EA201490219A1; CA2844637A1; CA2844637C; DK2742359T3; PL2742359T3; TR201806889T4; EP2742359A1; AU2011375025B2; AU2011375025A1; CN103930786A; HRP20180790T1; CN103930786B; WO2013025095A1

Abstract

본 발명은, 피험자의 샘플, 바람직하게는 소변 샘플, 내 박테리아 총량에 대한 락토바실러스 및 스타필로코커스의 존재를 사용하는 식으로 지시되는 비율, 상기 비율에 기반하여 성공 임신 가능성을 결정하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명의 방법을 수행하고 결과를 출력하기 위하여, 키트, 바람직하게는 qPCR 키트가 본 발명에 포함된다. 그러한 방법 및 키트는, IVF 또는 ICSI와 같은 인공 수정 방법에 자격이 있거나 경험이 있는 피험자 내 성공적인 임신 가능성을 예측하는데 특히 이점이 있다.

Description

체외 수정의 성공을 예측하는 새로운 방법 및 키트{NEW METHOD AND KIT FOR PREDICTION SUCCESS OF IN VITRO FERTILIZATION}

본 발명은 인간 생식의 분야, 더욱 특별히 인간 생식이 실패한 상황에 관한 것이다. 그런 경우에, 인공적인 방법은 임신 하는데 있어서 여성을 지원하기에 적절하지만, 이러한 치료의 성공은 낮고, 더 중요하게는, 예측할 수 없다. 본 발명은 체외 수정에서의 성공 가능성을 예측하기 위하여 더 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다.

배란 저하(Sub-fertility)는 서구에서 커플들의 10 내지 15%에 영향을 준다. 이러한 배란 저하는, 절반은 여성의 원인, 20 내지 26 %는 남성의 원인, 및 25 내지 30%는 알려지지 않은 원인(Evers, J.L., 2002, Lancet 360:151-159)의 탓일 수 있다. 많은 커플들은 아이를 얻기 위하여 체외 수정 (in vitro fertilization: IVF) 또는 세포질 내 정자 삽입 (intra-cytoplasmatic sperm injection: ICSI)에 의지한다. 이러한 기술들의 성공 확률은 시작된 발동된 사이클 당 대략 25%이다. (Andersen, A. et al. 2007, Hum. Reprod. 22:1513-1525) 만약 이러한 성공률이 개선될 수 있다면 매우 감동적이고 경제적인 이점이 있을 것이다. 지원되는 임신 치료의 개인적이고 사회적인 부담의 관점에서, 자발적인 임신의 높은 가능성을 갖는 커플들과 매우 낮은 성공 가능성을 갖는 커플들을 확인하는 것이 바람직하다. 특히 불임의 원인이 알려지지 않은 커플들은, 자발적인 임신의 높은 확률을 나타내며, 기대요법 (expectant management)이 이들에게 바람직하다. (Brandes, M. et al., 2011, Hum. Reprod. 26:360-368) 그러므로 치료 개선하고, 개별적 경우에 진행여부를 결정하는 둘 모두를 위해서, 여성이 IVF/ICSI 이후에 임신하고 정상 출산할지 정확하게 예측할 수 있는 모델이 필요하다. 10년 이상 동안 모델들은, 연령, 이전에 실패한 IVF 시도들의 숫자, 및 불임에 개연적 원인을 포함하는 임상적인 데이터에 기반하여 정상 출산의 가능성을 예측하는 것이 이용되어 왔다(Templeton, W. et al., 1996, Lancet 348:1402-1406). 큰 집단에서, 예상되는 정상 출산에 대하여 관찰되는 정상 출산의 비율은 40 내지 60% 였다(Nelson, S.M. and Lawlor D.A. 2011, PLOS Medicine 8:1-10). 이들 저자들은, 연령상 더 많은 계층 및 불임의 원인을 이용하여, 1400,000 이상의 여성으로부터의 데이터에 기반하여 개선된 모델을 발전시켰고, 그 과정에서 난자의 원천(source)과 아이를 원하는 기간이 이용되었다. 새로운 모델의 보고자 조작 곡선의 아래 면적(AUROC)이 이러한 새로운 모델 기능을 얼마나 좋은지에 사용될 때, 작지만 중요한 증가가 보고되었다(0.6184 에서 0.6335). 이 모델은 더 큰 여성 그룹(100,000 이상)에서 좋은 예측을 나타내는 것으로 생각된다. 하지만 여전히 이러한 모델이 개인적인 기반에 근거한 예측에서 얼마나 좋은지는 알려져 있지 않다.

정산 출산의 경로는 3 가지 중요한 단계로 축소될 수 있는데, 난자의 수정, 여성 환경에 의한 수정된 난자의 수용 및 실제 출산까지 발생이다. 첫 번째 단계는 인공적으로(IVF 및 ICSI와 같은) 이뤄질 수 있을 때, 출산에 도달하는 가능성은 두 번째 단계에서 마커에 의해 설명될 수 있다. 하지만 수정된 난자의 수용을 담당하는 요인들은 실질적으로 알려져 있지 않다. 따라서 현재로서는 이러한 두 번째 단계에서의 성공을 예측하는 기준들을 설립하는 것이 불가능하다.

그러므로, 개인적인 기준에서 성공적인 IVF/ICSI 치료상 가능성을 신뢰할 수 있게 예측할 수 있는 모델이 여전히 필요하다.

개인적인 기준에서 성공적인 (또는 비성공적인) IVF/ICSI 치료상 가능성에의 예측 가능성을 75 내지 100%로 증가시키도록 발전시킬 수 있는 모델이 발견되었다.

본 발명은, 피험자 내 성공적인 임신 가능성을 예측하는 방법으로서,

a) 소변 샘플을 얻는 단계;

b) 상기 샘플 내 존재하는 박테리아 총량에 대한 퍼센트로서 박테리아 종 락토바실러스 (Lactobacillus) 및 스타필로코커스 (Staphylococcus)의 양을 결정하는 단계; 및

c) 상기 박테리아 사이의 비율에 기반하여 성공적인 임신 가능성을 예측하는 단계;를 포함하는 방법을 포함한다.

바람직하게는, 상기 방법에서 피험자는 IVF 또는 ICSI와 같은 인공 수정 방법에 자격이 있거나 또는 경험이 있다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 락토바실러스 종은 락토바실러스 크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 이고, 스타필로코커스 종은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 이다.

더 바람직하게는, 박테리아 양의 측정은 PCR, 더 바람직하게는 qPCR에 의해 수행되며, 그 다음에 스타필로코커스는 바람직하게는 프라이머 5'-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3' 및 5'-GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3' 를 사용하여 결정되고, 락토바실러스는 바람직하게는 프라이머 5'- GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3' 및 5'- AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3' 를 사용하여 결정된다.

대체적으로 (alternatively), 박테리아 양의 측정은 질량 분석, 더 바람직하게는 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 수행된다.

본 발명에 따르는 방법에서 더 구체적으로는, 성공적인 임신 가능성은 다음의 식에 의해 결정된다:

Y = a* (% 락토바실러스) - b* (% 스타필로코커스) - c

이 식에서

a는 0.025 내지 0.051의 값을 가지며,

b는 0.04 내지 0.07의 값을 가지며,

c는 -1.10 내지 -0.66의 값을 가지며;

% 락토바실러스는, 박테리아 총량의 퍼센트로서 표현되는 락토바실러스 박테리아의 양이며;

% 스타필로코커스는, 박테리아 총량의 퍼센트로서 표현되는 스타필로코커스의 양이며; 및

이 식에서, Y는 성공 가능성을 나타낸다.

바람직하게는 이 식에서 a 는 0.025 내지 0.04의 값을 가지며, 또한 바람직하게는 b는 0.04 내지 0.06의 값을 가지며, 및 더 바람직하게는 c는 1.06 내지 -0.9, 더 바람직하게는 -1.06 내지 -1.01의 값을 갖는다.

박테리아가 검출되는 샘플은 소변 샘플일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아는 중간뇨 소변 샘플(mid-stream urine sample) 에서 검출되는 반면, 샘플은 또한 질 도말 표본(vaginal smear)과 같은, 질 샘플이 될 수도 있다.

본 발명은 또한, 성공적인 임신 가능성의 예측을 위한 키트로서,

a. 피험자로부터의 샘플 내 박테리아의 총 함량을 측정하는 수단;

b. 락토바실러스 박테리아의 함량을 측정하는 수단;

c. 스타필로코커스 박테리아의 함량을 측정하는 수단;

d. 위에서 정의된 식에 따라서 가능성을 계산하는 수단을 포함하는, 키트를 포함한다.

바람직하게는, 이러한 키트에서 락토바실러스 박테리아의 함량을 측정하는 수단은 프라이머 5'- GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3' 및 5'- AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3'를 포함하는 반면, 스타필로코커스 박테리아의 함량을 측정하는 수단은 프라이머 5'-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3' 및 5'-GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3' 를 포함한다. 또한 바람직하게는 이러한 키트에서 피험자로부터의 샘플 내 박테리아 총 함량을 측정하는 수단은, 박테리아의 16s rDNS에 특이적인 일반 프라이머 세트를 포함하며, 더 바람직하게는 상기 일반 프라이머 세트는, 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 EUB 프라이머를 포함한다.

또 바람직하게는 상기 키트에서 가능성을 계산하는 수단은, 측정된 박테리아의 값을 입력장치로 받을 수 있는 프로세스를 포함하며, 이는 위에서 정의된 바와 같은 식에 따라서 가능성을 계산하며, 바람직하게는 이런 프로세스는 키트를 사용하여 사람에 의해 읽힐 수 있는 신호적 수단으로 그 가능성을 출력할 수 있다.

다음의 기술 및 실시예들에서 많은 용어들이 사용된다. 그러한 용어들에 부여된 범위를 포함하여, 명세서 및 청구항의 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위하여, 다음의 정의들이 제공된다. 본원에서 정의되지 않는다면, 사용되는 모든 기술적 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 일반적인 기술자 중 하나에 의해 보통으로 이해될 수 있는 의미와 같은 의미를 갖는다.

'IVF' 또는 체외 수정은 여성의 난소로부터의 난자가 제거되는 과정이다. 이들은 실험실 과정에서 정자와 수정되고, 그 다음에 수정된 난자 (태아)는 여성의 자궁으로 되돌아간다.

‘ICSI'는 세포질 내 정자 삽입, 테스트-튜브 수정 과정을 나타내며, 수정되도록 난자 내로 직접적으로 정자가 삽입된다. ICSI는 주로 남성 불임에서 행하여지며, IVF 과정의 일부로 수행될 수 있다.

‘중간뇨 소변'은, 요도 개구가 조심스럽게 깨끗이 된 후에(흘러간 소변에 의해서), 소변줄기의 중간 동안에 수집되는 소변 표본으로서 본원에서 정의된다. 중간뇨 소변 샘플은 또한 ‘클린 패치 표본(clean catch specimen)' 라고도 불린다.

‘요감염증 (urinary tract infection: UTI)'은 요로의 일부에 영향을 미치는 박테리아성 감염이다. 증상은 자주 감각적이고 및/또는 소변이 필요하고, 배뇨 시 통증, 및 뿌연 소변을 포함한다.

‘16s DNA'는 RNA의 타입을 코딩하는 세포 핵의 인 내부의 DNA이며 이어서 단백질 사슬로 메신저 RNA의 번역이 일어나는 리보솜의 구성요소를 형성한다. 다른 유기체들의 리보솜 RNA의 유전자 서열 비교는 유기체들 사이의 진화적 관계를 결정하는데 사용되어왔다.

자궁 내에 수정된 난자의 착상(settlement)의 성공을 예측하는 요인들 중 하나는 여성의 비뇨생식기 (uro-genital)영역 내 박테리아 개체군의 구성에 의해 형성된다는 것이 현재 발견되었다. 박테리아 개체군의 구성 (장 내 또는 질 내와 같은)은 이들의 직접적인 환경을 반영하고 이러한 구성은 환경의 변화에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 모든 인간 개체군에 걸쳐서 위 내에 박테리아는 우리가 마주치는 박테리아의 다양한 종의 임의적인 수집에는 없다는 것이 명백하다. 이들은 숙주에 의해 제공되는 환경과 동적 평형 내에 있는 개체군과 구별된다(De Filippo, C. et al., 2010, PNAS 107:14691-14696). 인간 장은, 인간 장 세포가 부족한 능력을 수여하는 것으로서 적합하다고 여겨지고 숙주의 음식에 반응하는 박테리아를 품는다(De Filippo, C. et al., 2010, PNAS 107:14691-14696). 음식에서의 변화는 실제로는 박테리아 생존 환경의 화학적 구성의 변화이다. 위 미소생물(microbiota)의 구성에 영향을 미칠 다른 환경적 요인들은 (면역) 방어 시스템, 세포 표면 특성들 및 이들이 거주하는 적소의 물리적 특성과 같은 숙주 요인들을 포함한다(Backhed, F. et al., 2005, Science 307:1915-1920).

비뇨생식기관에서의 일 실시예는 질 상태가 변할 때 일어나는 질의 박테리아 개체군에서의 변화이다. 일반적으로, 질은 1 내지 6 박테리아 종들로 구성되는 개체군이 선호하고 락토바실러스 종이 우세한 낮은 pH 환경을 제공한다(Fredricks, D.N. et al., 2005, New Eng. J. Med., 353:1899-1911). 락토바실리(Lactobacilli)는 낮은 pH를 유지하고 추가적으로 다른 박테리아에 대하여 그들의 적소를 적극적으로 방어한다. 박테리아성 질염을 갖는 여성에서, pH는 더 높고, 질 박테리아 개체군은 17종 이상으로 증가되며, 병원성 박테리아에 유리하게 락토바실리의 존재는 크게 감소된다. 박테리아 개체군 구성에서의 이러한 변화의 시작은 락토바실러스 종의 감소 또는 다른 박테리아의 침입 중 하나일 수 있다. 하지만, 연속성은 락토바실러스 종의 감소, pH의 증가, 및 새로운 상황에 번식하는 스타필로코커스와 같은 종들의 증가, 사이에서의 균형을 변화시킬 것이다. 이러한 변화가 질염의 징후에 선행하는지 아닌지 확립될 것이 남아있다.

박테리아 개체군이 특이적인 상황을 예측하는데 사용될 수 있다는 암시는, 박테리아 개체군이 16s rDNA 분석 넓은-스펙트럼으로 조사되는 요도염을 가진 사람 및 갖지 않은 사람을 대상으로 하는 작은 연구에서 발견되었다.(Riemersma, W.A. et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41:1977-1986) 지금까지 알려지지 않은 3개 박테리아의 존재는 요도염이 없는 것과 관련되었다.

본 발명을 발생시킨 연구에서, 발명자들은 기본적으로 두 가지 질문을 던졌다: 여성의 소변 박테리아 개체군이, 임신하기 위한 IVF 또는 ICSI에 여성이 적합한 내부 환경인지 아닌지 정보를 갖는지, 그리고 박테리아 개체군이 요로 감염증에 대한 변화된 위험성에 관련이 있는지? 첫 번째 목적 뒤의 아이디어는 IVF 또는 ICSI의 성공의 첫 단계가, 난자가 둥지를 틀어야만 하는 기간 동안에 여성의 내부 환경에 의한, 외래 물질, 수정된 난자의 수용이라는 것이다. 이러한 내부 환경은 호르몬의 조절 하에 있을 것이다. 이러한 조절의 본질은 완전히 알려지지는 않았지만 자궁의 상태에 영향을 미칠 뿐 아니라 요로와 같은 신체 어딘가의 상태에 영향을 미칠 수도 있다. 그로 인하여 이는 요로 내의, 거주 박테리아 개체군, 외래 물질의 수용에 영향을 미친다. 이러한 아이디어에 기반하여 두 가지 가설들이 연구를 추진하며 형성되었다: 첫 번째는, 여성 내 박테리아 개체군이 수정된 난자가 얼마나 잘 수용될 것인지를 나타낸다는 것이며, 두 번째는 소변 내 박테리아 개체군은 여성이 임신을 하였을 때 여성 내 일어나는 환경적 변화에 반응할 것이라는 것이다. 임신동안 요로는 요도 및 신우의 팽창과 같은 해부학적 변화를 겪으며, 요 정체(urinary stasis) 및 방광의 이동은 방광 평활근 및 화학적 변화(소변 pH, 소변 삼투압, 당뇨 및 아미노산뇨(aminociduria) 와 관계가 있다. 이러한 변화된 상태들은 거주 박테리아보다는 다른 박테리아 타입에 더 알맞은 것으로 기대될 수 있다. 거주 박테리아는 또한 연구에서 요로 그 자체의 내부적 문제(감염증)의 원인이 될 수 있기 때문에 또한 소변 내 박테리아 개체군 구성 사이의 관계 및 요감염증이 조사되었다.

이 연구에서, 박테리아 종/계통 5 가지의 핵심 군이 테스트받은 모든 환경 하에서 발견되었다(임신, 임신이 아닌, IVF/ICSI 이후에 임신이 아닌). 락토바실러스 크리스파투스 및 스타필로코커스 아우레우스는 모든 샘플의 대다수 내에 존재한 반면, 대장균(E. coli), 스프렙토미세스 속(Streptomyces sp.) 및 비배양 박테리움 추출물 CH96Fc_H10 (uncultured bacterium isolate CH96Fc_H10)은 소수의 샘플 내에서 발견되었다. 모든 여성에서, 총 개체군의 70% 이상은, 총 개체군의 10% 이상으로 개별적으로 존재하는 최대 4개 타입들로 구성된다. 이는 언급된 박테리아 종 5개에 더하여 다른 타입의 최종후보를 더한 것을 포함하였다(표 5 참고). 박테리아 타입의 많은 항목들은 하나 또는 소수의 샘플들 내에서 작은 퍼센트로 발견되었다(표 3 참고).

모든 우리의 테스트 상태하에서 여성 내에서 발견되는 5개 박테리아 종들의 핵심군은 외부 풀로부터 요로를 침입할 높은 가능성을 가지는 종들을 나타낼 수 있으며, 이는 요로 내 상태에 더 잘 적응하거나 숙주에 의해 더 잘 수용된다. 두 번째 군은 빈번하게 발견되는 종들로 구성되지만, 이는 개별적인 여성 내에서 장시간 지속할 수 있으며, 우세한 종이 될 수도 있다. 이들 종들이 더 자주 발견되지 않는 이유는 이들 박테리아의 외부 풀로 요로의 노출은 모든 여성에게 동일하지 않거나, 특이적인 숙주 요인들이 여성들의 작은 집합 내에서만 오직 존재하게 하는 것 일 수 있다. 하나의 단일 샘플에서만 발견되는 수많은 종들은 요로 내에서 잘 생존하기 어려우므로- 합격을 나타낼 수 있다.

연구로부터 결론 내릴 수 있는 것은 여성이 임신할 때 요로 내 박테리아 개체군의 조성이 극적으로 변한다는 점이다. 임신 전에 박테리아 개체군은 다양한 락토바실러스 계통이 우세하다(주로 L.크리스파투스). 임신 동안 락토바실러스는 다른 박테리아, 주로 스타필로코커스 아우레우스에 의해 대체되며, 이는 종종 우세한 종이 되기도 한다. 이러한 변화는 여성이 경험한 절차에 기인한 것이 아니라, IVF/ICSI 를 경험했지만 임신하지 않은 여성 내에서는 일어나지 않기 때문이다.

물론, 임신을 판단하는 더 쉬운 방법들이 있기 때문에, 이러한 결과는 만약 여성이 임신한다면 요로 개체군은 임상적으로 관계없는 것이 된다. 그 적합성은, 분명하게 여성의 생식력 상태가 요로 내 박테리아 개체군에 영향을 미치는지를 관찰하여 제시된다. 이는 요로 내 박테리아 개체군이 숙주의 내부적 상태에 대한 마커라는 가설을 지지한다.

연구는 이러한 마커 기능이 임신하기를 원하는 여성의 생식력을 진단하는데 충분하게 특이적이라는 것을 나타낸다. 실험적인 부분으로부터 명백하듯이, IVF/ICSI 절차 이전에 소변 내의 락토바실러스 종 및 스타필로코커스 종의 상대적인 존재에 의거한 모델은 IVF/ICSI 이 성공적인지 아닌지를 예측할 수 있다.

따라서, 본 발명은 피험자 내 성공적인 임신 가능성을 예측하는 방법을 제공하며, 다음의 단계를 포함한다:

a. 소변 샘플을 얻는 단계;

b. 상기 샘플 내 존재하는 박테리아 총량에 대한 퍼센트로서 박테리아 종 락토바실러스 및 스타필로코커스의 양을 결정하는 단계; 및

c. 상기 박테리아 사이의 비율에 기반하여 성공적인 임신 가능성을 예측하는 단계;

이러한 방법, 비록 IVF 또는 ICSI와 같은 인공 수정 방법에 자격이 있거나 또는 경험이 있는 피험자에게 바람직하지만, 그런 한정에 제한되지는 않는다. 방법은 또한 자연적인 방법으로 임신이 될 가능성이 어느 정도인지에 관심있는 피험자에게도 또한 유용할 수 있다. 이런 관점에서, 이미 임신한 여성으로부터, 젊은 여성으로부터, 또는 남성 피험자, 즉, 임신될 수 없는 피험자로부터 샘플이 얻어질 때, 그 방법은 또한 올바른 예측을 줄 수 있는 것으로 주목할 만하다: 이러한 샘플들로부터 테스트 결과는 부정적인 것으로 나타난다. 물론, 위와 같이 계산된 성공적인 임신 가능성은 오직, 파트너의 불임에 의하거나 또는 여성 피험자 내의 총체적인 생리적 부진에 의해 영향을 받지 않고(예를 들면 자궁 결여, 호르몬적 불균형 등등), 어떠한 인공 수정도 사용되지 않은 경우에서, 임신이 될 가능성이 있는 상황에 관한 것이다.

바람직하게는 검출된 락토바실러스 종은 락토바실러스 크리스파투스이다. 하지만 또한 다른 락토바실러스 종, L.젠세니(L. jensenii), L.이너스 (L. iners) 및 L.가세리 (L. gasseri) 와 같은 종을 검출하는 것 또한 유용할 수 있다. 이들 종들은 여성의 일부에서 보이며 락토바실라이 (Lactobacillae) 의 군으로 이들 종을 포함하는 것은 위에 언급된 방법의 예측적인 힘을 증가시킨다. 스타필로코커스에도 실제로 동일하게 스타필로코커스 아우레우스 뿐만 아니라 S.에피더미디스(S. epidermidis), S.해몰리티커스(S. haemolyticus) 및 S.코흐니(S. cohnii)가 보이며, 추가적인 힘을 보탤 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 박테리아 종들의 검출은 PCR 및 바람직하게는 qPCR과 같은, 분자 생물학적인 어쎄이를 통하여 수행된다. 이러한 어쎄이에서 박테리아는 검출되며, 검출된 박테리아에 특이적인 프라이머로 증폭에 의해 정량화된다. 락토바실러스의 경우에 이는 L.크리스파투스에 특이적인 프라이머가 사용될 수 있지만, 바람직하게는 이런 프라이머들은 또한 위에서 언급된 바와 같은 다른 락토바실러스 종들을 인식할 것이다. 일반적으로, 최선의 검출 방법은 실시예 2에서 사용된 바와 같은, 락토바실러스 특이적인 프라이머를 포함한다.

작용하는 비슷한 방법은 또한 스타필로코커스 종의 검출에도 적용하며, 주로 S.아우레우스가 검출되지만, S.에피더미디스, S.해몰리티커스 및 S.코흐니의 검출이 포함될 수 있다. 이러한 경우에도 또한, 실시예 2에서 알려진 바와 같은 프라이머가 최선의 결과를 가져온다.

하지만, 검출된 락토바실러스 및 스타필로코커스의 절대적인 비율이 사용되어야 하는 것은 아니라는 점이 이해되어야 한다. 상당히, 박테리아 총량에 대한 이들 박테리아의 퍼센트 비율이 사용된다. 샘플 내 박테리아 총량을 결정하기 위하여, 박테리아의 16s rDNA를 인식하는 프라이머를 사용하는 것이 바람직하며, 이는 모든 박테리아 내 존재하는 16S rDNA의 보존된 부분들을 인식하는 프라이머를 사용할 기회를 연다. 박테리아 16s rDNA에 특이적이며 그리하여 다른 유기체들로부터의 생물학적 물질이 존재하는 샘플 내에서 박테리아만을 오직 인식할 수 있는 프라이머 세트들은, 문헌에 기술되어있다. 위키피디아(https://en.wikipedia.org/wiki/16S_ribosomal_RNA)에는, 다음의 프라이머들이 기술되어 있다.

프라이머 이름 서열 (5'-3')

B27F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

U1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T

928F TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GG

336R ACT GCT GCS YCC CGT AGG AGT CT

1100F YAA CGA GCG CAA CCC

1100R GGG TTG CGC TCG TTG

337F GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG

907R CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT

785F GGA TTA GAT ACC CTG GTA

805R GAC TAC CAG GGT ATC TAA TC

533F GTG CCA GCM GCC GCG GTA A

518R GTA TTA CCG CGG CTG CTG G

몇몇의 가능한 것들 중에서(예를 들면 EUB f933 및 EUB r1387; EUB 8f 및 EUB 536r, EUB 341 및 EUB 534, 등등), 매우 적절한 프라이머 세트로 소위 EUB 프라이머가 사용된다. EUR 프라이머들에 기반하여 박테리아의 16s rDNA를 검출하는 키트가 상업적으로 이용 가능하다(Iris technologies Int., Cursdorf, Germany로부터의 Onar®EUB 키트와 같은).

본 발명의 또 다른 실시예에서, 샘플 내 박테리아의 양은, 질량 분광사진기, 라만 분광기(Raman spectrography) 및 등등과 같은, 분광사진적 수단에 의해 결정된다. 이러한 양의 측정에서 바람직하게는, MALDI-TOF가 분석적인 도구로서 사용된다.

총 박테리아의 양 및 락토바실러스와 스타필로코커스의 양이, 본 발명의 바람직한 실시예에서 박테리아의 비율을 결정할 때, 그리하여 성공적인 임신의 가능성이 다음의 식에 따라서 계산될 수 있다:

Y = a* (% 락토바실러스) - b* (% 스타필로코커스) - c

이 식에서

a는 0.025 내지 0.051의 값을 가지며,

b는 0.04 내지 0.07의 값을 가지며,

c는 -1.10 내지 -0.66의 값을 가지며;

이 식에서, Y는 성공 가능성을 나타낸다. Y의 값은 다음 식에 의하여 0 (성공확률이 없는)과 1 (확실한 성공)사이 범위를 갖는 가능성으로 전환될 수 있다.

가능성 = eY/(1+eY)

사용되는 정수에 의존하여 Y의 값은 4.44 (100% 락토바실러스, a=0.051 및 c=-0.66)에서 -8.1 (100% 스타필로코커스, b=0.07 및 c=-1.1)까지 다양할 것이다. 예측되는 임신에 대하여 실제 임신의 비교에서 가장 좋은 컷-오프 값은, 가능성 = 0.5 인 것으로 밝혀졌다. 그리고는 0.5 보다 더 높거나 동일한 Y값은 성공을 예측하며, 0.5 보다 낮은 값은 실패를 예측한다. 이러한 컷-오프 값을 갖는 공식은, IVF/ICSI의 첫 번째 시도 이후에 그 여성의 86%에서 정확하게 임신을 예측하였으며, 1년 동안 다중 시도 이후에 그 여성의 92.3%에서 정확하게 임신을 예측하였다. 따라서 IVF/ICSI 이후에 여성이 임신되었지만, 7.7% 경우에서, 공식은 실패를 예측하였다(부정 오류). 3.8%에서 임신은 유산 때문에 완전해지지 못했다. 3.8%에서 식은 정상 출산을 누락하였다. 공식이 임신을 예측한 25% 경우에서, 어떠한 진행적인 임신도 성취되지 못했다(긍정 오류).

임신하기를 원하고 IVF/ICSI를 진행할지 안 할지 결정하기 위해서 사전적 테스트를 사용하길 원하는 여성은 특히 부정 오류 예측을 받아들이지 않을 것이기 때문에, 부정-오류 예측을 3.8% 에서 0으로 줄이는 것이 바람직하다. 그러한 경우, 컷-오프 값은 0.04로 낮아져야 한다. 하지만, 이러한 컷-오프 값에서 공식은 모든 여성에 대해 임신을 예언하며, 물론 바람직하지도 않다.

완전한 임신의 가장 좋은 예측을 위한 공식은 a가 0.03 에서 0.051 값을 갖는 것이 사용되는 반면, 더 바람직하게는 b는 0.056 에서 0.064 값을 가진다. 더 바람직하게는, c는 -1.06 에서 -1.03 값을 갖는다. 임신할 가능성을 위한 컷-오프는 바람직하게는 0.5 이다.

피검자로부터의 샘플은 바람직하게는 소변 샘플이며, 더 바람직하게는 중간-뇨 소변 샘플이다. 이는 소변 내 박테리아 개체군을 가장 잘 나타내기 때문에, 이런 중간뇨 소변 샘플은 바람직하다. 이는 첫 번째 소변이 요도를 헹구고 요도에 살고 있는 박테리아를 대동하기 때문이다.

질 샘플 상에서 본 발명의 방법을 수행하는 것 또한 가능하다. 박테리아의 동일한 타입이 질 내에서 보일 수 있기 때문에, 성공적인 임신 가능성을 예측하기 위한 바람직한 유사한 공식 및 유사한 비율이 소변 샘플에서와 같이 사용될 수 있다는 것이 이치에 맞다. a, b 및 c의 값들은 최적화될 필요가 있는 것이 가능하지만 그런 최적화는 숙련된 자의 기술 내에서 충분하다.

또한 본 발명의 일부분은 성공적인 임신의 가능성을 결정하기 위한 키트이다. 이런 키트는 샘플 내 박테리아 총 함량을 결정하는 수단 및 락토바실러스 및 스타필로코커스 박테리아 둘 모두를 검출하는 수단을 포함한다. 게다가 이런 키트는 위에 나타낸 바와 같은 공식에 기반하여 가능성을 계산하는 수단을 포함한다. 가능성을 계산하는 이런 수단들은 바람직하게는, 특이적인 위에서 언급한 박테리아의 속들/계통들 및 박테리아의 총 함량의 검출 값을 받을 수 있는 프로세서를 포함한다. 그런 다음에 프로세서는 본 발명의 공식에 따라서 Y를 계산할 것이며, 성공적인 임신 가능성을 출력할 것이다. 이러한 출력은 수치 값의 형태일 수 있으나, 가능성의 표시일 수도 있으며, 예를 들면 빛 출처의 신호를 통하여 붉은색(부정적) 또는 초록색(긍정적 가능성) 중 하나일 것이며, 또는 수치적인 Y의 값을 나타내는 컬러-코드 바를 통하여 부정적인 값은 어두운 붉은색 (매우 부정적)에서 밝은 붉은색 (중간 부정적)을 통하여 노란색 (대략 0)으로의 기울기, 및 긍정적인 값은 노란색 (대략 0)에서 밝은 초록색 (중간 긍정적)을 통하여 어두운 초록색 (매우 긍정적)으로의 기울기를 나타낸다. 같은 방법으로, 피험자는 예측 신뢰도를 가시적인 표시로 받을 수 있다. 모든 적용에서 하나의 선택사항은, 0.5에서 표준 세트이고, 긍정 예측 오류의 수를 늘리는 것을 희생하여 부정 예측 오류의 수를 줄이는, 가능성에 대한 컷-오프 값에 포함된다. 물론, y의 값을 나타내는 다른 표시들이 가능하며, 숙련된 자는 본 발명의 요지에서 벗어나지 않고 위의 실시예들 상에서 다양하게 디자인할 수 있을 것이다.

실시예

환자 인클루젼 및 그룹 배치

2005년 및 2006년에, 로테르담의 ErasmusMC의 IVF 병동을 방문한 98 명의 여성들이 연구에 기록되었다. 이들 98명 중에서 40명 (41%)의 여성은 3년의 연구 기간 동안에 임신이 되었으며, 일부 경우 다중 시도를 한 후였다. 사전 동의 및 중간-뇨 소변 수집 방법의 지시를 준 후에, 여성들은 첫 번째 방문 동안에 중간-뇨 소변 샘플을 갖다 주었으며, 이전에 항생제의 사용과 이전의 UTI에 대한 질문을 받았다. 이들은 소변 용기 및 중간-뇨 소변 수집 과정을 설명하는 폴더를 받았다. 여성들은, 임신의 16번째 주에, 또는 임신이 되지 않은 여성에게는 태아의 착상(placement) 후 유사한 시간에, 중 어느 하나가 되었을 때, 두 번째 샘플을 수집하도록 다시 알려주었다. 소변 샘플은 같은 날 병원으로 돌아가거나, 동결하여 이후 날짜에 돌아갔다. 두 번째 샘플의 수집 후에 여성은, 최대 3년간 임신의 결과 상에서 및 나중의 임신에서 데이터를 수집하는 것이 이어졌다.

98명의 여성들 중에서 16명은 질문서 상에 모든 질문에 답을 하지 않았거나, 온전한 두 번째 소변 샘플을 돌려주지 않았다. 이들은 두 지점에서의 샘플을 요하는 관찰 연구에서 배제되었다. 남은 82명의 여성으로부터, 첫 번째 소변 샘플이 잇따른, 첫 번째 IVF/ ICSI 사이클에 의해 임신된 제1의 21명은 관찰 연구에 포함되었다. 두 번째 샘플이 수집되었을 때(태아의 착상 후 16주) 임신하지 않은 21명의 여성은 비-임신 여성의 그룹으로 포함되었다. 포함 라운드 후에, 두 번째 샘플이 수집되었을 때, 21명의 비-임신 여성 중 한 명이 임신하였다. 그녀는 임신 그룹으로 재배치되었다. 이는 결과적으로 임신 그룹 n = 22 이고 비 임신 그룹 n =20이 되었다. 이들 42명의 여성에서, 넓은 스펙트럼 16s rDNA으로 소변 샘플 양쪽에서 박테리아 개체군을 결정하였다. 게다가 여성들은 임신 및 이의 결과에 관하여 3년 동안 임상적으로 따랐다. 모든 42명 여성의 첫 번째 소변 샘플에서 확인된 박테리아 종들은 IVF/ICSI 의 결과를 예측하는 모델을 확립하는데 사용되었다(임신/ 비임신). 여성이 임신될 때 발생하는 박테리아 개체군에서의 변화는 UTI의 주요 원인에서의 변화와 비교되었다. 후자는 분리 그룹으로부터 얻어졌다(아래 참고).

두 개의 소변 샘플 및 완전한 설문지 둘 모두를 돌려준 남은 40명의 여성에 더하여, 온전한 첫 번째 샘플 및 완전한 설문지 둘 모두를 돌려준 여성들로부터, 독립적인 실증 그룹, n = 42를 구성하였다. 이러한 그룹에서 우리는, 예측 모델에 포함된 박테리아에 특이적인 프라이머들에 기반한, 위의 qPCR을 사용하여 얻어진 예측 모델을 실증하였다.

선택 프로토콜로 인하여, 관찰 단계에서 임신 성공 확률은 98명의 전체 여성에 대한 41%에 비교하여, 22/42 = 52% 였다.

그룹의 특성들은 표 1에 나타내었다.

배제 기준

연구 기간 16주 동안에 항생제를 사용하였거나 또는 UTI를 가진 여성들은 배제되었다.

후속 데이터 (3년 기간)

임신 그룹의 4명의 여성에서 임신은 유산 (3) 또는 자궁 내 사망 (ITD)로 끝났다. 추가적인 과정 후에, 4명 모두 두 번째 샘플이 수집된 후 6개월 내에 성공적인 임신을 가졌다.

IVF 실패한 그룹의 12명의 여성은 임신되지 못하였고, 7명은 두 번째 샘플의 수집 동안에는 임신하지 않았으나 다른 두 개의 지점에서 임신하였다. 이는:

환자 6, 임신 > 첫 번째 샘플 후 1년, < 두 번째 샘플 후 1년

환자 10, 첫 번째 샘플 후 1년 이내 임신(쌍둥이)

환자 14, 첫 번째 샘플 후 1년 이내 임신

환자 19, 첫 번째 샘플 후 1년 이내, 유산

환자 58, 첫 번째 샘플의 수집 시간 즈음 자발적인 임신이 발견되었다. 이는 결과적으로 IUD였다. IVF가 이어지고 및 태아의 착상 후 16주에 두 번째 샘플이 수집되었다. IVF는 실패했다. 이 환자는 첫 번째 IVF/ICSI의 결과 테스트 및 임신으로 인한 변화 테스트의 결과로 비-임신 그룹으로 배정되었다. 완전성을 위해서 모델 확립은 또한 임신 그룹으로 배정된 환자 58명으로 수행되었다. 1년 이내에서 임신이 될 수 있는 여성인지를 테스트하기 위하여 임신 그룹으로 배정되었다.

환자 78, 자발적인 임신 > 첫 번째 및 두 번째 샘플 후 1년, 유산

환자 92, 임신 (IVF) > 첫 번째 및 두 번째 샘플 후 1년, 그리고는 첫 번째 샘플 후 2년 성공적인 자발적 임신 유산

IVF/ICSI 성공의 예측 모델

첫 번째 소변 샘플의 박테리아 개체군 데이터는, 두 가지 모델을 확립시키는 이항식 회귀 분석(binomial regression analysis)으로 다루어졌다. 모델 1은 첫 번째 IVF/ICSI 시도가 임신에 도달할 것인지를 예측한다. 모델 2는 여성이 IVF/ICSI를 시도하는(1 내지 3번의 시도) 1년 동안 임신이 될 지를 예측한다. 이 모델에서, 모델의 기반이 되는, 첫 번째 소변 샘플의 수집 후에 1년 이내에 임신이 된 환자 10, 14, 19 및 58은 임신 그룹으로 재배치되었고, n = 26 인 임신 그룹 및 n = 15인 비임신 그룹을 산출하였다. 환자 6, 78 및 92는, 두 번째 샘플의 수집 이후 1년 이상에서 임신이 시작되었기 때문에, 1년 이내에 임신이 되지 않음을 유지하였다. 예측 모델들은 16 주에서 수집된 소변 샘플에 적용되었다. 넓은 범위 분석에 기반한 모델들은, 독립적인 테스트 그룹 내에서 실증된 종 특이적 QPCR 테스트로 옮겨졌다.

비임신 및 임신 여성에서 UTI의 원인 및 박테리아 개체군

DNA 분석으로 발견되는 박테리아 개체군은, UTI 없는 임신 / 비임신 여성들의 요로 내 적은 수로 존재하는 박테리아를 나타낸다. 이러한 데이터는, Maternity Hospital in Erbil (Kurdistan Region, Irak)에 참여한 여성으로부터 질 도말 표본 배양(vaginal smear cultures) 및 소변에 의해 얻어지는, 임신 / 비임신 여성 내 질 감염 및 UTI의 원인이 되는 데이터와 비교되었다. 2009년 동안에 총 599 소변 배양 결과 (210 비임신 및 389 임신) 및 216 질 도말 표본 배양 결과 (94 비임신 및 122 임신)이 얻어졌다.


		임신	비임신
연령		32.7±3.7	33.6±5.9
BMI		45.0±4.1	22.9±2.7
흡연		1	1
수 년간 아이를 원한 기간		4.1±3.4	6.0±5.4
원인	남성	10	7
	남성/ pesa	1	1
	남성/ tuba		1
	자궁 경부		1
	사이클 문제	3	1
	불명	5	7
	자궁내막증		1
	난소절제 후	1
	포프 (Pof)	1
	튜바 (Tuba)	1	1

표 1. 두 환자 그룹의 특성들

방법

DNA 정제

박테리아 개체군 구성은 넓은 스펙트럼 박테리아 16s rDNA 분석 분석(Riemersma, W.A. et al., 2003, J. Clin. Microbiol. 41:1977-1986)에 의해 평가되었다. 소변 샘플은 10분 동안 800g 에서 원심분리 되었다. 펠렛은 -80℃ 에서 다음 사용까지 보관되었다. 그런 다음 펠렛의 150㎕가 DNA 추출 및 정제에 사용되었다. <150㎕의 부피를 갖는 샘플에, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)-0.1 mM EDTA-50 mM 글루코스 버퍼의 양을 보완하여 추가되었다. 첫 번째, 리소스타핀 용액 75㎕ (10 mg/ml; Sigma, St Louis, Mo.)가 추가되었고, 그 혼합물은 37℃ 에서 30분 동안 가열되었다. 그 후에, 구아니디니움(guanidinium) 용해 버퍼(4 mM guanidinium isothiocyanate, 0.1 M Tris-HCl [pH 6.4], 0.2 M EDTA, 0.1% Triton X-100)의 1ml가 추가되었으며, 그 혼합물은 1시간 동안 상온에 유지되었고, 후에 Celite 현탁액 50㎕가 추가되었다. 샘플들은 상온에서 10분동안 정규 간격으로 혼합되었다. 볼텍싱 및 원심분리 (에펜도르프 원심분리기에서 14,000rpm, 10분) 후에, 상청액은 제거되었으며, 펠렛은 두 번째 용해 버퍼(4 M guanidinium isothiocyanate, 0.1 M Tris-HCl; pH 6.4)로 두 번, 에탄올(70%)로 두 번, 마지막 아세톤으로 한 번 세척되었다. 펠렛은 진공건조 되었고, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)의 100㎕에서 에멀젼화되었다. 샘플은 56℃ 에서 10분동안 가열되었으며, 원심분리되었다 에펜도르프 원심분리에서 14,000rpm, 10분). 상청액은, 50 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA 및 50 mM 글루코스를 함유하는 버퍼 내에서 PCR을 위한 주형으로 사용되었다.

PCR

정제된 DNA로부터 박테리아 16S rDNA의 분리는, 유전자의 보존된 부분에 직접 관련된 프라이머, EUB-L (5'-CTTTACGCCCATTTAATCCG-3') 및 EUB-R (5'-AGA-GTTTGATCCTGGTTCAG-3')를 사용하는 PCR 반응으로 수행되었다. PCR은, 작은-서브유닛 (ssu) rRNA 유전자의 3'-말단 끝에서 유래하는 ~500bp 조각을 생성한다(Wilson, K.H. et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28:1942-1946). 정제된 DNA 용액의 5㎕에 PCR 혼합물 45㎕가 첨가되었다(10 ㎕ 20 mM 디소시뉴클레오티드 트리포스파이트 스톡 용액 (desoxynucleotide triphosphate stock solution) (Amersham Life Science, Cleveland, Ohio), 10-배-농축된 SuperTaq PCR 버퍼 5㎕ (HT Biotechnology, Cambridge, United Kingdom), 프라이머 둘 다 0.5㎕, 증류수 28.92㎕, 및 SuperTaq 중합효소 0.08㎕ (15 U/㎕; HT Biotechnology, Cambridge, United Kingdom). PCR 반응은 5분 동안 94℃에서 프리사이클링 변성 단계를 포함하며, 94℃ (45초) 변성, 55℃ (45초)에서 어닐링, 및 72℃ (45초)에서 신장의 30 사이클이 이어졌다. 대조군으로서, 추가적인 DNA 샘플 없이 PCR 혼합물 50㎕이 동시에 이뤄졌다. 그런다음에, PCR 생성물의 일부 10-㎕는 에티디움브로마이드(ethidium bromide)를 함유하는 1% 아가로스젤 상에서 분석되었다. 전기영동이 0.5X TBE (50 mM Tris, 50 mM borate, 1 mM EDTA)에서 수행되었다; 젤들은 수용성의 에티디움브로마이드 (10ng/ml)에서 염색되었으며, UV 조명하에서 촬영되었다.

증폭 생성물의 클로닝

PCR 증폭 생성물은, 소변 내 존재하는 다른 박테리아로부터 유래한 16s rDNA 조각들의 혼합물을 함유한다. 이들 조각들을 분리하기 위해서 클로닝-형질전환 단계가 행하여졌다. 각각 PCR 생성물의 3㎕가 pGEM-T easy 벡터 내 접합에 사용되었고, competent Escherichia coli JM109 세포 내에 열-충격으로 형질전환되었다. 클론들은, 엠피실린 (100㎍/ml) 및 X-Gal (5-브로모-4클로로-3-인돌리-β-D-갈락토파이라노사이드; 40㎍/ml)을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 37℃에서 밤새도록 성장되었다. 형질전환은 파란색-흰색 콜로니 스크리닝으로 확인되었다.

서열화

삽입을 갖는 플라스미드를 함유하는 모든 클론들의, 그 플라스미드들은 QIAgen Miniprep kit (QIAgen, Venlo, The Netherlands)를 사용하여 격리되었다. 최대 100개의 클론들이 샘플 당 사용되었다. 각각의 플라스미드 격리를 위한 서열화 PCR이, 16S rDNA, TAATACGACTCACTATAGGG의 변이 부분에 직접적인 T7 프라이머로 수행되었다. 결과적인 서열은 BLAST 데이터베이스 내 원래의 박테리아 유형을 확인하는데 사용되었다. 모든 결과들은, 특이적인 박테리아 유형으로 보이는 개체군의 퍼센트를 얻기 위해 분석되는 클론들의 총 숫자와 관련있었다. 따라서 100개 클론들이 분석되었으며 20개가 Lactobacillus crispatus에 대한 서열을 산출하였을 때, 개체군의 20% 은 Lactobacillus crispatus 였다.

PCR 접근은 원래의 소변 샘플 내 박테리아 개체군의 정량적 분석을 산출한다. 정량적 데이터를 산출하는 배양들은 감염의 징후 없는 여성들 내에서 수행되지 않았다.

통계

모든 통계적 테스트는 PASW 17.0 프로그램 (SPSS)으로 수행되었다. 그룹들 내에서 첫 번째 및 두 번째 샘플들 사이의 차이점은, 짝지은 Student t-test (paired Student t-test)로 중요도 테스트 되었다. 그룹들 사이의 차이점들은, 두 그룹들의 동일한 격차를 갖는 독립 Student t-test (unpaired Student t-test)로 테스트 되었다.

예측적인 모델들은 이항식 회귀 분석으로 얻어졌다.

결과

박테리아 개체군의 안정도 및 구성

모든 소변 샘플은 1 내지 10개의 박테리아 유형으로 구성되는 박테리아 개체군을 가졌다. 표 2는 2명의 여성의 결과를 나타내며, 한 명은 임신하였고, 한 명은 임신하지 않았다. 발견되는 박테리아의 다양한 유형들은 별도로 하고, 어떻게 이들 박테리아가 임신 되거나 또는 안된 여성들 내에서 안정한지 또한 관심사이다. 안정도 측정의 첫 번째는, 두 번째 샘플에서 다시 발견되는, 첫 번째 샘플로부터의 박테리아 유형의 수를 정량적으로 보는 것이다. 따라서 임신 여성에서 박테리아 타입 4개 중에 3개(75%)는 >16주의 기간에 걸쳐 존재하는 것으로 남았다(락토바실러스 크리스파투스 스트레인 ZDY35b, 스타필로코커스 아우레우스 스트레인 LA14 및 슈도모나스 아세팔리티카 (Pseudomonas acephalitica) 75% 중복).

안정도 측정의 두 번째는 두 가지 샘플들 사이의 퍼센트 내 완전한 중복이다. 임신한 여성에서 개체군의 37%는 두 개의 시점에서 동일하였다(12% 락토바실러스 크리스파투스, 15% 스타필로코커스 아우레우스, 10% 슈도모나스 아세팔리티카). 커다란 변화가 락토바실러스 크리스파투스에서 스타필로코커스 아우레우스로 발생하였다. 임신되지 않은 여성들 내에서 개체군의 79%는 IVF 전과 후가 동일하였다.

	임신		비임신
	1^st 샘플	2^nd 샘플	1^st 샘플	2^nd 샘플
락토바실러스 크리스파투스 스트레인 ZDY35b	50%	12%	27%	20%
스타필로코커스 아우레우스 스트레인 LA14	15%	78%	53%	60%
슈도모나스 아세팔리티카	30%	10%
스트렙토미세스 종 ( Streptomyces sp .) SD-Z	5%	0%
브레분디모나스 종 ( Brevundimonas sp .) DB5			14%	0%
무배양 박테리움 클론 투릭 _ 준2005 _ 인터투속 _69 ( Uncultured bacterium clone Toolik _ Jun2005 _ Intertussock _69)			6%	15%
스트렙토미세스 종 ( Streptomyces sp .) WYE2			0%	5%

전체 그룹에 이러한 분석을 적용한 것은 다음을 나타낸다:

임신 그룹에서 박테리아 종의 평균 수는 두 샘플 모두 내에서 4개였다. 비임신 그룹에서 이러한 숫자는, IVF/ICSI 시도 후에 4개이며, 전에는 3개 였다. 임신 그룹에서 평균 1.9±1.2 박테리아 유성들은 두 샘플 모두에서 존재하였다. 비임신 그룹에서의 숫자는 2.1±0.9 였다. 종들의 다양성은 두 그룹 모두에서 크게 다르지 않았다.

첫 번째 및 두 번째 샘플 사이에서 정확한 중복은, 비임신 그룹에 비하여, 68±24%, 임신 그룹 내에서 크게 더 낮았다, 37±23%.

전반적인 박테리아 개체군은, 임신되지 않은 여성 내에서 정량적으로 및 질적으로 둘 모두에서 안정하였다. 임신된 여성 내에서 큰 변화는, 다량의 개별적인 박테리아 타입들로 존재하는 개체군에서 일어났다. 이러한 변화의 성질은 아래에 주어진다.

[table 3]

박테리아의 타입 및 우세한 종들

발견된 총 79개의 다른 박테리아 종들에서, 개요가 표 3에 제시된다. 분석의 대다수에서, 상기 얻어진 DNA 서열과 BLAST 데이터뱅크 내 종-특이적 서열 간의 매치는 97%를 초과하였다. 더 낮은 매칭 퍼센트는 표에 나타내었다. 대다수의 종들은 극소의 샘플에서만 발견되었다. 표 4는 박테리아 종들이 발견되는 빈도를 표현한다.

표 4. 하나 또는 그 이상의 샘플들 내 존재하는 종들의 수

N samples	1	2	3	4	5	8	9	11	13	26	58	75
N species	49	12	3	3	2	1	2	3	1	1	1	1

N 샘플 = 특이적인 종들이 존재하는 샘플의 수

N 종 = N 샘플들에 해당하는 종들의 수 (따라서 49개 종들이 오직 1개의 샘플에서 발생하는 반면, 1개의 종은 75개 샘플에서 발생하였다)

적은 종들

대부분의 종들은 오직 1명의 여성의 개체군의 10% 미만으로 및 종종 오직 1개의 샘플 내에서 존재하였다. 임신 그룹에서 19개 종들이 두 개의 시점 모두에서 발견되었으며 (동일 여성임을 요하지는 않는다), 16개는 첫 번째 샘플에서, 18개는 두 번째 샘플에서 독특하였다. 비임신 그룹에서 16개의 박테리아 종들은 두 개의 샘플 모두에서 발생하였으며, 14개는 첫 번째 샘플에서, 25개는 두 번째 샘플에서 독특하였다. 4개의 다른 샘플 그룹에서 독특한 박테리아 종들은 없었다(비임신, 임신, IVF/ICSI 실패 전, IVF/ICSI 실패 후).

많은 종들

4개의 샘플 그룹 모두에서 5개의 종들이 발생하였다. 락토바실러스 크리스파투스 및 스타필로코커스 아우레우스는 모든 샘플의 대다수에서 존재하였다. 대장균, 스트렙토미세스 종 및 무배양 박테리움 격리 CH96Fc_H10 (uncultured bacterium isolate CH96Fc_H10)는 소수의 샘플 내에 존재하였으나 또한 4개 그룹들 모두 내에 존재하였다.

우세한 종들 (총 개체군의 가장 큰 부분인)

4개의 샘플 그룹에서 우세한 종들에 의해 점유되는 평균 퍼센트는 각각 67±16% (첫 번째 샘플 임신 그룹, 48% 내지 100%), 59±18% (두 번째 샘플 임신 그룹, 22% 내지 88%), 56±15% (첫 번째 샘플 비임신 그룹, 20% 내지 100%) 및 57±17% (두 번째 샘플 비임신 그룹, 18% 내지 100%)였다. 우세한 종들의 개관은 표 5에 제공된다.

표 5 우세한 종들 (18% to 100%)

표 5 우세한 종들 (18% to 100%)
No.	임신 그룹		비임신 그룹
No.	첫 번째 샘플	두 번째 샘플	No.	첫 번째 샘플	두 번째 샘플
10	Lc	Sa	6	Sa	Sa
4	Lc	Lc	6	Lc	Lc
2	Lc	B RG4	2	Lc	Sa
1	Lc	B CPB8	2	Li	Li
1	Lc	Msb	1	Lcu	Lcu
1	Lc	S	1	Bc	Lc
1	Lj	B RG4	1	Cc	Cc
1	Lj	Sa	1	UbB	UbE
1	B RG4	B RG4

Lc=락토바실러스 크리스파투스 (Lactobacillus crispatus),

Lcu=락토바실러스 커바투스 클론 B225 (Lactobacillus curvatus clone B225), Li=락토바실러스 이너스 (Lactobacillus iners),

Lj=락토바실러스 젠세니 아이솔레이트 C72 (Lactobacillus jensenii isolate C72),

Sa=스파킬로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus),

B RG4=바실러스 sp. RG4 (Bacillus sp. RG4),

Bcpb= 바실러스 sp.CPB 8 (Bacillus sp. CPB 8),

Msb= 마린 세디먼트 박테리움 ISA-3195 (Marine sediment bacterium ISA-3195) ,

S=스핀고모나스 sp. FL13-1-1 (Sphingomonas sp. FL13-1-1),

Cc= 클로스트리디움 크리스파투스 cTPY-17 (Clostridium crispatus cTPY-17),

Bc=바실러스 클라우시 스트레인 za-w-3 (Bacillus clausii strain za-w-3),

UbB= 무배양 박테리움 클론 베르무다스8-E3 (Uncultured bacterium clone Bermudas8-E3,

UbE= 무배양 박테리움 클론 E67BE-207 (Uncultured bacterium clone E67BE-207)

임신 그룹에서 락토바실러스의 다양한 스트레인들은, 첫 번째 시점에서 얻어진 22개 샘플들 중에서 21개 내에서, 및 임신동안 얻어진 4개의 샘플들 내에서 우세한 종들이었다. 임신 동안 스타필로코커스 아우레우스는 가장 빈번하게 우세한 종이었다. 22명의 여성 중에서 5명에서 우세한 종들은 두 샘플들 모두에서 동일하였다.

비임신 그룹 내에서 첫 번째 샘플 내 우세한 종들은, 20명의 여성 중에서 11명에서 락토바실러스 종들이었다. 6개의 샘플 내에서는 스타필로코커스 아우레우스였다. 우세한 종들은 20명의 여성 중에서 16명에서 두 샘플들 모두에서 동일하였다.

우세한 종의 유형에 기반하여, 박테리아 개체군은, 임신 동안에 큰 변화에 피험자 및 실패한 IVF 절차 (아무 효과 없는 IVF) 에서 안정하게 나타났다.

임신동안 및 IVF 후의 박테리아 개체군 내 특이적인 변화들

임신 동안에 일어나는 다양한 박테리아 종들에서 변화는 주로, 62±21% 에서 18±16% (p<0.0001)로의 락토바실러스 종들의 감소 및 7±11% 에서 41±29% (p<0.0001)로의 스타필로코커스 종들의 증가이다.

비임신 그룹에서 첫 번째에 대한 두 번째 샘플에서의 다양성은 락토바실러스 종들, 46±24 대 40±27 및 스타필로코커스 종들, 27±22 대 32±25, 둘 모두에서 변하지 않았다.

비교를 위하여, 두 번째 샘플의 수집 동안에 임신하지 않았으나 첫 번째 샘플의 수집 이후 어느 다른 시점에 임신된 7명 이상의 여성들은 비임신 그룹으로 배치되었다. 7명 중에서 4명은 첫 번째 샘플에서 어떠한 스타필로코커스도 없었다. 2명은 스타필로코커스가 높게 존재하였으며, 이어지는 두 번째 또는 세 번째 연도에서 임신되었다(한 명은 유산하였고; 한 명은 유산하였다가 2년 후에 성공적인 자발적 임신이 이어졌다). 7번째 여성은 스타필로코커스가 높게 존재하였으며, 실패한 첫 번째 IVF 시도에 이어서 실패한 ICSI 이후에 1년 안에 자발적 임신이 되었다(유산).

이전의 UTI 또는 항생제 사용에 대한 박테리아 개체군의 관련성

임신 그룹 중에서 5명의 여성 (23%)는 과거에 UTI가 있었으며, 2명 (9%)는 최근에 항생제를 사용하였다고 보고하였다. 비임신 그룹 중에서 9명의 여성 (45%)는 이전에 UTI가 있었으며, 5명 (25%)는 최근에 항생제를 사용하였다고 보고하였다. 다른 점들은 통계학적으로 중요하지는 않았다. 이전에 UTI 또는 항생제 사용을 보고한 여성들 내 박테리아 개체군의 구성은 각각 그룹의 다른 여성들 내의 그것과 크게 다르지 않았다.

IVF/ICSI 전에 대한 IVF/ICSI 결과 박테리아 개체군

IVF/ICSI 절차 전에 얻어진 소변은, 임신 그룹에 비하여 비임신 그룹에서 더 많은 스타필로코커스 종 (27±22% 대 7±11%, p<0.001) 및 더 적은 락토바실러스 종 (46±24% 대 62±21%, p<0.001)를 함유하였다.

임신 및 비임신 여성 내 질 감염 및 UTI의 대다수의 원인

2009년에 소변 배양 599 및 질도말표본 배양 206 총 숫자는 Maternity hospital in Erbil (Kurdistan region Irak)에 참여한 여성들에게 수행되었다. 각각 임신 또는 비임신인 여성에 대한 결과를 표 6에 나타내었다. 비임신 여성에서 E.coli는 모든 긍정적인 소변 배양의 44% (70/158)에서, 22% (35/158)에서 스타필로코커스 아우레우스가 발견되었다. 임신 여성에서 E.coli는 21% (75/350)에서, 50% (175/350)에서 스타필로코커스 아우레우스가 발견되었다.

질 도말 표본에서 E.coli는 29% (24/84)에서 발견된 병원체였고, 비임신 여성에서 모든 긍정적인 도말들의 29% (25/84)에서 스타필로코커스였다. 임신한 여성에서 그 숫자는 E.coli에서 38% (28/74) 및 스타필로코커스 아우레우스에서 49% (36/74)였다. 소변에서 및 더 적은 질도말표본에서, 임신 동안에 스타필로코커스 아우레우스 존재는 증가되고(p<0.001) E.coli 존재는 감소되는 (p<0.001) 방향으로의 변화가 있었다.

	total	neg.	pos.	pseudo.	E coli	Kleb.	Staph. a	Enterob.	Portus sp.	Streptoc.
	소변
임신	389	39	350	0	75	17	175	69	11	3
비임신	210	52	158	1	70	4	35	39	6	3
	질 도말 표본
임신	122	48	74	0	28	4	36	3	1	2
비임신	94	10	84	0	24	14	25	18	3	0

Pseudo. = 슈도모나스 종들,

Kleb.= 클레브시엘라 종들,

enterob.= 엔테로박테르 종들,

Streptoc.= 스트렙토코커스 종들

IVF/ ICSI 성공 가능성에 대한 예측 모델

모델들은, 첫 번째 소변 샘플 (IVF/ ICSI 전, n=42)에서 확인된 박테리아 종들의 입력을 갖는 이항식 회귀 분석에 의해 확립되었다. 락토바실러스 종들 및 스타필로코커스 종들은 모델에 크게 기여하였다. 첫 번째 IVF/ICSI 후 임신의 가장 좋은 예측은, Y=0.030*%락토바실러스 - 0.057*%스타필로코커스 - 1.031를 갖는 모델로 얻어졌다. 환자 58이 임신 그룹으로 배치될 때 (그녀는 첫 번째 샘플이 수집된 즈음에 임신되었다), 방정식은, Y=0.034*% 락토바실러스 -0.064*%스타필로코커스 - 0.668 이었으며, 그 %는 86% 에서 96%로 증가된 임신을 정확하게 예측하였다. 1년 예측 동안 그 방정식은 Y=0.051*% 락토바실러스 -0.056*%스타필로코커스 - 1.053이었다. 표 7은 첫 번째 IVF/ICSI 시도 모델 및 1년 기간 모델에 대한 교차 표 값을 나타낸다. 1년 기간 모델에서 다중 IVF/ICSI 시도가 이루어졌다.

		예측된
		첫 번째 시도		% 정확도	1 년		% 정확도
		비임신	임신		비임신	임신
관찰된	비임신	16	4	80	12	4	75
	임신	3	19	86	2	24	92.3

두 개의 모델들에서 ROC 곡선은, 커브 (0.819, 첫 번째 시도 및 0.901, 1년) 아래 지역으로부터, 1년 이내 임신이 가장 잘 예측될 수 있다는 점을 나타낸다. 이러한 1년 예측에서 불임의 원인은, 긍정 오류 예측 4명 중 3명에서, 및 부정 오류 예측 2명 중 1명에서, 남성이었다. 그 원인은 긍정 오류 예측 4명 중 1명에서, 및 부정 오류 예측 2명 중 1명에서, 알려지지 않았다.

불임의 원인과 우리 모델의 예측력 사이에 관계가 있는지를 테스트하기 위해, 불임의 알려진 원인 (n = 30) 및 불임의 알려지지 않은 원인 (n = 12)으로 여성들을 세분화하였다[표 8].

		1 년 예측
		알려진 원인		% 정확도	원인 불명		% 정확도
		비임신	임신		비임신	임신
관찰된	비임신	6	4	60	6	0	100
	임신	1	24	96	1	5	83

두 번째 샘플의 수집 중에 임신이 아닌 여성에게, n=20, 새로운 IVF/ICSI 시도들이 시작되었다. 1년 모델은, 이들 여성들이 다음 12개월 안에 새로운 시도들에 의하여 임신이 되는지를 두 번째 샘플에 기반하여 예측하는데 사용되었다. 4명의 여성들은 그 기간에 임신되었다 (환자 10, 14, 19 및 58). 표 9는 실제 결과 대 모델에 의해 예측된 결과를 나타낸다. 새로운 시도들이 결과적으로 임신이 아니라는 것을 예측한 것은 14/15 경우에서 정확했다(93%).

		예측된		% 정확도
		비임신	임신
관찰된	비임신	14	2	88
	임신	1	3	75

그 모델이 임신 16주째에 얻어진 소변에 적용되었을 때, 그 모델은 이들 여성들 중의 어느 누구도 다음의 IVF/ICSI 절차에서 임신되지 않을 것이라고 예측했다.

리브-원-아웃 모델 (Leave-one-out model)

예측 모델을 실증하기 위하여, 우리는 leave-one-out 절차를 적용하였다. 이러한 절차에서 모델은 41 환자들의 데이터로부터 구축되었고, 이 모델은 이 환자가 IVF/ICSI로 시작한 1년 이내에 임신될지 안될지를 예측하는 것이 누락된, 환자들로부터의 소변 데이터에 적용되었다. 그 결과 (표 10)는 총 그룹 42명(표 7)에 얻어진 것들과 완전하게 매치한다.

		예측된		% 정확도
		비임신	임신
관찰된	비임신	12	4	75
	임신	2	24	92

실증 그룹에서 그 모델은 임신 28명 중 24명을, 실패 16명 중 12명을 정확하게 예측하였다 (표 10).

현존하는 모델 [5]에 비교하여

Nelson으로부터의 모델에서, 출산의 개인적인 가능성은 나이, 아이를 원하는 기간 및 몇몇의 다른 임상적인 파라미터에 기반하여 예측되었다. 그 모델로 우리 연구 그룹에 대한 이들 데이터를 넣었고, 1년 이내에 출산이 목격된 여성들 대 출산이 없는 여성들에 대한 결과를 비교하였다 (표 11). 예측된 가능성은 두 그룹 모두에서 다르지 않았다 (p=0.18, 독립적 t-test)

		% 출산 가능성 (Nelson model)
		평균	s.d.
관찰된	비임신	27	9
	임신	23	11

실시예 2

락토바실러스 종 및 스타필로코커스 종의 qPCR

실시예 1에서 나타낸 예측 모델은 오직, 박테리아의 총 수, 스타필로코커스 및 락토바실러스의 존재의 데이터를 사용하기 때문에, 이는 이들 3개 값을 측정하여 특이적으로 직접적인 qPCR 절차를 발전시키기로 결정되었다.

소변 샘플에서 PCR은 일반적인 프라이머 세트 (EUB-R, EUB-L)로 수행된다. 이러한 PCR의 생성물은, 소변 내 모든 박테리아로부터 유래된 16S rDNA의 혼합물이며, 따라서 박테리아의 총 수를 나타낸다.

이러한 총 혼합물에 이어서 qPCR은 3개의 프라이머 세트들, 일반적인 프라이머 세트, 락토바실러스에 특이적인 프라이머 세트 (다중 유형의), 및 스타필로코커스에 특이적인 프라이머 세트 (다중 유형의)로 수행된다.

개시 PCR 생성물의 총 DNA 함량은 나노드롭 어쎄이를 통하여 측정된다. 이러한 분석에서 DNA는 대부분 전부 16S rDNA로 구성된다. 이러한 나노드롭 어쎄이에 기반하여 각각의 어쎄이에서 DNA의 총량은 동일하게 유지될 수 있다.

일반적인 프라이머는 모든 16S rDNA 조각들과 반응할 것이고, 따라서 박테리아 개체군의 100%를 정의하는 CT 값을 생성할 것이다. 일반적인 프라이머 세트는 또한 초기의 PCR 생성물 (1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1)의 희석물 연속에서 테스트될 것이다. 이러한 희석물 연속은 결과적으로, 전체의 각각 약 80%, 60%, 40%, 20% 및 10%의 DNA 양과 매치하는 CT 값을 도출할 것이다.

특이적인 프라이머 세트를 갖는 qPCR 어쎄이는 결과적으로, 일반적인 프라이머 세트(만약 그 개체군이 오직 하나의 종을 함유한다면) 또는 그 이상(만약 테스트되는 종이 오직 전체 개체군의 일부라면)으로 얻어지는 CT 값과 동일한, CT 값을 도출할 것이다. 희석물 연속에 기초하여, 퍼센트가 이러한 특이적인 CT 값에 매치한다는 점이 결정될 수 있다.

스타필로코커스 아우레우스 프라이머 세트 (다음에 개제된: 처리된 및 미처리된 우유의 냉장보관동안 박테리아 개체군 구조 및 역학의 분자 분석 (Molecular analysis of bacterial population structure and dynamics during cold storage of untreated and treated milk.) Rasolofo EA, St-Gelais D, LaPointe G, Roy D. Int J Food Microbiol. 2010 Mar 31;138(1-2):108-18. Epub 2010 Jan 20):

정방향 (nt 61) 프라이머 5'-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3'

역방향 (nt 241) 프라이머 5'-GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3'

조각 크기 201 bp

락토바실러스 크리스파투스 프라이머 세트 (다음에 게재된: 박테리아 바기노시스를 갖는 여성 및 갖지 않는 여성에서의 박테리아 종들의 정량적 PCR 평가 (Quantitative PCR Assessments of Bacterial Species in Women with and without Bacterial Vaginosis.) Marcela Zozaya-Hinchliffe, Rebecca Lillis,David H. Martin, and Michael J. Ferris, J Clin Microbiol. 2010 May; 48(5): 1812-1819; Published online 2010 March 19. doi: 10.1128/JCM.00851-09. PMCID: PMC2863870)

정방향 프라이머 GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA

역방향 프라이머 AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC

Claims

피험자 내 성공적인 임신 가능성을 예측하는 방법으로서,
a) 소변 샘플을 얻는 단계;
b) 상기 샘플 내 존재하는 박테리아 총량에 대한 퍼센트로서 박테리아 종 락토바실러스 및 스타필로코커스의 양을 결정하는 단계; 및
c) 상기 박테리아 사이의 비율에 기반하여 성공적인 임신 가능성을 예측하는 단계;를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 피험자는, IVF 또는 ICSI와 같은 인공 수정 방법에 자격이 있거나 또는 경험이 있는 자인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 락토바실러스 종은 락토바실러스 크리스파투스인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 스타필로코커스 종은 스타필로코커스 아우레우스인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리아 양의 측정은 PCR, 더 바람직하게는 qPCR에 의해 수행되는 것인, 방법.
제5항에 있어서,
상기 스타필로코커스는 프라이머5'-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3' 및 5'-GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3' 를 사용하여 결정되는 것인, 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 락토바실러스는 프라이머 5'- GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3' 및 5'- AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3' 를 사용하여 결정되는 것인, 방법.
제1항 내지 제4항에 있어서,
상기 박테리아 양의 측정은 질량 분석, 더 바람직하게는 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 수행되는 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 성공적인 임신 가능성은 다음의 식에 의해 결정되는, 방법:
Y = a* (% 락토바실러스) - b* (% 스테필로코커스) - c
이 식에서
a는 0.025 내지 0.051의 값을 가지며,
b는 0.04 내지 0.07의 값을 가지며,
c는 -1.10 내지 -0.66의 값을 가지며;
% 락토바실러스는, 박테리아 총량의 퍼센트로서 표현되는 락토바실러스 박테리아의 양이며;
% 스테필로코커스는, 박테리아 총량의 퍼센트로서 표현되는 스테필로코커스의 양이며; 및
이 식에서, Y는 성공 가능성을 나타낸다.
제8항에 있어서,
상기 a는, 0.025 내지 0.04의 값을 갖는, 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 b는, 0.04 내지 0.06의 값을 갖는, 방법.
제8항 내지 제10항 중 어는 한 항에 있어서,
상기 c는 -1.06 내지 -0.9, 더 바람직하게는 -1.06 내지 -1.01의 값을 갖는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 박테리아는, 중간뇨 소변 샘플에서 검출되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
a 단계는, 질 도말 표본과 같은 질 샘플을 얻는, 방법.
성공적인 임신 가능성의 예측을 위한 키트로서,
a) 피험자로부터의 샘플 내 박테리아의 총 함량을 측정하는 수단;
b) 락토바실러스 박테리아의 함량을 측정하는 수단;
c) 스타필로코커스 박테리아의 함량을 측정하는 수단;
d) 제8항 내지 제11항에서 정의된 식에 따른 가능성을 계산하는 수단을 포함하는, 키트.
제14항에 있어서,
상기 락토바실러스 박테리아의 함량을 측정하는 수단은, 프라이머 5'- GATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGA-3' 및 5'- AGCTGATCATGCGATCTGCTTTC-3' 를 포함하는, 키트.
제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 스타필로코커스 박테리아의 함량을 측정하는 수단은, 프라이머 5'-GAGTAACACGTGGATAACCTACCTATAAGAC-3' 및 5'-GCATCGTTGCCTTGGTAAGC-3' 를 포함하는, 키트.
제14항 내지 제16항에 있어서,
상기 피험자로부터의 샘플 내 박테리아 총 함량을 측정하는 수단은, 박테리아의 16s rDNS에 특이적인 일반 프라이머 세트를 포함하는, 키트.
제17항에 있어서,
상기 일반 프라이머 세트는, 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 EUB 프라이머를 포함하는, 키트.
제14항 내지 제18항에 있어서,
상기 가능성을 계산하는 수단은, 상기 측정된 박테리아의 값을 입력장치로 받을 수 있는 프로세스를 포함하며, 이는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 식에 따른 가능성을 계산하는, 키트.
제19항에 있어서,
상기 프로세스는, 상기 키트를 사용하며 사람에 의해 읽힐 수 있는 신호적 수단으로 상기 가능성을 출력할 수 있는, 키트.