KR20060036901A - 고상 세포 용해 및 포획 플랫폼 - Google Patents

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KR20060036901A
KR20060036901A KR1020057020839A KR20057020839A KR20060036901A KR 20060036901 A KR20060036901 A KR 20060036901A KR 1020057020839 A KR1020057020839 A KR 1020057020839A KR 20057020839 A KR20057020839 A KR 20057020839A KR 20060036901 A KR20060036901 A KR 20060036901A
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KR1020057020839A
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윌리엄 케이. 카펠
리처드 제이. 미하이
엘리자베쓰 에이. 젠킨스
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시그마-알드리치컴퍼니
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Abstract

본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 또는 추출 및 단리하는 것과 관련된 용기, 방법 및 키트를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 용기는 입구, 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면, 부피, 용해 시약, 및 어떤 경우에는 지지된 포획 리간드를 포함한다. 또한, 본원에 개시된 용기를 사용하여 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 또는 추출 및 단리하는 방법 및 키트가 제공된다.
용해 시약, 숙주 세포, 세포 성분, 지지된 포획 리간드.

Description

고상 세포 용해 및 포획 플랫폼 {Solid Phase Cell Lysis and Capture Platform}
본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분, 예를 들어 폴리펩티드 및 핵산을 단리하는 것에 관한 것이다.
최근, 재조합 DNA 기술이 진전되어 숙주 세포에서 다량의 펩티드를 제조할 수 있게 되었다. 그러나, 지금까지는, 표적 펩티드, 단백질, 핵산, 또는 기타 세포 성분을 그들의 숙주 세포로부터 추출 및 단리하는 것은 제1 용해 단계에 이어서 표적 생성물을 다른 세포 성분들로부터 분리하는 하나 이상의 후속 단계를 포함하는 다단계 공정이었다.
다양한 기술을 이용해서 세포를 용해시켜 왔으며, 이들 기술은 각각 특유의 장점 및 단점을 갖는다. 예를 들어, 초음파분해, 프렌치 프레스 셀(French press cell), 균질화, 분쇄(grinding), 동결-해동 용해, 및 세포를 물리적 또는 기계적으로 용해시키는 다양한 다른 방법들이 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Bollag & Edelstein, Protein Extraction, in Protein Methods, 27-43 (1993); Schutte & Kula, Biotech. and App. Biochem., 12: 559-620 (1990); and Hughes, et al., Methods in Microbiology, 5B: 1-54 (1969)] 참조). 그러나, 기계적 용해는 이용하기가 쉽지 않을 수 있는 특별한 장치를 필요로 하며, 또한 초음파분해는 일부 단 백질에 유해할 수 있는 열을 발생시키기도 한다. 또한, 효소 및 디터전트(detergent)를 사용하여 세포를 효소적 또는 화학적으로 용해시켜 왔다 (예를 들어, 문헌 [Hughes, et al., Methods in Microbiology, 5B: 1-54; Andrews & Asenjo, Trends in Biotech., 5: 273-77 (1987); Wiseman, Process Biochem., 63-65 (1969); and Wolska-Mitaszko, et al., Analytical Biochem., 116: 241-47 (1981)] 참조).
그러나, 효소 또는 디터전트 용액을 첨가하면, 용해될 세포를 함유하는 용액이 희석되며, 또한 생성된 막 단편, 목적 생성물을 원치않는 단백질 및 기타 세포 잔해로부터 여전히 분리해야만 한다.
유사하게, 각종 친화성 포획 방법을 이용하여 펩티드, 단백질 및 핵산을 정제해왔다. 미국 특허 제4,569,794호, 동 제5,310,663호 및 동 제5,594,115호는 히스티딘 잔기를 포함하는 금속 킬레이팅 펩티드의 사용 및 단백질 정제에서 상기 펩티드의 용도를 기술한다. 미국 특허 제4,703,004호, 동 제4,851,341호, 동 제5,011,912호 및 동 제6,461,154호는 항원성 플래그(FLAG; 등록상표) 펩티드, 및 이 펩티드를 포함하는 단백질 정제를 기술한다. 미국 특허 제5,654,176호는 단백질 정제에 있어서 글루타티온-S-트랜스퍼라제의 용도를 기술한다. 미국 특허 제5,998,155호는 아비딘/바이오틴 포획 시스템의 사용을 기술한다. 이들 경우의 각각에서, 표적 생성물 상의 친화성 태그 또는 서열과 상응하는 리간드 사이의 상호작용은 표적 생성물을 "포획"한다. 이어서, 표적 생성물이 태그- 또는 서열-특이적 리간드에 결합된채로, 비결합 조성물 및 다른 세포 잔해를 세척 제거할 수 있 다. 이후, 특정 용출제를 사용하여 결합된 표적 생성물을 방출시킴으로써 표적 생성물을 정제한다.
단점으로서는, 숙주 세포를 먼저 용해시킨 다음 표적 생성물을 정제하는 것과 관련된 여러 단계가, 특히 고 처리량 장치에서 생성물을 단리하는데 필요한 비용 및 시간을 증가시킨다는 것이다.
<발명의 개요>
따라서, 본 발명의 다양한 측면 중에서는 세포를 용해시키고 펩티드, 단백질, 핵산, 또는 기타 세포 성분을 포획하기 위한, 비교적 빠르고 효율적인 방법이 제공된다. 유리하게는, 본 발명의 공정 및 용기를 사용하면, 세포 용액을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하거나, 추가의 디터전트 용해액 또는 효소 억제제 중에서 피펫팅(pipetting)하거나(이에 따라, 본래의 세포 함유 용액을 희석시킴), 또는 후속 정제 단계를 수행할 필요가 없다.
따라서, 요약하면, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 용기에 관한 것이다. 이 용기는 입구(mouth), 내부 표면, 및 내부 표면의 적어도 일부에 코팅된 용해 시약을 포함하는데, 여기서 코팅 중 용해 시약의 양은 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액이 용기내로 도입될 때 숙주 세포를 용해시키는 용량을 갖는 용해액을 형성시키기에 충분하다. 한 실시양태에서, 코팅된 내부 표면적 대 용기 부피의 비율은 약 4 mm2/㎕ 미만이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하 기 위한 용기에 관한 것이다. 이 용기는 입구, 내부 표면, 부피, 용해 시약, 및 지지된 포획 리간드를 포함한다. 상기 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구 및 액체를 용기로부터 제거하기 위한 배출구로서 작용하며, 포획 리간드는, 원형(intact) 숙주 세포 또는 그로부터 유도된 고체 세포 성분을 함유하는 액체 현탁액이 입구를 통해 용기내로 도입될 때, 포획 리간드가 상기 원형 숙주 세포 또는 고체 세포 성분과 접촉하게끔 하는 용기내 위치에 지지된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 다중웰(multiwell) 플레이트에 관한 것이며, 다중웰 플레이트의 웰들 중 하나 이상은 용해 시약을 함유한다. 용해 시약은 (i) 웰(들)의 내부 표면의 적어도 일부에 코팅되어 있거나 또는 (ii) 웰내에 함유된 물질 덩어리 형태이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 공정에 관한 것이다. 이 공정은 (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구, 내부 표면, 및 내부 표면의 적어도 일부에 코팅된 용해 시약을 갖는 용기내에 도입하는 단계 (코팅된 내부 표면적 대 용기 부피의 비율은 약 4 mm2/㎕ 미만임), 및 (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 세포 잔해를 형성시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하는 공정에 관한 것이다. 이 공정은 (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구, 내부 표면, 부피, 용해 시약, 및 지지된 포획 리간드를 갖는 용기내에 도입하 는 단계 (상기 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구 및 액체를 용기로부터 제거하기 위한 배출구로서 작용함), (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 고체 세포 잔해를 형성시키는 단계, 및 (c) 고체 세포 잔해의 존재하에 포획 리간드를 사용해서 세포 성분을 포획하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하기 위한 공정에 관한 것이다. 이 공정은 (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구, 내부 표면, 부피, 용해 시약, 및 지지된 포획 리간드를 갖는 용기내에 도입하는 단계 (상기 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구로서 작용함), (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 고체 세포 잔해를 형성시키는 단계, (c) 고체 세포 잔해의 존재하에 포획 리간드를 사용해서 세포 성분을 포획하는 단계, (d) 포획 리간드로부터 세포 성분을 방출시키는 단계, 및 (e) 방출된 세포 성분을 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하기 위한 키트에 관한 것이다. 이 키트는 본 발명의 용기, 및 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하기 위한 지침을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이 키트는 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및(또는) 단리하기 위한 추가의 시약 및(또는) 포획된 세포 성분을 분석 또는 검출하기 위한 시약을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 용기의 내부 표면과, 용해 시약을 함유하는 액체를 접촉시키는 단계 및 상기 액체를 건조시켜 용기의 내부 표면에 용해 시약 흡착층을 형성시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 용기의 제조 공정에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 특징은 하기에 부분적으로 기재되어 있으며 그러한 기재로부터 부분적으로 명백하다.
도 1은 HIS-셀렉트(HIS-Select) (상표명) 고용량 플레이트로부터 용출된 물질의 SDS-PAGE 겔 사진을 도시한다. 용해 시약을 플레이트 표면에서 건조시키고 세포 0.1 ㎖을 가하였다. 각 레인의 내용물은 표 1에 기재되어 있다. 본 도면은 용해된 조질 세포의 존재하에서 단백질이 플레이트에 결합될 수 있음을 예시한다. 이러한 조건하에서 시약을 바꿔가며 더 많은 양의 단백질이 결합되어 용출될 수 있다.
도 2는 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트로부터 용출된 물질의 SDS-PAGE 겔 사진을 도시한다. 용해 시약 (0.05 ㎖)을 플레이트 표면에서 건조시키고 세포 또는 순수한 단백질 0.1 ㎖을 각 웰에 가하였다. 각 레인의 내용물은 표 3에 기재되어 있다. 본 도면은 용해된 조질 세포의 존재 또는 부재하에서 단백질이 결합될 수 있음을 예시한다. 이러한 조건하에서는 더 많은 양의 단백질이 결합되어 용출될 수 있다.
도 3은 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트로부터 용출된 물질의 SDS-PAGE 겔 사진을 도시한다. 용해 시약 (0.1 ㎖)을 플레이트 표면에서 건조시키고 세포 또는 순수한 단백질 0.1 ㎖을 각 웰에 가하였다. 각 레인의 내용물은 표 3에 기재되어 있다. 본 도면은 용해된 조질 세포의 존재 또는 부재하에서 단백질이 결합될 수 있음을 예시한다. 이러한 조건하에서는 더 많은 양의 단백질이 결합되어 용출 될 수 있다.
도 4는 안티-플래그(ANTI-FLAG) M2 (등록상표) 고감도 플레이트를 사용한 효소 면역검출 검정법으로부터의 보정된 흡광도 (A450) 판독치를 도시한다. 본 챠트에서 사선을 그어 나타낸 막대는 DYKDDDDK (서열 1) 태그가 부착된 단백질에 대한 결과를 나타내고, 수평선을 그어 나타낸 막대는 DYKDDDDK (서열 1)/his-태그가 부착된 단백질에 대한 결과를 나타내며, 백색으로 나타낸 막대는 his-태그가 부착된 단백질에 대한 결과를 나타낸다. 사용한 용해 시약은 실시예 4에 기재되어 있으며, 본 챠트에서는 A 내지 H의 문자로 나타내었다.
도 5는 HIS-셀렉트 (상표명) 고감도 플레이트를 사용한 효소 면역검출 검정법으로부터의 보정된 흡광도 (A450) 판독치를 도시한다. 본 챠트에서 사선을 그어 나타낸 막대는 DYKDDDDK (서열 1) 태그가 부착된 단백질에 대한 결과를 나타내고, 수평선을 그어 나타낸 막대는 DYKDDDDK (서열 1)/his-태그가 부착된 단백질에 대한 결과를 나타내며, 백색으로 나타낸 막대는 his-태그가 부착된 단백질에 대한 결과를 나타낸다. 사용한 용해 시약은 실시예 4에 기재되어 있으며, 본 챠트에서는 A 내지 H의 문자로 나타내었다.
도 6은 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트로부터 용출된 물질의 SDS-PAGE 겔 사진을 도시한다. 용해 시약, 프로세싱(processing) 시약 및 효소의 여러가지 조합물을 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트 표면에서 건조시키고, 표적 단백질을 포함하는 세포를 가하였다. 각 레인의 내용물은 표 6에 기재되어 있다. 본 도 면은 각종 용해 시약이 세포를 용해시킬 수 있었고, 표적 단백질이 성공적으로 포획되어 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트로부터 용출되었음을 예시한다.
도 7은 본 발명의 용기를 도시한다.
1. 용기
일반적으로, 본 발명의 용기는 액체를 보유하는데 적합하며, 바닥부, 입구 및 측벽 형성부를 포함한다. 한 실시양태에서, 측벽 형성부는 다양한 임의의 기하학적 형상을 가질 수 있으며, 예를 들어 본 실시양태에서는 측벽 형성부가 실린더형, 다각형, 원뿔형 또는 오목면 (예를 들어 반구형)일 수 있다. 유사하게, 한 실시양태에서, 바닥부는 다양한 임의의 기하학적 형상을 가질 수 있으며, 예를 들어 본 실시양태에서는 바닥부가 평평하거나 곡면일 수 있고, 또는 심지어 하나의 꼭지점 (예를 들어 뒤집힌 원뿔에서 가장 낮은 지점)을 포함할 수도 있다. 입구는 액체가 용기로 도입될 수 있는 개구부로 작용한다. 한 실시양태에서, 입구와 바닥부는 측벽 형성부에서 대향하는 끝쪽에 있으며, 입구는 측벽 형성부의 최상부에서 개구부에 의해 형성된다. 따라서, 이것의 여러 실시양태에서는 용기가 실린더, 플라스크, 단지, 비커, 바이알, 병 또는 컬럼일 수 있고, 또는 심지어 평면에서의 함몰부일 수도 있다. 또한, 용기는 세울 수 있는 하나의 리셉터클(receptacle)로서 제공될 수도 있고, 또는 복수개의 리셉터클이 물리적으로 통합된 것일 수도 있다. 따라서, 한 실시양태에서는 용기가 하나의 다중웰 플레이트, 예를 들어 48 웰, 96 웰, 384 웰, 1536 웰 등과 같은 다중웰 플레이트의 개개 웰이다. 또한, 용기는 영구 밀폐된 바닥부를 가질 수도 있고, 또는 바닥부가, 용기내의 액체가 임의로 배출될 수 있는 밸브 또는 덮개가 있는 개구부를 포함할 수도 있다.
펩티드, 단백질, 핵산 또는 기타 세포 성분의 추출 또는 추출과 친화성 포획에 사용되는 용기는 그 치수가 다양할 수 있으며, 큰 부피의 액체를 함유할 필요는 없다. 일반적으로, 용기의 부피는 50 ℓ 미만이다. 한 실시양태에서, 용기의 부피는 1 ℓ 이하이면서 1.0 ㎕ 이상이다. 또 다른 실시양태에서, 용기의 부피는 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎖이다.
용기의 내부 표면은 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하며 용기의 액체 부피 용량을 한정한다. 한 실시양태에서, 내부 표면에 의해 한정되는 표면적 : 내부 표면에 의해 한정되는 부피의 비율은 약 4 mm2/㎕ 미만이다. 또 다른 실시양태에서, 용기의 내부 표면에 의해 한정되는 표면적 : 부피의 비율은 약 3 mm2/㎕ 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 용기의 내부 표면에 의해 한정되는 표면적 : 부피의 비율은 약 2 mm2/㎕ 이하이다. 또 다른 실시양태에서, 용기의 내부 표면에 의해 한정되는 표면적 : 부피의 비율은 약 1 mm2/㎕ 이하이다.
의도한 용도 및 조작자의 선택에 따라, 용기는 임의로 밀폐될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서는 입구에 꼭 맞아서 용기내용물을 주변 대기로부터 격리시킬 수 있는 있는 덮개 또는 캡이 용기에 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 용기의 최상부는 환경에 개방되어 있다. 따라서, 예를 들어 용기가 다중웰 플레이트 형태인 경우, (i) 각 웰은 별개의 덮개 (예를 들어 플라스틱 덮개 포장물)로 개별적으로 밀폐될 수 있거나, (ii) 웰의 일부 또는 복수개의 웰이 하나의 덮개로 밀폐되어서 웰의 나머지 분획은 주변 대기에 개방될 수 있거나, (iii) 모든 웰이 하나의 덮개로 밀폐될 수 있거나, 또는 (iv) 모든 웰이 주변 대기에 개방될 수 있다. 또한, 덮개는 액체를 용기로 도입하기 위한 하나의 포트를 포함할 수도 있고, 또는 액체를 용기로 도입하거나 또는 액체를 용기로 도입하고 용기로부터의 배출시키기 위한 복수개의 포트를 포함할 수도 있다. 또 다른 실시양태에서, 용기 바닥부가 용기내의 액체를 임의로 배출시킬 수 있는 개구부를 포함하는 경우에는 용기의 입구와 바닥부 둘 다가 임의로 캡핑될 수 있다.
일반적으로, 용기는 각종 천연 또는 합성 물질로 형성될 수 있다. 예를 들어, 용기는 플라스틱, 실리카, 유리, 금속, 세라믹, 자철광, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 나일론, 폴리아크릴아미드, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 라텍스 등일 수 있다.
2. 포획 리간드 및 생성물 정제
일단 숙주 세포가 용해된 후에는, 세포 성분은 용기내의 지지체 물질상에 고정된 포획 리간드를 사용하여 다른 세포 잔해로부터 단리 및 분리될 수 있다. 포획 리간드는 용기의 내부 표면에 의해 또는 그곳에 고정 배치된 비드 또는 기타 지지체에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 지지되거나, 다른 방법으로 용기내에 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 포획 리간드는 용기의 바닥부에 배치된다. 또 다른 실시양태에서, 포획 리간드는 측벽 형성부에 배치된다. 또 다른 실시양태에서, 포획 리간드는 용기의 바닥부 및 측벽 형성부 둘 다에 배치된다. 또 다른 실시양태에서, 지지된 포획 리간드는 이것이 원형 숙주 세포 또는 그로부터 유래되어 용기내에 존재할 수 있는 고체인 세포 성분에 노출될 수 있는 위치에서 용기에 배치된다.
본 발명의 시약, 성분 및 방법은 소정 범위의 포획 리간드가 사용될 수 있게 하는 것이 유리하다. 한 바람직한 실시양태에서, 포획 리간드는 세포 잔해를 포함하는 액체 현탁액 중의 세포 성분을 단리할 수 있다.
단백질, 펩티드, DNA, RNA 또는 기타 세포 성분을 정제하는 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 기술을 본원에 기재된 용기 및 방법과 함께 이용할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Becker, et al., Biotech. Advs., 1:247-61(1983)]을 참조한다. 한 실시양태에서, 용해 시약의 존재가 결합을 저해하지 않는 한은 임의의 포획 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 통상의 단백질 정제 방법은 표적 단백질, 및 친화성 매트릭스에 높은 특이성으로 결합할 수 있는 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질의 제조를 포함한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 용기는 표적 단백질 또는 펩티드의 친화성 태그에 높은 특이성으로 결합할 수 있는 지지된 포획 리간드를 포함하여, 표적 단백질 또는 펩티드를 다른 단백질 및 세포 잔해로부터 단리한다. 몇몇 예에서, 표적 단백질 또는 펩티드는 상응하는 포획 리간드에 결합할 수 있는 서열을 천연적으로 함유한다. 상기한 예에서, 표적 단백질 또는 펩티드와 결합할 수 있는 포획 리간드가 존재하는 한, 단백질을 재조합시킬 필요는 없다. 단백질 또는 펩티드 포획에 사용될 수 있는 공지된 친화성 포획 시스템의 몇몇 특정 예로는 (i) 금속 킬레이트 크로마토그래피 (예를 들어, 니켈 또는 코발트와 히스티딘 태그와의 상호작용), (ii) 면역원성 포획 시스템, 예를 들어 항원-항체 상호작용을 이용한 면역원성 포획 시스템 (예를 들어, 플래그 (등록상표) 펩티드, c-myc 태그, HA 태그 등), (iii) 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 포획 시스템, 및 (iv) 바이오틴-아비딘/스트렙타비딘 포획 시스템 등이 있다. 다른 기술로는 음이온 교환 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피 둘 다를 포함하는 이온 교환 크로마토그래피 뿐만이 아니라 소수성 크로마토그래피 및 호황성(thiophilic) 크로마토그래피 등이 있다. 이들 각종 포획 방법의 조합, 예를 들어 혼합 방식의 크로마토그래피 역시 이용할 수 있다. 이들 기술은 단백질 정제에 통상적으로 이용되는 기술의 몇가지 예이다. 소수성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 각종 혼성화 기술, 예를 들어 표적 DNA 또는 표적 RNA에 특이성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 이용한 혼성화 기술 역시 DNA 및 RNA 정제에 통상적으로 이용된다. 또 다른 통상의 RNA 포획 방법은 폴리(dT)이다. 이러한 포획 시스템 및 기타 포획 시스템은 당업계에 공지되어 있는 것이기 때문에 본원에서는 단지 간략하게만 기재할 것이다.
고정 금속 친화성 크로마토그래피 ("IMAC")는 단백질 내 특정 잔기가 금속 이온에 대해 갖는 친화성을 이용하여 단백질을 정제한다. IMAC에서는 금속 이온이 고체 지지체에 고정되어 있고 이것을 이용하여 금속 킬레이팅 펩티드를 포함하는 단백질을 포획한다. 금속 킬레이팅 펩티드는 단백질 내의 천연 발생적인 것일 수도 있고, 또는 단백질이 금속 킬레이팅 펩티드를 포함하는 친화성 태그가 부착된 재조합 단백질일 수도 있다. 가장 통상적으로 사용되는 금속 이온 중 몇가지로는 니켈 (Ni2 +), 아연 (Zn2 +), 구리 (Cu2 +), 철 (Fe3 +), 코발트 (Co2 +), 칼슘 (Ca2 +), 알루미늄 (Al3 +), 마그네슘 (Mg2 +), 망간 (Mn2 +) 및 갈륨 (Ga3 +) 등이 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 용기 및(또는) 지지체는 그의 표면 또는 그의 일부에 고정된 금속 이온을 포함하며, 이때의 금속 이온은 니켈 (Ni2 +), 아연 (Zn2 +), 구리 (Cu2 +), 철 (Fe3+), 코발트 (Co2 +), 칼슘 (Ca2 +), 알루미늄 (Al3 +), 마그네슘 (Mg2 +), 망간 (Mn2 +) 및 갈륨 (Ga3 +)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상기 금속 이온이 니켈, 구리, 코발트 또는 아연인 것이 바람직하다. 상기 금속 이온이 니켈인 것이 가장 바람직하다.
금속 킬레이팅 펩티드를 함유하는 각종 단백질은 이러한 방법으로 정제할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,569,794호 (Smith, et al. (1986))에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 금속 킬레이팅 펩티드의 화학식은 His-X (여기서, X는 Gly, His, Tyr, Trp, Val, Leu, Ser, Lys, Phe, Met, Ala, Glu, lle, Thr, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys 및 Pro로 이루어진 군으로부터 선택됨)일 수 있다. 또한, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,594,115호 (Sharma, et al. (1997))에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 금속 킬레이팅 펩티드의 화학식은 (His-X)n (여기서, X는 Asp, Pro, Glu, Ala, Gly, Val, Ser, Leu, Ile 또는 Thr으로 이루어진 군으로부터 선택되며, n은 3 내지 6임)일 수도 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,310,663호 (Dobeli, et al. (1994))에 더욱 상세하게 기재된 바와 같이, 금속 킬레이팅 펩티드는 화학식 (His)y (여기서, y는 적어도 2 내지 6임)의 폴리(His) 태그를 포함한다. 금속 킬레이팅 펩티드의 다른 예는 당업계에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 포획 리간드는 WO 01/81365에 기재된 바와 같은 금속 킬레이트이다. 더욱 구체적으로, 이러한 실시양태에서의 포획 리간드는 하기 화학식 1의 금속 킬레이팅 구성으로부터 유래된 금속 킬레이트이다.
Figure 112005063099095-PCT00001
상기 식에서,
Q는 캐리어이고,
S1은 스페이서이고,
L은 -A-T-CH(X)- 또는 -C(=O)-이고,
A는 에테르, 티오에테르, 셀레노에테르 또는 아미드 연결기이고,
T는 결합이거나, 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알케닐이고,
X는 -(CH2)kCH3, -(CH2)kCOOH, -(CH2)kSO3H, -(CH2)kPO3H2, -(CH2)kN(J)2 또는 -(CH2)kP(J)2, 바람직하게는 -(CH2)kCOOH 또는 -(CH2)kSO3H이고,
k는 0 내지 2의 정수이고,
J는 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌이고,
Y는 -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 또는 -P(J)2, 바람직하게는 -COOH이고,
Z는 -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 또는 -P(J)2, 바람직하게는 -COOH이며,
i는 0 내지 4의 정수, 바람직하게는 1 또는 2이다.
일반적으로, 캐리어 Q는 커플링을 위해 유도체화될 수 있는 임의의 고체 또는 가용성 물질 또는 화합물을 포함할 수 있다. 고체 (또는 불용성) 캐리어는 아가로스, 셀룰로스, 메트아크릴레이트 공중합체, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 종이, 폴리아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴, 폴리술폰, 니트로셀룰로스, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 실리카, 유리, 라텍스, 플라스틱, 금, 철 산화물 및 폴리아크릴아미드를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있지만, 조성물의 나머지가 캐리어 Q에 커플링되도록 유도체화될 수 있는 임의의 불용성 또는 고체 화합물일 수도 있다. 가용성 캐리어로는 단백질, DNA, RNA 및 올리고뉴클레오티드 등을 비롯한 핵산, 지질, 리포좀, 합성 가용성 중합체, 단백질, 폴리아미노산, 알부민, 항체, 효소, 스트렙타비딘, 펩티드, 호르몬, 발색 염료, 형광 염료, 형광색소 또는 임의의 기타 검출 분자, 약물, 작은 유기 화합물, 다당류 및 조성물의 나머지가 캐리어 Q에 커플링되도록 유도체화될 수 있는 임의의 기타 가용성 화합물 등이 있다. 한 실시양태에서, 캐리어 Q는 본 발명의 용기이다. 또 다른 실시양태에서, 캐리어 Q는 본 발명의 용기내에 제공되는 물체이다.
캐리어 옆의 스페이서 S1은 포화되거나 포화되지 않고, 또는 치환되거나 치 환되지 않고, 또는 선형이거나 고리형이고, 또는 직쇄형이거나 분지형일 수 있는 원자 쇄를 포함한다. 전형적으로, 스페이서 S1을 한정하는 원자 쇄는 약 25개 이하의 원자로 구성되고, 언급된 또 다른 방법에서 스페이서의 주쇄는 약 25개 이하의 원자로 구성된다. 더욱 바람직하게는, 스페이서 S1을 한정하는 원자 쇄는 약 15개 이하의 원자, 훨씬 더욱 바람직하게는 약 12개 이하의 원자로 구성된다. 스페이서 S1을 한정하는 원자 쇄는 전형적으로 탄소, 산소, 질소, 황, 셀레늄, 규소 및 인으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 탄소, 산소, 질소, 황 및 셀레늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 쇄 원자는 수소 이외의 원자, 예를 들어 히드록시, 케토 (=O), 또는 아실, 예를 들어 아세틸로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 따라서, 상기 쇄는 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌 부위 사이에 1개 이상의 에테르, 티오에테르, 셀레노에테르, 아미드 또는 아민 연결기를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서 S1의 예로는 메틸렌, 알킬렌옥시 (-(CH2)aO-), 알킬렌티오에테르 (-(CH2)aS-), 알킬렌셀레노에테르 (-(CH2)aSe-), 알킬렌아미드 (-(CH2)aNR1C(=O)-), 알킬렌카르보닐 (-(CH2)aC(=O)-) 및 이들의 조합 (여기서, a는 일반적으로 1 내지 약 20이고, R1은 수소 또는 히드로카르빌, 바람직하게는 알킬임) 등이 있다. 한 실시양태에서, 스페이서 S1은 친수성의 중성 구조물이며 임의의 아 민 연결기 또는 치환기 또는 폴리펩티드의 정제 동안에 전기적으로 대전될 수 있는 다른 연결기 또는 치환기를 함유하지 않는다.
상기 언급한 바와 같이, 링커 L은 -A-T-CH(X)- 또는 -C(=O)-일 수 있다. L이 -A-T-CH(X)-인 경우, 상기 킬레이팅 구성은 하기 화학식에 상응한다.
Figure 112005063099095-PCT00002
상기 식에서, Q, S1, A, T, X, Y 및 Z는 앞서 정의한 바와 같다. 이러한 실시양태에서, 에테르 (-O-), 티오에테르 (-S-), 셀레노에테르 (-Se-) 또는 아미드 (-NR1C(=O)-) 또는 (-C(=O)NR1-) (여기서, R1은 수소 또는 히드로카르빌임) 연결기는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알케닐 부위에 의해서 상기 분자의 킬레이팅 부분으로부터 분리된다. T는, 결합이 아닌 경우에는 치환되거나 치환되지 않은 C1-6알킬 또는 치환되거나 치환되지 않은 C2 -6 알케닐인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, A는 -S-이고 T는 -(CH2)n-이며 이때의 n은 0 내지 6의 정수, 전형적으로는 0 내지 4의 정수, 더욱 전형적으로는 0, 1 또는 2이다. L이 -C(=O)-인 경우에는 상기 킬레이팅 조성물이 하기 화학식에 상응한다.
Figure 112005063099095-PCT00003
상기 식에서, Q, S1, i, Y 및 Z는 앞서 정의한 바와 같다.
바람직한 실시양태에서, 서열 -S1-L-의 조합은 탄소, 산소, 황, 셀레늄, 질소, 규소 및 인으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 더욱 바람직하게는 오직 탄소, 산소, 황 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 훨씬 더욱 바람직하게는 오직 탄소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 약 35개 이하의 원자로 구성된 쇄이다. 비특이적 결합의 가능성을 줄이기 위해서, 질소가 존재하는 경우에는 상기 질소가 아미드 잔기의 형태인 것이 바람직하다. 또한, 탄소 쇄 원자가 수소 이외의 임의의 것으로 치환되는 경우에는 이것이 히드록시 또는 케토로 치환되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, L은 아미노산, 예를 들어 시스틴, 호모시스틴, 시스테인, 호모시스테인, 아스파르트산, 시스테인산 또는 그의 에스테르, 예를 들어 그의 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르로부터 유래된 부분 (때로는 단편 또는 잔기라고 지칭되기도 함)을 포함한다.
킬레이팅 구성의 예는 다음과 같다.
Figure 112005063099095-PCT00004
Figure 112005063099095-PCT00005
Figure 112005063099095-PCT00006
Figure 112005063099095-PCT00007
Figure 112005063099095-PCT00008
Figure 112005063099095-PCT00009
상기 식에서, Q는 캐리어이고, Ac는 아세틸이다.
또 다른 실시양태에서, 포획 리간드는 미국 특허 제5,047,513호에 기재된 유형의 금속 킬레이트이다. 더욱 구체적으로, 이러한 실시양태에서는 포획 리간드가 화학식 NH2-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COOH)2 (여기서, x는 2, 3 또는 4임)의 니트릴로트리아세트산 유도체로부터 유래된 금속 킬레이트이다. 이러한 실시양태에서, 니트릴로트리아세트산 유도체는 앞서 기재한 임의의 캐리어 Q상에 고정된다.
포획 리간드가 WO 01/81365 또는 미국 특허 제5,047,513호에 기재된 바와 같은 금속 킬레이트인 상기 실시양태에서는, 금속 킬레이트가 니켈 (Ni2 +), 아연 (Zn2+), 구리 (Cu2 +), 철 (Fe3 +), 코발트 (Co2 +), 칼슘 (Ca2 +), 알루미늄 (Al3 +), 마그 네슘 (Mg2 +) 및 망간 (Mn2 +) 중에서 선택된 금속 이온을 함유하는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 금속 킬레이트는 니켈 (Ni2 +)을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 또 다른 일반적인 정제 기술은 면역원성 포획 시스템을 사용하는 것이다. 상기 시스템에서, 단백질 또는 펩티드 상의 에피토프 태그는 지지체 상에 고정된 상응하는 리간드 (예를 들어, 항체)에 대한 에피토프 태그의 친화성을 기준으로 단백질이 부착되어 정제되도록 한다. 이러한 태그의 한 예는 서열 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 또는 DYKDDDDK (서열 1)이고, 이 서열에 대해 특이성을 갖는 항체는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 상표명 플래그(등록상표)로 시판된다. 이러한 태그의 또 다른 예는 서열 Asp-Leu-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 또는 DLYDDDDK (서열 2)이고, 이 서열에 대해 특이성을 갖는 항체는 인비트로젠(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스배드 소재)으로부터 시판된다. 이러한 태그의 또 다른 예는 3X 플래그(등록상표) 서열 Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (서열 3)이고, 이 서열에 특이성을 갖는 항체는 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 시판된다. 따라서, 한 실시양태에서 용기는 서열 1에 대해 특이성을 갖는 고정된 항체를 포함하고, 또 다른 실시양태에서 용기는 서열 2에 대해 특이성을 갖는 고정된 항체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서 용기는 서열 3에 대해 특이성을 갖는 고정된 항체를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서 시그마-알드리치 (미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 시판되는 안티- 플래그(등록상표) M1, M2 또는 M5 항체는 용기의 내부 표면 또는 그의 일부분 및(또는) 용기내의 비드 또는 다른 지지체 상에 고정된다.
다른 태그는 또한 기질에 부착된 상응하는 리간드에 대한 그들의 친화성을 기준으로 하여 재조합 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 이러한 다른 태그의 일부 예로는 특히 c-myc, 말토즈 결합 단백질 (MBP), 인플루엔자 A 바이러스 적혈구 응집소 (HA) 및 β-갈락토시다제가 있다. 상응하는 리간드가 본 발명의 용기 및(또는) 고체 지지체 상에 부착됨으로써, 본원에 기재된 바와 같이 상기 친화성 태그를 함유하는 재조합 단백질이 다른 단백질 및 세포 잔해로부터 정제될 수 있다. 비-재조합 단백질은 단백질 또는 펩티드 서열 또는 상기 서열의 일부분에 대해 친화성을 갖는 리간드를 본 발명의 용기 및(또는) 지지체 상에 부착시킴으로써 유사한 방식으로 정제될 수 있다. 적절한 리간드의 선택은 당업자의 능력 내에 있다.
또 다른 실시양태에서, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 함유하는 단백질은 상기 단백질을 고정된 글루타티온과 접촉시킴으로써 정제할 수 있다. 상기 단백질은 GST의 그의 기질에 대한 친화성의 결과로서 정제될 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어 미국 특허 제5,654,176호에 더욱 상세히 기재되어 있고, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입된다. 따라서, 또 다른 실시양태에서, 글루타티온은 용기의 내부 표면 또는 그의 일부분 및(또는) 용기내의 비드 또는 다른 지지체 상에 고정된다.
단백질은 또한 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 아비딘, 스트렙타비딘, 또 는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 유도체와 조합하여 사용함으로써 정제될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 스트렙타비딘은 본 발명의 용기 및(또는) 지지체 상에 고정되고, 바이오틴 표지된 단백질은 스트렙타비딘에 대한 바이오틴의 친화성을 기준으로 하여 정제될 수 있다. 마찬가지로, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,506,121에 기재된 것과 같은 스트렙타비딘 태그를 함유하는 단백질은 스트렙타비딘에 대한 태그의 친화성을 기준으로 하여 정제될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 바이오틴이 본 발명의 용기 및(또는) 고체 지지체 상에 고정되고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 태그를 함유하는 단백질은 아비딘 및 스트렙타비딘에 대한 바이오틴의 친화성을 기준으로 하여 정제될 수 있다. 아비딘/바이오틴 또는 바이오틴/스트렙타비딘 친화성 정제 기술의 이용은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001]에 기재되어 있다.
단백질 및 DNA 또는 RNA는 또한 이온 교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피에서, 고체 지지체 상에 고정된 하전된 입자는 표면 전하를 갖는 단백질 또는 DNA에 가역적으로 결합한다. 예를 들어, 이온-교환 포획 리간드는 질소기, 카르복실기, 포스페이트기 또는 술폰산기를 함유할 수 있다. 이온-교환 포획 리간드의 예로는 디에틸아미노에틸 (DEAE), 디에틸[2-히드록시프로필]아미노에틸 (QAE), 카르복시메틸 (CM), 및 술포프로필 (SP) 및 포스포릴이 있다. 소수성 크로마토그래피에서, 표면에 소 수성기를 갖는 단백질 또는 DNA는 고체 지지체 상에 고정된 불용성 소수성기와의 소수성 상호작용을 기준으로 하여 정제될 수 있다. 소수성 리간드의 예로는 실리카, 페닐, 헥실, 옥틸 및 C18 기가 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 하전된 입자는 본 발명의 용기 및(또는) 지지체의 표면 상에 고정된다. 또 다른 실시양태에서, 불용성 소수성기는 본 발명의 용기 및(또는) 지지체의 표면 상에 고정된다.
다른 적합한 포획 리간드로는 예를 들어 호르몬, 아미노산, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 렉틴, 효소, 효소 기질, 효소 억제제, 보조인자, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 올리고 dT), 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 당, 올리고당류, 약물 및 염료가 있다.
다양한 다른 정제 기술이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 용기 및 방법과 함께 이용될 수 있다. 이러한 일부 기술은 예를 들어 문헌 [Kenney & Fowell, Methods in Molecular Biology, Vol. 11, Practical Protein Chromatography (1992)], [Hanson & Ryden, Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications (1989)], [Dean, et al., Affinity Chromatography: A Practical Approach (1987)], [Hermanson, et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques (1992)], 및 [Jakoby & Wilchek, Affinity Techniques, Enzyme Purification, Part B, in Methods in Enzymology, Vol. 34 (1974)]에 기재되어 있다.
세포 성분이 포획 리간드에 결합하면, 세포 잔해가 예를 들어 물 또는 완충액의 사용에 의해 세척 제거될 수 있다. 세척 후, 결합된 세포 성분은 포획 리간 드와의 회합으로부터 유리되어, 특성 분석 및 정량화를 위해 제거될 수 있다. 표적 세포 성분의 방출은 pH 또는 온도의 변화, 또는 경쟁적 결합을 비롯한 다양한 용출 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 구체적인 용출 기술은 이용되는 포획 시스템에 따라 달라지며, 당업자에게 자명할 것이다. 대안적으로, 포획된 성분이 고정된 리간드에 부착되어 있는 동안 검출할 수 있다. 예를 들어 특히 ELISA, 효소 분석 및 단백질 검출을 비롯한 다양한 분석 기술이 공지되어 있다.
3. 중합체 코팅
한 실시양태에서, 포획 리간드는 용기의 내부 표면에 직접 결합한다. 대안적으로, 포획 리간드는 용기 표면에 덮힌 중합체 매트릭스에 결합할 수 있다. 달리 말하면, 포획 리간드가 중합체 매트릭스에 직접 결합하고, 중합체 매트릭스가 용기의 내부 표면 상에 결합되거나 달리 고정된다. 예를 들어, 포획 리간드는 폴리스티렌 또는 다른 플라스틱 하층 위에 덮힌 유도체화 덱스트란 중합체 매트릭스에 결합된 금속 킬레이팅 조성물일 수 있다. 따라서, 중합체 매트릭스를 사용함으로써 (아래에 있는 하층보다 넓은 표면적을 제공하는 매트릭스를 가짐으로써) 유효한 표면적을 증가시킬 수 있고, 이로써 포획 리간드의 밀도를 증가시킬 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 중합체 매트릭스는 용기 벽에 비해 더 소수성이거나 덜 소수성일 수 있고, 이로써 하층의 원래 표면보다 바람직하게는 더욱 (또는 달리 덜) 친수성인 표면이 제공된다.
중합체 코팅은 다양한 방법에 의해 형성되거나 도포될 수 있다. 예를 들어, 중합체 코팅은 계내 중합에 의해 형성될 수 있고, 이 접근법에서는, 단량체의 혼합 물을 개시제와 함께 용매에 용해시키고, 활성화시킨 후 용기 벽의 표면 상에서 중합을 수행한다. 대안적으로, 충분히 형성된 중합체를 용기 벽의 표면 상에 고정시킬 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 선드버그(Sundberg) 등의 미국 특허 제5,624,711호에 기재되어 있다.
중합체 코팅을 도포하는 바람직한 실시양태에서, 중합체 코팅은 용기 벽에 결합된 두가지 중합체의 혼합물로부터 유도된다. 일반적으로, 상기 중합체 중 하나 또는 둘 다는 반응성기를 함유하며, 이러한 반응성기를 함유하는 중합체 분자는 활성화되었을 때 용기 벽에 화학 결합하고(하거나) 상기 분자 자체끼리 또는 다른 중합체 분자와 가교한다. 또한, 상기 중합체 중 하나 또는 둘 다는 본원에 기재된 포획 리간드에 대한 부착 지점을 제공하는 활성화가능한 기를 함유할 수 있다. 이러한 중합체 코팅 및 그의 형성 수단은 미국 특허 출원 공보 제2003/0032013 A1호에 개괄적으로 기재되어 있다.
기질 상의 중합체 매트릭스의 밀도는 특히 사용되는 특정 중합체 및 반응성기의 선택 및 양에 따라 조절될 수 있다. 중합체의 분자량, 반응성기의 개수 및 유형, 및 포획 리간드의 개수 및 분자량은 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이 선택되고 조정될 수 있다. 중합체 매트릭스는 모든 기질에 또는 기질의 일부분에만 부착될 수 있다. 예를 들어, 용기 벽의 일부분에만 또는 다중웰 플레이트의 웰의 한 분획에만 중합체 매트릭스가 제공될 수 있다.
중합체 혼합물로부터 형성된 중합체 매트릭스
중합체 매트릭스를 포함하는 용기는 반복 단위를 갖는 복수개의 중합체 분자 를 포함하는 중합체 조성물과 용기 기질을 접촉시킴으로써 제조될 수 있으며, 상기 중합체 분자 중 적어도 일부는 그에 공유 결합된 1개 이상의 반응성기를 갖고, 상기 중합체 분자 중 적어도 일부는 그에 공유 결합된 1개 이상의 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기)를 갖고, 상기 중합체 분자는 평균 분자량이 100 kDa 이상이고, 상기 중합체 분자 중 25％ 이상은 그에 공유 결합된 1개 이상의 반응성기 및 1개 이상의 포획 리간드를 갖는다. 상기 반응성기는 활성화되어 중합체 분자 중 적어도 일부분에서 용기 기질에 직접 결합하고, 중합체 분자들 사이의 가교를 유도하여, 용기 기질에 부착된 중합체 매트릭스를 형성한다.
일반적으로, 중합체 매트릭스는 천연 중합체 (또는 그의 유도체), 합성 중합체 (또는 그의 유도체), 천연 중합체 (또는 그의 유도체(들))의 블렌드, 합성 중합체 (또는 그의 유도체(들))의 블렌드, 또는 1종 이상의 천연 중합체 (또는 그의 유도체(들))와 1종 이상의 합성 중합체 (또는 그의 유도체(들))의 블렌드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 천연 중합체는 생물계에서 생성된 분지형 또는 선형 중합체이다. 천연 중합체의 예로는 올리고당류, 다당류, 펩티드, 단백질, 글리코겐, 덱스트란, 헤파린, 아밀로펙틴, 아밀로스, 펙틴, 펙트산 다당류, 전분, DNA, RNA 및 셀룰로스가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 특정 개질 천연 중합체는 과요오드산염 산화 및 환원성 아민화 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용하여 덱스트란 분자를 따라 여러 선형 위치에 리신을 공유적으로 삽입함으로써 제조된 덱스트란-리신 유도체이다. 반대로, 합성 중합체는 인공 제조된 분지형 또는 선형 중합체이다. 합성 중합체의 예로는 플라스틱, 엘라스토머 및 접착 제, 부가, 축합 또는 촉매 유도된 중합 반응, 즉 축합 중합 반응에 의해 제조된 올리고머, 단독중합체 및 공중합체가 있다. 천연이건 합성이건 간에, 중합체는 산화에 의해 또는 광-반응성기, 친화성 리간드, 이온 교환 리간드, 소수성 리간드, 다른 천연 또는 합성 중합체, 또는 스페이서 분자의 공유 결합에 의해 유도체화되거나 개질될 수 있다.
따라서, 중합체 매트릭스는 1종 이상의 여러 상이한 중합체 유형을 포함할 수 있다. 중합체의 예로는 셀룰로스-기재 생성물, 예컨대 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 및 셀룰로스 부티레이트; 아크릴, 예컨대 히드록시에틸 아크릴레이트, 히드록시에틸 메타크릴레이트, 글리세릴 아크릴레이트, 글리세릴 메타크릴레이트, 아크릴산, 메타크릴산, 아크릴아미드 및 메타크릴아미드로부터 중합된 것; 비닐, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리비닐 알코올; 나일론, 예컨대 폴리카프로락탐, 폴리라우릴 락탐, 폴리헥사메틸렌 아디프아미드 및 폴리헥사메틸렌 도데칸디아미드; 폴리우레탄; 폴리락트산; 선형 다당류, 예컨대 아밀로스, 덱스트란, 키토산, 헤파린 및 히알루론산; 및 분지형 다당류, 예컨대 아밀로펙틴, 히알루론산 및 헤미셀룰로스가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 2종 이상의 상이한 중합체 분자의 블렌드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서 중합체 분자는 덱스트란과 헤파린의 혼합물이다. 또 다른 실시양태에서 덱스트란은 폴리 Lys-Gly (20개의 글리신 당 1개의 리신)과 혼합된다.
일반적으로, 중합체 분자는 바람직하게는 평균 분자량 (공유 결합된 관능기 를 포함하는 중합체의 전체 분자량)이 100 kDa 이상이다. 일부 실시양태에서, 중합체 분자는 평균 분자량이 300 kDa 내지 6,000 kDa이다. 일부 실시양태에서, 중합체 분자는 평균 분자량이 400 kDa 내지 3,000 kDa이다. 또 다른 실시양태에서, 중합체 분자는 평균 분자량이 500 kDa 내지 2,000 kDa이며, 이 때, 평균 분자량은 다각도 광산란 및 굴절율 검출을 이용하는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 측정한 중합체의 중량 평균 분자량 (Mw) 수치이다. 존재하는 모든 쇄 길이의 중합체 분포의 평균 Mw는 굴절율에 의해 측정된 피크의 선택을 기준으로 하고, 굴절율 수치의 시작 및 끝 피크의 선택 요건은 굴절율 기준선의 3배이다. 예시된 바와 같이, 바람직한 중합체는 분자량 범위가 112 kDa 내지 19,220 kDa로서 평균 Mw가 1,117 kDa일 수 있다.
한 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 중합체 혼합물을 고정시킴으로써 형성되며, 혼합물 중 중합체 분자의 하위집합은 포획 리간드(들) 또는 포획 리간드의 후속적인 공유 결합을 가능하게 하는 활성화가능한 기(들)을 함유하고, 중합체 분자의 여러 하위집합은 (상기 기재한 바와 같이 용기 벽에 중합체를 부착시키고 가교시키기 위해) 공유 결합된 1개 이상의 반응성기를 갖는다. 중합체 분자들간 반응성기의 상호작용은 3차원 매트릭스의 형성을 가능하게 한다. 반응성기는 열화학적으로 또는 광화학적으로 반응한다 (광-반응성기를 함유하는 중합체는 광 표지된 것으로 지칭된다).
중합체 분자가 공유 결합된 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기)를 가질 때, 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기) 대 중합체 반복 단위의 비율은 바람직하게는 각각 약 1:1 포획 내지 약 1:100이다. 예를 들어, 한 실시양태에서 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기) 대 중합체 반복 단위의 비율은 바람직하게는 각각 약 1:1 포획 내지 약 1:20이다. 중합체 분자가 공유 결합된 반응성기를 가질 때, 반응성기 대 중합체 반복 단위의 비율은 바람직하게는 약 1:600 미만이고, 더욱 바람직하게는 반응성기 대 중합체 반복 단위의 비율은 바람직하게는 각각 약 1:200 미만이다.
반응성기의 예로는 크로마토그래피 매질의 제조에 사용되는 반응성기, 예컨대 에폭시드, 옥시란, N-히드록시숙신이미드, 알데히드, 히드라진, 말레이미드, 머캅탄, 아미노기, 알킬할로겐화물, 이소티오시아네이트, 카르보디이미드, 디아조 화합물, 트레실 클로라이드, 토실 클로라이드 및 트리클로로-S-트리아진이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 바람직한 반응성기는 α,β-불포화 케톤 광-반응성기이다. 광-반응성기의 예로는 아릴 아지드, 디아자렌, 베타-카르보닐디아조 및 벤조페논이 있다. 반응성 화학종은 니트렌, 카르벤 및 라디칼이다. 이들 반응성 화학종은 일반적으로 공유 결합을 형성할 수 있다. 바람직한 광-반응성기는 광-활성화가능한 불포화 케톤, 예컨대 아세토페논, 벤조페논 및 이들의 유도체이다. 광-반응성기는 광과 접촉했을 때 활성화되어 고체 기질의 표면에 공유 결합할 수 있다. 예를 들어, 광-반응성기는 광의 강도 및 노출 지속 시간에 따라 약 3 J/㎠ 내지 약 6 J/㎠의 UV 광에 노출되어 활성화될 수 있다. 노출 시간은 광원의 강도에 따라 0.5 초/㎠ 내지 대략 32 분/㎠의 범위일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 광-반응성기는 약 1,000 mW/㎠ 내지 약 5,000 mW/㎠, 또는 약 1,000 mW/㎠ 내지 약 3,000 mW/㎠, 또는 약 1,500 mW/㎠ 내지 약 2,500 mW/㎠에서 0.5 초/㎠ 내지 5 초/㎠ 동안 광에 노출되어 활성화된다.
한 실시양태에서, 포획 리간드 및(또는) 반응성기는 스페이서를 통해 중합체 분자에 공유 결합된다. 중합체 매트릭스의 형성과 관련하여 사용될 때, 스페이서는 한 분자이거나 중합체 분자를 연결하는 공유 결합된 분자들의 조합이고, 1개 이상의 포획 리간드 또는 반응성기이다. 스페이서는 임의의 중합체, 중합체 조성물 또는 중합체 매트릭스와 동일하거나 상이할 수 있다. 당업자는 여러 유형의 스페이서가 이용될 수 있고, 그의 선택 및 사용은 중합체 매트릭스, 예를 들어 리신 분자 또는 아미노카프로산 분자의 의도된 용도에 따라 좌우된다는 것을 알고 있을 것이다.
스페이서는 아미드 형성을 비롯한 수많은 여러 화학에 의해 광-반응성기에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 탄화수소 스페이서의 사용은 중합체 매트릭스 안정성을 급격히 향상시킨다. 스페이서를 갖는 광-반응성기는 전체 단량체 (글루코스)에 대한 비율의 조절하에 바람직한 중합체 덱스트란의 1급 아민의 일부분에 아미드 결합에 의해 커플링될 수 있다. 스페이서를 갖는 광-반응성기의 예로는 벤조벤조산, 아미노카프로산, N-숙신이미딜-N'-(4-아지도-살리실)-6-아미노카프로에이트, N-숙신이미딜-(4-아지도-2-니트로페닐)-아미노부티레이트 및 N-숙신이미딜-(4-아지도-2-니트로페닐)-6-아미노카프로에이트가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 스페이서를 갖는 이들 광-반응성기는 중합체와 반응하여, 광-반응성기에 부착된 원래의 스페이서 뿐만 아니라 리신을 포함하는 스페이서를 형성할 수 있다. 스페이서는 또한 리신 및 아미노카프로산과 같은 다중 분자를 추가의 스페이서를 함유하거나 함유하지 않는 광-반응성기를 부착하기 전에 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 중합체 분자에 공유 부착된 반응성기의 예는, 아미노기로부터 반응성 수소를 잃음으로써 하나 이상의 반응성기의 화학 물질에 결합된 리신의 부분 또는 잔기를 포함하는 스페이서이다. 한 실시양태에서, 리신 스페이서가 기여하는 일차 아민의 밀도는 바람직한 포획 리간드 및 반응성기의 밀도를 나타낸다. 일차 아민 또는 스페이서와 같은 다른 부분을 매 1 내지 100개 중합체 반복 단위당 1개 부분의 범위로 함유하는 개질된 중합체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 부분을 개질하여 바람직한 양의 반응성기를 선택적으로 혼입시키는 것은 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 리신 스페이서가 기여하는 일차 아민의 밀도는 매 12개 덱스트란 중합체 반복 글루코스 단위에 대해 평균 1이다. 상기 밀도는 광-반응성기의 바람직한 혼입도에 비해 매우 높으며, 예를 들어 200개 반복 단량체당 1개 미만의 광-반응성기이다. 중합체의 제조 동안 용액 중 일차 아민의 농도는 4.5 μmol/mL일 수 있는 반면, 광-반응성기의 바람직한 혼입도는 0.09 μmol/mL을 나타낼 것이다. 따라서, 상기한 예에서, 반응성 에스테르를 통한 필요한 광-반응성기 혼입에 대해 50배 과량의 일차 아민이 존재할 것이다. 아민의 상기 농도에서, 반응성 에스테르를 통해 광-반응성기를 바람직한 혼입 수준으로 첨가하면 90％를 초과하는 효율의 혼입을 얻는다. 반응성 에스테르를 함유하는 광-반응성기의 양을 변경함으로써, 200개 단량체 당 1개 미만의 반응성기의 임의의 혼입도 수준을 일정하게 달성할 수 있다. 각각의 남아있는 스페이서 부분 또는 아민을 포 획 리간드 부착 지점으로 효율적으로 전환시키는데 필요한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 수 배 과량의 아민 반응성기, 예를 들어 반응성 에스테르, 유도체화 시약이 일 단계로 직접 또는 다단계로 포획 리간드의 부착에 사용된다. 일부의 경우, 유도체화 시약은 그 반응성에 따라 후속 포획 리간드 부착을 위한 화학량론을 지시하게 되는 추가의 반응성기를 제공할 것이다. 보다 낮은 리간드 밀도가 바람직할 경우, 최초 아민 반응성 유도체화 시약은 그에 따라 낮아질 것이다. 일부의 경우, 선택적 개질 후에 남아있는 유리 아민은 일반적으로 아세틸화에 의해 유도체화될 것이다.
기재 표면을 코팅하는데 있어서 제1 단계는 중합체 조성물을 코팅될 기재 표면과 접촉시키는 것이다. 중합체 조성물을 용기 표면과 접촉시키는데 사용되는 방법은 코팅될 표면의 치수 및 형상에 따라 다르다. 용기는 상기 열거된 것과 같은 다양한 천연 및 합성 물질로부터 제조될 수 있다. 용기 표면은 코팅 전에 유도체화될 수 있다. 예비-유도체화는 실리카 및 유리의 실란화 및 폴리스티렌 또는 폴리프로필렌의 플라즈마 처리를 비롯한 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 아민, 카르복실기, 알코올, 알데히드 및 기타 반응성기를 혼입시킴으로써, 또는 표면의 화학적 개질로 그의 화학적 조성을 변화시킴으로써 수행될 수 있다.
필요할 경우, 기재 표면을 화학적으로 개질하여 중합체 분자 상에 담지된 반응성기와의 공유 결합을 용이하게 할 수 있다. 이러한 개질로는 기재 표면을 탄화수소로 처리하는 것, 또는 표면을 플라즈마-처리하는 것을 들 수 있다. 화학적 개질의 예시적인 예는 유리의 실란화이다. 바람직한 실시양태에서, MALDI 플레이트 를 클로로포름에 용해된 파라필름 1 mg/mL 용액 내로 침지하고 건조시킨다.
0.1 ㎟ 초과의 다중웰 플레이트, 튜브 또는 표면 또는 그의 부분을 코팅할 경우, 코팅될 용기 또는 플레이트, 예를 들어 웰의 부분 상에 중합체 조성물을 붓거나, 마이크로피펫팅하거나, 옮김으로써 용기 표면과 접촉시킬 수 있다. 별법으로, 코팅될 2 ㎟ 초과의 플레이트, 튜브, 용기 표면, 또는 지지체의 부분은 또한 중합체 조성물 용액 내로 표면의 부분을 침지하여 용기 표면을 중합체 조성물과 접촉하도록 놓음으로써 코팅할 수 있다.
용기 표면에 부착된 중합체의 양은 기재에 첨가된 중합체 조성물 농도 및 부피를 변경함으로써 조정 또는 제어될 수 있다. 일단 중합체 조성물을 표면과 접촉하게 놓고, 반응성기를 활성화시키기 전에 중합체 조성물을 용기 표면 상에서 건조시킬 수 있으며, 예를 들어 어두운 곳에서 20 내지 50℃에서 기류와 함께 인큐베이션함으로써 증발 건조시킬 수 있다. 또한, 중합체 조성물을 동결건조 또는 공기 건조를 비롯한 임의의 다른 건조 수단에 의해 증발시켜 용매를 제거할 수 있다. 건조 단계에 반응하는 반응성기의 때이른 활성화가 없는 한 다양한 건조 방법이 사용될 수 있다. 기재는 수분이 육안으로 검출되지 않을 경우 충분히 건조된 것으로 여겨진다. 건조 동안, 중합체 조성물의 중합체 분자는 기재 표면과 결합하거나 서로 상호작용하여 중합체 조성물의 다른 중합체와의 상호 및 내부-가교를 촉진하도록 그 자신들을 향하게 된다.
그 후, 건조된 코팅된 고체 표면을 처리하여 반응성기가 기재와 공유 결합하도록 유도한다. 광-반응성기의 경우, 이들은 조사에 의해 활성화될 수 있다. 활 성화는 반응성기가 기재에 결합하도록 하는 외부 자극의 적용이다. 구체적으로, 공유 결합은 기재 및 반응성기 사이에 형성되며, 예를 들어 탄소-탄소 결합 형성이다.
광-반응성 중합체를 탄화수소가 풍부한 기재에 결합시키는데 필요한 총 에너지 (줄(Joule) 단위로 측정된 투입량)를 전달할 수 있는 많은 UV 조사 시스템이 있다. 조사는 별개의 공지된 조사 파장 패턴을 갖는 수은 램프에 의해 제공될 수 있다. 조사 강도는 3 내지 6 J/㎠의 범위에 해당하는 줄을 필요로 한다. 줄 측정은 시간 인자 (1 J = W ×초)를 포함한다. 한 실시양태에서, 조사는 마이크로파 방사선에 의해 전력인가되는 무전극 수은 램프에 의해 제공된다. 6 인치, 500 W/인치의 램프 1개는 기재에 대한 램프의 거리 약 2 인치에서 UVA 범위에서 측정된 2,500 mW/㎠의 정격 출력을 갖는다. 램프는 80％ 전력 또는 대략 2,000 mW/㎠에 성공적으로 작동할 수 있다. 샘플 플레이트는 우수한 결합을 제공하기 위해 대략 9.0 mW/㎠에서 측정된 조사 강도 (UVA/UVB, 대략 250 내지 350 nm)를 가지며 10 J/㎠ (10,000 mJ) 초과의 총 에너지를 필요로 하는 표준 저강도 UV 조사 박스를 사용하여 제조된다. 이것은 조사 박스에서 샘플 플레이트를 인큐베이션하는 시간 20분 초과를 필요로 한다. 무전극 수은 램프 (2,000 mW/㎠) 조사 시스템을 사용하여 가공된 플레이트는 3.5 J/㎠의 총 에너지 투입량을 위해 1.75 초/㎠만을 필요로 한다. 조사 강도가 보다 높을수록 광-반응성기가 보다 효율적으로 활성화되고 결과적으로 필요한 전체 에너지 투여량이 보다 낮아진다.
한 실시양태에서, 활성화는 9.0 mW/㎠에서 대략 30분 동안 대략 15,000 mJ/ ㎠의 총 에너지까지 UVA/UVB 광 조사하여 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 활성화는 2,000 mW/㎠에서 약 3 J/㎠ 내지 약 4 J/㎠의 총 에너지까지 UVA/UVB 광 조사에 노출시킴으로써 수행된다. 사용되는 인큐베이션 시간 및 총 에너지량은 중합체에 결합되는 광-반응성기에 따라 다양할 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 활성화는 400 W/인치의 램프 전력을 갖는 8 피트/분으로 설정된 컨베이어 벨트가 구비된 무전극 수은 램프를 2,000 mW/㎠에서 조사하는 융합 UV 컨베이어 시스템(Fusion UV Conveyor System)을 사용하여 광조사함으로써 수행될 수 있다. IL290 라이트 버그(Light Bug) 복사계를 컨베이어 벨트를 통해 작동시켜 목적하는 에너지를 3,000 내지 4,000 mJ/㎠ 범위에서 변화시킨다. 다중웰 플레이트는 예를 들어 시간당 약 800개 플레이트로, 또는 4 내지 5초당 약 1개 플레이트로 광조사된다.
중합체 조성물의 농도는 용매의 mL 당 중합체의 총량을 변화시킴으로써 조정될 수 있다. ㎠ 당 중합체 조성물 또는 중합체 매트릭스의 농도가 보다 높은 것이 유리할 경우, 조성물의 중합체 분자를 용매화하는데 보다 적은 용매가 사용될 수 있다. ㎠ 당 중합체 조성물 또는 중합체 매트릭스의 농도가 보다 낮은 것이 유리할 경우, 조성물의 중합체 분자를 용매화하는데 보다 많은 용매가 사용될 수 있다. 즉, 중합체 조성물의 농도를 0.02 내지 1.0 mg/mL 용매로 조정하고, 다중웰 플레이트와 같은 고체 표면을 코팅하는 것은 선택가능한 범위의 총 결합 중합체 매트릭스를 갖는 표면을 생성할 것이다. 중합체 조성물은 완전히 가용성일 수 있거나 현탁된 불용성 중합체를 함유할 수 있다. 중합체 조성물을 제조하는데 사용될 수 있는 용매로는 물, 알코올, 케톤, 및 임의의 또는 모든 상기 물질의 혼합물을 들 수 있다. 용매(들)는 바람직하게는 사용될 기재와 혼화성이다. 조성물의 중합체가 서로 가교될 수 있기 때문에, 조성물의 유체형 용액을 겔로 변화시킬 수 있다. 별법으로, 용액은 슬러리의 형태로 제조될 수 있다. 조성물에 사용될 수 있는 용매의 예로는 물, 알코올, 케톤, 및 임의의 또는 모든 상기 물질의 혼합물을 들 수 있다.
비-결합된 중합체는 적합한 용액에서 인큐베이션하여 결합되지 않은 중합체를 용해 및 제거함으로써 제거될 수 있다. 예를 들어, 다중웰 플레이트를 MOPS 완충액으로 25℃에서 밤새 인큐베이션하고, MPTS 완충액으로 세척하고, 물로 각각 3회 증류하고, 히비테인(hibitane) 용액으로 세척하고, 공기 건조시키고, 패키징하고, 주위 온도 (2 내지 8℃) 미만에서 저장할 수 있다. 남아있는 중합체는 중합체 매트릭스를 형성한다.
생성된 중합체-코팅된 기재는 바람직하게는 중합체 매트릭스를 2 ㎍/㎠ 이상의 밀도로, 보다 바람직하게는 4 ㎍/㎠ 내지 30 ㎍/㎠의 밀도로, 일부 실시양태에서는 6 ㎍/㎠ 내지 15 ㎍/㎠의 밀도로 함유한다. 따라서, 중합체 매트릭스 중 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기)의 밀도는 중합체 분자에 공유 부착된 포획 리간드의 수 및(또는) 분자량을 제어함으로써 제어될 수 있다. 일반적으로, 중합체 매트릭스 중 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기)의 밀도는 바람직하게는 1 nmol/㎠ 이상이다. 일부 실시양태에서, 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기)의 밀도는 약 1.2 nmol/㎠ 내지 약 185 nmol/㎠이다. 또 다른 실시양태에서, 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기)의 밀도는 약 1.5 nmol/㎠ 내지 약 90 nmol/㎠, 또는 약 1.8 nmol/㎠ 내지 약 15 nmol/㎠이다. 따라서, 결과적으로 중합체 매트릭스는 1 nmol/㎠ 이상의 양으로 분자량이 3.5 kDa 미만인 표적 분자를 결합시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 용기 기재와 접촉하는 중합체 분자는 그에 공유 부착된 하나 이상의 포획 리간드 (또는 활성화가능한 기)를 가지며, 적어도 일부의 중합체 분자는 그에 공유 부착된 반응성기를 갖지 않는다. 공유 부착된 반응성기 및 포획 리간드 둘 다를 갖는 중합체 분자의 비율은 25％ 내지 80％일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 공유 부착된 반응성기 및 포획 리간드 둘 다를 갖는 중합체 분자의 비율은 40％ 내지 75％일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 공유 부착된 반응성기 및 포획 리간드 둘 다를 갖는 중합체 분자의 비율은 50％ 내지 60％일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 그에 공유 부착된 반응성기 및 포획 리간드 둘 다를 갖는 중합체 분자의 비율은 대략 50％일 수 있다. 반응성기를 갖거나 갖지 않는 중합체 분자의 혼합물을 사용하면 3차원 중합체 매트릭스의 고관능성 형성이 향상된다.
목적할 경우, 형성된 중합체 매트릭스 중의 포획 리간드를 예를 들어 상이한 포획 리간드의 첨가 또는 존재하는 포획 리간드의 화학적 개질에 의해 포획 리간드를 비공유 또는 공유 부착시킴으로써 유도체화시켜 보다 다양한 표적 분자의 고용량 포획을 추가로 가능하게 할 수 있다.
한 실시양태에서, 용기는 다중웰 폴리스티렌 플레이트이고, 중합체 코팅은 덱스트란 중합체의 혼합물로부터 유래되고, 포획 리간드는 니켈 킬레이트이고, 중합체 매트릭스의 포획 리간드 밀도는 1.5 nmol/㎠ 내지 7.5 nmol/㎠이다. 다른 실 시양태에서, 포획 리간드는 갈륨 또는 철 킬레이트이거나, 포획 리간드는 글루타티온이다.
또 다른 실시양태에서, 용기는 다중웰 폴리프로필렌 플레이트이고, 중합체 코팅은 덱스트란 중합체의 혼합물로부터 유래되고, 포획 리간드는 올리고뉴클레오티드이다.
또 다른 실시양태에서, 용기는 다중웰 폴리스티렌 플레이트이고, 중합체 코팅은 덱스트란 중합체의 혼합물로부터 유래되고, 포획 리간드는 스트렙타비딘이고, 중합체 매트릭스의 포획 리간드 밀도는 1.5 ㎍/㎠ 내지 7.5 ㎍/㎠이다.
또한, 또 다른 실시양태에서, 용기는 다중웰 폴리스티렌 플레이트이고, 중합체 코팅은 덱스트란 중합체의 혼합물로부터 유래되고, 포획 리간드는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 중합체 매트릭스의 포획 리간드 밀도는 1.5 ㎍/㎠ 내지 7.5 ㎍/㎠이다.
또 다른 실시양태에서, 용기는 폴리프로필렌 컬럼이고, 중합체 코팅은 덱스트란 중합체의 혼합물로부터 유래되고, 포획 리간드는 니켈 킬레이트이다.
중합체 매트릭스를 포함하는 용기를 본원의 여러 곳에 보다 상세히 기재된 용해 시약과 조합으로 사용하여 세포를 용해시키고 생성된 용액으로부터 표적 세포 성분을 격리할 수 있다. 용해 시약은 하기 기재된 것과 같은 임의의 적합한 방식으로 용기내에 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 용해 시약은 중합체 매트릭스의 적어도 한 부분 상에 흡착된다. 또 다른 실시양태에서, 용해 시약은 중합체 매트릭스의 최상부 상에 자유-유동 분말로서 용기내에 존재한다. 그 후, 숙주 세포를 포함하는 용액을 중합체 매트릭스 및 용해 시약을 포함하는 용기에 첨가할 수 있다. 세포 성분의 일부 또는 전부가 용해 시약에 의해 숙주 세포로부터 방출되면, 표적 세포 성분은 중합체 매트릭스에 존재하는 포획 리간드에 의해 세포 용액으로부터 격리될 수 있다.
중합체 매트릭스는 분자량이 3.5 kDa 내지 500 kDa인 표적 분자를 0.5 ㎍/㎠ 내지 20 ㎍/㎠의 양으로, 분자량이 10 kDa 내지 500 kDa인 표적 분자를 1 ㎍/㎠ 내지 20 ㎍/㎠의 양으로, 분자량이 10 kDa 내지 350 kDa인 표적 분자를 2 ㎍/㎠ 내지 20 ㎍/㎠의 양으로, 분자량이 10 kDa 내지 350 kDa인 표적 분자를 3 ㎍/㎠ 내지 15 ㎍/㎠의 양으로 결합시킬 수 있도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 분자량이 10 kDa 내지 350 kDa인 표적 분자를 4 ㎍/㎠ 내지 10 ㎍/㎠의 양으로 결합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 분자량이 350 kDa 이하인 폴리펩티드 표적 분자를 중합체 매트릭스 2 ㎍/㎠ 이상의 양으로 결합시킬 수 있다.
4. 용해 시약
펩티드, 단백질 또는 핵산과 같은 세포 성분의 숙주 세포로부터의 추출 또는 추출 및 단리를 보조하기 위해, 본 발명의 용기는 용해 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 용해 시약은 숙주 세포의 막을 파열시키고 그의 내용물을 용해 시약을 함유하는 용액 내로 방출시키는 농도 및 조성의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 용해 시약은 반드시 전부일 필요는 없지만 그의 세포 성분의 일부를 방출하도록만 막이 충분히 투과성이 되게 한다.
용해 시약은 다양한 방식으로 용기내에 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 용해 시약은 용기의 내부 표면에 (또는, 별법으로, 존재할 경우 용기 표면을 싸는 중합체 코팅에) (건조 조성물로서) 흡착된다. 이러한 실시양태에서, 예를 들어 용해 시약은 용기의 측벽 형성부의 적어도 한 부분에 흡착된다. 또 다른 실시양태에서, 용해 시약은 용기의 바닥부의 적어도 한 부분에 흡착된다. 또 다른 실시양태에서, 용해 시약은 용기의 바닥부 및 측벽 형성부 각각의 적어도 한 부분에 흡착된다. 임의로, 용기가 중합체 매트릭스를 포함할 경우, 용해 시약은 중합체 매트릭스 표면의 적어도 한 부분에 흡착될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용해 시약은 용기의 부피 내에 느슨하게 함유되거나 용기의 내부 표면에 고착된 또 다른 물체, 예를 들어 비드, 막대, 망상체 (예를 들어 필터) 또는 다른 다공성 물체와 같은 지지체에 흡착된다. 이러한 지지체 및 용기 자체는 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 유리, 나일론, 폴리아크릴아미드, 셀룰로스, 니트로셀룰로스, 기타 플라스틱 중합체, 금속, 자철광, 또는 기타 합성 기재로 구성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 용해 시약은 용기의 내부 표면의 적어도 한 부분, 및 용기의 부피 내에 느슨하게 함유되거나 용기의 내부 표면에 고착된 물체, 예를 들어 비드, 막대, 망상체 (예를 들어 필터) 또는 다른 다공성 물체와 같은 지지체에 흡착된다.
용해 시약으로 코팅된 표면의 표면적 비율 (즉, 용기의 코팅된 내부 표면 및(또는) 용기의 부피 내에 함유된 코팅체의 표면적 합)은 본 발명의 한 측면에 따라 제어될 수 있다. 한 실시양태에서, 표면적 대 부피의 비율인 SA:V (여기서, SA는 용기의 코팅된 내부 표면 및 용기의 부피 내에 함유된 임의의 코팅체 표면의 표면 적이고, V는 용기의 부피임)는 약 4 mm2/㎕ 미만이다. 다른 실시양태에서, 상기 표면적 대 부피의 비율은 약 3 mm2/㎕를 초과하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 표면적 대 부피의 비율은 약 2 mm2/㎕를 초과하지 않는다. 다른 실시양태에서, 상기 표면적 대 부피의 비율은 약 1 mm2/㎕를 초과하지 않는다.
용기의 내부 표면 및(또는) 용기의 부피 내에 함유된 물체의 용해 시약으로의 코팅은, 전형적으로 건조물 (즉, 수분 함량 약 5 중량％ 이하의 조성물)로서 흡착될 것이다. 별법으로, 용해 시약은 용기의 내부 표면 또는 내부 표면의 일부에 코팅되거나, 또는 부가적으로 포함된 물체에 코팅된 겔 또는 페이스트의 형태 (즉, 점도 약 10,000 센티푸아즈 초과의 물질)로 제공될 수 있다.
한 다른 실시양태에서, 용해 시약은 용기의 내부 표면 또는 용기의 부피 내에 함유된 물체 상에 흡착된 층이 아니라, 물질의 덩어리 (예컨대, 매트릭스, 과립(들), 정제(들), 또는 자유-유동 분말)로서 제공되어 용기내에 잔존한다. 따라서, 예를 들어 용해 시약은 포획 리간드에 독립적으로 용기내에 배치된 동결건조 매트릭스 또는 동결건조 분말일 수 있으며, 한 실시양태에서, 동결건조된 용해 시약의 덩어리는 포획 리간드가 결합된 수지층에 배치된다. 일반적으로, 보다 미세한 입자가 보다 큰 입자보다 더 신속하게 용해되는 경향이 있다. 용해 시약이 손실 및(또는) 오염되는 위험성을 최소화하기 위해, 용기의 입구 위에 덮개를 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
다른 실시양태에서, 용해 시약은 용해되거나 슬러리화된 성분으로서 용기에 존재할 수 있다. 숙주 세포를 함유하는 임의의 용액 또는 현탁액의 원치않는 희석을 피하기 위해, 본 실시양태에서는 용해 시약이 용해되거나 슬러리화된 액체가 고농도의 용해 시약 (예컨대, 약 10 중량％ 초과)을 함유하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 용해 시약의 농도는 약 20 중량％를 초과한다. 또한, 용해 시약이 손실 및(또는) 오염되는 위험성을 최소화하기 위해, 용기를 덮개로 덮는 것이 바람직할 수 있다.
일반적으로, 용해 시약은 세포로 하여금 화학적 또는 효소적 방식으로 숙주 세포로부터 표적 세포성 성분을 방출하도록 유도하는 임의의 조성물 또는 조성물들의 조합물일 수 있다. 또한, 용해 시약은 임의로 분해로부터의 보호와 같은 보호 작용을 당해 성분에 제공할 수 있다. 따라서, 용해 시약은 디터전트, 용해 효소, 카오트로픽 시약(chaotropic reagent), 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 용해 시약은 완충액, 소포제, 벌크화제, 프로세싱 효소, 효소 억제제, 또는 펩티드, 단백질 또는 핵산과 같은 세포성 성분의 추출 및 단리를 보조하는 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 용해 시약은 디터전트를 포함한다. 각종 디터전트가 본원에서 사용될 수 있으며, 그 예로는 음이온성, 양이온성, 비-이온성 및 양쪽이온성 디터전트가 있다. 디트전트의 예로는 케노데옥시콜산; 케노데옥시콜산 나트륨 염; 콜산; 데히드로콜산; 데옥시콜산; 데옥시콜산 메틸 에스테르; 디기토닌(digitonin); 디기톡시게닌(digitoxigenin); N,N-디메틸도데실아민 옥시드; 도쿠세 이트(docusate) 나트륨 염; 글리코케노데옥시콜산 나트륨 염; 글리코콜산 수화물; 글리코콜산 나트륨 염 수화물; 글리코데옥시콜산 1수화물; 글리코데옥시콜산 나트륨 염; 글리코리토콜산 3-술페이트 2나트륨 염; 글리코리토콜산 에틸 에스테르; N-라우로일사르코신 나트륨 염; N-라우로일사르코신; 리튬 도데실 술페이트; 루골(lugol) 용액; 니아프루프(Niaproof) 4, 타입 4 (즉, 7-에틸-2-메틸-4-운데실 술페이트 나트륨 염; 나트륨 7-에틸-2-메틸-4-운데실 술페이트); 1-옥탄술폰산 나트륨 염; 나트륨 1-부탄술포네이트; 나트륨 1-데칸술포네이트; 나트륨 1-도데칸술포네이트; 나트륨 1-헵탄술포네이트 무수물; 나트륨 1-노난술포네이트; 나트륨 1-프로판술포네이트 1수화물; 나트륨 2-브로모에탄술포네이트; 나트륨 콜레이트 수화물; 나트륨 콜레에이트; 나트륨 데옥시콜레이트; 나트륨 데옥시콜레이트 1수화물; 나트륨 도데실 술페이트; 나트륨 헥산술포네이트 무수물; 나트륨 옥틸 술페이트; 나트륨 펜탄술포네이트 무수물; 나트륨 타우로콜레이트; 나트륨 타우로데옥시콜레이트; 사우로케노데옥시콜산 나트륨 염; 타우로데옥시콜산 나트륨 염 1수화물; 타우로히오데옥시콜산 나트륨 염 수화물; 타우로리토콜산 3-술페이트 2나트륨 염; 타우로우르소데옥시콜산 나트륨 염; 트리즈마(등록상표, Trizma) 도데실 술페이트 (즉, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 라우릴 술페이트); 우르소데옥시콜산, 알킬트리메틸암모늄 브로마이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤질디메틸헥사데실암모늄 클로라이드; 벤질디메틸테트라데실암모늄 클로라이드; 벤질도데실디메틸암모늄 브로마이드; 벤질트리메틸암모늄 테트라클로로요오데이트; 세틸트리메틸암모늄 브로마이드; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드; 도데실에틸디메틸암모늄 브로마이드; 도데실트리 메틸암모늄 브로마이드; 에틸헥사데실디메틸암모늄 브로마이드; 기라르드 시약 T(Girard's reagent T); 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드; N,N',N'-폴리옥시에틸렌(10)-N-탈로우-1,3-디아미노프로판; 톤조늄 브로마이드; 트리메틸(테트라데실)암모늄 브로마이드, BigCHAP (즉, N,N-비스[3-(D-글루콘아미도)프로필]콜아미드); 비스(폴리에틸렌 글리콜 비스[이미다조일 카르보닐]); 폴리옥시에틸렌 알콜, 예컨대, Brij(등록상표) 30 (폴리옥시에틸렌(4) 라우릴 에테르), Brij(등록상표) 35 (폴리옥시에틸렌(23) 라우릴 에테르), Brij(등록상표) 35P, Brij(등록상표) 52 (폴리옥시에틸렌 2 세틸 에테르), Brij(등록상표) 56 (폴리옥시에틸렌 10 세틸 에테르), Brij(등록상표) 58 (폴리옥시에틸렌 20 세틸 에테르), Brij(등록상표) 72 (폴리옥시에틸렌 2 스테아릴 에테르), Brij(등록상표) 76 (폴리옥시에틸렌 10 스테아릴 에테르), Brij(등록상표) 78 (폴리옥시에틸렌 20 스테아릴 에테르), Brij(등록상표) 78P, Brij(등록상표) 92 (폴리옥시에틸렌 2 올레일 에테르), Brij(등록상표) 92V (폴리옥시에틸렌 2 올레일 에테르), Brij(등록상표) 96V, Brij(등록상표) 97 (폴리옥시에틸렌 10 올레일 에테르), Brij(등록상표) 98 (폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르), Brij(등록상표) 58P 및 Brij(등록상표) 700 (폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르); 크레모포르(등록상표, Cremophor) EL (즉, 폴리옥시에틸렌글리세롤트리리시놀레에이트 35; 폴리옥실 35 피마자유); 데카에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 데카에틸렌 글리콜 모노 헥사데실 에테르; 데카에틸렌 글리콜 모노 트리데실 에테르; N-데카노일-N-메틸글루카민; n-데실 α-D-글루코피라노시드; 데실 β-D-말토피라노시드; 디기토닌; n-도데카노일-N-메틸글루카미드; n-도데실 α-D-말토 시드; n-도데실 β-D-말토시드; 헵타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르; 헵타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 헵타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르; n-헥사데실 β-D-말토시드; 헥사에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 헥사에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르; 헥사에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르; 헥사에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르; 이게팔(등록상표, Igepal) CA-630 (즉, 노닐페닐-폴리에틸렌글리콜, (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올, 옥틸페닐-폴리에틸렌 글리콜); 메틸-6-O-(N-헵틸카르바모일)-α-D-글루코피라노시드; 노나에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; N-노나노일-N-메틸글루카민; 옥타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르; 옥타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 옥타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르; 옥타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르; 옥타에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르; 옥틸-β-D-글루코피라노시드; 펜타에틸렌 글리콜 모노데실 에테르; 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 펜타에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르; 펜타에틸렌 글리콜 모노헥실 에테르; 펜타에틸렌 글리콜 모노옥타데실 에테르; 펜타에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르; 폴리에틸렌 글리콜 디글리시딜 에테르; 폴리에틸렌 글리콜 에테르 W-1; 폴리옥시에틸렌 10 트리데실 에테르; 폴리옥시에틸렌 100 스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 20 이소헥사데실 에테르; 폴리옥시에틸렌 20 올레일 에테르; 폴리옥시에틸렌 40 스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 50 스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 8 스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 비스(이미다졸릴 카르보닐); 폴리옥시에틸렌 25 프로필렌 글리콜 스테아레이트; 퀼라자 껍질(quillaja bark)로부터의 사포닌; 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대, 스판(등록상표, Span) 20 (소르비탄 모노라우레이트), 스판(등록상 표) 40 (소르비탄 모노팔미테이트), 스판(등록상표) 60 (소르비탄 모노스테아레이트), 스판(등록상표) 65 (소르비탄 트리스테아레이트), 스판(등록상표) 80 (소르비탄 모노올레에이트) 및 스판(등록상표) 85 (소르비탄 트리올레에이트); 폴리에틸렌 글리콜의 각종 알킬 에테르, 예컨대, 테르기톨(등록상표, Tergitol) 타입 15-S-12, 테르기톨(등록상표) 타입 15-S-30, 테르기톨(등록상표) 타입 15-S-5, 테르기톨(등록상표) 타입 15-S-7, 테르기톨(등록상표) 타입 15-S-9, 테르기톨(등록상표) 타입 NP-10 (노닐페놀 에톡실레이트), 테르기톨(등록상표) 타입 NP-4, 테르기톨(등록상표) 타입 NP-40, 테르기톨(등록상표) 타입 NP-7, 테르기톨(등록상표) 타입 NP-9 (노닐페놀 폴리에틸렌 글리콜 에테르), 테르기톨(등록상표) MIN FOAM 1x, 테르기톨(등록상표) MIN FOAM 2x, 테르기톨(등록상표) 타입 TMN-10 (폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), 테르기톨(등록상표) 타입 TMN-6 (폴리에틸렌 글리콜 트리메틸노닐 에테르), 트리톤(등록상표, Triton) 770, 트리톤(등록상표) CF-10 (벤질-폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르), 트리톤(등록상표) CF-21, 트리톤(등록상표) CF-32, 트리톤(등록상표) DF-12, 트리톤(등록상표) DF-16, 트리톤(등록상표) GR-5M, 트리톤(등록상표) N-42, 트리톤(등록상표) N-57, 트리톤(등록상표) N-60, 트리톤(등록상표) N-101 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르; 폴리옥시에틸렌 분지화 노닐페닐 에테르), 트리톤(등록상표) Q-15, 트리톤(등록상표) QS-44, 트리톤(등록상표) RW-75 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 260 모노(헥사데실/옥타데실) 에테르 및 1-옥타데칸올), 트리톤(등록상표) SP-135, 트리톤(등록상표) SP-190, 트리톤(등록상표) W-30, 트리 톤(등록상표) X-15, 트리톤(등록상표) X-45 (즉, 폴리에틸렌 글리콜 4-tert-옥틸페닐 에테르; 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜), 트리톤(등록상표) X-100 (t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올; 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르; 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜), 트리톤(등록상표) X-102, 트리톤(등록상표) X-114 (폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르; (1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜), 트리톤(등록상표) X-165, 트리톤(등록상표) X-305, 트리톤(등록상표) X-405 (즉, 폴리옥시에틸렌(40) 이소옥틸시클로헥실 에테르; 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르), 트리톤(등록상표) X-705-70, 트리톤(등록상표) X-151, 트리톤(등록상표) X-200, 트리톤(등록상표) X-207, 트리톤(등록상표) X-301, 트리톤(등록상표) XL-80N 및 트리톤(등록상표) XQS-20; 테트라데실-β-D-말토시드; 테트라에틸렌 글리콜 모노데실 에테르; 테트라에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 테트라에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르; 트리에틸렌 글리콜 모노데실 에테르; 트리에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르; 트리에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르; 트리에틸렌 글리콜 모노옥틸 에테르; 트리에틸렌 글리콜 모노테트라데실 에테르; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 예컨대, 트윈(등록상표, TWEEN) 20 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트), 트윈(등록상표) 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), 트윈(등록상표) 21 (폴리옥시에틸렌 (4) 소르비탄 모노라우레이트), 트윈(등록상표) 40 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), 트윈(등록상표) 60 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노스테아레이트; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트), 트윈 (등록상표) 61 (폴리옥시에틸렌 (4) 소르비탄 모노스테아레이트), 트윈(등록상표) 65 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리스테아레이트), 트윈(등록상표) 80 (폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노올레에이트; 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), 트윈(등록상표) 81 (폴리옥시에틸렌 (5) 소르비탄 모노올레에이트) 및 트윈(등록상표) 85 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 트리올레에이트); 틸록사폴(tyloxapol); n-운데실 β-D-글루코피라노시드, CHAPS (즉, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트); CHAPSO (즉, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트); N-도데실말토시드; α-도데실-말토시드; β-도데실-말토시드; 3-(데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염 (즉, SB3-10); 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염 (즉, SB3-12); 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트 (즉, SB3-14); 3-(N,N-디메틸옥타데실암모니오)프로판술포네이트 (즉, SB3-18); 3-(N,N-디메틸옥틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염 (즉, SB3-8); 3-(N,N-디메틸팔미틸암모니오)프로판술포네이트 (즉, SB3-16); MEGA-8; MEGA-9; MEGA-10; 메틸헵틸카르바모일 글루코피라노시드; N-노나노일 N-메틸글루카민; 옥틸-글루코피라노시드; 옥틸-티오글루코피라노시드; 옥틸-β-티오글루코피라노시드; 3-(4-헵틸) 페닐 3-히드록시 프로필) 디메틸암모니오 프로판 술포네이트 (즉, C7BzO); 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판술포네이트 (즉, ASB-14); 및 데옥시콜라트산, 및 이들의 각종 조합물이 있다.
한 실시양태에서, 용해 시약은 CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니 오]-1-프로판술포네이트), 옥틸-β-티오글루코피라노시드, 옥틸-글루코피라노시드, C7BzO (3-(4-헵틸) 페닐 3-히드록시 프로필) 디메틸암모니오 프로판 술포네이트), ASB-14 (3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판술포네이트), 트리톤(등록상표) X-100, α-도데실-말토시드, β-도데실-말토시드, 데카에틸렌 글리콜 모노 헥사데실 에테르, 데카에틸렌 글리콜 모노 트리데실 에테르, 데옥시콜라트산, 나트륨 도데실 술페이트, 이게팔(등록상표) CA-630, 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, SB3-10 (3-(데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염), SB3-12 (3-(도데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염), SB3-14 (3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트) 및 n-도데실 α-D-말토시드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 디터전트일 것이다.
다른 실시양태에서, 용해 시약은 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트, 옥틸-β-티오글루코피라노시드, 옥틸-글루코피라노시드, 3-(4-헵틸) 페닐 3-히드록시 프로필) 디메틸암모니오 프로판 술포네이트, 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판술포네이트, 3-(데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트 및 n-도데실 α-D-말토시드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 디터전트일 것이다.
다른 실시양태에서, 용해 시약은 용해 효소를 포함한다. 각종 효소가 본원에서 사용될 수 있다. 예시적인 효소로는 베타 글루쿠론디아제, 글루카나제, 글루술라제, 리소자임, 리티카제, 만나나제, 뮤타놀리신, 자이몰라제, 셀룰라제, 키티 나제, 리소스타핀, 펙톨리아제, 스트렙토리신 O, 및 이들의 각종 조합물이 있다. 예를 들어, 문헌 [Wolska-Mitaszko, et al., Analytical Biochem., 116:241-47 (1981)], [Wiseman, Process Biochem., 63-65 (1969)] 및 [Andrews ＆ Asenjo, Trends in Biotech., 5:273-77 (1987)]을 참조한다.
용해되는 세포의 유형은 효소의 선택에 영향을 미칠 수 있다. 문헌 [Coakley, et al., Adv. Microb. Physiol, 16:279-341 (1977)]을 참조한다. 예를 들어, 단백질 또는 펩티드에 대해서는 숙주 세포가 식물 세포인 경우에 키티나제, 베타 글루쿠론디아제, 만나나제 및 펙톨리아제가 모두 유용하다. 효모 세포는 세포벽이 캡슐 또는 내성 포자를 형성할 수 있기 때문에 파쇄하기 어렵다. 리티카제, 키티나제, 자이몰라제 및 글루쿨라제와 같은 용해 효소를 사용하여 부분적인 스페로플라스트(spheroplast) 형성을 유도하고, 이후에 스페로플라스트를 용해하여 DNA를 방출시킴으로써 효모로부터 DNA를 추출할 수 있다. 리티카제는 효모의 세포벽을 분해하고 형질전환용 진균류로부터 스페로플라스트를 생성하는데 바람직하다. 리티카제는 효모의 세포벽 글루칸과 같은 폴리(β-1,3-글루코스)를 가수분해시킨다.
리소자임 및 뮤타놀리신은 숙주 세포가 박테리아 세포인 경우에 유용하다. 리소자임은 펩티도글리칸의 다당류 주쇄에서 N-아세틸글루코사민과 N-아세틸뮤라민산 사이의 베타 1-4 글리코시드 결합을 가수분해시킨다. 이는 박테리아 세포벽에 존재하는 펩티도글리칸을 가수분해시킴으로써 박테리아를 용해시키는데 효과적이다.
다른 실시양태에서, 용해 시약은 카오트로프(chaotrope)를 포함한다. 몇몇 예에서, 카오트로프는 단독으로도 숙주 세포를 용해시키기에 충분하다. 특히, 카오트로프는 세포성 성분이 RNA인 경우에 사용된다. 본원에서 사용될 수 있는 카오트로프의 예로는 우레아, 구아니딘 HCl, 구아니딘 티오시아네이트, 구아니듐 티오술페이트 및 티오우레아가 있다. 카오트로프는 또한 디터전트, 완충액, 소포제, 및 본원에 기재된 기타 첨가제와 함께 사용될 수도 있다.
숙주 세포를 용해시키는 과정을 주로 담당하는 디터전트, 용해 효소 또는 카오트로프 이외에, 용해 시약은 pH를 제어하기 위한 완충액, 과도한 거품 발생 또는 거품 형성을 방지하기 위한 소포제, 벌크화제, 효소 억제제, 및 세포성 성분의 정제를 보조하는 기타 프로세싱 효소를 하나 이상 포함할 수 있다. 완충액의 예로는 TRIS, TRIS-HCl, HEPES 및 포스페이트가 있다. 소포제의 예로는 안티폼(Antifoam) 204, 안티폼 A 농축액, 안티폼 A 에멀전, 안티폼 B 에멀전 및 안티폼 C 에멀전이 있다. 벌크화제의 예로는 염화나트륨, 염화칼륨 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이 있다. 프로세싱 효소 및 효소 억제제로는 뉴클레아제, 예컨대, 벤조나제(등록상표, Benzonase) 엔도뉴클레아제, DNAse (예컨대, DNase I), RNAse (예컨대, RNase A), 프로테아제, 예컨대, 프로테이나제 K, 뉴클레아제 억제제, 프로테아제 억제제, 예컨대, 포스포라미돈, 펩스타틴 A, 베스타틴, E-64, 아프로티닌, 류펩틴, 1,10-페난트롤린, 안티파인, 벤즈아미딘 HCl, 키모스타틴, EDTA, e-아미노카프로산, 트립신 억제제 및 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드, 및 포스파타제 억제제, 예컨대, 칸타리딘(cantharidin), 브로모테트라미솔 (bromotetramisole), 마이크로시스틴(microcystin) LR, 나트륨 오르토바나데이트, 나트륨 몰리브데이트, 나트륨 타르트레이트 및 이미다졸 등이 있다. 용해 효소와 마찬가지로, 프로세싱 효소 및 효소 억제제의 선택은 또한 추출될 재료의 유형 (예컨대, 펩티드, 단백질, 핵산 등) 및 용해될 세포의 유형 (예컨대, 식물, 효모, 박테리아, 진균류, 포유류, 곤충 등)을 비롯한 여러가지 인자에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산을 가수분해시키거나 분해시킨다. 따라서, 용해 시약은 세포성 성분이 핵산이 아니라 단백질 또는 펩티드인 경우에 뉴클레아제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이와 유사하게, 프로테아제는 단백질을 파괴시키거나 분해시킨다. 따라서, 용해 시약은 세포성 성분이 단백질이 아니라 핵산인 경우에 프로테아제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 다른 효소 또는 억제제를 선택함에 있어서도 유사한 논법이 적용될 수 있다. 따라서, 일반적으로 프로테아제, 뉴클레아제 억제제 및 리소자임과 같은 효소 또는 억제제는 세포성 성분이 핵산인 경우에 유용하다. 벤조나제(등록상표) 엔도뉴클레아제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, DNase, RNase 또는 기타 뉴클레아제와 같은 다른 효소 또는 억제제는 세포성 성분이 단백질 또는 펩티드인 경우에 유용하다. 핵산에 대해서는 RNase A가 박테리아 및 포유류 DNA를 추출하는데 사용될 수 있다. DNase I은 박테리아 RNA, 효모 RNA, 동물 세포 및 조직으로부터의 RNA, 및 생물학적 유체로부터의 RNA를 추출하는데 사용될 수 있다. 프로테이나제 K와 같은 프로테아제는 모든 세포 유형으로부터 DNA를 추출하는데 사용될 수 있다.
숙주 세포가 박테리아 또는 동물 세포인 경우, 또는 세포성 성분이 단백질 또는 DNA인 경우, 용해 시약은 전형적으로 디터전트를 포함할 것이다. 숙주 세포가 효모 세포인 경우, 용해 시약은 전형적으로 디터전트, 또는 효모 세포를 용해시킬 수 있는 효소 (예컨대, 리티카제, 자이몰라제, 또는 상기 열거한 것과 같은 기타 용해 효소)를 포함할 것이다.
추가의 예로써, 세포성 성분이 단백질 또는 펩티드인 경우, 용해 시약은 하나 이상의 디터전트, 리소자임, 뉴클레아제, 벤조나제(등록상표) 엔도뉴클레아제, 완충액, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제 또는 카오트로픽 시약, 또는 이들의 각종 조합물을 포함하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 세포성 성분이 DNA인 경우, 용해 시약은 하나 이상의 디터전트, 리소자임, 뉴클레아제 억제제, RNase, 완충액 또는 프로테아제, 또는 이들의 각종 조합물을 포함하는 것이 바람직하다.
다른 실시양태에서, 세포성 성분이 RNA인 경우, 용해 시약은 하나 이상의 디터전트, 카오트로픽 시약 또는 완충액, 또는 이들의 각종 조합물을 포함하는 것이 바람직하다. 효소는 전형적으로 이러한 적용에 사용되지 않는데, 이는 카오트로프가 효소를 불활성화시킬 것이기 때문이다.
한 실시양태에서, 용해 시약은 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트, 리소자임, Tris-HCl 및 DNase I을 포함한다.
다른 실시양태에서, 용해 시약은 옥틸-티오글루코피라노시드, 프로테아제 억제제, 리소자임 및 벤조나제(등록상표) 엔도뉴클레아제를 포함한다.
이와 같이, 용해 시약은 디터전트, 효소, 억제제, 카오트로프, 완충액, 소포 제, 벌크화제, 및(또는) 세포성 성분의 추출 및 단리를 보조하는 기타 첨가제의 다양한 조합을 포함할 수 있다. 이러한 용해 시약 및(또는) 성분들은 천연 형태, 재조합체 형태, 또는 임의의 변형 또는 활성 형태일 수 있다. 당업자는 세포성 성분 및 숙주 세포의 유형에 기초하여 바람직한 용해 시약이 무엇을 포함하는지 용이하게 결정할 수 있다.
용해 시약의 양 및 각 시약 성분의 상대적인 비율은 숙주 세포의 유형, 선택된 용해 시약의 부류 및 정해진 기간에 요망되는 세포 투과도에 따라 달라질 것이다. 따라서, 한 실시양태에서는 임의의 단일 디터전트의 농도가 약 0.01 중량/부피％ 내지 약 5 중량/부피％이며, 보다 바람직하게는 약 0.1 중량/부피％ 내지 약 2 중량/부피％이다. 다른 실시양태에서, 각 용해 효소의 농도는 약 0.01 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml이다. 또 다른 실시양태에서, 완충액의 농도는 추출 또는 추출과 단리가 발생하는 기간 동안 세포성 용액의 pH가 약 pH 3 내지 약 pH 12로 유지되도록 하는 농도이다. 다른 실시양태에서, 프로테아제 억제제의 농도는 약 10 nM 내지 약 10 mM이다. 다른 실시양태에서, 포스파타제 억제제의 농도는 약 0.01 nM 내지 약 10 mM이다.
용해 시약이 용기내에서 흡착된 성분, 자유-유동 성분, 용해된 성분 또는 슬러리화된 성분으로 존재하는지의 여부와 무관하게, 숙주 세포를 함유하는 용액 또는 현탁액이 용기에 첨가되면, 용해 시약은 숙주 세포를 함유하는 현탁액에 의해 용해 또는 희석될 것이며, 숙주 세포는 용해된다. 용해 시약이 용해에 필요한 모든 시약을 함유한다면, 필요한 모든 용해 시약이 확실히 제공되도록 하기 위한 다 수의 피펫팅 단계를 수행할 필요가 없다. 더욱이, 상기 언급한 바와 같이 용해 시약이 효과를 나타낼 숙주 세포를 완전하게 가용화시킬 필요도 없다. 오히려, 숙주 세포는 표적 생성물의 일부 또는 전부를 용액으로 방출하기에 필요한 정도로 용해되기만 하면 된다. 또한, 용해 시약은 몇몇 숙주 세포가 용해되기만 한다면, 효과를 나타낼 임의의 특정 세포성 현탁액 중의 모든 숙주 세포를 용해시킬 필요는 없다.
5. 키트
유리하게는, 본 발명의 용기는 사용 지침, 및 숙주 세포로부터 세포성 성분을 추출 및(또는) 단리하기 위한 시약, 및(또는) 포획된 세포성 성분을 분석 또는 검출하기 위한 시약, 및(또는) 프로세싱 완충액 또는 대조군을 아울러 포함할 수 있으며, 여기서 이들 모두는 함께 포장되어 키트로서 배포된다. 한 실시양태에서, 키트는 단일 용기를 포함하거나, 또는 발법으로 다수의 용기를 포함하는 다중웰(multiwell) 플레이트를 포함할 수 있으며, 전형적으로 키트는 밀폐될 것이다. 어떤 방식이든, 용해 시약이 포함되며, 임의로는 포획 리간드도 또한 포함될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 용해 시약 및(또는) 포획 리간드는 다양한 방식으로 본 발명의 용기 중에 제공될 수 있으며, 예를 들어 용해 시약은 용기의 일부에 코팅되거나, 용기의 바닥부에 코팅되거나, 측벽 형성부에 코팅되거나, 용기의 바닥부와 측벽 형성부 둘 다에 코팅될 수 있고, 또한 자유-유동 분말의 형태로 존재할 수도 있다. 이와 유사하게, 지지된 포획 리간드는 용기의 일부에 배치되거나, 용 기의 바닥부에 배치되거나, 측벽 형성부에 배치되거나, 또는 용기의 바닥부와 측벽 형성부 둘 다에 배치될 수 있다. 한 실시양태에서, 용기는 용해 시약이 코팅되고(되거나) 지지된 포획 리간드가 배치될 수 있는 비드 또는 메쉬와 같은 부가의 지지체를 추가로 포함한다. 별법으로, 용기는 3차원 중합체 매트릭스, 포획 리간드 또는 활성화가능한 기, 및 용해 시약을 포함하는 고용량 플랫폼일 수 있다.
한 실시양태에서, 용기는 세포성 성분 (예컨대, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA 생성물)의 추출 또는 추출과 단리에 필요한 모든 시약을 포함할 것이다. 또한, 키트는 지지된 포획 리간드 또는 3차원 매트릭스로부터 포획된 생성물을 방출 또는 용출시키는데 유용한 다른 시약 및 장비, 및 각종 프로세싱 완충액을 함유할 수 있다.
6. 방법
일반적으로, 본 발명의 방법은 숙주 세포로부터의 세포 성분, 예컨대 펩티드, 단백질, 핵산, 또는 기타 세포 성분의 추출 또는 추출 및 단리에 관한 것이다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터의 세포 성분의 추출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구; 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 및 내부 표면의 적어도 일부에 코팅된 용해 시약을 갖는 용기내로 도입하는 단계 (코팅된 내부 표면적 대 부피(V)의 비율은 약 4 mm2/㎕미만임), 및 (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 세포 잔해를 형성시키는 단계를 포함한다. 용해 시약은 숙주 세포가 그의 내용 물을 유리하도록 유발한다. 용해가 완료될 수 있는데, 즉 모든 세포 성분 (예를 들어, 펩티드, 단백질, 또는 핵산)은 숙주 세포로부터 방출되거나, 또는 부분적으로 용해될 수 있는데, 즉 세포 성분의 부분이 숙주 세포로부터 방출된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터의 세포 성분의 추출 및 단리 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구; 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 용해 시약; 및 지지된 포획 리간드를 갖는 용기내에 도입하는 단계 (상기 측벽 형성부는 바닥부와 입구 사이에 위치하며, 상기 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구 및 액체를 용기로부터 배출시키기 위한 배출구로서 작용함), (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 세포 잔해를 형성시키는 단계; 및 (c) 고체 세포 잔해의 존재하에 포획 리간드를 사용해서 세포 성분을 포획하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 포획 리간드는 용기의 내부 표면에 의해 지지된다. 또 다른 실시양태에서, 포획 리간드는 용기의 내부 표면 상에 코팅된 중합체성 매트릭스에 부착된다.
또 다른 측면에서, 상기 방법은 (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구; 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 용해 시약; 및 지지된 포획 리간드를 갖는 용기에 도입하는 단계 (상기 측벽 형성부는 바닥부와 입구 사이에 위치하며, 상기 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구로서 작용함), (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 세포 잔해를 형성시키는 단계, (c) 고체 세포 잔해의 존재하에 포획 리간드를 사용해서 세포 성분을 포획하는 단계, (d) 포획 리간드로부터 세포 성분을 방출시키는 단계, 및 (e) 방출된 세포 성분을 회수하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 포획 리간드는 용기의 내부 표면에 의해 지지된다. 또 다른 실시양태에서, 포획 리간드는 용기의 내부 표면 상에 코팅된 중합체성 매트릭스에 부착된다.
용해는 완전할 수 있는데, 즉 모든 세포 성분은 숙주 세포로부터 방출되거나 또는 부분적으로 용해될 수 있으며, 즉 세포 성분의 부분이 숙주 세포로부터 방출된다. 한 실시양태에서, 세포 잔해 및 다른 결합되지 않은 세포내 조성물을 이어서 세척해내고, 포획 리간드에 부착된 세포 성분을 남긴다. 이어서, 포획된 생성물은 여전히 포획 리간드에 부착되어 있는 동안 검출될 수 있다. 이러한 검출 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 이들 중에 ELISA, 단백질 검출, 및 효소 분석이 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 포획된 성분은 시약, 예컨대 염을 사용하여 포획 리간드로부터 포획된 세포 성분을 방출 또는 용출시키거나, 또는 다른 시약을 포획 리간드와 경쟁 결합시킴으로써 회수된다.
도 7을 참조하여, 본 발명의 방법은 용해 시약 및 포획 리간드를 포함하는 용기의 환경에 대해 기술한다. 10으로 표시한 용기는 일반적으로 내부 챔버의 경계를 짓는 실린더형 샤프트 12, 입구 13 (상부 캡 14에 의해 닫힐 수 있음), 출구 15 (하부 캡 16에 의해 닫힐 수 있음)를 일반적으로 갖는 컬럼 또는 튜브이다. 일반적으로 실린더형 샤프트 12에 의해 경계를 짓는 챔버 내에 수지층 18에 결합된 포획 리간드를 갖는 상기 수지층 18, 및 수지층 18에 오버레이된 용해 시약 20의 덩어리가 있다. 챔버 내의 수지층을 지지시키기 위해, 용기 10을 추가로 다공성 폴리에틸렌 프릿 (대략 20 ㎛ 세공 크기)을 포함할 수 있다. 작업에서, 상부 캡 14를 제거하고, 숙주 세포를 함유한 액체 현탁액을 입구 13을 통해 컬럼 내로 붓는다. 용해 시약 20은 숙주 세포의 세포 성분, 및 수지층 18에 결합된 포획 리간드에 의한 그의 포획물을 모두 또는 부분 방출시킬 수 있는 액체 현탁액에 의해 용해된다. 세포 성분의 포획 후에, 세포 잔해 및 액체 현탁액의 기타 성분을 출구 15를 통해 용기로부터 배수하는데; 유리하게는, 프릿 또는 다른 지지체는 수지 18이 챔버에 존재하는 것은 차단하지만, 세포 잔해 및 현탁액의 다른 성분이 컬럼에 존재하는 것은 허용한다는 것을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 컬럼은 내부 컬럼 길이가 9.1 cm이고 (또는 바닥부 및 입구에서 캡핑되는 경우에는 길이가 12.3 cm임); 바닥부 개구부에서의 직경이 대략 1 cm이고, 입구 개구부에서의 직경이 대략 1.7 cm이고; 총 부피가 대략 7.5 ml이다. 한 실시양태에서, 포획 리간드는 아가로스 수지층에 공유 부착된 니켈 킬레이트이고, 용해 시약은 CHAPS (즉, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트)의 자유-유동 분말, 리소자임, 트리스-HCl, 및 DNase I을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 기재한 방법은 용해 시약 및 중합체 매트릭스 코팅을 포함한 웰 또는 다중웰 플레이트, 예컨대 96 웰 다중웰 플레이트의 웰에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 웰(들)은 상기 기재한 바와 같이 덱스트란 중합체(들)로부터 유도된 중합체 매트릭스로 코팅되고, 그에 포획 리간드가 부착된다. 바람직한 실시양태에서, 중합체 매트릭스는 덱스트란 중합체의 혼합물로부터 유도되고, 포획 리간드는 니켈 킬레이트이다. 한 실시양태에서, 용해 시 약은 옥틸-티오글루코피라노시드 (OTG), 프로테아제 억제제, 리소자임, 및 벤조나제 (Benzonase (등록상표)) 엔도뉴클레아제로 이루어진다. 더욱 구체적으로, 용해 시약은 2％ OTG, 1％ 프로테아제 억제제, 2％ 리소자임, 및 0.02％ 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제로 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 용해 시약은 중합체 매트릭스의 표면의 적어도 일부에 및(또는) 웰(들)의 측벽에 코팅된다. 달리, 또는 또한, 용해 시약은 웰(들) 내에 동결건조된 매트릭스 또는 다른 덩어리 (예를 들어, 자유-유동 분말) 형태로 존재할 수 있다. 숙주 세포를 함유한 액체 현탁액을 웰(들) 내에 첨가하는 경우에, 상기 기재한 바와 같이 용해 시약을 용해하고, 숙주 세포를 용해시킨다. 표적 세포 성분은 이어서 포획 리간드에 의해 결합된다. 포획된 표적 세포 성분은 이어서 당업계에 공지되고 상기 기재된 기술을 사용하여 임의로 방출시키고, 회수할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 다중웰 플레이트의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 용해 시약을 함유하는 액체와 다중웰 플레이트의 복수개의 웰의 내부 표면을 접촉시키는 것, 및 액체를 건조시켜 웰의 내부 표면에 용해 시약 흡착층을 형성시키는 것을 포함한다. 본원에 기재한 바와 같이 임의의 용해 시약은 이 방식으로 사용될 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 용해 시약의 양은 다양할 수 있지만, 흡착된 용해 시약의 양이 목적하는 수준의 추출을 제공하기에 충분하여야 한다. 건조는 공기 건조, 인큐베이터의 사용, 또는 당업계에 공지된 기타 기술에 의해 달성될 수 있다.
숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하기 위한 용기는 동일한 방식으 로 제조될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 지지된 포획 리간드를 포함하는 웰의 내부 표면은 용해 시약을 함유한 액체와 접촉될 수 있으며, 상기 액체는 건조되어 웰의 내부 표면에 용해 시약 흡착층을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 웰 (예컨대, 상기 기재한 웰 또는 다중웰 플레이트의 웰)에 부착된 중합체 매트릭스를 포함하는 웰의 내부 표면은 용해 시약을 함유한 액체와 접촉될 수 있으며, 상기 액체는 건조되어 중합체 매트릭스의 표면 및(또는) 웰(들)의 측벽에 용해 시약 흡착층을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 컬럼, 예컨대 상기 기재한 바와 같이 부착된 포획 리간드를 갖는 수지를 포함하는 컬럼의 내부 표면은 용해 시약을 함유한 액체와 접촉될 수 있으며, 상기 액체는 건조되어 수지의 표면 및(또는) 컬럼의 측벽에 용해 시약 흡착층을 형성한다.
본원에 인용된 모든 공개물, 특허, 특허 출원 및 기타 참조문헌은 공개물, 특허, 특허 출원 및 기타 참조문헌이 각각 참조에 의해 인용되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것처럼 본원에서 그 전문이 참조로 인용된다.
7. 정의
용어 "포획 리간드"는 용기 또는 지지체 상에 고정 또는 지지될 수 있거나 또는 되고, 세포 잔해로부터 세포 성분을 격리하기 위해 사용될 수 있는 임의의 잔기, 분자, 수용체, 또는 층을 나타낸다. 본 발명과 연관하여 사용될 수 있는 포획 리간드의 일부 비제한적 예에는 바이오틴, 스트렙타비딘, 각종 금속 킬레이트 이온, 항체, 각종 하전된 입자, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피에 사용하기 위한 것, 염료, 각종 친화성 크로마토그래피 지지체, 및 소수성 크로마토그래피에 사용 하기 위한 각종 소수성 군이 포함된다.
용어 "세포의 잔해" 및 "세포 잔해"는 세포 용해의 결과로서 숙주 세포로부터 방출된 표적 생성물 이외의 막 단편, 세포소기관, 또는 임의의 다른 가용성 또는 불용성 세포 성분을 설명하도록 본원에서 교환가능하게 사용된다.
용어 "추출"은 표적 생성물이 발현되는 숙주 세포로부터 세포 용해의 결과로서 표적 생성물의 적어도 일부의 방출을 의미한다.
용어 "숙주 세포"는 표적 생성물을 발현하거나 또는 함유하는 임의의 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다. 숙주 세포는 예를 들어 박테리아 세포, 예컨대 대장균(E. coli); 진균 세포, 예컨대 효모 세포; 식물 세포; 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포; 및 곤충 세포를 포함할 수 있다.
용어 "단리" 또는 "정제"는 세포 잔해의 적어도 부분으로부터의 표적 생성물의 적어도 부분의 제거 또는 분리를 의미한다.
용어 "용해" 또는 "용해하는"은 표적 생성물이 방출되도록 세포 벽 및(또는) 세포의 세포 막을 파열시키는 것을 의미한다. 용해가 완료 또는 부분적으로 될 수 있다 (즉, 세포 벽 및(또는) 세포 막이 세포 성분의 일부를 방출하거나, 또는 반드시는 아니지만 세포 성분의 모두를 방출시키기에 충분히 투과성이 되도록 함).
용어 "표적 생성물"은 임의의 세포 성분, 예컨대 폴리펩티드, 단백질, 단백질 단편, DNA, RNA, 기타 뉴클레오티드 서열, 탄수화물, 지질, 콜레스테롤, 키나제, 또는 기타 세포 성분을 의미하며, 이들은 이들이 발현 또는 함유되는 숙주 세포로부터 추출, 또는 추출 및 격리된다 (예를 들어, "표적 단백질", "표적 DNA", " 표적 RNA", "표적 세포내성분" 등). 표적 생성물은 천연적으로 숙주 세포에서 발생될 수 있거나, 또는 재조합 단백질과 같이 비-천연적으로 발생될 수 있다.
본 발명의 범위로부터 벗어남 없이 상기 생성물 및 방법에서 각종 변화가 만들어질 수 있기 때문에, 상기 명세서 및 하기 실시예에 함유된 모든 내용은 제한 없이 실례로서 해석되는 것으로 의도되어야 한다.
실시예 1
his-태그 재조합 단백질을 사용하는 HIS- 셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트에 의한 디터전트 용해 및 정제
이 실시예에서, 재조합 his-태그를 함유한 단백질을 포함하는 박테리아를 용해하고, 표적 단백질을 한 단계로 정제하였다. 세포가 용해되는 동안 단백질이 포획될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 재조합 단백질을 상이한 양으로 대장균 세포 내로 스파이킹하였다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 물질은 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation)으로부터 획득하였다.
건조 용해 지지체. 표적 단백질의 정제는 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 (HC) 플레이트 (시그마 S5563)를 사용하여 수행하였다. 이들 96 웰 다중웰 플레이트를 예컨대 상기 기재한 바와 같이 고밀도 니켈 킬레이트 중합체 매트릭스로 코팅하였다. 이들 플레이트는 his-태그 재조합 단백질의 정제를 위해 사용하고, 웰 당 단백질 4 ㎍ 초과가 결합할 수 있었다. 주요 용해 성분는 20 mM 트리스-Cl pH 7.5 중의 1％ 옥틸-티오글루코피라노시드 (OTG)이었다. 각종 프로세싱 시약 및 효소를 또한 완충된 디터전트에 첨가하였다: i) 1％ (부피/부피(v/v)) 프로테아제 억제제 (시그마 P8849), 2％ 리소자임 (시그마 L3790 용액 10 mg/ml), 및 0.02％ 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014); ii) 1％ 프로테아제 억제제 및 2％ 리소자임; 및 iii) 1％ 프로테아제 억제제 및 0.02％ 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제. 상기 용액은 각 웰이 완충된 디터전트 및 (i), (ii), 또는 (iii)의 용액 0.1 ml를 함유한 96 웰 HIS-셀렉트 (상표명) HC 플레이트의 개별 웰에 분배하였다. 인큐베이터 내에서 밤새 47 ℃에서 플레이트 상으로 취입하는 건조 공기로 상기 용액을 플레이트의 웰 상으로 건조시켰다. 건조된 경우에, 디터전트 및 (i), (ii), 또는 (iii)로 코팅된 각 웰의 표면적은 대략 134.7 mm2이었다.
세포 성장. 멸균 테리픽 브로쓰 (terrific broth; TB) 배지 5 ml를 3개의 15-ml 둥근 바닥 튜브 각각에 첨가하였다. 암피실린을 튜브 각각에 최종 농도 0.1 mg/ml로 첨가하였다. 비-발현 대장균의 1개의 콜로니를 튜브 각각에 첨가하였다. 배양물을 250 rpm에서 진탕하며 밤새 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
대장균 샘플. 서열 His-Asn-His-Arg-His-Lys-His (서열 4)의 히스티딘 태그를 함유한 정제된 재조합 28 kDa 단백질을 멸균 TB 배지로 1 mg/ml로 희석하였다. 단백질 샘플은 특정량의 표적 단백질을 비-발현 대장균 배양물 내로 스파이킹함으로써 제조하였다. 분취량 100 ㎕은 건조된 용해 시약을 함유한 각 웰에 첨가하였다. 비-발현 대장균 배양물을 대조군으로서 사용하였다. 샘플을 2시간 동안 완만 하게 진탕하며 실온에서 인큐베이션하였다.
SDS-PAGE 분석. 플레이트는 바이오메크(BioMek) 플레이트 세척기를 사용하여 0.05％ 트윈(Tween) 20 (TBST) (pH 8.0)을 갖는 트리스 완충 염수로 4회 세척하였다. 선별된 웰을 실온에서 50 mM 인산나트륨, pH 8, 300 mM 염화나트륨, 및 250 mM 이미다졸을 함유한 용액 50 ㎕로 용출하였다. 샘플을 라엠리(Laemmli) 샘플 완충액과 1:1로 혼합하고, 샘플 20 ㎕는 1 x 트리스-글리신-SDS 완충액 중의 4 내지 20％ 트리스-글리신 겔 (인비트로겐(Invitrogen))을 통해 전기영동하였다. 겔을 EZBlue 염색 시약 (시그마 G1041), 이어서 실버 염색 (시그마 #Prot-sil1)으로 염색하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.
결과 및 논의. 하기 표 1은 도 1의 각 레인에 사용한 샘플의 용해 시약 및 조성을 나타낸다. 표적 단백질을 첨가한 각 웰에서, 단백질을 포획하고, 용출하였다. 더 큰 양의 단백질은 더 큰 표적 단백질을 포획시켰다. 상기 프로세싱 조력은 특히 디터전트 외에 리소자임의 존재시에 결합된 표적 단백질의 양에 유익하였다.
Figure 112005063099095-PCT00010
Figure 112005063099095-PCT00011
<실시예 2>
HIS- 셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트를 사용하는 재조합 대장균 세포의 디터전트 용해, 포획 및 정제
이 절차에서, 재조합 his-태그가 부착된 단백질을 포함하는 박테리아를 프로세싱 보조제와 함께 여러가지 디터전트를 사용하여 용해시키고, 표적 단백질을 한 단계로 정제하였다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 물질을 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션 (Sigma-Aldrich Corporation)으로부터 입수하였다.
건조 용해 지지체. 디터전트, 프로세싱 시약 및 효소의 여러가지 조합물을 사용하여 소정 범위의 용해 시약을 시험하였다. 2％의 OTG, 2％의 CHAPS, 4％의 CHAPS, 2％의 C7BzO, 또는 2％의 ASB-14 100 ㎕를 96 웰 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트 (시그마 S5563) 상에서 건조시켰다. 이들 디터전트와 다른 프로세싱 시약 및 효소를 함유하는 용액 또한 제조하였다. 각 디터전트를 i) 2％ (v/v)의 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 P8849); ii) 2％의 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 P8849) 및 0.01％의 벤조나제 (Benzonase, 등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014); iii) 2％의 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 P8849) 및 0.04％의 리소자임; 및 iv) 2％의 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 P8849), 0.01％의 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014), 및 0.04％의 리소자임과 배합하였다. i) 2％의 OTG 또는 2％의 CHAPS 및 0.04％의 리소자임; ii) 2％의 OTG 또는 2％의 CHAPS 및 0. 01％의 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014); 및 iii) 2％의 OTG 또는 2％의 CHAPS 및 0.01％의 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014) 및 0.04％의 리소자임을 함유하는 또 다른 용액도 제조하였다. 이들 용액 각각을 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트 (시그마 S5563)의 2-3개의 웰에 분배하였고, 각 웰은 용액 100 ㎕를 함유하였다. 용해 시약을 밤새 47 ℃ 오븐에서 플레이트 상에 공기를 취입시키면서 건조시켰다.
세포 성장. 15 ml들이 둥근 바닥 튜브에, 멸균 TB 배지 5 ml를 가하였다. 암피실린을 튜브에 최종 농도가 0.1 mg/ml가 되도록 가하였다. his-태그가 부착된 표적 단백질을 발현하는 대장균 BL21G의 콜로니 하나를 튜브에 가하였다. 배양물을 밤새 37 ℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션하였다. 출발 배양물로부터의 세포 1 ml를 사용하여 멸균 테리픽 브로쓰 (terrific broth, TB) 500 ml를 접종시켰다. 암피실린을 튜브에 최종 농도가 0.1 mg/ml가 되도록 가하였다. 배양물을 250 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 3½시간 동안 인큐베이션하였다. 3½시간 후에, 600 nm에서의 OD는 0.5이었다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 최종 농도가 0.1 mM이도록 배양물에 가하여 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 배양물을 다시 250 rpm으로 진탕하면서 1½시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
대장균 샘플. his-태그가 부착된 단백질을 발현하는 대장균 (실시예 1에서 사용된 것임)을 200 ㎕의 분취액으로, 건조된 용해 시약을 함유하는 웰의 절반까지 가하였다. 비어 있는 웰을 대조군으로 사용하였다. 샘플을 부드럽게 진탕하면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
비신코닌산 ( BCA ) 단백질 분석법. 웰을 바이오멕(BioMek) 플레이트 세척기를 사용하여 TBST, pH 8.0로 4회 세척하였다. 소 혈청 알부민 (BSA) 1 mg/ml를 표준 곡선으로 사용하였다. BCA 작용 시약 200 ㎕를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 30분 동안 37 ℃에서 인큐베이션하고 플레이트 판독기로 562 nm에서 판독하였다. 그 결과는 표 2에 기재되어 있다.
결과 및 평가. BCA 단백질 분석법은 표적 단백질이 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트에 성공적으로 포획되었다는 것을 나타낸다. 여러가지 디터전트 제제가 세포를 용해시켜, 단백질이 포획될 수 있었다. 비이온성 디터전트 OTG 뿐만 아니라, 양쪽성 이온 디터전트 CHAPS, C7BzO 및 ASB-14 또한 잘 작용하였다. 프로세싱 보조제, 특히 리소자임을 첨가하는 것은 플레이트에 결합된 단백질의 양이 증가하는 것에 기여하였다.
Figure 112005063099095-PCT00012
표 2로부터 BCA 단백질 분석법으로 시험한 각 용해 시약에 대한 웰당 단백질의 평균량 (㎍)을 알 수 있었다. 컬럼 1은 사용된 디터전트를 나타낸다. 컬럼 2는 디터전트만을 사용하였을 때의 결과를 요약한 것이다. 컬럼 3 내지 컬럼 9는 디터전트 외에도 리소자임 ("Lys"), 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 ("Benz"), 프로테아제 억제제 칵테일 ("Pr. Inh"), 또는 이들의 여러가지 조합물을 사용하였을 때의 결과를 요약한 것이다.
<실시예 3>
2％의 OTG 및 HIS- 셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트를 사용하는 대장균 및 재조합 his-태그가 부착된 단백질의 용해, 포획, 및 정제
본 실시예에서, 재조합 his-태그가 부착된 단백질을 포함하는 박테리아를 2％의 OTG를 사용하여 용해시키고, 표적 단백질을 한 단계로 정제하였다.
달리 언급하지 않는 한, 모든 물질을 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션으로부터 입수하였다.
건조 용해 지지체. 표적 단백질을 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트 (시그마 S5563)를 사용하여 정제하였다. 이들 96 웰 다중웰 플레이트를 his-태그가 부착된 재조합 단백질의 정제를 위해 사용하였고 웰당 4 ㎍을 초과한 단백질이 결합될 수 있었다. 20 mM의 트리스-Cl pH 7.5 중 2％의 옥틸티오글루코피라노시드 (OTG), 1％ (v/v)의 프로테아제 억제제 (시그마 P8849), 2％의 리소자임 (시그마 10 mg/ml 용액 L3790), 및 0.02％의 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014)를 포함하는 용해액을 제조하였다. 이 용액 50 ㎕ 또는 100 ㎕를 96 웰 HIS-셀렉트 (상표명) HC 플레이트의 웰에 분배하였다. 상기 용액을 밤새 47 ℃ 인큐베이터에서 플레이트 상에 건조 공기를 취입시키면서 플레이트의 웰 상에서 건조시켰다.
세포 성장. 15 ml들이 둥근 바닥 튜브에, 멸균 TB 배지 5 ml를 가하였다. his-태그가 부착된 표적 단백질을 발현하는 암피실린에 대한 비내성 대장균의 콜로니 하나를 튜브에 가하였다. 배양물을 밤새 37 ℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 인큐베이션하였다.
대장균 샘플. 히스티딘 태그가 부착된, 정제된 재조합 28 kDa 단백질 (실시예 1에 기재되어 있음)을 멸균 TB 배지를 사용하여 1 mg/ml로 희석시켰다. 단백질 샘플을 특정량의 표적 단백질을 비발현 대장균 배양물에 스파이킹함으로써 제조하였다. 대조 샘플은 정제된 표적 단백질 또는 비발현 대장균 배양물만을 포함하였다. 100 ㎕의 분취액을 건조된 용해 시약을 함유하는 각 웰에 가하였다. 샘플을 2시간 동안 부드럽게 진탕하면서 실온에서 인큐베이션하였다.
SDS-PAGE 분석법. 인큐베이션 후에, 플레이트를 바이오멕 플레이트 세척기를 사용하여 TBST, pH 8.0로 4회 세척하였다. 일부 웰을 50 mM의 인산나트륨, pH 8, 300 mM의 염화나트륨, 및 250 mM의 이미다졸을 함유하는 용액 50 ㎕로 실온에서 용출하였다. 샘플을 래믈리(Laemmli) 샘플 완충액과 1:1로 혼합하고, 20 ㎕를 1x 트리스-글리신-SDS 완충액 중 4-20％의 트리스-글리신 겔 (인비트로겐(Invitrogen))을 통해 전기영동하였다. 겔을 EZBlue 염색 시약으로 염색한 후 은으로 염색하였다. 그 결과는 도 2 및 도 3과 표 3에 기재되어 있다.
브래드포드 단백질 분석법. BSA 1 mg/ml를 표준 곡선으로 사용하였다. 브래드포드 시약 250 ㎕를 각 웰에 가하였다. 플레이트를 실온에서 15분간 인큐베이션하고 플레이트 판독기로 595 nm에서 판독하였다. 그 결과는 표 5에 기재되어 있다.
광산란 . 세포 배양물의 100 ㎕의 분취액을 멸균 배지로 1:10으로 희석하여 용해되기 전의 550 nm에서의 OD를 측정하였다. 스파이크 표적 단백질 8 ㎍을 함유하는 세포 샘플을, 용해시킨 후에 두 분취액으로 550 nm에서 판독하였다. 그 결과는 표 4에 기재되어 있다.
결과 및 평가. SDS-PAGE 샘플로부터 세포가 용해되었고, 표적 단백질이 포획되어 성공적으로 용출되었다는 것을 알 수 있었다. 포획된 표적 단백질의 양은 세포에 가한 표적 단백질의 양이 증가함에 따라 증가하였다. 광산란 데이타로부터 용해후 샘플이 550 nm에서의 흡광도가 감소하였다는 것을 알 수 있었고, 이는 세포가 용해되었다는 것을 나타낸다. 샘플의 브래드포드 단백질 분석법 데이타는 플레이트에 결합된 표적 단백질이 있다는 것을 나타낸다. 비발현 세포의 용해로부터 백그라운드(background) 단백질 수준을 알 수 있으나, 표적 단백질의 양이 증가하면 이 백그라운드 수준보다 큰 단백질가가 얻어졌다.
Figure 112005063099095-PCT00013
표 3은 도 2 및 도 3의 각 레인의 샘플 조성을 나타낸다. 모든 샘플을 2％의 OTG, 20 mM의 트리스-Cl pH 7.5, 2％의 10 mg/ml 리소자임, 1％ (v/v)의 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마 P8849) 및 0.02％의 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014)의 건조된 용액 50 ㎕ (도 2) 또는 100 ㎕ (도 3)를 함유하는 HIS-셀렉트 (상표명) HC 플레이트 (시그마 S5563)에 가하였다.
Figure 112005063099095-PCT00014
Figure 112005063099095-PCT00015
<실시예 4>
고용량 및 고감도 HIS- 셀렉트 (상표명) 및 안티 -플래그(등록상표) M2 플레이트를 사용하는 재조합 단백질의 디터전트 용해, 포획 및 정제
본 실시예에서, DYKDDDDK (서열 1) 태그 및(또는) his-태그를 갖는 표적 단백질을 발현하는 박테리아 세포를 프로세싱 보조제와 함께 여러가지 디터전트(들)를 사용하여 용해시키고, 표적 단백질을 한 단계로 정제하였다.
달리 언급하지 않는 한, 모든 물질을 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션으로부터 입수하였다.
건조 용해 지지체. 디터전트, 프로세싱 시약, 및 효소의 여러가지 조합물을 사용하여 다수의 용해 조건을 시험하였다. 하기를 함유하는 디터전트 용해액을 제조하였다:
a) 2％의 SB3-10, 0.2％의 C7BzO, 0.2％의 n-도데실 α-D-말토시드, 0.2％의 트리톤 X-100
b) 2％의 CHAPS, 1％의 ASB-14
c) 2％의 SB3-14, 0.2％의 C7BzO
d) 2％의 CHAPS, 1％의 n-옥틸 글루코시드
e) 2％의 SB3-12, 0.2％의 C7BzO
f) 2％의 SB3-14, 0.2％의 ASB-14
g) 1％의 n-옥틸 글루코시드, 1％의 CHAPS, 0.2％의 n-도데실 α-D-말토시드
h) 8％의 CHAPS
디터전트 CHAPS는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트이고, SB3-10은 3-(데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 분자내염이고, SB3-12는 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 분자내염이고, SB3-14는 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트이고, C7BzO는 3-(4-헵틸)페닐 3-히드록시프로필)디메틸암모니오 프로판 술포네이트이고, ASB-14는 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일 아미노프로필)암모니오]프로판술포네이트이었다. 처음 7가지의 디터전트 용액 (a 내지 g)은 40 mM의 트리스-HCl, pH 7.4, 0.04％의 리소자임 (시그마 L3790), 및 0.01％의 벤조나제 (등록상표) 엔도뉴클레아제 (시그마 E1014)도 함유하였다. 8％의 CHAPS 용액 (h)은 80 mM의 트리스-HCI, pH 8.0, 0.04％의 리소자임 (시그마 L6876), 및 0.01％의 DNase I (시그마 D4527)도 함유하였다. 이들 디터전트 용액 각각 100 ㎕를 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트 (시그마 M5563), HIS-셀렉트 (상표명) 고감도 플레이트 (시그마 S5688), 안티-플래그 (등록상표) M2 고용량 플레이트, 및 안티-플래그 (등록상표) M2 고감도 플레이트 (시그마 P2983)의 6개의 웰 (½줄)에 분배하였다. 용해 시약을 플레이트 상에 취입된 주위의 공기 하에 인큐베이터에서 밤새 건조시켰다.
세포 성장. 멸균 테리픽 브로쓰 (TB) 5 ml를 3개의 15 ml들이 둥근 바닥 튜브 각각에 가하였다. 암피실린을 각 튜브에 최종 농도가 0.1 mg/ml이도록 가하였다. DYKDDDDK (서열 1) 태그를 갖는 표적 단백질을 발현하는 BL21 대장균의 글리세롤 스톡 용액의 20 ㎕의 분취액을 제1 튜브에 가하였다. DYKDDDDK (서열 1)/his-태그를 갖는 표적 단백질을 발현하는 BL21 대장균의 글리세롤 스톡 용액의 20 ㎕의 분취액을 제2 튜브에 가하였다. his 태그를 갖는 표적 단백질을 발현하는 BL21 대장균 (실시예 1에 기재되어 있음)의 글리세롤 스톡 용액의 20 ㎕의 분취액을 제3 튜브에 가하였다. 배양물을 275 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
밤새 성장시킨 출발 배양물을 사용하여 3개의 멸균 테리픽 브로쓰 샘플 500 ml를 접종시켰다. 암피실린을 각 플라스크에 최종 농도가 0.1 mg/ml이도록 가하였다. 배양물을 275 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 최종 농도가 1 mM이도록 배양물에 가하여 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 배양물은 다시 275 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다.
대장균 샘플. 500 ml들이 진탕 플라스크에서 성장시킨 재조합 단백질을 발현하는 대장균을 200 ㎕의 분취액으로, 용해 시약으로 코팅한 각 플레이트의 두 컬럼에 가하였다. 비어 있는 웰을 대조군으로서 사용하였다. 샘플을 부드럽게 진탕하면서 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다.
고감도 플레이트의 효소 면역검출 검정법. 웰을 바이오텍(BioTek) 플레이트 세척기를 사용하여, TBS-T, pH 8.0로 4회 세척한 후, 탈이온수로 4회 세척하였다. 표적 단백질에 대해 특이적인 호스래디쉬 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase, HRP) 콘쥬게이팅 항체 200 ㎕를 각 웰이 가하였다. 이들 콘쥬게이트를 또한 블랭크(blank)로서 사용하기 위해 단백질을 함유하지 않는 4개의 다른 웰에도 가하였다. 플레이트를 항체와 함께 실온에서 45분 동안 인큐베이션하고, 그 후에 TBS-T, pH 8.0로 4회 세척하였다. TMB 기질 (시그마 T0440) 100 ㎕를 각 웰에 가하고 플레이트를 색상이 뚜렷해질 때까지 (대략 3 내지 5분) 두었다. 이 때, 1 M의 HCl 100 ㎕를 각 웰에 가함으로써 반응을 중지시켰다. 450 nm에서의 흡광도 판독치를 얻고, 보정된 A450을 측정하기 위해 블랭크를 뺐다.
고용량 플레이트의 TCA 침강. 웰을 바이오텍 플레이트 세척기를 사용하여, TBS-T, pH 8.0로 4회 세척한 후, 탈이온수로 4회 세척하였다. 50 mM의 인산나트륨, pH 8.0, 300 mM의 NaCl, 및 250 mM의 이미다졸 100 ㎕를 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 0.1 M의 글리신, pH 3.0 100 ㎕를 안티-플래그 (등록상표) M2 고용량 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 플레이트를 37 ℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 표적 단백질을 용출하였다. 용출된 샘플을 플레이트로부터 제거하고 깨끗한 튜브에 두었다. 각 샘플을 0.2％의 나트륨 데옥시콜레이트 용액 (시그마 D3691)으로 최종 부피가 500 ㎕이도록 희석시켰다. 샘플을 잠시동안 볼텍싱하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 100％의 트리클로로아세트산 용액 (TCA) (시그마 T6323) 50 ㎕를 각 샘플에 가하고, 이들을 잠시동안 볼텍싱하고 빙상에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 실온에서 10분 동안 15,000 × g로 원심분리하고 상등액을 기울여 따라냈다. 25％의 아세톤 용액 (시그마 A5351) 500 ㎕를 각 튜브에 가하였다. 샘플을 잠시동안 볼텍싱하고 5분 동안 15,000 × g로 원심분리하였다. 상등액을 기울여 따라내고 단백질 펠렛을 스피드백(SpeedVac)으로 30 ℃에서 20분 동안 건조시켰다.
SDS-PAGE 분석법. 각 단백질 펠렛을 래믈리 샘플 완충액 (시그마 S3401) 10 ㎕에 재현탁시키고, 1 M의 NaOH를 사용하여 염기성 pH로 적정하였다. 샘플 전체를 10-20％의 트리스-글리신 겔 (바이오래드(BioRad) 카탈로그 #345-0044)을 통해 전기영동하였다. 겔을 EX Blue (상표명) (시그마 G1041) 겔 염색 시약으로 1시간 동안 염색하고, 밤새 탈이온수로 탈염하였다.
결과 및 평가. 효소 면역검출 검정법으로부터의 보정된 A450 판독치는 표적 단백질이 HIS-셀렉트 (상표명) 및 안티-플래그 (등록상표) M2 고감도 플레이트에 성공적으로 포획되었다는 것을 나타낸다. 여러가지 디터전트 제제가 세포를 용해시켜, 단백질이 포획될 수 있었다. 도 4는 안티-플래그 (등록상표) M2 고감도 플레이트 분석법으로부터의 보정된 흡광도 값을 도시하고, 이로부터 DYKDDDDK (서열 1) 태그를 갖는 단백질이 포획되었고, DYKDDDDK (서열 1) 태그가 없는 그러한 단백질을 포획되지 않았다는 것을 알 수 있었다. 도 5는 HIS-셀렉트 (상표명) 고감도 플레이트 면역검출 검정법으로부터의 보정된 흡광도 값을 함유하고, 이로부터 플레이트가 his-태그가 부착된 표적 단백질을 선택적으로 포획할 수 있고, his-태그가 없는 단백질은 포획하지 않았다는 것을 알 수 있었다. 마찬가지로, 도 6의 SDS-PAGE 결과로부터 표적 단백질이 성공적으로 포획되어 HIS-셀렉트 (상표명) 고용량 플레이트로부터 용출되었다는 것을 알 수 있었다. 유사한 결과가 안티-플래그 (등록상표) M2 고용량 플레이트로부터 얻어졌다. 표 6은 도 6에서 각 레인에 대해 사용된 용해 시약 및 샘플의 조성을 나타낸다.
Figure 112005063099095-PCT00016
Figure 112005063099095-PCT00017
Figure 112005063099095-PCT00018

Claims (28)

  1. 입구(mouth); 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 및 내부 표면의 적어도 일부에 코팅된 용해 시약을 포함하며, 코팅 중 용해 시약의 양은 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액이 용기내로 도입될 때 숙주 세포를 용해시키는 용량을 갖는 용해액을 형성시키는데 충분하고, 코팅된 내부 표면적(SA) 대 부피(V)의 비율은 약 4 mm2/㎕ 미만인, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 용기.
  2. 입구; 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 용해 시약; 및 지지된 포획 리간드를 가지며, 측벽 형성부는 바닥부와 입구 사이에 위치하고, 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구 및 액체를 용기로부터 배출시키기 위한 배출구로서 작용하고, 포획 리간드는 원형(intact) 숙주 세포 또는 그로부터 유도된 고체 세포 성분을 함유하는 액체 현탁액이 입구를 통해 용기내로 도입될 때 상기 원형 숙주 세포 또는 고체 세포 성분과 접촉하게끔 하는 용기내 위치에 지지되는 것인, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하기 위한 용기.
  3. (i) 웰(들)의 내부 표면의 적어도 일부에 코팅되어 있거나 또는 (ii) 웰(들)내에 함유된 물질 덩어리 형태인 용해 시약을 함유하는 하나 이상의 웰을 갖는, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 다중웰(multiwell) 플레이트.
  4. 제3항에 있어서, 웰(들)이 세포 성분에 대한 포획 리간드를 추가로 포함하는 것인 다중웰 플레이트.
  5. 용해 시약이 디터전트(detergent), 용해 효소, 카오트로프(chaotrope) 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제1항 또는 제2항의 용기 또는 제3항의 다중웰 플레이트.
  6. 제5항에 있어서, 용해 시약이 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트, 옥틸-β-티오글루코피라노시드, 옥틸-글루코피라노시드, 3-(4-헵틸)페닐 3-히드록시프로필)디메틸암모니오 프로판술포네이트, 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판술포네이트, 3-(데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트, n-도데실 α-D-말토시드 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 디터전트인 용기 또는 다중웰 플레이트.
  7. 제5항에 있어서, 용해 시약이 베타 글루쿠론디아제, 글루카나제, 글루술라제, 리소자임, 리티카제, 만나나제, 뮤타놀리신, 자이몰라제, 셀룰라제, 리소스타핀, 펙톨리아제, 스트렙토리신 O, 및 이들의 각종 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해 효소인 용기 또는 다중웰 플레이트.
  8. 제5항에 있어서, 용해 시약이 우레아, 구아니딘 HCl, 구아니딘 티오시아네이트, 구아니듐 티오술페이트, 티오우레아, 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 카오트로프인 용기 또는 다중웰 플레이트.
  9. 제5항에 있어서, 용해 시약이 완충액, 소포제, 벌크화제, 프로세싱(processing) 효소, 효소 억제제, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함하는 것인 용기 또는 다중웰 플레이트.
  10. 포획 리간드가 금속 킬레이트, 글루타티온, 바이오틴, 스트렙타비딘, 항체, 하전된 입자, 또는 불용성 소수성기인 제2항의 용기 또는 제4항의 다중웰 플레이트.
  11. 제10항에 있어서, 포획 리간드가 서열 1, 서열 2 또는 서열 3에 대해 특이성을 갖는 항체인 용기 또는 다중웰 플레이트.
  12. 제10항에 있어서, 포획 리간드가 하기 화학식 1에 상응하는 구성으로부터 유도된 금속 킬레이트인 용기 또는 다중웰 플레이트.
    <화학식 1>
    Figure 112005063099095-PCT00019
    상기 식에서,
    Q는 캐리어이고,
    S1은 스페이서이고,
    L은 -A-T-CH(X)- 또는 -C(=O)-이고,
    A는 에테르, 티오에테르, 셀레노에테르 또는 아미드 연결기이고,
    T는 결합이거나, 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알케닐이고,
    X는 -(CH2)kCH3, -(CH2)kCOOH, -(CH2)kSO3H, -(CH2)kPO3H2, -(CH2)kN(J)2 또는 -(CH2)kP(J)2, 바람직하게는 -(CH2)kCOOH 또는 -(CH2)kSO3H이고,
    k는 0 내지 2의 정수이고,
    J는 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌이고,
    Y는 -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 또는 -P(J)2, 바람직하게는 -COOH이고,
    Z는 -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 또는 -P(J)2, 바람직하게는 -COOH이며,
    i는 0 내지 4의 정수, 바람직하게는 1 또는 2이다.
  13. 제12항에 있어서, 금속 킬레이트가 하기 화학식 1-1 내지 1-4로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성으로부터 유도되는 것인 용기 또는 다중웰 플레이트.
    Figure 112005063099095-PCT00020
    상기 식에서, Q는 캐리어이다.
  14. (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구; 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 및 내부 표면의 적어도 일부에 코팅된 용해 시약을 갖는 용기내에 도입하는 단계 (코팅된 내부 표면적(SA) 대 부피(V)의 비율은 약 4 mm2/㎕ 미만임), 및 (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 세포 잔해를 형성시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하는 방법.
  15. (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구; 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 용해 시약; 및 지지된 포획 리간드를 갖는 용기내에 도입하는 단계 (상기 측벽 형성부는 바닥부와 입구 사이에 위치하며, 상기 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구 및 액체를 용기로부터 배출시키기 위한 배출구로서 작용함), (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 고체 세포 잔해를 형성시키는 단계, 및 (c) 고체 세포 잔해의 존재하에 포획 리간드를 사용해서 세포 성분을 포획하는 단계를 포함하는, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하는 방법.
  16. 용기의 내부 표면 또는 다중웰 플레이트의 다수의 웰과 용해 시약 함유 액체를 접촉시키는 단계 및 상기 액체를 건조시켜 용기 또는 웰의 내부 표면에 용해 시약 흡착층을 형성시키는 단계를 포함하는, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출하기 위한 용기 또는 다중웰 플레이트의 제조 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 시약이 디터전트, 용해 효소, 카오트로프, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 용해 시약이 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트, 옥틸-β-티오글루코피라노시드, 옥틸-글루코피라노시드, 3-(4-헵틸)페닐 3-히드록시프로필)디메틸암모니오 프로판술포네이트, 3-[N,N-디메틸(3-미 리스토일아미노프로필)암모니오]프로판술포네이트, 3-(데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(도데실디메틸암모니오)프로판술포네이트 내부 염, 3-(N,N-디메틸미리스틸암모니오)프로판술포네이트, n-도데실 α-D-말토시드, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 디터전트인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 용해 시약이 베타 글루쿠론디아제, 글루카나제, 글루술라제, 리소자임, 리티카제, 만나나제, 뮤타놀리신, 자이몰라제, 셀룰라제, 리소스타핀, 펙톨리아제, 스트렙토리신 O, 및 이들의 각종 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용해 효소인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 용해 시약이 우레아, 구아니딘 HCl, 구아니딘 티오시아네이트, 구아니듐 티오술페이트, 티오우레아 및 이들의 임의의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 카오트로프인 방법.
  21. 제17항에 있어서, 용해 시약이 완충액, 소포제, 벌크화제, 프로세싱 효소, 효소 억제제, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 제15항에 있어서, 포획 리간드가 금속 킬레이트, 글루타티온, 바이오틴, 스트렙타비딘, 항체, 하전된 입자, 또는 불용성 소수성기인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 포획 리간드가 서열 1, 서열 2 또는 서열 3에 대해 특이성을 갖는 항체인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 포획 리간드가 하기 화학식 1에 상응하는 구성으로부터 유도된 금속 킬레이트인 방법.
    <화학식 1>
    Figure 112005063099095-PCT00021
    상기 식에서,
    Q는 캐리어이고,
    S1은 스페이서이고,
    L은 -A-T-CH(X)- 또는 -C(=O)-이고,
    A는 에테르, 티오에테르, 셀레노에테르 또는 아미드 연결기이고,
    T는 결합이거나, 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알케닐이고,
    X는 -(CH2)kCH3, -(CH2)kCOOH, -(CH2)kSO3H, -(CH2)kPO3H2, -(CH2)kN(J)2 또는 -(CH2)kP(J)2, 바람직하게는 -(CH2)kCOOH 또는 -(CH2)kSO3H이고,
    k는 0 내지 2의 정수이고,
    J는 히드로카르빌 또는 치환된 히드로카르빌이고,
    Y는 -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 또는 -P(J)2, 바람직하게는 -COOH이고,
    Z는 -COOH, -H, -SO3H, -PO3H2, -N(J)2 또는 -P(J)2, 바람직하게는 -COOH이며,
    i는 0 내지 4의 정수, 바람직하게는 1 또는 2이다.
  25. (a) 숙주 세포를 함유하는 액체 현탁액을, 입구; 측벽 형성부 및 바닥부를 포함하는 내부 표면; 부피(V); 용해 시약; 및 지지된 포획 리간드를 갖는 용기내에 도입하는 단계 (상기 측벽 형성부는 바닥부와 입구 사이에 위치하며, 상기 입구는 액체를 용기내로 도입하기 위한 유입구로서 작용함), (b) 용기내 숙주 세포를 용해시켜 세포 성분을 방출시키고 고체 세포 잔해를 형성시키는 단계, (c) 고체 세포 잔해의 존재하에 포획 리간드를 사용해서 세포 성분을 포획하는 단계, (d) 포획 리간드로부터 세포 성분을 방출시키는 단계, 및 (e) 방출된 세포 성분을 회수하는 단계를 포함하는, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하는 방법.
  26. 제1항 또는 제2항의 용기 또는 제3항의 다중웰 플레이트, 및 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하기 위한 지침을 포함하는, 숙주 세포로부터 세포 성분을 추출 및 단리하기 위한 키트.
  27. 제26항에 있어서, 포획된 세포 성분을 분석 또는 검출하기 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
  28. 제2항에 있어서, 결합된 포획 리간드를 갖는 수지층 및 용해 시약을 포함하는 동결건조된 덩어리를 포함하는 내부 챔버를 갖는 컬럼을 포함하는 용기.
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