KR101837622B1 - Composition for controlling plant diseases comprising an extract of Maesa japonica, and method for controlling plant diseases using the same - Google Patents

Composition for controlling plant diseases comprising an extract of Maesa japonica, and method for controlling plant diseases using the same Download PDF

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Abstract

본 발명은 빌레나무(Maesa japonica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법을 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 또는 토마토 잿빛곰팡이병 등의 식물진균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention provides a composition for controlling a plant disease comprising a Maesa japonica extract or a fraction thereof as an active ingredient and a method for controlling a plant disease using the same, wherein the composition for controlling a plant disease of the present invention comprises Since it shows harmless and harmless to the human body and exhibits activity against plant fungal diseases such as rice blast, rice sheath blight, wheat red rust, tomato blight or tomato gray fungus disease without inducing environmental pollution, development of environmentally friendly natural material fungicide And can be usefully used for producing high value added organic agricultural products.

Description

빌레나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법{Composition for controlling plant diseases comprising an extract of Maesa japonica, and method for controlling plant diseases using the same}[0001] The present invention relates to a composition for controlling a plant disease, which contains an extract of Bile tree, as an active ingredient, and a method for controlling plant diseases using the same,

본 발명은 빌레나무(Maesa japonica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하는 환경친화적인 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an environmentally friendly plant disease controlling composition comprising an extract of Maesa japonica or a fraction thereof as an active ingredient.

20세기 후반 미국의 식물병리학자 볼로그는 교잡종자, 합성농약, 합성살균제로 대표되는 현대농법을 발전시켰다. 이를 ‘녹색혁명’이라 부르며, 현대농업에서 농약의 사용은 수확량을 보전하는데 필수적이게 되었다. 작물 생산에 있어 각종 식물병원균, 해충 및 잡초가 작물의 생육을 저해하고, 적절한 방제를 실시하지 않을 경우 재배하는 작물의 종류에 따라서 30~100%의 수확량 감소가 일어난다. 지금까지 다양한 종류의 합성농약들이 개발되고 작물보호에 적극적으로 이용되어 왔지만, 다년간의 합성농약사용으로 인해 약제에 저항성이 생긴 유해생물의 출현빈도가 증가하고 있고, 오남용된 농약의 잔류독성에 의한 인체 건강과 환경오염 및 생태계 교란에 대한 우려가 커지고 있어, 우리나라를 포함한 OECD 가입국을 중심으로 합성농약 사용에 대한 정책적인 규제가 강화되고 있다. 미국화학협회의 화학정보데이터베이스(CAS)에 등록된 수백만 종의 화합물을 군집분석하면 단 몇 백 종의 선도물질 군으로 분류할 수 있는데, 선도물질을 기준으로 규제가 강화되면, 앞으로 사용할 수 있는 합성농약의 수는 급감하게 될 수밖에 없다. 합성농약 사용을 감축하고자 하는 친환경농업정책과 더불어 새로운 친환경적인 방제 수단에 대한 수요가 증가하고 있어, 생물농약이 합성농약의 대안으로 떠오르고 있다.In the latter half of the 20th century, American plant pathologist Bollog developed modern farming practices represented by hybrids, synthetic pesticides, and synthetic fungicides. This is called the "Green Revolution," and the use of pesticides in modern agriculture has become essential for preserving yields. In the production of crops, various plant pathogens, pests and weeds inhibit the growth of the crops, and if not properly controlled, yields of 30 ~ 100% will occur depending on the type of crops to be cultivated. Although a variety of synthetic pesticides have been developed and used actively to protect crops, the frequency of occurrence of harmful organisms resistant to medicines has increased due to the use of synthetic pesticides for many years, and the human body due to the residual toxicity of abused pesticides Concerns about health, environmental pollution and ecosystem disturbance are growing, and policy regulations on the use of synthetic pesticides are strengthening, especially in the OECD countries including Korea. Cluster analysis of millions of compounds registered in the American Chemical Society's Chemical Information Database (CAS) can be categorized as a group of only a few hundred leading substances. As regulations are strengthened on the basis of lead compounds, The number of pesticides is bound to decline. In addition to eco - friendly agricultural policies aimed at reducing the use of synthetic pesticides, the demand for new environmental - friendly control measures is increasing, and bio - pesticides are emerging as an alternative to synthetic pesticides.

생물농약은 합성농약과 달리 인축 및 생태계에 미치는 영향이 적은 환경친화적인 작물보호제로서, 유기농산물과 같이 부가가치가 높은 농산물을 생산하는데 이용할 수 있고, 합성농약으로 방제가 어려운 병해충을 효과적으로 방제하는데 이용될 수 있다. 생물농약에는 미생물의 기능을 활용하는 미생물농약과 식물이나 미생물에서 유래한 대사물질을 활용하는 생화학농약이 있다. 세계 농약의 20%를 생물농약(biopesticide)으로 대체하자는 '리우환경회의 협약' 이후 친환경 천연물 농약, 특히 식물 추출물을 이용한 농약 개발이 주목을 받고 있다. 2011년 13억 달러였던 생물농약 시장도 연평균 16% 정도 성장해 오는 2017년에는 32억 달러에 달할 전망이다. 우리 정부도 친환경농업정책에 힘을 쏟고 있고, 친환경 농산물에 대한 국민 인식도 높아져 있어 현재 정부출연연구소와 대학, 그리고 몇몇 중소벤처 기업체에서 개별적으로 진행되고 있는 생물농약에 대한 연구도 보다 활기를 띌 것으로 전망한다. 학술지 엘스비어(Elsevier)의 데이터베이스에서 얻은 친환경 천연물 농약 관련 논문 3236편(1996-2013년)을 분석한 결과, 연평균증가율 12%로 논문 수가 증가하여 바이오농약에 대한 관심이 꾸준히 증가하고 있는 것으로 나타났다. Bio-pesticides are eco-friendly crop protection agents that have little effect on human life and ecosystem, unlike synthetic pesticides. They can be used to produce agricultural products with high added value such as organic agricultural products and can be effectively used to control pests that are difficult to control with synthetic pesticides . Biological pesticides include microbial pesticides that utilize the functions of microorganisms and biochemical pesticides that utilize metabolites derived from plants or microorganisms. Since the Rio Conventions on Environmental Conventions to replace 20% of the world's pesticides with biopesticides, the development of pesticides using environmentally friendly natural pesticides, especially plant extracts, has attracted attention. The bio-pesticide market, which was $ 1.3 billion in 2011, is expected to reach $ 3.2 billion by 2017, growing at an average annual rate of 16%. The Korean government is also concentrating on eco-friendly agricultural policies, and the public awareness of eco-friendly agricultural products is rising, and research on bio-pesticides, which are now being carried out separately at government-funded research institutes, universities and some small and medium-sized venture businesses, do. An analysis of pesticide-related papers 3236 (1996-2013) obtained from Elsevier's database showed that interest in bio-pesticides was steadily increasing due to an increase in the number of papers with an average annual growth rate of 12%.

우리나라는 농촌진흥청에서 친환경농업에 사용되는 병해충 방제용 생물농약의 등록과 관리를 주관하며, '친환경 유기농자재 목록'을 공시하여 친환경 유기농업에 사용할 수 있는 제제의 정보를 제공하고 있다. 2016년 3월 기준으로 총 427종이 병해충 방제용 생물농약으로 공시되어 있고, 이 가운데 식물 추출물이 204종, 미생물추출물 10종, 미생물제제 62종으로 유기농업에 사용할 수 있는 제제의 약 48%가 식물 추출물을 이용했다.In Korea, the RDA administers the registration and management of pesticides for pest control used in environmentally friendly agriculture, and provides a list of products that can be used for environmentally friendly organic agriculture by publishing a list of 'environmentally friendly organic materials'. As of March 2016, a total of 427 pesticides were declared as pesticides for the control of pests, of which 204 were plant extracts, 10 were microbial extracts, and 62 were microbials. About 48% The extract was used.

빌레나무(Maesa japonica)(Thunb) Morizi & Zoll.는 분류학적으로 앵초목(Primulales) 빌레나무과(Maesaceae)에 속하는 상록 덩굴성 떨기나무이다. 본 종은 제주도에서 채집되어 2006년에 국내 미기록종으로 발표되었다. 빌레나무과는 빌레나무속(Maesa) 1속으로 구성되며, 꽃자루에 1쌍의 소포엽이 있고, 가웅예가 없으며, 다수의 종자가 있는 폐과로서 자금우과(Myrsinaceae) 및 앵초과(Primulaceae)와 구분된다. 줄기는 곧게 자라며, 높이 1~1.5 m이다. 가지를 치며 땅에 닿는 마디에서 뿌리가 나온다. 잎은 마주나며, 타원형 또는 긴 타원형, 길이 5~17 ㎝, 폭 2~5 ㎝이다. 잎 뒷면은 회녹색이다. 꽃은 4~5월에 피며, 잎겨드랑이에서 나온 총상꽃차례에 달린다. 꽃받침은 5갈래로 갈라지며, 꽃받침잎은 둔한 삼각형이다. 수술은 5개, 암술은 1개이다. 열매는 장과로 둥글다. 국내뿐만이 아니라 대만, 베트남, 일본, 중국에 분포한다. Maesa japonica (Thunb) Morizi & Zoll. Is an evergreen bush bush that belongs to the primevalle Maesaceae taxonomically. This species was collected in Jeju Island and published as an unrecorded species in 2006. It is composed of a genus Maesa 1, with a pair of follicles on peduncle, no callus, and a large number of seeds, separated from Myrsinaceae and Primulaceae. The stem grows straight and is 1 to 1.5 m high. The roots come out of the nodes touching the ground and touching the ground. Leaves are opposite, oval or oblong, 5 to 17 cm long, 2 to 5 cm wide. The back side of the leaf is green. Flowers bloom from April to May, hanging from the axilla of leaves. Calyx is divided into 5 branches, sepals are dull triangles. There are 5 stamens and 1 pistil. The fruit is round with bowels. Not only in Korea, but also in Taiwan, Vietnam, Japan, and China.

중국전통의학에서는 잎과 뿌리가 일반적인 감기 증상을 치료한다고 알려졌으며, 메사 속(Maesa spp.)에 속하는 다른 종은 아프리카와 아시아 국가에서 민간요법에 사용되어왔다. 메사 란세올라타(Maesa lanceolata)는 아프리카 르완다의 전통의학에서 간염, 이질, 피부병, 신경병 치료에 사용되었고, 이 식물이 동아프리카에서는 콜레라(cholera)를 예방하는 민간요법에 사용되었다. 메사 발란세(Maesa balansae)는 베트남 전통의학에서는 알러지, 염좌, 기생충감염, 피부궤양, 숙취, 두통의 치료제로 사용되었다. 메사 란세올라타(Maesa lanceolata)의 잎에서 분리된 메사사포닌(maesasaponins)은 항바이러스, 항연체동물, 용혈작용, 혈관형성억제 등 다양한 생리활성을 나타냈으며, 이 식물의 열매에서 분리된 메사닌(maesanin) 및 메사퀴논(maesaquinone)은 면역증강 및 항암활성을 나타냈다. 메사 발란세(Maesa balansae)의 잎에서 분리된 메사발라이드(maesabalides)는 항리슈만편모충(antileishmania) 활성을 나타냈다. 빌레나무(Maesa japonica)의 나무껍질, 뿌리, 열매에서 메사퀴논(maesaquinone) 및 아세틸메사퀴논(acetylmaesaquinone)이 분리되었고, 잎에서는 메사사포닌(maesasaponins)의 일종인 메자포사이드(maejaposides)가 분리된 바 있다. 빌레나무(Maesa japonica) 잎추출물의 n-부탄올 분획물에서 MRC-5에 대한 세포독성 및 항리슈만편모충 활성이 보고된 바 있고, 빌레나무의 잎·줄기 및 꽃 추출물이 피부노화방지에 효과가 있는 화장품 원료로서 미국특허(US8709507 B2)로 등록된 바가 있다. 그러나 빌레나무 추출물의 식물병 방제활성에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.In Chinese traditional medicine, leaves and roots are known to treat common cold symptoms, and other species belonging to the genus Mesa ( Maesa spp.) Have been used in folk remedies in Africa and Asia. Maesa lanceolata was used in traditional Rwandan medicine in Africa to treat hepatitis, dysentery, dermatosis, and neuropathy, which was used in folk remedies to prevent cholera in East Africa. Maesa balansae has been used in traditional Vietnamese medicine for the treatment of allergies, sprains, parasitic infections, skin ulcers, hangovers and headaches. Maesasaponins isolated from the leaves of Maesa lanceolata showed various physiological activities such as antiviral, anti-molluscic, hemolytic and anti-angiogenic activities, and mesanganin isolated from the fruit of this plant maesanin) and mesesquinone (maesaquinone) showed immunological enhancement and anticancer activity. Mesa Balan aged methoxy bowl fluoride (maesabalides) isolated from leaves of (Maesa balansae) exhibited hangri Schumann parasite (antileishmania) activity. Maesaquinone and acetylmaesaquinone were isolated from bark, root and fruit of Maesa japonica and maejaposides, a kind of maesasaponins, were isolated from leaves. . The cytotoxicity and antimutagenic activity of MRC-5 in the n-butanol fraction of leaf extract of Maesa japonica have been reported, and the leaf, stem and flower extracts of bilem trees have been effective in preventing skin aging It has been registered as a US patent (US 8709507 B2) as a raw material. However, there has been no report on the activity of plant extracts for controlling plant diseases.

식물 추출물은 다양한 생리활성을 나타내어 전통의학 및 민간요법을 통해 다양한 분야에서 이용되어 왔다. 이에 근거하여 본 발명자들은 환경친화적인 식물병 방제 수단으로서 식물 추출물을 이용하고자 하였다.Plant extracts have shown various physiological activities and have been used in various fields through traditional medicine and folk remedies. Based on this, the present inventors tried to use plant extract as an environmentally friendly plant disease control means.

본 발명의 목적은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 벼 도열병(Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(Puccinia recondita) 및 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes) 등 작물생산에 있어 중요한 식물병에 대해 우수한 방제 효과를 나타내는 빌레나무(Maesa japonica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 식물병 방제방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for preventing and treating harmful insects such as Magnaporthe oryzae , Rhizoctonia solani , Botrytis cinerea , Phytophthora infestans , Rust ( Puccinia recondita ) and pepper anthracnose ( Colletotrichum The present invention also provides a composition for controlling plant diseases, which comprises Maesa japonica extract or a fraction thereof as an active ingredient, which exhibits an excellent controlling effect on plant diseases important for the production of crops,

상기 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 빌레나무(Maesa japonica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다. In order to solve the above-mentioned object, the present invention provides a plant disease controlling composition comprising Maesa japonica extract or a fraction thereof as an active ingredient.

빌레나무(Maesa japonica) 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 식물병 방제 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 천연물로서 인체에 무해하고 자연계에서 생분해되어 환경부하가 적으면서 벼 도열병(Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(Puccinia recondita) 및 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes) 등 식물진균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 생물농약으로 개발될 수 있고 고부가가치의 유기농산물 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a composition for the control of plant diseases, which contains Maesa japonica extract as an active ingredient. The composition for controlling plant diseases according to the present invention is a natural product harmless to the human body, ( Rhizoctonia solani ), Botrytis cinerea , Phytophthora infestans , Puccinia recondita , and Colletotrichum anthracnose ( Colletotrichum anthracnose) are the most common species of the genus , such as Magnaporthe oryzae , Rhizoctonia solani , coccodes and the like, it can be developed as an environmentally friendly biological pesticide and can be usefully used in the production of high value added organic agricultural products.

도 1은 빌레나무(Maesa japonica) 전초의 에탄올추출물(3,000 ppm)의 벼 도열병에 대한 방제효과를 나타낸 결과이다:
왼쪽은 무처리 대조구; 중간은 빌레나무 추출물; 및 오른쪽은 합성살균제 트리사이클라졸(tricyclazole 10 ppm) 처리구.
도 2는 빌레나무(Maesa japonica)의 에틸아세테이트추출물(900 ㎍) 및 n-부탄올 추출물(900 ㎍)의 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae)에 대한 in vitro 항균 활성을 페이퍼디스크 한천배지확산법으로 평가한 결과이다.
도 3은 빌레나무(Maesa japonica) 잎·줄기메탄올 추출물의 에틸아세테이트층으로부터 분리한 분획물 E222241을 고성능액체크로마토그래피를 사용하여 280 ㎚ 파장에서 검출한 크로마토그램 및 분석된 피크의 UV 흡광스펙트럼과 항균활성을 나타낸 결과이다.
도 4는 빌레나무(Maesa japonica) 잎·줄기 메탄올 추출물의 n-부탄올층으로부터 분리한 분획물 B944를 고성능액체크로마토그래피를 사용하여 230 ㎚ 파장에서 검출한 크로마토그램 및 분석된 피크의 UV 흡광스펙트럼과 항균활성을 나타낸 결과이다.
도 5는 빌레나무(Maesa japonica) 잎·줄기 메탄올 추출물의 n-부탄올층으로부터 분리한 분획물 B9453을 고성능액체크로마토그래피를 사용하여 210㎚ 파장에서 검출한 크로마토그램 및 분석된 피크의 UV 흡광스펙트럼과 항균활성을 나타낸 결과이다.
Fig. 1 shows the results of controlling the ethanol extract of Maesa japonica (3,000 ppm) against rice blast.
Left untreated control; The middle is the bille tree extract; And on the right were treated with synthetic antimicrobial tricyclazole (10 ppm).
Fig. 2 shows the in vitro antimicrobial activity of Magnaporthe oryzae of ethyl acetate extract (900 ㎍) and n-butanol extract (900 쨉 g) of Maesa japonica by the paper disk agar diffusion method to be.
Fig. 3 is a graph showing the chromatogram of the fraction E222241 isolated from the ethyl acetate layer of the leaf extract of Maesa japonica at 280 nm wavelength using high performance liquid chromatography and the UV absorption spectrum of the analyzed peak and the antimicrobial activity Respectively.
FIG. 4 is a graph showing the chromatogram of the fraction B944 isolated from the n-butanol layer of the leaves and stem methanol extract of Maesa japonica at 230 nm wavelength using high performance liquid chromatography and the UV absorption spectrum of the analyzed peak, Activity.
Figure 5 shows the chromatogram of the fraction B9453 isolated from the n-butanol layer of the leaves and stem methanol extract of Maesa japonica at a wavelength of 210 nm using high performance liquid chromatography and the UV absorption spectrum of the analyzed peak, Activity.

본 명세서 중에서 “방제”라고 하는 것은 병이나 해충의 예방, 기피 뿐만 아니라 제거, 사멸을 포함하는 의미로 이용하는 것으로 한다. 하지만 식물병 방제는 예방적 처리에 의한 방제효과가 주요 방제 기작이므로 빌레나무 추출물 및 분획물의 식물병에 대한 방제효과 조사는 예방적 처리로 실험하였다.In the present specification, the term " control " is used to mean prevention and avoidance of diseases and insects as well as removal and death. However, the control effect of plant disease control by preventive treatment is the main control mechanism. Therefore, the control effect of plant extracts and fractions on the plant diseases was tested by prophylactic treatment.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 빌레나무(Maesa japonica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for controlling a plant disease comprising an extract of Maesa japonica or a fraction thereof as an active ingredient.

상기 빌레나무 추출물 또는 이의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:It is preferable, but not limited, that the bille-tree extract or the fraction thereof is produced by a manufacturing method comprising the following steps:

1) 빌레나무에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;1) Extracting the extract with an extraction solvent;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;2) filtering the extract of step 1);

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 빌레나무의 추출물을 제조하는 단계; 및3) concentrating the filtered extract of step 2) under reduced pressure and then drying to prepare an extract of Bile wood; And

4) 단계 3)의 빌레나무 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 빌레나무 분획물을 제조하는 단계.4) a step of extracting the extract of the bilemen of the step 3) with an organic solvent to prepare the bilemen fractions.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 빌레나무는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 빌레나무는 잎, 줄기 또는 뿌리가 모두 이용가능하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 빌레나무의 채취 시기는 9월인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. In the above method, the tree of step 1) can be used without limitation such as cultivated or marketed. The above-mentioned tree can be used as leaves, stalks or roots, but is not limited thereto. The harvesting time of the tree is preferably September, but is not limited thereto.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올, n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.In the above method, it is preferable to use water, an alcohol, n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, acetone or a mixture thereof in the extraction solvent in step 1).

상기 알코올로는 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 빌레나무 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 2 내지 3배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.As the alcohol, a C 1 to C 4 lower alcohol is preferably used, and as the lower alcohol, ethanol, methanol, propanol or butanol is preferably used. As the extraction method, it is preferable to use shaking extraction, Soxhlet extraction or reflux extraction, but it is not limited thereto. The extraction solvent is preferably added by 1 to 10 times, more preferably 2 to 3 times, to the amount of dried bamboo. The extraction temperature is preferably 20 占 폚 to 100 占 폚, more preferably 20 占 폚 to 40 占 폚, and most preferably room temperature, but is not limited thereto. The extraction time is preferably 10 to 48 hours, more preferably 15 to 30 hours, most preferably 24 hours, but is not limited thereto. In addition, the extraction number is preferably 1 to 5 times, more preferably 3 to 4 times, and most preferably, 3 times, but not limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.In the above method, it is preferable to use a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator for the decompression concentration in step 3), but it is not limited thereto. The drying is preferably performed under reduced pressure, vacuum drying, boiling, spray drying or freeze drying, but not always limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 빌레나무 추출물을 물에 현탁시킨 후 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 에틸아세테이트 분획물 또는 n-부탄올 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 빌레나무 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.In the above method, the organic solvent in step 4) is preferably, but not limited to, n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol or water. The fractions can be obtained by suspending the extracts of Bilequinia species in water and then fractionating the fractions in the order of n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol and water in the order of n-hexane fraction, chloroform fraction, ethyl acetate fraction, n- Water fraction, and more preferably an ethyl acetate fraction or an n-butanol fraction. However, the present invention is not limited thereto. The fractions can be obtained by repeating the fractionation process from the above-mentioned Bile tree extract for 1 to 5 times, preferably 3 times, followed by fractionation and concentration under reduced pressure, but the present invention is not limited thereto.

상기 식물병은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The plant disease is preferably one or more selected from the group consisting of rice blast, rice sheath blight, tomato gray mold, tomato blight, wheat blight and anthracnose.

상기 조성물은 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola), 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola), 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물 병원성 곰팡이 균사 생장을 억제하는 것이 바람직하며, 아그로박테리움 튜메파시엔(Agrobacterium tumefaciens), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae) 및 펙토박테리움 카로토보럼(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물 병원성 세균 생장을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The composition may include Botrytis < RTI ID = 0.0 > cinerea , Alternaria brassicicola , Colletotrichum fructicola , Fusarium < RTI ID = 0.0 > oxysporum , Magnaporthe oryzae , Phytophthora ( Phytophthora) infestans , Rhizoctonia solani , and Sclerotinia sclerotiorum . It is preferred that Agrobacterium tumefaciens , Burkholderia sp., and the like are used for inhibiting the growth of at least one phytopathogenic fungus mycelial growth selected from the group consisting of Agrobacterium tumefaciens , Burkholderia glumae) and Peck tobak Te Karo Solarium Sat boreom (Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum ), but the present invention is not limited thereto.

상기 추출물 또는 이의 분획물은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 3,000 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 1,000 내지 3,000 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. The extract or the fraction thereof is preferably contained at a concentration of 100 to 3,000 占 퐂 / ml in the composition for controlling a plant disease, but is not limited thereto. It is more preferable that the extract or the fraction thereof is contained at a concentration of 1,000 to 3,000 占 퐂 / ml.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 빌레나무 추출물의 7가지 식물병에 대한 방제활성을 확인한 결과 빌레나무 전초에서 70% 에탄올수용액으로 수득한 추출물은 3,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 보리 흰가루병을 제외한 나머지 6종의 식물병에 대한 방제활성을 나타내었으며 특히, 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병에 대하여는 방제가 80% 이상의 강한 방제 활성이 나타냈다(표 1 및 도 1 참조).In the concrete examples of the present invention, the extracts obtained from the extracts obtained with the 70% ethanol aqueous solution at a concentration of 3,000 ㎍ / The control efficacy against the remaining six plant diseases was shown. In particular, the control activity against rice blast, wheat red rust and red pepper anthracnose showed strong control activity of 80% or more (see Table 1 and FIG. 1).

또한, 빌레나무 부위별 추출물의 7가지 식물병에 대한 방제활성을 확인한 결과, 빌레나무의 잎·줄기추출물 또는 뿌리추출물 용액을 3,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병에 대하여 방제가 73% 이상의 높은 방제 효과를 나타냈고, 잎·줄기추출물의 경우 고추 탄저병에 대하여 방제가 50%의 방제활성을 나타냈다. 1,000 ㎍/㎖ 농도에서도 두 가지 종류의 추출물은 벼 도열병에 대하여 80% 이상의 높은 방제가를 나타냈고, 벼 잎집무늬마름병균, 밀 붉은녹병에 대해서는 50~60%의 방제가를 나타냈다(표 2 참조). As a result of controlling the inhibitory activity against 7 plant diseases, the extracts of leaves, stem extracts and root extracts of bilem trees were treated at a concentration of 3,000 ㎍ / ㎖, and the rice blast fungus, rice sheath blight, The control effect against wheat red rust showed a high control effect of over 73%. The leaf and stem extract showed 50% control against pepper anthracnose. At the concentration of 1,000 ㎍ / ㎖, the two kinds of extracts showed 80% higher control value against rice blast, and 50 ~ 60% control value against rice sheath blight and wheat red rust (Table 2) ).

또한, 시기별로 채취한 빌레나무의 전초추출물을 3,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 채취시기에 관계없이 벼 도열병에 대하여 방제가 98%의 높은 방제활성을 나타냈고 9월에 채취한 시료는 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 고추 탄저병에 대하여 방제 활성이 다른 시기와 비교해서 다소 높은 방제 효과를 나타냈다(표 3 참조).In addition, when the extracts of Pinus sylvestris extracts were treated at a concentration of 3,000 ㎍ / ㎖, the control activity against rice blast fungus was 98% regardless of harvesting time. In September, Herbicide blight, tomato gray mold, and red pepper anthracnose were shown to have a somewhat higher control effect (see Table 3).

또한, 빌레나무 잎·줄기추출물의 8가지 식물병원균에 대한 균사생장 억제활성을 확인한 결과 빌레나무 잎·줄기추출물을 333 ㎍/㎖ 이상의 농도로 처리했을 때, 벼 도열병 원인균인 마그나포르테 오라이제의 균사 생장이 100% 억제되었고 111㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 마그나포르테 오라이제(72.1%), 알터나리아 브라시시콜라 (53.4%), 스클레로티니아 스클레로티오럼(40.7%), 콜레토트리쿰 프럭티콜라(37.8%) 순으로 균사생장억제율이 높았으며, 처리농도가 높아짐에 따라 억제율이 증가하였다. 1,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 토마토 역병 원인균인 파이토프토라 인페스탄스에 대한 균사생장억제율은 69.3%으로 급증했으나, 푸자리움 옥시스포럼, 보트라이티스 시네리아, 라이족토니아 솔라니에 대한 균사생장억제율은 20.2~35.7%로 낮았고 벼도열병균에 대한 빌레나무 잎·줄기추출물의 균사생장억제 활성이 가장 높았다(표 4 참조).In addition, the inhibition of mycelial growth inhibition on 8 plant pathogenic microbial strains of Lilium leaves and stem extracts revealed that when the leaves and stem extracts of Liliaceae were treated at a concentration of 333 ㎍ / ㎖ or more, the mycelial growth of Magnaporthe oryzae (72.1%), Alteraria brassicola (53.4%), Sclerotinia sclerotiorum (40.7%), and Staphylococcus aureus were found to be 100% Cholate tricum fructicola (37.8%) in order of inhibition rate of mycelial growth. When treated at a concentration of 1,000 ㎍ / ㎖, mycelial growth inhibition rate against the P. aeruginosa pitoflora infestans increased to 69.3%. However, the rate of inhibition of mycelial growth against the P. aeruginosa fungus, P. vorotis cinerea, The inhibition rate of mycelial growth was low at 20.2 ~ 35.7%, and the mycelial growth inhibition activity of the extracts of Lilium leaves and stem extracts against rice blast fungi was highest (see Table 4).

또한, 빌레나무 잎·줄기추출물의 9가지 식물병원성 세균에 대한 세균생장 억제활성을 확인한 결과 빌레나무 잎·줄기추출물의 처리농도가 높아짐에 따라 아그로박테리움 튜메파시엔스의 성장을 52.1%까지 억제하는 효능을 나타내었고 111 ㎍/㎖의 농도로 처리했을 때, 버크홀데리아 글루메의 생장을 40% 억제하는 효능을 나타냈으나, 처리농도가 높아짐에 따른 생장억제활성의 증가는 나타나지 않았다. 1,000㎍/㎖의 농도로 처리했을 때, 펙토박테리움 카로토보럼의 생장을 17.3%까지 저해하는 효능을 나타냈다(표 5 참조).In addition, the bacterial growth inhibition activity of nine phytopathogenic bacterium of Lilium leaf and stem extracts showed that the growth of Agrobacterium tumefaciens decreased to 52.1% And 111 ㎍ / ㎖ inhibited the growth of Burkholderia glume by 40%, but the growth inhibitory activity did not increase with increasing treatment concentration. When treated at a concentration of 1,000 μg / ml, the effect of inhibiting the growth of Pectobacterium carotovorum was inhibited up to 17.3% (see Table 5).

또한, 빌레나무 메탄올추출물 용매 분획의 7가지 식물병에 대한 방제활성을 확인한 결과, 에틸아세테이트분획물과 n-부탄올분획물이 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 벼 도열병에 대해 90% 이상의 방제가를 나타냈고, 밀 붉은녹병에 대해 67%의 방제가를 나타냈다. 하지만 수용액층은 방제활성을 나타내지 않았다. 따라서 빌레나무 추출물의 항균활성물질은 수용성 물질이 아닌 비극성 물질로 추정되었다(표 6 참조).In addition, the inhibitory activity against the seven plant diseases of the extract of methanol extract of bichescholesterol showed that the ethyl acetate fraction and the n - butanol fraction had a control value of over 90% against rice blast fungus at the concentration of 1,000 ㎍ / ㎖, 67% of the red rust showed a control value. However, the aqueous solution layer showed no controlling activity. Therefore, the antimicrobial active substance of bile extract was not a water-soluble substance but a non-polar substance (see Table 6).

또한, 빌레나무 메탄올추출물 용매 분획의 벼 도열병균 균사생장 억제 활성을 확인한 결과, 에틸아세테이트분획물과 n-부탄올분획물이 벼 도열병균의 균사생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 in vitro 조건에서 항균활성을 나타내는 물질이 벼 도열병에 방제 활성을 나타내는 유효성분일 것으로 확인되었다(도 2 참조).The ethyl acetate fraction and the n - butanol fraction inhibited mycelial growth of the rice blast fungus by the methanol extract of Bilkeo extract. Therefore, it was confirmed that a substance exhibiting antimicrobial activity under in vitro conditions is an active ingredient showing a controlling activity against rice blast (see FIG. 2).

따라서, 본 발명의 빌레나무 추출물 및 이의 분획물은 천연물로서 인체에 무해하고 자연계에서 생분해되어 환경부하가 적으면서 벼 도열병(Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(Puccinia recondita) 및 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes) 등 식물진균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 식물병 방제용 조성물 또는 생물농약으로 개발될 수 있고 고부가가치의 유기농산물 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the extract of the invention and its fractions are natural products harmless to the human body, biodegraded in the natural environment and have a small environmental load, and thus can be used for producing Magnaporthe oryzae , Rhizoctonia solani ), tomato gray mold ( Botrytis cinerea ), tomato blight ( Phytophthora infestans ), wheat red rust ( Puccinia recondita ) and pepper anthracnose ( Colletotrichum coccodes and the like. Therefore, it can be developed as an environmentally friendly composition for controlling plant diseases or as a biochemical pesticide, and can be usefully used in the production of high value-added organic agricultural products.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 계면활성제 및 발효알콜이 추가로 포함될 수 있으며, 추가로 포함되는 계면활성제의 양은 전체 조성물 100 중량부를 기준으로 1 내지 10 중량부, 추가로 포함되는 발효알콜의 양은 전체 조성물 100 중량부를 기준으로 1 내지 20 중량부일 수 있다.The composition for controlling plant diseases according to the present invention may further contain a surfactant and a fermented alcohol, and the amount of the surfactant further included is 1 to 10 parts by weight based on 100 parts by weight of the total composition, and the amount of the fermented alcohol May be 1 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the total composition.

상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소비탄 라우릴, 소디움도데실 벤젠썰포네이트, 실리콘 폴리에테르 코폴리머 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 않는다. 상기 발효알콜은 통상적으로 사용되는 발효알콜을 의미하며, 바람직하게는 95% 주정일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물에는 살균효과 강화나 살균범위 확대를 위하여, 살균효과가 알려진 공지의 식물추출물이 더 포함될 수 있다.The surfactant may be at least one selected from the group consisting of polyoxyethylene sorbitan lauryl, sodium dodecylbenzene sisphonate, and silicone polyether copolymer, but is not limited thereto. The fermentation alcohol means a commonly used fermentation alcohol, preferably 95% alcohol. In addition, the composition of the present invention may further include a known plant extract having a sterilizing effect for enhancing the sterilizing effect or expanding the sterilization range.

본 발명은 식물병 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제방법을 제공하며, 처리방법은 특별히 한정되지 않고, 예컨대 식물이나 토양에 첨가하는 물이나 비료에 첨가하는 방법 등을 들 수 있다.The present invention provides a plant disease control method comprising treating a plant or a soil with a composition for controlling plant disease, the treatment method is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding to water or fertilizer added to plants or soil .

상기 식물은 바람직하게는 원예식물일 수 있으며, 과채류, 엽채류, 근채류 등을 포함하며, 보다 구체적으로 상기 과채류는 가지, 고추, 딸기, 수박, 오이, 참외, 토마토, 피망, 호박 등을 포함하고, 엽채류는 배추, 부추, 상추, 쌈채소 등을 포함하며, 근채류는 무 등을 포함할 수 있다.More specifically, the fruit and vegetables include branches, peppers, strawberries, watermelons, cucumbers, melons, tomatoes, bell peppers, amber and the like, and more preferably, Leafy vegetables include cabbage, leek, lettuce, and vegetable vegetables, and root vegetables may contain nothing.

상기 식물병 방제용 조성물은 적절한 배율로 희석하여 사용할 수 있으며, 예컨대, 무게 기준으로 500배 이하 (예컨대, 10 내지 500배), 바람직하게는 300배 이하 (예컨대 10 내지 300배), 더욱 바람직하게는 200배 이하 (예컨대, 10 내지 200배) 의 희석배율로 희석하여 사용할 수 있다.The plant disease controlling composition may be diluted with an appropriate amount and may be used in an amount of not more than 500 times (for example, 10 to 500 times), preferably not more than 300 times (for example, 10 to 300 times) May be diluted to a dilution magnification of 200 times or less (for example, 10 to 200 times).

본 발명의 방제용 조성물의 희석에 사용되는 희석제는 특별한 제한이 없으며 관련 분야에서 통상적으로 사용되는 희석제를 사용할 수 있으며, 예컨대, 물을 사용할 수 있다.No particular limitation is imposed on the diluent used for diluting the control composition of the present invention, and a diluent commonly used in the related art can be used. For example, water can be used.

본 발명의 방제방법은 식물 또는 토양에 처리하되, 식물병 방제용 조성물을 식물의 경엽에 3일 내지 5일 간격으로 하여 2 내지 3회 살포하는 것이 바람직하다. The controlling method of the present invention is preferably applied to a plant or soil, wherein the composition for controlling a plant disease is sprayed on the foliage of a plant every 2 to 3 days at intervals of 3 to 5 days.

본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물의 주성분은 식물 이차대사산물로 원칙적인 유기합성살균제의 살포가 불가한 친환경농업에 적합하며, 사람과 가축에 대한 유해성과 잔류독성이 없기 때문에 농산물의 안전성이 보장되므로 원예식물의 수확기 중에도 처리가 가능하다.The main component of the composition for controlling plant diseases according to the present invention is a plant secondary metabolite, which is suitable for environmentally friendly agriculture in which it is impossible to dispense organic synthetic fungicide in principle and there is no harmfulness and residual toxicity to human and livestock, So it can be processed even during the harvesting period of horticultural plants.

이들 조성물의 살포 시 식물에 안전하여 유기합성살균제를 대체할 수 있는 안전한 방제물질이다. 또한 화학농약과 혼용 처리하거나 처리 중간에 살포하여도 식물병 방제가 가능하므로 화학농약의 살포횟수 절감에도 크게 기여할 수 있다.It is a safe control material which can substitute organic synthetic fungicide safely in plants when spraying these compositions. Also, even when mixed with chemical pesticides or sprayed in the middle of treatment, it is possible to control the plant diseases, which can contribute to a reduction in the number of spraying of chemical pesticides.

본 발명은 식물병 방제용 조성물을 포함하는 식물병 방제제(제품)를 제공한다. 상기 식물병 방제제는 농축물로서 제형화될 수 있으며, 최종 사용자가 적절한 희석배율로 희석시켜 사용할 수 있다. The present invention provides a plant disease controlling agent (product) comprising a composition for controlling a plant disease. The herbicide may be formulated as a concentrate and may be diluted to an appropriate dilution by the end user.

본 발명에 따른 방제제는 그 자체로 토양 또는 식물에 처리되고 식물 보호를 제공하는 유동 가능한 제형, 현탁액, 미세 현탁액, 에멀젼(예컨대, 서스포에멀젼, 마이크로에멀젼), 분말 (예컨대, 습윤 가능한 분말), 과립 농축물, 페이스트 등의 형태로 제형화될 수 있다.The controlling agent according to the present invention is a flowable formulation, suspension, microsuspension, emulsion (e. G., Suspension emulsion, microemulsion), powder (e. G., Wettable powder) , Granular concentrates, pastes, and the like.

또한, 본 발명의 식물병 방제제는 유효성분으로서 필요에 따라 살충제, 다른 살균제, 제초제, 식물생장조절제, 비료, 광물질 등의 기타 성분을 포함할 수 있다.In addition, the plant disease control agent of the present invention may contain other components such as insecticides, other fungicides, herbicides, plant growth regulators, fertilizers and minerals as necessary as an effective ingredient.

상기 식물병 방제제는 식물병 방제용 조성물을 유효성분 중량을 기준으로 0.1 내지 99 중량부 바람직하게는 10 내지 90 중량부, 더욱 바람직하게는 50 내지 90 중량부의 양으로 포함할 수 있고, 잔부로서 1종 이상의 계면활성제 및/또는 당해 분야에 공지된 임의의 기타 불활성 성분, 예를 들면, 보호 콜로이드, 접착제, 증점제, 틱소트로픽제, 침투제, 보존제, 안정화제, 소포제, 동결방지제, 금속이온봉쇄제, 염료, 안료, 착색제 및 중합체와 함께 담체를 추가로 포함할 수 있다. The plant disease control agent may contain 0.1 to 99 parts by weight, preferably 10 to 90 parts by weight, more preferably 50 to 90 parts by weight, based on the weight of the active ingredient, of the composition for controlling plant diseases, One or more surfactants and / or any other inert ingredients known in the art, such as protective colloids, adhesives, thickeners, thixotropic agents, penetrants, preservatives, stabilizers, antifoaming agents, cryoprotectants, , Dyes, pigments, colorants and polymers.

상기 침투제로서는, 지방 알코올 알콕시레이트, 광유, 식물유, 광유 혹은 식물유의 에스테르 등을 들 수 있다. Examples of the penetrating agent include fatty alcohol alkoxylates, mineral oils, vegetable oils, mineral oils, and esters of vegetable oils.

상기 안정화제로서는, 에폭시화 동식물유, 비이온계 폴리옥시에틸렌형 계면활성제, 음이온계 폴리옥시에틸렌형 계면활성제, 다가 알코올 및 염기성 물질 등을 들 수 있다. Examples of the stabilizer include epoxidized plant and animal oils, nonionic polyoxyethylene surfactants, anionic polyoxyethylene surfactants, polyhydric alcohols and basic substances.

상기 소포제로서는, 상품명 Anti-mousse(BELCHIM CROP PROTECTION제) 등을 들 수 있다. Examples of the defoaming agent include trade name Anti-mousse (manufactured by BELCHIM CROP PROTECTION).

상기 동결 방지제로서는, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등을 들 수 있다.Examples of the cryoprotectant include ethylene glycol, propylene glycol, and the like.

상기 담체로서는, 고체 담체와 액체 담체로 나눌 수 있고, 고체 담체로서는, 전분, 설탕, 셀룰로오스분, 시클로 덱스트린, 활성탄, 대두분, 소맥분, 왕겨분, 목분(木粉), 어분(魚粉), 분유 등의 동식물성 분말; 탈크, 카올린, 벤토나이트, 유기 벤토나이트, 탄산칼슘, 황산칼슘, 중탄산나트륨, 제올라이트, 규조토, 화이트카본, 진흙, 알루미나, 실리카, 유황분말, 소석회 등의 광물성 분말 등을 들 수 있다. 또한, 액체 담체로서는, 물; 대두유, 면실유 등의 식물유; 소의 지방, 경유 등의 동물유; 에틸알코올, 에틸렌글리콜 등의 알코올류; 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 이소포론 등의 케톤류; 디옥산, 테트라히드로푸란 등의 에테르류; 케로신, 등유, 유동파라핀, 시클로헥산 등의 지방족 탄화수소류; 톨루엔, 크실렌, 트리메틸벤젠, 테트라메틸벤젠, 솔벤트 나프타 등의 방향족 탄화수소류; 클로로포름, 클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류; N,N-디메틸포름아미드 등의 산아미드류; 초산에틸에스테르, 지방산의 글리세린 등의 에스테르류; 아세트니트릴 등의 니트릴류; 디메틸술폭시드 등의 유황함유 화합물류, 혹은, N-메틸-2-피롤리돈 등을 들 수 있다.Examples of the carrier include a solid carrier and a liquid carrier. Examples of the solid carrier include starch, sugar, cellulose powder, cyclodextrin, activated carbon, soybean powder, wheat flour, rice hull powder, wood flour, fish meal, The same vegetable powder; Mineral powders such as talc, kaolin, bentonite, organic bentonite, calcium carbonate, calcium sulfate, sodium bicarbonate, zeolite, diatomaceous earth, white carbon, clay, alumina, silica, sulfur powder and slaked lime. Examples of the liquid carrier include water; Vegetable oils such as soybean oil and cottonseed oil; Animal oil such as bovine fat, light oil; Alcohols such as ethyl alcohol and ethylene glycol; Ketones such as acetone, methyl ethyl ketone, methyl isobutyl ketone and isophorone; Ethers such as dioxane and tetrahydrofuran; Aliphatic hydrocarbons such as kerosine, kerosene, liquid paraffin, and cyclohexane; Aromatic hydrocarbons such as toluene, xylene, trimethylbenzene, tetramethylbenzene, and solvent naphtha; Halogenated hydrocarbons such as chloroform and chlorobenzene; Acid amides such as N, N-dimethylformamide; Esters such as acetic acid ethyl ester and glycerin of fatty acid; Nitriles such as acetonitrile; Sulfur-containing compounds such as dimethyl sulfoxide, and N-methyl-2-pyrrolidone.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 추출물의 7가지 ) 7 kinds of extract 식물병에In botanical bottles 대한 방제활성 확인 Confirmation of control activity against

<1-1> <1-1> 빌레나무Tree 에탄올 추출물의 제조 Preparation of ethanol extract

본 발명자들은 빌레나무 추출물을 제조하기 위해, 건조한 빌레나무(Maesa japonica)의 전초 시료를 잘게 잘라 70% 에탄올 수용액을 가하고 상온에서 24시간 동안 추출하여 여과지로 거른 다음 여과물을 감압농축하여 120 ㎎의 추출물을 얻었다. In order to prepare the extract of bamboo tree, the extracts of Maesa japonica were cut into small pieces and 70% ethanol aqueous solution was added thereto. The extract was extracted at room temperature for 24 hours and filtered. The filtrate was concentrated under reduced pressure to give 120 mg An extract was obtained.

하기 빌레나무 추출물의 식물병 방제효과 평가 실험을 위해 60 ㎎/㎖ 농도로 메탄올에 용해한 식물추출물 시료 2 ㎖를 증류수 38 ㎖로 희석하였고, 전착제 트윈 20(tween 20)을 250 ㎍/㎖ 농도가 되도록 첨가하여 3,000 ㎍/㎖ 농도의 추출물 용액을 40 ㎖ 준비했다. 이때 대조구는 5%의 메탄올과 250 ㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다. For the evaluation of the phytotoxic effect of the extracts, 2 ㎖ of the plant extract solution dissolved in methanol at a concentration of 60 ㎎ / ㎖ was diluted with 38 ㎖ of distilled water, and the concentration of the tween 20 (tween 20) was 250 ㎍ / ㎖ To prepare 40 ml of an extract solution having a concentration of 3,000 占 퐂 / ml. Here, distilled water containing 5% of methanol and 250 占 퐂 / ml of Tween 20 was used as the control.

<1-2> <1-2> 빌레나무Tree 에탄올 추출물의 방제활성 확인 Identification of the control activity of ethanol extracts

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 빌레나무 추출물의 벼 도열병(Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 보리 흰가루병(Blumeria graminis f. sp . hordei), 밀 붉은녹병(Puccinia recondita) 및 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes) 등 7가지 식물병에 대한 in vivo 항균활성을 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.The inventors of the present invention found that Magnaporthe oryzae , Rhizoctonia spp., And Rhizoctonia spp. solani ), tomato gray mold ( Botrytis cinerea ), tomato blight ( Phytophthora infestans), barley powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. hordei ), wheat leaf rust (Puccinia recondita ) and anthracnose ( Colletotrichum coccodes ) were investigated as follows.

구체적으로, 각 식물병 당 2개의 포트를 이용하였고, 추출물 용액을 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀 식물은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 25 ± 5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다. Specifically, two pots were used per plant, and the extract solution was sprayed on the leaf surface, then air-dried for 24 hours, and each plant pathogen was inoculated. The rice, tomato, barley and wheat plants used in the experiment were filled with plastic pots with a diameter of 4.5 ㎝ of about 70% of the ground or horticultural soil, seeded and cultivated in a greenhouse at 25 賊 5 캜 for 1 to 4 weeks .

벼 도열병은 3~4 엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5 × 105 spores/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. The rice blast fungus was sprayed with a spore suspension (5 × 10 5 spores / ㎖) of Magnaporthe oryzae (Korea Research Institute of Chemical Technology), which is a causative organism of blast fungus , And then cultured in a constant temperature room at 25 DEG C for 4 days to induce the onset.

벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g 및 증류수 100 ㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5 엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. Rhizoctonia solani ( Rhizoctonia solani , Korea Research Institute of Chemical Technology), which is a causative agent of sheath blight, was cultivated for 7 days in medium (90 g of bran, 15 g of rice hull and 100 ml of distilled water) Seedlings were inoculated, treated for 4 days in a wet condition at 25 ° C, and cultured in a constant temperature room at 25 ° C for 4 days to induce the onset.

토마토 역병은 3~4 엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(105 sporangia/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다. Tomato blight was sprayed on tomato seedlings from 3 to 4 leafy tomatoes by inoculation with a suspension of the extruded juveniles from Phytophthora infestans (Kangnung National University) (10 5 sporangia / ㎖) Actually, the cells were treated for 2 days and cultured in a constant temperature and humidity room at 25 ° C for 1 day to induce the onset.

토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3~4 엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5 × 105 spores/㎖)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다.Tomato gray mold was detected in 3 ~ 4 seedlings of tomatoes by Botrytis , a causative organism of gray mold spore suspension of the cinerea, Korea Research Institute of Chemical Technology) (after treatment with 5 × 10 5 spores / ㎖) , it was induced by the onset for 3 days in a moist substance of 20 ℃.

밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 리콘디타(Puccinia recondita, 인천대학교)의 포자를 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67 g spores/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실상에서 하루 동안 처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다. Wheat red rust is caused by Puccinia , a causative organ of rust, Recondita , Incheon University) was suspended in 250 .mu.g / ml Tween 20 solution in an amount of 0.67 g spores / l, treated for 20 days at 20 ° C in a humidified chamber, transferred to a constant temperature chamber at 20 ° C, To induce the onset.

보리 흰가루병은 보리의 1 엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 블루메리아 그래미니스 포메 스페살리스 홀데이(Blumeria graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다.Barley powdery mildew is the cause of a subculture in the host plant, the first leaf stage seedlings of barley powdery mildew Blue Almeria Grammy Nice Pomeranian seupesal lease Hall Day (Blumeria graminis f. sp. hordei , Korea Research Institute of Chemical Technology) were inoculated and incubated for 7 days in a constant temperature chamber at 20 ° C to induce the onset. Tomato gray mold and tomato blight were examined 3 days after inoculation, 5 days after inoculation with rice blast, 7 days after inoculation with wheat red rust, barley powdery mildew, and 8 days after inoculation with rice sheath blight.

한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0 ㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3~4 엽기까지 키운 다음 상기 실시예 <1-1>에서 준비된 빌레나무 추출물 용액을 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4 × 105 spores/㎖)을 분무 접종하였다. 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리 후에 항온항습실(25℃, 상대습도 80%)에서 1일간 재배하였고, 접종 3일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다.In order to test the antifungal activity against pepper anthracnose, a plastic pot having a diameter of 7.0 cm was filled with about 70% of the soil for horticultural use, and then the best pepper seeds were sown. The seeds were raised in greenhouse to 3-4 weeks, 1-1> were sprayed on the leaf surface. After spraying the sample, it was dried at room temperature for 24 hours and then colletotrichum (4 × 10 5 spores / ㎖) of the spore suspension of the coccodes (Korea University). (25 ℃, relative humidity 80%) for 1 day after 2 days of damp treatment at 25 ℃ on the wet field. The percentage of lesion area (%) was examined 3 days after inoculation.

상기로부터 얻은 병반면적율(%)을 이용하여 다음과 같은 식에 따라 방제가(%)를 계산하였다.The% control was calculated according to the following equation using the percent area percentage of the lesion obtained from the above.

[수학식 1][Equation 1]

Figure 112016068298318-pat00001
Figure 112016068298318-pat00001

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 빌레나무 전초에서 70% 에탄올 수용액으로 수득한 추출물을 3,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 보리 흰가루병을 제외한 나머지 6종의 식물병에 대한 방제활성을 나타내는 것을 확인하였다(표 1 및 도 1). 특히, 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병에 대하여는 방제가 80% 이상의 강한 방제 활성이 나타냈다.As a result, as shown in Table 1, when the extract obtained with a 70% ethanol aqueous solution was treated at a concentration of 3,000 μg / ml in the bark beetle outbreak, it was confirmed that it exhibited the controlling activity against the remaining six plant diseases except the barley powdery mildew (Table 1 and Fig. 1). Especially, rice flour disease, wheat red rust and red pepper anthracnose showed strong control activity of 80% or more.

시료sample 농도 (㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 방제가(%)Control (%) RCBRCB RSBRSB TGMTGM TLBTLB WLRWLR BPMBPM PANPAN 빌레나무 전초추출물Bilye tree seed extract 3,0003,000 9494 5555 4343 9494 100100 00 7979 RCB: 벼 도열병; RSB; 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병; TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병RCB: rice blast; RSB; Rice sheath blight; TGM: Tomato gray mold disease; TLB: tomato blight; WLR: wheat red rust; BPM: barley powdery mildew; PAN: pepper anthracnose

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 부위별 추출물의 7가지 ) 7 kinds of extracts by site 식물병에In botanical bottles 대한 방제활성 확인 Confirmation of control activity against

<2-1> <2-1> 빌레나무Tree 부위별 추출물의 제조 Preparation of extracts by site

본 발명자들은 빌레나무 잎 및 줄기 건조시료 500 g을 잘게 잘라 10 ℓ의 70% 메탄올 수용액을 가한 후 상온에서 24시간 추출하여 얻은 메탄올 추출물을 여과지를 사용하여 거른 다음, 여과물을 감압농축하여 78.3 g의 잎·줄기추출물을 얻었다. The present inventors finely cut 500 g of dried bamboo leaves and stem water samples and 10 L of 70% aqueous methanol solution was added thereto, and the methanol extract obtained by extraction at room temperature for 24 hours was filtered using a filter paper. The filtrate was concentrated under reduced pressure to obtain 78.3 g Leaf and stem extracts were obtained.

동일한 방식으로 뿌리 건조시료 300 g을 잘게 잘라서 70% 메탄올 수용액 3 ℓ를 가한 후 상온에서 24시간 동안 추출하고 감압농축하여 34.8 g의 뿌리추출물을 얻었다. In the same manner, 300 g of root drying sample was finely cut, and 3 L of a 70% methanol aqueous solution was added. The mixture was extracted at room temperature for 24 hours and concentrated under reduced pressure to obtain 34.8 g of root extract.

상기 부위별 추출물을 20 ㎎/㎖ 및 60 ㎎/㎖ 두 가지 농도로 메탄올에 용해시킨 각각의 시료 2 ㎖를 증류수 38 ㎖에 희석하였고, 전착제 트윈 20(tween 20)을 250 ㎍/㎖ 농도가 되도록 첨가하여 1,000 ㎍/㎖ 및 3,000 ㎍/㎖ 농도의 부위별 추출물 용액을 40 ㎖씩 준비했다. 이때 대조구는 5%의 메탄올과 250 ㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다. 2 ml of each sample obtained by dissolving the above extract in methanol at two concentrations of 20 mg / ml and 60 mg / ml was diluted in 38 ml of distilled water, and the concentration of the electrodeposited tween 20 (tween 20) was adjusted to 250 μg / ml To prepare 40 ml of the extract solution of 1,000 μg / ml and 3,000 μg / ml, respectively. Here, distilled water containing 5% of methanol and 250 占 퐂 / ml of Tween 20 was used as the control.

<2-2> <2-2> 빌레나무Tree 부위별 추출물의 방제활성 확인 Identification of control efficacy of extracts by site

본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 얻은 빌레나무 부위별 추출물의 방제활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서와 동일한 방법으로 식물병 방제효과를 평가했다.The present inventors evaluated the plant disease control effect in the same manner as in Example <1-2> in order to confirm the controlling activity of the extract of the bamboo plant extract obtained in Example <2-1> above.

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 빌레나무의 잎·줄기추출물 또는 뿌리추출물 용액을 3,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병에 대하여 방제가 73% 이상의 높은 방제 효과를 나타냈고, 잎·줄기추출물의 경우 고추 탄저병에 대하여 방제가 50%의 방제활성을 나타내는 것을 확인하였다. 1,000 ㎍/㎖ 농도에서도 두 가지 종류의 추출물은 벼 도열병에 대하여 80% 이상의 높은 방제가를 나타냈고, 벼 잎집무늬마름병균, 밀 붉은녹병에 대해서는 50~60%의 방제가를 나타는 것을 확인하였다(표 2). 빌레나무의 부위별 추출물은 식물병 방제활성에 있어 거의 차이를 나타내지 않았다.As a result, as shown in Table 2, when treated with a leaf extract, stem extract or root extract solution at a concentration of 3,000 μg / ml, the control against rice blast, rice sheath blight, and wheat rust was more than 73% The extracts of leaf and stem extracts showed 50% inhibitory activity against pepper anthracnose. At the concentration of 1,000 ㎍ / ㎖, the two kinds of extracts showed more than 80% control effect against rice blast, and 50 ~ 60% of control against rice blast fungus and wheat red rust (Table 2). The extracts of each part of the bilet trees showed little difference in plant disease control activity.

시료sample 농도 (㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 방제가(%)Control (%) RCBRCB RSBRSB TGMTGM TLBTLB WLRWLR BPMBPM PANPAN 빌레나무 잎·줄기추출물Leaf tree stem extract 3,0003,000 9090 7575 1414 77 8383 00 5050 1,0001,000 8787 5050 00 00 6060 00 2020 빌레나무 뿌리추출물Bile root extract 3,0003,000 9090 100100 1414 77 7373 00 3030 1,0001,000 8080 6060 00 77 5353 00 2020 RCB: 벼 도열병; RSB; 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병; TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병RCB: rice blast; RSB; Rice sheath blight; TGM: Tomato gray mold disease; TLB: tomato blight; WLR: wheat red rust; BPM: barley powdery mildew; PAN: pepper anthracnose

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 채취시기별 추출물의 7가지 ) Seven kinds of extracts 식물병에In botanical bottles 대한 방제활성 확인 Confirmation of control activity against

<3-1> <3-1> 빌레나무의Of the tree 채취 시기별 추출물의 제조 Preparation of Extract by Collection Period

본 발명자들은 시기별(1월, 6월, 9월, 12월)로 채취한 빌레나무의 전초를 잘게 잘라 메탄올을 가한 다음 상온에서 24시간 동안 추출하고 여과지를 사용하여 거른 후 여과물을 감압농축하여 건조된 추출물을 얻었다. The present inventors cut out the outbreaks of the bille trees collected in the period (January, June, September, December) by chopping and methanol for 24 hours at room temperature, filtered using a filter paper, To obtain a dried extract.

60 ㎎/㎖ 농도로 메탄올에 용해한 각각의 채취 시기별 빌레나무 전초 시료 2 ㎖를 증류수 38 ㎖로 희석하였고, 전착제 트윈 20(tween 20)을 250 ㎍/㎖ 농도가 되도록 첨가하여 3,000 ㎍/㎖ 농도의 시기별 추출물 용액을 40 ㎖씩 준비했다. 이때 대조구는 5%의 메탄올과 250 ㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다.2 ㎖ of the bilayers outpost specimen of each sampling period dissolved in methanol at a concentration of 60 ㎎ / ㎖ was diluted with 38 ㎖ of distilled water and added to the concentration of 250 ㎍ / ㎖ of the tween 20 of the electrodeposition agent. 40 ml of the extract solution of each period was prepared. Here, distilled water containing 5% of methanol and 250 占 퐂 / ml of Tween 20 was used as the control.

<3-2> <3-2> 빌레나무Tree 채취시기별 추출물의 방제활성 확인 Identification of control efficacy of extracts by collection period

본 발명자들은 상기 실시예 <3-1>에서 얻은 빌레나무 채취시기별 추출물의 방제활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서와 동일한 방법으로 식물병 방제효과를 평가했다. The present inventors evaluated the plant disease control effect in the same manner as in Example <1-2> in order to confirm the controlling activity of the extracts obtained by the extracting time of the bale trees obtained in the above Example <3-1>.

그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 시기별로 채취한 빌레나무의 전초추출물을 3,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 채취시기에 관계없이 벼 도열병에 대하여 방제가 98%의 높은 방제활성을 나타냈다. 9월에 채취한 시료는 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 고추 탄저병에 대하여 방제 활성이 다른 시기와 비교해서 다소 높은 방제 효과를 나타냈다(표 3). 하지만 전체적으로 보았을 때, 채취시기에 따른 식물병 방제효과의 차이는 거의 나타나지 않았다.As a result, as shown in Table 3, when the seedling extract of Bilye tree collected at different time points was treated at a concentration of 3,000 ㎍ / ㎖, the control effect against rice blast fungus was as high as 98% regardless of harvesting time. In September, the herbicidal activity against rice sheath blight, tomato gray mold, and red pepper anthracnose was somewhat higher than other control (Table 3). Overall, however, there was little difference in the effectiveness of plant disease control over harvesting time.

시료sample 채취시기When to collect 농도 (㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 방제가(%)Control (%) RCBRCB RSBRSB TGMTGM TLBTLB WLRWLR BPMBPM PANPAN 빌레나무 전초추출물Bilye tree seed extract 1월January 3,0003,000 9898 1010 4444 00 4747 00 4242 6월June 3,0003,000 9898 4545 6565 00 6767 00 3333 9월September 3,0003,000 9898 4545 7070 44 5858 00 6060 12월December 3,0003,000 9898 2323 6161 00 4747 00 3838 RCB: 벼 도열병; RSB; 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병; TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병RCB: rice blast; RSB; Rice sheath blight; TGM: Tomato gray mold disease; TLB: tomato blight; WLR: wheat red rust; BPM: barley powdery mildew; PAN: pepper anthracnose

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 잎·줄기추출물의 8가지 ) 8 kinds of leaves and stem extracts 식물병원균에On plant pathogens 대한 균사생장 억제활성 확인 Identification of mycelial growth inhibitory activity

본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 빌레나무 잎·줄기추출물을 100 ㎎/㎖의 농도로 메탄올에 용해시킨 시료를 사용하여 식물병원성 곰팡이의 균사생장을 억제하는 효능을 평가하였다. The present inventors evaluated the efficacy of inhibiting the mycelial growth of phytopathogenic fungi using a sample obtained by dissolving the bilayre leaf stem extract prepared in Example <2-1> in methanol at a concentration of 100 mg / ml.

구체적으로, 메탄올에 용해한 잎·줄기추출물을 111, 333, 1,000 ㎍/㎖ 농도로 PDA(감자한천배지, BD Biosciences)에 잘 섞어서 6-웰 플레이트(6-well plate)에 분주하였고, 배지의 정가운데에 3 ㎜ 직경의 곰팡이 균사디스크를 접종하였다. 8종의 곰팡이에 대하여 농도별로 3 반복하여 실험하였다. 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea)와 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)는 20℃에서 배양하였고, 나머지 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola), 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola), 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum)은 25℃에서 배양하였다. 1% 메탄올을 넣은 감자한천배지에서 배양한 것을 무처리구로 사용했으며, 무처리구의 곰팡이가 웰 직경의 70~80% 정도로 방사생장(radial growth) 했을 때, 무처리구와 처리구의 균사생장직경을 측정했다. 접종한 균사디스크직경 3 ㎜를 뺀 나머지 장경(major axis)과 단경(minor axis)의 길이의 평균값을 사용하여 균사생장직경 값을 구했다.Specifically, the leaf and stem extracts dissolved in methanol were mixed in a PDA (potato agar medium, BD Biosciences) at a concentration of 111, 333, and 1,000 μg / ml to a 6-well plate, In the middle, 3 mm diameter fungal hypha disks were inoculated. Eight species of fungi were tested in 3 replicates per concentration. Botrytis cinerea and Phytophthora ( Phytophthora) infestans ) were cultured at 20 ° C, and the remaining Alternaria brassicycola brassicicola , Colletotrichum &lt; RTI ID = 0.0 &gt; fructicola , Fusarium oxysporum , Magnaporthe &lt; RTI ID = 0.0 &gt; oryzae , Rhizoctonia solani , Sclerotinia sclerotiorum were cultured at 25 ° C. The mycelial growth diameter of untreated and treated mycelium was measured when the mold of the non-treatment area was irradiated with radial growth of 70 to 80% of the diameter of the well, which was cultured in a potato agar medium containing 1% methanol. Mycelial growth diameter values were obtained by using mean values of the major axis and minor axis length minus the inoculated mycelial disk diameter of 3 mm.

상기로부터 얻은 균사생장직경 값을 이용하여 다음과 같은 식에 따라 균사생장억제율(%)을 계산하였다.The mycelial growth inhibition rate (%) was calculated according to the following equation using the mycelial growth diameter value obtained from the above.

[수학식 2]&Quot; (2) &quot;

Figure 112016068298318-pat00002
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그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이 빌레나무 잎·줄기추출물을 333 ㎍/㎖ 이상의 농도로 처리했을 때, 벼 도열병 원인균인 마그나포르테 오라이제의 균사 생장이 100% 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 111 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 마그나포르테 오라이제(72.1%), 알터나리아 브라시시콜라(53.4%), 스클레로티니아 스클레로티오럼(40.7%), 콜레토트리쿰 프럭티콜라(37.8%) 순으로 균사생장억제율이 높았고, 처리농도가 높아짐에 따라 억제율이 증가하였다. 1,000 ㎍/㎖ 농도로 처리했을 때, 토마토 역병 원인균인 파이토프토라 인페스탄스에 대한 균사생장억제율은 69.3%으로 급증했으나, 푸자리움 옥시스포럼, 보트라이티스 시네리아, 라이족토니아 솔라니에 대한 균사생장억제율은 20.2~35.7%로 낮았다(표 4). 벼도열병균에 대한 빌레나무 잎·줄기추출물의 균사생장억제 활성이 가장 높았고, 이는 상기 <실시예 2>에서 빌레나무 잎·줄기추출물(1,000 ㎍/㎖)이 벼 도열병에 높은 방제가(87%)를 나타내는 것과 일치하는 결과를 나타냈다.As a result, as shown in Table 4, it was confirmed that mycelial growth of Magnaporthe oryzae, a causative agent of rice blast fungus, was inhibited by 100% when treated with a concentration of 333 ㎍ / ㎖ or higher. When treated at the concentration of 111 ㎍ / ㎖, Magnaporthe lucerne (72.1%), Alteraria brassicycola (53.4%), Sclerotinia sclerotiorum (40.7%), Cola (37.8%), and the inhibition rate was increased with increasing treatment concentration. When treated at a concentration of 1,000 ㎍ / ㎖, mycelial growth inhibition rate against the P. aeruginosa pitoflora infestans increased to 69.3%. However, the rate of inhibition of mycelial growth against the P. aeruginosa fungus, P. vorotis cinerea, Mycelial growth inhibition rate was 20.2 ~ 35.7% (Table 4). The highest inhibitory activity of Mycobacterium tuberosum L. and Stem Extracts against rice blast fungus was observed in the above Example 2 in that the extracts of Lilium japonica leaf and stem extract (1,000 μg / ml) ), Respectively.

식물병원성 곰팡이Plant pathogenic fungi 농도 (㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 균사생장억제율(%) ± 표준편차Mycelial growth inhibition rate (%) ± standard deviation MagnaportheMagnaporthe oryzaeoryzae 111111 72.1 ± 0.772.1 ± 0.7 333333 100100 1,0001,000 100100 AlternariaAlternaria brassicicolabrassicicola 111111 53.4 ± 1.953.4 ± 1.9 333333 58.4 ± 1.458.4 ± 1.4 1,0001,000 61.4 ± 1.261.4 ± 1.2 SclerotiniaSclerotinia sclerotiorumsclerotiorum 111111 40.7 ± 0.940.7 ± 0.9 333333 44.5 ± 1.344.5 ± 1.3 1,0001,000 44.9 ± 2.544.9 ± 2.5 ColletotrichumColletotrichum fructicolafructicola 111111 37.8 ± 3.737.8 ± 3.7 333333 38.2 ± 1.738.2 ± 1.7 1,0001,000 46.1 ± 2.246.1 ± 2.2 PhytophthoraPhytophthora infestansinfestans 111111 15.6 ± 1.815.6 ± 1.8 333333 31.3 ± 3.431.3 ± 3.4 1,0001,000 69.3 ± 3.469.3 ± 3.4 RhizoctoniaRhizoctonia solanisolani 111111 22.5 ± 0.922.5 ± 0.9 333333 30.8 ± 2.430.8 ± 2.4 1,0001,000 35.7 ± 1.635.7 ± 1.6 BotrytisBotrytis cinereacinerea 111111 19.4 ± 1.119.4 ± 1.1 333333 21.1 ± 3.721.1 ± 3.7 1,0001,000 32.2 ± 5.932.2 ± 5.9 FusariumFusarium oxysporumoxysporum 111111 9.8 ± 0.79.8 ± 0.7 333333 13.1 ± 3.013.1 ± 3.0 1,0001,000 20.2 ± 0.820.2 ± 0.8

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 잎·줄기추출물의 9가지 식물병원성 9 Plant Pathogens of Leaf and Stem Extracts 세균에 대한 세균생장 억제활성Bacterial growth inhibitory activity against bacteria 확인  Confirm

본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 빌레나무 잎·줄기추출물(100 ㎎/㎖ 농도로 메탄올에 용해시킨 시료)을 사용하여 식물병원성 세균의 생장을 억제하는 활성을 평가하였다. The present inventors evaluated the activity of inhibiting the growth of phytopathogenic bacteria by using the extract of Lilium japonica leaf and stem extract prepared in Example <2-1> (a sample dissolved in methanol at a concentration of 100 mg / ml).

구체적으로, 96-웰 플레이트(96-well plate)에서 액체배지 미량희석법(broth microdilution method)을 사용하였으며, 웰 당 100 ㎕의 TSB(tryptic soybean broth, BD Biosciences) 배지에서 빌레나무 추출물이 최종적으로 111, 333, 1,000 ㎍/㎖ 농도가 되도록 분주하였다. 9종의 식물병원성 세균 엑시도보락스 아베네(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae), 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 딕케야 크리산테마이(Dickeya chrysanthemi), 펙토박테리움 카로토보럼(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 슈도모나스 시린게(Pseudomonas syringae pv. lachrymans), 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum), 잔토모나스 아르보리콜라(Xanthomonas arboricola pv. pruni)에 대하여 농도별로 3 반복하여 실험하였다. 각 세균은 TSB 배지에서 30℃에서 2일 150 rpm으로 진탕배양 후 TSB 배지로 희석하여 분광광도계로 측정했을 때, OD600(600 ㎚에서 측정한 optical density)값이 0.1이 되도록 하여 세균농도가 약 5.0~8.0 × 107 CFU/㎖가 되도록 하였다. 희석한 TSB 세균배양액을 웰 당 1 ㎕씩 접종하여, 최종적으로 약 5.0~8.0 × 105 CFU/㎖가 되도록 하였다. 1% 메탄올을 넣은 TSB 배지에서 배양한 것을 무처리구로 사용했으며, 엑시도보락스, 아그로박테리움, 버크홀데리아, 클라비박터, 펙토박테리움은 30℃에서 24시간 정치배양한 후 처리구와 무처리구의 OD600값을 측정하고, 딕케야, 슈도모나스, 랄스토니아, 잔토모나스는 48시간 정치배양 후 OD600값을 측정하였다.Specifically, a broth microdilution method was used in a 96-well plate, and in a 100 μl TSB (tryptic soybean broth, BD Biosciences) medium per well, , 333, 1,000 占 퐂 / ml. Nine species of phytopathogenic bacteria, Acidovorax avenae subsp. cattleyae), Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens), Burke holde Ria glue methoxy (Burkholderia glumae , &lt; RTI ID = 0.0 &gt; Clavibacter & lt ; / RTI &gt; michiganensis subsp . michiganensis , Dickeya chrysanthemi , Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum , Pseudomonas sp. syringae pv . lachrymans , Ralstonia &lt; RTI ID = 0.0 &gt; solanacearum), Pseudomonas janto ahreubo Ricola (Xanthomonas arboricola pv . pruni ) was repeated three times for each concentration. Each bacterium was cultured in TSB medium at 30 ° C for 2 days with shaking at 150 rpm, diluted with TSB medium, and measured with a spectrophotometer. The OD 600 (optical density measured at 600 nm) was 0.1, 5.0 to 8.0 x 10 &lt; 7 &gt; CFU / ml. Of diluted bacterial TSB culture solution was inoculated by 1 ㎕ per well, was adjusted to finally about 5.0 ~ 8.0 × 10 5 CFU / ㎖. After incubation at 30 ° C for 24 hours, the cells were cultured in TSB medium supplemented with 1% methanol and used as an untreated control. Exodoborax, Agrobacterium, Burkholderia, Claviabacter, and Pectobacterium were incubated for 24 hours at OD 600 values were measured. Dickey, Pseudomonas, Ralstonia, and Zanthomonas were incubated for 48 hours to measure an OD 600 value.

상기로부터 얻은 OD600 값을 이용하여 다음과 같은 식에 따라 세균생장억제율(%)을 계산하였다. Using the OD 600 value obtained from the above, the inhibition rate (%) of bacterial growth was calculated according to the following equation.

[수학식 3]&Quot; (3) &quot;

Figure 112016068298318-pat00003
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그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 빌레나무 잎·줄기추출물의 처리농도가 높아짐에 따라 아그로박테리움 튜메파시엔스의 성장을 52.1%까지 억제하는 효능을 나타내는 것을 확인하였다. 111 ㎍/㎖의 농도로 처리했을 때, 버크홀데리아 글루메의 생장을 40% 억제하는 효능을 나타냈으나, 처리농도가 높아짐에 따른 생장억제활성의 증가는 나타나지 않았다. 또한, 1,000 ㎍/㎖의 농도로 처리했을 때, 펙토박테리움 카로토보럼의 생장을 17.3%까지 저해하는 효능을 나타내는 것을 확인하였다(표 5). 전체적으로 보았을 때, 빌레나무 잎·줄기추출물의 식물병원성 세균에 대한 생장억제활성은 낮았다.As a result, as shown in Table 5, it was confirmed that the effect of suppressing the growth of Agrobacterium tumefaciens to 52.1% was increased as the treatment concentration of the leaf extract and stem extract of bilemens increased. 111 ㎍ / ㎖ inhibited the growth of Burkholderia glume by 40%, but the growth inhibitory activity did not increase with increasing treatment concentration. In addition, it was confirmed that when treated at a concentration of 1,000 占 퐂 / ml, the effect of inhibiting the growth of Pectobacterium carotovorum was inhibited up to 17.3% (Table 5). Overall, the growth inhibitory activity of phytophthora leaves and stem extracts against phytopathogenic bacteria was low.

식물병원성 세균Phytopathogenic bacteria 농도 (㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 세균생장억제율(%)Bacterial growth inhibition rate (%) Acidovorax avenae subsp. cattleyae Acidovorax avenae subsp. cattleyae 111111 00 333333 8.18.1 1,0001,000 00 AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens 111111 1616 333333 32.532.5 1,0001,000 52.152.1 BurkholderiaBurkholderia glumaeglumae 111111 4040 333333 41.141.1 1,0001,000 37.937.9 Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis 111111 66 333333 00 1,0001,000 7.67.6 DickeyaDickeya chrysanthemichrysanthemi 111111 00 333333 00 1,0001,000 00 Pectobacterium carotovarum subsp. carotovarum Pectobacterium carotovarum subsp. carotovarum 111111 4.24.2 333333 3.83.8 1,0001,000 17.317.3 Pseudomonas syringae pv. lachrymans Pseudomonas syringae pv. lachrymans 111111 00 333333 5.15.1 1,0001,000 00 RalstoniaRalstonia solanacearumsolanacearum 111111 5.85.8 333333 00 1,0001,000 00 Xanthomonas arboricola pv. pruni Xanthomonas arboricola pv. pruni 111111 00 333333 00 1,0001,000 00

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 메탄올 추출물 용매 분획의 7가지 ) 7 kinds of methanol extract solvent fraction 식물병에In botanical bottles 대한 방제활성 확인 Confirmation of control activity against

<6-1> <6-1> 빌레나무Tree 메탄올 추출물의 용매  Solvent of methanol extract 분획물Fraction 제조 Produce

빌레나무 추출물 항균활성물질의 기초적인 성질을 파악하기 위하여, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 빌레나무 잎·줄기 메탄올추출물의 분획물을 제조하였다.To obtain the basic properties of the antimicrobial active substance, the fractions of the extracts of bamboo leaves and stem methanol prepared in Example <2-1> were prepared.

구체적으로, 빌레나무 잎·줄기 메탄올추출물 78.3 g을 3 ℓ의 증류수에 용해시킨 후 동량의 에틸아세테이트 수용액으로 2회 추출한 후 에틸아세테이트층과 수용액층을 감압농축하였다. 농축한 수용액층을 다시 3 ℓ의 증류수로 용해시킨 후 동량의 n-부탄올로 2회씩 추출하였고 유기용매추출물 및 수용액층을 감압농축하여 건조된 용매분획물을 얻었다. 20 ㎎/㎖ 농도로 메탄올에 용해한 각각의 분획물 시료 2 ㎖를 증류수 38 ㎖로 희석하였고, 전착제 트윈 20(tween 20)을 250 ㎍/㎖ 농도가 되도록 첨가하여 1,000 ㎍/㎖ 농도의 분획물 용액을 40 ㎖씩 준비했다. 이때 대조구는 5%의 메탄올과 250㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다.Specifically, 78.3 g of methanol extract of Lilium leaves and stem were dissolved in 3 L of distilled water and extracted twice with an equal volume of ethyl acetate solution. The ethyl acetate layer and the aqueous layer were concentrated under reduced pressure. The concentrated aqueous solution layer was dissolved again with 3 L of distilled water and extracted twice with the same amount of n-butanol. The organic solvent extract and the aqueous solution layer were concentrated under reduced pressure to obtain a dried solvent fraction. 2 ml of each fraction sample dissolved in methanol at a concentration of 20 mg / ml was diluted with 38 ml of distilled water and tween 20 (Tween 20) was added thereto to a concentration of 250 占 퐂 / ml to prepare a fraction solution having a concentration of 1,000 占 퐂 / Ml. Here, distilled water containing 5% of methanol and 250 占 퐂 / ml of Tween 20 was used as the control.

<6-2> <6-2> 빌레나무Tree 메탄올 추출물 용매  Methanol extract solvent 분획물의Fraction 방제활성 확인 Check control activity

본 발명자들은 상기 실시예 <6-1>에서 얻은 빌레나무 메탄올 추출물의 용매 분획물의 방제활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서와 동일한 방법으로 식물병 방제효과를 평가했다. The present inventors evaluated the plant disease control effect in the same manner as in Example <1-2> in order to confirm the control activity of the solvent fraction of the methanol extract of B. bistilis obtained in Example <6-1> above.

그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이 에틸아세테이트분획물과 n-부탄올분획물이 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 벼 도열병에 대해 90% 이상의 방제가를 나타냈고, 밀 붉은녹병에 대해 67%의 방제가를 나타내는 것을 확인하였다. 그러나, 수용액층은 방제활성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(표 6). 따라서 빌레나무 추출물의 항균활성물질은 수용성 물질이 아닌 비극성 물질로 확인되었다.As a result, as shown in Table 6, the ethyl acetate fraction and the n-butanol fraction showed a control value of over 90% for rice blast fungus at a concentration of 1,000 ㎍ / ㎖, and a control value of 67% against wheat rust Respectively. However, it was confirmed that the aqueous solution layer did not exhibit the controlling activity (Table 6). Therefore, the antimicrobial active substance of the extract of Bilye tree was identified as a nonpolar material rather than a water soluble substance.

시료sample 농도 (㎍/㎖)Concentration (/ / ml) 방제가(%)Control (%) RCBRCB RSBRSB TGMTGM TLBTLB WLRWLR BPMBPM PANPAN 에틸아세테이트층Ethyl acetate layer 1,0001,000 9090 2121 2121 88 6767 00 2525 n-부탄올층n-butanol layer 1,0001,000 9797 77 77 00 6767 00 1717 수용액층Aqueous solution layer 1,0001,000 1717 00 00 00 00 00 88 RCB: 벼 도열병; RSB; 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병; TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병RCB: rice blast; RSB; Rice sheath blight; TGM: Tomato gray mold disease; TLB: tomato blight; WLR: wheat red rust; BPM: barley powdery mildew; PAN: pepper anthracnose

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 메탄올 추출물 용매 분획의 벼 ) Methanol extract The rice fraction of the solvent fraction 도열병균Blast fungus 균사생장 억제 활성 확인 Identification of Mycelial Growth Inhibitory Activity

빌레나무 항균활성물질의 기초적인 성질을 파악하기 위하여, 상기 실시예 <6-1>에서 제조한 에틸아세테이트분획물 및 n-부탄올 분획물의 벼 도열병균에 대한 in vitro 항균활성을 확인하였다.In order to understand the basic properties of the antimicrobial active substances of Liliaceae, the in vitro antibacterial activities of the ethyl acetate fraction and the n-butanol fraction prepared in Example <6-1> were examined.

구체적으로, 페이퍼디스크 한천배지확산법(paper disk agar diffusion method)으로 평가하였다. 벼 도열병균 마그나포르테 오라이제의 균사디스크 5개를 삼각플라스크에 담긴 100 ㎖ PDB(감자) 배지에 접종한 후 7~10일 동안 25℃에서 150 rpm으로 진탕한 배양액을 믹서기(blade mixer)로 갈아서 제조한 균사현탁액 중 1 ㎖를 40℃이하로 식힌 100 ㎖ 감자한천배지에 잘 섞어서 굳힌 다음, 에틸아세테이트분획물 및 n-부탄올분획물을 각각 900 ㎍씩 포함한 페이퍼디스크(직경 8 ㎜)를 올려놓고 25℃에서 2일간 배양했다.Specifically, it was evaluated by a paper disk agar diffusion method. Mycelial disks of Magnaporthe oryzae of rice blast fungus Magnesium stearate 5 disks were inoculated into 100 ml PDB (potato) medium containing Erlenmeyer flasks and shaken at 150 rpm at 25 ° C for 7 to 10 days. The mixture was ground with a blender mixer One milliliter of the prepared mycelial suspension was mixed and hardened in a 100 ml potato agar medium cooled to 40 DEG C or less. Then, a paper disk (diameter: 8 mm) containing 900 g each of ethyl acetate fraction and n-butanol fraction was placed, For 2 days.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 에틸아세테이트분획물 및 n-부탄올분획물이 벼 도열병균의 균사생장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 따라서 in vitro 조건에서 항균활성을 나타내는 빌레나무 분획 물질이 벼 도열병에 방제 활성을 나타내는 유효성분일 것으로 확인되었다. As a result, it was confirmed that the ethyl acetate fraction and the n-butanol fraction inhibited mycelial growth of rice blast fungus bacteria as shown in FIG. 2 (FIG. 2). Therefore, it was confirmed that the fractions of Bilye tree fractions exhibiting antimicrobial activity under in vitro conditions are effective ingredients for control of rice blast.

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 용매 분획으로부터 항균활성물질 분리) Separation of the antimicrobial active substance from the ethyl acetate solvent fraction of the methanol extract

본 발명자들은 항균활성을 나타내는 빌레나무 분획 물질이 벼 도열병에 방제 활성을 나타내는 유효성분일 것으로 확인하였으며, 따라서 다양한 크로마토그래피 기법을 사용하여 항균활성물질을 분리·정제하는 실험을 수행하였다.The inventors of the present invention have confirmed that the bichromatic fractions exhibiting antimicrobial activity are active ingredients exhibiting control activity against rice blast fungi. Therefore, experiments for separating and purifying antimicrobial active materials using various chromatographic techniques have been conducted.

구체적으로, 상기 실시예 <6-1>에서 수득한 에틸아세테이트분획물(4.45 g)로부터 항균활성물질을 분리하기 위하여, 실리카겔(silica gel) 액체크로마토그래피 방법을 사용했다. 컬럼(지름 3 ㎝ × 높이 60 ㎝)에 약 300 g 실리카겔을 채우고, 시료를 소량의 다이클로로메탄에 녹여서 로딩한 후에 다이클로로메탄과 메탄올을 99:1, 97:3, 95:5, 70:30의 부피비로 혼합한 용매로 순차적으로 용출시켰다. 박막크로마토그래피(TLC) 패턴에 따라 분획물을 E1~E9로 분리하였다. Specifically, a silica gel liquid chromatography method was used to separate the antimicrobial active substance from the ethyl acetate fraction (4.45 g) obtained in the above Example <6-1>. The sample was loaded in a small amount of dichloromethane and loaded, and dichloromethane and methanol were then added in a ratio of 99: 1, 97: 3, 95: 5, 70: 30 &lt; / RTI &gt; by volume. The fractions were separated into E1 to E9 according to a thin film chromatography (TLC) pattern.

이 중 분획물 E2(849 ㎎)가 페이퍼디스크 한천배지확산법에서 벼 도열병균에 항균활성을 나타냈다. 따라서, 분획물 E2를 세파덱스 LH-20(Sephadex LH-20, GE Healthcare Life Sciences) 컬럼 크로마토그래피로 다시 분획하고, 이 중 항균활성을 나타내는 분획물 E222241(2.4 ㎎)을 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하였다. 워터스(Waters) 515 HPLC 시스템을 사용하였으며, 컬럼은 페노메넥스(phenomenex)사의 Luna C18(2) (5 ㎛, 4.6 × 250 ㎜)을 사용하였으며, 포토다이오드어레이(photo diode array) 검출기로 210~400 ㎚ 파장의 흡광스펙트럼을 얻었다. 20% 아세토나이트릴수용액에서 80% 아세토나이트릴수용액으로 15분간 선형농도구배(linear gradient)를 주었고, 이후에는 80% 아세토나이트릴수용액로 용출시켰다. 전체분석시간은 30분이고 유속은 1 ㎖/분이었다. 280 ㎚ 파장에서 검출되는 피크(peak)를 분취하여, 벼 도열병에 대한 in vitro 항균활성을 페이퍼디스크 한천배지확산법으로 평가하였다.Among them, fraction E2 (849 ㎎) showed antimicrobial activity against rice blast fungus in the paper disk agar diffusion method. Therefore, fraction E2 was further fractionated by column chromatography on Sephadex LH-20 (GE Healthcare Life Sciences), and fraction E222241 (2.4 mg) showing antimicrobial activity was fractionated by high performance liquid chromatography (HPLC) Respectively. A Waters 515 HPLC system was used. The column was a Luna C18 (2) (5 μm, 4.6 × 250 mm) from Phenomenex Inc. and a 210-250 nm column using a photodiode array detector. An absorption spectrum of 400 nm wavelength was obtained. A linear gradient of 15% aqueous acetonitrile in 80% acetonitrile in 20% aqueous acetonitrile was followed by elution with 80% aqueous acetonitrile. The total analysis time was 30 minutes and the flow rate was 1 ml / min. Peaks detected at a wavelength of 280 nm were aliquoted and the in vitro antimicrobial activity against rice blast was evaluated by paper disk agar diffusion method.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 15.4분의 체류시간(retention time)를 나타내는 항균활성물질(▼)이 분석되었다(도 3). 이 항균활성물질은 274 ㎚에서 최대흡수파장 값을 나타내는 특징을 가졌다. As a result, an antimicrobial active substance (▼) showing a retention time of 15.4 minutes as shown in Fig. 3 was analyzed (Fig. 3). This antimicrobial active substance had a characteristic of exhibiting a maximum absorption wavelength value at 274 nm.

빌레나무Tree (( MaesaMaesa japonica japonica ) 메탄올 추출물 n-부탄올 용매 분획으로부터 항균활성물질 분리) Separation of antimicrobial active substance from methanol extract n-butanol solvent fraction

본 발명자들은 또한 상기 실시예 <6-1>에서 수득한 n-부탄올분획물(18.71 g)으로부터 항균활성물질을 분리하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.The present inventors also conducted the following experiment to isolate the antimicrobial active substance from the n-butanol fraction (18.71 g) obtained in the above Example <6-1>.

구체적으로, 실리카겔(silica gel) 액체크로마토그래피 방법을 사용했다. 컬럼(지름 6 ㎝ × 높이 60 ㎝)에 약 500 g의 실리카겔을 채우고, 시료를 소량의 다이클로로메탄에 녹여서 로딩한 후에 다이클로로메탄과 메탄올을 99.5:0.5, 99:1, 95:5, 9:1, 85:15, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50의 부피비로 혼합한 용매로 순차적으로 용출시켰다. 박막크로마토그래피 패턴에 따라 분획물을 B1~B14로 분리하였고, 이 중 페이퍼디스크 한천배지확산법에서 벼 도열병균에 항균활성을 나타내는 분획물 B9(3,433 ㎎)을 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 통해서 다시 분획하였다. 이로부터 2가지 항균활성 분획물 B944(7.6 ㎎) 및 B9453(17.0 ㎎)을 얻었고, 상기 <실시예 8>과 동일한 방법을 사용하여 각각 HPLC로 분석하였다. 210 ㎚ 또는 230 ㎚ 파장에서 검출되는 피크를 분취하여, 벼 도열병에 대한 in vitro 항균활성을 페이퍼디스크 한천배지확산법으로 평가하였다.Specifically, a silica gel liquid chromatography method was used. About 500 g of silica gel was filled in a column (6 cm in diameter × 60 cm in height), and the sample was dissolved in a small amount of dichloromethane and loaded. Dichloromethane and methanol were then added at a ratio of 99.5: 0.5, 99: 1, 95: : 1, 85:15, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 by volume. The fraction B9 (3,433 mg), which exhibited antimicrobial activity against rice blast fungus, was fractionated by Sephadex LH-20 column chromatography in a paper disk agar diffusion method, and the fractions were separated into B1 to B14 according to the thin film chromatography pattern. Respectively. From these, two antimicrobially active fractions B944 (7.6 mg) and B9453 (17.0 mg) were obtained and analyzed by HPLC, respectively, in the same manner as in Example 8 above. Peaks detected at the wavelength of 210 nm or 230 nm were aliquoted and the in vitro antimicrobial activity against rice blast was evaluated by paper disk agar diffusion method.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 항균활성 분획물 B944(7.6㎎)를 HPLC로 분석한 결과 22.2분의 체류시간을 나타내는 항균활성물질(●)이 검출되었으며, 이 물질은 222 ㎚와 273 ㎚에서 최대흡수파장 값을 나타내는 특징을 가졌다(도 3). 컬럼에서의 체류시간과 UV 흡광스펙트럼을 바탕으로 상기 <실시예 8>에서 분리된 항균활성물질과는 다른 계열의 화합물일 것으로 추정되었다.As a result, as shown in FIG. 4, an antimicrobial active substance (●) exhibiting a residence time of 22.2 minutes was detected by HPLC analysis of the antimicrobial active fraction B944 (7.6 mg). This substance exhibited maximum activity at 222 nm and 273 nm And exhibited absorption wavelength values (FIG. 3). Based on the retention time in the column and the UV absorption spectrum, it was presumed to be a compound of a different kind from the antimicrobial active substance isolated in Example 8 above.

또 다른 항균활성 분획물 B9453(17.0 ㎎)를 HPLC로 분석한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 11.4분(◆)과 11.7분(★)의 체류시간을 나타내는 2가지 항균활성물질이 검출되었다. 2가지 항균활성물질은 216 ㎚에서 최대흡수파장 값을 나타내는 특징을 보였다(도 5). 컬럼에서의 체류시간과 UV 흡광스펙트럼이 비슷하기 때문에 2가지 항균활성물질은 서로 유사한 화합물일 것으로 추정되었다. 또한 상기 <실시예 8>에서 분리된 항균활성물질 및 상기 도 4의 항균활성물질과는 다른 계열의 화합물임을 알 수 있다.As a result of analysis of another antibacterial active fraction B9453 (17.0 mg) by HPLC, two antimicrobially active substances showing retention times of 11.4 minutes (♦) and 11.7 minutes (★) were detected as shown in FIG. The two antimicrobial active substances exhibited a maximum absorption wavelength value at 216 nm (Fig. 5). Because the residence time in the column is similar to the UV absorption spectrum, it is assumed that the two antimicrobially active substances are similar compounds. In addition, it can be seen that the antimicrobial active material isolated in Example 8 and the antimicrobial active material in FIG. 4 are different from each other.

Claims (10)

빌레나무(Maesa japonica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물병 방제용 조성물.
A plant disease control selected from the group consisting of rice blast fungus, rice sheath blight disease, tomato gray mold fungus, tomato pest, wheat red rust and red pepper anthracnose containing an extract of Maesa japonica or a fraction thereof as an active ingredient / RTI &gt;
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C4 저급 알코올, n-헥산, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
The composition according to claim 1, wherein the extract is extracted with water, a C 1 to C 4 lower alcohol, n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate, acetone or a mixture thereof as a solvent.
제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 부탄올인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
[3] The composition according to claim 2, wherein the lower alcohol is ethanol, methanol, propanol or butanol.
제 1항에 있어서, 상기 분획물은 빌레나무 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
[Claim 2] The composition according to claim 1, wherein the fractions are fractionated using an organic solvent.
제 4항에 있어서, 상기 유기용매는 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 또는 n-부탄올(butanol)인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
5. The composition according to claim 4, wherein the organic solvent is hexane, ethyl acetate or n-butanol.
제 1항에 있어서, 상기 분획물은 빌레나무 추출물을 헥산(hexane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(butanol) 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
The method according to claim 1, wherein the fraction is a hexane fraction, an ethyl acetate fraction, a butanol fraction, or a water fraction obtained by phyllotaxis fractionation in the order of hexane, ethyl acetate, n-butanol, Wherein the composition is a fraction.
삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea), 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola), 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola), 푸자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 스클레로티니아 스클레로티오럼(Sclerotinia sclerotiorum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물 병원성 곰팡이 균사 생장을 억제하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
The composition of claim 1, wherein the composition is selected from the group consisting of Botrytis cinerea , Alternaria brassicicola , Colletotrichum fructicola , Fusarium &lt; RTI ID = 0.0 &gt; oxysporum , Magnaporthe oryzae , Phytophthora infestans , Rhizoctonia &lt; RTI ID = 0.0 &gt; solani and Sclerotinia sclerotiorum . The composition according to claim 1, wherein the plant pathogenic fungus is a plant growth regulator.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 아그로박테리움 튜메파시엔(Agrobacterium tumefaciens), 버크홀데리아 글루메(Burkholderia glumae) 및 펙토박테리움 카로토보럼(Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 식물 병원성 세균 생장을 억제하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
The method of claim 1, wherein the composition comprises Agrobacterium tyume Pacific yen (Agrobacterium tumefaciens), Burke holde Ria glue methoxy (Burkholderia glumae ) and Pectobacterium carotovorum subsp . carotovorum , which inhibits the growth of any one or more phytopathogenic bacterium.
제 1항에 있어서, 상기 추출물 또는 이의 분획물은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 3,000 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
[Claim 2] The composition according to claim 1, wherein the extract or the fraction thereof is contained in a composition for controlling plant diseases at a concentration of 100 to 3,000 [mu] g / ml.
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