KR20010015817A - Modified Antibodies with Enhanced Ability to elicit an anti-idiotype response - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 면역글로불린 분자에 관하고, 여기서 사슬사이 이황화결합을 형성하는 하나 또는 복수변이영역을 SH(sulfydryl)기를 보유하지 않은 아미노산 잔기로 대체하여, 사슬사이 이황화결합이 형성되지 않도록 한다. 이런 면역글로불린 분자는 향상된 항-유전자형반응 유도능력을 갖는다. 본 발명은 또한 본 발명의 변형된 면역글로불린을 사용하여 암 및 감염성 질병의 예방 및 치료방법을 제공한다.The present invention relates to modified immunoglobulin molecules, wherein one or more mutant regions forming interchain disulfide bonds are replaced with amino acid residues having no SH (sulfydryl) group so that no interchain disulfide bonds are formed. These immunoglobulin molecules have the ability to induce enhanced anti-genic responses. The present invention also provides methods of preventing and treating cancer and infectious diseases using the modified immunoglobulins of the present invention.
Description
2. 발명의 배경2. Background of the Invention
2.1. 면역글로블린 구조2.1. Immunoglobulin structure
면역글로블린 구조의 기본 단위는 네 개 폴리펩티드 복합체로써, 이는 두 개의 동일한 분자량이 적은 또는 "light"(L) 쇄와 두 개의 동일한 분자량이 큰 또는 "heavy"(H) 쇄가 비공유 연합 및 이황화결합에 의해 연결되어 있다. 항체의 각 L 및 H에는 각 이의 아미노산 말단에 가변 부분을 가지고 이의 C말단에는 항상부분을 가진다(도 1참고). 가변 부분은 각 항체마다 독특한 것으로 항체 항원 결합 부위를 포함한다. 각 가변 도메인은 4개의 관련된 보존 구조로 된 부분과 상보성 결정 부분 또는 CDR이라고 불리는 초가변성 서열로 된 3 부분으로 구성된다(도 2). 대부분의 경우에 항원 결합 부위를 형성하고, 항원 특이성을 제공하는 것이 CDR이다. 항상 부분은 가변 도메인에 비해 매우 보존성이 큰데, 반수체형의 차이로 인해 어느 정도의 다양성은 가진다.The basic unit of immunoglobulin structure is four polypeptide complexes, in which two identical low molecular weight or "light" (L) chains and two identical high molecular weight or "heavy" (H) chains are used for non-covalent association and disulfide bonds. Are connected by. Each L and H of the antibody has a variable portion at its amino acid terminus and always has a portion at its C terminus (see FIG. 1). The variable portion is unique for each antibody and includes an antibody antigen binding site. Each variable domain consists of four related conserved structures and three parts of complementarity determining parts or hypervariable sequences called CDRs (FIG. 2). In most cases it is the CDRs that form the antigen binding site and provide antigen specificity. The part is always very conservative compared to the variable domain, with some diversity due to the haplotype difference.
이들의 아미노산 서열을 기초로 하여, L쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 항상부분의 H쇄는 다중 도메인(CH1, CH2, CH3 ... CHx)으로 구성되는데, 그 수는 특정 항체 종류에 따라 달라진다. CH1 부분은 항체에 유연성을 제공하는 힌지 부분을 사이에 두고 CH2와 분리되어 있다. 각 L 쇄의 가변 부분은 각 H 쇄의 가변 부분과 일직선상에 배열되어 있고, 각 L쇄의 항상 부분은 각 H쇄의 제 1 항상 부분과 일직선 상에 배열되어 있다. H쇄의 항상 부분의 CH2-CHx 도메인은 "Fc 부분"을 만드는데, 이는 상보성 결합, 임파세포, 과립세포, 단세포 계통 세포, 킬러 세포, 비반세포 및 다른 면역 효과 세포에 의해 발현되는 Fc 수용체에 결합하는 등의 효과물질 기능을 담당하고 있다.Based on their amino acid sequences, L chains are classified as either kappa or lambda. The H chain always consists of multiple domains (CH1, CH2, CH3 ... CHx), the number of which depends on the specific antibody type. The CH1 moiety is separated from CH2 with a hinge moiety interposed between them that provides flexibility to the antibody. The variable portion of each L chain is arranged in line with the variable portion of each H chain, and the always portion of each L chain is arranged in line with the first always portion of each H chain. The CH2-CHx domain of the always part of the H chain makes an "Fc part", which binds to Fc receptors expressed by complementary binding, lymphocytes, granule cells, unicellular lineage cells, killer cells, plaque cells and other immune effector cells. It is in charge of the function of the effective substance.
도 3에서 볼 수 있는 것과 같이, IgG 분자의 각 L 및 H 쇄는 가변 부분 도메인 및 항상 부분 도메인을 만든다. 각 도메인은 길이가 약 100인 아미노산으로 된 두개 단백질 층이 샌드위치형으로 배열되고, 이 층은 한 개의 이황화결합에 의해 연결되어 있다(Roitt et al., Immunology, 3rd Edition, London; Mosby, 1993, p 4.4). 두 개의 단백질 층으로 된 각 도메인에는 두 개의 "anti-paralle" 인접 가닥을 포함하여, 베타-쉬트 모양을 만들 수 있다(e.g., Stryer, 1975, Biochemistry, WH Freeman and Co., p. 950). 각 도메인은 면역글로블린 폴드에 기초한 유사한 3차 구조를 가진다.As can be seen in FIG. 3, each L and H chain of the IgG molecule creates a variable partial domain and always a partial domain. Each domain consists of two protein layers of about 100 amino acids in length, sandwiched by a single disulfide bond (Roitt et al., Immunology, 3rd Edition, London; Mosby, 1993, p 4.4). Each domain of two protein layers contains two "anti-paralle" contiguous strands to form a beta-sheet shape (e.g., Stryer, 1975, Biochemistry, WH Freeman and Co., p. 950). Each domain has a similar tertiary structure based on immunoglobulin folds.
2.2. 면역치료 및 항-이디오타입 항체2.2. Immunotherapy and Anti-idiotype Antibodies
현대 의학에 따르면, 면역치료 또는 백신화반응으로 실제 소아마비, 파상풍, 결핵, 수두, 홍역 및 간염등의 질병을 제거하였다. 백신화반응을 이용하여, 감염성 질환을 예방하기 위한 면역계의 능력에 대해 조사하였다.According to modern medicine, immunotherapy or vaccination has resulted in the elimination of diseases such as polio, tetanus, tuberculosis, chicken pox, measles and hepatitis. Vaccination reactions were used to investigate the ability of the immune system to prevent infectious diseases.
암 치료를 위해 면역치료법을 이용하여 연구하였다. 종양 면역학 분야는 Prehn and Main에 의해 시작되었는데, 이들은 메틸클로란트렌(MCA)에 의해 유오된 육종에 항원이 종양 특이적이라는 것을 보여주었는데, 이식 검사에서 이들 항원이 쥐의 정상 조직에서는 감지되지 않았다(Prehn et al., 1957, J. Natl. Cancer Inst. 18:79-778). 이는 MCA-유도된 종양에 대해 종양 특이적인 저항성이 자발 숙주 즉, 종양의 기원이 되는 쥐에서 유도되었다는 것을 설명하는 추가 실험에 의해 확인된 바 있다(Klein et al., 1990, cancer Res. 20:151-1572).The study was carried out using immunotherapy for the treatment of cancer. The field of tumor immunology was initiated by Prehn and Main, which showed that the antigens were tumor specific for sarcomas induced by methylchloranthrene (MCA), which was not detected in normal tissues of rats by transplantation tests. (Prehn et al., 1957, J. Natl. Cancer Inst. 18: 79-778). This was confirmed by further experiments demonstrating that tumor specific resistance to MCA-induced tumors was induced in spontaneous hosts, i.e., mice from which the tumor originated (Klein et al., 1990, cancer Res. 20: 151-1572).
암 환자를 치료하는데 면역요법을 이용하는 것이 왜 바람직한 것인지에 대해서는 몇 가지 이유가 있다. 우선, 마취 및 연속적인 화학요법을 하는 외과술에서 암 환자가 면역억제된 경우에, 면역억제를 악화시킬 수 있고, 그다음 수술전 기간동안에 적절한 면역요법을 하면, 이와 같은 면역억제는 억제되거나 또는 역전될 수 있다. 이로써 감염 복합증을 줄리고, 상처 치료를 가속시킨다. 둘째, 종양 크기는 외과술후에 작아지고, 면역요법은 이 상황에서 가장 효과적이다. 셋째는 종양 세포가 외과술에서 순환계로 들어가지 때문에 이 시기에 효과적인 면역요법을 실시하면 이들 세포를 제거할 수 있다.There are several reasons why it is desirable to use immunotherapy to treat cancer patients. First, if cancer patients are immunosuppressed in anesthesia and subsequent chemotherapy surgery, immunosuppression can be exacerbated, and then appropriate immunotherapy during the preoperative period, such immunosuppression is inhibited or reversed. Can be. This reduces complications and accelerates wound healing. Second, tumor size is reduced after surgery, and immunotherapy is most effective in this situation. Third, because tumor cells enter the circulatory system in surgery, effective immunotherapy at this time can remove these cells.
면역요법에는 두가지 종류가 있는데, "능동적인 면역요법"과 "수동적인 면역요법"이 있다. "능동적인 면역요법"에서, 항원은 환장[ 백신형으로 투여되어 보호성 면역 반응을 유도한다. "수동적인 면역요법"은 동시에 면역 반응을 유도하지 않고 환자에 항체를 투여하는 것이다. 한 동물에서 취한 특정 항체를 적절한 제 2 동물로 이뮤노겐으로 주사하였을 경우에, 주사된 항체는 면역 반응을 유도하게 된다. 항체 요법은 환자가 항체의 소스가 아니기 때문에 수동적이라고 할 수 있다. 그러나, 환자가 항-이디오타입 제 2 항체를 만들고, 이는 고유 항원과 교차 반응성을 가지는 면역 반응을 일으키기 때문에 수동적이라는 용어는 잘못된 것이다. 제 2 항체를 환자에서 만들게 하는 면역 요법은 항체의 최초 주입후에 특정 항원을 보유하는 세포와 환자의 고유 면역계가 지속적으로 투쟁하기 때문에 수동적인 면역요법보다는 치료요법적으로 더 효과적이다.There are two types of immunotherapy, "active immunotherapy" and "passive immunotherapy". In "active immunotherapy", the antigen is administered in the form of a vaccine [vaccination] to induce a protective immune response. "Passive immunotherapy" is the administration of an antibody to a patient without inducing an immune response at the same time. When a specific antibody taken in one animal is injected with an immunogen into an appropriate second animal, the injected antibody will induce an immune response. Antibody therapy is passive because the patient is not the source of the antibody. However, the term passive is misleading because the patient makes an anti-idiotype second antibody, which causes an immune response that has cross reactivity with the native antigen. Immunotherapy, which makes a second antibody in a patient, is therapeutically more effective than passive immunotherapy because, after the initial infusion of the antibody, cells bearing a specific antigen and the patient's native immune system are constantly fighting.
항-이디오타입 반응에서, 면역 반응 동안에 처음에 만들어진 또는 유기체로 도입된 항체는 유기체가 이에 대해 내성을 가지지 않는 독특한 신규한 에피토프를 가지고, 제2 항체 생산("Ab2")을 유도하고, 이들 중 일부는 외부에서 초기에 도입되거나 생산된 항체인 제1 항체("Ab1")의 이디오타입(항원 결합 부위)에 대항하게 된다. 이와 같은 제 2 항체 또는 Ab2는 제3항체("Ab3")를 유도할 수 있는 이디오타입을 가지고, 이들중 일부는 Ab2의 항원 결합 부위를 인지할 수 있다. 이는 소위 "네트워크" 이론으로 알려져 있다. 제 2 항체의 일부는 고유 항원과 유사한 결합 부분을 가지고, 따라서, 고유 항원의 "내부 이미지"를 다시 만들 수 있다. 따라서, Ab2 항체의 항원 결합 부위를 인지하는 제3 또는 Ab3 항체 또한 고유 항원을 인지할 수 있다(도 4).In an anti-idiotypic response, an antibody initially made or introduced into an organism has a unique novel epitope that the organism is not resistant to, and induces second antibody production (“Ab2”). Some of these will be against the idiotype (antigen binding site) of the first antibody (“Ab1”), which is an antibody initially introduced or produced externally. Such a second antibody or Ab2 has an idiotype capable of inducing a third antibody (“Ab3”), some of which may recognize the antigen binding site of Ab2. This is known as the so-called "network" theory. Some of the second antibodies have a binding moiety that is similar to the native antigen, and thus can recreate an "internal image" of the native antigen. Thus, a third or Ab3 antibody that recognizes the antigen binding site of the Ab2 antibody may also recognize the native antigen (FIG. 4).
따라서, 항-이디오타입 항체는 항원의 모양 및 전하와 유사한 결합 부위를 가지고, 암 항원자체와 동일한 또는 더 큰 반응을 유도할 수 있다. 강력한 항-이디오타입 반응을 유도할 수 있는 외생 항체를 투여하면, 일정한 면역 반응을 유도하여 효과적인 백신으로 작용한다.Thus, anti-idiotype antibodies have binding sites similar to the shape and charge of the antigen and can induce a response equal to or greater than that of the cancer antigen itself. Administration of exogenous antibodies that can induce potent anti-idiotype responses, induces a constant immune response and acts as an effective vaccine.
현재까지, 항-이디오타입 백신은 항-이디오타입 반응이 전형적인 사람 항-쥐 항체(HAMA) 반응의 일부로 발생되기 때문에 뮤린 항체로 구성된다. Ab1을 구조적으로 파괴하여(Madiyalakan et al., 1995, Hybridoma 14:199-203), 항체에 더 이질성을 부여할 경우에 강력한 항-이디오타입 단계가 관찰되었다. 개체에 항-종양 항체의 이디오타입에 대해 발생된 항-이디오타입 항체를 외생적으로 직접 투여한다(U.S. Patent No. 4,918,14). 투여후에, 개체의 몸에서 항-항체가 만들어지는데, 이는 이들 항-이디오타입 항체를 인지할 뿐만 아니라 고유 종양 에피토프도 인지하여, 상보적인 활성화반응 및 이물질에 대한 다른 면역계 반응에 관계하여, 종양 에피토프를 발현시키는 종양 세포를 공격한다.To date, anti-idiotype vaccines consist of murine antibodies because the anti-idiotype response occurs as part of a typical human anti-mouse antibody (HAMA) response. A strong anti-idiotype step was observed when structurally disrupting Ab1 (Madiyalakan et al., 1995, Hybridoma 14: 199-203) to impart more heterogeneity to the antibody. The subject is exogenously administered directly with an anti-idiotype antibody raised against the idiotype of the anti-tumor antibody (U.S. Patent No. 4,918,14). After administration, anti-antibodies are made in the body of the individual, which not only recognizes these anti-idiotype antibodies, but also the native tumor epitopes, in relation to complementary activation and other immune system responses to foreign bodies. Attack tumor cells expressing epitopes.
그러나, 항-이디오타입 백신이 바람직한 표적이고, 몇가지가 확인되었지만, 이와 같은 항-이디오타입 반응을 반복적으로 들 수 있는 항체를 운반하는 능력이 현재는 불가능하다(foon et al., 1995, J. Clin, Invest. 9:334-342; Madiyalakan et al., 1995, Hybridoma 14:199-203). 이와 같은 항-이디오타입 반응을 만들지 못하는 이유중에 한가지는 외생직인 Ab1이 모든 항체가 가지는 매우 유사한 구조와 매우 유사하여, 자체에 대한 항-이디오타입 반응이 매우 한정되기 때문이다. 따라서, 특정 항체에 대한 항-이디오타입 반응을 신뢰성있게 만들 수 있는 방법이 당분야에서는 필요하다.However, although anti-idiotype vaccines are a desirable target and some have been identified, the ability to carry antibodies that can repeatedly hear such anti-idiotype responses is currently unavailable (foon et al., 1995, J. Clin, Invest. 9: 334-342; Madiyalakan et al., 1995, Hybridoma 14: 199-203). One of the reasons why such anti-idiotype reactions cannot be made is because exogenous Ab1 is very similar to the very similar structure of all antibodies, so the anti-idiotype response to itself is very limited. Thus, there is a need in the art for methods that can reliably anti-idiotype responses to specific antibodies.
3. 발명의 요약3. Summary of the Invention
본 발명은 한 개 이상의 사슬간 이황화결합을 만들 수 있는 항체의 한가지 이상의 가변 부분 시스테인 잔기를 SH기를 가지지 않는 아미노산 잔기로 치환하여, 특정 이황화결합을 만들지 않는 항체가 고유한 가변성 부분에 이황화결합을 가지는 항체보다 더 강력한 항-이디오타입 반응을 유도할 수 있다는 발명자의 발견에 기초한다.The present invention replaces one or more variable moiety cysteine residues of an antibody that can form one or more interchain disulfide bonds with amino acid residues that do not have an SH group, so that the antibody that does not form a particular disulfide bond has disulfide bonds in a unique variable moiety. It is based on the inventors' finding that they can induce more potent anti-idiotype responses than antibodies.
따라서, 본 발명은 변형된 면역글로블린 분자 또는 항체( 및 기능적으로 활성 단편, 이의 유도체 및 이의 유사체) 및 이와 같은 면역글로블린 분자를 포함하는 백신 조성믈을 제공하는데, 이때 면역글로블린의 가변성 부위는 한 가지 이상의 사슬간 또는 사슬내에 이황화결합이 파괴됨으로써 모양으로 인한 구속이 감소된 것이다. 특이, 본 발명은 제2 면역글로블린 분자에 대해 가변성 부분에서 한가지 이상의 아미노산 치환된 부분을 가지는 것을 제외하고는 동일한 가변성 부분으로 구성된 변형된 면역글로블린을 제공하는데, 이때 제 2 면역글로블린 분자는 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는데(예를 들면, 항체-항원 결합을 결정하기 위해 당분야에 공지된 임의 방법으로 결정된 것과 같은 항원에 면역글로블린이 특이적으로 결합하는 등, 이때 비-특이적인 결합은 배제되고, 다른 항원과 교차 반응성 없는), 이때 한가지 이상의 아미노산 치환체는 제2 면역글로블린 분자에서 이황화결합을 만드는 한가지 이상의 시스테인 잔기에 상응하는 한가지 이상의 위치에서 SH기를 가지지 않는 한가지 이상의 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 적절한 구체예에서, 제2면역글로블린 분자는 암 항원에 면역 특이적으로 결합할 수 있고; 또 다른 적절한 구체예에서, 제 2 면역글로블린 분자는 감염성 질환 매체 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체의 항원에 면역 특이적으로 결합할 수 있다.Accordingly, the present invention provides a vaccine composition comprising a modified immunoglobulin molecule or antibody (and functionally active fragments, derivatives and analogs thereof) and such immunoglobulin molecules, wherein the variable region of the immunoglobulin is one The dissociation of disulfide bonds between the chains or in the chains reduces the binding due to shape. Specifically, the present invention provides a modified immunoglobulin consisting of the same variable moiety except having one or more amino acid substituted moieties in the variable moiety for the second immunoglobulin molecule, wherein the second immunoglobulin molecule is immune to the antigen. Non-specific binding, such as specific binding of an immunoglobulin to an antigen such as determined by any method known in the art for determining antibody-antigen binding, such as Excluded, and not cross-reactive with other antigens, wherein one or more amino acid substituents are substituted with one or more amino acid residues that do not have an SH group at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues that make disulfide bonds in the second immunoglobulin molecule . In suitable embodiments, the second immunoglobulin molecule is capable of immunospecifically binding to a cancer antigen; In another suitable embodiment, the second immunoglobulin molecule may immunospecifically bind to an antigen of an infectious disease medium or a cell receptor of the infectious disease medium.
또한 본 발명은 개체에 본 발명의 변형된 면역글로블린을 투여함으로써 개체에서 항-이디오타입 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 변형된 면역글로블린 분자를 투여하여 암을 치료하고 예방하는데 이용되는데, 이때 면역글로블린 분자는 특정 암 환자에 관련하여 발현되는 암 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로블린 분자로부터 가령, 본 발명에 따라 SH기를 포함하지 않은 아미노산 잔기를 사슬내에 이황화결합을 만드는 한가지 이상의 가변성 부분의 시스테인 잔기에 대체하는 등의 방법으로 변형되어 유도된다. 또한, 다른 구체예에서, 본 발명의 변형된 면역글로블린 분자는 감염성 질환을 치료하거나 예방하는데 이용되는데, 예를 들면, 감염성 질환의 원인이 되는 감염성 질환 매체에 때한 세포 수용체 또는 항원에 면역 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로블린 분자에서 유도된 면역글로블린 분자를 투여하면 된다.The present invention also provides a method of inducing an anti-idiotype response in a subject by administering to the subject a modified immunoglobulin of the invention. In certain embodiments, a modified immunoglobulin molecule of the invention is used to treat and prevent cancer, wherein the immunoglobulin molecule is immune capable of immunospecific binding to a cancer antigen expressed in relation to a particular cancer patient. From the globulin molecule, for example, a modified amino acid residue which does not contain an SH group in accordance with the present invention is replaced with a cysteine residue of one or more variable moieties that make disulfide bonds in the chain. Furthermore, in other embodiments, the modified immunoglobulin molecules of the invention are used to treat or prevent an infectious disease, for example immunospecific to cell receptors or antigens in an infectious disease medium that is responsible for the infectious disease. An immunoglobulin molecule derived from an immunoglobulin molecule capable of binding can be administered.
본 발명은 또한 본 발명의 변형된 면역글로블린 분자를 생산하는 방법 및 본 발명의 변형된 면역글로블린 분자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.The invention also provides a method of producing a modified immunoglobulin molecule of the invention and a vaccine composition comprising the modified immunoglobulin molecule of the invention.
관련된 출원Related applications
본 출원은 1997년 11월 14일 출원된 예비 출원 60/065,716 및 1998년 4월 10일 출원된 예비출원 60/081,403의 장점을 청구한다.This application claims the advantages of preliminary application 60 / 065,716 filed November 14, 1997 and pre-application 60 / 081,403 filed April 10, 1998.
1. 발명의 분야1. Field of Invention
본 발명은 변형된 면역글로블린 및 이의 백신 조성물에 관계하는데, 변형된 면역글로블린에서는 사슬내에 이황화결합을 형성하는 한가지 이상의 가변 부분 시스테인 잔기가 SH기를 포함하지 않는 아미노산 잔기로 치환되어, 이황화결합형성하지 않는다. 또한, 본 발명은 특정 질환 특히 암과 감염성 질환을 치료 및 예방하기 위해 본 발명의 백신 조성물을 이용하는 것에 관계한다.The present invention relates to modified immunoglobulins and vaccine compositions thereof, wherein in modified immunoglobulins, one or more variable partial cysteine residues forming disulfide bonds in the chain are replaced with amino acid residues that do not contain an SH group, thereby not disulfide bond formation. . The invention also relates to the use of the vaccine compositions of the invention for the treatment and prevention of certain diseases, in particular cancer and infectious diseases.
도 1은 면역글로블린 분자의 L 및 H쇄의 구조를 나타내는 도면으로 각 쇄는 아미노 말단 부분(H2N-)에 있는 가변 부분 및 카르복시 말단 부분(-COOH)에 있는 항상 부분으로 구성된다.Figure 1 shows the structure of the L and H chains of an immunoglobulin molecule, each chain consisting of a variable portion at the amino terminal portion (H 2 N-) and an always portion at the carboxy terminal portion (-COOH).
도 2는 IgG의 구조를 나타내는데, 각 L 및 H 쇄의 가변 부분(VL,VH)에 4개의 기본 부분(FR1,FR2,FR3, FR4) 및 3개의 상보성 결정 부분(CDR1,CDR2, CDR3)이 있음을 나타낸다. 항상 부분 도메인은 L쇄 항상 부분은 CL으로 나타내고, H쇄 항상 부분의 세 개 도메인은 CH1,CH2,CH3으로 나타낸다. FAb는 항체 단편의 일부분으로 나타내는데, 여기에는 L 및 H쇄의 가변성 부분 도메인과 CL및 CH1도메인을 포함한다. Fc는 CH2및 CH3도메인을 포함하는 항상 부분 단편을 나타낸다.Figure 2 shows the structure of IgG, with four basic portions (FR1, FR2, FR3, FR4) and three complementarity determining portions (CDR1, CDR2, CDR3) in the variable portions (V L, V H ) of each L and H chain. ) Is present. Always partial domains are represented by the L chain always part as C L and the three domains of the H chain always part as CH 1, CH 2, CH 3 . FAb is represented as part of an antibody fragment, which includes the variable partial domains of the L and H chains and the C L and CH 1 domains. Fc always refers to a partial fragment comprising the CH 2 and CH 3 domains.
도 3은 도 2에 나타낸 항체 구조의 도면을 나타내는데, 이는 각 도메인(루프 구조에 각각 VL,VH,CL,CH1,CH2,CH3을 표시하였다)이 이황화결합(검게 나타낸 선)에 의해 구조적으로 한정되어, 3차 구조를 유지하고 있다는 것을 강조한 것이다(Roitt et al., Immunology, Second Edition, London: Gower Medical Publishig, 1989, p 5.3).FIG. 3 shows a diagram of the antibody structure shown in FIG. 2, in which each domain (V L, V H, C L, CH 1, CH 2, CH 3 is indicated in the loop structure, respectively) is disulfide bond (black line) ), Which is structurally defined and maintains a tertiary structure (Roitt et al., Immunology, Second Edition, London: Gower Medical Publishig, 1989, p 5.3).
도 4는 항-이디오타입 계단에서 리간드에 대해 발생된 이디오타입 항체(Ab1)로부터 항-이디오타입 항체(Ab2)와 항-항-이디오타입 항체(Ab3)를 가지는 내무 이미지의 발생 과정을 나타내는 도면이다.4 shows the generation of a home image with an anti-idiotype antibody (Ab2) and an anti-anti-idiotype antibody (Ab3) from an idiotype antibody (Ab1) generated for a ligand in an anti-idiotype step. A diagram illustrating the process.
도 5는 가변 부분 사슬내에 이황화결합을 파괴하기 위해 가변 부분에 있는 시스테인 잔기를 알라닌 잔기로 치환하여 면역글로블린의 가변 부분의 변형을 나타낸 것이다. CH1, CH2, CH3은 항상 부분이다. VH은 H 쇄 가변 부분이 되고, VL은 L쇄 가변 부분을 나타낸다.5 shows modification of the variable portion of an immunoglobulin by replacing cysteine residues in the variable portion with alanine residues to break up disulfide bonds in the variable portion chain. CH1, CH2, CH3 are always part. V H becomes an H chain variable moiety, and V L represents an L chain variable moiety.
도 6A-C(A)에서 (A)는 사람 카파 L쇄 항상 부분 서열을 포함하는 발현 벡터 pMRRO10.1의 구조를 나타낸다. (B)는 사람 IgG1 항상 부분(CH1,CH2,CH3) H쇄 및 힌지 부분 서열을 인코드하는 서열을 포함하는 발현벡터 pGamma1의 구조를 나타낸다. (C)는 L쇄의 카파 항상 도메인 및 H쇄의 항상 도메인 및 힌지 부분을 인코드하는 서열을 포함하는 발현벡터 pNEPuDGV의 구조를 나타낸다. 이들 세가지 벡터는 Bebbington et al., 1991, Methods in Enzymology 2:136-145을 참고한다.(A) in FIGS. 6A-C (A) show the structure of the expression vector pMRRO10.1 comprising the human kappa L chain always partial sequence. (B) shows the structure of the expression vector pGamma1 comprising a sequence encoding the human IgG1 always part (CH1, CH2, CH3) H chain and the hinge part sequence. (C) shows the structure of the expression vector pNEPuDGV comprising a sequence encoding the kappa always domain of the L chain and the always domain and hinge portion of the H chain. For these three vectors, see Bebbington et al., 1991, Methods in Enzymology 2: 136-145.
도 7A 및 B에서 (A)는 콘센선스 L쇄 가변성 부분 ConVL1의 리더 서열을 포함하는 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (B)는 리더 서열을 포함하는 콘센선스 H쇄 가변성 부분 CONVL1에 대한 아미노산 서열 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.(A) in FIGS. 7A and B show the amino acid sequence and the corresponding nucleotide sequence comprising the leader sequence of the consensus L chain variable portion ConVL1. (B) shows the amino acid sequence for the consensus H chain variable portion CONVL1 and the corresponding nucleotide sequence comprising the leader sequence.
도 8A-B에서 (A)는 2CAVLCOL1의 아미노산 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열로써, mAb31.1에서 유도된 항체의 L쇄 가변성 부분 서열로써, 이때 알라닌 잔기는 23 및 88 위치에서 시스테인 잔기 대신에 치환된 것으로 상자로 표시가 되어있다. (B)는 2CAVHCOL1의 아미노산 및 이에 상응하는 뉴클레오티드 서열로써, mAb31.1에서 유도된 항체의 H쇄 가변성 부분 서열로써, 이때 알라닌 잔기는 23 및 88 위치에서 시스테인 잔기 대신에 치환된 것으로 상자로 표시가 되어있다.In Figures 8A-B, (A) is the amino acid and corresponding nucleotide sequence of 2CAVLCOL1, the L chain variable subsequence of the antibody derived from mAb31.1, wherein the alanine residues are substituted for cysteine residues at positions 23 and 88 It is marked with a box. (B) is the amino acid and corresponding nucleotide sequence of 2CAVHCOL1, the H chain variable subsequence of the antibody derived from mAb31.1, wherein the alanine residues are substituted for cysteine residues at positions 23 and 88 and are boxed It is.
도 9A-D에서는 (A)는 2CAVHCOL1을 어셈블리하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는데, 사람 결장 암 항원에 특이적인 H쇄 가변성 부분 유전자이다. (B)는 2CAVHCOL1을 어셈블리하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내는데, 사람 결장 암 항원에 특이적인 L쇄 가변성 부분 유전자이다. (C) ConVL1으로 언급된 L쇄 콘센선스 부분을 어셈블리하는데 이용된 올리고뉴클레오티드에 대한 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. (D)는 ConVL1으로 언급된 H쇄 콘센선스 부분을 어셈블리하는데 이용된 올리고뉴클레오티드에 대한 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.In Figures 9A-D (A) shows the oligonucleotide sequence of the oligonucleotides used to assemble 2CAVHCOL1, which is an H chain variable partial gene specific for human colon cancer antigens. (B) shows the oligonucleotide sequence of the oligonucleotides used to assemble 2CAVHCOL1, which is an L chain variable partial gene specific for human colon cancer antigens. (C) shows the oligonucleotide sequence for the oligonucleotide used to assemble the L chain consensus portion referred to as ConVL1. (D) shows the oligonucleotide sequence for the oligonucleotide used to assemble the H chain consensus portion referred to as ConVL1.
도 10은 사람 결정 암 항원에 특이적인 합성된 변형 항체를 인코드하는 조작된 유전자를 어셈블리하는 전반적인 단계를 나타낸다.10 shows the overall steps of assembling an engineered gene encoding a modified modified antibody specific for a human determinant cancer antigen.
도 11은 mAB31.1에서 유도된 시스테인이 알라닌으로 변형되지 않은 항체와 LS-174 T-세포에서 유도된 항원 분비물에 바이오틴 라벨된 동일한 항체의 결합 경쟁을 검사한 결과를 나타내는 도트 블랏을 나타낸다. 라벨안된 항체의 농도는 nM 라벨안된 항체로 나타낸다. "blk"라인은 항원이 없다.FIG. 11 shows dot blots showing the results of testing binding competition between cysteine derived from mAB31.1 unaltered with alanine and the same antibody biotin-labeled to antigen secretions derived from LS-174 T-cells. The concentration of unlabeled antibody is shown as nM unlabeled antibody. The "blk" line is free of antigen.
도 12A-D에서 (A)는 운반체만으로 백신화된 생쥐의 항-혈청존재하에 LS-174T에 대한 바이오틴-라벨된 항-결장 암종 세포 항체와 변형되지 않은 결장 암종 세포 항체에 결합하는 기준 항체 및 LS-174T 세포에 기준 결합 비율로 나타내는 브래디키닌 수용체 결합 부위를 포함하는 CDR 서열을 가지는 CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 펩티드의 경쟁 결합 검사 결과를 나타낸다. (B)는 운반체 단독으로 백신화된 생쥐의 항-혈청 존재하에 LS-174T 세포에 바이오틴-라벨된 항-결장 암종 세포 항체와 변형안된 2CAVHCOL1 및 2CAVLCOL1의 결장 암 세포 항체에 결합하는 기준 항체의 경쟁 결합 검사의 결과를 나타낸다. (C)는 항원(짙은 삼각형)에 바이오틴-라벨된("b"로 나타냄) 항체(역Y자 모양)의 결합을 나타내는 도면. (D)는 항원(짙은 삼각형)에 바이오틴-라벨된("b"로 나타냄) 항체(역Y자 모양)가 항-이디오타입 항체(화살표)에 의해 결합이 방해되는 것을 나타낸 도면.(A) in Figures 12A-D are reference antibodies that bind to biotin-labeled anti-colon carcinoma cell antibodies and unmodified colon carcinoma cell antibodies to LS-174T in the presence of anti-serum of mice vaccinated with carrier only and Competitive binding test results of CDR1, CDR2, CDR3, CDR4, CDR5, CDR6 peptides having CDR sequences comprising a bradykinin receptor binding site expressed in LS-174T cells at baseline binding ratios are shown. (B) shows competition of biotin-labeled anti-colon carcinoma cell antibodies on LS-174T cells with unmodified 2CAVHCOL1 and 2CAVLCOL1 colon cancer cell antibodies in the presence of anti-serum of mice vaccinated with carrier alone. The results of the binding test are shown. (C) is a diagram showing binding of a biotin-labeled (represented by "b") antibody (inverted Y-shape) to an antigen (dark triangle). (D) shows that biotin-labeled (represented by "b") antibody (inverted Y-shaped) to antigen (dark triangle) is prevented from binding by anti-idiotype antibody (arrow).
도 13은 HNFG1에 대한 결합 서열을 포함하는 CDR을 가지는 L쇄 가변성 부분의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.13 shows the nucleotide sequence of an L chain variable moiety having a CDR comprising a binding sequence for HNFG1.
본 발명은 변형안된 면역글로블린에 비하여, 강력한 면역 반응 특히, 강력한 항-이디오타입 반응을 유도할 수 있는 변형된 면역글로블린(특히, 항체, 기능적으로 활성 단편, 유도체, 이의 유사체)을 제공한다. 특히, 본 발명의 변형된 면역글로블린은 변형되지 않았을 경우에, 항원에 면역 특이적으로 결합하고, 면역글로블린 분자의 한가지 가변 부분에 모양으로 인한 구속이 감소되도록 변형되는데, 바람직하게는 면역글로블린의 가변성 부분에 있는 사슬내 이황화결합을 형성하는데 관여하는 시스테인중 적어도 한 개가 SH기를 가지지 않는 아미노산 잔기로 치환되어, 이황화결합을 만들지 못함으로써, 면역글로블린의 가변성 부분의 적어도 한 부분에서 모양으로 인한 구속을 감소시키는 것이다(도 5). 본 발명의 적절한 구체예에서, 변형된 면역글로블린 분자는 암 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로블린 분자에서 유도되고, 또 다른 적절한 구체예에서, 변형된 면역글로블린 분자는 감염성 질환 매체 또는 감염성 질환 문질에 세포 수용체에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로블린에서 유도된다.The present invention provides modified immunoglobulins (particularly antibodies, functionally active fragments, derivatives, analogs thereof) that can induce potent immune responses, in particular potent anti-idiotype responses, compared to unmodified immunoglobulins. In particular, the modified immunoglobulins of the invention, when unmodified, are modified to immunospecifically bind to the antigen and to reduce shape-induced binding to one variable portion of the immunoglobulin molecule, preferably the variability of the immunoglobulin At least one of the cysteines involved in forming intrachain disulfide bonds in the moiety is substituted with amino acid residues that do not have an SH group, resulting in no disulfide bonds, thereby reducing shape-restriction in at least one part of the variable moiety of the immunoglobulin. (FIG. 5). In a suitable embodiment of the invention, the modified immunoglobulin molecule is derived from an immunoglobulin molecule capable of immunospecifically binding to a cancer antigen, and in another suitable embodiment, the modified immunoglobulin molecule is an infectious disease medium or infectious It is derived from immunoglobulins capable of immunospecific binding to cellular receptors on disease portals.
본 발명은 또한 발명의 변형된 면역글로블린 분자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 발명의 변형된 면역글로블린 분자를 개체에 투여하여 항-이디오타입 반응을 생성시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a vaccine composition comprising the modified immunoglobulin molecule of the invention. The invention also provides a method of generating an anti-idiotype response by administering a modified immunoglobulin molecule of the invention to a subject.
특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 면역글로블린 분자를 투여하여 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데, 변형안된 상태에서는 특정 암과 연합되어 발현되는 암 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 변형된 면역글로블린을 투여하면, 개체에서 항-이디오타입 반응을 유도하여, 개체에서 암 항원에 특이적인 항체를 생산하도록 한다. 또 다른 특정 구체예에서, 변형된 면역글로블린은 변형안된 상태에서, 감염성 질환 매체 또는 감염성 질환 매체에 대한 세포 수용체의 항원에 결합할 수 있다. 이와 같은 면역글로블린을 이용하여 감염성 질환 매체로 인한 감염성 질환을 치료하거나 예방한다.In certain embodiments, the present invention provides a method of treating or preventing cancer by administering a modified immunoglobulin molecule of the invention, wherein in an unmodified state it is able to specifically bind to a cancer antigen that is expressed in association with a particular cancer. have. Administration of the modified immunoglobulin induces an anti-idiotype response in the subject, thereby producing an antibody specific for the cancer antigen in the subject. In another specific embodiment, the modified immunoglobulin may bind to an antigen of a cellular receptor to an infectious disease medium or infectious disease medium in an unmodified state. Such immunoglobulins are used to treat or prevent infectious diseases caused by an infectious disease medium.
설명을 명확하게 하기 위해 다음에는 본 발명의 여러 소단락으로 설명하나 본 발명을 이에 국한시키고자 함은 아니다.In the following description, for the sake of clarity, the present invention is described in several subparagraphs, but is not intended to limit the present invention.
5.1. 변형된 항체5.1. Modified antibody
본 발명의 변형된 면역글로블린 특히 항체는 적어도 변형안된 항태에서 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로블린으로써, 항-이디오타입 반응을 유도하는 이들의 능력을 강화시키는 방향으로 변형시킨다. 이와 같은 면역글로블린을 변형시켜, 면역글로블린의 가변성 부분에 있는 모양으로 인한 구속을 감소시키는데 예를 들면, 사슬간 또는 사슬내에 이황화결합을 제거하거나 감소시키거나 화학적으로 변형시키거나 당분야에 공지된 임의 방법을 이용한다. 특이적으로는 본 발명은 제 2 면역글로블린의 가변성 부분에 한가지 이상의 아미노산 치환을 제외하고는 이와 동일한 가변성 부분으로 구성된 제 1 면역글로블린 분자를 제공하는데, 제 2 면역글로블린 분자는 항원에 면역 특이적으로 결합할 수 있고, 아미노산 치환은 제 2 면역글로블린 분자에 이황화결합을 형성하는 한가지 이상의 시스테인 잔지에 상응하는 위치에서 SH기를 가지지 않은 한가지 이상의 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 변형된 면역글로블린을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.Modified immunoglobulins, particularly antibodies, of the invention are immunoglobulins that specifically bind antigens, at least in unmodified conditions, and are modified in a way that enhances their ability to induce anti-idiotype responses. Such immunoglobulins can be modified to reduce constraints due to the shape in the variable portion of the immunoglobulin, for example to remove or reduce disulfide bonds or chemically modify or to disulfide bonds within or within chains. Use the method. Specifically, the present invention provides a first immunoglobulin molecule consisting of the same variable moiety except for one or more amino acid substitutions in the variable part of the second immunoglobulin, wherein the second immunoglobulin molecule is immunospecific to the antigen. Capable, amino acid substitutions are those that are substituted with one or more amino acid residues having no SH group at positions corresponding to one or more cysteine residues that form disulfide bonds in the second immunoglobulin molecule. The invention also provides a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a modified immunoglobulin of the invention.
당분야에 공지의 방법을 이용하여 특정 항체의 가변성 부분에서 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들면, 사슬내 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기는 항체 종류간에 그리고 종간에 상당히 보존되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이황화결합을 형성하는데 참여하는 시스테인 잔기는 이황화결합을 하는 잔기로 알려진 다른 항체 분가와 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다.Methods known in the art can be used to identify cysteine residues that can form disulfide bonds in the variable portion of a particular antibody. For example, cysteine residues that form intrachain disulfide bonds are known to be highly conserved between antibody types and between species. Thus, cysteine residues that participate in forming disulfide bonds can be identified by comparing sequences with other antibody moieties known as residues that disulfide bonds.
표 1에서는 많은 수의 항체 분자에서 이황화결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기의 위치를 제공한다(Kabat et al, 1991, sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland)Table 1 provides the location of cysteine residues that can form disulfide bonds in a large number of antibody molecules (Kabat et al, 1991, sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, Bethesda). , Maryland)
표 1Table 1
()안에 있는 위치를 나타내는 숫자는 이 위치에서 서열이 확인되지 않은 것으로 단지 공지의 서열과 비교하여 추정한 잔기이다.Numbers indicating positions in () are residues estimated by comparison with known sequences for which no sequence was identified at this position.
주목할 만한 것으로, 표 1에 나열된 모든 항체 분자에서, 사슬내 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기는 L쇄 가변 도메인의 22 및 88 위치와 H쇄 가변 도메인의 22 및 92위치가 된다. 위치를 나타내는 숫자는 Kabat(1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland)에서 설명하는 콘센선스 서열에 있는 잔기에 항응하는 잔기를 말하거나 또는 도 7A 및 B에서 설명한 H 및 L쇄 가변 부분 서열에 나타낸 것과 같은 잔기를 말한다("상응하는"의미는 도 7A 또는 B에서 나타낸 것과 같은 H 및 L쇄 가변성 부분의 서열 또는 콘센선스 서열의 특정 항체 서열과 나란하게 배열하여 결정된 이란 의미를 가진다).Notably, in all antibody molecules listed in Table 1, the cysteine residues that form intrachain disulfide bonds are at positions 22 and 88 of the L chain variable domain and at positions 22 and 92 of the H chain variable domain. The number indicating the position refers to a residue that corresponds to a residue in the consensus sequence described by Kabat (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, US Department of Health and Human Services, Bethesda, Maryland) or FIG. 7A. And residues such as those shown in the H and L chain variable region sequences described in B ("corresponding" means those of the H and L chain variable regions as shown in FIG. 7A or B or specific antibody sequences of the consensus sequence). Means arranged by side by side).
따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 변형된 면역글로블린 분자는 L쇄의 23 또는 88위치에 있는 잔기가 SH기를 가지지 않은 아미노산 잔기로 치환되었거나 H쇄의 22 또는 92 위치에 있는 잔기가 SH기를 가지지 않는 아미노산 잔기로 치환된 항체를 말한다.Thus, in one embodiment of the invention, the modified immunoglobulin molecule is substituted with an amino acid residue whose residue at position 23 or 88 of the L chain has no SH group or the residue at position 22 or 92 of the H chain has SH group. Refers to an antibody substituted with an amino acid residue.
본 발명의 변형된 면역글로블린에서, 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기에 대체하는 아미노산은 SH기를 가지지 않는 임의 아미노산 잔기가 되는데 예를 들면, 알라닌, 아르기닌, 아스파라진, 아스파라테이트(또는 아스파라틱산), 글루타민, 글루타메이트(또는 글루타민산), 글리신, 히스티딘, 이소루이신, 루이신, 리신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 또는 발린이 된다. 특정 구체예에서, 시스테인 잔기는 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라진, 글루타민 잔기로 치환되는데, 가장 바람직하게는 알라닌 잔기로 치환된다.In the modified immunoglobulins of the present invention, amino acids replacing cysteine residues that form disulfide bonds are any amino acid residues that do not have an SH group, for example, alanine, arginine, asparagine, aspartate (or aspartic acid). , Glutamine, glutamate (or glutamic acid), glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine or valine. In certain embodiments, cysteine residues are substituted with glycine, serine, threonine, tyrosine, asparagine, glutamine residues, most preferably with alanine residues.
추가로, 이황화결합을 형성하는 시스테인는 SH기를 포함하지 않는 가령, 일상적인 단백질 합성 방법에 의해 만들어진 비-전통적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체에 의해 치환될 수 있는데, 이에 국한시키지는 않는다. 비-전통적인 아미노산에는 통상적인 아미노산의 D-이성체, α-아미노산 이소부틸산, 4-아미노부틸산, Abu, r-Abu, 2-아미노부틸산, γ-Abu, ε-Ahx, 아미노 헥사논산, Aib, 2-아미노 이소부틸산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루이산, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시투룰린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플로오르-아미노산, β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산과 같은 디자이너 아미노산, 일반적인 아미노산 유도체등이 포함되나, 이에 국한시키지는 않는다. 또한, 아미노산은 D 또는 L형이 될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이황화결합을 형성하는 잔기를 제거할 수도 있다.In addition, cysteines that form disulfide bonds may be substituted by, but not limited to, non-traditional amino acids or chemical amino acid analogues that do not include SH groups, such as made by routine protein synthesis methods. Non-traditional amino acids include D-isomers of conventional amino acids, α-amino acid isobutyl acid, 4-aminobutyl acid, Abu, r-Abu, 2-aminobutyl acid, γ-Abu, ε-Ahx, amino hexanoic acid, Aib, 2-amino isobutyl acid, 3-amino propionic acid, ornithine, norruic acid, norvaline, hydroxyproline, sarcosine, cyturulin, t-butylglycine, t-butylalanine, phenylglycine, cyclohexylalanine , but are not limited to, β-alanine, fluoro-amino acids, β-methyl amino acids, Cα-methyl amino acids, designer amino acids such as Nα-methyl amino acids, common amino acid derivatives, and the like. In addition, the amino acids may be of type D or L. In another embodiment, residues that form disulfide bonds may be removed.
특정 구체예에서, 이황화결합을 형성하는 잔기 치환은 H쇄 가변성 부분 또는 L쇄 가변성 부분에서 이루어지거나 또는 H 및 L쇄 가변성 부분 모두에서 이루어질 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 특정 이황화결합을 형성하는 잔기중에 하나는 치환되거나(또는 결손되거나) 특정 이황화결합을 형성하는 잔기 모두 치환(결손)된다.In certain embodiments, residue substitutions that form disulfide bonds can be in the H chain variable moiety or the L chain variable moiety or in both the H and L chain variable moiety. In other specific embodiments, one of the residues that form a particular disulfide bond is substituted (or deleted) or all of the residues that form a particular disulfide bond are substituted (deleted).
또 다른 구체예에서, 본 발명은 가변성 부분에 이황화결합을 형성하는 제 2 면역글로블린 분자에 관련하여, SH 기를 포함하지 않는 아미노산으로 치환되고, 추가로, 한가지 이상의 다른 아미노산 치환체(가령, 이황화결합을 형성하는 잔기가 SH기를 포함하지 않는 잔기로 치환되지 않은)을 가질 수 있다.In another embodiment, the invention relates to a second immunoglobulin molecule that forms a disulfide bond in the variable moiety, wherein the invention is substituted with an amino acid that does not include an SH group and further comprises one or more other amino acid substituents (eg, disulfide bonds). Residues to be formed are not substituted with residues that do not contain an SH group).
특히, 본 발명은 제 2 면역글로블린 분자에 대해 가변성 부분에 한가지 이상의 아미노산 치환체를 가지는 것을 제외하고는 제2면역글로블린 분자와 동일한 것으로 구성된 가변성 부분을 가지는 제 1 면역글로블린 분자를 제공하는데, 이때 제 2 면역글로블린 분자는 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있고, 이때 한가지 이상의 아미노산 치환체중 적어도 하나는 제 2 면역글로블린 분자에서 이황화결합을 형성하는 한가지 이상의 시스테인 잔기에 상응하는 위치에서 SH기를 가지지 않는 아미노산 잔기로 치환된 것이 된다.In particular, the present invention provides a first immunoglobulin molecule having a variable moiety consisting of the same as the second immunoglobulin molecule except for having at least one amino acid substituent in the variable moiety for the second immunoglobulin molecule, wherein the second An immunoglobulin molecule may immunospecifically bind to an antigen, wherein at least one of the one or more amino acid substituents does not have an SH group at a position corresponding to one or more cysteine residues that form disulfide bonds in the second immunoglobulin molecule Replaced with.
바람직한 구체예에서, 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기가 SH기를 가지지 않는 잔기로 치환되지 않은 아미노산 치환체는 안정적인 변화가 아니다. 안정적인 변화는 항체 분자의 안정성을 증가시키는 아미노산 변화로 정의한다. 이와 같은 아미노산 변화는 특정 항체 분자에 특정 위치에 통상적이지 않는 아미노산(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda Maryland,에서 제공된 것과 같은 다수의 항체 분자에 대한 콘센선스 서열로 정의된)이 특정 위치에서 흔한 잔기로 치환되는 치환되는 변화가 된다(PCT Publication WO96/02574, data February 1, 1996 by Steipe et al.).In a preferred embodiment, amino acid substituents in which the cysteine residues forming disulfide bonds are not substituted with residues having no SH group are not stable changes. Stable changes are defined as amino acid changes that increase the stability of the antibody molecule. Such amino acid changes are amino acids that are not customary at specific positions for a particular antibody molecule (such as those provided by Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Department of Health and Human Services, Bethesda Maryland, Is defined as the consensus sequence for a number of antibody molecules, which is replaced by substitution with common residues at specific positions (PCT Publication WO96 / 02574, data February 1, 1996 by Steipe et al.).
이와 같은 다른 아미노산 치환은 변형된 면역글로블린이 항-항-이디오타입 항체 형성을 유도하도록 변형시키지 않는 임의 아미노산 치환으로 이는 5.5에서 설명하는 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 다른 아미노산 치환체에는 기능적으로 등가의 아미노산 잔기 치환체를 포함한다. 예를 들면, 한 개 이상의 아미노산 잔기는 기능적으로 등가로 작용하는 유사한 극성을 가지는 또다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 서열내에 아미노산 치환은 아미노산이 속하는 류별의 다른 구성원에서 선택된다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산에는 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌등이 포함된다. 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민등이 포함된다. 양전하(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신, 히스티딘이 포함된다. 음전하(산성) 아미노산에는 아스파라틱산, 글루타민산이 포함된다.Such other amino acid substitutions are any amino acid substitutions that do not modify the modified immunoglobulin to induce anti-anti-idiotype antibody formation, which can be determined by the method described in 5.5. For example, such other amino acid substituents include functionally equivalent amino acid residue substituents. For example, one or more amino acid residues are substituted with another amino acid residue having a similar polarity that is functionally equivalent. Amino acid substitutions in the sequence are selected from other members of the class to which the amino acid belongs. For example, nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, methionine, and the like. Polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, glutamine and the like. Positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine. Negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
본 발명의 변형된 항체는 면역특이적으로 임의 항원에 결합할 수 있는 항체에서 유도될 수 있다. 특정 구체예에서, 변형된 항체는 암 항원 좀더 적절하게는 종양 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체에서 유도된다. 특정 구체예에서, 변형된 항체는 다형성 상피 점소 항원, 사람 결장 암종-연합된 단백질 항원, 사람 결장 암종-연합된 탄수화물 항원, 사람 유지방 구에 결합할 수 있는 항체 또는 유방암, 난소암, 자궁암,방광암, 폐암, 피부암, 결장암, 췌장암, 위장관암, B 임파세포암 또는 T 임파세포암의 항원 또는 단락 5.2.1에서 설명하는 특정 항원을 발현하는 임의 다른 암의 항원에 결합할 수 있는 항체에서 유도된다. 적절한 구체예에서, 변형된 항체는 MAb31.1(the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2201의 기탁번호 No. 12314), Mab 33.28(기탁번호 12315), Mab HMFG-1(see PCT Publication WO90/05142 and PCT Publication WO92/04380)에서 유도될 수 있다.Modified antibodies of the invention can be derived from antibodies that are capable of immunospecifically binding to any antigen. In certain embodiments, the modified antibody is derived from an antibody capable of immunospecifically binding to a cancer antigen, more suitably a tumor antigen. In certain embodiments, the modified antibody is a polymorphic epithelial mucosal antigen, a human colon carcinoma-associated protein antigen, a human colon carcinoma-associated carbohydrate antigen, an antibody capable of binding to human fat or breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, bladder cancer Is derived from an antibody capable of binding to an antigen of lung cancer, skin cancer, colon cancer, pancreatic cancer, gastrointestinal cancer, B lymphocyte cancer or T lymphocyte cancer or an antigen of any other cancer expressing a specific antigen described in paragraph 5.2.1. . In a suitable embodiment, the modified antibody comprises MAb31.1 (Accession No. 12314 of the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2201), Mab 33.28 (Accession No. 12315), Mab HMFG-1 ( see PCT Publication WO90 / 05142 and PCT Publication WO92 / 04380).
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 감염성 질병 매체의 항원 또는 감염성 질병 매체의 세포 수용체에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체에서 유도된다. 적절한 구체예에서, 감염성 질환의 매체에 대한 항원은 박테리아성 항원, 바이러스 항원 또는 기생충 항원 또는 5.2.2에서 설명하는 감염성 질병 매체등의 임의 다른 항원이 된다.In another specific embodiment, the antibody is capable of immunospecifically binding to an antigen of an infectious disease medium or a cellular receptor of an infectious disease medium. In a suitable embodiment, the antigen for the medium of an infectious disease is any other antigen, such as a bacterial antigen, a viral antigen or a parasite antigen or an infectious disease medium described in 5.2.2.
본 발명의 면역글로블린 분자는 면역글로블린의 임의 종류, 분류 또는 아류가 될 수 있다. 적절한 구체예에서, 면역글로블린 분자는 항체 분자 점도 적절하게는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA에서 선택된 타입으로, 가장 적절하게는 IgG 분자가 된다. 또는 면역글로블린 분자는 T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체, 세포 표현 흡착 분자 가령, 공-수용체 CD4,CD8, CD19 또는 MHC 분자의 비변성-도메인이 된다.The immunoglobulin molecules of the invention can be any kind, class or subclass of immunoglobulins. In suitable embodiments, the immunoglobulin molecule is of a type selected from IgG molecule IgE, suitably IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, most suitably an IgG molecule. Or the immunoglobulin molecule becomes an unmodified-domain of T cell receptor or B cell receptor, cell expressing adsorption molecule such as co-receptor CD4, CD8, CD19 or MHC molecule.
변형된 면역글로블린은 임의 자연발생 항체 적절하게는 단클론 항체에서 유도되고, 또는 합성 또는 조작된 항체에서 유도될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서 변형된 면역글로블린 분자는 결합쌍의 구성원에 대한 결합 부위 또는 항원의 일부분에 대한 결합 부위가 가변부분에 있는 CDRs중 한 부분 또는 모든 부분에 합입된 항체로부터 유도될 수 있다(이는 공동계류중인 미국 특허 출원 "Immunoglobulin Molecules Having A Synthetic Variable Region And Modified Specificity", and Burch, Filed November 13, 1998(attorney docket no. 6750-016)에서 볼 수 있다).Modified immunoglobulins can be derived from any naturally occurring antibody, suitably monoclonal antibodies, or from synthetic or engineered antibodies. In one aspect of the invention the modified immunoglobulin molecule can be derived from an antibody incorporated in one or all of the CDRs in which the binding site for a member of the binding pair or binding site for a portion of the antigen is in the variable region ( This can be seen in co-pending US patent application "Immunoglobulin Molecules Having A Synthetic Variable Region And Modified Specificity", and Burch, Filed November 13, 1998 (attorney docket no. 6750-016).
특히, 합성 항체는 결합쌍의 제 1 멤버에 면역특이적으로 결합할 수 있는 항체로, 결합쌍에서 항체의 CDRs중 적어도 한 개에는 결합쌍의 제 1 멤버의 결합 부위를 포함하고, 이때 결합부위는 결합쌍의 또다른 멤버의 아미노산 서열에서 유도된다. 본 발명의 한 측면에서, 결합 부위의 아미노산 서열은 CDR내에 자연상태에서는 없는 것이다. 또한, CDR의 적어도 한 개는 항원의 일부분 특히 에피토프를 포함한다.In particular, a synthetic antibody is an antibody capable of immunospecifically binding to a first member of a binding pair, wherein at least one of the CDRs of the antibody in the binding pair comprises a binding site of the first member of the binding pair, wherein the binding site Is derived from the amino acid sequence of another member of the binding pair. In one aspect of the invention, the amino acid sequence of the binding site is not in nature in the CDRs. In addition, at least one of the CDRs comprises a portion of the antigen, in particular an epitope.
결합 부위의 아미노산 서열은 당분야에 공지의 임의 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에서, 결합쌍의 멤버의 서열은 결합쌍의 다른 멤버의 결합에 직접적으로 관련이 된다는 것이 이미 확인되었다. 이와 같은 경우에, 이러한 서열을 이용하여, 결합쌍의 다른 멤버를 특이적으로 인지하는 합성 항체의 CDR을 작제할 수 있다. 결합쌍의 다른 멤버에 대해 결합쌍의 한 멤버에 결합 부위에 대한 아미노산 서열이 알려지지 않은 경우에, 당분야에 임의 방법을 이용하여 가령, 분자 모델링 방법 또는 경험적인 방법 가령, 다른 멤버에 결합하는 멤버의 부분(가령, 펩티드)를 검사하거나 또는 멤버에 돌연변이를 만들고, 돌연변이가 결합을 방해하는 지를 측정하는 등으로 서열을 결정할 수 있다.The amino acid sequence of the binding site can be confirmed by any method known in the art. For example, in some cases, it has already been identified that the sequence of a member of a binding pair is directly related to the binding of other members of the binding pair. In such cases, such sequences can be used to construct CDRs of synthetic antibodies that specifically recognize other members of a binding pair. If the amino acid sequence for the binding site is not known to one member of the binding pair for another member of the binding pair, any method known in the art can be used, for example, by molecular modeling or empirical methods, such as a member The sequence can be determined by examining a portion of (e.g., a peptide) or by making a mutation in a member, determining whether the mutation interferes with binding, and the like.
결합쌍은 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질등의 서로 상호작용할 수 있는 임의 두 개 분자가 되는데, 적절하게는 결합부위가 유도되는 결합짝은 단백질 분자이다. 적절한 구체예에서, 변형된 면역글로블린에는 암 항원, 감염성 질환 항원, 병인물질에 대한 세포 수용체, 수용체-리간드 결합쌍에 참여하는 수용체 또는 리간드에 대한 세포 수용체에 대한 결합 서열을 포함한다.The binding pair may be any two molecules that can interact with each other, such as proteins, nucleic acids, carbohydrates, lipids, and the like. In suitable embodiments, the modified immunoglobulin comprises a binding sequence for a cancer antigen, an infectious disease antigen, a cell receptor for a pathogen, a cell receptor for a ligand or a receptor participating in a receptor-ligand binding pair.
특정 구체예에서, 결합쌍은 단백질-단백질 상호작용 쌍으로 동질성 상호작용(가령, 동일한 두 개 단백질간에 상호작용) 또는 이형성 상호작용(가령 두 개의 다른 단백질사이에 상호작용)이 된다.In certain embodiments, the binding pair is a homogeneous interaction (eg, interaction between two identical proteins) or heterologous interaction (eg, interaction between two different proteins) in a protein-protein interaction pair.
특정 구체예에서, 제1 멤버는 리간드-수용체 결합쌍의 멤버로써, 적절하게는 수용체-리간드 결합쌍의 멤버로 이때 리간드는 수용체에 결합하여 세포내 시그날발생과 같은 생리학적 반응을 유도한다. 예를 들면, 리간드 또는 수용체는 호르몬, 오토코이드, 생장인자, 사이토킨, 신경전달물질 또는 호르몬, 오토코이드, 생장인자, 사이토킨, 신경전달물질의 수용체 또는 시그날 전달에 관계하는 임의 수용체 또는 리간드가 될 수 있으나 이에 국한시키지는 않는다(signal transduction pathways, see, e.g., Campbell, 1997, J. Pediat, 131:S42-S44; Hamilton, 1997, J. Leukoc. Biol. 62:145-155; Soede-Bobok & Touw, 1997, J. Mol. Med. 75:47-477; Heldin, 1995, Cell 80:213-223; Kishimoto et al., 1994, Cell 76:253-262; Miyajima et al., 1992, Annu, Rev, Immunol. 10:295-331; and Cantley et al, 1991, Cell 64:281-302). 특정 구체예에서, 결합쌍의 한가지 멤버는 콜레사이토키닌, 갈라닌, IL-1,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-11, 케모킨, 렙틴, 프로테아제, 신경펩티드 Y, 뉴로키닌-1, 뉴로키닌-2, 뉴로키닌-3, 봄베신, 카스트린, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 엔도테린, 메탈토닌, 스마토스타틴, 혈관활성 내장 펩티드, 상피 생장 인자, 종양 괴사 인자, 도파민, 엔도테린등과 같은 리간드 또는 이들 이간드의 임의 수용체가 되나 이에 국한시키지는 않는다. 한 구체예에서, 결합쌍의 한 멤버에는 오피오이드 수용체, 포도당 운반물질, 글루타메이트 수용체, 오르파닌 수용체, 이리트로포에틴 수용체, 인슐린 수용체, 티로신 카이나제(TK)-수용체, KIT 간 세포 인자 수용체, 신경 생장 인자 수용체, 인슐린-유사 생장 인자 수용체, 과립세포-콜로니 자극 인자 수용체, 소마토트로핀 수용체, 신경교-유도 신경성 인자 수용체 또는 gp39 수용체, G-단백질 수용체 또는 β2-아드네네린 수용체와 같은 수용체 또는 이들 수용체에 결합하는 임의 리간드등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 결합쌍의 멤버중에 하나는 리간드 게이트 이온 채널 가령, 칼슘 체널, 나트륨 체널, 칼륨 체널등이 되나 이에 한정시키지는 않는다. 특정 구체예에서, 본 발명은 수용체에 면역특이적으로 결합하는 변형된 면역글로블린을 제공하는데, 이는 수용체에 결합하는 리간드의 길항물질로써 예를 들면, 엔도르핀, 엔케팔린, 노시세핀의 길항물질이 되나 이에 국한시키지는 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명은 수용체에 면역특이적으로 결합하는 변형된 항체로 수용체에 길항물질인데, 예를 들면, 엔도르핀, 엔케팔린, 노시세핀의 길항물질이 되나 이에 국한시키지는 않는다. 적절한 구체예에서, 변형된 면역글로블린은 피브로넥틴 수용체에는 결합하지 않는다. 또 다른 적절한 구체예에서는 결합 서열은 Arg-Gly-Asp이 아니고, 다중 결합 서열로 아니고, 바람직하게는 결합 서열은 Arg-Gly-Asp이 아니다.In certain embodiments, the first member is a member of a ligand-receptor binding pair, suitably a member of a receptor-ligand binding pair, where the ligand binds to the receptor and induces a physiological response such as intracellular signaling. For example, a ligand or receptor may be a hormone, autocoid, growth factor, cytokine, neurotransmitter or any receptor or ligand that is involved in the receptor or signal delivery of a hormone, autocoid, growth factor, cytokine, neurotransmitter. Signal transduction pathways, see, eg, Campbell, 1997, J. Pediat, 131: S42-S44; Hamilton, 1997, J. Leukoc. Biol. 62: 145-155; Soede-Bobok & Touw, 1997, J. Mol. Med. 75: 47-477; Heldin, 1995, Cell 80: 213-223; Kishimoto et al., 1994, Cell 76: 253-262; Miyajima et al., 1992, Annu, Rev, Immunol. 10: 295-331; and Cantley et al, 1991, Cell 64: 281-302). In certain embodiments, one member of the binding pair is cholecytokine, galanine, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, chemokine, leptin, protease, Neuropeptide Y, Neurokinin-1, Neurokinin-2, Neurokinin-3, Bombesin, Castrin, Corticotropin-releasing hormone, Endotherin, Metaltonin, Smatostatin, Vasoactive visceral peptide, Epithelium Ligands such as growth factors, tumor necrosis factor, dopamine, endothelin, or the like, or any receptor of these igands. In one embodiment, one member of the binding pair comprises an opioid receptor, a glucose transporter, a glutamate receptor, an orphanin receptor, an erythropoietin receptor, an insulin receptor, a tyrosine kinase (TK) -receptor, a KIT hepatocellular factor receptor, a nerve Receptors such as growth factor receptors, insulin-like growth factor receptors, granulocyte-colony stimulating factor receptors, somatotropin receptors, glial-induced neuronal factor receptors or gp39 receptors, G-protein receptors or β2-adrenergic receptors or Arbitrary ligands that bind to these receptors, and the like. In another embodiment, one of the members of the binding pair is, but is not limited to, ligand gate ion channels such as calcium channels, sodium channels, potassium channels, and the like. In certain embodiments, the present invention provides a modified immunoglobulin that immunospecifically binds to a receptor, which is an antagonist of a ligand that binds to the receptor, for example, an antagonist of endorphin, enkephalin, or nocisepin. It is not limited to this. In another embodiment, the present invention is a modified antibody that immunospecifically binds to a receptor, which is an antagonist of the receptor, for example, but is not limited to, antagonists of endorphins, enkephalins, noscipine. In suitable embodiments, the modified immunoglobulin does not bind to the fibronectin receptor. In another suitable embodiment the binding sequence is not Arg-Gly-Asp, not a multiple binding sequence, preferably the binding sequence is not Arg-Gly-Asp.
다른 특정 구체예에서, 변형된 면역글로블린은 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 CDR을 가진다. 적절한 측면에서, 변형된 면역글로블린은 특이적인 DNA 서열에는 결합되지 않는데, 특히 전사 결합 인지에 결합하지 않는다.In another specific embodiment, the modified immunoglobulin has a CDR that includes a binding site for a transcription factor. In a suitable aspect, the modified immunoglobulin does not bind to specific DNA sequences, in particular it does not bind to transcriptional binding recognition.
적절한 구체예에서는 변형된 면역글로블린에는 암 항원 또는 종양 항원에 결합 부위의 아미노산 서열을 포함하는 적어도 한 개의 CDR을 가지고(5.2.1의 설명 참고), 좀더 적절하게는 항원은 사람 결장 암종-관련된 항원 또는 상피 점막 항원이 된다. 또 다른 구체예에서, 변형된 면역글로블린의 적어도 한 개의 CDR에는 사람 유지방 구 수용체의 결합 부위에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 변형된 면역글로블린에는 유방, 난소, 자궁, 전립선, 방광, 폐, 피부, 췌장, 결장, 위장관, B-임파세포, T-임파세포의 종양 항원의 결합 부위의 아미노산 서열을 포함한다.In a suitable embodiment the modified immunoglobulin has at least one CDR comprising the amino acid sequence of a binding site to a cancer antigen or a tumor antigen (see description in 5.2.1), more preferably the antigen is a human colon carcinoma-associated antigen. Or epithelial mucosal antigen. In another embodiment, at least one CDR of the modified immunoglobulin comprises an amino acid sequence for the binding site of a human milk fat receptor. In another embodiment, the modified immunoglobulin comprises the amino acid sequence of the binding site of the tumor antigen of the breast, ovary, uterus, prostate, bladder, lung, skin, pancreas, colon, gastrointestinal tract, B-lymphocytes, T-lymphocytes. Include.
본 발명의 또 다른 적절한 구체예에서, 변형된 항체의 적어도 한 개의 CDR에는 감염성 질환 매체의 항원에 대한 결합 부위(5.2.2. 단락의 설명 참고) 또는 감염성 질환 매체의 세포 수용체의 결합 부위, 적절하게는 결합 부위가 플라스모디늄(Plasmodium) 항원의 아미노산 서열이 아니고, 또는 Asn-Ala-Asn-Pro 또는 Asn-Val-Asp-Pro이 아닌 결합 부위의 아미노산 서열을 가진다. 추가 구체예에서, 변형된 항체는 세균성 또는 바이러스성 효소에 대한 결합 부위를 포함하는 CDR을 가진다.In another suitable embodiment of the present invention, at least one CDR of the modified antibody has a binding site for the antigen of the infectious disease medium (see description in paragraph 5.2.2) or a binding site of the cell receptor of the infectious disease medium, appropriately. Preferably the binding site is not the amino acid sequence of the Plasmodium antigen or has the amino acid sequence of the binding site which is not Asn-Ala-Asn-Pro or Asn-Val-Asp-Pro. In further embodiments, the modified antibody has a CDR comprising a binding site for a bacterial or viral enzyme.
합성 항체는 기존에 존재하는 항체 또는 자연 발생적인 항체의 서열에 기초하여 만들거나(가령, 이러한 항체의 CDR에 결합 부위 서열을 삽입함) 또는 공지의 항체 콘센선스 서열에서 합성할 수 있는데, 이는 도 7A 및 B에서 L 및 H 항체 콘센선스 서열에서 합성하거나 또는 임의 다른 항체 콘센선스 또는 생식세포계열 서열로부터 합성할 수 있다(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thedition, NIH Publication No. 91-3242, pp 2147-2172).Synthetic antibodies can be made based on the sequences of existing or naturally occurring antibodies (eg, by inserting binding site sequences into the CDRs of such antibodies) or synthesized from known antibody consensus sequences, which are illustrated in FIG. It can be synthesized from L and H antibody consensus sequences at 7A and B or from any other antibody consensus or germline sequences (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th edition, NIH). Publication No. 91-3242, pp 2147-2172).
각 항체 분자는 6개의 CDR 서열을 가지는데, 세 개는 L쇄에 세 개는 H 쇄에 있고, 이들 CDRs중 5개는 생식세포계열 CDRs(가령, 임의 재조합없이 동물의 게놈 서열에서 바로 유도된)이고, CDRs의 하나는 non-생식세포계열 CDR(가령, 동물의 생식세포계열 게놈 서열과는 다르고, 생식세포계열 서열의 재조합에 의해 발생됨)이다. CDR이 생식세포계열 또는 non-생식세포계열 서열인지는 CDR의 서열을 조사하고, 공지의 생식세포계열 서열과 비교하여 결정한다(Kabat et al., (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thedition, NIH Publication No. 91-3242, pp 147-2172)). 공지의 생식세포계열 서열에서 상당한 변화가 있다는 것은 CDR이 non-생식세포계열 CDR이라는 것을 말한다. 따라서, 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열을 포함하는 CDR은 생식세포계열 CDR이고, 그렇지 않으면, non-생식세포계열 CDR이다.Each antibody molecule has six CDR sequences, three in the L chain and three in the H chain, five of which are germline CDRs (eg, derived directly from the animal's genomic sequence without any recombination). And one of the CDRs is a non-germline CDR (eg, different from the germline genome sequence of an animal and is generated by recombination of the germline sequence). Whether a CDR is a germline or non-germline sequence is determined by examining the sequence of the CDR and comparing it with known germline sequences (Kabat et al., (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 th). edition, NIH Publication No. 91-3242, pp 147-2172). Significant changes in known germline sequences indicate that the CDRs are non-germline CDRs. Thus, the CDRs comprising the amino acid sequence of the binding site or antigen are germline CDRs, otherwise non-germline CDRs.
항체의 임의 CDRs에 결합 부위 또는 항원 서열을 삽입하고, 항체의 상이한 CDRsd[ 결합 부위를 삽입하는 것은 당분야에 공지된 것이고, 그 다음 결합쌍의 특정 멤버에 결합하는 능력에 대해 생성된 변형 항체(단락 5.5)를 선별하거나 또는 항원 부위에 대해 면역 반응을 유도하는 능력에 대해 생성된 변형 항체(달락 5.5)를 선별한다. 따라서, 당업자는 CDR에 선택적으로 결합 부위 또는 항원을 포함하는지를 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, H쇄 또는 L쇄의 CDR을 변형시켜, 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열을 포함하도록 한다. 또 다른 특정 구체예에서, 변형된 항체에는 가변성 도메인을 포함하는데, H쇄의 가변성 부분의 제1, 제2, 제3 CDR 또는 L쇄의 가변성 부분의 제1, 제2, 제3 CDR에는 결합 부위 또는 항원의 아미노산 부분을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 한가지 이상의 CDR에 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열을 포함하고, 또는 한가지 이상의 CDR에 각각 동일한 분자의 상이한 결합 부위를 포함하거나 또는 다른 분자의 다른 결합 부위를 포함한다. 특히, 2, 3, 4, 5, 6개 CDRs을 조작하여, 결합쌍의 제 1 멤버의 결합부위를 가지도록 한다. 적절한 구체예에서, 한 개 또는 그이상의 CDRs이 결합쌍의 제1멤버에 대한 결합부위를 포함하고, 한 개 또는 그이상의 CDRs에 면역 세포, 가령, T 세포, B 세포, NK 세포, K 세포, TIL 세포의 표면에 있는 분자의 결합 부위를 포함한다. 예를 들면, 암 항원 또는 감염성 질환 항원에 대한 결합 부위 및 면역 세포의 표면에 있는 분자의 결합부위를 가지는 변형된 항체를 이용하여, 면역세포가 암 항원을 가지는 암 세포 또는 감염성 질환 매체를 표적으로 할 수 있도록 한다.Inserting a binding site or antigen sequence into any CDRs of an antibody and inserting different CDRsd [binding sites of the antibody are known in the art and then modified antibodies generated for its ability to bind to specific members of the binding pair ( Paragraph 5.5) or a modified antibody (Dock 5.5) generated for its ability to induce an immune response against the antigenic site. Thus, one skilled in the art can determine whether the CDRs optionally comprise a binding site or antigen. In certain embodiments, the CDRs of the H or L chain are modified to include the amino acid sequence of the binding site or antigen. In another specific embodiment, the modified antibody comprises a variable domain that binds to the first, second, third CDRs of the variable portion of the H chain or to the first, second, third CDRs of the variable portion of the L chain. Amino acid portion of the site or antigen. In another embodiment of the invention, one or more CDRs comprise the binding site or amino acid sequence of an antigen, or one or more CDRs each comprise different binding sites of the same molecule or different binding sites of another molecule. In particular, two, three, four, five, six CDRs are engineered to have the binding site of the first member of the binding pair. In suitable embodiments, one or more CDRs comprise a binding site for the first member of the binding pair, and the immune cells, such as T cells, B cells, NK cells, K cells, The binding site of the molecule on the surface of the TIL cell. For example, by using a modified antibody having a binding site for a cancer antigen or an infectious disease antigen and a binding site for a molecule on the surface of the immune cell, the immune cell may target a cancer cell or infectious disease medium having a cancer antigen. Do it.
본 발명의 특정 구체예에서, 결합 부위 또는 항원 아미노산 서열은 CDR 자체의 아미노산 서열에 임의 변화없이 CDR내에 삽입시키거나 결합 부위 또는 항원 아미노산 서열을 CDR의 모두 또는 전부에 대신한다. 특정 구체예에서, 결합 부위 아미노산은 CDR 서열의 1,2,5,8,10,15, 20 아미노산에 대신한다.In certain embodiments of the invention, the binding site or antigen amino acid sequence is inserted into the CDR without any change to the amino acid sequence of the CDR itself or replaces the binding site or antigen amino acid sequence with all or all of the CDR. In certain embodiments, the binding site amino acids replace the 1,2,5,8,10,15,20 amino acids of the CDR sequences.
CDR에 있는 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열은 결합쌍의 멤버에 결합에 필수적인 또는 항원에 대해 면역반응을 유도 할 수 있는데(임의 공지의 방법으로 결정할 수 있음) 필수적인 최소 결합 부위로써; 또는 서열은 결합 부위 또는 항원의 아미노산 서열은 결합쌍의 멤버에 결합에 필수적인 또는 항원에 대해 면역반응을 유도 할 수 있는데 필요한 최소 결합 부위 또는 항원 서열보다는 크다. 특정 구체예에서, 결합 부위 또는 항원 아미노산 서열은 길이가 적어도 4개 아미노산 또는 길이가 적어도 6,8,10,15, 20개 아미노산이 된다. 다른 구체예에서, 결합 부위 아미노산 서열은 길이가 10,15,20, 25개 아미노산 또는 길이가 5-10,5-15,5-20,10-15,10-20,10-25 아미노산이 된다.The amino acid sequence of the binding site or antigen in the CDRs is the minimum binding site necessary for binding to the members of the binding pair or for inducing an immune response against the antigen (determined by any known method); Or the amino acid sequence of the binding site or antigen is larger than the minimum binding site or antigen sequence necessary for binding to a member of the binding pair or required to elicit an immune response against the antigen. In certain embodiments, the binding site or antigenic amino acid sequence is at least 4 amino acids in length or at least 6,8,10,15,20 amino acids in length. In another embodiment, the binding site amino acid sequence is 10,15,20, 25 amino acids in length or 5-10,5-15,5-20,10-15,10-20,10-25 amino acids in length .
또한, CDR의 총 길이(가령, 결합 부위 서열과 나머지 CDR 서열을 합한 길이)는 항체가 항원에 결합할 수 있도록 적정수의 아미노산이 되어야 한다. CDR은 특정 범위의 아미노산 잔기를 가지는 것을 볼 수 있는데, 파악된 CDRs의 크기(도 2에 액어도 표시됨)는 표 2에 나타낸다.In addition, the total length of the CDRs (eg, the length of the binding site sequence plus the remaining CDR sequences) should be an appropriate number of amino acids to allow the antibody to bind to the antigen. It can be seen that the CDRs have a specific range of amino acid residues, the size of the identified CDRs (also indicated in Figure 2) are shown in Table 2.
표 2TABLE 2
많은 CDR H3 부분은 길이가 5-9개의 잔기인데 반해, 특정 CDR H3 부분은 휠씬 더 긴것도 관찰되었다. 특히, 상당수의 항-바이러스 항체는 길이가 17-24개 잔기인 H쇄 CDR H3 부분을 가진다.Many CDR H3 moieties are 5-9 residues in length, while certain CDR H3 moieties are much longer. In particular, many anti-viral antibodies have H chain CDR H3 moieties that are 17-24 residues in length.
따라서, 본 발명의 특정 구체예에서, 결합 부위 또는 항원 부분을 포함하는 CDR은 표 2의 특정 CDR에 제공된 크기 범위에 있는데, 예를 들면, L쇄의 처음 CDR 즉, L1의 경우에 CDR은 10 내지 17개 아미노산 잔기를 가지고, L쇄의 두 번째 CDR즉 L2의 경우에, CDR은 7개 아미노산 잔기를 가지고, L쇄의 세 번째 CDR 즉 L3의 경우에, CDR은 7 내지 11개의 아미노산 잔기를 가진다. H쇄의 처음 CDR 즉, H1의 경우에 CDR은 5 내지 7개 아미노산 잔기를 가지고, H쇄의 두 번째 CDR즉 H2의 경우에, CDR은 9 내지 12개 아미노산 잔기를 가지고, H쇄의 세 번째 CDR 즉 H3의 경우에, CDR은 2 내지 25개의 아미노산 잔기를 가진다. 다른 특정 구체예에서, 결합 부위를 포함하는 CDR은 길이가 5-10,5-15,5-20,11-15,11-20,11-25, 16-25인 아미노산을 가진다. 다른 구체예에서, 결합 부위를 가지는 CDR의 경우에 적어도 5,10,15,20개 아미노산 또는 길이가 10,15,20,25,30개 아미노산을 가진다.Thus, in certain embodiments of the invention, the CDRs comprising the binding site or antigenic portion are in the size range provided in the particular CDRs in Table 2, e.g., the initial CDRs of the L chain, i. Having from 17 amino acid residues, for the second CDR of the L chain, L2, the CDRs have 7 amino acid residues, and for the third CDR of the L chain, L3, the CDRs have 7-11 amino acid residues. Have The first CDR of the H chain, i.e. CDR, has 5 to 7 amino acid residues, and in the case of the second CDR of the H chain, H2, the CDR has 9 to 12 amino acid residues and the third of the H chain. In the case of a CDR, ie H3, the CDRs have from 2 to 25 amino acid residues. In another specific embodiment, the CDRs comprising a binding site have amino acids 5-10,5-15,5-20,11-15,11-20,11-25, 16-25 in length. In other embodiments, the CDRs having a binding site have at least 5, 10, 15, 20 amino acids or 10, 15, 20, 25, 30 amino acids in length.
변형된 CDRs을 포함하는 항체를 작제한 후에, 변형된 항체는 추가 변경시키고, 더 큰 친화력 또는 특이성을 가지는 항체를 선별한다. 표적 항원에 대해 더 큰 친화력 또는 특이성을 가지는 항체가 만들어지고, 이는 당분야에 임의 공지된 방법으로 선별된다. 예를 들면 합성된 변형 항체를 인코드하는 핵산이 무작위로 또는 화학적 또는 부위-직접적인 돌연변이생성에 의해 돌연변이되거나 또는 변형된 항체를 인코드하는 핵산에 특정 위치에 특정 돌연변이생성시키고, 표적이 되는 항원에 결합 친화성을 가지는 돌연변이된 핵산 분자에 노출된 항체를 선별한다. 선별은 발현된 항체 분자를 개별적으로 테스트하거나 또는 상 디스플레이 기술등과 같은 돌연변이된 서열의 라이브러리를 스크린하여 실시한다(U.S.Patent Nos. 5,223,409; 5,403,484; and 5,571,698 all by Ladner et al; PCT Publication WO 92/01047 by McCafferty et al.).After constructing the antibody comprising the modified CDRs, the modified antibody is further modified and screened for antibodies with greater affinity or specificity. Antibodies with greater affinity or specificity for the target antigen are made and selected by any method known in the art. For example, a nucleic acid encoding a synthesized modified antibody may be mutated randomly or by a chemical or site-directed mutagenesis or specific mutagenesis at a specific position in a nucleic acid encoding a modified antibody, to a target antigen. Antibodies exposed to mutated nucleic acid molecules with binding affinity are selected. Selection is performed by individually testing the expressed antibody molecules or by screening libraries of mutated sequences such as phase display techniques (US Patent Nos. 5,223,409; 5,403,484; and 5,571,698 all by Ladner et al; PCT Publication WO 92 / 01047 by McCafferty et al.).
특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 면역글로블린 분자의 기능적으로 활성이 있는 단편, 유도체 또는 유사체를 제공한다. 기능적으로 활성이 있다는 것은 단편, 유도체, 유사체가 이들이 유도된 항체가 인지하는 동일한 항원을 인지할 수 이는 항-항-이디오타입 항체(가령, 3차 항체 또는 Ab3 항체)를 유도할 수 있다는 것을 의미한다(이는 단락 5.5에서 설명하는 방법으로 확인할 수 있다). 특히, 적절한 구체예에서, 항원을 특이적으로 인지하는 특정 CDR 서열의 N-말단이 되는 CDR 서열과 구조를 제거하면, 면역글로블린 분자의 이디오타입의 항원성이 강화된다. CDR 서열이 항원에 결합하는지를 결정하기 위해, CDR 서열을 포함하는 합성 펩티드를 항원 결합 검사에 이용하는데, 이는 당분야에 공지된 임의 결합 검사를 이용한다. 따라서, 적절한 구체예에서, 본 발명은 가변성 부분 도메인에 있는 한 개 이황화결합을 형성하는 시스테인 잔기를 SH기를 포함하지 않는 아미노산 잔기로 치환되고, 이의 가변성 부분의 일부분이 결손된 변형 면역글로블린 분자를 포함한다.In certain embodiments, the invention provides functionally active fragments, derivatives or analogs of the modified immunoglobulin molecules of the invention. Functionally active means that fragments, derivatives, and analogs can recognize the same antigen that the antibody from which they are derived is capable of inducing anti-anti-idiotype antibodies (eg, tertiary antibodies or Ab3 antibodies). (This can be verified by the method described in paragraph 5.5). In particular, in suitable embodiments, eliminating the CDR sequences and structures that are the N-terminus of a particular CDR sequence that specifically recognizes an antigen enhances the antigenicity of the idiotype of an immunoglobulin molecule. To determine if the CDR sequences bind to the antigen, synthetic peptides comprising the CDR sequences are used for antigen binding assays, which use any binding assay known in the art. Thus, in a suitable embodiment, the invention encompasses modified immunoglobulin molecules in which a cysteine residue forming one disulfide bond in the variable moiety domain is replaced with an amino acid residue not comprising an SH group and a portion of the variable moiety is deleted. do.
본 발명의 다른 구체예에는 본 발명의 변형 항체의 단편을 포함하는데, 가령, 가변성 부분을 포함하는 F(ab')2, L쇄 항상 부분 및 H쇄의 CH1 도메인이 항체 분자의 펩신 처리로 만들어진것이고, F(ab')2의 이황화결합 다리를 환원시켜 만들어지는 Fab 단편 등이 있으나 이에 한정하지는 않는다. 또한, 본 발명은 본 발명의 변형 분자의 H쇄 및 L쇄 이량체 또는 Fvs 또는 단일 쇄 항체(SCAs)와 같은 임의 최소 단편 또는 본 발명의 변형 항체와 동일한 특이성을 가지는 임의 다른 분자를 제공한다(e.g., as described in U.S.Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-54).Other embodiments of the invention include fragments of the modified antibodies of the invention, including, for example, F (ab ') 2 comprising a variable moiety, the L chain always part and the CH1 domain of the H chain made by pepsin treatment of the antibody molecule. And Fab fragments produced by reducing the disulfide bridges of F (ab ') 2 , but are not limited thereto. The present invention also provides any minimum fragments, such as the H and L chain dimers or Fvs or single chain antibodies (SCAs) of the modified molecules of the invention or any other molecule with the same specificity as the modified antibodies of the invention ( eg, as described in US Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54).
"키메라 항체"를 생산하는 기술도 개발되어왔는데(Morrison et al., 1984, Proc. NA시. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608, Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454), 적절한 항원 특이성을 가진 생쥐 항체 분자의 유전자와 적절한 생물학적 활성을 가지는 사람 항체 분자의 유전자를 접합시키는 것이다. 키메라 항체는 뮤린 단클론 항체에서 유도된 가변성 부분을 가지는 것과 사람의 면역글로블린의 항상부분을 가지는 것과 같은 상이한 동물종에서 유도된 상이한 부분을 가지는 분자로 예를 들면, 사람화된 항체를 말한다.Techniques for producing "chimeric antibodies" have also been developed (Morrison et al., 1984, Proc. NA, Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608, Takeda) et al., 1985, Nature 314: 452-454), conjugating the genes of mouse antibody molecules with appropriate antigen specificity to those of human antibody molecules with appropriate biological activity. Chimeric antibodies refer to, for example, humanized antibodies with molecules having different portions derived from different animal species, such as those having variable portions derived from murine monoclonal antibodies, and those having the always part of human immunoglobulins.
특정 구체예에서, 본 발명의 변형 면역글로블린은 사람화된 항체, 좀더 적절하게는 구조 부분은 사람 항체의 것이고, CDRs은 사람이 아닌 동물 적절하게는 생쥐의 항체에서 유도된 가변 도메인을 가지는 것이다(International Patent Application No. PCT/GB8500392 by Neuberger et al. and Celltech Limited).In certain embodiments, the modified immunoglobulins of the invention are those of a humanized antibody, more suitably the structural portion of a human antibody, and the CDRs have a variable domain derived from an antibody of a non-human animal suitably mouse ( International Patent Application No. PCT / GB8500392 by Neuberger et al. And Celltech Limited).
CDR 접합은 사람화 항체의 또 다른 방법이다. 이는 뮤린 항체를 다시 만드는 것으로 사람 구조에 전체적인 항원 특이성 및 결합 친화성을 전달하는 것이다(Winter et al. U.S.Patnet No. 5,225,539). CDR-접합된 항체는 다양한 항원에 대해 성공적으로 만들어졌는데, 예를 들면, IL-2 수용체에 대한 항체(Queen et al.,1989(Proc. NA시. Acad. Sci. USA 86:10029); 세포 표면 수용체-CAMPATH에 대한 항체(Riechmann et al.(1988, Nature, 332:323)); 간염 B에 대한 항체(Cole et al.(1991, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:2869)); 항원-호흡기 합체 바이러스에 대한 항체(Tempest et al.(1991,Bio-Technology 9:267))등이 있다. CDRs-접합된 항체는 뮤린 단클론 항체의 CDR을 사람 항체에 접합시켜 만든다. 접합후에, 구조 부분에 있는 추가 아미노산 변화로부터 이익을 얻어, 친화력을 유지하는데, 그 이유는 골격구조 잔기가 CDR 모양을 유지하는데 필수적이고, 일부 골격구조잔기는 항원 결합 부위의 일부분인 것으로 알려졌기 때문이다. 그러나, 임의 항원성 부위를 도입시키기 않기 위해 골격구조를 보존할 수 있기위하여, 정립된 생식세포계열 서열과 비교하고, 컴퓨터 모델링한다.CDR conjugation is another method of humanized antibodies. This is a remaking of murine antibodies, which conveys the overall antigen specificity and binding affinity to the human structure (Winter et al. U. S. Patnet No. 5,225, 539). CDR-conjugated antibodies have been successfully made against a variety of antigens, for example, antibodies against IL-2 receptors (Queen et al., 1989 (Proc. NA C. Acad. Sci. USA 86: 10029); cells Antibody to Surface Receptor-CAMPATH (Riechmann et al. (1988, Nature, 332: 323)); Antibody to Hepatitis B (Cole et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869)) Antibodies against antigen-respiratory conjugate viruses (Tempest et al. (1991, Bio-Technology 9: 267)), etc. CDRs-conjugated antibodies are made by conjugating CDRs of murine monoclonal antibodies to human antibodies. , Benefiting from further amino acid changes in the structural moiety to maintain affinity since the skeletal residues are essential for maintaining the CDR shape and some framework residues are known to be part of the antigen binding site. However, in order to preserve the framework structure in order not to introduce any antigenic sites, Compared to established germline sequences and computer modeled.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 변형 면역글로블린의 융합 단백질을 제공하는데(또는 이의 기능적으로 활성이 있는 단편), 예를 들면 변형 면역글로블린을 공유결합을 통하여, 변형된 면역글로블린이 아닌 또 다른 단백질(또는 이의 일부분, 적어도 단백질의 10,20,50개 아미노산으로된 부분)의 아미노산 서열의 N- 또는 C-말단에 융합된 것이다. 적절하게는 변형 면역글로블린 또는 이의 단편은 항상 부분의 N-말단에서 다른 단백질에 공유결합된다. 적절한 구체예에서, 본 발명은 변형된 면역글로블린이 IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-10,γ-인터페론, MCH 유도된 펩티드, G-CSF,TNF, 포린, NK 세포 항원 또는 세포 엔도사이토시스 수용체에 공유적으로 연결된 융합 단백질이다.In another embodiment, the present invention provides a fusion protein of the modified immunoglobulin of the invention (or a functionally active fragment thereof), eg, via covalent linkage of a modified immunoglobulin, which is not modified immunoglobulin. Is fused to the N- or C-terminus of the amino acid sequence of another protein (or a portion thereof, at least a portion of 10, 20, 50 amino acids of the protein). Suitably the modified immunoglobulin or fragment thereof is always covalently linked to another protein at the N-terminus of the portion. In suitable embodiments, the present invention provides a modified immunoglobulin wherein IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, γ-interferon, MCH derived peptide, G-CSF, It is a fusion protein covalently linked to a TNF, porin, NK cell antigen or cellular endocytosis receptor.
본 발명의 변형 면역글로블린에는 변형된 유사체 및 유도체가 포함되는데, 예를 들면, 임의 형태의 분자에 공유결합된 것으로 단, 이와같은 공유적으로 결합되는 것이 항-이디오타입 반응을 유도하는데 있어서, 변형 면역글로블린을 방해하지 않아야 한다(이는 단락 5.5에서 설명하는 임의 방법으로 결정함). 예를 들면, 본 발명의 변형 면역글로블린의 유도체 및 유사체에는 추가 변형된 것들이 포함되는데, 예를 들면, 글리코실화반응, 아세틸화반응, 페질화반응(pegylation), 포스포릴화반응, 아미데이션, 공지의 보호 및 차단기, 단백질분해성 절단, 세포 리간드 또는 임의 부분에 연결되는 등의 방법으로 유도된 것들이 포함된다. 임의 다양한 화학적인 변형도 공지 기술을 이용하여 이루어질 수 있는데, 가령, 특정 화학물질을 이용한 절단, 아세틸화반응, 포밀화반응, 튜니카마이신(tunicamycin)의 대사적 합성등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 추가로, 유사체 또는 유도체에는 이 단락에서 나열한 것과 같은 한 개이상의 비-교유적인 아미노산을 포함할 수 있다.Modified immunoglobulins of the present invention include modified analogs and derivatives, including, for example, covalently attached to any type of molecule, provided that such covalent binding induces an anti-idiotype response, It should not interfere with the modified immunoglobulin (which is determined by any method described in paragraph 5.5). For example, derivatives and analogs of the modified immunoglobulins of the invention include those that are further modified, for example, glycosylation, acetylation, pegylation, phosphorylation, amidation, known And those derived by methods such as protecting and blocking groups, proteolytic cleavage, linkage to cellular ligands, or any portion thereof. Any of a variety of chemical modifications may be made using known techniques, including but not limited to cleavage with specific chemicals, acetylation, formylation, metabolic synthesis of tunicamycin, and the like. . In addition, analogs or derivatives may include one or more non-crossing amino acids, such as those listed in this paragraph.
변형 면역글로블린, 이의 단편, 유사체, 유도체를 만드는 방법은 5.4에서 설명한다.Methods for making modified immunoglobulins, fragments, analogs and derivatives thereof are described in 5.4.
5.2. 치료요법상의 용도5.2. Therapeutic Uses
본 발명은 개체에 치료제를 투여함으로써 항-이디오타입 항체 및 항-항-이디오타입 항체 생산을 유도하는 방법을 제공한다. 이와 같은 치료제에는 본 발명의 변형 면역글로블린, 기능적으로 활성이 있는 단편, 이의 유사체 및 이의 유도체(단락 5.1참고), 본 발명의 변형 항체를 인코드하는 핵산, 이의 기능적으로 활성을 가진 단편, 이의 유도체(단락 5.1참고)을 포함한다.The present invention provides a method of inducing anti-idiotype antibody and anti-anti-idiotype antibody production by administering a therapeutic agent to a subject. Such therapeutic agents include modified immunoglobulins of the invention, functionally active fragments, analogs and derivatives thereof (see paragraph 5.1), nucleic acids encoding modified antibodies of the invention, functionally active fragments thereof, derivatives thereof (See paragraph 5.1).
일반적으로, 개체와 동일한 종인 종기원 또는 종 반응성을 가진 생성물을 투여하는 것이 바람직하다. 따라서, 적절한 구체예에서는 본 발명의 방법은 사람 항체에서 유도된 변형 항체를 이용하고, 또 다른 구체예에서는 키메라 또는 사람화된 항체에서 유도된 변형 항체를 이용한다.In general, it is desirable to administer a product with a botanical or species reactivity that is the same species as the individual. Thus, in suitable embodiments, the methods of the present invention utilize modified antibodies derived from human antibodies, and in still other embodiments use modified antibodies derived from chimeric or humanized antibodies.
특히, 본 발명의 변형 항체를 포함하는 백신 조성물(단락 5.3)을 개체에 투여하여, 변형 항체 Ab2의 이디오타입을 특이적으로 인지하는 항체(가령, 항-이디오타입 항체 또는 Ab2)를 생산하도록 유도하고, 다시, 이는 Ab2의 이디오타입을 특이적으로 인지하는 항-항-이디오타입 항체(Ab3)의 생산을 유도하여, 이와 같은 Ab3 항체는 변형된 항체와 동일한 또는 유사한 특이성을 가진다.In particular, a vaccine composition comprising the modified antibody of the invention (paragraph 5.3) is administered to a subject to produce an antibody (eg, an anti-idiotype antibody or Ab2) that specifically recognizes the idiotype of the modified antibody Ab2. Inducing, again, this leads to the production of an anti-anti-idiotype antibody (Ab3) that specifically recognizes the idiotype of Ab2, such that the Ab3 antibody has the same or similar specificity as the modified antibody.
본 발명은 항-이디오타입 반응을 유도하기 위해, 가령, Ab2 및 Ab3 타입 항체를 만들기 위해 본 발명의 변형 항체를 투여하는 방법을 제공한다. 또는, 본 발명은 한 개체에서 Ab2 항체를 생산하기 위해 본 발명의 변형된 항체를 투여하고, Ab2 항체를 분리시키고, 그 다음 제 2 개체에 Ab2 항체를 투여하여, 제2개체에서 Ab3타입 항체를 만드는 방법을 제공한다.The present invention provides a method of administering a modified antibody of the invention to induce an anti-idiotype response, such as to make Ab2 and Ab3 type antibodies. Alternatively, the present invention provides an Ab3-type antibody in a second individual by administering a modified antibody of the invention to produce an Ab2 antibody in one individual, isolating the Ab2 antibody, and then administering an Ab2 antibody to a second individual. Provide a way to make it.
따라서, 본 발명은 개체에 항-이디오타입 반응을 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 항-이디오타입 반응을 유도하는데 충분한 제1 면역글로블린 분자(또는 이의 기능적으로 활성이 있는 단편 또는 이의 유도체)의 일정량을 투여하고, 제1면역글로블린은 제2면역글로블린 분자와는 가변 부분에 한 개이상의 아미노산 잔기 치환체가 있는 것을 제외하고는 동일한 가변 부분을 가지고, 제2 면역글로블린 분자는 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는 능력이 있고, 이때 제 2 면역글로블린 분자에서 이황화결합을 형성하는 한 개 이상의 시스테인 잔기에 상응하는 한 개 이상의 위치에 SH기를 포함하지 않는 아미노산 잔기로 치환된 한 개 이상의 치환체를 가진다. 또 다른 구체예에서, 제2면역글로블린 분자의 이디오타입을 인지하는 항-이디오타입 항체를 분리하고, 항-이디오타입 항체를 제2개체에 투여하는 방법을 추가로 제공한다.Accordingly, the present invention provides a method of inducing an anti-idiotype response in a subject, the method comprising a first immunoglobulin molecule (or a functionally active fragment thereof or sufficient thereof) that induces an anti-idiotype response. Derivative) and the first immunoglobulin has the same variable moiety as the second immunoglobulin molecule, except that there is at least one amino acid residue substituent in the variable moiety, and the second immunoglobulin molecule is immune to the antigen. One or more substituents having the ability to bind specifically, wherein one or more substituents are substituted with amino acid residues that do not contain an SH group at one or more positions corresponding to one or more cysteine residues that form disulfide bonds in the second immunoglobulin molecule Has In another embodiment, there is further provided a method of isolating an anti-idiotype antibody that recognizes the idiotype of a second immunoglobulin molecule and administering the anti-idiotype antibody to the second individual.
하기 단락에서 더 상세하게 논의될 특정 구체예에서, 본 발명의 변형된 항체를 이용하여 감염성 매개물, 질병이 있는 또는 비정상적인 세포 가령, 세균, 기생충, 곰팡이, 바이러스, 종양 및 암등을 포함하나 이에 국한하지 않는 물질에 대해 항-이디오타입 반응을 유도한다. 본 발명의 변형 항체를 이용하여, 특정 항원에 대해 항-항-이디오타입 반응을 유도하여, 치료 또는 예방할 수 있는 임의 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.In certain embodiments, which will be discussed in more detail in the following paragraphs, the modified antibodies of the present invention may be used to include, but are not limited to, infectious agents, diseased or abnormal cells such as bacteria, parasites, fungi, viruses, tumors, and cancers. Do not induce an anti-idiotype response. The modified antibodies of the invention can be used to induce an anti-anti-idiotype response to a specific antigen, thereby treating or preventing any disease that can be treated or prevented.
또 다른 구체예에서, 변형 항체를 이용하여, 류마티스 관절염, 낭창, 궤양성 대장염, 건선 또는 알레르기 치료등을 포함하나 이에 국한되지 않는 자가면역 질환을 치료한다. 한 특정 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 개체에서 체액 반응을 유도한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 개체에서 세포-중개된 반응을 유도한다. 적절한 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 체액 및 세포-중개된 반응을 유도한다.In another embodiment, the modified antibody is used to treat autoimmune diseases, including but not limited to the treatment of rheumatoid arthritis, lupus, ulcerative colitis, psoriasis or allergies, and the like. In one specific embodiment, the methods and compositions of the invention are used to induce a humoral response in a subject. In another embodiment, the methods and compositions of the invention are used to induce cell-mediated responses in a subject. In suitable embodiments, the methods and compositions of the present invention are used to induce humoral and cell-mediated responses.
본 발명을 이용할 수 있는 개체는 임의 포유류 종 또는 척추동물종이 되는데, 예를 들면, 소, 말, 양, 돼지, 가금류(닭), 염소, 고양이, 개, 헴스터, 생쥐, 들쥐, 원숭이, 토끼, 침팬지 및 사람이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 적절한 구체예에서는 개체는 사람이 된다. 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여, 질병을 예방하거나, 특정 질병을 치료하고, 이때 특정 면역글로블린 분자에 대한 항-이디오타입 반응이 질병을 치료하거나 예방하는데 효과적이다.Individuals that can utilize the present invention are any mammalian or vertebrate species, for example, cattle, horses, sheep, pigs, poultry (chicken), goats, cats, dogs, helmsters, mice, rats, monkeys, rabbits. This includes, but is not limited to, chimpanzees and humans. In suitable embodiments, the subject is a human. Using the compositions and methods of the present invention, diseases are prevented or certain diseases are treated, wherein an anti-idiotype response to a particular immunoglobulin molecule is effective for treating or preventing the disease.
5.2.1. 암의 치료 및 예방5.2.1. Cancer Treatment and Prevention
신형성, 종양, 전이 또는 조절이 안되는 세포 생장을 특징으로 하는 임의 질병을 포함하는 암은 본 발명의 변형 면역글로블린(또는 이의 활성 단편, 유도체 및 유사체) 또는 변형 면역글로블린을 인코드하는 핵산 또는 이의 기능적으로 활성 단편, 유도체 및 유사체를 투여함으로써 치료 및 예방할 수 있는데,Cancers, including any disease characterized by neoplasia, tumors, metastases or unregulated cell growth, are nucleic acids encoding modified immunoglobulins (or active fragments, derivatives and analogs thereof) or modified immunoglobulins thereof or Can be treated and prevented by administering functionally active fragments, derivatives and analogs,
, 이런 변형된 면역글로불린은 하나 또는 복수의 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린에서 유도하고, 상기 항원은 치료 또는 예방할 암의 암세포와 관계한다. 특정 치료요법이 일정형태의 암의 예방 또는 치료에 효과가 있는 가의 여부는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있는데, 이런 방법의 예는 섹션 5.5에 제시하였지만, 이들 예에 한정하지 않는다.Such modified immunoglobulins are derived from immunoglobulins that specifically recognize one or a plurality of antigens, which antigens are associated with cancer cells of the cancer to be treated or prevented. Whether a particular therapy is effective in preventing or treating some form of cancer can be determined by any method known in the art, examples of which are provided in Section 5.5, but are not limited to these examples.
가령, 다음의 암항원과 관련된 암은 이들 암항원을 인식하는 항체로부터 유도한 본 발명의 변형항체를 투여하여 치료 또는 예방한다: KS1/4 범-암(종)항원(Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:32-37; bumal, 1988 Hybridoma7(4):407-415), 난소암 항원(CA125)(Yu et al., 1991, Cancer Res. 51(2):48-475), 전립선산 인산염(Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(1):4928), 전립선특이적 항원(Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230), 흑색종-관련 항원p97(Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-44), 흑색종 항원gp75(vijayasardahl et al., 1990. J. Exp. Med. 171(4):1375-1380), 고분자량 흑색종 항원(HMW-MAA)(Natali et al., 1987, Cancer 59:55-3; Mittelman et al., 1990, j. Chin. invest 86:2136-2133). 전립선 특이적 막 항원, 태아성 암(종) 항원(CEA)(Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13:294), 다형성 내피 무친 항원, 사람 유지방 구체항원, 결장직장암-관련 항원(예, CEA, TAG-72(Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52:3402-3408), C017-1A(Ragnhammar et al., 1993, Int, J. Cancer 53:751-758); GICA 19-9(Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2:135), CTA-1, LEA), 벌키트 림프종 항원 38.13, CD19(Ghetie et al., 1994, Blood 83:1329-1336), 사람 b-림프종 항원-CD20(Reff et al., 1994, Blood 83:435-445), CD33(Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34:422-430), 흑색종 특이적 항원(예, 강글리시드 GD2(Saleh et al., 1993, J. Immunol. 151,3390-3398), 강글리시드 GD3(Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother, 36:373-380), 강글리시드 GM2(Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12:1036-1044), 강글리시드 GM3(Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53:5244-5250)), 종양-특이적 이식 형태의 세포-표면 항원(TSTA)(예, T-항원 DNA 종양 바이러스와 RNA 종양 바이러스의 외피항원을 비롯한 바이러스-유도 종양항원), 신생종양 항원-알파-태아단백질(예, 결장의 CEA), 방광 종양 신생종양 항원(Hellstrom et al., 1985, Cancer. Res. 45:2210-2218), 분화항원(예, 사람 폐암(종) 항원 L6,L20(Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46:3917-3923)), 섬유육종의 항원, 사람 백혈병 T 세포 항원-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141:1398-1403), 신당단백질, 스핑고지질, 유방암 항원(예, EGFR(상피 생장인자 수용체)), HER2 항원(p185HER2), 다형성 내피 무친(PEM)(Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17:359), 악성 사람 림프구 항원-APO-I(Bernhard et al., 1989, Science 245:301-304), 분화항원(Feizi, 1985, Nature 314:53-57)(예, 신생 적혈구 및 일차 내배엽에서 발견되는 I 항원), 위 선암종에서 발견되는 I(Ma), 유방 내피에서 발견되는 M18 및 M39, 골수성세포에서 발견되는 SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5, 결장직장암에서 발견되는 D156-22, TRA-1-85(혈액 그룹 H), 결장 선암(종)에서 발견된 C14, 폐 선암(종)에서 발견된 F3, 위암에서 발견된 AH6, Y 합텐, 태아 암(종)세포에서 발견된 Ley, TL5(혈액 그룹 A), A431 세포에서 발견된 EGF, 췌장암에서 발견된 E1시리즈(혈액 그룹 B), 태아 암(종)세포에서 발견된 FC10.2, 위 선암종, 선암(종)에서 발견된 CO-514(혈액 그룹 Leu), 선암(종)에서 발견된 NS-10, CO-43(혈액 그룹 Leb), G49, 결장 선암(종)에서 발견된 EGF 수용체(혈액 그룹 ALeb/Ley), 결장암에서 발견된 19.9, 위암 무친, 골수세포에서 발견된 T5A7, 흑색종에서 발견된 R24, 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, 태아 암(종)세포에서 발견된 M1:22:25:8, 4-8-세포단계 태아에서 발견된 SSEA-3, SSEA-4. 또 다른 구체예에서, 항원은 피부 T 세포 림프종에서 얻은 T 세포 수용체유도 펩티드이다( Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62 참조).For example, cancers associated with the following cancer antigens are treated or prevented by administering the modified antibodies of the invention derived from antibodies recognizing these cancer antigens: KS1 / 4 pan-cancer (species) antigens (Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142: 32-37; bumal, 1988 Hybridoma7 (4): 407-415), ovarian cancer antigen (CA125) (Yu et al., 1991, Cancer Res. 51 (2): 48-475), Prostate acid phosphate (Tailor et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18 (1): 4928), prostate-specific antigen (Henttu and Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 10 (2): 903- 910; Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227-230), melanoma-associated antigen p97 (Estin et al., 1989, J. Natl. Cancer Instit. 81 (6): 445-44), Melanoma antigen gp75 (vijayasardahl et al., 1990. J. Exp. Med. 171 (4): 1375-1380), high molecular weight melanoma antigen (HMW-MAA) (Natali et al., 1987, Cancer 59:55 -3; Mittelman et al., 1990, j. Chin.invest 86: 2136-2133). Prostate specific membrane antigen, fetal cancer (species) antigen (CEA) (Foon et al., 1994, Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 13: 294), polymorphic endothelial murine antigen, human milk fat antigen, colon Rectal Cancer-Related Antigens (e.g. CEA, TAG-72 (Yokata et al., 1992, Cancer Res. 52: 3402-3408), C017-1A (Ragnhammar et al., 1993, Int, J. Cancer 53: 751-) 758); GICA 19-9 (Herlyn et al., 1982, J. Clin. Immunol. 2: 135), CTA-1, LEA), bulk kit lymphoma antigen 38.13, CD19 (Ghetie et al., 1994, Blood 83 : 1329-1336), human b-lymphoma antigen-CD20 (Reff et al., 1994, Blood 83: 435-445), CD33 (Sgouros et al., 1993, J. Nucl. Med. 34: 422-430) , Melanoma specific antigens (e.g., strong glycid GD2 (Saleh et al., 1993, J. Immunol. 151,3390-3398), strong glycid GD3 (Shitara et al., 1993, Cancer Immunol. Immunother, 36) : 373-380), strong glycid GM2 (Livingston et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12: 1036-1044), strong glycid GM3 (Hoon et al., 1993, Cancer Res. 53: 5244- 5250)), cell-surface antigen (TSTA) in a tumor-specific graft form ( Virus-induced tumor antigens, including envelope antigens of T-antigen DNA tumor virus and RNA tumor virus), neoplastic antigen-alpha-fetoprotein (e.g., CEA of the colon), bladder tumor neoplastic antigen (Hellstrom et al., 1985, Cancer Res. 45: 2210-2218), differentiation antigens (eg, human lung cancer (species) antigens L6, L20 (Hellstrom et al., 1986, Cancer Res. 46: 3917-3923), fibrosarcoma, human leukemia T cell antigen-Gp37 (Bhattacharya-Chatterjee et al., 1988, J. of Immun. 141: 1398-1403), glycoprotein, sphingolipids, breast cancer Antigens (e.g. EGFR (epithelial growth factor receptor)), HER2 antigen (p185 HER2 ), polymorphic endothelial mucin (PEM) (Hilkens et al., 1992, Trends in Bio. Chem. Sci. 17: 359), malignant human lymphocytes Antigen-APO-I (Bernhard et al., 1989, Science 245: 301-304), differentiation antigen (Feizi, 1985, Nature 314: 53-57) (e.g., I antigen found in neoplastic erythrocytes and primary endoderm), I (Ma) found in gastric adenocarcinoma, M18 and M39 found in breast endothelium, SSEA-1, VEP8, VEP9, Myl, VIM-D5 found in myeloid cells, D 1 56-22, TRA found in colorectal cancer -1-85 (blood group H), C14 found in colon adenocarcinoma (species), F3 found in lung adenocarcinoma (species), AH6 found in gastric cancer, Y hapten, Le y found in fetal cancer (species) cells , TL5 (blood group A), EGF found in A431 cells, pancreatic cancer The document found E 1 series (blood group B), fetal cancer (species) that FC10.2, found in the stomach adenocarcinoma cells in adenocarcinoma (species) A CO-514 (blood group Le u) found in adenocarcinoma (kind of) Found NS-10, CO-43 (blood group Le b ), G49, EGF receptor (blood group ALe b / Le y ) found in colon adenocarcinoma (species), 19.9 found in colon cancer, gastric cancer-free, bone marrow cells Found T 5 A 7 , found in melanoma R 24 , 4.2, G D3 , D1.1, OFA-1, G M2 , OFA-2, G D2 , M1: 22 found in fetal carcinoma cells : 25: 8, SSEA-3 and SSEA-4 found in 4-8-cell stage embryos. In another embodiment, the antigen is a T cell receptor-derived peptide obtained from cutaneous T cell lymphoma (see Edelson, 1998, The Cancer Journal 4:62).
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 변형항체로 치료하는 대상은 선택적으로 수술, 방사선치료 또는 화학치료와 같은 다른 암치료법으로 치료한다. 특히, 암을 예방하거나 치료하기 위해 사용하는 본 발명의 치료물질은 하나의 화학치료요법 물질 또는 이런 물질의 화합물과 결합하여 투여하는데, 화학치료요법 물질의 예로는 메토트렉세이트, 탁솔, 멀캡토퓨린, 티오구아닌, 수산화요소, 시타라빈, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 니토로소우레아, 시스플라틴, 카르보플라틴, 미토마이신, 다카르바진, 프로카비진, 에토포시드, 캠파테신, 블레오마이신, 독소루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 필리카마이신, 미톡산트론, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 팔실리탁셀, 도체탁셀등을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.In another embodiment of the invention, the subject treated with the modified antibody of the invention is optionally treated with another cancer therapy such as surgery, radiation therapy or chemotherapy. In particular, the therapeutic agents of the invention used to prevent or treat cancer are administered in combination with a single chemotherapeutic agent or a compound of such a substance, examples of which are methotrexate, taxol, mercaptopurine, thio Guanine, urea hydroxide, cytarabine, cyclophosphamide, phosphamide, nitorourea, cisplatin, carboplatin, mitomycin, dacarbazine, procarbazine, etoposide, camppatin, bleomycin, doxorubicin , Idarubicin, daunorubicin, dactinomycin, phyllomycin, mitoxantrone, asparaginase, vinblastine, vincristine, vinorelbine, pasililitaxel, docetaxel, and the like. It is not limited.
5.2.1.1. 악성(종)암5.2.1.1. Malignant (species) cancer
본 발명의 투여로 치료하거나 예방할 수 있는 악성암이나 다른 관련질환은 표3에 제시한 것들을 들 수 있지만, 이들에 한정하지 않는다(fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia 참조)Malignant cancers and other related diseases that can be treated or prevented by the administration of the present invention include those listed in Table 3, but are not limited to these (fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., JB Lippincott Co. , Philadelphia)
표 3TABLE 3
악성암 및 관련 질환Malignant Cancer and Related Diseases
백혈병leukemia
급성 백혈병Acute leukemia
급성 림프구성 백혈병Acute Lymphoblastic Leukemia
급성 골수성 백혈병Acute myeloid leukemia
골수아구성Myeloid
전골수성Myeloid
골수성단구Myeloid
단구성Construction
적백혈병Red leukemia
만성 백혈병Chronic leukemia
만성 골수성 백혈병Chronic myeloid leukemia
만성 림프구성 백혈병Chronic Lymphocytic Leukemia
진성 적혈구 증가증True erythrocytosis
림프종Lymphoma
홉킨스병Hopkins disease
비-홉킨스병Non-Hopkins Disease
다발성 골수종Multiple myeloma
발렌스트룀의 매크로글로불린 혈증Macroglobulinemia in Valentseng
H 사슬 질병H chain disease
고형암Solid rock
육종 및 암(종)Sarcoma and Cancer (species)
섬유육종Fibrosarcoma
점액육종Myxedema
지방육종Liposarcoma
연골육종Chondrosarcoma
골육종Osteosarcoma
척(수)삭종Chuck
맥관 육종Vascular Sarcoma
내피 육종Endothelial sarcoma
림프관 육종Lymphatic sarcoma
림프관내피 육종Lymphatic endothelial sarcoma
활악종Live music
중피종Mesothelioma
유잉종양Ewing tumor
평활 근육종Smooth myoma
결장암(종)Colon cancer (species)
췌장암Pancreatic cancer
유방암Breast cancer
난소암Ovarian Cancer
전립선암Prostate cancer
편평 세포암(종)Squamous cell carcinoma (species)
기저 세포암(종)Basal cell carcinoma (species)
선암(종)Adenocarcinoma (species)
한선 육종Korean sarcoma
피(지)선 육종Blood Gland Sarcoma
유두상암(종)Papillary carcinoma (species)
유두상 선암(종)Papillary adenocarcinoma (species)
낭종암(종)Cyst cancer (species)
수양암(종)Weeping Cancer (species)
기관지 암(종)Bronchial cancer (species)
직장세포 암종Rectal Cell Carcinoma
간(세포)암Liver (cell) cancer
담관암(종)Cholangiocarcinoma (species)
융모암(종)Villi (species)
정상피종Normal somatoma
태생암(종)Born cancer (species)
윌름 종양Wilm Tumor
경부암Cervical cancer
자궁암Uterine cancer
고환종양Testicular tumor
폐암(종)Lung cancer (species)
소세포폐암(종)Small cell lung cancer (species)
방광암(종)Bladder Cancer
상피암(종)Epithelial cancer (species)
신경교종Glioma
신경(교) 세포종Glioma
수아세포종Medulloblastoma
두 개 인두(관)종Two pharynx
상의 세포종Celloma on Pinterest
송과체종Pineal carcinoma
현관아(세포)종Vestibular (cell) species
청신경초종Auditory nerve bell
희<핍>돌기 교종Rare <pip> dendrite
수막종Meningioma
흑색종Melanoma
신경아세포종Neuroblastoma
망막아세포종Retinoblastoma
특정 구체예에서, 악성암 또는 이상증식변화(전이 및 형성이상), 또는 초 증식질환은 난소, 방광, 유방, 결장, 폐, 피부, 췌장 또는 자궁에서 치료하고 예방한다. 또 다른 구체예에서, 육종, 흑색종 또는 백혈병을 치료하고 예방한다.In certain embodiments, malignant cancer or dysplasia (metastasis and dysplasia), or hyperproliferative disease, is treated and prevented in the ovary, bladder, breast, colon, lung, skin, pancreas or uterus. In another embodiment, treating and preventing sarcoma, melanoma or leukemia.
5.2.1.2. 전암 상태5.2.1.2. Precancerous condition
본 발명의 치료물질은 전암 상태를 치료하고, 신생종양 또는 악성암상태로 진전되는 것을 예방하기 위하여 투여하는데, 이런 악성암의 예는 표3에 제시하지만, 이들에 예에 한정하지 않는다. 이런 예방 또는 치료요법적 용도는 신생종양 또는 암으로의 진전되는 것으로 공지된 또는 추측되는 질환, 특히, 비-신생종양 세포생장이 과형성, 이형성으로 이루어지는 경우, 이 중에서도 특히 형성장애가 발생하는 경우에 처방된다(비정상적 생장상태의 검토를 위해서는 Robbins and Angell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.8-79 참조). 과형성은 조직 또는 장기에서 세포수의 증가를 포함하여 통제된 형태의 세포증식으로 구조 또는 기능에 별다른 변화가 없다. 한가지 예를 제외하고, 자궁내막 과형성은 종종 자궁내막암을 선행한다. 이형성은 통제된 형태의 세포생장으로, 일형의 성숙 또는 완전분화된 세포가 다른 형태의 성숙세포로 치환된다. 과형성은 내피 또는 연결조직세포에 발생할 수 있다. 일반적인 과형성에는 다소의 무질서한 과성 내피세포가 관계한다. 형성장애는 암을 빈번하게 전조하고, 주로 내피에서 발견된다; 이것은 가장 무질서한 형태의 비-신생종양세포 생장으로, 여기에는 개별 세포의 통일성 및 세포의 조직적 방향성 상실이 일어난다. 형성장애 세포는 종종 비정상적으로 크고, 진하게 착색된 핵을 갖고, 다형성을 보인다. 형성장애는 특이적으로 만성적 발적 또는 염증이 있는 곳에 발생하고, 주로 경부, 호흡기, 구강, 담낭에서 발견된다.The therapeutic agent of the present invention is administered to treat precancerous conditions and to prevent progression to neoplastic or malignant cancer conditions. Examples of such malignant cancers are shown in Table 3, but are not limited to these examples. This prophylactic or therapeutic use is prescribed for diseases known or suspected of developing neoplastic or cancerous progression, in particular when non-neoplastic cell growth consists of hyperplasia and dysplasia, especially when dysplasia occurs. (See Robbins and Angell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., WB Saunders Co., Philadelphia, pp. 8-79 for a review of abnormal growth conditions). Hyperplasia is a controlled form of cell proliferation, including an increase in cell numbers in tissues or organs, with little change in structure or function. With one exception, endometrial hyperplasia often precedes endometrial cancer. Heterogeneity is a controlled form of cell growth in which one type of mature or fully differentiated cell is replaced with another type of mature cell. Hyperplasia can occur in endothelial or connective tissue cells. Common hyperplasia involves some disordered hyperepithelial cells. Dysplasia is a frequent precursor to cancer and is mainly found in the endothelium; This is the most disordered form of non-neoplastic cell growth, in which the unity of individual cells and the loss of organizational orientation of the cells occur. Dysplasia cells often have abnormally large, darkly colored nuclei and show polymorphism. Dysplasia occurs specifically in chronic redness or inflammation and is mainly found in the cervix, respiratory system, oral cavity and gallbladder.
과형성, 이형성 또는 형성장애로 특징지어지는 비정상적 세포생장의 존재에 더하여, 환자의 세포샘플에 의해 생체내 및 시험관내에서 드러나는 형질전환된 표현형 또는 악성 표현형의 하나 또는 복수 특징의 존재는 백신조성물의 예방/치료 필요정도의 척도가 된다. 앞에서 언급한 바와 같이, 이런 형질전환된 표현형의 특성에는 형태변화, 느슨해진 기증부착, 접촉억제의 상실, 유지의존의 상실, 프로테아제 kdcnf, 당전달증가, 혈청필요의 감소, 태아항원의 발현, 250,000 달톤의 세포 표면 단백질의 소멸등이 포함된다(형질전환된 또는 악성표현형과 관련된 특성을 검토하려면 상기 동일 자료 pp. 84-90 참조).In addition to the presence of abnormal cell growth characterized by hyperplasia, dysplasia or dysplasia, the presence of one or more features of the transformed phenotype or malignant phenotype manifested in vivo and in vitro by the patient's cell sample may prevent the composition of the vaccine. It is a measure of the need for treatment. As mentioned earlier, the characteristics of these transformed phenotypes include morphological changes, loose donation, loss of contact inhibition, loss of maintenance dependence, protease kdcnf, increased glycosylation, decreased serum need, expression of fetal antigens, 250,000. The disappearance of Dalton's cell surface proteins (see pp. 84-90, supra) for properties related to transformed or malignant phenotypes.
특정 구체예에서, 백반증, 내피의 양성-과형성 또는 형성장애 병소, 또는 보우인병(in situ 암종)은 예방 개입 필요성의 기준이 되는 선-종양 병소다.In certain embodiments, vitiligo, a benign-hyperplasia or dysplastic lesion of endothelial, or Bowin's disease (in situ carcinoma) is a pre-tumor lesion on which the need for preventive intervention is based.
다른 구체예에서, 섬유세포 질환(포낭 과형성, 유방 형성장애, 특정 선증(양성 내피 과형성)은 예방 개입 필요성의 기준이 된다.In another embodiment, fibroblast disease (vesicle hyperplasia, breast dysplasia, certain adenomas (benign endothelial hyperplasia) are the criteria for the need for preventive intervention.
또 다른 구체예에서, 악성암에 대한 하나 또는 복수의 근원인자를 보이는 환자는 본 발명의 치료약물 효과량을 투여하여 치료하는데, 이런 인자에는 악성암과 관련된 크로모좀 전좌(예, 만성 골육종 백혈병에 대한 필라델피아 크로모좀, 여포성 림프종에 대한 t(14;18)), 가족특유의 폴리포시스 또는 가드너 증후군(결장암의 전조), 양성 단클론 갬모패시(다중 흑색종의 전조), 멘델의 유전패턴(예, 가족특유의 결장암 폴리포시스, 가드너 증후군, 유전적 엑소스토시스, 다내분비 선종증, 아밀로이드 생산 및 크롬친화세포종을 가진 골수흉선암(종), 포이츠-제이어 증후군, 본 렉클링그하우젠의 신경교종증, 망막아세포종, 경동맥 체암, 피부 흑색암(종), 망막내 흑색암(종), 피부건조증 색소성, 운동실조 모세관확장증, 체디아크-히가시 신드롬, 피부백변증, 프랑코니 재생불량성빈혈, 블룸증후군)을 보이는 암 또는 전암성 질환에 걸린 사람과의 일차관계가 있다(Robbins and Angell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113 참조).In another embodiment, a patient showing one or more source factors for malignant cancer is treated by administering an effective amount of a therapeutic drug of the present invention, which factors include chromosomal translocation associated with malignant cancer (eg, chronic osteosarcoma leukemia). For Philadelphia chromosome, t for follicular lymphoma (14; 18)), family-specific polyphosis or Gardner syndrome (precursor of colon cancer), benign monoclonal gambifaxi (precursion of multiple melanoma), Mendelian genetic pattern (E.g., family-specific colon cancer polyphosis, Gardner syndrome, genetic exostosis, polyendocrine adenomatosis, myeloid thymic carcinoma (amyloid) with amyloid production and chromaffin cell tumors, Poetz-Jay syndrome, Bon Reckling Ghausen's glioma, Retinoblastoma, Carotid carcinoma, Cutaneous melanoma (species), Intraretinal melanoma (species), Dry skin pigmentation, Ataxia Capillary dilatation, Cheddiac-Higashi syndrome, Cutaneous sclerosis, Lancony aplastic anemia, Blum syndrome) has a primary relationship with people with cancer or precancerous diseases (Robbins and Angell, 197, Basic Pathology, 2d Ed., WB Saunders Co., Philadelphia, pp. 112- 113).
또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 치료약물을 사람환자에게 투여하여 난소, 유방, 결장, 폐, 췌장, 피부, 전립선, 위장, B 림프구 또는 자궁의 암, 흑색종 또는 육종으로의 진전을 예방한다.In another specific embodiment, the therapeutic agent of the invention is administered to a human patient to prevent progression to cancer, melanoma or sarcoma of the ovary, breast, colon, lung, pancreas, skin, prostate, stomach, B lymphocytes or uterus do.
5.2.2. 감염성 질환의 치료5.2.2. Treatment of Infectious Diseases
본 발명은 또한 본 발명의 치료약물, 특히, 변형된 면역글로불린 분자(또는 이의 기능적 활성단편, 유도체 또는 유사체, 또는 변형된 면역글로불린을 인코드한 핵산, 이의 기능적 활성 단편, 유사체 또는 유도체)를 투여하여 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 면역글로불린 분자는 감염성 질환을 유발하는 병인의 항원 또는 감염성 질환병인에 대한 세포 수용체에 면역특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자로부터 유도한 것이다. 후술한 바와 같이 감염성병인에는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생동물, 기생균이 포함되는데, 이들에 한정하지 않는다.The invention also administers a therapeutic agent of the invention, in particular a modified immunoglobulin molecule (or a functionally active fragment, derivative or analog thereof, or a nucleic acid encoding a modified immunoglobulin, a functionally active fragment, analog or derivative thereof) By providing a method for preventing or treating an infectious disease, the immunoglobulin molecule is derived from an immunoglobulin molecule capable of immunospecific binding to an antigen of a pathogen causing an infectious disease or a cell receptor for an infectious disease pathogen. will be. As described below, infectious pathogens include, but are not limited to, viruses, bacteria, fungi, protozoa, and parasites.
특정 구체예에서, 감염성 질환은 본 발명의 변형된 면역글로불린 분자(또는 이의 기능적 활성단편, 유도체 또는 유사체, 또는 변형된 면역글로불린을 인코드한 핵산)를 투여하여 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 면역글로불린 분자는 다음의 감염성 질환병인의 항원중 하나를 특이적으로 인식하는 면역글로불린으로부터 유도한 것이다: 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(Genbank accession no. J02132; Air, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:739-743; Newton et al., 1983, Virology 128:495-501), 사람 호흡기 합포체성 바이러스 G 당단백질(Genbank accessionno. Z33429; Garcia et al., 1994, J. Virol.; Collins et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:783), 뎅그바이러스의 심부 단백질, 모체 단백질 또는 다른 단백질(Genbank accession no. M19197; Hahn et al., 1988, Virology 12:17-180), 홍역바이러스 헤마글루티닌(Genbank accession no. M81899; Rota et al., 1992, Virology 188:135-142), 단수포진바이러스 2형 당단백질 gB(Genbank accession no. M14923; Bzik et al., 198, Virology 155:322-333), 폴리오바이러스 I VP1(Emini et al., 1983, Nature 304:99), HIV I의 외피 당단백질(예, gp120, Putney et al., 198, Science 234:1392-1395), B형 간염 표면항원(Itoh et al., 198, Nature 308:19; Neurath et al., 198, Vaccine 4:34), 디프테리아 독소(Audibert et al., 1981, Nature 289:543), 스트렙토콕커스(Streptococcus) 24M 에피토오프(Beachey, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:193), 고노콕커스 필린(Gonococcal pilin)(Rothbard and Schoolnik, 1985, Adv, Exp. Med. Biol. 185:247), 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 g50(gpD), 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 당단백질 H, 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 당단백질 gIII(gpC), 전파가능 위장염 당단백질 195, 전파가능 위장염 모체단백질, 돼지 로타바이러스 당단백질 38, 돼지 파르보바이러스 캡시드 단백질, 설푸리나 히도디센테리아(Serpulina hydodysenteriae)보호 항원, 소 바이러스성 설사 당단백질 55, 뉴캐슬 질환 바이러스 헤마글루티닌-뉴우라미니다제, 돼지 감기 헤마글루티닌, 돼지 감기 뉴우라미니다제, 구제역 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 아프리카 돼지 열병 바이러스, 미코플라스마 히포프뉴모니아(Mycoplasma hypopnemoniae), 감염성 소 비강기관염 바이러스(예, 감염성 소 비강기관염 바이러스 당단백질 E 또는 당단백질 G), 감염성 후두기관염 바이러스(에, 감염성 후두기관염 바이러스 당단백질 G 또는 당단백질 I), 라 크로제(La Crosse)바이러스의 당단백질(Gonzales-scarano et al., 1982, virology 120:42), 태아소 설사 바이러스(Matsuno and Inouye, 1983, Infection and Immunity 39:155), 베네주엘라 말 뇌척수염 바이러스(Mathews and Roehrig, 1982, J. Immunol. 129:273), 푼타 토로 바이러스(Dalrymple et al., 1981, in Replication of Negative Strand Viruses, Bishop and Compans(eds.),Elsevier, NY, p.17), 뮤린 백혈병 바이러스(Steeves et al., 1974, J. Virol. 14:187), 생쥐 유방 종양 바이러스(Massey and Schochetman, 1981, Virology 115:20), B형 간염바이러스 심부 단백질 또는 B형 간염바이러스 표면항원(U.K.Patent Publication No. GB 2034323A published June 4, 1980; Ganerm and Varmus, 1987, Ann, Rev. Biochem. 5:51-93; Tiollais et al., 1985, Nature 317:489-495 참조), 말 인플루엔자 바이러스 또는 말 헤르페스바이러스의 항원(예, A형(말 인플루엔자 바이러스/알래스카 91 뉴우라미니다제, 말 인플루엔자 바이러스 A형/마이애미 63 뉴우라미니다제, 말 인플루엔자 바이러스 A형/켄터키 81 뉴우라미니다제, 말 헤르페스바이러스 1형 당단백질 B, 말 헤르페스바이러스 1형 당단백질 D), 소 호흡기 합포체성 바이러스 또는 소 파라인플루엔자 바이러스(예, 소 호흡기 합포체성 바이러스 부착단백질(BRSV G), 소 호흡기 합포체성 바이러스 융합단백질(BRSV F), 소 호흡기 합포체성 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(BRSV N), 소 파라인플루엔자 바이러스 3형 융합 단백질, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형 헤마글루티닌 뉴우라미니다제), 소 바이러스성 설사 바이러스 당단백질 48, 소 설사바이러스 당단백질 53. 또 다른 특정구체예에서, 감염성 질병은 변형된 면역글로불린(또는 이의 기능적 활성 단편, 유도체 또는 유사체, 또는 이들을 인코드한 핵산)을 투여하여 치료 또는 예방하는데, 상기 변형 면역글로불린은 상응하는 병원균 및 세포 수용체를 통해 감염질병 병인에 대한 세포 수용체를 인식하는데, 병원균과 세포 수용체의 목록은 표4에서 제시한다.In certain embodiments, the infectious disease comprises a method for preventing or treating an infectious disease by administering a modified immunoglobulin molecule (or functionally active fragment, derivative or analog thereof thereof, or a nucleic acid encoding a modified immunoglobulin). To provide, the immunoglobulin molecule is derived from an immunoglobulin that specifically recognizes one of the following infectious disease pathogens: Influenza virus hemagglutinin (Genbank accession no. J02132; Air, 1981, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 78: 739-743; Newton et al., 1983, Virology 128: 495-501), human respiratory syncolitic virus G glycoprotein (Genbank accessionno. Z33429; Garcia et al., 1994, J Virol .; Collins et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 783), deep proteins, parent proteins or other proteins of the dengue virus (Genbank accession no. M19197; Hahn et al., 1988, Virology 12: 17-180), measles bar Irus hemagglutinin (Genbank accession no. M81899; Rota et al., 1992, Virology 188: 135-142), herpes zoster virus type 2 glycoprotein gB (Genbank accession no. M14923; Bzik et al., 198, Virology 155: 322-333), poliovirus I VP1 (Emini et al., 1983, Nature 304: 99), envelope glycoproteins of HIV I (eg, gp120, Putney et al., 198, Science 234: 1392-1395) , Hepatitis B surface antigen (Itoh et al., 198, Nature 308: 19; Neurath et al., 198, Vaccine 4:34), Diphtheria toxin (Audibert et al., 1981, Nature 289: 543), Streptococcus Streptococcus 24M epitooff (Beachey, 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185: 193), Gonococcal pilin (Rothbard and Schoolnik, 1985, Adv, Exp. Med. Biol. 185: 247), Pseudorabies virus g50 (gpD), Pseudorabies ) Viral glycoprotein H, Pseudorabies virus glycoprotein gIII (gpC), spreadable gastroenteritis glycoprotein 195, spreadable gastroenteritis parent protein, porcine rotavirus glycoprotein 38, porcine parvovirus capsid protein, sulfurina Serpulina hydodysenteriae protective antigen, bovine viral diarrhea glycoprotein 55, Newcastle disease virus hemagglutinin-neuuraminidase, swine cold hemagglutinin, swine cold nuuraminidase, foot-and-mouth virus, swine Cholera virus, swine influenza virus, African swine fever virus, Mycoplasma hypopnemoniae, infectious bovine nasal bronchitis virus (eg, infectious bovine nasal cavity) Gitis protein E or glycoprotein G), infectious laryngitis virus glycoprotein G or glycoprotein I), glycoprotein of La Crosse virus (Gonzales-scarano et al., 1982, virology 120: 42), fetal diarrhea virus (Matsuno and Inouye, 1983, Infection and Immunity 39: 155), Venezuelan equine encephalomyelitis virus (Mathews and Roehrig, 1982, J. Immunol. 129: 273), Punta Toro virus (Dalrymple et al., 1981, in Replication of Negative Strand Viruses, Bishop and Compans (eds.), Elsevier, NY, p. 17), murine leukemia virus (Steeves et al., 1974, J. Virol. 14: 187 ), Mouse breast tumor virus (Massey and Schochetman, 1981, Virology 115: 20), hepatitis B deep protein or hepatitis B surface antigen (UKPatent Publication No. GB 2034323A published June 4, 1980; Ganerm and Varmus, 1987, Ann, Rev. Biochem. 5: 51-93; Tiollais et al., 1985, Nature 317: 489-495), antigens of Equine Influenza Virus or Equine Herpes Virus (e.g., Type A (Equine Influenza Virus / Alaska 91 New Uramidinase, Equine Influenza Virus Type A / Miami 63) Neuuraminidase, Equine Influenza Virus Type A / Kentucky 81 Neuuraminidase, Equine Herpesvirus Type 1 Glycoprotein B, Equine Herpesvirus Type 1 Glycoprotein D), Bovine Respiratory Synthetic Virus or Bovine Parainfluenza Virus (e.g., Bovine respiratory syncytial virus adherent protein (BRSV G), bovine respiratory syncytotic virus fusion protein (BRSV F), bovine respiratory syncytial virus nucleocapsid protein (BRSV N), bovine parainfluenza virus type 3 fusion protein, bovine parainfluenza Virus type 3 hemagglutinin nuuraminidase), bovine viral diarrhea virus glycoprotein 48, bovine diarrhea virus sugar White matter 53. In another specific embodiment, the infectious disease is treated or prevented by administering a modified immunoglobulin (or a functionally active fragment, derivative or analog thereof, or a nucleic acid encoding them), wherein the modified immunoglobulin is associated with a corresponding protein. Pathogens and cellular receptors are used to recognize cellular receptors for infectious disease etiology, a list of pathogens and cellular receptors is presented in Table 4.
표 4Table 4
본 발명 방법으로 치료 또는 예방할 수 있는 바이러스 질병에는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 수두, 아데노바이러스, 단순포진바이러스 I형(HSV-I), 단순포진 II형(HSV-I), 우역, 코감기바이러스, 에코바이러스, 로타바이러스, 호흡기 합포체성 바이러스, 파필로마 바이러스, 파포바 바이러스, 시토메갈로바이러스, 에치노 바이러스, 아르보바이러스, 한탄바이러스, 콕사키 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 폴리오바이러스, 사람 면역결핍 바이러스 I형(HIV-I), 사람 면역결핍 바이러스 II형(HIV-I), 피코르나바이러스, 엔테로바이러스, 칼리시비리드아(caliciviridae), 노르워크 바이러스 그룹, 토가바이러스(에, 덩그바이러스), 알파바이러스, 플라비바이러스, 코로나바이러스, 라비즈 바이러스, 마르버그 바이러스, 에볼라바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 오르토믹소바이러스, 분야바이러스, 아레나바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스, 오르비바이러스, 사람 T 세포 백혈병 바이러스 I형, 사람 T 세포 백혈병 바이러스 II형, 유인원 면역결핍 바이러스, 렌티바이러스, 폴로오마바이러스, 파르보바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 사람 헤르페스바이러스-6, 원숭이 헤르페스바이러스 1, 팍스바이러스, 뇌염에 의해 유발된 질병이 포함되지만, 이들에 한정하지 않는다.Viral diseases that can be treated or prevented by the methods of the present invention include hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, influenza, chickenpox, adenovirus, herpes simplex virus type I (HSV-I), and herpes simplex type II (HSV-I). ), Erosion, nasal cold virus, echovirus, rotavirus, respiratory syncytial virus, papilloma virus, papova virus, cytomegalovirus, ecino virus, arbovirus, hantan virus, coxsackie virus, mumps virus, measles Virus, rubella virus, poliovirus, human immunodeficiency virus type I (HIV-I), human immunodeficiency virus type II (HIV-I), picornavirus, enterovirus, calciviridae, nord Walk virus group, togavirus (e.g., dung virus), alphavirus, flavivirus, coronavirus, labyze virus, marburg virus, Bolavirus, parainfluenza virus, orthomyxovirus, field virus, arenavirus, leovirus, rotavirus, orbivirus, human T cell leukemia virus type I, human T cell leukemia virus type II, apes immunodeficiency virus, lentivirus, Diseases caused by poloomavirus, parvovirus, Epstein-Barr virus, human herpesvirus-6, monkey herpesvirus 1, faxvirus, encephalitis are included, but are not limited to these.
본 발명의 방법으로 치료 또는 예방할 수 있는 박테리아 질병에는 그람음성 및 그람양성 박테리아, 미코박테리아 릭케차(Mycobateria rickettsia), 미코플라스마(Mycoplasma), 네이세리아종(예, Neisseria mennigitidis, neisseria gonorrhoeae), 레지오넬라(legionella), 시겔라종(Shigella spp.,), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 스트렙토콕커스속(예, Streptococcus pneumoniae), 코르네박테리아 디프테리아(Cornebacteria diphtheriae), 파상풍균(Clostridium tetani), 보르데텔라 펄투시스(Bordetella pertussis), 해모필러스종(Haemophilus spp.,), 클라미디아종(Chlamydia spp.,), 장관 독원성 대장균(Escherichia coli)을 포함하나 이들에 한정하지 않는 박테리아에 의해 유발되거나, 또는 매독 또는 라임병과 박테리아 질병이다.Bacterial diseases that can be treated or prevented by the methods of the present invention include Gram-negative and Gram-positive bacteria, Mycobateria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria species (eg, Neisseria mennigitidis, neisseria gonorrhoeae), Legionella ( legionella, Shigella spp., Vibrio cholerae, Streptococcus pneumoniae, Cornebacteria diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella perlella Syphilis induced or caused by bacteria, including but not limited to, Bossetella pertussis, Haemophilus spp., Chlamydia spp., Intestinal toxin Escherichia coli Or Lyme disease and bacterial disease.
본 발명의 방법에 의해 예방 또는 치료할 수 있는 원생동물 질환에는 말라리아, 아이메리아, 레시마니아, 코크지디오아, 트리마노소마, 곰팡이(예, 캔디다)를포함하나 이에 한정하지 않는 원생동물에 의해 야기된다.Protozoan diseases that can be prevented or treated by the methods of the present invention are caused by protozoa, including but not limited to malaria, eymeria, resimania, coccidioa, trimansomoma, mold (eg, Candida). .
본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 치료약물은 적당한 항생제, 항-진균제, 항-바이러스제 또는 감염의 질병의 치료 또는 예방에 유용한 다른 약물과 결합하여 투여한다.In certain embodiments of the invention, the therapeutic agents of the invention are administered in combination with a suitable antibiotic, anti-fungal, anti-viral or other drug useful for the treatment or prevention of the disease of the infection.
5.3. 유전자 치료법5.3. Gene therapy
유전자 치료법은 항원의 발현과 관련된 질환을 가진 개체에 핵산을 투여하여 이루어지는 질병의 예방 또는 치료를 의미하는데, 상기 항원은 변형된 글로불린 분자가 유도된 면역글로불린에 의해 인식된다. 가령, 질병 또는 질환은 특정 암 또는 종양항원의 발현과 관련된 암, 또는 감염성질병의 특정항원의 발현과 관련된 감염성 질환 또는 감염성 질환병인이 특정 세포 수용체와 결합하는 감염성 질환이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 치료핵산은 세포내(리드 서열없음) 또는 세포내(리드 서열있음) 변형된 면역글로불린을 생산하는 서열을 인코드한다.Gene therapy refers to the prevention or treatment of a disease by administering a nucleic acid to a subject having a disease associated with the expression of an antigen, which antigen is recognized by an immunoglobulin from which the modified globulin molecule is derived. For example, a disease or condition is an cancer associated with the expression of a specific cancer or tumor antigen, or an infectious disease associated with the expression of a specific antigen of an infectious disease or an infectious disease pathogen in combination with a specific cellular receptor. In certain embodiments of the invention, the therapeutic nucleic acid encodes a sequence that produces an intracellular (without lead sequence) or intracellular (with lead sequence) modified immunoglobulin.
유전자 치료방법의 일반적 검토를 위해, Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu 1991, Biocherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217을 참조한다. 사용할 수 있는 재조합 DNA 기술분야에서 일반적으로 공지된 방법은 Ausubel et al., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY에서 제시한다.For a general review of gene therapy methods, see Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu 1991, Biocherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. See 62: 191-217. Methods generally known in the recombinant DNA art that can be used are described in Ausubel et al., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.
또 다른 측면에서, 치료핵산은 변형된 면역글로불린 분자를 발현하는 발현벡터를 포함한다.In another aspect, the therapeutic nucleic acid comprises an expression vector expressing a modified immunoglobulin molecule.
핵산의 환자로의 전달은 직접적일 수 도 있고, 이 경우, 환자는 핵산 또는 핵산-전달 벡터, 또는 전달복합체에 직접 노출되고, 간접적일 수도 있는데, 이 경우 세포는 먼저 시험관내에서 핵산으로 형질전환되고, 이후 환자로 이식된다. 이들 두 방식은 각각, 공지된 생체내 또는 탈체 유전자치료법이다.The delivery of the nucleic acid to the patient may be direct, in which case the patient may be directly exposed to the nucleic acid or nucleic acid-delivery vector, or delivery complex, and indirect, in which case the cell is first transformed with the nucleic acid in vitro. And then transplanted into the patient. Each of these two approaches is known in vivo or ex vivo gene therapy.
특정 구체예에서, 핵산은 집적 생체내로 투여하는데, 이 경우, 이것은 발현되어 항체를 생산한다. 이것은 당분야에 공지된 수많은 방법중 임의의 방법으로 성취할 수 있는데, 예를 들면, 이것을 적당한 핵산 발현벡터의 일부로 작제하고 이를 투여하여 세포내에 위치하도록 하여, 결함성 또는 약독화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용하여(U.S.Patnet No. 4,980,286 참조), 나체 DNA를 직접주사하여, 미세입자 폭발(예, 유전자 총: Biolistic, Dupont)을 사용하여, 지질, 세포-표면 수용체 또는 트랜스펙션 약물로 코팅하여, 생중합체(예, poly-β-1->4-N-아세틸글로코사민 폴리사카라이드; U.S. Patent No. 5,635,493 참조)형태의 캡슐화, 리포좀형태의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 핵에 들어가는 것으로 알려진 펩티드에 이것을 연결하여 투여하거나, 또는 수용체-매개의 엔도사이토시스의 표적리간드에 이것을 연결하여 투여한다(Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). 또 다른 구체예에서, 핵산-리간드 복합체를 만들 수 있는데, 여기서 리간드는 엔도좀을 교란하는 융합원성 바이러스 펩티드를 포함하여 핵산이 리포좀 분해를 피하도록 한다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 특정 수용체를 사용하여 세포 특이적 흡착 및 발현에 대한 생체내 표적화 할 수 있다(PCT Publications WO92/06180 dated April 16, 1992(Wu et al.); WO 92/22635 dated December 23, 1992(Wilson et al.); WO92/20316 dated November 26, 1992(Findeis et al.); WO93/14188 dated July 22, 1993(Young) 참조). 다른 방법으로, 핵산은 상동성 재조합으로, 세포내에 도입하고 발현용 숙주 세포 DNA 사이에 삽입할 수 있다(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438).In certain embodiments, the nucleic acid is administered in an integrated body, in which case it is expressed to produce an antibody. This can be accomplished by any of a number of methods known in the art, for example, by constructing it as part of a suitable nucleic acid expression vector and administering it so that it is placed in the cell, thereby causing a defective or attenuated retrovirus or other Using viral vectors (see US Pat. No. 4,980,286), direct injection of naked DNA, microparticle explosion (e.g., Genel: Biolistic, Dupont), into lipids, cell-surface receptors or transfection drugs Coating to encapsulate in the form of a biopolymer (e.g. poly-β-1-> 4-N-acetylglocosamine polysaccharide; see US Patent No. 5,635,493), encapsulation in the form of liposomes, microparticles, microcapsules, nuclei It is administered by linking it to a known peptide or by linking it to a target ligand of receptor-mediated endocytosis (Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 442). 9-4432). In another embodiment, nucleic acid-ligand complexes can be made, wherein the ligands comprise fusion viral peptides that perturb endosomes to allow nucleic acids to avoid liposome degradation. In another embodiment, nucleic acids can be targeted in vivo for cell specific adsorption and expression using specific receptors (PCT Publications WO92 / 06180 dated April 16, 1992 (Wu et al.); WO 92/22635 dated December 23, 1992 (Wilson et al.); WO 92/20316 dated November 26, 1992 (Findeis et al.); WO 93/14188 dated July 22, 1993 (Young). Alternatively, nucleic acids can be introduced into cells and inserted between host cell DNA for expression by homologous recombination (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et. al., 1989, Nature 342: 435-438.
다른 방법으로, 세포내 에피토오프에 결합하는 중화항체와 같은 단일사슬항체를 또한 투여할 수 있다. 이런 단일사슬항체는 당분야에 공지된 기술을 사용하여 표적세포개체군내 단일사슬항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 발현하여 투여할 수 있다(Marasco et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893Alternatively, single chain antibodies such as neutralizing antibodies that bind to intracellular epitooff can also be administered. Such single chain antibodies can be administered by expressing nucleotide sequences encoding single chain antibodies in a target cell population using techniques known in the art (Marasco et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893
Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503). 아데노바이러스는 유전자치료법에 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터다. 아데노바이러스는 특히 호흡기 에피텔리아에 유전자를 전달할 수 있는 매력적인 운반체로, 이들은 호흡기 상피에서 경미한 질병을 유발한다. 아데노바이러스-기초 전달계에 대한 다른 표적은 간, 중추신경게, 내피 세포, 근육이 된다. 아데노바이러스는 비-분열세포를 감염시킬 수 있다는 장점이 있다. Kozarsky 및 Wilson (1993, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503)은 아데노바이러스-기초 유전자 치료법의 개관을 제시한다. Bout등(1994, Human Gene Therapy 5:3-10)은 레서스 원숭이의 호흡기 에피텔리아로 유전자를 전달하는 방법을 밝힌다. 유전자치료법에 아데노바이러스의 다른 사용예는 Rosenfeld et al., 1991, Science 252:432-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234에서 발견할 수 있다. 아데노-관련 바이러스(AAV) 또한 유전자치료법에 사용이 고려되고 있다(Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med 204:289-300).Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503). Adenoviruses are other viral vectors that can be used for gene therapy. Adenoviruses are particularly attractive carriers for gene transfer to respiratory epithelia, which cause minor diseases in the respiratory epithelium. Other targets for the adenovirus-based delivery system are the liver, central nervous system, endothelial cells, and muscle. Adenoviruses have the advantage of being able to infect non-dividing cells. Kozarsky and Wilson (1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503) provide an overview of adenovirus-based gene therapy. Bout et al. (1994, Human Gene Therapy 5: 3-10) show how to transfer genes to respiratory epithelia in rhesus monkeys. Other examples of use of adenoviruses in gene therapy include Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 432-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. Found at 91: 225-234. Adeno-associated virus (AAV) is also being considered for use in gene therapy (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med 204: 289-300).
사용하기 위한 치료핵산의 형태와 양은 질병의 형태, 원하는 효과의 정도, 환자상태에 따라 달라지며, 당업자가 결정할 수 있다.The type and amount of therapeutic nucleic acid for use depends on the type of disease, the degree of effect desired, the patient's condition, and can be determined by one skilled in the art.
5.3. 백신 조성물 및 투여5.3. Vaccine Compositions and Administration
본 발명은 또한 본 발명의 치료약물을 함유한 백신조성물을 제공하는데, 상기 백신조성물은 특정 항원에 대한 보호면역(체액 및/또는 세포 매개)반응을 유도하기 위한 투여에 적절하다.The present invention also provides a vaccine composition containing the therapeutic drug of the present invention, wherein the vaccine composition is suitable for administration to induce a protective immune (bodily and / or cell mediated) response to a specific antigen.
이런 백신의 적당한 제제는 주사가능물질(액체용액 또는 현탁액)이 포함된다; 주사하기 전에 용해 또는 현탁에 적당한 고형형태로 만들 수도 있다. 제제는 유화시키거나 또는 펩티드는 리포좀형태로 캡슐로 만든다. 활성면역원성 성분은 종종 부형제와 혼합하는데, 상기 부형제는 제약학적으로 수용가능하고, 활성성분과 상보적이다. 적당한 담체에는 물, 식염수, 완충식염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올, 멸균 등장 수용성버퍼, 이들의 화합물이 있다. 또한, 원하는 경우, 백신제제에는 또한 소량의 첨가물질, 예를 들면, 습윤제 또는 유제, pH 완화제, 백신의 효능을 증가시키는 항항원체가 포함된다.Suitable formulations of such vaccines include injectables (liquid solutions or suspensions); It may also be in solid form suitable for dissolution or suspension prior to injection. The formulation is emulsified or the peptide is encapsulated in liposome form. Active immunogenic ingredients are often mixed with excipients, which are pharmaceutically acceptable and complementary to the active ingredient. Suitable carriers include water, saline, buffered saline, glucose, glycerol, ethanol, sterile isotonic water soluble buffers, compounds thereof. In addition, if desired, vaccine formulations also include small amounts of additives, such as wetting or tanning agents, pH relaxants, anti-antibodies that increase the efficacy of the vaccine.
효과적인 항항원체의 예로는 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-nor-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-누-글리세로-3-이드록시포스포릴옥시)-에틸아민을 들 수 있는데, 이들 예에 한정하지 않는다.Examples of effective anti-antigens include aluminum hydroxide, N-acetyl-mural-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramil-L-alanyl-D-isoglutamine , N-acetylmurayl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2- (1′-2′-dipalmitoyl-nu-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)- Although ethylamine is mentioned, It is not limited to these examples.
항항원체의 효능은 특정 항항원체로 만들어진 주사 면역글로불린에 대한 항-유전형 항체의 유도를 측정하여 결정한다.The efficacy of an antiantibody is determined by measuring the induction of anti-genetic antibodies against injected immunoglobulins made of specific antiantibodies.
조성물은 액체용액, 현탁액, 유제, 정제, 알약, 캡슐, 지속방출 제제 또는 분말이 될 수 있다. 경구 조성물에는 제약학적 등급의 만니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘, 스테아르산염, 소디움 사카라이드, 셀룰로즈, 탄산마그네슘과 같은 표준 담체가 포함될 수 있다.The composition may be a liquid solution, suspension, emulsion, tablet, pill, capsule, sustained release formulation or powder. Oral compositions may include standard carriers such as pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium, stearate, sodium saccharide, cellulose, magnesium carbonate.
일반적으로, 성분은 단위약량형태로 개별적으로 또는 혼합하여 제공하는데, 이들의 형태는 밀봉된 용기상의 동결건조 분말 또는 무수 농축물이 되고, 상기 용기의 예로는 활성성분의 양을 지시하는 앰플 또는 사키트를 들 수 있다. 조성물을 주사투여하는 경우, 멸균희석액의 앰플을 제공하여 투여전 성분을 혼합한다.Generally, the ingredients are provided individually or in admixture in unit dosage form, the form of which is a lyophilized powder or anhydrous concentrate on a sealed container, an example of which is an ampoule or yarn indicating the amount of active ingredient. Kits. When the composition is administered by injection, an ampoule of sterile diluent is provided to mix the components before administration.
특정 구체예에서, 동결건조된 본 발명의 변형 면역글루불린은 제 1 용기로 제공하고; 제 2 용기에는 50% 글리세린, 0.25% 페놀, 방부제(예, 0.005% 브릴런트 그린)의 수용성 용액으로 이루어진 희석액이 담겨진다.In certain embodiments, the lyophilized modified immunoglobulin of the present invention is provided in a first container; The second container contains a diluent consisting of an aqueous solution of 50% glycerin, 0.25% phenol and a preservative (eg 0.005% brilliant green).
본 발명은 또한 제약학적 팩 또는 키트를 제공하는데, 이들은 하나 또는 복수의 본 발명 백신조성물 성분으로 채워진 하나 또는 복수용기로 이루어진다. 이런 용기는 제약물 또는 생물학적 산물의 제조, 사용 또는 판매를 조절에 관한 정부당국의 지침을 따르며, 사람에게 투여시 제조, 사용 또는 판매를 주관하는 당국의 승인을 받아야 한다.The invention also provides pharmaceutical packs or kits, which consist of one or more containers filled with one or more of the vaccine composition components of the invention. Such containers follow the guidelines of the governmental authority on controlling the manufacture, use, or sale of pharmaceuticals or biological products, and must be approved by the authority responsible for manufacturing, use, or sale when administered to humans.
원하는 경우, 조성물은 팩 또는 자동판매장치로 제공하는데, 이들은 활성성분을 함유한 하나 또는 복수 단위약량을 보유한다. 팩은 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 조각으로 이루어진다. 픽 또는 자동판매장치는 투여지침을 따른다. 상보적인 제약학적 담체형태로 만들어진 본 발명화합물을 포함한 조성물을 또한 만들어, 적당한 용기에 담고, 지정된 질환치료용 표지한다.If desired, the compositions are provided in packs or vending machines, which contain one or multiple unit doses containing the active ingredient. The pack consists of a piece of metal or plastic, such as a blister pack. Picks or vending machines follow the instructions for administration. Compositions comprising the compounds of the invention in the form of complementary pharmaceutical carriers are also prepared, placed in suitable containers, and labeled for the indicated disease treatment.
백신을 투여하는 개체는 가급적 포유동물, 가장 적절하게는 사람이지만, 사람이외의 동물이 될 수 있는데, 예로는 소, 말, 양, 돼지, 닭(예, 병아리), 염소, 고양이, 강아지, 햄스터, 생쥐 또는 쥐를 들 수 있는데, 이들 예에 한정하지 않는다.The individual receiving the vaccine is preferably a mammal, most suitably a human, but may be other than human, for example cattle, horses, sheep, pigs, chickens (eg chicks), goats, cats, puppies, hamsters. , Mice or rats, but not limited to these examples.
많은 방법을 사용하여 본 발명의 백신조성물을 도입할 수 있다; 이런 방법의 예로는 경구, 대뇌내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내 경로, 방혈(두 갈래로 나눠진 바늘을 사용하여 피부 최상층 긁기), 또는 다른 임의의 면역화 경로를 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다. 특정 구체예에서, 방혈을 사용한다.Many methods can be used to introduce a vaccine composition of the present invention; Examples of such methods include oral, cerebral, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal routes, bleeding (scratching the top layer of skin using a bifurcated needle), or any other immunization route. Although it may be, it is not limited to these examples. In certain embodiments, bleeding is used.
조성물 형태로 사용하는 변형 면역글로불린 분자의 정확한 일일약량은 투여의 경로, 환자의 상태에 따라 달라지는데, 표준임상기술에 따라 의사 및 각 환자의 여건을 고려하여 결정한다. 효과적인 면역량은 백신제제를 투여할 숙주에 변형면역글로불린에 대해 면역반응을 유발하기에 충분한 양이 된다. 효과적 일일약량은 동물모델시험장치에서 얻은 약량-반응곡선으로부터 추정할 수도 있다.The exact daily dose of the modified immunoglobulin molecule used in the form of the composition depends on the route of administration and the condition of the patient, which is determined in consideration of the condition of the physician and each patient according to standard clinical techniques. The effective amount of immunity is an amount sufficient to elicit an immune response against the modified immunoglobulin in the host to which the vaccine is administered. Effective daily doses may be estimated from dose-response curves obtained from animal model testing apparatus.
5.4. 변형면역글로불린을 생산하는 방법.5.4. How to produce modified immunoglobulins.
본 발명의 변형 면역글로불린은 면역글로불린합성을 위해 당분야에 공지된 임의의 방법으로 만들고, 특히 화합합성 또는 재조합발현으로 만들 수 있는데, 가급적 재조합 발현기술로 만든다.The modified immunoglobulins of the present invention can be made by any method known in the art for immunoglobulin synthesis, and in particular by synthetic or recombinant expression, preferably by recombinant expression techniques.
본 발명의 변형면역글로불린, 이의 단편, 유사체 또는 유도체의 재조합 발현은 변형면역글로불린을 인코드한 핵산의 작제를 필요로 한다. 변형면역글로불린의 뉴클레오티드 서열이 공지된 것이라면, 변형면역글로불린을 인코드한 핵산은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 합성하며(Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), 여기에는 간단히 말하면, 변형면역글로불린을 인코드한 서열의 일부분을 보유한 중복 올리고뉴클레오티드의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고 결찰하고, 이후 결찰된 올리고뉴클레오티드를 PCR로 증폭하는 단계가 포함된다.Recombinant expression of the modified immunoglobulins, fragments, analogs or derivatives thereof of the present invention requires the construction of nucleic acids encoding modified immunoglobulins. If the nucleotide sequence of the modified immunoglobulin is known, then the nucleic acid encoding the modified immunoglobulin is synthesized from chemically synthesized oligonucleotides (Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242), in brief hereby referred to as modified immunoglobulin. Synthesis of overlapping oligonucleotides having portions of the sequence encoding the globulin, annealing and ligation of these oligonucleotides, and then amplifying the ligation oligonucleotides by PCR.
다른 방법으로, 변형면역글로불린을 인코드한 핵산은 변형면역글로불린이 유도된 면역글로불린을 인코드한 핵산에서 만든다. 특정 면역글로불린을 인코드한 핵산을 보유한 클론은 얻을 수 없지만, 면역글로불린 분자서열이 공지된 경우, 면역글로불린을 인코드한 핵산은 적당한 출처(항체 cDNA 라이버러리 또는 면역글로불린을 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 만든 cDNA 라이버러리)에서 얻을 수 있는데, 이때 서열의 3'및 5'말단과 혼성화되는 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 혼성화 방법을 이용한다.Alternatively, the nucleic acid encoding the modified immunoglobulin is made from the nucleic acid encoding the immunoglobulin derived from the modified immunoglobulin. Clones bearing nucleic acids encoding specific immunoglobulins cannot be obtained, but if immunoglobulin molecular sequences are known, nucleic acids encoding immunoglobulins may be derived from a suitable source (antibody cDNA library or any tissue or cell expressing immunoglobulin). CDNA library) can be obtained using PCR amplification using synthetic primers that hybridize with the 3 'and 5' ends of the sequence or hybridization methods using oligonucleotide probes specific for a specific gene sequence.
특이적으로 특정항원을 인식하는 면역글로불린 분자를 입수할 수 없는 경우(또는 이런 면역글로불린을 인코드한 핵산을 클로닝할 cDNA 라이버러리 소스가 없는 경우), 특정 항원에 특이적인 면역글로불린은 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 토끼와 같은 동물을 면역화시키는 방법, 다클론항체를 만드는 방법, 좀더 바람직하게는 다클론항체를 만드는 방법으로 만든다(Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497; Kozbon et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al.(1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). 다른 방법으로, 면역글로불린의 적어도 Fab부분을 인코드한 클론은 특정 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론에 대한 Fab 발현 라이버러리를 선별하여(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) 또는 항체 라이버러리를 선별하여(Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937) 얻을 수 있다.If an immunoglobulin molecule that specifically recognizes a particular antigen is not available (or there is no cDNA library source for cloning a nucleic acid encoding such immunoglobulin), immunoglobulins specific for a particular antigen are known in the art. Methods, for example, immunization of animals such as rabbits, polyclonal antibodies, and more preferably polyclonal antibodies (Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495-497). Kozbon et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al. (1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) .Alternatively, at least the immunoglobulin Clones encoding the Fab moiety can be selected by selecting Fab expression libraries for clones of Fab fragments that bind to specific antigens (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) or by selecting antibody libraries (Clackson et al). ., 1991, Nature 352: 62 4; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937.
일단 면역글로불린의 적어도 변이도메인을 인코드한 핵산은 얻은 후에는. 이들 임의의 적당한 클로닝 벡터로 도입하고, 면역글로불린 분자의 일정영역을 인코드한 뉴클레오티드를 보유한 벡터로 도입한다(PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication WO 89/01036; U.S. Patent No. 5,122,464; and Bebbington, 1991, Methods in Enzymology 2:136-145). 완전항체분자의 발현을 가능하게 하는 핵산과의 공동발현용 완전 L 또는 H사슬을 보유한 벡터 또한 사용가능하다. 이후, 면역글로불린을 인코드한 핵산은 변형하여 뉴클레오티드 치환 또는 결손을 도입하는데, 이것은 임의 다른 원하는 아미노산의 치환, 결손 또는 삽입과 함께, 사슬사이 이황화결합에 참여하는 하나 또는 복수 변이영역 시스테인 잔기를 SH기를 갖지 않는 아미노산잔기로 치환하기 위하여 필요하다. 이런 변형은 뉴클레오티드에 특정 돌연변이 또는 결손의 도입을 위해 당분야에 공지된 임의의 방법으로 실시할 수 있는데, 이런 방법의 예로 화학돌연변이, 시험관내 특정부위 돌연변이유발(Hutchinson et al., 1979, J. Biol. Chem. 253:6551), PCR 기초한 방법을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.Once the nucleic acid encoded at least the variant domain of immunoglobulin was obtained. Any suitable cloning vector is introduced and a region of the immunoglobulin molecule is introduced into a vector containing encoded nucleotides (PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication WO 89/01036; US Patent No. 5,122,464; and Bebbington , 1991, Methods in Enzymology 2: 136-145. Vectors containing complete L or H chains for co-expression with nucleic acids that allow expression of complete antibody molecules are also available. The nucleic acid encoding the immunoglobulin is then modified to introduce nucleotide substitutions or deletions, which, together with substitutions, deletions or insertions of any other desired amino acids, SH one or multiple variant region cysteine residues that participate in disulfide bonds between the chains. It is necessary to substitute with an amino acid residue having no group. Such modifications can be carried out by any method known in the art for the introduction of specific mutations or deletions in nucleotides, such as chemical mutations, in vitro mutagenesis (Hutchinson et al., 1979, J. Biol. Chem. 253: 6551) and PCR-based methods, but not limited to these examples.
또한, 적당한 생리활성의 사람항체분자에서 얻은 유전자와 적당한 항원특이성의 생쥐 항체 분자로부터 얻은 유전자를 결합시켜 키메라 항체를 생산하는 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)을 또한 이용할 수 있다. 전술한 바와 같이, 키메라 항체는 다른 부분이 상이한 동물종에서 유도된 분자로, 예로는 뮤린 단클론항체에서 유도한 변이영역 및 사람면역글로불린으로부터 유도한 일정영역(예, 인체에 적응한 항체)을 갖는 것을 들 수 있다.In addition, a technique for producing chimeric antibodies by combining genes obtained from human antibody molecules with appropriate bioactivity with genes derived from mouse antibody molecules having appropriate antigen specificity (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454. As described above, chimeric antibodies are molecules derived from different species of animals, for example, murine monoclonal antibody-derived mutation regions and human immunoglobulins derived from certain regions (e.g., antibodies adapted to the human body). It can be mentioned.
다른 방법으로, 단일사슬항체 생산을 위한 기술(U.S. Patent 4,694,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-54)을 변형하여 단일사슬항체를 만들 수 있다. 단일사슬항체는 아미노산 브릿지를 통해 Fv 영역의 H사슬과 L사슬을 연결시켜 만들고, 이를 통해, 단일사슬 폴리펩티드가 생성된다. 대장균(E. coli)에서 기능적 Fv 단편의 조합기술을 또한 사용할 수 있다(Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).Alternatively, techniques for the production of single chain antibodies (US Patent 4,694,778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54) can be modified to produce single chain antibodies. Single chain antibodies are made by connecting the H and L chains of the Fv region through an amino acid bridge, thereby producing a single chain polypeptide. Combination techniques of functional Fv fragments in E. coli can also be used (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041).
특정 에피토오프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술로 만든다. 가령, 이런 단편에는 항체분자의 펩신절단에 의해 만들어 질 수 있는 F(ab')2단편, F(ab')2단편의 이황화결합을 환원시켜 만들어지는 Fab 단편이 있지만, 이들에 한정하지 않는다.Antibody fragments that recognize specific epitopes are made by known techniques. For example, such fragments include, but are not limited to, F (ab ') 2 fragments, Fab fragments made by reducing disulfide bonds of F (ab') 2 fragments, which can be made by pepsin cleavage of antibody molecules.
일단 본 발명의 변형 면역글로불린분자를 인코드한 핵산이 얻어지면, 면역글로불린분자 생산용 벡터는 당분야에 공지된 기술을 이용한 재조합 DNA기술로 만든다. 변형 면역글로불린 분자는 이후 재조합발현하고 당분야에 공지된 임의의 방법(예, 섹션 6에서 밝힌 방법)으로 분리한다(Bebbington, 1991, Methods in Enzymology 2:136-145, 참조). 간단히 말하면, COS 세포 또는 다른 임의의 적당한 배양세포는 변형면역글로불린을 인코드한 발현벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 트랜스펙션시키고, 적당한 기간동안 배양하여 면역글로불린을 발현시키고, 이후 상청액을 COS 세포에서 수거하는데, 이때 상청액은 분비된, 발현변형된 면역글로불린을 보유한다.Once the nucleic acid encoding the modified immunoglobulin molecule of the present invention is obtained, the vector for producing immunoglobulin molecule is made by recombinant DNA technology using techniques known in the art. The modified immunoglobulin molecule is then recombinantly expressed and isolated by any method known in the art (eg, the method identified in section 6) (see Bebbington, 1991, Methods in Enzymology 2: 136-145,). In brief, COS cells or any other suitable cultured cell are transiently or non-temporarily transfected with an expression vector encoding modified immunoglobulin, incubated for a suitable period of time to express immunoglobulin, and then the supernatant is COS The cells are harvested, wherein the supernatant retains secreted, modified immunoglobulins.
당업자에게 공지된 방법을 이용하여 면역글로불린 분자 코딩서열, 적당한 전사 및 해독조절시그널을 보유한 발현벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성기술, 생체내 유전재조합이 포함된다. Sambrook등(1990, Molecular Cloning. A. Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) and Ausubel et al.(eds, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY)이 제시한 기술을 참고한다.Methods known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors carrying immunoglobulin molecular coding sequences, appropriate transcriptional and translational control signals. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, and in vivo genetic recombination. Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning. A. Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) and Ausubel et al. (Eds, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY See the description given by).
발현벡터는 통상적인 기술로 숙주세포로 이전하고, 트랜스펙션된 세포는 통상적인 방법으로 배양하여 본 발명의 면역글로불린을 만든다.Expression vectors are transferred to host cells by conventional techniques, and the transfected cells are cultured by conventional methods to produce the immunoglobulins of the present invention.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기 위하여 사용한 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)과 같은 박테리아세포, 또는 가급적 진핵세포, 특히 전체 재조합 면역글로불린분자의 발현을 위한 세포가 된다. 특히, 중국 햄스터 난소세포(CHO)와 같은 포유동물세포는 사람시토메갈로바이러스의 주요 중간단계 초기유전자 프로모터 인자와 같은 벡터와 결합시키는데, 면역글로불린에 대한 유용한 발현계가 된다(Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).The host cell used for expressing the recombinant antibody of the present invention is a bacterial cell such as Escherichia coli, or preferably a eukaryotic cell, particularly a cell for the expression of the whole recombinant immunoglobulin molecule. In particular, mammalian cells, such as Chinese hamster ovary cells (CHO), bind to vectors such as the major intermediate early gene promoter factor of human cytomegalovirus, which is a useful expression system for immunoglobulins (Foecking et al., 198, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio / Technology 8: 2).
다양한 숙주-발현벡터계를 사용하여 본 발명의 변형면역글로불린분자를 발현한다. 이런 숙주-발현계는 관심있는 코딩서열을 생산되고 연이어 정제되는 담체를 나타내지만, 또한 적당한 뉴클레오티드 코딩서열로 형질전환되거나 또는 트랜스펙션된 경우에 in situ에서 본 발명의 면역글로불린분자를 발현하는 세포를 나타내기도 한다. 이들에는 면역글로불린 코딩서열을 보유한 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현벡터에 의해 형질전환된 박테리아(E. coli, B. subtilis); 면역글로불린 코딩서열을 보유한 재조합 효모 발현벡터에 의해 형질전환된 효모(Saccharomyces, Pichia); 면역글로불린 코딩서열을 보유한 재조합 바이러스 발현벡터(예, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충세포; 재조합 바이러스 발현벡터(에, 카룰리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 면역글로불린 코딩서열을 보유한 재조합 플라스미드 발현벡터(에, Ti 플라스미드)로 감염된 식물세포계; 또는 포유동물세포의 게놈에서 유도한 프로모터(예, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스에서 유도한 프로모터(예, 아데노바이러스 후프로모터, 두진 바이러스 7.5K 프로모터)를 보유한 재조합 발현 구성체를 갖는 포유동물세포계(예, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)가 있다.Various host-expression vector systems are used to express the modified immunoglobulin molecules of the present invention. Such host-expression systems exhibit carriers that produce and subsequently purify the coding sequence of interest, but also express the immunoglobulin molecule of the invention in situ when transformed or transfected with the appropriate nucleotide coding sequence. Also indicates. These include bacteria (E. coli, B. subtilis) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA or cosmid DNA expression vectors carrying an immunoglobulin coding sequence; Yeast (Saccharomyces, Pichia) transformed by a recombinant yeast expression vector carrying an immunoglobulin coding sequence; Insect cells infected with a recombinant virus expression vector (eg, baculovirus) having an immunoglobulin coding sequence; Plant cell lines infected with a recombinant viral expression vector (e.g., cauliflower mosaic virus, CaMV; tobacco mosaic virus, TMV) or a recombinant plasmid expression vector (e.g. Ti plasmid) carrying an immunoglobulin coding sequence; Or a mammal having a recombinant expression construct with a promoter derived from the genome of a mammalian cell (e.g., a metallothionein promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (e.g., an adenovirus post-promoter, a duplex virus 7.5K promoter) Cell lines (eg, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 cells).
박테리아계에서, 다수의 발현벡터는 발현될 면역글로불린 분자에 대한 사용목적에 따라 우선적으로 선택된다. 가령, 면역글로불린 분자의 제약학적 조성물의 생산을 위해 이런 단백질을 대량으로 생산하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질산물의 고수준발현을 조절하는 벡터가 바람직하다. 이런 벡터에는 대장균 발현벡터 pUR278(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)을 예를 들 수 있는데, 여기서 면역글로불린 코딩 서열은 lac Z 코딩영역을 통해 개별로 벡터프레임으로 결찰되어 융합 단백질이 만들어진다: PIN 벡터(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509. pGEX 벡터를 사용하여 외래 폴리펩티드를 글루타티온 S-전이효소(GST)를 가진 융합단백질로 발현한다. 일반적으로, 이런 융합 단백질은 수용성이고, 용해된 세포로부터 쉽게 정제할 수 있는데, 이때, 흡수하고 메트릭스 글르타티온-아가로즈 비드에 결합시키고 자유 글루타티온의 존재하에 용출과정을 거친다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 인자 프로테아제 절단부위를 포함하도록 고안하여, 클론된 표적유전자산물이 GST 부분에서 떨어지도록 한다.In bacterial systems, a number of expression vectors are preferentially selected depending on the intended use for the immunoglobulin molecule to be expressed. For example, when producing such proteins in large quantities for the production of pharmaceutical compositions of immunoglobulin molecules, vectors that control the high level expression of fusion protein products that are readily purified are desirable. Such vectors include Escherichia coli expression vector pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), wherein the immunoglobulin coding sequence is individually ligated into a vector frame through the lac Z coding region and is a fusion protein. This is made: PIN vector (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509. It is expressed as a fusion protein with S-transferase (GST) In general, these fusion proteins are water soluble and can be easily purified from lysed cells, which absorb and bind to matrix glutathione-agarose beads Elution is carried out in the presence of free glutathione The pGEX vector is designed to contain a thrombin or factor Xa protease cleavage so that the cloned target gene product falls from the GST moiety.
곤충계에서, 오토그래파 칼리포르니카(Autographa californica)핵 다면체 바이러스(AcNPV)를 벡터로 사용하여 외래 유전자를 발현시킨다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)에 키운다. 면역글로불린 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 부위로 개별클론하고, AcNPV 프로모터(예, 다면체 프로모터)의 조절하에 둔다.In the insect system, Autographa californica nuclear polyhedron virus (AcNPV) is used as a vector to express foreign genes. The virus is grown in Spodoptera frugiperda. Immunoglobulin coding sequences are individually cloned into non-essential sites of the virus and placed under the control of an AcNPV promoter (eg, polyhedral promoter).
포유동물 세포에서, 다수의 바이러스-기초 발현계를 사용한다. 아데노바이러스를 발현벡터로 사용하는 경우, 관심있는 면역글로불린 코딩서열은 아데노바이러스 전사/해독 컨트롤 복합체(예, 후프로모터, 삼자 리드서열)에 결찰시킨다. 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합으로 이후 아데노바이러스 게놈에 삽입한다. 바이러스 게놈의 비-필수영역(예, E1 또는 E2 영역)에 삽입하면, 생존하고, 감염된 숙주에서 면역글로불린분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스가 만들어진다(Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359). 특정 개시시그널은 삽입된 면역글로불린 코딩서열의 효율적인 해독을 위해 필요하다. 이들 시그널에는 ATG 개시코돈 및 인접서열이 포함된다. 또한 개시코돈은 원하는 코딩서열의 해독틀과 보조를 맞추어 전체 삽입체의 해독이 일어나도록 한다. 이들 외인성 해독컨트롤 시그널은 및 개시 코돈은 다양한 출처(자연, 인공)에서 얻을 수 있다. 발현의 효율은 적당한 전사강화인자, 전사종결체등의 삽입으로 강화할 수 있다(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:51-544 참조).In mammalian cells, a number of virus-based expression systems are used. When adenovirus is used as the expression vector, the immunoglobulin coding sequence of interest is ligated to the adenovirus transcriptional / detoxification control complex (e.g. post-promoter, trilateral lead sequence). This chimeric gene is subsequently inserted into the adenovirus genome by in vitro or in vivo recombination. Insertion into non-essential regions (eg, E1 or E2 regions) of the viral genome results in recombinant viruses that survive and are capable of expressing immunoglobulin molecules in infected hosts (Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359). Certain initiation signals are required for efficient translation of inserted immunoglobulin coding sequences. These signals include ATG start codons and contiguous sequences. Initiation codons also keep pace with the translation framework of the desired coding sequence so that the entire insert is translated. These exogenous detox control signals and initiation codons can be obtained from various sources (natural, artificial). The efficiency of expression can be enhanced by the insertion of appropriate transcription enhancers, transcription terminators, etc. (see Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).
또한, 숙주세포계통은 삽입된 서열의 발현하고, 원하는 특정형식으로 유전자산물을 변형하고 조절하는 것으로 선택한다. 단백질산물의 이런 변형(예, 당부가) 및 가공(예, 절단)은 단백질의 기능에 중요하다. 상이한 숙주세포는 해독후 과정 및 단백질 및 유전자산물의 변형에 대한 특징적이고 특이적인 기작을 갖는다. 적당한 세포계 또는 숙주계를 선택하여 외래 발현단백질의 정확한 변형 및 가공을 가능하게 한다. 이런 목적을 위하여, 일차 전사체의 적절한 가공, 당부가, 유전자산물의 인산화를 위한 세포기작을 보유한 진핵숙주세포를 사용한다. 이런 포유동물숙주세포에는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38이 포함되나, 이들에 한정하지 않는다.In addition, the host cell line is selected to express the inserted sequence and to modify and regulate the gene product in the specific format desired. Such modifications (eg, sugar additions) and processing (eg, cleavage) of protein products are important for the function of the protein. Different host cells have characteristic and specific mechanisms for the post-translational process and for modification of proteins and gene products. Appropriate cell or host systems are selected to allow for the correct modification and processing of foreign expression proteins. For this purpose, eukaryotic host cells with appropriate processing, sugar addition, and cellular mechanisms for phosphorylation of gene products are used. Such mammalian host cells include, but are not limited to, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38.
재조합 단백질의 장기간, 고-산출율의 생산을 위해, 적당한 발현이 선호된다. 가령, 안정적으로 면역글로불린 분자를 발현하는 세포계는 가공한다. 바이러스 기원의 복제를 보유한 발현벡터를 사용하기보다는 숙주세포는 적당한 발현조절인자(예, 프로모터, 증강체, 서열, 전사종결체, 폴리아데닐화 부위등) 및 선택성 마크로 조절한 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 외래 DNA의 도입후, 가공한 세포는 완전배지에서 1-2일 생장시키고, 이후 선택성 배지로 옮긴다. 재조합 플라스미드상의 선택성 마크는 선택성에 대한 저항력을 제공하고 세포가 안정적으로 플라스미드를 크로모좀으로 통합하게 하여 병소를 형성하게 하고, 상기 병소는 이후에 클론하고 세포계로 확대할 수 있다. 이 방법은 면역글로불린 분자를 발현하는 세포계를 가공하기 위하여 우선적으로 사용한다. 이렇게 가공된 세포계는 특히 면역글로불린 분자와 직간접적으로 상호작용하는 화합물의 선별 및 평가에 유용하다.For long-term, high-yield production of recombinant proteins, proper expression is preferred. For example, cell systems that stably express immunoglobulin molecules are processed. Rather than using expression vectors with replication of viral origin, host cells can be transformed with DNA regulated with appropriate expression regulators (e.g., promoters, enhancers, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) and selectivity marks. have. After introduction of the foreign DNA, the processed cells are grown 1-2 days in complete medium and then transferred to selective medium. Selectivity marks on the recombinant plasmids provide resistance to selectivity and allow cells to stably integrate the plasmid into the chromosomes to form lesions, which can then be cloned and expanded into the cell line. This method is used preferentially to process cell lines expressing immunoglobulin molecules. This processed cell line is particularly useful for the selection and evaluation of compounds that interact directly or indirectly with immunoglobulin molecules.
다수의 선별계를 사용하는데, 이들의 예로 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 히폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 192, Proc. NA시. Acad. Sci. USA 48:202), 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., 1980, Cell 22:817) 유전자는 각각 tk-, hgprt-또는 aprt-세포에 사용할 수 있다. 또한, 대사길항물질 저항성은 다음 유전자들의 선별기초로 사용할 수 있다: 메토프렉세이트에 대한 저항성을 공여하는 경우, dhfr(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코피놀산에 대한 저항성을 공여하는 경우, gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 저항성을 공여하는 경우, neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann, Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann, Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215). 사용할 수 있는 재조합 DNA 기술에 공지된 방법은 Ausubel et al.(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Bioloby, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1에서 제시한다.Multiple screening systems are used, examples of which are herpes simplex virus thymidine kinase (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Szybalska & Szybalski, 192, Proc. NA Acad. Sci. USA 48: 202), adenine phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817) genes can be used for tk − , hgprt − or aprt − cells, respectively. In addition, metabolite resistance can be used as the basis for selection of the following genes: dhfr (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O, when conferring resistance to methotrexate). Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); Gpt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072) when conferring resistance to mycofinolic acid; When conferring resistance to aminoglycoside G-418, neo (Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu and Wu, 1991, biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann, Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann, Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5): 155-215). Methods known in the recombinant DNA technology that can be used are described in Ausubel et al. (Eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Bioloby, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY .; colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. Presented at 150: 1.
다른 방법으로, 임의의 융합 단백질은 발현되는 융합단백질에 특이적인 항체를 사용하여 쉽게 정제한다. 가령, Janknecht등이 밝힌 시스템을 통해 사람 세포계에서 발현된 비-변성된 융합단백질의 쉽게 정제할 수 있다(Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). 이 시스템에서, 관심있는 유전자는 우두 재조합 플라스미드로 소클론시켜 유전자의 개방 해독틀이 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 아미노-말단태그에 해독융합하도록 한다. 상기 태그는 융합 단백질에 대한 결합도메인모체 역할을 한다. 재조합 우두 바이러스로 감염된 세포에서 얻은 추출물은 Ni2+니트릴로아세트산-아가로즈 칼럼으로 적하하고, 히스티딘-태그 단백질은 이미다졸-포함 버퍼로 선택적 용출한다.Alternatively, any fusion protein is readily purified using antibodies specific for the fusion protein expressed. For example, Janknecht et al. Can readily purify non-denatured fusion proteins expressed in human cell systems (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-897). In this system, the gene of interest is so cloned with the vaccinia recombinant plasmid such that the open translation frame of the gene is fused to an amino-terminal tag consisting of six histidine residues. The tag serves as a binding domain to the fusion protein. Extracts obtained from cells infected with recombinant vaccinia virus were loaded onto a Ni 2+ nitriloacetic acid-agarose column and the histidine-tag protein was eluted selectively with imidazole-containing buffer.
면역글로불린 분자의 발현수준은 벡터증폭으로 증가시킬수 있다(Bebbington and Hentschel, the Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning, Vol.3.(Academic Press, New York, 1987 )참조). 면역글로불린을 발현하는 벡터계상의 마크가 증폭가능한 경우, 숙주 세포의 배양시 존재하는 억제물질의 수준증가로 의해 마크 유전자의 사본수가 증가한다. 증폭된 영역은 면역글로불린 유전자와 연관하기 때문에, 면역글로불린의 생산 또한 증가한다(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).Expression levels of immunoglobulin molecules can be increased by vector amplification (Bebbington and Hentschel, the Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987). When the mark on the vector line expressing an immunoglobulin is amplifiable, the number of copies of the mark gene is increased due to the increase in the level of inhibitor present in the culture of the host cell. Since the amplified region is associated with an immunoglobulin gene, the production of immunoglobulin also increases (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
숙주세포는 본 발명의 두 개의 발현벡터, H 사슬 유도의 폴리펩티드를 인코드한 제 1 벡터 및 L 사슬 유도 폴리펩티드를 인코드한 제 2 서열로 공동트랜스펙션시킨다. 두 개의 벡터는 H 및 L 사슬 폴리펩티드의 동등하게 발현시키는 동일한 선택성 마크를 보유한다. 다른 방법으로, H 및 L 사슬 폴리펩티드를 모두 인코드한 단일벡터를 사용한다. 이런 경우에서, L 사슬은 H 사슬앞에 위치하여 독성 자유 H사슬의 과도하게 많아지는 것을 피한다(Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). H 및 L 사슬에 대한 코딩서열은 cDNA 또는 게놈 DNA로 이루어진다.The host cell is cotransfected with two expression vectors of the invention, a first vector encoding H chain induction polypeptide and a second sequence encoding L chain induction polypeptide. Both vectors carry the same selectivity mark, which expresses equally H and L chain polypeptides. Alternatively, a single vector encoding both H and L chain polypeptides is used. In this case, the L chain is located in front of the H chain to avoid excessive increases in toxic free H chains (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197). . Coding sequences for H and L chains consist of cDNA or genomic DNA.
일단 본 발명의 변형면역글로불린이 재조합발현되면, 이것은 면역글로불린 정제를 위해 당분야에 공지된 임의의 방법으로 정제하는데, 이런 방법에는 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A와 유사한 특정 항원에 대한 친화도, 칼럼크기 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차이 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준기술이 있다.Once the modified immunoglobulins of the present invention are recombinantly expressed, they are purified by any method known in the art for immunoglobulin purification, which involves chromatography (e.g., ion exchange, affinity, in particular similar to protein A). Affinity for the antigen, column size chromatography), centrifugation, solubility difference or any other standard technique for protein purification.
5.5. 치료요법적 용도의 입증5.5. Demonstration of therapeutic use
본 발명의 변형항체는 특정질환의 치료 또는 예방에서 다양한 효능으로 선별하고 분석할 수 있다.Modified antibodies of the present invention can be selected and analyzed with various efficacy in the treatment or prevention of specific diseases.
먼저, 본 발명의 변형항체를 함유한 백신조성물의 면역능력은 백신면역화후 실험동물의 항-유전형반응을 모니터하여 결정할 수 있다. 체액반응의 발생은 전신적인 면역반응의 징후로 받아들이는데, 이의 다른 요th, 특히 세포-매개의 면역은 질병으로부터의 보호에 중요하다. 실험동물에는 생쥐, 토끼, 침팬지, 종국적으로는 사람개체가 포함된다. 본 발명에서 만들어진 백신은 실험적으로 침팬지를 감염시키도록 만들 수 있다. 하지만, 침팬지는 보호 동물종이기 때문에, 침팬지 효능연구에 사용할 하나 또는 복수의 최적면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 최적화합물을 발견할 목적으로, 본 발명 백신에 대한 항체 반응은 먼저 다수의 더 작고 값싼 동물에 연구할 수 있다.First, the immune capacity of the vaccine composition containing the modified antibody of the present invention can be determined by monitoring the anti-genetic response of the experimental animals after vaccine immunization. The development of a humoral response is taken as a sign of a systemic immune response, the other of which is important for protection from disease, especially cell-mediated immunity. Experimental animals include mice, rabbits, chimpanzees and, ultimately, human subjects. The vaccine made in the present invention can be experimentally made to infect chimpanzees. However, because chimpanzees are protected animal species, the antibody response to the vaccines of the present invention is first described in order to find one or more optimal immunoglobulin molecules or optimal compounds for immunoglobulin molecules for use in chimpanzee efficacy studies. Can study on animals.
실험개체의 면역반응은 공지된 기술, 예를 들면, 효소-면역흡착법(ELISA), 면역블랏, 방사성면역침전, 또는 감염으로부터 보호 또는 면역화된 숙죽에서 질병증상의 약독화를 사용하여, 항체에 대한 생성 면역혈청의 반응성과 같은 다양한 방식으로 분석한다.The immune response of the test subject is known against antibodies by using known techniques, such as enzyme-immunoassay (ELISA), immunoblot, radioimmunoprecipitation, or attenuation of disease symptoms in protected or immunized porridge. Analyze in a variety of ways, such as the reactivity of the generated immune serum.
적당한 동물실험의 한 예로서, 본 발명의 백신조성물은 변형면역글로불린분자에 대한 항-유전형 반응의 유도능력을 토끼에서 시험한다. 가령, 수컷 특이적-병원균-무(無)(SPF) 어린 뉴우질랜드 백색 어른 토끼를 사용한다. 토끼 실험그룹은 각각 백신효과량을 섭취하였다. 토끼 컨트롤 그룹에 자연발생 항체를 함유한 백신의 1 mM Tris-HCl(pH 9.0)를 주사한다. 혈액샘플은 1주 또는 2주 단위로 토끼로부터 채취하고, 혈청은 변형면역글로불린에 대한 항-유전형 항체 및 방사성면역분석(Abbort Laboratories)을 사용하여 변형항체를 직접 유도된 항원에 특이적인 항-항-유전형항체에 대해 분석한다. 항-유전형 항체의 존재는 ELISA를 이용하여 분석한다. 토끼는 비근교계 성질로 인해 다양한 반응을 보이기 때문에, 생쥐에서 백신을 시험하는 것이 유용하다.As an example of a suitable animal experiment, the vaccine composition of the present invention is tested in rabbits for the ability to induce anti-genetic responses to modified immunoglobulin molecules. For example, male specific-pathogen-free (SPF) young New Zealand white adult rabbits are used. The rabbit experimental group each ingested an effective amount of vaccine. The rabbit control group is injected with 1 mM Tris-HCl (pH 9.0) of a vaccine containing naturally occurring antibodies. Blood samples are taken from rabbits on a weekly or two-week basis, and serum is derived from anti-genetic antibodies against modified immunoglobulins and anti-antibodies specific for antigens directly directed to the modified antibodies using Abbort Laboratories. Analyze genotype antibodies The presence of anti-genetic antibodies is analyzed using ELISA. Because rabbits have a variety of responses due to their non-negative nature, it is useful to test vaccines in mice.
또한, 본 발명의 변형항체는 먼저 실험개체(동물 또는 사람)에 변형항체를 투여하고, 이후 주사된 변형된 항체에 대한 항-유전형 반응의 일부로서 만들어진 항-항-유전형 항체(즉, Ab3 항체)를 분리하여 시험한다. 분리된 Ab3은 이후 당분야에 공지된 임의의 면역분석으로 특정항원(예, 종양항원, 감염성 질병병인의 항원)에 대한 결합능력을 시험하였는데, 이런 면역분석의 예로는 방사성면역분석, ELISA, "샌드위치"면역분석, 겔 확산 침전반응, 면역확산분석, 웨스턴블랏, 침강반응, 응집반응분석, 보체고정분석, 면역형광분석, 단백질 A 분석, 면역전기영동 분석을 들 수 있지만, 이들 예에 한정하지 않는다.In addition, the modified antibodies of the present invention are first administered to a test subject (animal or human), and then an anti-anti-genetic antibody (ie, an Ab3 antibody) made as part of an anti-genetic response to the injected modified antibody. Test separately. The isolated Ab3 was then tested for binding to specific antigens (eg tumor antigens, antigens of infectious diseases) by any immunoassay known in the art. Examples of such immunoassays include radioimmunoassay, ELISA, " Sandwich "immunoassay, gel diffusion precipitation reaction, immunodiffusion analysis, western blot, sedimentation reaction, aggregation reaction analysis, complement fixation analysis, immunofluorescence analysis, protein A analysis, immunoelectrophoresis analysis, but not limited to these examples Do not.
변형항체가 암 또는 종양에 직접 투여되는 경우에, 분리된 Ab3의 암, 종양 또는 다른 신생종양 질병에 대한 치료효능은 환자로부터 암 또는 종양을 배양하고, 세포를 실험할 Ab3 항체와 접촉시키고, Ab3 항체와 접촉시킨 세포의 증식 또는 생장과 Ab3 항체와 접촉시키지 않은 세포의 증식 또는 생장을 비교하여 선별하고, 여기서 접촉시킨 세포의 훨씬 낮은 수준의 증식 또는 생장은 Ab3 항체(본 발명의 변형항체 면역화에 의해 유도됨)가 환자의 암치료에 효과적임을 암시한다. 당분야에 많은 표준분석을 이용하여 이러 생존 또는 생장을 평가하였다; 가령, 세포 증식은When the modified antibody is administered directly to a cancer or a tumor, the therapeutic effect of the isolated Ab3 against cancer, tumor or other neoplastic disease may be achieved by culturing the cancer or tumor from the patient, contacting the cells with the Ab3 antibody to be tested, Ab3 The proliferation or growth of cells in contact with the antibody is selected by comparing the proliferation or growth of cells not in contact with the Ab3 antibody, wherein much lower levels of proliferation or growth of the cells in contact are selected from the Ab3 antibody (modified antibody immunization of the present invention). Induced) is effective for treating cancer in patients. Many standard assays in the art have been used to assess this survival or growth; For example, cell proliferation
3H-티미딘 삽입의 평가, 직접 세포계수, 프로토-종양유전자와 같은 공지된 유전자의 전사활성변화의 감지 또는 세포 사이클 마크로 평가할 수 있다; 세포 생존은 트리판 블루 염색으로 평가할 수 있고, 분화는 형태변화에 기초하여 평가할 수 있다. 변형된 항체가 감염성 질병병인의 항원에 대하여 직접 유도되는 경우, 분리된 Ab3은 특정 병원균에 대한 임의의 시험관내 활성검사에서 활성을 시험한다.Assessment of 3 H-thymidine insertions, direct cell counts, detection of changes in transcriptional activity of known genes such as proto-tumor genes, or cell cycle marks; Cell survival can be assessed by trypan blue staining and differentiation can be assessed based on morphological changes. If the modified antibody is directly directed against the antigen of the infectious disease agent, the isolated Ab3 is tested for activity in any in vitro activity test for the particular pathogen.
또한, 본 발명의 변형항체는 생체내에서 직접 시험한다. 본 발명의 치료약물의 효과를 모니터하기 위하여, 변형된 항체가 목표로 하는 항원의 수준은 치료 전, 동안, 후에 적당한 시간간격을 두고 측정한다. 항원양의 변화 또는 변화부재는 확인할 수 있고, 개체에 대한 치료효과와 연관한다.In addition, the modified antibodies of the present invention are tested directly in vivo. In order to monitor the effects of the therapeutic agents of the present invention, the level of antigen targeted by the modified antibody is measured at appropriate time intervals before, during and after treatment. Changes or absence of changes in antigenic amounts can be identified and associated with therapeutic effects on the subject.
특히, 암치료의 경우에, 항원의 혈청수준은 암(에 유방암)의 정도, 서투른 예후와 직접 상관관계를 갖는다. 일반적으로, 항원수준의 감소는 효과적인 치료와 연관한다.In particular, in the case of cancer treatment, the serum level of the antigen has a direct correlation with the degree of cancer (e.g. breast cancer), poor prognosis. In general, reduction of antigen levels is associated with effective treatment.
변형항체가 감염성 질병병인의 항원을 목표로 하여 만들어지는 경우, 변형항체의 효능은 감염성 질환병인의 항원수준을 치료 전, 동안, 후에 적당한 시간간격을 두고 측정하여 모니터할 수 있는데, 여기서 항원 수준의 감소 변형항원이 효과적임을 암시한다.If the modified antibody is directed against an antigen of an infectious disease agent, the efficacy of the modified antibody can be monitored by measuring the antigenic level of the infectious disease agent at appropriate time intervals before, during and after treatment, wherein It suggests that the reduced modifying antigen is effective.
적절한 측면에서, 취할 수 있는 방법은 상이한 시점에서 항원의 수준을 결정하여 기저수준과 이들 수준을 비교하는 것이다. 기저 수준은 정상적인 질병없는 개체에서 존재하는 마크수준이 될 것이다; 치료전 존재수준, 질병의 호전동안 또는 안정기간동안. 이들 수준은 질병과정 또는 치료결과와 상관관계를 갖질 수 있다.In an appropriate aspect, a method that can be taken is to determine the levels of antigen at different time points and compare these levels with the basal level. The basal level will be the mark level present in normal disease-free individuals; Pre-treatment level, during disease improvement or during stability. These levels can be correlated with disease course or treatment outcome.
항원수준은 당분야에 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있다. 가령, 특정 항원은 웨스턴 블라팅 면역침강과 같은 공지된 면역진단방법으로 정량화할 수 있는, 상기 방법에서는 특정 항원에 대한 항체를 사용한다.Antigen levels can be determined by any method known in the art. For example, specific antigens can be quantified by known immunodiagnostic methods, such as Western blotting immunoprecipitation, in which methods use antibodies to specific antigens.
변형 면역글로불린에 대한 생체내 면역반응의 강도는 당분야에 공지된 임의의 방법으로 결정하는데, 이런 방법에는 지체성 초민감성 피부시험, 시험관내 세포융해 T-림프구의 활성분석이 포함되는데, 이들에 한정하지 않는다.The intensity of the in vivo immune response to modified immunoglobulins is determined by any method known in the art, including retarded ultrasensitive skin testing, in vitro activity analysis of cell fusion T-lymphocytes. It is not limited.
지체성 초민감성 피부 시험은 항원에 대한 전체 면역능력 및 세포면역의 실험에서 매우 중요하다. 피부 시험에서 적당한 기술에서는 항원을 4℃에 멸균보관하고, 광을 차단하고, 사용하기직전 재구성해야 한다. 25- 또는 27-게이지 바늘을 이용해 피하가 아닌 경피로 항원을 투여한다. 항원의 경피투여 24시간, 48시간후, 가장 큰 홍진 및 경화를 자로 측정한다. 임의의 항원 또는 항원그룹에 대한 저활성은 유사한 환경에서 더 높은 농도의 항원실험 또는 중간단계 실험의 반복으로 확인한다.Retarded supersensitive skin testing is of great importance in experiments with overall immunity to antigen and cellular immunity. Appropriate techniques in skin testing require antigen sterilization at 4 ° C, light blocking, and reconstitution immediately before use. The antigen is administered transdermally rather than subcutaneously using a 25- or 27-gauge needle. 24 hours, 48 hours after transdermal administration of antigen, the largest erythema and sclerosis are measured by rule. Low activity against any antigen or group of antigens is confirmed by repetition of higher concentrations of antigen or intermediate experiments in a similar environment.
세포융해 T-림프구활성을 시험하기 위하여, 원심분리 농도차 기술을 이용하여 면역화된 개체에서 분리한 T-림프구는 10% 태아 소 혈청을 함유한 3ml PRMI 배지에서, 변형항체가 목표로 하는 항원을 보유한 세포로 재자극한다. 몇몇 실험에서 33% 이차 혼성 림프구 배양상청액 또는 IL-2는 T 세포 생장인자로서 배양배지에 포함된다. 면역화후 세포융해 T-림프구의 일차반응을 측정하기 위하여, 분리된 T 세포는 항원을 보유한 세포 유무하에 배양한다. 6일후, 배양물은 4시간51Cr-방출분석에서 세포독성에 대해 시험한다. 자발적인 표적의51Cr-방출은 면역화가 효과적일 경우 20% 미만 수준이 된다(Heike et al., J. Immunotherapy 15:15-174).To test for cytolytic T-lymphocyte activity, T-lymphocytes isolated from immunized subjects using centrifugal concentration difference techniques were tested for antigens targeted by the modified antibody in 3 ml PRMI medium containing 10% fetal bovine serum. Restimulate with retained cells. In some experiments 33% secondary hybrid lymphocyte culture supernatants or IL-2 are included in the culture medium as T cell growth factors. To measure the primary response of cytolytic T-lymphocytes after immunization, isolated T cells are cultured with and without antigen. After 6 days, the cultures are tested for cytotoxicity in a 4 hour 51 Cr-release assay. 51 Cr-release of spontaneous targets is below 20% when immunization is effective (Heike et al., J. Immunotherapy 15: 15-174).
다른 측면에서, 변형 면역글로불린은 변형항체가 목표로 하는 항원과 관련된 특정 질병 또는 질환으로부터 호전 또는 회복에 대해 개체를 모니터함으로써 효능을 시험한다. 변형항체가 종양 또는 암항원을 목표로 하는 경우, 특정 종양 또는 암의 진전은 암 또는 종양을 모니터하기 위한 공지된 임의의 진단 또는 선별방법으로 추적한다. 가령, 암 또는 종양진전은 개체의 혈청에서 특정 암 또는 종양항원(또는 특정 종양 또는 암과 관련된 또 다른 항원)의 수준을 분석하여 또는 항원에 특이적인 표지된 항체를 주사하여 모니터한다. 또한 컴퓨터 X선단층사진(CT) 스캔 또는 소노그래프와 같은 다른 화상기술을 이용하여 암 또는 종양의 진전을 모니터한다. 생검을 또한 실시한다. 사람에서 이런 시험을 실시하기 전에, 변형면역글로불린의 효능검사는 특정 암 또는 종양의 동물모델에서 실시할 수 있다.In another aspect, modified immunoglobulins test efficacy by monitoring a subject for improvement or recovery from a particular disease or condition associated with the antigen to which the modified antibody is targeted. When the modified antibody targets a tumor or cancer antigen, the progress of the particular tumor or cancer is tracked by any known diagnostic or screening method for monitoring the cancer or tumor. For example, cancer or tumor progression is monitored by analyzing the level of a particular cancer or tumor antigen (or another antigen associated with a particular tumor or cancer) in the serum of an individual or by injecting labeled antibodies specific for the antigen. Other imaging techniques, such as computed tomography (CT) scans or sonographs, are also used to monitor cancer or tumor progress. Biopsies are also performed. Prior to conducting this test in humans, potency testing of modified immunoglobulins may be performed in animal models of specific cancers or tumors.
감염성 질병의 경우에, 변형된 항체의 효능은 변형항체를 개체(사람 개체 또는 동물 질병모델)에 투여하고, 이후 특정 감염성 질병병인 또는 특정감염성 질병의 증상을 모니터하여 분석할 수 있다. 감염성 질병병인의 수준은 감염성 질병병인의 분석을 위한 당분야에 공지된 임의의 방법으로 결정하는데, 바이러스 또는 박테리아수준의 경우에, 바이러스 적정농도를 예로 들 수 있다. 감염성 질병병인의 수준 또한 변형면역글로불린이 표적으로 하는 항원 또는 감염성 질병병인의 또 다른 항원수준을 측정하여 결정한다. 감염성 질병병인 수준의 감소 또는 감염성 질병증상의 완화는 변형항체가 효과적임을 암시한다.In the case of an infectious disease, the efficacy of the modified antibody can be analyzed by administering the modified antibody to a subject (human subject or animal disease model) and then monitoring the symptoms of the specific infectious disease etiology or specific infectious disease. The level of infectious etiology is determined by any method known in the art for the analysis of infectious etiology, in the case of viral or bacterial levels, for example viral titers. The level of infectious disease etiology is also determined by measuring the antigen that the modified immunoglobulin targets or another antigenic level of infectious disease etiology. Reducing the level of infectious disease or reducing the symptoms of infectious disease suggests that the modified antibody is effective.
6. 실시예: 결장암에 대한 항-유전형 백신 유도물질6. EXAMPLES: Anti-Genetic Vaccine Inducers for Colon Cancer
이 실시예는 단일클론 항체 MAb31.1(하이브리도마 분비 Mab31.1은 American Type Tissue Collection as accession No. HB12314에서 얻을 수 있다)에서 유도한 변형항체의 작제를 설명한다. Mab31.1은 사라 결장암(종)에 의해 발현된 항원을 인식한다. Mab31.1에 기초한 본 발명의 변형항체를 가공하여 H 및 L 사슬 변이영역의 시스테인 잔기를 알라닌으로 치환한다. 따라서, 생성된 변형 항체는 H 및 L 사슬 변이영역에서 사슬사이 이황화결합이 없다.This example describes the construction of a modified antibody derived from the monoclonal antibody MAb31.1 (Hybridoma Secretion Mab31.1 is available from American Type Tissue Collection as accession No. HB12314). Mab31.1 recognizes antigens expressed by Sarah colon cancer (species). The modified antibody of the present invention based on Mab31.1 is processed to replace the cysteine residues of the H and L chain variant regions with alanine. Thus, the resultant modified antibody lacks interchain disulfide bonds in H and L chain variant regions.
6.1. 변형항체의 작제6.1. Construction of Modified Antibodies
변형항체를 작제하는 방법은 H 및 L 사슬변이영역을 인코드한 두 개의 가공유전자를 작제하는 것으로, 여기서 사슬사이 이황화결합에 중요한 것으로 알려진 특정 시스테인 잔기를 알라닌으로 변형한다. 알라닌 잔기는 Mab31.1에서 유도한 항체의 H 사슬변이영역의 22 및 92위치의 시스테인 잔기 또는 Mab31.1에서 유도한 항체의 L 사슬변이영역의 23 및 88 위치의 시스테인 잔기가 치환된 것이다. 이들 가공유전자를 작제하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 그룹은 조합하여(후술한 바와 같이), 일정영역을 제공하는 적당한 벡터로 삽입하였다.A method of constructing a modified antibody consists of constructing two processing genes encoding H and L chain mutation regions, wherein a particular cysteine residue known to be important for disulfide bonds between chains is modified with alanine. Alanine residues are those substituted with cysteine residues at positions 22 and 92 of the H chain mutation region of the antibody derived from Mab31.1 or cysteine residues at positions 23 and 88 of the L chain mutation region of the antibody derived from Mab31.1. To construct these processing genes, oligonucleotide groups were combined (as described below) and inserted into a suitable vector providing a region.
사슬사이 이황화결합이 없는 CDR을 인코드한 변이영역 유전자를 작제하기 위하여, 다음의 과정을 실시하였다.In order to construct a mutation region gene encoding CDRs without disulfide bonds between chains, the following procedure was carried out.
먼저, 제 1 올리고뉴클레오티드는 어닐링하여 점착성 두가닥 DNA 단편을 만든다(도10에서 도면제시, 단계1). 특히, 20개 염기 중복 영역을 가진 서열에 상응하는 80개정도 염기길이의 올리고뉴클레오티드는 GenoSys Biotech Inc.의 자동화기술을 이용하여 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 각각의 특이서열은 도 9A 및 9B에 제시한다. 도9A는 2CAVHCOL1라고 하는 H 사슬 변이영역 유전자의 가공에 사용한 10개 올리고 그룹의 목록을 나타낸다. 2CAVHCOL1은 공통 H 사슬 변이유전자에 비교할 때 두 개의 시스테인 잔기가 없다. 도 9B는 2CAVLCOL1라고 하는 L사슬변이 영역유전자의 가공에 사용한 12개 올리고 그룹의 목록을 나타낸다. 2CAVLCOL1은 공통 L 사슬 변이유전자에 비교할 때 두 개의 시스테인 잔기가 없다. 원하는 유전자로 올리고를 결합하기 위하여, 10 내지 12 올리고 그룹은 후술한 바와 같이 결합하고 도 10에 제시하였는데, 이때, 도10에서 지적한 1 내지 10개 올리고의 본질은 표5에 제시하였다. 결합하기에 앞서, 각 올리고뉴클레오티드는 다음과 같이 5'인산화하였다: 25㎕의 각 올리고는 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제, 50mM ATP 존재하에서 37℃로 1시간동안 배양하였다. 반응은 70℃에서 5분동안 가열하여 중단시키고 이후 에탄올침전시켰다. 일단 인산화된 상보성 올리고뉴클레오티드(올리고1 + 올리고10, 올리고2 + 올리고9, 올리고3 + 올리고8, 올리고4 + 올리고7, 올리고5 + 올리고6)(도 10)은 이후 멸균원심분리튜브에서 혼합하고 5분동안 65℃로 수조에서 튜브를 가열하여 어닐링하고 이후 30분동안 실온에서 냉각한다, 어닐링하면, 점착말단을 지닌 짧은 두 가닥 DNA 단편이 만들어진다.First, the first oligonucleotide is annealed to form a sticky double-stranded DNA fragment (shown in FIG. 10, step 1). In particular, oligonucleotides of about 80 base lengths corresponding to sequences having 20 base overlap regions were synthesized using GenoSys Biotech Inc.'s automated technology. Specific sequences of each of these oligonucleotides are shown in FIGS. 9A and 9B. Fig. 9A shows a list of ten oligo groups used for processing the H chain variant region gene called 2CAVHCOL1. 2CAVHCOL1 lacks two cysteine residues when compared to a common H chain variant gene. 9B shows a list of twelve oligo groups used to process the L-chain variant region gene called 2CAVLCOL1. 2CAVLCOL1 lacks two cysteine residues when compared to the consensus L chain variant gene. In order to bind oligos with desired genes, 10-12 oligo groups were combined as described below and presented in FIG. 10, wherein the nature of 1-10 oligos indicated in FIG. 10 is shown in Table 5. Prior to binding, each oligonucleotide was 5 ′ phosphorylated as follows: 25 μl of each oligo was incubated for 1 hour at 37 ° C. in the presence of T4 polynucleotide kinase, 50 mM ATP. The reaction was stopped by heating at 70 ° C. for 5 minutes and then ethanol precipitated. Once phosphorylated complementary oligonucleotides (oligo 1 + oligo 10, oligo 2 + oligo 9, oligo 3 + oligo 8, oligo 4 + oligo 7, oligo 5 + oligo 6) (Figure 10) are then mixed in a sterile centrifuge tube and The tube is annealed by heating in a water bath at 65 ° C. for 5 minutes and then cooled at room temperature for 30 minutes. When annealed, short two-stranded DNA fragments with sticky ends are produced.
그 다음, 점착성 두 가닥 DNA 단편은 가공된 변이영영 유전자가 조합될 때까지, 좀더 긴 가닥으로 결찰한다(도10, 단계 2-4). 특히, 점착성 두 가닥 DNA 단편은 T4 DNA 리가아제, 10mM ATP 존재하에서 2시간동안 16℃로 유지한 수조에서 결찰하였다. 어닐링된 올리고 1/10은 어닐링된 올리고 2/9와 혼합하고, 어닐링된 올리고 3/8은 어닐링된 올리고 4/7과 혼합하였다. 생성된 올리고는 올리고 1/10/2/9 및 올리고 3/8/4/7로 기록하였다. 그런후, 올리고 3/8/4/7은 올리고 5/6에 결찰하였다. 생성된 올리고 3/8/4/7/5/6은 이후 올리고 1/10/2/9와 결찰하여 전장변이영역 유전자를 만들었다.The sticky two-stranded DNA fragments are then ligated into longer strands until the combined mutagen genes are combined (Figure 10, steps 2-4). In particular, sticky two-stranded DNA fragments were ligated in a water bath maintained at 16 ° C. for 2 hours in the presence of T4 DNA ligase, 10 mM ATP. The annealed oligo 1/10 was mixed with the annealed oligo 2/9 and the annealed oligo 3/8 with the annealed oligo 4/7. The resulting oligo was recorded as oligo 1/10/2/9 and oligo 3/8/4/7. Oligo 3/8/4/7 was then ligated to oligo 5/6. The resulting oligo 3/8/4/7/5/6 was then ligated with oligo 1/10/2/9 to produce full length mutation regions genes.
다른 방법으로, 12 올리고 그룹을 사용하는 경우, 첨가의 순서는 다음과 같다:1+12=1/12, 2+11=2/11, 3+10=3/10, 4+9=4/9, 5+8=5/8, 6+7=6/7, 1/12+2/11=1/12/1/11, 3/10+4/9=3/10/4/9, 5/8+6/7=5/8/6/7, 1/122/11+3/10/4/9=1/12/2/11/3/10/4/9, 1/12/2/11/3/10/4/9+5/8/6/7=전장 변이영역 유전자. 가공유전자의 작제에 사용한 올리고뉴클레오티드의 이름은 표5에 제시한다. 변형된 H 사슬변이영역은 2CAVHCOL1이라 하였다. 변형된 L 사슬변이영역은 2CAVLCOL1이라 하였다.Alternatively, when using 12 oligo groups, the order of addition is as follows: 1 + 12 = 1/12, 2 + 11 = 2/11, 3 + 10 = 3/10, 4 + 9 = 4 / 9, 5 + 8 = 5/8, 6 + 7 = 6/7, 1/12 + 2/11 = 1/12/1/11, 3/10 + 4/9 = 3/10/4/9, 5/8 + 6/7 = 5/8/6/7, 1/122/11 + 3/10/4/9 = 1/12/2/11/3/10/4/9, 1/12 / 2/11/3/10/4/9 + 5/8/6/7 = full length variant region gene. The oligonucleotide names used in the construction of the process genes are shown in Table 5. The modified H chain mutation region was called 2CAVHCOL1. The modified L chain variant region was called 2CAVLCOL1.
생성된 변형영역 유전자는 이후 겔전기영동으로 정제하였다. 결찰되지 않은 과도한 올리고 및 다른 불완전 DNA 단편을 제거하기 위하여, 결찰된 산물은 2시간동안 직류 100V에서 1% 저용해 아가로즈 겔에 걸었다. 전장 DNA 산물을 보유한 중요 밴드는 절단하여 멸균 1.5ml 원심분리튜브에 위치시켰다. 아가로즈로부터 DNA를 방출시키기 위하여, 겔 조각은 40℃에서 f3-아가라제 I로 절단하였다. DNA는 -20℃에서 1시간동안 0.3M NaOAc 및 이소프로판올로 첨전시켜 수거하고, 이후 15분동안 12,000rpm으로 원심분리하였다. 정제된 DNA 펠렛은 50㎕의 TE 버퍼(pH 8.0)에 재현탁시켰다. 가공된 변이영역 유전자는 이후 PCR로 증폭하였다. 특히, 100ng의 가공된 변이영역 유전자는 버퍼에서 25mM dNTPs, 200ng 프라이머, 5U 고순도 열안정성 Pfu DNA 폴리메라제와 혼합하였다. 생성된 PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에서 분석하였다.The resulting modified region gene was then purified by gel electrophoresis. To remove excess oligo and other incomplete DNA fragments that were not ligated, the ligated product was hanged on agarose gel at 1% low solubility at 100 V DC for 2 hours. Critical bands with full length DNA products were cut and placed in sterile 1.5 ml centrifuge tubes. To release the DNA from the agarose, the gel pieces were cut with f3-agarase I at 40 ° C. DNA was harvested by charging with 0.3 M NaOAc and isopropanol at −20 ° C. for 1 hour and then centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes. Purified DNA pellet was resuspended in 50 μl of TE buffer (pH 8.0). The processed mutation region gene was then amplified by PCR. In particular, 100 ng of the engineered mutagenesis gene was mixed with 25 mM dNTPs, 200 ng primer, 5 U high purity thermostable Pfu DNA polymerase in buffer. The resulting PCR product was analyzed on 1% agarose gel.
가공 변이영역 유전자에 해당하는 각 정제된 DNA는 연속적으로 pUC 19 박테리아 벡터에 삽입하였다. pUC19는 2686 염기쌍이고, lacZ 및 Amp 선택마크상에 54개 염기쌍 폴리링크를 보유한 다수의 대장균(E. coli) 플라스미드 벡터다. 가공된 변이영역 유전자의 삽입용 벡터를 만들기 위하여, 10㎍의 pUC19은 3시간동안 37℃에서 Hinc Ⅱ(50U)로 선형화시켜, 블런트 말단서열 5'GTC를 가진 벡터를 만들었다. 자가-결찰을 예방하기 위하여, 선형 벡터 DNA는 1시간동안 37℃에서 25U의 소 내장 알칼린 포스파타제(CIP)로 탈인산화시켰다. 가공된 변이영역 유전자를 pUC19 벡터로 삽입하기 위하여, 대략 0.5㎍의 탈인산화된 선형 벡터 DNA는 T4 DNA 리가아제(1000U)의 존재하에서 3㎍의 인산화된 변이영역 유전자와 혼합하고, 12시간동안 16℃에서 배양하였다.Each purified DNA corresponding to the processing variant region gene was subsequently inserted into the pUC 19 bacterial vector. pUC19 is a 2686 base pair and a large number of E. coli plasmid vectors with 54 base pair polylinks on the lacZ and Amp selection marks. To make a vector for insertion of the engineered mutation region gene, 10 μg of pUC19 was linearized with Hinc II (50U) at 37 ° C. for 3 hours to produce a vector with blunt terminal 5′GTC. To prevent self-ligation, linear vector DNA was dephosphorylated with 25 U of bovine visceral alkaline phosphatase (CIP) at 37 ° C. for 1 hour. To insert the engineered variant region gene into the pUC19 vector, approximately 0.5 μg of dephosphorylated linear vector DNA was mixed with 3 μg of phosphorylated variant region gene in the presence of T4 DNA ligase (1000U) and 16 for 12 hours. Incubated at ℃.
가공된 변이영역 유전자를 보유한 박테리아 벡터를 이후 사용하여 박테리아 세포를 형질전환시켰다. 특히, 새로 만든 강력한 DH-5α세포, 50㎕는 가공된 변이영역 유전자를 보유한 1㎍의 pUC19와 혼합하고 에렉트로포레이션 쿠벳트(0.2cm gap; Bio-Rad)로 옮겼다. 각 쿠벳트에 에렉트로포레이션 장치((Bio-Rad Gene Pulser)를 이용해 2.5kV/200ohm/25㎌로 펄스를 보냈다. 이후, 1ml의 SOC 배지를 각 쿠벳트에 첨가하고, 세포는 원심분리 튜브에서 1시간동안 37℃에서 회수하였다. 각 형질전환세포에서 일정부분을 떼어내어 1:100으로 희석하고, 이후 앰피실린(Amp 40㎍/ml)을 함유한 LB 평판에 100㎕ 도말하였다. 평판은 Amp 마크의 존재로 인해 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. pUC19벡터를 보유한 형질전환체만이 LB/Amp 평판에서 생장한다.Bacterial vectors carrying the engineered variant region genes were then used to transform bacterial cells. In particular, 50 μl of freshly produced strong DH-5α cells were mixed with 1 μg of pUC19 carrying the engineered mutagenesis gene and transferred to an electroporation cuvette (0.2 cm gap; Bio-Rad). Each cuvette was pulsed at 2.5 kV / 200 ohm / 25 Hz using an electroporation device ((Bio-Rad Gene Pulser). Then, 1 ml of SOC medium was added to each cuvette, and the cells were placed in a centrifuge tube. The cells were recovered for 1 hour at 37 ° C. A portion of each transformed cell was removed, diluted 1: 100, and then 100 μl plated onto an LB plate containing ampicillin (Amp 40 μg / ml). Due to the presence of the mark it was incubated overnight at 37 ° C. Only transformants carrying the pUC19 vector grew on LB / Amp plates.
단일형질전환체 집락을 선택하고, 3ml LB/amp 멸균 유리튜브에서 하룻밤동안 배양하면서, 37℃에서 연속진탕하였다. 플라스미드 DNA는 Easy Prep 칼럼(Pharmacia Biotech)을 사용하여 분리하고, 100㎕의 TE 버퍼(pH7.5)에서 현탁하였다. pUC19상에 유전자삽입의 존재를 확인하기 위하여, 각 집락에서 얻은 25㎕의 플라스미드 DNA는 제한 효소로 1시간동안 37℃에서 절단하고, 1% 아가로즈 겔에서 분석하였다. 이런 방법으로, 플라스미드 DNA 유전자 삽입체는 제한 위치(5'..GTCGAC..3')의 상실로 인해 효소 절단에 저항성을 나타내고 닫힌 원형(CC) DNA로 되지만, 삽입없는 플라스미드는 절단되고, 겔상에 선형(L) 두 가닥 DNA 단편이 된다.Monotransformer colonies were selected and continuously shaken at 37 ° C. with overnight incubation in 3 ml LB / amp sterile glass tubes. Plasmid DNA was isolated using an Easy Prep column (Pharmacia Biotech) and suspended in 100 μl of TE buffer (pH7.5). To confirm the presence of gene insertion on pUC19, 25 μl of plasmid DNA from each colony was digested with restriction enzymes for 1 hour at 37 ° C. and analyzed on a 1% agarose gel. In this way, the plasmid DNA gene insert is resistant to enzymatic cleavage due to the loss of restriction sites (5 '.. GTCGAC..3') and becomes closed circular (CC) DNA, but the plasmid without insertion is cleaved and gelled. Becomes a linear (L) two-stranded DNA fragment.
가공된 변이영역 유전자의 정확한 유전자 서열을 확인하고, 작제과정동안 이루어진 원하지 않는 돌연변이 가능성을 없애기 위하여, DNA 서열화는 자동화 ABI 377 DNA 서열화 장치에서, 상기 클론에 대해 M13/pUC 역상 프라이머(5'AACAGCTATGACCATG3')를 사용하고, 또한 PCR 유전자 산물은 5'말단 20염기 쌍 프라이머(5'GAATT CATGGCTTG GGTGTG 3')를 사용하여 실시한다.DNA sequencing was performed on an automated ABI 377 DNA sequencing device for M13 / pUC reversed-phase primers (5'AACAGCTATGACCATG3 ') to identify the exact gene sequence of the engineered variant region gene and to eliminate the possibility of unwanted mutations made during construction. ) And PCR gene products are also carried out using 5 'terminal 20 base pair primer (5'GAATT CATGGCTTG GGTGTG 3').
표 5Table 5
Mab 31.1에서 나온 CDR을 보유한 변형항체를 인코드한 유전자의 작제Construction of genes encoding modified antibodies with CDRs from Mab 31.1
6.3. 포유동물 발현벡터로의 가공된 변이영역 유전자의 삽입6.3. Insertion of engineered mutation region gene into mammalian expression vector
완전 항체 L 사슬은 변이영역 및 일정영역 모두를 보유한다. 완전항체 H 사슬은 변이영역, 일정영역, 힌지(hinge) 영역을 보유한다. 변형 변이영역 유전자 2CAVHCOL1 또는 2CAVLCOL1은 적당한 일정영역을 보유한 벡터로 삽입하였다. L 사슬에 시스테인 잔기가 결핍된 가공된 변이영역 유전자는 pMRRO10.1 벡터로 삽입하였다(도 6A). pMRRO10.1 벡터는 사람 Kappa L 사슬 일정영역을 보유했다. 가공된 L 사슬변이영역의 이 벡터로의 삽입에서 완전 L 사슬서열이 만들어졌다. 다른 방법으로, H 사슬상의 시스테인 잔기가 결핍된 가공된 변이영역 유전자는 pGAMMA1 벡터로 삽입하였다(도 6B). The pGAMMA1 벡터는 사람 및 IgG1 일정영역, 힌지 영역서열을 보유했다. 가공된 H 사슬변이영역 유전자의 이 벡터로의 삽입에서 완전 H 사슬 서열이 만들어졌다.Complete antibody L chains possess both mutation and constant regions. The full antibody H chain has a mutation region, a constant region, and a hinge region. The modified variant region gene 2CAVHCOL1 or 2CAVLCOL1 was inserted into a vector having an appropriate constant region. The engineered mutagenesis gene lacking cysteine residues in the L chain was inserted into the pMRRO10.1 vector (FIG. 6A). The pMRRO10.1 vector had a human Kappa L chain constant region. The insertion of the engineered L chain mutation region into this vector produced the complete L chain sequence. Alternatively, the engineered variant region gene lacking the cysteine residue on the H chain was inserted into the pGAMMA1 vector (FIG. 6B). The pGAMMA1 vector possessed human and IgG1 constant region, hinge region sequences. Insertion of the processed H chain variant region gene into this vector resulted in the complete H chain sequence.
H 사슬 및 L 사슬 유전자로 이루어진 포유동물 벡터를 가공하기 위하여, 완전 L 사슬 서열 및 완전 H사슬 서열은 포유동물 발현벡터 pNEPuDGV로 삽입하였다(도6C)(Bebbington, C.R., 1991, In METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, vol.2, pp. 136-145). 생성된 벡터는 변형항체의 H 사슬 및 L 사슬 모두를 인코드한다.To process mammalian vectors consisting of H chain and L chain genes, the complete L chain sequence and the complete H chain sequence were inserted into the mammalian expression vector pNEPuDGV (FIG. 6C) (Bebbington, CR, 1991, In METHODS: A Companion). to Methods in Enzymology, vol. 2, pp. 136-145). The resulting vector encodes both the H and L chains of the modified antibody.
6.4. 포유동물 세포에서 인공 변형항체의 발현6.4. Expression of Artificially Modified Antibodies in Mammalian Cells
조합된 항체의 생산을 검사하기 위하여, 포유동물 발현 벡터는 COS 세포로 트랜스펙션시켰다. COS 세포(아프리카 그린 원숭이 신장세포계, CV-1, 기원-결핍 SV40 바이러스로 형질전환됨)는 인공 항체의 단기간 일시발현을 위해 사용하는데, 그 이유는 이들이 SV40 기원의 복제를 보유한 원형 플라스미드를 다수의 사본으로 복제할 수 있기 때문이다. 항체 발현 벡터는 C0S7 세포(American Type Culture Collection)로 이전시켰다. 옮겨진 벡터는 둘베코(Dulbecco) 변형 이이글 배지에서 생장시키고, 칼슘침전을 이용하여 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다(Sullivan et al., FEBS Lett. 285:120-123, 1991). 트랜스펙션된 세포는 상청액 수거 72시간후에 배양하였다. 트랜스펙션된 COS의 상청액은 조합된 IgG에 대해 ELISA 방법으로 분석하였다. ELISA에는 샘플 및 기준물의 96-웰 평판으로의 포획이 포함되고, 상기 평판은 항-사람 IgG Fc로 피막된 것이다. 결합된 조합IgG는 말 라디시 페폭시다제(HRP) 및 테트라메틸벤지딘 기질(TMB)에 결합된 항-사람 Kappa 사슬로 검출하였다. 색깔 변화는 샘플상에 존재하는 조합항체의 양에 비례하였다.To test the production of the combined antibodies, mammalian expression vectors were transfected with COS cells. COS cells (transformed with the African Green Monkey Renal Cell Line, CV-1, origin-deficient SV40 virus) are used for short term transient expression of artificial antibodies because they have a large number of copies of circular plasmids bearing replication of SV40 origin. Because it can be replicated. Antibody expression vectors were transferred to C0S7 cells (American Type Culture Collection). The transferred vectors were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium and transfected with expression vectors using calcium precipitation (Sullivan et al., FEBS Lett. 285: 120-123, 1991). Transfected cells were cultured 72 hours after supernatant harvest. Supernatants of transfected COS were analyzed by ELISA method for combined IgG. ELISA includes capture of samples and references to 96-well plates, which are coated with anti-human IgG Fc. Bound Combination IgG was detected with anti-human Kappa chains bound to horse radish epoxidase (HRP) and tetramethylbenzidine substrate (TMB). The color change was proportional to the amount of combination antibody present on the sample.
6.5. 사람 결장암(종)세포에 면역특이적으로 결합하는 변형항체 및 이들 세포에 의해 생성된 항원6.5. Modified antibodies that immunospecifically bind to human colon cancer (species) cells and antigens produced by these cells
변형항체는 섹션 6.4에서 지적한 바와 같이 발현하고 분리하였다. 결합능력 및 특이도는 이후 LS-174T세포 WiDR 세포(사람 결장암 세포계) 및 이들 세포에서 유도한 항원을 이용하여 분석하였다.Modified antibodies were expressed and isolated as indicated in section 6.4. Binding capacity and specificity were then analyzed using LS-174T cell WiDR cells (human colon cancer cell line) and antigens derived from these cells.
MA31.1 결합 특이성 및 결합능력을 검사하기 위하여, 닷 블랏 분석을 실시하였다(도11). LS-174T 세포에 얻은 막 조성물은 Bio-Blot 장치(Bio-Rad)를 이용하여 니트로셀룰로즈 막에 도포하였다. 웰은 찌기 우유를 이용하여 비-특이적 결합을 봉쇄하였다. Mab31.1에서 유도한 생리소형화 항체는 모든 웰에서 배양하였다. 0.003 내지 20nM 농도의 비표지된 항체는 이후 니트로셀룰로즈 막에 도포하고 배양하였다. 결합되지 않은 항체는 세척하여 막으로부터 제거하고, 제 2 항체인 알칼린 포스파타제 표지된 항-사람 IgG를 첨가하였다. 최종적으로, 알칼린 포스파타제 기질을 첨가하면 짙은 자줏빛 침전이 만들어지는데, 이것은 결합된 표지항체의 존재를 암시한다. 도11은 닷 블랏 분석의 결과를 제공한다. 수치는 표지된 항체가 LS-174T 세포에 결합함을 입증하였다. 또한, 비표지된 항체는 생리소형화 항체와 경쟁하는데, 이것은 Mab31.1에서 유도한 항체의 종양 세포 항원에 대한 특이성을 암시한다.To check MA31.1 binding specificity and binding capacity, dot blot analysis was performed (FIG. 11). Membrane compositions obtained on LS-174T cells were applied to nitrocellulose membranes using a Bio-Blot device (Bio-Rad). Wells blocked non-specific binding with steaming milk. Physiologically miniaturized antibodies derived from Mab31.1 were cultured in all wells. Unlabeled antibodies at a concentration of 0.003 to 20 nM were then applied to the nitrocellulose membrane and incubated. Unbound antibody was washed away from the membrane and a second antibody, alkaline phosphatase labeled anti-human IgG, was added. Finally, addition of an alkaline phosphatase substrate results in a dark purple precipitate, suggesting the presence of bound labeling antibody. 11 provides the results of the dot blot analysis. The figures demonstrated that the labeled antibody binds to LS-174T cells. In addition, unlabeled antibodies compete with physiologically miniaturized antibodies, suggesting the specificity of Mab31.1-derived antibodies for tumor cell antigens.
6.6. 항-유전형 반응6.6. Anti-genetic reactions
변형항체의 LS-174T 세포에 대한 결합효과는 경쟁 결합 분석에서 검사하였다. LS-174T 세포는 사람 결장암(종)세포인데, 이것은 Mab31.1 항체에 의해 인식된 항체를 발현한다. Mab31.1항체의 CDR중 한 서열을 보유한 펩티드를 만들었다. 이들 펩티드, 변형항체, Mab31.1에서 유도한 컨트롤 항체는 생쥐에 투여하여 Mab31.1의 CDR에 반한 항혈청 및 항체를 만들었다. 생쥐의 혈액샘플은 주사후 2주 및 42에 뽑았다. 면역화된 생쥐의 항혈청을 결합경쟁분석에 사용하였다(도 12A, B).The binding effect of the modified antibodies on LS-174T cells was examined in a competitive binding assay. LS-174T cells are human colon cancer (species) cells that express antibodies recognized by the Mab31.1 antibody. Peptides with one sequence of the CDRs of the Mab31.1 antibody were made. These peptides, modified antibodies, and control antibodies derived from Mab31.1 were administered to mice to produce antiserum and antibodies against the CDRs of Mab31.1. Blood samples from mice were drawn 2 weeks and 42 weeks after injection. Antisera of immunized mice were used for binding competition assay (FIGS. 12A, B).
항혈청 및 생리소형화 항체는 LS-174T 세포에 결합할 수 있는 능력에 대해 분석하였다. 도 12A, B에서 보인 바와 같이, CDR3, CDR4 펩티드에 대해 생성된 항혈청은 LS-174T 세포에 결합하는 컨트롤 항체(Mab31.1에서 유도한 항체)와 격렬한 경쟁을 벌였다. CDR1, CDR2에 대해 생성된 항혈청 또한 LS-174T 세포에 결합하는 컨트롤 항체와 상당한 경쟁을 벌였다(도 12B). 또한, 2CAVHCOL1, 2CAVLCOL1 항체(즉, 변이영역에 시스테인이 알라닌으로 변환된 항체)를 주사한 쥐의 항혈청은 Mab31.1로부터 유도한 항체를 주사한 생쥐의 항혈청보다는 더 효과적으로 Mab31.1로부터 유도한 생리소형화 항체와 경쟁하였다. 이 결과에서, 변이영역에서 시스테인이 알라닌으로 변화된 항체를 투여하면, 변이영역에 사슬-사이 이황화결합을 지닌 항체보다 더 효과적으로, 결장암(종)세포 항원을 인식하는 항-유전형 항체를 유도할 수 있다는 것을 알 수 있다.Antisera and physiologically miniaturized antibodies were analyzed for their ability to bind LS-174T cells. As shown in FIGS. 12A and B, antiserum generated against CDR3, CDR4 peptides was in fierce competition with control antibodies (antibodies derived from Mab31.1) that bind to LS-174T cells. Antisera generated against CDR1, CDR2 also competed significantly with control antibodies that bind to LS-174T cells (FIG. 12B). In addition, antiserum of mice injected with 2CAVHCOL1 and 2CAVLCOL1 antibodies (ie, antibodies in which cysteine was converted to alanine in the mutant region) was more effective than physiologically derived from Mab31.1 than antiserum of mice injected with Mab31.1-induced antibody. Competed with miniaturized antibodies. In these results, administration of an antibody whose cysteine is changed to alanine in the mutation region can induce anti-genetic antibodies that recognize colon cancer (species) cell antigens more effectively than antibodies having chain-to-disulfide bonds in the mutation region. It can be seen that.
표 6Table 6
Mab 31.1 CDR 서열로부터 유도한 비오틴-표지 펩티드Biotin-labeled Peptides Derived from Mab 31.1 CDR Sequences
펩티드 ID 서열Peptide ID sequence
COL311 L1 비오틴-N-Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-AlaCOL311 L1 Biotin-N-Thr-Ala-Lys-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Asn-Asp-Val-Ala
COL311 L2 비오틴-N-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-ThrCOL311 L2 Biotin-N-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Ser-Asn-Arg-Tyr-Thr
COL311 L3 비오틴-N-Phe-Ala-Gln-Gln-Asp-Tyr-Ser-Ser-Pro-Leu-ThrCOL311 L3 Biotin-N-Phe-Ala-Gln-Gln-Asp-Tyr-Ser-Ser-Pro-Leu-Thr
COL311 H1 비오틴-N-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-AsnCOL311 H1 Biotin-N-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly-Met-Asn
COL311H2 비오틴-N-Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-COL311H2 Biotin-N-Ala-Gly-Trp-Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro-Thr-Tyr-
Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-GlyAla-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly
COL311 H3 비오틴-N-Ala-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Phe-Asp-TyrCOL311 H3 Biotin-N-Ala-Arg-Ala-Tyr-Tyr-Gly-Lys-Tyr-Phe-Asp-Tyr
실시예 7: HMFG-1 서열을 보유한 인공 변형항체의 생산Example 7: Production of Artificially Modified Antibodies Containing HMFG-1 Sequences
면역특이적으로 HMFG-1 항체에 결합하는 항-유전형 항체를 작제하였다. HMFG-1는 다형성 상피 무친(PEM)에 결합하는 것으로 공지된 항체다(Stewart et al., 1990, J Clin Oncol 8:1941-50; Kosmas et al., 1994, Cancer 73:3000-3010). ProAspThrArgPro서열을 가진 PEM의 항원성 결정부를 본 발명의 방법으로 변형사슬영역으로 삽입하였다. 이 짧은 서열은 사람 다형성 상피 무친의 고도 면역원성 영역이다(Gendler et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:12820-12823). HMFG-1의 잔기 27A-27E(SerLeuLeuTyrSer)(표6)는 섹션6에서 밝힌 올리고뉴클레오티드 방법을 이용하여 ProAspThrArgPro로 치환하였다(도10). HMFG-1에 면역특이적으로 결합하는 항-유전형 인공 HMFG-1 항체는 HMFG-1의 L 및 H 사슬의 변이영역의 공지된 서열을 이용하여 만들었다. 올리고는 다음과 같은 순서로 첨가하였다: 1+8=1/8, 2+7=2/7, 3+6=3/6, 4+5=4/5, 1/8+2/7=1/8/2/7, 3/6+4/5=3/6/4/5, 1/8/2/7+3/6/4/5=1/8/2/7/3/6/4/5. 표7은 HMFG-1과 다양한 공통 CDR 서열사이의 서열비교를 보여준다. HMFG-1 및 관련 단클론항체에 관한 정보는 WO 09/05142(Imperial Cancer Research Technology, Ltd)에서 제시하며, 면역화된 HMFG-1는 WO 92/04380(Unilever)에서 제시한다.Anti-genetic antibodies were constructed that immunospecifically bind to HMFG-1 antibodies. HMFG-1 is an antibody known to bind to polymorphic epithelial muchins (PEM) (Stewart et al., 1990, J Clin Oncol 8: 1941-50; Kosmas et al., 1994, Cancer 73: 3000-3010). The antigenic determinant of PEM having the ProAspThrArgPro sequence was inserted into the modified chain region by the method of the present invention. This short sequence is the highly immunogenic region of human polymorphic epithelial mucins (Gendler et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 12820-12823). Residues 27A-27E (SerLeuLeuTyrSer) of HMFG-1 (Table 6) were substituted with ProAspThrArgPro using the oligonucleotide method identified in section 6 (FIG. 10). Anti-genetic artificial HMFG-1 antibodies that immunospecifically bind to HMFG-1 were made using known sequences of the variant regions of the L and H chains of HMFG-1. Oligos were added in the following order: 1 + 8 = 1/8, 2 + 7 = 2/7, 3 + 6 = 3/6, 4 + 5 = 4/5, 1/8 + 2/7 = 1/8/2/7, 3/6 + 4/5 = 3/6/4/5, 1/8/2/7 + 3/6/4/5 = 1/8/2/7/3 / 6/4/5. Table 7 shows the sequence comparison between HMFG-1 and various consensus CDR sequences. Information on HMFG-1 and related monoclonal antibodies is presented in WO 09/05142 (Imperial Cancer Research Technology, Ltd), and immunized HMFG-1 is presented in WO 92/04380 (Unilever).
폴리메라제 연속반응(PCR)을 사용하여 조합된 서열(도13)을 증폭하였다. HMFG-1를 인코드한 뉴클레오티드 서열을 보유하도록 작제한 가공 변이영역은 도13에서 보여준다. 가공된 변이영역 유전자는 pNEFuDGV 벡터와 같은 항체생산에 적당한 벡터로 삽입하였다(섹션 6). 가공된 유전자를 작제하는 다른 방법을 사용할 수 있는데, 이런 방법들은 Jayaraman et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17:4403; Sandhu et al., 1992, BioTechniques 12:14; Barnett and Erfie, 1990, H. Nucleic Acids Res 18:3094; Ciccarelli et al., 1991, Nucleic Acids Res 19:6007; Michaels et al., 1992, BioTechniques 12:45에서 제시하고 있지만, 이들에 한정하지 않는다.Polymerase sequencing (PCR) was used to amplify the combined sequence (FIG. 13). The processing variant region constructed to retain the nucleotide sequence encoded by HMFG-1 is shown in FIG. The engineered variant region gene was inserted into a vector suitable for antibody production, such as the pNEFuDGV vector (section 6). Other methods of constructing engineered genes can be used, such as Jayaraman et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 4403; Sandhu et al., 1992, BioTechniques 12:14; Barnett and Erfie, 1990, H. Nucleic Acids Res 18: 3094; Ciccarelli et al., 1991, Nucleic Acids Res 19: 6007; Michaels et al., 1992, BioTechniques 12:45, but are not limited to these.
표 7TABLE 7
본 발명은 이 글에서 제시한 특정 구체예로 범위를 한정하지 않는다. 실제로, 이 글에서 제시한 것들을 비롯하여 다양한 본 발명의 변형은 앞서 밝힌 명세서와 첨부한 도면을 보면 당업자에게 명확한 것이다. 이런 변형은 아래의 청구항 범위에 속한다.The present invention is not to be limited in scope by the specific embodiments presented in this article. Indeed, various modifications of the invention, including those set forth herein, will be apparent to those skilled in the art upon review of the foregoing specification and accompanying drawings. Such modifications fall within the scope of the following claims.
이 글에서 인용한 다양한 자료는 여기에 순전히 참고문헌으로 한다.The various resources cited in this article are hereby incorporated by reference in their entirety.
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