KR101740066B1 - 프로테아제 저항성 폴리펩티드를 선택하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 펩티드들 및 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리 (예를 들어, 디스플레이 시스템)로부터 혈청 내에서 발견되는 프로테아제와 같은 프로테아제에 의한 분해에 대해 저항성인 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 라이브러리 또는 레퍼토리를 프로테아제와 함께 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및 프로테아제에 의한 분해에 대해 저항성이고 원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 단계를 포함한다. 선택된 펩티드 및 폴리펩티드는 치료제로서, 예를 들어 인간에서의 질환을 치료하는데 유용하다.

Description

프로테아제 저항성 폴리펩티드를 선택하는 방법{METHODS FOR SELECTING PROTEASE RESISTANT POLYPEPTIDES}
공업 용도, 및 약제, 치료제 및 진단제로서의 용도가 포함되는 다양한 용도에서 폴리펩티드 및 펩티드가 점점 중요한 작용제가 되었다. 그러나, 다수의 치료용 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 천연 발생 프로테아제(protease)에 의한 생체 내에서의 분해에 대해 특히 감수성이다. 또한, 특정 생리학적 상태, 예컨대 염증 상태 (예를 들어, COPD) 및 암에서, 조직, 장기 또는 동물 내에 (예를 들어, 폐 내에, 종양 내에, 또는 종양에 인접하여) 존재하는 프로테아제의 양이 증가될 수 있다. 이러한 프로테아제 증가는 내인성 단백질 및 질환을 치료하기 위해 투여된 치료용 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질의 가속화된 분해 및 불활성화를 초래할 수 있다. 따라서, 생체 내에서 사용될 가능성 (예를 들어, 인간과 같은 포유동물에서 질환을 치료, 진단 또는 예방하는데 사용될 가능성)이 있는 일부 작용제는 프로테아제에 의해 급속하게 분해되고 불활성화되기 때문에 제한된 효능만을 지닌다.
프로테아제 저항성 폴리펩티드는 여러 장점을 제공한다. 예를 들어, 프로테아제 저항성 폴리펩티드는 프로테아제 민감성 작용제보다 생체 내에서 더 길게 여전히 활성이고, 따라서 생물학적 효과를 일으키는데 충분한 기간 동안 여전히 기능성이다. 프로테아제 분해에 대해 저항성이고 또한 바람직한 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드를 선택하는 개선된 방법이 요구된다.
글루카곤-유사 펩티드 (GLP)-1은 강력한 글루코스-의존적 인슐린자극성 및 글루카곤유지성 작용, 췌장 β 세포에 대한 영양 효과, 및 위장관 분비 및 운동에 대한 억제 효과가 있는 인크레틴 호르몬이고, 이러한 작용 및 효과는 조합되어 혈장 글루코스를 저하시키고 혈당 변동(glycemic excursion)을 감소시킨다. GLP-1은 GLP-1 수용체의 효능제이다. 또한, 포만감을 강화하는 능력을 통하여, GLP-1은 음식 섭취를 감소시킴으로써, 체중 증가를 제한하며, 심지어 체중 감소를 야기할 수 있다. 총괄적으로, 이러한 작용들은 항당뇨병제로서 고도로 바람직하게 고려되는 독특한 프로파일을 GLP-1에게 제공하는데, 이는 특히 GLP-1의 항-고혈당 효과의 글루코스 의존성이 중증 저혈당의 임의의 위험을 최소화하여야 하기 때문이다. 그러나, 이의 약동학/약역학 프로파일은 천연 GLP-1이 치료적으로 유용하지 않도록 한다. 따라서, GLP-1은 지속적으로 투여되는 경우에 가장 효과적인 한편, 단일 피하 주사는 효과가 짧게 지속된다. GLP-1은 생체 내에서의 효소 분해에 대해 고도로 감수성이고, 디펩티딜 펩티다제(peptidase) IV (DPP-IV)에 의한 절단이 아마도 가장 관련될 것인데, 이는 이것이 신속하게 발생하고 비-인슐린자극성 대사물을 생성시키기 때문이다. 따라서, GLP-1의 대사 안정성 및 약동학/약역학 프로파일에 영향을 미치는 인자들의 이해를 기초로 하는, GLP-1의 치료 잠재력을 이용하기 위한 전략에 집중적인 연구의 초점이 맞춰졌다.
이러한 펩티다제들을 억제하도록 시도하기 위해 또는 GLP-1의 생물학적 활성은 여전히 유지하면서 이의 분해가 느려지는 방식으로 GLP-1를 변형시키기 위해 집중적인 작업이 수행되었다. WO05/027978 (US2007203058)에는 작용 프로파일이 연장된 (그리고, 본 발명에서 사용될 수 있는 GLP-1 유도체 및 유사체의 예로서 본원에 참고로 포함되는) GLP-1 유도체가 개시되어 있다. WO 02/46227 (US2004053370)에는 GLP-1 또는 유사체 (이러한 유사체에 대한 개시내용은 본 발명에서 사용될 수 있는 GLP-1 유사체의 예로서 참고로 본원에 포함된다)에 융합된 폴리펩티드 (예를 들어, 알부민)를 포함하는 이종성 융합 단백질이 개시되어 있다. WO05/003296, WO03/060071, WO03/059934에는 호르몬의 반감기를 증가시키려는 시도로 GLP-1이 알부민과 융합된 아미노 융합 단백질이 개시되어 있다.
그러나, 이러한 노력들에도 불구하고, 장기간 지속되는 활성 GLP-1이 생산되지 않았다.
<발명의 요약>
본 발명은 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법, 및 표적 리간드에 높은 친화력으로 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법에 관한 것이다. 추가로 본 발명은 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 생산하는 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법이다. 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 제공하는 단계, 레퍼토리 및 프로테아제를 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및 원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수함으로써, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 선택되는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리가 디스플레이 시스템에서 발현되고, 프로테아제는 디스플레이 시스템 또는 발현 숙주에서 발현되는 프로테아제이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리가 박테리아 세포에서 발현되고, 프로테아제는 박테리아에 대해 내인성인 프로테아제이다. 적절하게는, 레퍼토리 발현을 위한 조건은 내인성 프로테아제, 예컨대 박테리아 프로테아제의 발현 및 활성을 최대화한다. 예를 들어, 박테리아 내에서의 레퍼토리의 단백질 발현을 위한 시간 및/또는 온도를 증가시킴으로써, 프로테아제 발현 및 활성이 최대화된다. 예를 들어, 인큐베이션 시간은 1시간 내지 하룻밤 (예를 들어, 12시간 내지 24시간)이거나 또는 이보다 길 수 있다 (예를 들어, 24시간 내지 48시간, 또는 이보다 길다). 한 실시양태에서, 온도는 30℃ 내지 37℃이거나, 또는 이를 초과할 수 있다. 또한, 프로테아제 발현이 상이한 박테리아 균주 및/또는 배지 성분의 변형을 사용함으로써 강화될 수 있다. 박테리아 배양물의 밀도가 또한 변할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 프로테아제 발현을 강화하는 유전자 변형에 의해 디스플레이 시스템이 변형될 수 있다.
한 실시양태에서, 박테리오파지 레퍼토리가 대장균 박테리아 세포, 예컨대 대장균 TB1 세포, TC1 세포 또는 대장균 균주 HB2151로부터의 세포에서 발현 및/또는 증폭되는 박테리오파지 디스플레이 시스템으로서 레퍼토리가 제공된다. 따라서, 이러한 실시양태에서, 박테리아 프로테아제는 대장균 세포에서 내인성으로 발현되는 프로테아제이다. 한 실시양태에서, 박테리아 프로테아제는 박테리아 원형질막주위공간에서 발현되는 프로테아제일 수 있다. 한 실시양태에서, 프로테아제 발현은 파지 생산, 분비 동안의 발현일 수 있거나, 또는 박테리아 상등액 내에서의 발현일 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 박테리오파지 라이브러리를 취하는 단계, 상기 라이브러리를 박테리아 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 박테리아에서 발현시키는 단계, 상기 발현된 라이브러리를 표적 리간드와 함께 인큐베이션함으로써, 프로테아제 저항성 표적 결합 펩티드를 선택하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 임의적으로, 표적 리간드와의 인큐베이션은 추가적인 프로테아제의 존재를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 디스플레이 시스템은 효모 디스플레이 시스템 예컨대 피치아(Pichia)이고, 프로테아제는 효모 세포에서 발현되는 내인성 프로테아제이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 레퍼토리와 추가적인 프로테아제를 이러한 추가적인 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계, 및 원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수함으로써, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 용액 내의 레퍼토리와 조합된다 (즉, 프로테아제가 지지체 상에 고정되지 않는다). 적절하게는, 추가적인 프로테아제는 혈청, 가래, 점액 (예를 들어, 위 점액, 코 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질화물, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액 또는 눈물 중 하나 이상에서 발견된다.
또 다른 측면에서, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 제공하는 단계, 레퍼토리 및 제1 프로테아제를 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 레퍼토리를 제2 프로테아제와 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계 및 원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수함으로써, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 측면의 한 실시양태에서, 제1 프로테아제는 레퍼토리 디스플레이 시스템에 대해 내인성인 프로테아제이고, 제2 프로테아제는 혈청, 가래, 점액 (예를 들어, 위 점액, 코 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질화물, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액 또는 눈물에서 발견되는 프로테아제로부터 선택된다. 그러나, "제1" 및 "제2" 프로테아제 단계가 임의의 순서로 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 임의의 이같은 단계의 다중 반복이 본 발명의 방법 내에 포함될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 임의의 측면의 한 실시양태에서, 상기 추가적인 또는 제2 프로테아제 활성에 대한 조건은 (i) 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 3 ㎎/㎖ 프로테아제, (ii) 약 20℃ 내지 약 40℃ 및 (iii) 약 30분 이상 동안이다. 한 실시양태에서, 이러한 엄격한 조건은 친화력이 높고/높거나 Tm이 개선된 펩티드 또는 폴리펩티드의 선택을 가능하게 한다. 이같은 경우에, 펩티드 및 폴리펩티드는 단량체성 형태에서 높은 친화력을 디스플레이할 수 있다.
한 실시양태에서, 임의의 측면에 따른 본 발명의 방법에서, 프로테아제 활성에 적절한 상기 조건에 대해, 약 10 내지 약 100 ㎍/㎖ 프로테아제가 사용된다. 프로테아제 활성에 적절한 상기 조건에 대해, 약 30℃ 내지 약 37℃의 온도 (예를 들어, 약 37℃ 또는 대략 실온)가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 레퍼토리 및 프로테아제는 약 1시간 이상 (예를 들어, 약 1시간, 약 2시간, 하룻밤, 예를 들어 18시간 내지 24시간) 동안 조합될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 한 실시양태에서, 레퍼토리 및 프로테아제는 약 30분 이상의 기간 동안 인큐베이션된다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 약 100 ㎍/㎖으로 사용되고, 조합된 레퍼토리 및 프로테아제는 약 37℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션된다.
본 발명의 임의의 측면의 한 실시양태에서, 프로테아제, 예를 들어 트립신 대 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 비율 (몰/몰 기준)은 8,000 내지 80,000 프로테아제:가변 도메인이다. 한 실시양태에서, 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 대 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 비율 (중량/중량, 예를 들어, ㎍/㎍ 기준)은 16,000 내지 160,000 프로테아제:가변 도메인이다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 적어도 100 또는 1000 ㎍/㎖ 프로테아제의 농도로 사용된다.
임의의 원하는 프로테아제, 예컨대 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 카르복시펩티다제(carboxypeptidase) (예를 들어, 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타제(elastase), 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신 (예를 들어, 카텝신 G), 프로테이나제(proteinase) (예를 들어, 프로테이나제 1, 프로테이나제 2, 프로테이나제 3), 써모리신, 키모신, 엔테로펩티다제(enteropeptidase), 카스파제(caspase) (예를 들어, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 9, 카스파제 12, 카스파제 13), 칼파인, 피카인, 클로스트리파인, 악티니다인, 브로멜라인, 세파라제(separase) 및 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV) 중 하나 이상이 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 프로테아제는 트립신, 엘라스타제 또는 류코자임이다. 프로테아제는 생물학적 추출물, 생물학적 균질화물 또는 생물학적 제제, 예를 들어 시험관 내의 전체 세포에 의해 또한 제공될 수 있다. 원한다면, 방법은 인큐베이션이 완료된 후 레퍼토리 및 프로테아제의 조합물에 프로테아제 억제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 프로테아제(들)은 레퍼토리와 조합될 때 용액 내에 존재한다.
본 발명의 임의의 측면의 한 실시양태에서, 원하는 생물학적 활성은 결합 활성, 예를 들어, 리간드, 예를 들어 표적 리간드 또는 제너릭(generic) 리간드에 대한 결합 활성이다.
일부 실시양태에서, 원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드가 결합 활성을 기초로 회수된다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드가 제너릭 리간드, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L에 결합하는 것을 기초로 회수될 수 있다. 또한 결합 활성은 표적 리간드에 대한 특이적 결합일 수 있다. 예시적인 표적 리간드에는 ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카르디오트로핀(Cardiotrophin)-1, CEA, CD40, CD40 리간드, CD56, CD38, CD138, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, 엑소두스(Exodus)-2, FAPα, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유모세포 성장 인자-10, FLT3 리간드, 프랙트알킨(Fractalkine) (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-β1, 인간 혈청 알부민, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-1 수용체, 제1형 IL-1 수용체, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), 인히빈(Inhibin) α, 인히빈 β, IP-10, 각질세포 성장 인자-2 (KGF-2), KGF, 렙틴(Leptin), LIF, 림포탁틴(Lymphotactin), 뮐러관(Mullerian) 억제 물질, 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MlP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, 골수성 전구체 억제제 인자-1 (MPIF-1), NAP-2, 뉴르투린(Neurturin), 신경 성장 인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 옹코스타틴(Oncostatin) M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β, SCF, SCGF, 줄기 세포 인자 (SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2, TGF-β3, 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF A, VEGF B, VEGF C, VEGF D, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, 혈청 알부민, vWF, 아밀로이드 단백질 (예를 들어, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, IgE, IL-13Rα1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), 키마제(chymase), FGF, 푸린(Furin), 엔도텔린(Endothelin)-1, 에오탁신 (예를 들어, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁신-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, 인테그린, L-셀렉틴, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMP, 호중구 엘라스타제, 오스테오폰틴, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, 트롬빈(Thrombin), Tim-1, TNF, TRANCE, 트립타제(Tryptase), VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, 알파v베타6, 알파v베타8, cMET, CD8, vWF, 아밀로이드 단백질 (예를 들어, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, 및 IgE가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 표적 리간드는 GLP-1 수용체, 또는 이의 일부분이다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서, 리간드는 GLP-1 수용체 세포외 도메인일 수 있다.
본 발명의 임의의 측면의 특정 실시양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 패닝(panning)에 의해 회수된다.
임의의 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 레퍼토리가 프로테아제의 존재 하에 리간드 (표적 리간드; 제너릭 리간드)에 노출되고, 레퍼토리의 하나 이상의 구성원이 리간드에 대한 결합을 기초로 선택된다.
임의의 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 레퍼토리는 디스플레이 시스템을 포함한다. 예를 들어, 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 에멀션 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 푸로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드 상의 디스플레이, 또는 공유결합 디스플레이일 수 있다. 바람직한 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 연결한다. 특정 실시양태에서, 디스플레이 시스템은 복제가능한 유전자 패키지를 포함한다.
임의의 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이를 포함한다. 예를 들어, 박테리오파지는 fd, M13, 람다, MS2 또는 T7일 수 있다. 특정 실시양태에서, 박테리오파지 디스플레이 시스템은 다가 시스템이다. 일부 실시양태에서, 펩티드 또는 폴리펩티드는 pIII 융합 단백질로서 디스플레이된다.
임의의 본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 펩티드들 또는 폴리펩티드들 (예를 들어, 가변 도메인들)의 레퍼토리가, 예를 들어 106개 내지 1013개, 예를 들어 108개 내지 1012개 복제 유닛 (감염성 비리온)의 파지 라이브러리 크기로, 박테리오파지 상에 디스플레이된다. 한 실시양태에서, 제2 또는 추가적인 프로테아제와 함께 인큐베이션될 때 레퍼토리가 박테리오파지 상에 디스플레이된다.
본 발명의 임의의 측면의 다른 실시양태에서, 방법은 원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 파지 증폭, 세포 성장 또는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해에 핵산이 증폭된다.
본 발명의 임의의 측면의 한 실시양태에서, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리가 박테리아 세포 예컨대 대장균에서 증폭 및 발현되는 박테리오파지 상에 디스플레이된다. 이러한 실시양태에서, 박테리아 세포에서 발현될 때 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리가 박테리아 프로테아제에 노출된다.
일부 실시양태에서, 레퍼토리는 면역글로불린 단일 가변 도메인들의 레퍼토리이다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 중쇄 가변 도메인이다. 더욱 특정한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인은 인간 중쇄 가변 도메인이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인은 인간 경쇄 가변 도메인이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리로부터 높은 친화력으로 표적 리간드에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법이다. 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 제공하는 단계, 레퍼토리와 및 프로테아제를 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계, 및 표적 리간드에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다.
상기 본 발명의 방법에 따라서, 원하는 생물학적 활성이 결합 활성인 경우, 결합된 리간드 (표적 리간드; 제너릭 리간드)는 프로테아제(들)와 동일하지 않다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 프로테아제 저항성 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 생산하는 방법이다. 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 제공하는 단계, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리 및 프로테아제를 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계, 및 원하는 생물학적 활성이 있는 다수의 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수함으로써 프로테아제 저항성 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리가 생산되는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 원하는 생물학적 활성이 있는 다수의 펩티드 또는 폴리펩티드가 결합 활성을 기초로 회수된다. 예를 들어, 다수의 펩티드 또는 폴리펩티드가 제너릭 리간드, 예컨대 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 L에 결합하는 것을 기초로 회수될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 레퍼토리로부터 표적 리간드에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인 (dAb)을 포함하는 프로테아제 저항성 폴리펩티드를 선택하는 방법이다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드들의 라이드러리를 포함하는 파지 디스플레이 시스템을 제공하는 단계, 파지 디스플레이 시스템과 엘라스타제, 류코자임 및 트립신으로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제를 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계, 및 표적 리간드에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 회수하는 단계를 포함한다. 적절하게는, 이러한 측면의 한 실시양태에서, 이러한 방법은 내인성 프로테아제의 발현을 위한 조건 하에서이 인큐베이션을 추가로 포함한다. 예를 들어, 내인성 프로테아제는 디스플레이 시스템에 의해 발현되는 프로테아제이다.
일부 실시양태에서, 프로테아제는 100 ㎍/㎖로 사용되고, 조합된 파지 디스플레이 시스템 및 프로테아제는 약 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션된다.
일부 실시양태에서, 표적 리간드에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지가 상기 표적에 대한 결합에 의해 회수된다. 다른 실시양태에서, 표적 리간드에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지가 패닝에 의해 회수된다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능하거나 또는 선택된 단리된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 GLP-1 수용체 효능제, 예컨대 GLP-1 펩티드에 관한 것이다. 적절한 GLP-1 펩티드 및 GLP-1 펩티드 유도체가 실시예 및 도 1에 기재된다. 기타 적절한 펩티드에는 GLP-1 상동체 또는 유사체 예컨대 엑센딘 및 이의 상동체 및 유도체가 포함된다. 추가로 적절한 유도체에는 GLP-1의 디펩티딜 펩티다제 IV 저항성 유도체가 포함된다. 한 바람직한 펩티드가 아미노산 서열 DMS7148 (도 1의 6번 서열)에 의해 확인된다. 또 다른 바람직한 펩티드가 아미노산 서열 DMS7161 (도 1의 11번 서열)에 의해 확인된다. 적절하게는, 이러한 GLP-1 펩티드들이 AlbudAb™ 서열에 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능한 또는 선택된, 단리된 프로테아제 (예를 들어, 트립신, 엘라스타제, 류코자임) 저항성 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예를 들어, 인간 항체 중쇄 가변 도메인, 인간 항체 경쇄 가변 도메인)에 관한 것이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드는 발현 동안 단백질분해를 나타내지 않으면서 저-비용 숙주에서의 발현의 관점에서 개선된 성질을 나타낼 수 있어, 이를 공업적 규모의 생산에 더욱 적절하게 한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능한 또는 선택된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 트립신-, 엘라스타제-, 또는 류코자임-저항성 면역글로불린 단일 가변 도메인)를 코딩하는 단리된 핵산 또는 재조합 핵산, 및 이러한 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터) 및 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 핵산을 함유하는 숙주 세포를 발현에 적절한 조건 하에 유지시킴으로써, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 생산되는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능한 또는 선택된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 트립신-, 엘라스타제-, 또는 류코자임-저항성 면역글로불린 단일 가변 도메인)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 임의의 측면의 상황에서, 프로테아제는 디스플레이 시스템 예컨대 박테리아 프로테아제에 대해 내인성인 프로테아제일 수 있거나, 또는 혈청, 가래, 점액 (예를 들어, 위 점액, 코 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질화물, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액 또는 눈물 중 하나 이상에서 발견된다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 눈 및/또는 눈물에서 발견되는 것이다. 본원에 논의된 바와 같이, 선택된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드는 포유동물, 예를 들어, 인간에서의 질환 또는 상태의 요법, 예방 및 진단에서 유용하다. 특히, 이러한 펩티드 및 폴리펩티드는 환자, 예컨대 인간에게 투여되었을 때 프로테아제와 만나기 쉬운 약물의 기초로서 유용하다.
예를 들어, 위장관에 투여될 때 (예를 들어, 경구, 설하, 직장 투여), 이러한 경우에 펩티드 또는 폴리펩티드는 상부 위장관, 하부 위장관, 구강, 위, 소장 및 대장 중 하나 이상 내의 프로테아제에 적용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태는 환자의 질환 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 환자의 위장관에 경구, 설하 또는 직장 투여될 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명은 TNF 알파-매개 상태 또는 질환 예컨대 관절염 (예를 들어, 류머티스성 관절염), IBD, 건선 또는 크론병의 치료 및/또는 예방을 위한, 본 발명의 방법에 의해 선택된 또는 선택가능한 TNF 알파 길항제 펩티드 또는 폴리펩티드의 경구 투여에 관한 것이다. 이러한 실시양태에서, 길항제는 항-TNFR1 면역글로불린 단일 가변 도메인 (dAb)일 수 있다. 또 다른 예에서, 폐 조직 (예를 들어, 폐 또는 기도)에 투여될 때 (예를 들어 흡입 또는 비강내 투여에 의해), 펩티드 또는 폴리펩티드가 프로테아제를 만날 수 있다. 따라서, 한 실시양태는 환자의 질환 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 환자의 폐 조직에 흡입에 의해 투여되거나 비강내 투여될 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이같은 상태는 천식 (예를 들어, 알레르기성 천식), COPD, 인플루엔자, 또는 본원에 참고로 포함된 WO2006038027 (US2006002935)에 개시된 임의의 기타 폐 질환 또는 상태일 수 있다.
또 다른 예에서, 비경구적으로, 예를 들어 주사 (예를 들어, 피하 주사)를 통해 투여될 때 펩티드 또는 폴리펩티드가 혈청 내의 프로테아제를 만날 수 있다. 따라서, 한 실시양태는 환자의 질환 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한, 주사에 의해 투여될 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이같은 상태는 당뇨병일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 당뇨병 또는 당뇨병-관련 장애의 치료 및/또는 예방을 위한, 본 발명의 방법에 의해 선택된 또는 선택가능한 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 효능제, 예컨대 GLP-1 또는 이의 상동체 및 유도체, 예컨대 엑센딘 또는 이의 유도체의 비경구 투여를 제공한다.
본 발명에 따른 펩티드 및 폴리펩티드는 개선된 또는 비교적 높은 융점 (Tm)을 나타낼 수 있어, 강화된 안정성을 제공한다. 높은 친화력의 표적 결합이 또한 이러한 펩티드 및 폴리펩티드의 특색일 수 있다. 프로테아제 저항성과 조합된 이러한 특색들은, 프로테아제를 만날 수 있는 경우에, 예를 들어, 위장관, 폐 조직 또는 비경구 투여를 위해, 포유동물, 예컨대 인간에서 이러한 펩티드 및 폴리펩티드를 약물로서 사용될 수 있게 한다.
또 다른 예에서, 환자의 눈에 투여될 때 (예를 들어, 안내 주사에 의해 또는 점안제로서), 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 가변 도메인 또는 길항제)가 프로테아제를 만날 수 있다. 따라서, 한 실시양태는 환자의 질환 또는 상태 (예를 들어, 눈의 질환 또는 상태)를 치료 및/또는 예방하기 위한, 환자 (예를 들어 인간)에게의 프로테아제 저항성 펩티드, 폴리펩티드, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 효능제 또는 길항제의 안구 투여를 제공한다. 투여는 점안제 형태의, 또는 눈, 예를 들어 유리체액 내로의 주사에 의한, 눈에 대한 국소 투여일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 입자 크기 범위가 5 ㎛ 미만, 예를 들어 4.5, 4, 3.5 또는 3 ㎛ 미만인 본 발명의 효능제, 길항제, 펩티드, 폴리펩티드 또는 가변 도메인을 포함하는, 폐로의 전달을 위한 폐 제형을 제공한다 (예를 들어, pH가 예를 들어 6.5 내지 8.0, 예를 들어 7 내지 7.5, 예를 들어 7 또는 7.5인 브리튼-로빈슨(Britton-Robinson) 완충제 내에 존재).
한 실시양태에서, 본 발명의 제형 및 조성물은 6.5 내지 8.0, 예를 들어 7 내지 7.5, 예를 들어 7, 예를 들어 7.5의 pH로 제공된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 가변 도메인)는 Tm이 50℃ 이상, 또는 55℃ 이상, 또는 60℃ 이상, 또는 65℃ 이상, 또는 70℃ 이상일 수 있다. 본 발명의 효능제, 길항제, 용도, 방법, 조성물, 기구 또는 제형은 이같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 가변 도메인, 효능제, 길항제, 조성물 또는 제형은 브리튼-로빈슨 완충제 내에서 14일 동안 37℃ 내지 50℃에서 (1 ㎎/㎖의 폴리펩티드 또는 가변 도메인 농도로) 인큐베이션된 후 실질적으로 안정적이다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 펩티드, 폴리펩티드, 효능제, 길항제 또는 가변 도메인이 37℃에서의 이같은 인큐베이션 후 여전히 미응집 상태이다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 펩티드, 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 37℃에서의 이같은 인큐베이션 후 여전히 단량체성이다. 한 실시양태에서, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 펩티드, 폴리펩티드, 효능제, 길항제 또는 가변 도메인이 50℃에서의 이같은 인큐베이션 후 여전히 미응집 상태이다. 한 실시양태에서, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 펩티드, 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 50℃에서의 이같은 인큐베이션 후 여전히 단량체성이다. 한 실시양태에서, 이같은 인큐베이션 중 임의의 하나 후에 펩티드, 폴리펩티드, 가변 도메인, 효능제, 길항제의 응집이 나타나지 않는다. 한 실시양태에서, 브리튼-로빈슨 완충제 내에서 1 ㎎/㎖의 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 농도로 37℃에서 인큐베이션한 후 펩티드, 폴리펩티드 또는 가변 도메인의 pI가 변화되지 않고 유지되거나 실질적으로 변화되지 않고 유지된다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 가변 도메인, 효능제, 길항제, 조성물 또는 제형은 pH 7 내지 7.5 (예를 들어, pH 7 또는 pH 7.5)의 브리튼-로빈슨 완충제 내에서 7일 동안 4℃에서 (100 ㎎/㎖의 폴리펩티드 또는 가변 도메인 농도로) 인큐베이션된 후 실질적으로 안정적이다. 한 실시양태에서, 적어도 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 펩티드, 폴리펩티드, 효능제, 길항제 또는 가변 도메인이 이같은 인큐베이션 후 여전히 미응집 상태이다. 한 실시양태에서, 적어도 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 펩티드, 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 이같은 인큐베이션 후 여전히 단량체성이다. 한 실시양태에서, 이같은 인큐베이션 중 임의의 하나 후에 펩티드, 폴리펩티드, 가변 도메인, 효능제, 길항제의 응집이 나타나지 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드, 가변 도메인, 효능제, 길항제, 조성물 또는 제형은, 예를 들어, 실온, 20℃ 또는 37℃에서, 1시간 동안, 예를 들어 제트 분무기, 예를 들어, Pari LC+ 컵에서 (40 ㎎/㎖의 폴리펩티드 또는 가변 도메인 농도로) 분무된 후 실질적으로 안정적이다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 펩티드, 폴리펩티드, 효능제, 길항제 또는 가변 도메인이 이같은 분무 후 여전히 미응집 상태이다. 한 실시양태에서, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 95.5, 96, 96.5, 97, 97.5, 98, 98.5, 99 또는 99.5%의 펩티드, 폴리펩티드 또는 가변 도메인이 이같은 분무 후 여전히 단량체성이다. 한 실시양태에서, 이같은 분무 중 임의의 하나 후에 펩티드, 폴리펩티드, 가변 도메인, 효능제, 길항제의 응집이 나타나지 않는다.
펩티드 또는 폴리펩티드는 단리된 및/또는 재조합 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다.
적절하게는, 본 발명의 임의의 측면의 한 실시양태에서, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드는 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리로부터 선택된다.
본 발명은 또한 의약 (예를 들어, 요법 또는 진단을 위한 의약)에서 사용하기 위한 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능하거나 또는 선택된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 트립신-, 엘라스타제-, 또는 류코자임-저항성 면역글로불린 단일 가변 도메인)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능하거나 또는 선택된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 트립신-, 엘라스타제-, 또는 류코자임-저항성 면역글로불린 단일 가변 도메인)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유효량의 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능하거나 또는 선택된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 트립신-, 엘라스타제-, 또는 류코자임-저항성 면역글로불린 단일 가변 도메인)를 질환의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 임의의 측면의 한 실시양태에서, 방법은 제2 프로테아제를 프로테아제 저항성 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리와 제2 프로테아제의 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계; 및 원하는 생물학적 활성이 있는 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수함으로써, 제2 프로테아제에 대해 저항성인 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드가 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 제1 프로테아제와 제2 프로테아제는 상이하다. 제2 프로테아제는 상기 정의된 바와 같을 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 또는 제2 프로테아제는 레퍼토리 디스플레이 시스템에 대해 내인성이다.
본 발명은 당뇨병을 치료 및/또는 예방하기 위해 환자에게 투여하기 위한, 하나 이상의 상기 언급된 프로테아제와 함께 본 발명의 방법에 적절한 조건, 예를 들어 (i) 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 3 ㎎/㎖ 프로테아제, (ii) 약 20℃ 내지 약 40℃ 및 (iii) 약 30분 이상 동안의 조건 하에 (예를 들어, 37℃에서 1시간 이상 동안 100 ㎍/㎖의 프로테아제의 조건 하에) 인큐베이션되었을 때 이러한 프로테아제에 대해 저항성인 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 GLP-1 수용체 효능제를 추가로 제공한다. 효능제는 주사에 의한 투여에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드가 제2 프로테아제에 대한 저항성에 대해 또는 선택 방법에서 사용된 것과 상이한 조건 세트 하에서의 제1 프로테아제에 대한 저항성에 대해 추가로 평가된다. 제2 프로테아제는 제1 프로테아제와 상이하지만, 임의의 상기 기술된 프로테아제일 수 있다. 한 실시양태에서, 1가지를 초과하는 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 본 발명의 방법에서 선택된 후, 이러한 펩티드(들) 또는 폴리펩티드(들) 중 어느 것이 제2 프로테아제에 대한 저항성 또는 선택 방법에서 사용된 것과 상이한 조건 세트 하에서의 제1 프로테아제에 대한 저항성을 나타내는지를 결정하는 추가적인 단계가 이어진다. 제2 프로테아제는 제1 프로테아제와 상이하지만, 임의의 상기 기술된 프로테아제일 수 있다. 이러한 방식으로, 1가지를 초과하는 프로테아제에 대해 저항성인 하나 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드에 도달된다. 한 실시양태에서, 제1 프로테아제 또는 제2 프로테아제는 레퍼토리 디스플레이 시스템에서 내인성으로 발현되는 프로테아제이다.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 단량체성인 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인 단량체)가 선택된다.
본 발명의 약제, 효능제 및 길항제는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 항체 불변 영역 (예를 들어, Fc)을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 PK가 개선된 약제를 제공하기 위한 포유동물에게 투여하기 위한 약제의 제조에서의 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 개선된 PK는 개선된 AUC (곡선하 면적) 및/또는 개선된 반감기일 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 발명의 방법에 의해 선택되거나 또는 선택가능하다. 한 실시양태에서, 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 면역글로불린 단일 가변 도메인이다. 약제는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 항체 불변 영역, 예를 들어 항체 Fc를 포함할 수 있다.
본 발명은 포유동물에서의 PK가 개선된 약제를 제공하기 위한 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여하기 위한 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 약제를 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드는 본 발명의 방법에 의해 선택되거나 또는 선택가능하다. 한 실시양태에서, 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드는 면역글로불린 단일 가변 도메인이다. 약제는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 항체 불변 영역 (예를 들어, Fc)을 포함할 수 있다.
도 1은 GLP-1-AlbudAb 융합 변이체 1-10의 서열을 나타낸다.
도 2는 GLP-1-AlbudAb 융합 변이체 6-10의 젤을 나타낸다.
도 3은 GLP-1-AlbudAb 융합 변이체 6-10 (농축물)의 젤을 나타낸다.
도 4는 GLP-1-AlbudAb 융합 변이체 11의 젤을 나타낸다.
도 5는 GLP-1-AlbudAb 융합 변이체 6-11의 MS 결과를 나타낸다.
도 5a)는 DMS7148 (변이체 6)을 나타낸다; (분석 노트: 측정된 질량이 단일 디술피드가 있는 예상 질량 (15245.88)과 매칭된다.); b)는 DMS7149 (변이체 7)를 나타낸다 (분석 노트: 측정된 질량이 잔기 24-142 (12860.56), 26-142 (12603.26) 및 28-142 (12390.97) (모두 단일 디술피드가 있음)와 매칭된다. 각각의 피크에 +42 Da의 회합된 피크가 있다 - 아세틸화일 것이다.); c)는 DMS7150 (변이체 8)을 나타낸다 (분석 노트: 측정된 질량이 단일 디술피드가 있는 잔기 26-142 (12603.26)와 매칭된다.); d)는 DMS7151 (변이체 9)를 나타낸다 (분석 노트: 12960은 설명 불능. 12890.5, 12603 및 12391.50은 각각 잔기 24-142, 26-142 및 28-142 (각각 단일 디술피드가 있음) (12862.53, 12605.24 및 12392.94)에 근접하게 매칭된다. 그러나, 측정된 질량과 계산된 질량 사이에 2 Da 질량 불일치가 있다.); e)는 DMS7152 (변이체 10)를 나타낸다 (분석 노트: 12790.5 및 12320.5가 각각 잔기 24-142 및 28-142 (각각 단일 디술피드가 있음) (12790.42 및 12320.84)와 매칭된다.); f)는 DMS7161 (변이체 11)을 나타낸다.
도 6은 GLP-1-AlbudAb 융합 변이체 6의 검정의 결과를 나타낸다.
도 7은 GLP-1-AlbudAb 융합 변이체 11의 검정의 결과를 나타낸다.
본 명세서 내에서, 실시양태들을 참조로, 명확하고 정확한 명세서가 기재될 수 있도록 하는 방식으로 본 발명이 기술되었다. 실시양태들이 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다양하게 조합 또는 분리될 수 있도록 의도되고, 그럴 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용된 "펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 연결된 약 2개 내지 약 50개의 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용된 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 약 50개 이상의 아미노산을 지칭한다. 폴리펩티드는 일반적으로 3차 구조를 포함하고, 기능적인 도메인으로 폴딩(folding)된다.
본원에서 사용된, "프로테아제 분해에 대해 저항성인" 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어 도메인 항체 (dAb))는 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 프로테아제와 함께 인큐베이션되었을 때 프로테아제에 의해 실질적으로 분해되지 않는다. 프로테아제 활성에 적절한 온도, 예를 들어, 37℃ 또는 50℃에서 약 1시간 동안 프로테아제와 함께 인큐베이션된 후에 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 14% 이하, 약 13% 이하, 약 12% 이하, 약 11% 이하, 약 10% 이하, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하의 단백질이 프로테아제에 의해 분해되거나 또는 단백질이 실질적으로 분해되지 않는 경우에, 폴리펩티드 (예를 들어, dAb)가 실질적으로 분해되지 않는 것이다. 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예를 들어, SDS-PAGE에 의해 또는 본원에 기술된 바와 같은 기능적 검정 (예를 들어, 리간드 결합)에 의해 단백질 분해를 평가할 수 있다.
본원에서 사용된 "디스플레이 시스템"은 폴리펩티드들 또는 펩티드들의 선집이 원하는 특징, 예컨대 물리적, 화학적 또는 기능적 특징을 기초로 하는 선택에 대해 이용가능한 시스템을 지칭한다. 디스플레이 시스템은 폴리펩티드들 또는 펩티드들의 적절한 레퍼토리일 수 있다 (예를 들어, 용액 내, 고체 지지체 상에 고정됨). 또한 디스플레이 시스템은 세포 발현 시스템 (예를 들어, 핵산들의 라이브러리의 발현, 예를 들어, 형질전환, 감염, 형질감염 또는 형질도입된 세포에서의 발현, 및 코딩된 폴리펩티드의 세포 표면 상에서의 디스플레이) 또는 무세포 발현 시스템 (예를 들어, 에멀션 구획화 및 디스플레이)을 사용하는 생화학적 시스템일 수 있다. 바람직한 디스플레이 시스템은 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 연결한다. 이같은 디스플레이 시스템이 사용되는 경우, 원하는 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징이 있는 폴리펩티드 또는 펩티드를 선택할 수 있고, 선택된 폴리펩티드 또는 펩티드를 코딩하는 핵산을 쉽게 단리 또는 회수할 수 있다. 핵산의 코딩 기능과 폴리펩티드 또는 펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 연결하는 다수의 디스플레이 시스템, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이 (파지 디스플레이), 리보솜 디스플레이, 에멀션 구획화 및 디스플레이, 효모 디스플레이, 푸로마이신 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 플라스미드 상의 디스플레이, 공유결합 디스플레이 등이 당업계에 공지되어 있다. (예를 들어, EP 0436597 (다이액스(Dyax)), 미국 특허 번호 6,172,197 (맥카퍼티(McCafferty) 등), 미국 특허 번호 6,489,103 (그리피쓰(Griffiths) 등) 참조.)
본원에서 사용된 "레퍼토리"는 아미노산 서열 다양성을 특징으로 하는 폴리펩티드들 또는 펩티드들의 선집을 지칭한다. 레퍼토리의 개별적인 구성원들은 공통적인 특색, 예컨대 공통적인 구조적 특색 (예를 들어, 공통적인 코어(core) 구조) 및/또는 공통적인 기능적 특색 (예를 들어, 공통적인 리간드 (예를 들어, 제너릭 리간드 또는 표적 리간드)에 결합하는 능력)이 있을 수 있다.
본원에서 사용된 "기능적"은 생물학적 활성, 예컨대 특이적 결합 활성이 있는 폴리펩티드 또는 펩티드를 기술한다. 예를 들어, 용어 "기능적 폴리펩티드"는 자신의 항원-결합 부위를 통해 표적 항원에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 자신의 기질(들)에 결합하는 효소를 포함한다.
본원에서 사용된 "제너릭 리간드"는 소정의 레퍼토리의 기능적 구성원들 중 실질적인 일부분 (예를 들어, 실질적으로 모두)에 결합하는 리간드를 지칭한다. 제너릭 리간드 (예를 들어, 공통적인 제너릭 리간드)는, 비록 구성원들이 공통적인 표적 리간드에 대한 결합 특이성이 없을 수는 있지만, 소정의 레퍼토리의 다수의 구성원에 결합할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드 상에 기능적인 제너릭 리간드-결합 부위가 존재하는 것 (제너릭 리간드에 결합하는 능력에 의해 지시됨)은 폴리펩티드가 정확하게 폴딩되었고 기능적임을 가리킨다. 제너릭 리간드의 적절한 예에는 초항원, 레퍼토리의 기능적 구성원들의 실질적인 일부분 상에서 발현되는 에피토프에 결합하는 항체 등이 포함된다.
"초항원"은 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원들과 이러한 단백질들의 표적 리간드-결합 부위와 상이한 부위에서 상호작용하는 제너릭 리간드를 지칭하는 당업계의 용어이다. 스타필로코쿠스(Staphylococcus)의 장독소가 T-세포 수용체와 상호작용하는 초항원의 예이다. 항체에 결합하는 초항원에는 IgG 불변 영역에 결합하는 단백질 G (문헌 [Bjorck and Kronvall, J. Immunol, 133:969 (1984))]; IgG 불변 영역 및 VH 도메인에 결합하는 단백질 A (문헌 [Forsgren and Sjoquist, J. Immunol., 97:822 (1966)]); 및 VL 도메인에 결합하는 단백질 L (문헌 [Bjorck, J. Immunol, 140:1194 (1988)])이 포함된다.
본원에서 사용된 "표적 리간드"는 폴리펩티드 또는 펩티드가 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 리간드를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 경우, 표적 리간드는 임의의 원하는 항원 또는 에피토프일 수 있고, 폴리펩티드가 효소인 경우, 표적 리간드는 임의의 원하는 기질일 수 있다. 표적 항원에 대한 결합은 폴리펩티드 또는 펩티드가 기능성인 것에 좌우된다.
본원에서 사용된 "항체 포맷"은 구조물 상에 항원에 대한 결합 특이성을 부여하도록 항체 가변 도메인이 혼입될 수 있는 임의의 적절한 폴리펩티드 구조물을 지칭한다. 다양한 적절한 항체 포맷, 예컨대 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일쇄 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종 이량체, 상기의 것들 중 임의의 것의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fv 단편 (예를 들어, 단일쇄 Fv (scFv), 디술피드 결합 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 항체 가변 도메인 (예를 들어, dAb, VH, VHH, VL, 및 상기의 것들 중 임의의 것의 변형판 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 적절한 중합체의 공유결합 부착에 의해 변형됨)이 당업계에 공지되어 있다.
"면역글로불린 단일 가변 도메인"이라는 구절은 다른 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인 (VH, VHH, VL)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 가변 영역 또는 가변 도메인이 있는 포맷 (예를 들어, 동종-다량체 또는 이종-다량체)으로 존재할 수 있고, 이때 이러한 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 요구되지 않는다 (즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가적인 가변 도메인과 독립적으로 항원에 결합한다). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 바람직하게는 인간 항체 가변 도메인이지만, 설치류 (예를 들어, WO 00/29004 (US2002012909)에 개시되고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함됨), 너스 상어(nurse shark) 및 낙타류(Camelid) VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인이 또한 포함된다. 낙타류 VHH는 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타 및 과나코가 포함되는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이고, 이들은 천연적으로 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생산한다.
"도메인"은 나머지 단백질과 독립적인 3차 구조를 지니는 폴딩된 단백질 구조물이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 개별적인 기능적 성질들을 담당하고, 다수의 경우에 나머지 단백질 및/또는 도메인의 기능 손실 없이 부가되거나 제거되거나 또는 다른 단백질로 이동될 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 교체된 도메인, 또는 말단이 절단되었거나 N- 또는 C-확장물을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 유지하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
용어 "라이브러리"는 이종성 폴리펩티드들 또는 핵산들의 혼합물을 지칭한다. 라이브러리는 각각 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는 구성원들로 구성된다. 이러한 면에서, "라이브러리"는 "레퍼토리"와 동의어이다. 라이브러리 구성원들 간의 서열 차이가 라이브러리 내에 존재하는 다양성을 담당한다. 라이브러리는 폴리펩티드들 또는 핵산들의 단순한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 또는 핵산들의 라이브러리로 형질전환된 생물 또는 세포, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 각각의 개별적인 생물 또는 세포는 오직 1개의 또는 제한된 개수의 라이브러리 구성원을 함유한다. 유리하게는, 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 허용하기 위해, 핵산이 발현 벡터 내로 혼입된다. 따라서, 바람직한 측면에서, 라이브러리는 숙주 생물들의 집단의 형태를 취할 수 있고, 이때 자신의 상응하는 폴리펩티드 구성원을 생산하도록 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일 구성원을 함유하는 발현 벡터의 하나 이상의 카피를 각각의 생물이 함유한다. 따라서, 숙주 생물들의 집단은 다양한 폴리펩티드들의 대형 레퍼토리를 코딩하는 잠재력이 있다.
"유니버설(universal) 프레임워크"는 카밧(Kabat) (문헌 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, 1991])에 의해 정의된 바와 같이 서열 면에서 보존되는 항체 영역에 상응하거나 또는 문헌 [Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 의해 정의된 바와 같이 인간 생식계열 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 상응하는 단일 항체 프레임워크 서열이다. 본 발명은 초가변 영역 단독에서의 변동을 통해 사실상 모든 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 발견된 단일 프레임워크 또는 이같은 프레임워크들의 세트의 사용을 제공한다.
바람직하게는, 본원에서 정의된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 디폴트 파라메터를 사용하여 알고리즘 BLAST 2 시퀀시즈(BLAST 2 Sequences)을 사용하여 제조 및 결정된다 (문헌 [Tatusova, T. A. et al., FEMS Microbiol Lett, 174:187-188 (1999)]).
본 발명은 원하는 생물학적 활성이 있는 프로테아제 저항성 펩티드 및 폴리펩티드의 선택 방법에 관한 것이다. 고도로 안정적이고 프로테아제 분해에 대해 저항성인, 그리고 원하는 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드를 선택하기 위한 효율적인 공정이 제조되도록 이러한 방법에서 2가지 이상의 선택 압력이 사용된다. 본원에 기술된 바와 같이, 프로테아제 저항성 펩티드 및 폴리펩티드는 일반적으로 생물학적 활성을 유지한다. 반면에, 프로테아제 민감성 펩티드 및 폴리펩티드는 본원에 기술된 방법에서 프로테아제에 의해 절단 또는 소화되고, 따라서 자신의 생물학적 활성을 잃는다. 따라서, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 일반적으로 이의 생물학적 활성, 예컨대 결합 활성을 기초로 선택된다.
본원에 기술된 방법은 여러 장점을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기술되고 예시된 바와 같이, 하나의 프로테아제 (예를 들어, 트립신)에 의한 단백질분해성 분해에 대한 저항성에 대해 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드가 다른 프로테아제 (예를 들어, 엘라스타제, 류코자임)에 의한 분해에 대해 또한 저항성이다. 또한, 프로테아제 저항성이 펩티드 또는 폴리펩티드의 더 높은 용융 온도 (Tm)와 상관된다. 더 높은 용융 온도는 더욱 안정적인 펩티드 및 폴리펩티드를 가리킨다. 프로테아제 분해에 대한 저항성은 표적 리간드에 대한 높은 친화력의 결합과 또한 상관된다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 원하는 생물학적 활성이 있는, 그리고 프로테아제 저항성이고 안정적이기 때문에 생체내 치료 및/또는 진단 용도에 매우 적절한 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 효율적인 방식을 제공한다.
선택 방법
한 측면에서, 본 발명은 펩티드들 및 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리 (예를 들어, 디스플레이 시스템)로부터 프로테아제 (예를 들어, 하나 이상의 프로테아제)에 의한 분해에 대해 저항성인 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 방법이다. 바람직하게는, 이러한 방법은 펩티드들 및 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리 (예를 들어, 디스플레이 시스템)로부터 프로테아제 (예를 들어, 하나 이상의 프로테아제)에 의한 분해에 대해 저항성인 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 방법이다. 일반적으로, 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 라이브러리 또는 레퍼토리를 프로테아제 (예를 들어 박테리아 프로테아제 또는 외인성으로 첨가된 프로테아제, 예컨대 트립신, 엘라스타제, 류코자임, 판크레아틴, 가래)의 존재 하에 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계, 및 프로테아제에 의한 분해에 대해 저항성이고 원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 단계를 포함한다. 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 프로테아제의 활성으로 인해 일반적으로 생물학적 활성이 감소되거나 생물학적 활성을 잃는다. 따라서, 프로테아제 분해에 대해 저항성인 펩티드 또는 폴리펩티드를 이의 생물학적 활성, 예컨대 결합 활성 (예를 들어, 일반적인 리간드에 결합하는 것, 특이적 리간드에 결합하는 것, 기질에 결합하는 것), 촉매적 활성 또는 기타 생물학적 활성을 기초로 하는 방법을 사용하여 선택, 단리 및/또는 회수할 수 있다.
본원에 기술되고 예시된 바와 같이, 프로테아제 저항성 dAb는 일반적으로 높은 친화력으로 자신의 표적 리간드에 결합한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 리간드, 바람직하게는 표적 리간드에 높은 친화력으로 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 방법이다. 바람직하게는, 이러한 방법은 리간드, 바람직하게는 표적 리간드에 높은 친화력으로 결합하는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 방법이다. 일반적으로, 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 라이브러리 또는 레퍼토리를 프로테아제 (예를 들어, 트립신, 엘라스타제, 류코자임, 판크레아틴, 가래)와 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계, 및 리간드 (예를 들어, 표적 리간드)에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리를 디스플레이 시스템에 대해 내인성인 프로테아제, 예컨대 박테리아 프로테아제 (디스플레이 시스템이 박테리아에서의 발현을 포함하는 경우)의 활성에 적절한 조건 하에 인큐베이션하는 단계를 또한 포함할 수 있다. 프로테아제 민감성 펩티드 또는 폴리펩티드가 소화될 조건 하에 라이브러리 또는 레퍼토리가 프로테아제에 노출되었기 때문에, 프로테아제의 활성이 결합 친화력이 낮은 덜 안정적인 폴리펩티드를 제거할 수 있고, 이에 의해 고-친화력 결합 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집이 생산된다. 예를 들어, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드는 자신의 표적 리간드에 1 μM이거나 이보다 강한, 바람직하게는 약 500 nM 내지 약 0.5 pM의 친화력 (KD; KD = 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 K오프 ( off )(kd)/K온( on )(ka))으로 결합한다. 예를 들어, 고-친화력 펩티드 또는 폴리펩티드는 약 500 nM, 약 100 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 10 pM, 약 1 pM 또는 약 0.5 pM의 친화력으로 표적 리간드에 결합할 수 있다. 프로테아제에 대해 저항성인 펩티드 및 폴리펩티드는 엔트로피가 더 낮고/낮거나 안정화 에너지가 더 높은 것으로 여겨진다. 따라서, 프로테아제 저항성과 고-친화력 결합 간의 상관관계가 본 발명의 방법에 의해 선택된 펩티드 및 폴리펩티드의 표면의 안정성 및 조밀성(compactness)과 관련될 수 있다.
펩티드들 또는 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리가 프로테아제 (예를 들어, 하나 이상의 프로테아제)와 이러한 프로테아제의 단백질분해 활성에 적절한 조건 하에 조합된다. 프로테아제의 단백질분해 활성에 적절한 조건, 및 단백질분해 활성을 함유하는 생물학적 제제 또는 혼합물은 당업계에 주지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 원한다면, 예를 들어, 광범위한 pH 조건, 프로테아제 농도, 온도 하에서 프로테아제 활성을 평가함으로써 및/또는 라이브러리 또는 레퍼토리와 프로테아제가 반응하도록 허용되는 시간의 양을 변화시킴으로써, 적절한 조건을 확인 또는 최적화할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 프로테아제, 예를 들어 트립신 대 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 가변 도메인)의 비율 (몰/몰 기준)은 800 내지 80,000 (예를 들어, 8,000 내지 80,000) 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이고, 예를 들어 10 ㎍/㎖의 프로테아제가 사용되는 경우 비율이 800 내지 80,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이거나; 또는 100 ㎍/㎖의 프로테아제가 사용되는 경우 비율이 8,000 내지 80,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 대 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 가변 도메인)의 비율 (중량/중량, 예를 들어 ㎍/㎍ 기준)은 1,600 내지 160,000 (예를 들어, 16,000 내지 160,000) 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이고, 예를 들어 10 ㎍/㎖의 프로테아제가 사용되는 경우 비율이 1,600 내지 160,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이거나; 또는 100 ㎍/㎖의 프로테아제가 사용되는 경우 비율이 16,000 내지 160,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 적어도 100 또는 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용되고, 프로테아제, 예를 들어 트립신 대 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 가변 도메인)의 프로테아제:펩티드 비율 (몰/몰 기준)는 8,000 내지 80,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 적어도 10 ㎍/㎖의 농도고 사용되고, 프로테아제, 예를 들어 트립신 대 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 가변 도메인)의 프로테아제:펩티드 비율 (몰/몰 기준)은 800 내지 80,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 예를 들어 C가 10 ㎍/㎖인 경우, 프로테아제 (예를 들어, 트립신) 대 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 가변 도메인)의 비율 (중량/중량, 예를 들어 ㎍/㎍ 기준)이 1600 내지 160,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이거나; 또는 C 또는 C'이 100 ㎍/㎖인 경우 비율이 16,000 내지 160,000 프로테아제:펩티드 또는 폴리펩티드이다. 한 실시양태에서, 농도 (c 또는 c')는 적어도 100 또는 1000 ㎍/㎖ 프로테아제이다. 개별적인 또는 단리된 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 면역글로불린 가변 도메인), 예를 들어 레퍼토리 또는 라이브러리로부터 이미 단리된 것을 테스트하기 위해, 프로테아제가 적절한 완충제 (예를 들어, PBS) 내의 펩티드 또는 폴리펩티드의 용액에 첨가되어, 펩티드 또는 폴리펩티드/프로테아제 용액, 예컨대 적어도 약 0.01% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.01% 내지 약 5% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.05% 내지 약 5% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.1% 내지 약 5% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 0.5% 내지 약 5% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 약 1% 내지 약 5% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.01% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.02% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.03% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.04% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.05% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.06% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.07% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.08% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.09% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.1% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.2% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.3% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.4% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.5% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.6% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.7% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.8% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 0.9% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 1% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 2% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 3% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 적어도 약 4% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드, 또는 약 5% (w/w)의 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드가 생산될 수 있다. 이러한 혼합물을 프로테아제 활성에 적절한 온도 (예를 들어, 실온, 약 37℃)에서 인큐베이션할 수 있고, 시간 간격 (예를 들어, 1시간, 2시간, 3시간 등)으로 샘플을 취할 수 있다. 샘플을 임의의 적절한 방법, 예컨대 SDS-PAGE 분석 또는 리간드 결합을 사용하여 단백질 분해에 대해 분석할 수 있고, 결과를 사용하여 시간에 따른 분해 경과를 확립할 수 있다.
임의의 원하는 프로테아제 또는 프로테아제들이 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 프로테아제, 상이한 프로테아제들의 임의의 원하는 조합물, 또는 단백질분해 활성을 함유하는 임의의 생물학적 제제, 생물학적 추출물, 또는 생물학적 균질화물이 사용될 수 있다. 사용되는 프로테아제 또는 프로테아제들의 신원이 공지될 필요는 없다. 단독으로 또는 임의의 원하는 조합으로 사용될 수 있는 프로테아제의 적절한 예로는 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 티올 프로테아제, 매트릭스 메탈로프로테아제, 카르복시펩티다제(carboxypeptidase) (예를 들어, 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 B), 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인, 엘라스타제(elastase), 류코자임, 판크레아틴, 트롬빈, 플라스민, 카텝신 (예를 들어, 카텝신 G), 프로테이나제(proteinase) (예를 들어, 프로테이나제 1, 프로테이나제 2, 프로테이나제 3), 써모리신, 키모신, 엔테로펩티다제(enteropeptidase), 카스파제(caspase) (예를 들어, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 9, 카스파제 12, 카스파제 13), 칼파인, 피카인, 클로스트리파인, 악티니다인, 브로멜라인, 세파라제(separase), 디펩티딜 아미노펩티다제 IV 등이 포함된다. 단백질분해 활성을 함유하는 적절한 생물학적 추출물, 균질화물 및 제제에는 혈청, 가래, 점액 (예를 들어, 위 점액, 코 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질화물, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액, 눈물 등이 포함된다. 한 실시양태에서, 프로테아제는 눈 및/또는 눈물에서 발견되는 것이다. 프로테아제는 단백질분해성 분해가 일어나기에 적절한 양으로 사용된다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 프로테아제가 약 0.01% 내지 약 5% (w/w, 프로테아제/펩티드 또는 폴리펩티드)로 사용될 수 있다. 프로테아제가 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 포함하는 디스플레이 시스템 (예를 들어, 파지 디스플레이 시스템)과 조합되는 경우, 예를 들어, 프로테아제는 약 10 ㎍/㎖ 내지 약 3 ㎎/㎖, 약 10 ㎍/㎖, 약 20 ㎍/㎖, 약 30 ㎍/㎖, 약 40 ㎍/㎖, 약 50 ㎍/㎖, 약 60 ㎍/㎖, 약 70 ㎍/㎖, 약 80 ㎍/㎖, 약 90 ㎍/㎖, 약 100 ㎍/㎖, 약 200 ㎍/㎖, 약 300 ㎍/㎖, 약 400 ㎍/㎖, 약 500 ㎍/㎖, 약 600 ㎍/㎖, 약 700 ㎍/㎖, 약 800 ㎍/㎖, 약 900 ㎍/㎖, 약 1000 ㎍/㎖, 약 1.5 ㎎/㎖, 약 2 ㎎/㎖, 약 2.5 ㎎/㎖ 또는 약 3 ㎎/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 적절한 농도는 약 10 ㎍/㎖ 내지 1 ㎎/㎖, 10 ㎍/㎖ 내지 100, 90, 80, 70, 60, 50 또는 40 ㎍/㎖, 또는 10, 20, 30, 40 또는 50 ㎍/㎖ 내지 100, 90, 80, 70, 60 ㎍/㎖이다.
프로테아제는 이러한 프로테아제의 활성에 적절한 온도에서 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집 (라이브러리 또는 레퍼토리)과 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 프로테아제 및 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집이 약 20℃ 내지 약 40℃ (예를 들어, 실온, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃)의 온도에서 인큐베이션될 수 있다. 프로테아제 및 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집은 단백질분해성 분해가 일어나기에 충분한 기간 동안 함께 인큐베이션된다. 예를 들어, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집이 프로테아제와 함께 약 30분 내지 약 24시간 또는 약 48시간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 예에서, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집이 프로테아제와 함께 하룻밤 동안, 또는 적어도 약 30분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 48시간, 또는 이보다 긴 시간 동안 인큐베이션된다.
적어도 초기 선택 라운드에서 (예를 들어, 디스플레이 시스템이 사용되는 경우), 프로테아제와의 인큐베이션을 포함하지 않는 선택과 비교하여, 프로테아제가 선택되는 원하는 생물학적 활성이 있는 클론의 개수를 적어도 10배만큼 감소시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 특정 예에서, 방법에서 사용되는 프로테아제의 양 및 조건은 회수되는 클론의 개수를 적어도 약 1 로그 (10배), 적어도 약 2 로그 (100배), 적어도 약 3 로그 (1000배) 또는 적어도 약 4 로그 (10,000배)만큼 감소시키는데 충분하다. 회수되는 클론의 원하는 감소를 초래할 적절한 프로테아제의 양 및 인큐베이션 조건을 통상적인 방법 및/또는 본원에서 제공되는 지침을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다.
임의의 적절한 방법 (예를 들어, 시험관내, 생체내 또는 생체외)을 사용하여 프로테아제와 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집을 조합하여 인큐베이션할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 및 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집을 적절한 용기에서 조합하여, 프로테아제 활성에 적절한 온도에서 정지상으로 유지시키거나, 진동시키거나, 진탕시키거나, 와류시키는 것 등이 가능하다. 원한다면, 프로테아제 및 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집을 생체내 또는 생체외 시스템에서, 예컨대 폴리펩티드들의 선집 (예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 레퍼토리)을 적절한 동물 (예를 들어, 마우스) 내로 도입하고, 프로테아제 활성을 위한 충분한 시간이 지난 후, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집을 회수함으로써, 조합할 수 있다. 또 다른 예에서, 기관 또는 조직에 폴리펩티드들의 선집 (예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리 또는 레퍼토리)을 관류시키고, 프로테아제 활성을 위한 충분한 시간이 지난 후, 폴리펩티드들의 선집을 회수한다.
인큐베이션 후, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 원하는 생물학적 활성, 예컨대 결합 활성을 기초로 선택할 수 있다. 원한다면, 프로테아제 억제제를 선택 전에 첨가할 수 있다. 선택 방법을 실질적으로 방해하지 않을 임의의 적절한 프로테아제 억제제 (또는 2가지 이상의 프로테아제 억제제들의 조합물)이 사용될 수 있다. 적절한 프로테아제 억제제의 예로는 α1-항-트립신, α2-마크로글로불린, 아마스타틴, 안티파인, 항트롬빈 III, 아프로티닌, 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오라이드 히드로클로라이드 (AEBSF), (4-아미디노-페닐)-메탄-술포닐 플루오라이드 (APMSF), 베스타틴, 벤즈아미딘, 키모스타틴, 3,4-디클로로이소쿠마린, 디이소프로필 플루오로포스페이트 (DIFP), E-64, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 엘라스타티날, 류펩틴, N-에틸말레이미드, 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF), 펩스타틴, 1,10-페난트롤린, 포스포라미돈, 세린 프로테아제 억제제, N-토실-L-리신-클로로메틸 케톤 (TLCK), Na-토실-Phe-클로로메틸케톤 (TPCK) 등이 포함된다. 또한, 여러 클래스의 프로테아제의 억제제들을 함유하는 다수의 제제가 시판된다 (예를 들어, 키모트립신, 써모리신, 파파인, 프로나제(pronase), 췌장 추출물 및 트립신을 억제하는, 로슈 컴플릿 프로테아제 인히비터 칵테일 태블릿(Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets)™ (로슈 디아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation); 미국 인디애나주 인디아나폴리스)).
원하는 생물학적 활성이 있는 펩티드 및 폴리펩티드가 원하는 생물학적 활성이 없는 펩티드 또는 폴리펩티드로부터 구별되거나 이러한 펩티드 또는 폴리펩티드에 비해 선택되도록 하는 원하는 생물학적 활성 선택 방법을 사용하여 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택할 수 있다. 일반적으로, 프로테아제에 의해 소화 또는 절단된 펩티드 또는 폴리펩티드는 자신의 생물학적 활성을 잃는 한편, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드는 기능성으로 유지된다. 따라서, 생물학적 활성에 대한 적절한 분석법을 사용하여 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택할 수 있다. 예를 들어, 공통적인 결합 기능 (예를 들어, 일반적인 리간드의 결합, 특이적 리간드의 결합, 또는 기질의 결합)을 적절한 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 패닝)을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어, 표적 리간드 또는 제너릭 리간드, 예컨대 단백질 A, 단백질 L 또는 항체에 결합하는 폴리펩티드를 패닝에 의해 또는 적절한 친화력 매트릭스를 사용하여 선택, 단리 및/또는 회수할 수 있다. 패닝은 리간드 (예를 들어, 제너릭 리간드, 표적 리간드)의 용액을 적절한 용기 (예를 들어, 튜브, 페트리접시)에 첨가하고, 리간드가 용기의 벽에 침착 또는 코팅되도록 함으로써 달성될 수 있다. 과량의 리간드를 세정하여 제거할 수 있고, 폴리펩티드 (예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리)를 용기에 첨가하여, 고정된 리간드에 폴리펩티드가 결합하기에 적절한 조건 하에 용기를 유지시킬 수 있다. 미결합 폴리펩티드를 세정하여 제거할 수 있고, 결합된 폴리펩티드를 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 스크레이핑(scraping) 또는 pH 저하를 사용하여 회수할 수 있다.
파지 디스플레이 시스템이 사용되는 경우, 파지 ELISA에서 결합을 테스트할 수 있다. 임의의 적절한 절차에 따라 파지 ELISA를 수행할 수 있다. 한 예에서, 각각의 선택 라운드에서 생산된 파지 집단을 선택된 표적 리간드 또는 제너릭 리간드에 대한 결합에 대해 ELISA에 의해 스크리닝하여, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 디스플레이하는 파지를 확인할 수 있다. 원한다면, 가용성 펩티드 및 폴리펩티드를, 예를 들어, C- 또는 N-말단 태그(tag)에 대한 시약을 사용하여, 예를 들어, ELISA에 의해, 표적 리간드 또는 제너릭 리간드에 결합하는 것에 대해 테스트할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55] 및 이에 인용된 참고문헌 참조). 선택된 파지의 다양성을 PCR 생성물의 젤 전기영동 ([Marks et al. 1991, 상기 문헌]; [Nissim et al. 1994, 상기 문헌), 프로빙(probing) (문헌 [Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776]) 또는 벡터 DNA의 서열분석에 의해 또한 평가할 수 있다.
예를 들어, 촉매 활성을 기초로 프로테아제 저항성 펩티드 및 폴리펩티드를 또한 선택할 수 있고, 이러한 활성은 촉매 활성 분석법 (예를 들어, 단백질분해 활성 분석법, 포스포트랜스퍼라제(phosphotransferase) 분석법, 포스포히드롤라제(phosphohydrolase) 분석법, 폴리머라제 활성 분석법)을 사용하여 측정할 수 있다.
프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 단일 항체 가변 도메인)는 제너릭 리간드 또는 임의의 원하는 표적 리간드, 예컨대 사이토카인, 성장 인자, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체, 효소 (예를 들어, 프로테아제), 효소에 대한 보조인자, DNA 결합 단백질이 포함되는 인간 또는 동물 단백질, 지질 및 탄수화물에 대한 결합 특이성이 있을 수 있다. 사이토카인, 성장 인자, 사이토카인 수용체, 성장 인자 수용체 및 본원에 기술된 바와 같은 기타 단백질이 포함되는 적절한 표적 항원. 이러한 목록이 결코 완전한 것이 아님이 명백할 것이다.
일부 실시양태에서, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드는 폐 조직 내의 표적, 예컨대 TNFR1, IL-1, IL-1R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-8R, IL-9, IL-9R, IL-10, IL-12, IL-12R, IL-13, IL-13Rα1, IL-13Ra2, IL-15, IL-15R, IL-16, IL-17R, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-23, IL-23R, IL-25, CD2, CD4, CD11a, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD40, CD40L, CD56, CD138, ALK5, EGFR, FcER1, TGFb, CCL2, CCL18, CEA, CR8, CTGF, CXCL12 (SDF-1), 키마제, FGF, 푸린, 엔도텔린-1, 에오탁신 (예를 들어, 에오탁신, 에오탁신-2, 에오탁신-3), GM-CSF, ICAM-1, ICOS, IgE, IFNa, I-309, 인테그린, L-셀렉틴, MIF, MIP4, MDC, MCP-1, MMP, 호중구 엘라스타제, 오스테오폰틴, OX-40, PARC, PD-1, RANTES, SCF, SDF-1, siglec8, TARC, TGFb, 트롬빈, Tim-1, TNF, TRANCE, 트립타제, VEGF, VLA-4, VCAM, α4β7, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR8, 알파v베타6, 알파v베타8, cMET, CD8, vWF, 아밀로이드 단백질 (예를 들어, 아밀로이드 알파), MMP12, PDK1, 및 IgE로 구성된 군으로부터 선택된 표적에 결합한다.
디스플레이 시스템 (예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 연결하는 디스플레이 시스템)이 본원에 기술된 방법에서 사용되는 경우, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 카피수를 증폭 또는 증가시키는 것이 종종 유리하다. 이는 본원에 기술된 방법 또는 기타 적절한 방법을 사용하는 추가적인 선택 라운드를 위한 또는 추가적인 레퍼토리 (예를 들어, 친화력 성숙 레퍼토리)를 제조하기 위한 충분한 양의 핵산 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 수득하는 효율적인 방식을 제공한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 디스플레이 시스템 (예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 연결하는 것, 예컨대 파지 디스플레이)을 사용하는 것을 포함하고, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 카피수를 증폭 또는 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예컨대 파지 증폭, 세포 성장 또는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 핵산을 증폭시킬 수 있다.
본원에 기술된 방법은 원한다면 다른 적절한 선택 방법을 포함할 수 있는, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리하기 위한 프로그램의 일부로서 사용될 수 있다. 이러한 상황에서, 본원에 기술된 방법은 프로그램의 임의의 원하는 시점에, 예컨대 다른 선택 방법이 사용되기 전 또는 후에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 본원에 기술되고 예시된 바와 같이 2회 이상의 선택 라운드를 제공하는데 또한 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 프로테아제 저항성 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 생산하는 방법이다. 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 제공하는 단계; 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리 및 프로테아제를 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계; 및 원하는 생물학적 활성이 있는 다수의 펩티드 또는 폴리펩티드를 회수함으로써 프로테아제 저항성 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리가 생산되는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 원하는 생물학적 활성이 있는 다수의 펩티드 또는 폴리펩티드가 결합 활성, 예컨대 제너릭 리간드 또는 표적 리간드에 대한 결합을 기초로 회수된다. 프로테아제, 디스플레이 시스템, 프로테아제 활성에 대한 조건, 및 이러한 방법에서 사용하기에 적절한 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택하는 방법이 본 발명의 다른 방법과 관련하여 본원에서 기술된다.
일부 실시양태에서, 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 포함하는 디스플레이 시스템 (예를 들어, 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 연결하는 디스플레이 시스템)이 사용되고, 방법은 다수의 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 카피수를 증폭 또는 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예컨대 파지 증폭, 세포 성장 또는 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 핵산을 증폭시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이이고, 증폭은 대장균에서의 발현을 통한 것이다. 이러한 실시양태에서, 대장균에서의 프로테아제 발현이 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드의 선택을 위한 프로테아제를 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 dAb를 포함하는 프로테아제 저항성 폴리펩티드들의 레퍼토리를 생산하는 방법이다. 이러한 방법은 dAb를 포함하는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 제공하는 단계; 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리와 프로테아제 (예를 들어, 트립신, 엘라스타제, 류코자임)를 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계; 및 제너릭 리간드 (예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L) 또는 표적 리간드에 대한 결합 특이성이 있는 dAb를 포함하는 다수의 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 나이브(naive) 레퍼토리, 또는 원하는 결합 특이성에 대해 편향된 레퍼토리, 예컨대 원하는 표적 리간드에 대한 결합 특이성이 있는 어버이 dAb를 기초로 하는 친화력 성숙 레퍼토리를 생산하는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 디스플레이 시스템
바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 제공되는 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리 또는 라이브러리는 적절한 디스플레이 시스템을 포함한다. 바람직하게는 디스플레이 시스템은 프로테아제 (예를 들어, 단일 프로테아제 또는 프로테아제들의 조합물, 및 단백질분해 활성을 함유하는 임의의 생물학적 추출물, 균질화물 또는 제제 (예를 들어, 혈청, 가래, 점액 (예를 들어, 위 점액, 코 점액, 기관지 점액), 기관지폐포 세척액, 폐 균질화물, 폐 추출물, 췌장 추출물, 위액, 타액, 눈물 등))에 의한 분해에 대해 저항한다. 디스플레이 시스템, 및 디스플레이 시스템과 디스플레이된 폴리펩티드 간의 연결은 바람직하게는 적어도 레퍼토리의 가장 안정적인 펩티드 또는 폴리펩티드만큼 프로테아제에 대해 저항성이다. 이는 선택된 디스플레이된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 쉽게 단리 및/또는 증폭되도록 한다.
한 예에서, 용액 내에 있는 또는 적절한 표면, 예컨대 플라스틱 또는 유리 (예를 들어, 미량역가 플레이트, 폴리펩티드 어레이 예컨대 마이크로어레이)에 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 부착된 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리로부터 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 선택, 단리 및/또는 회수될 수 있다. 예를 들어, 각각의 별개의 라이브러리 구성원 (예를 들어, 독특한 펩티드 서열)이 어레이 내의 미리 정해진 개별적인 위치에 놓이는 방식의 표면 상의 펩티드 어레이가 사용될 수 있다. 이같은 어레이 내의 각각의 라이브러리 구성원의 신원이 어레이 내에서의 이의 공간적인 위치에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 표적 리간드와 반응성 라이브러리 구성원 간의 결합 상호작용이 일어나는 어레이 내의 위치가 결정됨으로서, 공간적 위치를 기초로 반응성 구성원의 서열을 확인할 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,143,854, WO 90/15070 및 WO 92/10092 참조.)
바람직하게는, 이러한 방법은 핵산의 코딩 기능과 이러한 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 연결하는 디스플레이 시스템을 사용한다. 이같은 디스플레이 시스템은 다수의 복제가능한 유전학적 패키지, 예컨대 박테리오파지 또는 세포 (박테리아)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 디스플레이 시스템은 라이브러리, 예컨대 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 포함한다. 박테리오파지 디스플레이가 특히 바람직한 디스플레이 시스템이다.
다수의 적절한 박테리오파지 디스플레이 시스템 (예를 들어, 1가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 기술되어 있다. (예를 들어, 그리피쓰(Griffiths) 등의 미국 특허 번호 6,555,313 B1 (본원에 참고로 포함됨); 존슨(Johnson) 등의 미국 특허 번호 5,733,743 (본원에 참고로 포함됨); 맥카퍼티(McCafferty) 등의 미국 특허 번호 5,969,108 (본원에 참고로 포함됨); 멀리건-케호(Mulligan-Kehoe)의 미국 특허 번호 5,702,892 (본원에 참고로 포함됨); 문헌 [Winter, G. et al., Annu. Rev. Immunol. 72:433-455 (1994)]; [Soumillion, P. et al., Appl Biochem. Biotechnol 47(2-3):175-189 (1994)]; [Castagnoli, L. et al., Comb. Chem. High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)] 참조.) 박테리오파지 디스플레이 시스템에 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어 필라멘트형 파지 (예를 들어, fd, M13, F1), 용균성 파지 (예를 들어, T4, T7, 람다), 또는 RNA 파지 (예를 들어, MS2)와 같은 임의의 적절한 박테리오파지 상에 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 적절한 파지 코트 단백질 (예를 들어, fd pIII 단백질)과의 융합 단백질로서 펩티드들 또는 파지 폴리펩티드들의 레퍼토리를 디스플레이하는 파지의 라이브러리가 생산 또는 제공된다. 이러한 융합 단백질은 파지 코트 단백질의 끝부분에 또는 원한다면 내부 위치에 펩티드 또는 폴리펩티드를 디스플레이할 수 있다. 예를 들어, 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드는 pIII의 도메인 1의 아미노-말단인 위치에 존재할 수 있다. (pIII의 도메인 1은 N1으로 또한 지칭될 수 있다.) 디스플레이된 폴리펩티드는 직접적으로 pIII (예를 들어, pIII의 도메인 1의 N-말단)에 융합될 수 있거나, 또는 링커(linker)를 사용하여 pIII에 융합될 수 있다. 원한다면, 융합물은 태그 (예를 들어, myc 에피토프, His 태그)를 추가로 포함할 수 있다. 파지 코트 단백질과의 융합 단백질로서 디스플레이된 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예컨대 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 파지 벡터 또는 파지미드 벡터의 라이브러리를 적절한 숙주 박테리아 내로 도입하고, 생성된 박테리아를 배양하여 파지를 생산함 (예를 들어, 원한다면 적절한 헬퍼 파지 또는 보완 플라스미드를 사용함)으로써 생산할 수 있다. 적절하게는, 본 발명의 한 실시양태에서, 박테리아에서의 프로테아제 발현을 위한 적절한 조건이 선택된다. 임의의 적절한 방법, 예컨대 침전 및 원심분리를 사용하여 파지의 라이브러리를 배양물로부터 회수할 수 있다.
디스플레이 시스템은 임의의 원하는 양의 다양성을 함유하는 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리는 생물, 일군의 생물, 원하는 조직 또는 원하는 세포 유형에 의해 발현되는 천연 발생 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있거나, 또는 무작위 또는 무작위화 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 원한다면, 폴리펩티드는 공통적인 코어 또는 스캐폴드(scaffold)를 공유할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 모든 폴리펩티드가 단백질 A, 단백질 L, 단백질 G, 피브로넥틴 도메인, 안티칼린, CTLA4, 원하는 효소 (예를 들어, 폴리머라제, 셀룰라제(cellulase)), 또는 면역글로불린 수퍼패밀리로부터의 폴리펩티드, 예컨대 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 항체 가변 도메인)으로부터의 스캐폴드를 기초로 할 수 있다. 이같은 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 폴리펩티드는 무작위 또는 무작위화 아미노산 서열의 규정된 영역, 및 공통적인 아미노산 서열의 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 레퍼토리 내의 모든 또는 실질적으로 모든 폴리펩티드는 원하는 유형, 예컨대 원하는 효소 (예를 들어, 폴리머라제) 또는 항체의 원하는 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간 VH 또는 인간 VL)의 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 디스플레이 시스템은 각각의 폴리펩티드가 항체 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 포함한다. 예를 들어, 레퍼토리 내의 각각의 폴리펩티드가 VH, VL 또는 Fv (예를 들어, 단일쇄 Fv)를 함유할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 레퍼토리는 어버이 분자 예컨대 GLP-1 또는 이의 유도체 예컨대 디펩티딜 펩티다제 IV-저항성 유도체를 기초로 하는 폴리펩티드들의 라이브러리일 수 있다.
임의의 적절한 방법을 사용하여 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 스캐폴드의 임의의 원하는 영역 내로 아미노산 서열 다양성이 도입될 수 있다. 예를 들어, 임의의 적절한 돌연변이유발 방법 (예를 들어, 저-충실도(fidelity) PCR, 올리고뉴클레오티드-매개 또는 부위 지정 돌연변이유발, NNK 코돈을 사용하는 다양화) 또는 임의의 기타 적절한 방법을 사용하여, 다양화된 폴리펩티드들을 코딩하는 핵산들의 라이브러리를 제조함으로써 아미노산 서열 다양성이 표적 영역, 예컨대 소수성 도메인 또는 항체 가변 도메인의 상보성 결정 영역 내로 도입될 수 있다. 원한다면, 다양화될 폴리펩티드의 영역이 무작위화될 수 있다.
레퍼토리를 구성하는 폴리펩티드의 크기는 주로 선택에 관한 문제이고, 균일한 폴리펩티드 크기가 요구되지 않는다. 바람직하게는, 레퍼토리 내의 폴리펩티드는 적어도 3차 구조가 있다 (하나 이상의 도메인을 형성한다).
선택/단리/회수
프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 프로테아제 저항성 폴리펩티드들의 집단)를 임의의 적절한 방법을 사용하여 레퍼토리 또는 라이브러리 (예를 들어, 디스플레이 시스템 내의 레퍼토리 또는 라이브러리)로부터 선택, 단리 및/또는 회수할 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제 저항성 폴리펩티드가 선택가능한 특징 (예를 들어, 물리적 특징, 화학적 특징, 기능적 특징)을 기초로 선택 또는 단리된다. 적절한 선택가능한 기능적 특징에는 레퍼토리 내의 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 제너릭 리간드 (예를 들어, 초항원)에 결합하는 것, 표적 리간드 (예를 들어, 항원, 에피토프, 기질)에 결합하는 것, 항체에 결합하는 것 (예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 상에 발현된 에피토프를 통해), 및 촉매 활성이 포함된다. (예를 들어, 톰린슨(Tomlinson) 등의 WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655 참조.)
일부 실시양태에서, 실질적으로 모든 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 공통적인 선택가능한 특색을 공유하는 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 선택 및/또는 단리된다. 예를 들어, 실질적으로 모든 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 공통적인 제너릭 리간드에 결합하거나, 공통적인 표적 리간드에 결합하거나, 공통적인 항체에 결합하거나 (또는 이에 의해 결합되거나), 또는 공통적인 촉매 활성을 보유하는 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 이러한 선택 유형은, 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화력 성숙을 수행하는 경우에, 원하는 생물학적 활성이 있는 어버이 펩티드 또는 폴리펩티드를 기초로 하는 프로테아제 저항성 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 레퍼토리를 제조하는데 특히 유용하다.
공통적인 제너릭 리간드에 결합하는 것을 기초로 하는 선택으로, 원래의 라이브러리 또는 레퍼토리의 성분인 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집 또는 집단이 산출될 수 있다. 예를 들어, 표적 리간드 또는 제너릭 리간드, 예컨대 단백질 A, 단백질 L 또는 항체에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 패닝 또는 적절한 친화력 매트릭스의 사용에 의해 선택, 단리 및/또는 회수할 수 있다. 패닝은 리간드 (예를 들어, 제너릭 리간드, 표적 리간드)의 용액을 적절한 용기 (예를 들어, 튜브, 페트리접시)에 첨가하고, 리간드가 용기의 벽에 침착 또는 코팅되도록 함으로써 달성될 수 있다. 과량의 리간드를 세정하여 제거할 수 있고, 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 프로테아제와 함께 인큐베이션된 레퍼토리)를 용기에 첨가하여, 고정된 리간드에 펩티드 또는 폴리펩티드가 결합하기에 적절한 조건 하에 용기를 유지시킬 수 있다. 미결합 펩티드 또는 폴리펩티드를 세정하여 제거할 수 있고, 결합된 폴리펩티드를 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 스크레이핑 또는 pH 저하를 사용하여 회수할 수 있다.
적절한 리간드 친화성 매트릭스는 리간드가 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 부착되는 고체 지지체 또는 비드 (예를 들어, 아가로스)를 일반적으로 함유한다. 매트릭스 상의 리간드에 대한 펩티드 또는 폴리펩티드의 결합에 적절한 조건 하에 뱃치(batch) 공정, 칼럼 공정 또는 임의의 기타 적절한 공정을 사용하여 친화성 매트릭스가 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 프로테아제와 함께 인큐베이션된 레퍼토리)와 조합될 수 있다. 친화성 매트릭스에 결합하지 않은 펩티드 또는 폴리펩티드를 세정하여 제거할 수 있고, 결합된 펩티드 또는 폴리펩티드를 임의의 적절한 방법, 예컨대 더 낮은 pH 완충제, 순한 변성제 (예를 들어, 요소), 또는 리간드에 결합하는 것에 대해 경쟁하는 펩티드로의 용출을 사용하여 용출시켜 회수할 수 있다. 한 예에서, 비오틴화 표적 리간드가 레퍼토리 내의 펩티드 또는 폴리펩티드가 표적 리간드에 결합하기에 적절한 조건 하에 레퍼토리와 조합된다. 결합된 펩티드 또는 폴리펩티드가 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘 (예를 들어, 비드 상에 고정됨)을 사용하여 회수된다.
일부 실시양태에서, 제너릭 또는 표적 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 라이브러리 또는 레퍼토리의 펩티드들 또는 폴리펩티드들에서 실질적으로 보존된 펩티드 또는 폴리펩티드의 구조적 특색에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편이 제너릭 리간드로서 특히 유용하다. 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리, 선택 및/또는 회수하기 위한 리간드로서 사용하기에 적절한 항체 및 항원 결합 단편은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 적절한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
라이브러리/레퍼토리
한 측면에서, 본 발명은 프로테아제 저항성 펩티드들 및 폴리펩티드들의 레퍼토리, 프로테아제 저항성 펩티드 및 폴리펩티드를 코딩하는 라이브러리, 및 이같은 라이브러리 및 레퍼토리를 생산하는 방법에 관한 것이다.
임의의 적절한 방법을 사용하여 프로테아제 저항성 펩티드 및 폴리펩티드를 코딩 및/또는 함유하는 라이브러리를 제조하거나 수득할 수 있다. 본 발명의 라이브러리는 관심 펩티드 또는 폴리펩티드를 기초로 하는 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들어, 라이브러리로부터 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드)를 코딩하도록 디자인될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 방법을 사용하여 또 다른 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 저항성 폴리펩티드가 강화된 라이브러리를 적절한 폴리펩티드 디스플레이 시스템을 사용하여 제조할 수 있다.
한 예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예를 들어, VH, Vk, Vλ)을 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드들의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리를 본원에 기술된 바와 같이 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 프로테아제와 조합한다. 원하는 생물학적 활성, 예컨대 결합 활성 (예를 들어, 제너릭 리간드에 결합하는 것, 표적 리간드에 결합하는 것)을 기초로 프로테아제 저항성 폴리펩티드를 회수함으로써, 프로테아제 저항성 폴리펩티드가 강화된 파지 디스플레이 라이브러리가 산출된다.
또 다른 예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인 (예를 들어, VH, Vk, Vλ)을 포함하는 디스플레이된 폴리펩티드들의 레퍼토리를 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리를 먼저 스크리닝하여, 원하는 표적 항원에 대한 결합 특이성이 있는 레퍼토리의 구성원을 확인한다. 원하는 결합 특이성이 있는 폴리펩티드들의 선집을 회수하고, 이러한 선집을 본원에 기술된 바와 같이 단백질분해 활성에 적절한 조건 하에 프로테아제와 조합한다. 원하는 표적 결합 특이성이 있는 프로테아제 저항성 폴리펩티드들의 선집을 회수하여, 프로테아제 저항성 및 고-친화력 폴리펩티드가 강화된 라이브러리가 산출된다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 선택 방법에서의 프로테아제 저항성이 고-친화력 결합과 상관된다.
원하는 유형의 폴리펩티드들의 레퍼토리를 코딩하는 라이브러리를 임의의 적절한 방법을 사용하여 용이하게 생산할 수 있다. 예를 들어, 원하는 유형의 폴리펩티드 (예를 들어, 폴리머라제, 면역글로불린 가변 도메인)를 코딩하는 핵산 서열을 수득할 수 있고, 예를 들어 에러-경향 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 시스템을 사용하여 핵산을 증폭시킴으로써, 화학적 돌연변이유발 (문헌 [Deng et al., J. Biol. Chem., 269:9533 (1994)])에 의해 또는 박테리아 돌연변이유발자 균주 (문헌 [Low et al., J. Mol. Biol, 260:359 (1996)])를 사용하여, 각각 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 핵산들의 선집을 제조할 수 있다.
다른 실시양태에서, 핵산의 특정 영역이 다양화를 위해 표적화될 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이시키는 방법이 또한 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, PCR을 사용하면서 또는 사용하지 않으면서 미스매칭된(mismatched) 올리고뉴클레오티드 또는 축퇴성 올리도뉴클레오티드를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이를 항원 결합 루프에 표적화함으로써 합성 항체 라이브러리가 생성되었다. 무작위 또는 반-무작위 항체 H3 및 L3 영역이 생식계열 면역글로불린 V 유전자 절편에 첨부되어, 프레임워크 영역이 돌연변이되지 않은 대형 라이브러리가 생산된다 ([Hoogenboom and Winter (1992) 상기 문헌]; [Nissim et al. (1994) 상기 문헌]; [Griffiths et al. (1994) 상기 문헌]; [DeKruif et al. (1995) 상기 문헌]). 이같은 다양화가 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 전부를 포함하도록 확장되었다 (문헌 [Crameri et al. (1996) Nature Med., 2:100]; [Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13:475]; 모포시스(Morphosys)의 WO 97/08320). 다른 실시양태에서, 핵산의 특정 영역이, 예를 들어, 제1 PCR의 생성물을 "메가-프라이머(mega-primer)"로 사용하는 2단계 PCR 전략에 의해, 다양화를 위해 표적화될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Landt, O. et al., Gene 96:125-128 (1990)] 참조.) 표적화된 다양화가, 예를 들어, SOE PCR에 의해 또한 달성될 수 있다. (예를 들어, 문헌 [Horton, R.M. et al., Gene 77:61-68 (1989)] 참조.)
선택된 위치에서의 서열 다양성은 폴리펩티드의 서열을 상술하는 코딩 서열을 다수의 가능한 아미노산 (예를 들어, 20개 모두 또는 이의 부분집합)이 이러한 위치에서 혼입될 수 있도록 변경시킴으로서 달성될 수 있다. IUPAC 명명법을 사용하여, 가장 다용도의 코돈은 NNK이고, 이는 모든 아미노산, 뿐만 아니라 TAG 정지 코돈을 코딩한다. 요구되는 다양성을 도입하기 위해 NNK 코돈이 바람직하게 사용된다. NNN 코돈이 포함되는 동일한 결과를 달성하는 기타 코돈이 또한 유용하고, 이는 추가적인 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생산에 이른다. 이같은 표적화된 접근법은 표적 구역 내의 전체 서열 공간이 탐구되도록 할 수 있다.
바람직한 라이브러리는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, 항체 또는 이의 일부분)인 프로테아제 저항성 폴리펩티드들을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 공지된 주쇄 입체형상을 지니는 프로테아제 저항성 항체 폴리펩티드들을 포함할 수 있다. (예를 들어, 톰린슨 등의 WO 99/20749 참조.) 적절한 플라스미드 또는 벡터에서 라이브러리가 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 벡터는 이종 DNA를 이의 발현 및/또는 복제를 위해 세포 내로 도입하기 위해 사용되는 개별적인 요소를 지칭한다. 플라스미드 (예를 들어, 박테리아 플라스미드), 바이러스 또는 박테리오파지 벡터, 인공 염색체 및 에피솜 벡터가 포함되는 임의의 적절한 벡터가 사용될 수 있다. 이같은 벡터가 단순한 클로닝 및 돌연변이유발에 사용될 수 있거나, 또는 발현 벡터가 라이브러리의 발현을 구동시키는데 사용될 수 있다. 벡터 및 플라스미드는 하나 이상의 클로닝 부위 (예를 들어, 폴리링커), 복제 기원, 및 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 일반적으로 함유한다. 발현 벡터는 폴리펩티드의 전사 및 번역을 구동시키는 요소, 예컨대 인핸서 요소, 프로모터, 전사 종결 신호, 신호 서열 등을 추가로 함유할 수 있다. 이러한 요소들은 이같은 발현 벡터가 발현에 적절한 조건 하에 (예를 들어, 적절한 숙주 세포 내에) 유지될 때 폴리펩티드가 발현 및 생산되도록, 폴리펩티드를 코딩하는 클로닝된 삽입물에 작동적으로 연결되도록 하는 방식으로 배열될 수 있다.
클로닝 및 발현 벡터는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 일반적으로 함유한다. 전형적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하는 것이고, 복제 기원 또는 자가 복제 서열을 포함한다. 이같은 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 주지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원이 대부분의 그람(Gram)-음성 박테리아에 적절하고, 2 마이크론 플라스미드 기원이 효모에 적절하며, 다양한 바이러스 기원 (예를 들어 SV40, 아데노바이러스)이 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예컨대 COS 세포에서 사용되지 않는 한, 포유류 발현 벡터에 대해서는 복제 기원이 필요하지 않다.
클로닝 또는 발현 벡터는 선택가능한 마커로 또한 지칭되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 이같은 마커 유전자는 선택 배양 배지에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 이러한 배양 배지에서 생존하지 않을 것이다. 전형적인 선택 유전자는 항생제 및 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 저항성을 부여하거나, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 성장 배지에서 입수가능하지 않은 결정적인 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.
적절한 발현 벡터는 다수의 성분, 예를 들어, 복제 기원, 선택가능한 마커 유전자, 하나 이상의 발현 제어 요소, 예컨대 전사 제어 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종결인자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 리더(leader) 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 제어 요소 및 신호 또는 리더 서열은, 존재하는 경우, 벡터 또는 기타 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 제어 서열이 발현을 지시하는데 사용될 수 있다.
원하는 숙주 세포에서의 발현을 위해 프로모터가 제공될 수 있다. 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 핵산의 전사를 지시하도록 프로모터가 항체, 항체 사슬 또는 이의 일부분을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있다. 원핵생물 숙주 (예를 들어, β-락타마제(lactamase) 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제(phosphatase), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 대장균용 lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵생물 숙주 (예를 들어, 원숭이 바이러스 40 초기 또는 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, EG-1a 프로모터)에 대한 다양한 적절한 프로모터가 입수가능하다.
또한, 전형적으로 발현 벡터는 벡터를 보유하는 숙주 세포의 선택을 위한 선택가능한 마커를 포함하고, 복제가능한 발현 벡터의 경우에는 복제 기원을 포함한다. 항생제 또는 약물 저항성을 부여하는 생성물을 코딩하는 유전자가 통상적인 선택가능한 마커이고, 원핵생물 세포에서 사용될 수 있다 (예를 들어, β-락타마제 유전자 (앰피실린 저항성), 테트라사이클린 저항성에 대한 Tet 유전자) 및 진핵생물 세포 (예를 들어, 네오마이신 (G418 또는 제네티신), gpt (미코페놀산), 앰피실린, 또는 히그로마이신 저항성 유전자). 디히드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트로의 선택을 허용한다. 숙주의 영양요구성 마커의 유전자 생성물을 코딩하는 유전자 (예를 들어, LEU2, URA3, HIS3)가 효모에서 선택가능한 마커로서 종종 사용된다. 바이러스 (예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있는 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터의 사용이 또한 고려된다.
원핵생물 세포 (예를 들어, 박테리아 세포 예컨대 대장균) 또는 포유류 세포에서의 발현을 위한 적절한 발현 벡터에는, 예를 들어, pET 벡터 (예를 들어, pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, 노바젠(Novagen) 등), 파지 벡터 (예를 들어, pCANTAB 5 E, 파마시아(Pharmacia)), pRIT2T (단백질 A 융합 벡터, 파마시아), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1 (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라호야), pCDEF3 (문헌 [Goldman, L.A., et al., Biotechniques, 27:1013-1015 (1996)]), pSVSPORT (깁코BRL(GibcoBRL), 메릴랜드주 로크빌), pEF-Bos (문헌 [Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)]) 등이 포함된다. 다양한 발현 숙주, 예컨대 원핵생물 세포 (대장균), 곤충 세포 (드로소필라(Drosophila) 슈나이더(Schnieder) S2 세포, Sf9), 효모 (피치아 메타놀리카(P. methanolica), 피치아 파스토리스(P. pastoris), 사카로마이세스 세레비지아에(S. cerevisiae)) 및 포유류 세포 (예를 들어, COS 세포)에서의 사용에 적절한 발현 벡터들이 입수가능하다.
바람직한 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 구성원에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 제너릭 및/또는 표적 리간드로의 선택이 폴리펩티드 라이브러리 구성원을 발현하는 단일 클론의 분리된 증식 및 발현에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 바람직한 선택 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이이다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터가 사용될 수 있다. 바람직한 벡터는 대장균 복제 기원 (이중 가닥 복제용) 및 또한 파지 복제 기원 (단일 가닥 DNA 생산용)이 있는 파지미드 벡터이다. 이같은 벡터의 조작 및 발현이 당업계에 주지되어 있다 ([Hoogenboom and Winter (1992) 상기 문헌]; [Nissim et al. (1994) 상기 문헌]). 간략하게, 벡터는 적절한 리더 서열, 다중 클로닝 부위, 하나 이상의 펩티드 태그, 하나 이상의 TAG 정지 코돈 및 파지 단백질 pIII을 함유할 수 있는 발현 카세트의 상류에 파지미드에 선택성을 부여하는 β-락타마제 유전자 및 lac 프로모터를 함유할 수 있다. 따라서, 대장균의 다양한 억제 및 비-억제 균주를 사용하고, 글루코스, 이소프로필 티오-β-D-갈락토시드 (IPTG) 또는 헬퍼 파지, 예컨대 VCS M13을 첨가하여, 벡터가 발현 없이 플라스미드로서 복제될 수 있고, 대량의 폴리펩티드 라이브러리 구성원 단독 또는 생성물 파지를 생산할 수 있으며, 이러한 파지 중 일부는 자신의 표면 상에 폴리펩티드-p III 융합물의 1개 이상의 카피를 함유한다.
본 발명의 라이브러리 및 레퍼토리는 항체 포맷을 함유할 수 있다. 예를 들어, 라이브러리 및 레퍼토리 내에 함유된 폴리펩티드는 항체 또는 이의 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv 또는 scFv 단편, 분리된 VH 또는 VL 도메인일 수 있고, 이들 중 임의의 것이 변형되거나 변형되지 않는다. 임의의 적절한 방법을 사용하여 scFv 단편, 뿐만 아니라 기타 항체 폴리펩티드를 용이하게 생산할 수 있다. 다수의 적절한 항체 조작 방법이 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 2개의 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 적합한 링커 펩티드, 예컨대 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 또는 기타 적절한 링커 펩티드를 코딩하는 적절한 올리고뉴클레오티드로 연결함으로써 scFv가 형성될 수 있다. 링커는 제1 V 영역의 C-말단과 제2 V 영역의 N-말단을 연결한다. 기타 항체 포맷, 예컨대 Fv, Fab 및 F(ab')2 단편의 구축을 위한 유사한 기술을 사용할 수 있다. Fab 및 F(ab')2 단편의 포맷을 위해, 재배열된 유전자, 생식계열 C 유전자로부터 단리될 수 있거나 또는 항체 서열 데이터로부터 합성될 수 있는 불변 영역과 VH 및 VL 폴리펩티드가 조합될 수 있다. 본 발명에 따른 라이브러리 또는 레퍼토리는 VH 또는 VL 라이브러리 또는 레퍼토리일 수 있다.
프로테아제 저항성 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 바람직하게는 표적 리간드 결합 부위 및/또는 제너릭 리간드 결합 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제너릭 리간드 결합 부위는 초항원, 예컨대 단백질 A, 단백질 L 또는 단백질 G에 대한 결합 부위이다. 가변 도메인은 임의의 원하는 가변 도메인, 예를 들어 인간 VH (예를 들어, VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), 인간 Vλ (예를 들어, VλI, VλII, VλIII, VλIV, VλV, VλVI 또는 Vκ1) 또는 인간 V□ (예를 들어, Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vκ5, VH6, Vκ7, Vκ8, Vκ9 또는 Vκ10)를 기초로 할 수 있다.
핵산, 숙주 세포, 및 프로테아제 저항성 폴리펩티드의 생산 방법
본 발명은 또한 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능하거나 선택된, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 및/또는 재조합 핵산에 관한 것이다.
본원에서 "단리된"으로 지칭되는 핵산은 자신의 원래의 환경 내 (예를 들어, 세포 내 또는 라이브러리와 같은 핵산들의 혼합물 내)의 다른 물질 (예를 들어, 게놈 DNA, cDNA 및/또는 RNA와 같은 다른 핵산)로부터 분리된 핵산이다. 단리된 핵산은 벡터 (예를 들어, 플라스미드)의 일부로서 단리될 수 있다.
본원에서 "재조합"으로 지칭되는 핵산은 인공적인 재조합, 예컨대 제한 효소, 동종 재조합, 바이러스 등을 예를 들어 사용하는 벡터 또는 염색체 내로의 클로닝에 의존하는 방법이 포함되는 재조합 DNA 방법에 의해 생산된 핵산, 및 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 제조된 핵산이다.
본 발명은 또한 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 의해 선택가능하거나 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 (하나 이상의) 재조합 핵산 또는 발현 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 재조합 숙주 세포를 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 유지시키는 단계를 포함하는, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드의 제조 방법을 또한 포함한다. 이러한 방법은 원한다면 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리 또는 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 (즉, 하나 이상의 핵산 분자), 또는 이같은 핵산 분자(들)를 포함하는 발현 구축물 (즉, 하나 이상의 구축물)을, 핵산 분자(들)가 하나 이상의 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결되도록 (예를 들어, 벡터 내에 있거나, 세포 내에서의 프로세스에 의해 생성된 구축물 내에 있거나, 숙주 세포 게놈 내로 통합됨), 선택된 숙주 세포에 적합한 임의의 방법 (예를 들어, 형질전환, 형질감염, 전기천공, 감염)을 사용하여 적절한 숙주 세포 내로 도입하여 재조합 숙주 세포를 생성시킬 수 있다. 생성된 재조합 숙주 세포가 발현에 적절한 조건 하에 (예를 들어, 유도인자의 존재 하에, 적절한 동물 내에, 적합한 염, 성장 인자, 항생제, 영양 보충물 등이 보충된 적절한 배양 배지 내에) 유지될 수 있고, 이에 의해 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드가 생산된다. 원한다면, 코딩된 펩티드 또는 폴리펩티드를 단리 또는 회수할 수 있다 (예를 들어, 동물, 숙주 세포, 배지, 밀크로부터). 이러한 공정은 트랜스제닉(transgenic) 동물의 숙주 세포에서의 발현을 포함한다 (예를 들어, WO 92/03918, 젠팜 인터내셔날(GenPharm International) 참조).
본원에 기술된 방법에 의해 선택된 프로테아제 저항성 펩티드 또는 폴리펩티드는 적절한 시험관내 발현 시스템에서, 화학적 합성에 의해 또는 임의의 기타 적절한 방법에 의해 또한 생산될 수 있다.
폴리펩티드, dAb , 효능제 & 길항제
본원에 기술되고 예시된 바와 같이, 본 발명의 프로테아제 저항성 폴리펩티드, 펩티드 또는 dAb는 일반적으로 자신의 표적 리간드에 높은 친화력으로 결합한다. 따라서, 또 다른 측면에서, 표적 항원에 높은 친화력으로 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb를 선택, 단리 및/또는 회수하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 이러한 방법은 펩티드들 또는 폴리펩티드들 (예를 들어 dAb들)의 라이브러리 또는 레퍼토리를 제공하는 단계, 라이브러리 또는 레퍼토리를 프로테아제 (예를 들어, 트립신, 엘라스타제, 류코자임, 판크레아틴, 가래)와 프로테아제 활성에 적절한 조건 하에 조합하는 단계, 및 리간드 (예를 들어, 표적 리간드)에 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 선택, 단리 및/또는 회수하는 단계를 포함한다. 라이브러리 또는 레퍼토리가 프로테아제 민감성 펩티드 또는 폴리펩티드가 소화될 조건 하에 프로테아제에 노출되었기 때문에, 프로테아제의 활성이 결합 친화력이 낮은 덜 안정적인 폴리펩티드를 제거할 수 있고, 이에 의해 고-친화력 결합 펩티드들 또는 폴리펩티드들의 선집이 생산된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb는 표적 항원에 1 μM이거나 이보다 강한, 또는 약 500 nM 내지 약 0.5 pM의 친화력 (KD; KD = 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정되는 K오프(kd)/K(ka))으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb는 표적 항원 (예를 들어 TNFR1)에 약 500 nM, 약 100 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 10 pM, 약 1 pM 또는 약 0.5 pM의 친화력으로 결합할 수 있다. 어떠한 특정 이론에 의해서도 한정되지 않지만, 프로테아제에 대해 저항성인 펩티드 및 폴리펩티드는 엔트로피가 더 낮고/낮거나 안정화 에너지가 더 높은 것으로 여겨진다. 따라서, 프로테아제 저항성과 고-친화력 결합 간의 상관관계가 본원에 기술된 방법에 의해 선택된 펩티드 및 폴리펩티드 및 dAb의 표면의 안정성 및 조밀성과 관련될 수 있다.
이러한 폴리펩티드, dAb, 효능제 또는 길항제는 대장균에서 또는 피치아(Pichia) 종 (예를 들어, 피치아 파스토리스)에서 발현될 수 있다. 한 실시양태에서, 대장균에서 또는 피치아 종 (예를 들어, 피치아 파스토리스)에서 발현되는 경우 리간드 또는 dAb 단량체가 약 0.5 ㎎/ℓ 이상의 양으로 분비된다. 본원에 기술된 리간드 및 dAb 단량체가 대장균에서 또는 피치아 종 (예를 들어, 피치아 파스토리스)에서 발현되는 경우 분비될 수 있지만, 임의의 적절한 방법, 예컨대 합성 화학 방법 또는 대장균 또는 피치아 종을 사용하지 않는 생물학적 생산 방법을 사용하여 이를 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드, dAb, 효능제 또는 길항제는 낙타류 면역글로불린 가변 도메인, 또는 낙타류 생식계열 항체 유전자 절편에 의해 코딩되는 면역글로불린 가변 도메인에 독특한 하나 이상의 프레임워크 아미노산, 예를 들어 위치 108, 37, 44, 45 및/또는 47의 아미노산을 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 효능제 또는 길항제는 1가 또는 다가일 수 있다. 일부 실시양태에서, 효능제 또는 길항제는 1가이고, 표적 항원과 상호작용하는 1개의 결합 위를 함유하며, 이러한 결합 부위는 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공된다. 1가 효능제 또는 길항제는 1개의 표적 항원에 결합하고, 수용체의 활성화 및 신호 전달에 이를 수 있는 세포 표면 상의 표적 항원 (예를 들어, 수용체 항원)의 가교 또는 클러스터링(clustering)을 유도하지 않을 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 효능제 또는 길항제는 다가이다. 다가 효능제 또는 길항제는 표적 항원에 대한 특정 결합 부위의 2개 이상의 카피를 함유할 수 있거나, 또는 표적 항원에 결합하는 2개 이상의 상이한 결합 부위를 함유할 수 있고, 이때 결합 부위 중 하나 이상이 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공된다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 효능제 또는 길항제는 표적 항원에 결합하는 본 발명의 특정 폴리펩티드 또는 dAb의 2개 이상의 카피, 또는 표적 항원에 결합하는 2개 이상의 상이한 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb를 포함하는 이량체, 삼량체 또는 다량체일 수 있다. 한 실시양태에서, 다가 길항제는 세포 표면 수용체 항원에 결합하고, 표준 세포 분석법에서 실질적으로 항원을 작동시키지 않는다 (항원의 효능제로서 작용하지 않는다).
특정 실시양태에서, 다가 효능제 또는 길항제는 표적 항원의 원하는 에피토프 또는 도메인에 대한 2개 이상의 결합 부위를 함유한다.
다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 인슐린자극성 작용제, 예컨대 GLP-1에서 유래된 펩티드일 수 있다. 인슐린자극성 작용제의 효능, 프로테아제, 예컨대 DPP-IV에 대한 저항성, 투여 후 반감기 및 생체내 효과를 결정하기 위한 적절한 방법들이 예를 들어 WO 2006/059106에 기술되어 있다.
다른 실시양태에서, 다가 효능제 또는 길항제는 표적 항원의 상이한 에피토프 또는 도메인에 결합하는 본 발명의 폴리펩티드 또는 dAb에 의해 제공되는 2개 이상의 결합 부위를 함유한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, dAb, 효능제 또는 길항제는 유효량이 투여되는 경우 만성 염증성 질환의 모델에서 효율적이다. 일반적으로, 유효량은 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ (예를 들어, 약 1 ㎎/㎏, 약 2 ㎎/㎏, 약 3 ㎎/㎏, 약 4 ㎎/㎏, 약 5 ㎎/㎏, 약 6 ㎎/㎏, 약 7 ㎎/㎏, 약 8 ㎎/㎏, 약 9 ㎎/㎏, 또는 약 10 ㎎/㎏)이다. 만성 염증성 질환의 모델 (WO2006038027에 기술된 것 참조)은 인간에서의 치료 효능을 예보하는 것으로 당업자에게 인지된다.
일반적으로, 본 발명의 리간드 (예를 들어, 효능제, 길항제)는 정제된 형태로 약리학상 적합한 담체와 함께 사용될 것이다. 전형적으로, 이러한 담체에는 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 염수 및/또는 완충 매질을 포함하는 임의의 것이 포함된다. 비경구 비히클에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨 및 젖산화 링거가 포함된다. 폴리펩티드 복합체를 현탁액으로 유지할 필요가 있는 경우, 적절한 생리학적으로 허용되는 보조제가 증점제, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴 및 알기네이트로부터 선택될 수 있다.
정맥내 비히클에는 유체 및 영양소 보충물 및 전해질 보충물, 예컨대 링거 덱스트로스를 기초로 하는 것이 포함된다. 방부제 및 기타 첨가물, 예컨대 항균제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체가 또한 존재할 수 있다 (문헌 [Mack (1982) Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition]). 연장 방출 제형이 포함되는 다양한 적절한 제형이 사용될 수 있다.
본 발명의 리간드 (예를 들어, 길항제)는 따로따로 투여되는 조성물로서 또는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다. 다른 작용제에는 다양한 면역요법 약물, 예컨대 시클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플래티넘, 및 면역독소가 포함될 수 있다. 제약 조성물은 본 발명의 리간드와 다양한 세포독성 작용제 또는 기타 작용제의 "칵테일", 또는 심지어 특이성이 상이한 본 발명에 따른 리간드들, 예컨대 상이한 표적 항원 또는 에피토프를 사용하여 선택된 리간드들의 조합물을 포함할 수 있다 (투여 전에 풀링(pooling)되는지 여부와 관계 없음).
본 발명에 따른 제약 조성물의 투여 경로는 당업자에게 통상적으로 공지된 경로들 중 임의의 경로일 수 있다. 면역요법이 비제한적으로 포함되는 요법에 대해, 본 발명의 선택된 리간드를 표준 기술에 따라 임의의 환자에게 투여할 수 있다.
투여는 비경구, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 폐 경로를 포함하고, 적합하게는 카테터로의 직접 주입을 또한 포함하는 임의의 적합한 방식에 의해 이루어질 수 있다. 투여량 및 투여 빈도는 환자의 연령, 성별 및 상태, 다른 약물의 공동 투여, 금기 및 의사가 고려할 기타 파라메터에 좌우될 것이다. 투여는 지시되는 바와 같이 국소 투여 (예를 들어, 폐 투여, 예를 들어 비강내 투여에 의한 폐로의 국소적인 전달), 또는 전신 투여일 수 있다.
본 발명의 리간드는 보관용으로 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적절한 담체에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린에 효과적인 것으로 나타났고, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기술을 사용할 수 있다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 손실에 이를 수 있다는 것 (예를 들어, 통상적인 면역글로불린의 경우, IgM 항체가 IgG 항체보다 활성 손실이 더 큰 경향이 있다)과 사용 수준이 보상을 위해 상향 조정되어야 할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명의 리간드 (예를 들어, 효능제, 길항제) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물을 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여할 수 있다. 특정 치료 용도에서, 선택된 세포 집단의 적어도 부분적인 억제, 억압, 조정, 사멸 또는 일부 기타 측정가능한 파라메터를 달성하기 위한 적당한 양이 "치료적 유효 용량"으로 정의된다. 이러한 투여량을 달성하는데 필요한 양은 질환의 중증도 및 환자 자신의 면역계의 일반적인 상태에 좌우될 것이지만, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.005 내지 5.0 ㎎의 리간드, 예를 들어 dAb, 효능제 또는 길항제의 범위이고, 0.05 내지 2.0 ㎎/㎏/용량의 용량이 더욱 통상적으로 사용된다. 예방 용도를 위해, 본 발명의 리간드 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물이 질환의 개시를 방지하거나, 억제하거나 또는 지연시키기 위해 (예를 들어, 완화 또는 정지를 지속시키기 위해 또는 급성기를 방지하기 위해) 유사하거나 약간 더 낮은 투여량으로 또한 투여될 수 있다. 숙련된 임상의는 질환을 치료, 억제 또는 방지하기 위한 적합한 투약 간격을 결정할 수 있을 것이다. 하나 이상의 증상이 처치 전에 존재하는 이같은 증상과 비교하여 또는 이같은 조성물 또는 다른 적절한 대조군으로 처치되지 않은 개체 (인간 또는 모델 동물)에서의 이같은 증상과 비교하여 감소된 경우에 (예를 들어, 적어도 10%만큼 또는 임상 평가 척도 상에서의 적어도 1점만큼), 본원에 기술된 조성물을 사용하여 수행되는 처치 또는 요법이 "효과적"인 것으로 간주된다. 증상은 표적화된 질환 또는 장애에 따라 명백하게 다양할 것이지만, 일반적인 숙련된 임상의 또는 전문가에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 질환 또는 장애의 하나 이상의 생화학적 지표물의 수준 (예를 들어, 질환과 상호관련되는 효소 또는 대사물의 수준, 영향을 받은 세포의 개수 등)을 모니터링함으로써, 물리적 소견 (예를 들어, 염증, 종양 크기 등)을 모니터링함으로서, 또는 승인된 임상 평가 척도, 예를 들어, 종합 장애 상태 척도(Expanded Disability Status Scale) (다발성 경화증용), 어바인 염증성 장 질환 질문서(Irvine Inflammatory Bowel Disease Questionnaire) (32점 감정으로 장 기능, 전신 증상, 사회적 기능 및 감정 상태와 관련된 삶의 질을 평가한다 - 점수는 32점 내지 224점 범위이고, 점수가 높을수록 더 양호한 삶의 질을 가리킨다), 삶의 질 류머티스 관절염 척도, 또는 당업계에 공지된 기타 승인된 임상 평가 척도에 의해, 이같은 증상을 측정할 수 있다. 적어도 10%만큼 또는 주어진 임상 척도 상에서의 적어도 1점만큼의 질환 또는 장애 증상에서의 지속적인 감소 (예를 들어, 1일 이상 또는 이보다 긴 감소)가 "효과적인" 처치를 가리킨다. 유사하게, 하나 이상의 증상의 개시 또는 중증도가 조성물로 처치되지 않은 유사한 개체 (인간 또는 동물 모델)에서의 이같은 증상과 비교하여 지연되거나, 감소되거나 또는 폐지되는 경우 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 사용하여 수행된 예방이 "효과적"이다.
본 발명에 따른 리간드 (예를 들어, 효능제, 길항제) 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물이 포유동물 내의 선택된 표적 세포 집단의 변경, 불활성화, 사멸 또는 제거를 보조하기 위해 예방적 및 치료적 환경에서 활용될 수 있다. 또한, 선택된 본원에 기술된 폴리펩티드들의 레퍼토리가 이종성 세포 선집으로부터 표적 세포 집단을 선택적으로 사멸시키거나, 고갈시키거나 또는 다른 방식으로 효과적으로 제거하기 위해 체외에서 또는 시험관 내에서 사용될 수 있다. 포유동물로부터의 혈액을 체외에서 리간드와 조합함으로써, 표준 기술에 따라 포유동물에게 돌려보내기 위한 혈액으로부터 원하는 세포를 사멸시키거나 또는 다른 방식으로 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 리간드 (예를 들어, 효능제 또는 길항제)를 함유하는 조성물이 포유동물 내의 선택된 표적 세포 집단의 변경, 불활성화, 사멸 또는 제거를 보조하기 위해 예방적 및 치료적 환경에서 활용될 수 있다.
리간드 (예를 들어, 항-표적 항원 길항제, 효능제, dAb 단량체)는 하나 이상의 추가적인 치료제 또는 활성 작용제와 함께 투여 및/또는 제형될 수 있다. 리간드 (예를 들어, dAb)가 추가적인 치료제와 함께 투여되는 경우, 리간드는 추가적인 작용제의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 리간드 및 추가적인 작용제는 치료 효과의 중복을 제공하는 방식으로 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 GLP-1 약물 또는 GLP-1 유사체 또는 유도체를 함유하는 제약 조성물은 이같은 치료를 필요로 하는 환자에게 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여는 주사기, 임의적으로는 펜형(pen-like) 주사기에 의한 피하 주사, 근육내 주사 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 별법적으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 추가적인 옵션은 비강 또는 폐 스프레이 형태의 GLP-1 약물 또는 GLP-1 유사체 또는 유도체의 투여를 위한 분말 또는 액체일 수 있는 조성물이다. 추가적인 옵션으로서, 본 발명의 GLP-1 약물 또는 GLP-1 유사체 또는 유도체는 경피 투여로, 예를 들어, 패치, 임의적으로는 이온이동성(iontophoretic) 패치로부터, 또는 경점막 투여로, 예를 들어 볼에 또한 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 경구 투여로, 예를 들어, 알약, 캡슐, 음료 (예를 들어, 비만 치료용으로 체중 감소 음료로서 판매되는 음료)로서 투여될 수 있다.
GLP-1 화합물의 비경구 투여를 위한 조성물을, 예를 들어, WO 03/002136 (US2003119734) (참고로 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 고혈당증, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 β-세포 결핍의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 화합물의 용도에 관한 것이다. 이러한 적응증들에 대한 특정 실시양태에서, 약물은 인슐린자극성 작용제, 및 인크레틴, 글루카곤-유사 1 펩티드, GLP-1 펩티드, GLP-1 유사체, GLP-1 유도체, PYY, PYY 펩티드, PYY 유사체, PYY 유도체, 엑센딘(Exendin)-3, 엑센딘-3 펩티드, 엑센딘-3 유사체, 엑센딘-3 유도체, 엑센딘-4, 엑센딘-4 펩티드, 엑센딘-4 유사체, 엑센딘-4 유도체 또는 이러한 작용제들 중 2개 이상의 조합물 (예를 들어, GLP-1 펩티드 및 PYY 펩티드)로부터 선택된다.
본 발명에 따른 화합물로의 치료는 약물 접합체 또는 융합물의 일부분일 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 제2의 또는 그 이상의 약리학상 활성인 물질과 또한 조합될 수 있다. 예를 들어, 활성 물질은 항당뇨병제, 항비만제, 식욕 조절제, 항고혈압제, 당뇨병으로부터 초래되거나 당뇨병과 관련된 합병증의 치료 및/또는 예방을 위한 작용제, 및 비만으로부터 초래되거나 비만과 관련된 합병증 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 작용제로부터 선택된다. 본 발명의 문맥에서, "항당뇨병제"라는 표현은 인슐린 저항성 및 인슐린 저항성이 병리생리학적 메커니즘인 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 화합물을 포함한다.
포맷
증가된 반감기는 면역글로불린, 특히 항체, 가장 특히 작은 크기의 항체 단편의 생체내 용도에 유용하다. 이같은 단편 (Fv, 디술피드-결합 Fv, Fab, scFv, dAb)은 신체로부터 급속하게 소거되는 문제가 있다; 따라서, 신체의 대부분의 부분에 신속하게 도달할 수 있고, 빠르게 제조되며, 취급하기가 더 용이한 반면, 이의 생체내 용도가 짧은 생체내 지속성에 의해서 제한되었다. 본 발명의 한 실시양태는 생체 내에서의 리간드의 증가된 반감기를 제공하고, 결과적으로 리간드의 기능적 활성의 신체 내에서의 더 긴 지속 시간을 제공함으로써 이러한 문제점을 해결한다.
리간드 반감기의 약동학적 분석 및 결정을 위한 방법이 당업자에게 친숙할 것이다. 상세사항을 문헌 [Kenneth, A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists] 및 [Peters et al., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)]에서 확인할 수 있다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 곡선하 면적 (AUC)과 같은 약동학 파라메터가 기술된 문헌 ["Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker, 2nd Rev. ex edition (1982)]을 또한 참조한다.
시간에 대한 리간드의 혈청 농도의 곡선으로부터 반감기 (t½ 알파 및 t½ 베타) 및 AUC를 결정할 수 있다. 예를 들어, 곡선을 모델링하기 위해 윈놀린(WinNonlin) 분석 패키지 (파사이트 코포레이션(Pharsight Corp.), 미국 94040 캘리포니아주 마운틴뷰)를 사용할 수 있다. 제1 단계 (알파 단계)에서, 리간드는 주로 환자 내에 분포되고, 일부가 제거된다. 제2 단계 (베타 단계)는 리간드의 분포가 완료되었고, 리간드가 환자로부터 소거됨에 따라 혈청 농도가 감소되는 말기 단계이다. t 알파 반감기는 제1 단계의 반감기이고, t 베타 반감기는 제2 단계의 반감기이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 tα 반감기가 15분 이상인 본 발명에 따른 리간드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 범위의 상한은 30분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간 또는 12시간이다. 추가적으로 또는 별법적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 tα 반감기가 12시간 이하의 범위일 것이다. 한 실시양태에서, 이러한 범위의 하한은 11시간, 10시간, 9시간, 8시간, 7시간, 6시간 또는 5시간이다. 적절한 범위의 예는 1시간 내지 6시간, 2시간 내지 5시간 또는 3시간 내지 4시간이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 tβ 반감기가 2.5시간 이상 범위인 본 발명에 따른 리간드 (폴리펩티드, dAb, 효능제 또는 길항제) 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 범위의 상한은 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간 , 11시간 또는 12시간이다. 추가적으로 또는 별법적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 tβ 반감기가 21일 이하의 범위이다. 한 실시양태에서, 이러한 범위의 하한은 12시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일 또는 20일이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 tβ 반감기가 12시간 내지 60시간 범위일 것이다. 추가적인 실시양태에서, 이는 12시간 내지 48시간 범위일 것이다. 추가적인 실시양태에서, 이는 12시간 내지 26시간의 범위일 것이다.
상기 기준에 대해 추가적으로 또는 별법적으로, 본 발명은 AUC 값 (곡선하 면적)이 1 ㎎.분/㎖ 이상인 본 발명에 따른 리간드 또는 리간드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 범위의 상한은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 ㎎.분/㎖이다. 추가적으로 또는 별법적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 AUC가 600 ㎎.분/㎖ 이하의 범위이다. 한 실시양태에서, 이러한 범위의 하한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 ㎎.분/㎖이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 리간드는 AUC가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 범위 내일 것이다: 15 내지 150 ㎎.분/㎖, 15 내지 100 ㎎.분/㎖, 15 내지 75 ㎎.분/㎖, 및 15 내지 50㎎.분/㎖.
본 발명의 폴리펩티드 및 dAb 및 이들을 포함하는 효능제 또는 길항제는, 예를 들어, PEG 기, 혈청 알부민, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 적어도 트랜스페린이 결합하는 이의 일부분의 부착에 의해, 또는 항체 도메인에 대한 접합에 의해, 유체역학적 크기가 더 크도록 포맷화될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드, dAb, 효능제 및 길항제가 항체의 더 큰 항원-결합 단편으로서 또는 항체로서 포맷이 정해진다 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, IgG, scFv로서 포맷화된다).
본 발명의 리간드 (예를 들어, dAb 단량체 및 다량체)의 유체역학적 크기를 당업계에 주지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 젤 여과 크로마토그래피를 사용하여 리간드의 유체역학적 크기를 결정할 수 있다. 리간드의 유체역학적 크기를 결정하기 위한 적절한 젤 여과 매트릭스, 예컨대 가교 아가로스 매트릭스가 주지되어 있고, 용이하게 입수가능하다.
리간드 포맷의 크기 (예를 들어, dAb 단량체에 부착된 PEG 모이어티(moiety)의 크기)는 원하는 용도에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 리간드가 순환을 떠나 말초 조직 내로 진입하도록 의도되는 경우, 혈류로부터의 유출(extravazation)을 용이하게 하기 위해 리간드의 유체역학적 크기를 낮게 유지시키는 것이 바람직하다. 별법적으로, 리간드가 더 오랜 기간 동안 체순환 내에 남아 있는 것을 원하는 경우, 예를 들어 Ig-유사 단백질로서 포맷화함으로써, 리간드의 크기를 증가시킬 수 있다.
생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프의 표적화에 의한 반감기 연장
본원에 기술된 바와 같이, 생체내 반감기를 증가시키는 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)에 본 발명의 표적 항원 결합 폴리펩티드, dAb, 효능제 또는 길항제를 접합 또는 회합시킴으로써 리간드의 유체역학 크기 및 이의 혈청 반감기가 또한 증가될 수 있다. 예를 들어, 표적 항원 결합제 (예를 들어, 폴리펩티드)가 항-혈청 알부민 또는 항-신생아 Fc 수용체 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 항-SA 또는 항-신생아 Fc 수용체 dAb, Fab, Fab' 또는 scFv, 또는 항-SA 어피바디(affibody) 또는 항-신생아 Fc 수용체 어피바디 또는 항-SA 아비머(avimer), 또는 CTLA-4, 리포칼린, SpA, 어피바디, 아비머, GroE1 및 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택되지만 바람직하게는 이에 한정되지 않는 스캐폴드를 포함하는 항-SA 결합 도메인에 접합 또는 연결될 수 있다 (이러한 결합 도메인의 개시내용에 대해 2008년 2월 8일 출원된 PCT/GB2008/000453 (WO2008096158; US2009259026)을 참조하고, 이러한 도메인 및 이의 서열은 참고로 본원에 포함되며, 본 명세서의 개시내용의 일부분을 형성한다). 접합은 혈청 알부민에 결합하는 결합 도메인에 (공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해) 결합된 본 발명의 폴리펩티드, dAb, 효능제 또는 길항제를 포함하는 조성물을 지칭한다.
생체내 혈청 반감기를 강화하는 적절한 폴리펩티드에는, 예를 들어, 트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경제약 작용제 융합 단백질 (미국 특허 번호 5,977,307을 참조하고, 이의 교시내용은 본원에 참고로 포함된다), 뇌 모세혈관 내피 세포 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 (예를 들어, 가용성 트랜스페린 수용체), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2 (IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체, 혈액 응고 인자 X, □1-항트립신 및 HNF 1α가 포함된다. 혈청 반감기를 강화하는 적절한 폴리펩티드에는 알파-1 당단백질 (오로소뮤코이드; AAG), 알파-1 항키모트립신 (ACT), 알파-1 마이크로글로불린 (단백질 HC; AIM), 항트롬빈 III (AT III), 아포지질단백질 A-1 (Apo A-1), 아포지질단백질 B (Apo B), 세룰로플라스민 (Cp), 보체 성분 C3 (C3), 보체 성분 C4 (C4), C1 에스테라제(esterase) 억제제 (C1 INH), C-반응성 단백질 (CRP), 페리틴 (FER), 헤모펙신 (HPX), 지질단백질(a) (Lp(a)), 만노스-결합 단백질 (MBP), 미오글로빈 (Myo), 프리알부민 (트랜스타이레틴; PAL), 레티놀-결합 단백질 (RBP), 및 류머티스 인자 (RF)가 또한 포함된다.
세포외 매트릭스로부터의 적절한 단백질에는, 예를 들어, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴이 포함된다. 콜라겐은 세포외 매트릭스의 주요 단백질이다. 신체의 여러 부분에서 발견되는 약 15가지 유형의 콜라겐분자, 예를 들어 뼈, 피부, 힘줄, 인대, 각막, 내부 기관에서 발견되는 제I형 콜라겐 (신체 콜라겐의 90%를 차지함) 또는 연골, 추간판, 척삭 및 눈의 유리체액에서 발견되는 제II형 콜라겐이 현재 공지되어 있다.
혈액으로부터의 적절한 단백질에는, 예를 들어, 혈장 단백질 (예를 들어, 피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 (예를 들어, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B), 혈청 아밀로이드 단백질 A, 합토글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 유테로글로불린 및 β-2-마이크로글로불린), 효소 및 효소 억제제 (예를 들어, 플라스미노겐, 라이소자임, 시스타틴 C, 알파-1-항트립신 및 췌장 트립신 억제제), 면역계의 단백질, 예컨대 면역글로불린 단백질 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, 면역글로불린 경쇄 (카파/람다)), 운반 단백질 (예를 들어, 레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린), 디펜신 (예를 들어, 베타-디펜신 1, 호중구 디펜신 1, 호중구 디펜신 2 및 호중구 디펜신 3) 등이 포함된다.
혈액 뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 적절한 단백질에는, 예를 들어, 멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 운반체 등이 포함된다.
생체내 혈청 반감기를 강화하는 적절한 폴리펩티드에는 신장에 국소화된 단백질 (예를 들어, 폴리시스틴, 제IV형 콜라겐, 유기 음이온 운반체 K1, 하이만(Heymann) 항원), 간에 국소화된 단백질 (예를 들어, 알콜 탈수소효소, G250), 폐에 국소화된 단백질 (예를 들어, IgA에 결합하는 분비 성분), 심장에 국소화된 단백질 (예를 들어, 확장형 심근병증과 관련된 HSP 27), 피부에 국소화된 단백질 (예를 들어, 케라틴), 뼈에 특이적인 단백질 예컨대 골혈성 활성을 나타내는 단백질들의 전환 성장 인자 β 수퍼패밀리의 부분집합인 형태발생 단백질 (BMP) (예를 들어, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8), 종양 특이적 단백질 (예를 들어, 영양막 항원, 헤르셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신 (예를 들어, 간 및 지라에서 발견될 수 있는 카텝신 B))이 또한 포함된다.
적절한 질환-특이적 단백질에는, 예를 들어, 활성화된 T-세포 상에서만 발현되는 항원이 포함되고, 여기에는 LAG-3 (림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린 리간드 (OPGL; 문헌 [Nature 402, 304-309 (1999)] 참조), OX40 (활성화된 T 세포 상에서 발현되고 인간 T 세포 백혈병 바이러스 유형-I (HTLV-I)-생산 세포에서 특히 상향 조절되는, TNF 수용체 패밀리의 구성원; 문헌 [Immunol. 165 (1):263-70 (2000)] 참조)이 포함된다. 적절한 질환-특이적 단백질에는, 예를 들어, CG6512 드로소필라, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 뮤린(murine) ftsH가 포함되는 메탈로프로테아제 (관절염/암과 관련됨); 및 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-1), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (FGF-2), 혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자 (VEGF/VPF), 전환 성장 인자-α (TGF α), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-□), 안지오제닌, 인터루킨-3 (IL-3), 인터루킨-8 (IL-8), 혈소판-유래 내피 성장 인자 (PD-ECGF), 태반 성장 인자 (PlGF), 미드카인 혈소판-유래 성장 인자-BB (PDGF), 및 프랙탈카인이 포함되는 혈관형성 성장 인자가 또한 포함된다.
생체내 혈청 반감기를 강화하는 적절한 폴리펩티드에는 스트레스 단백질 예컨대 열 충격 단백질 (HSP)이 또한 포함된다. HSP는 일반적으로 세포 내에서 발견된다. HSP가 세포외에서 발견되는 경우, 이는 세포가 사망하였고 내용물이 유출되었음을 가리킨다. 외상, 질환 또는 손상의 결과로서 세포외 HSP가 면역계로부터의 응답을 촉발할 때 이러한 프로그래밍되지 않은 세포 사망 (괴사)이 일어난다. 세포외 HSP에 결합하는 것은 본 발명의 조성물이 질환 부위에 국소화되는 것을 초래할 수 있다.
Fc 운반에 수반되는 적절한 단백질에는, 예를 들어, 브람벨(Brambell) 수용체 (FcRB로 또한 공지됨)가 포함된다. 이러한 Fc 수용체는 2가지 기능이 있고, 양쪽 모두 전달에 잠재적으로 유용하다. 이러한 기능은 (1) 태반을 가로질러 모체에서 아동으로 IgG를 운반하는 것, (2) 분해로부터 IgG를 보호함으로써 이의 혈청 반감기를 연장시키는 것이다. 수용체가 엔도솜으로부터 IgG를 재순환시키는 것으로 생각된다. (문헌 [Holliger et al., Nat Biotechnol 15(7):632-6 (1997)] 참조.)
혈청 알부민에 결합하는 dAb ( AlbudAb ™)
한 실시양태에서, 본 발명은 표적 항원에 결합하는 항-표적 항원 dAb (제1 dAb) 및 혈청 알부민 (SA)에 결합하는 제2 dAb를 포함하는 폴리펩티드, 효능제 또는 길항제 (예를 들어, 이중 특이적 리간드)를 제공하고, 이때 제2 dAb는 1 nM 내지 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 또는 500 μM (즉, ×10-9 내지 5×10-4), 또는 100 nM 내지 10 μM, 또는 1 내지 5 μM 또는 3 내지 70 nM 또는 10 nM 내지 1, 2, 3, 4 또는 5 μM의 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 KD로 SA에 결합한다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 30 내지 70 nM. 한 실시양태에서, 제1 dAb (또는 dAb 단량체)가 SA (예를 들어, HSA)에 약 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM 또는 1, 2 또는 3 μM의 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 KD로 결합한다. 한 실시양태에서, 제1 항-SA dAb 및 표적 항원에 대한 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드에 대해, 자신의 표적에 대한 제2 dAb의 친화력 (예를 들어, 비아코어(BiaCore)를 예를 들어 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 KD 및/또는 K오프)는 SA에 대한 제1 dAb의 친화력의 1배 내지 100000배 (예를 들어, 100배 내지 100000배, 또는 1000배 내지 100000배, 또는 10000배 내지 100000배)이다. 한 실시양태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 예를 들어, 제1 dAb는 SA에 약 10 μM의 친화력으로 결합하는 한편, 제2 dAb는 자신의 표적에 100 pM의 친화력으로 결합한다. 한 실시양태에서, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민 (HSA)이다. 한 실시양태에서, 제1 dAb는 SA (예를 들어, HSA)에 약 50, 예를 들어 70, 100, 150 또는 200 nM의 KD로 결합한다. 이중 특이적 리간드의 상세사항이 WO03002609, WO04003019 및 WO04058821에서 확인된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 리간드는 혈청 알부민 (SA)에 1 nM 내지 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 200, 300, 400 또는 500 μM (즉, ×10-9 내지 5×10-4), 또는 100 nM 내지 10 μM, 또는 1 내지 5 μM 또는 3 내지 70 nM 또는 10 nM 내지 1, 2, 3, 4 또는 5 μM의 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 KD로 결합하는 dAb를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 30 내지 70 nM. 한 실시양태에서, 제1 dAb (또는 dAb 단량체)는 SA (예를 들어, HSA)에 약 1, 50, 70, 100, 150, 200, 300 nM 또는 1, 2 또는 3 μM의 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 KD로 결합한다. 한 실시양태에서, 제1 dAb 및 제2 dAb는 링커, 예를 들어 아미노산 1개 내지 4개 또는 아미노산 1개 내지 3개 또는 3개를 초과하는 아미노산 또는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개 또는 20개를 초과하는 아미노산의 링커에 의해 연결된다. 한 실시양태에서, 더 긴 링커 (아미노산 3개 초과)가 효능 (효능제 또는 길항제 내의 dAb 중 하나 또는 양쪽 모두의 KD)을 강화하기 위해 사용된다. 한 실시양태에서, 링커는 나선형 링커이다.
리간드, 효능제 및 길항제의 특정 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, 알부민에의 결합에 대해 하기로 구성된 군으로부터 선택된 dAb와 경쟁한다:
MSA-16, MSA-26 (이러한 서열들의 개시내용에 대해 WO04003019 (US2006106203)를 참조하고, 이러한 서열 및 이의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고, 본 명세서의 개시내용의 일부분을 형성한다),
DOM7m-16 (서열 473), DOM7m-12 (서열 474), DOM7m-26 (서열 475), DOM7r-1 (서열 476), DOM7r-3 (서열 477), DOM7r-4 (서열 478), DOM7r-5 (서열 479), DOM7r-7 (서열 480), DOM7r-8 (서열 481), DOM7h-2 (서열 482), DOM7h-3 (서열 483), DOM7h-4 (서열 484), DOM7h-6 (서열 485), DOM7h-1 (서열 486), DOM7h-7 (서열 487), DOM7h-22 (서열 489), DOM7h-23 (서열 490), DOM7h-24 (서열 491), DOM7h-25 (서열 492), DOM7h-26 (서열 493), DOM7h-21 (서열 494), DOM7h-27 (서열 495), DOM7h-8 (서열 496), DOM7r-13 (서열 497), DOM7r-14 (서열 498), DOM7r-15 (서열 499), DOM7r-16 (서열 500), DOM7r-17 (서열 501), DOM7r-18 (서열 502), DOM7r-19 (서열 503), DOM7r-20 (서열 504), DOM7r-21 (서열 505), DOM7r-22 (서열 506), DOM7r-23 (서열 507), DOM7r-24 (서열 508), DOM7r-25 (서열 509), DOM7r-26 (서열 510), DOM7r-27 (서열 511), DOM7r-28 (서열 512), DOM7r-29 (서열 513), DOM7r-30 (서열 514), DOM7r-31 (서열 515), DOM7r-32 (서열 516), DOM7r-33 (서열 517) (이러한 서열들의 개시내용에 대해 WO2007080392 (US20070003549)를 참조하고, 이러한 서열 및 이의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고, 본 명세서의 개시내용의 일부분을 형성한다; 본 단락에서의 서열 번호는 WO2007080392에 나타난 것이다),
dAb8 (dAb10), dAb 10, dAb36, dAb7r20 (DOM7r20), dAb7r21 (DOM7r21), dAb7r22 (DOM7r22), dAb7r23 (DOM7r23), dAb7r24 (DOM7r24), dAb7r25 (DOM7r25), dAb7r26 (DOM7r26), dAb7r27 (DOM7r27), dAb7r28 (DOM7r28), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r29 (DOM7r29), dAb7r31 (DOM7r31), dAb7r32 (DOM7r32), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7r33 (DOM7r33), dAb7h22 (DOM7h22), dAb7h23 (DOM7h23), dAb7h24 (DOM7h24), dAb7h25 (DOM7h25), dAb7h26 (DOM7h26), dAb7h27 (DOM7h27), dAb7h30 (DOM7h30), dAb7h31 (DOM7h31), dAb2 (dAb 4,7,41), dAb4, dAb7, dAb11, dAb12 (dAb7m12), dAb13 (dAb 15), dAb15, dAb16 (dAb21, dAb7m16), dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25 (dAb26, dAb7m26), dAb27, dAb30 (dAb35), dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38 (dAb54), dAb41, dAb46 (dAb 47, 52 및 56), dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1 (DOM 7r1), dAb7r3 (DOM7r3), dAb7r4 (DOM7r4), dAb7r5 (DOM7r5), dAb7r7 (DOM7r7), dAb7r8 (DOM7r8), dAb7r13 (DOM7r13), dAb7r14 (DOM7r14), dAb7r15 (DOM7r15), dAb7r16 (DOM7r16), dAb7r17 (DOM7r17), dAb7r18 (DOM7r18), dAb7r19 (DOM7r19), dAb7h1 (DOM7h1), dAb7h2 (DOM7h2), dAb7h6 (DOM7h6), dAb7h7 (DOM7h7), dAb7h8 (DOM7h8), dAb7h9 (DOM7h9), dAb7h10 (DOM7h10), dAb7h11 (DOM7h1l), dAb7h12 (DOM7M2), dAb7h13 (DOM7h13), dAb7h14 (DOM7h14), dAb7p1 (DOM7p1), 및 dAb7p2 (DOM7p2) (이러한 서열들의 개시내용에 대해 WO2008096158 (US2009259026)를 참조하고, 이러한 서열 및 이의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고, 본 명세서의 개시내용의 일부분을 형성한다). 별법적인 명칭이 dAb 뒤의 괄호 안에 제시되고, 예를 들어 dAb8은 dAb10이라는 별법적인 명칭이 있으며, 즉 dAb8 (dAb10)이다.
특정 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다:
MSA-16, MSA-26,
DOM7m-16 (서열 473), DOM7m-12 (서열 474), DOM7m-26 (서열 475), DOM7r-1 (서열 476), DOM7r-3 (서열 477), DOM7r-4 (서열 478), DOM7r-5 (서열 479), DOM7r-7 (서열 480), DOM7r-8 (서열 481), DOM7h-2 (서열 482), DOM7h-3 (서열 483), DOM7h-4 (서열 484), DOM7h-6 (서열 485), DOM7h-1 (서열 486), DOM7h-7 (서열 487), DOM7h-22 (서열 489), DOM7h-23 (서열 490), DOM7h-24 (서열 491), DOM7h-25 (서열 492), DOM7h-26 (서열 493), DOM7h-21 (서열 494), DOM7h-27 (서열 495), DOM7h-8 (서열 496), DOM7r-13 (서열 497), DOM7r-14 (서열 498), DOM7r-15 (서열 499), DOM7r-16 (서열 500), DOM7r-17 (서열 501), DOM7r-18 (서열 502), DOM7r-19 (서열 503), DOM7r-20 (서열 504), DOM7r-21 (서열 505), DOM7r-22 (서열 506), DOM7r-23 (서열 507), DOM7r-24 (서열 508), DOM7r-25 (서열 509), DOM7r-26 (서열 510), DOM7r-27 (서열 511), DOM7r-28 (서열 512), DOM7r-29 (서열 513), DOM7r-30 (서열 514), DOM7r-31 (서열 515), DOM7r-32 (서열 516), DOM7r-33 (서열 517) (본 단락에서의 서열 번호는 WO2007080392 (US20070003549)에 나타난 것이다),
dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7r20, dAb7r21, dAb7r22, dAb7r23, dAb7r24, dAb7r25, dAb7r26, dAb7r27, dAb7r28, dAb7r29, dAb7r30, dAb7r31, dAb7r32, dAb7r33, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb1l, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7m12, dAb7m16, dAb7m26, dAb7r1, dAb7r3, dAb7r4, dAb7r5, dAb7r7, dAb7r8, dAb7r13, dAb7r14, dAb7r15, dAb7r16, dAb7r17, dAb7r18, dAb7r19, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13, dAb7h14, dAb7p1, 및 dAb7p2.
예를 들어, 인간 혈청 알부민에 결합하는 dAb는 하기 dAb와의 아미노산 서열 동일성이 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
DOM7h-2 (서열 482), DOM7h-3 (서열 483), DOM7h-4 (서열 484), DOM7h-6 (서열 485), DOM7h-1 (서열 486), DOM7h-7 (서열 487), DOM7h-8 (서열 496), DOM7r-13 (서열 497), DOM7r-14 (서열 498), DOM7h-22 (서열 489), DOM7h-23 (서열 490), DOM7h-24 (서열 491), DOM7h-25 (서열 492), DOM7h-26 (서열 493), DOM7h-21 (서열 494), DOM7h-27 (서열 495) (본 단락에서의 서열 번호는 WO2007080392 (US20070003549)에 나타난 것이다),
dAb8, dAb 10, dAb36, dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb11, dAb12, dAb13, dAb15, dAb16, dAb17, dAb18, dAb19, dAb21, dAb22, dAb23, dAb24, dAb25, dAb26, dAb27, dAb30, dAb31, dAb33, dAb34, dAb35, dAb38, dAb41, dAb46, dAb47, dAb52, dAb53, dAb54, dAb55, dAb56, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14.
특정 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 dAb의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다:
DOM7h-2 (서열 482), DOM7h-6 (서열 485), DOM7h-1 (서열 486), DOM7h-7 (서열 487), DOM7h-8 (서열 496), DOM7h-22 (서열 489), DOM7h-23 (서열 490), DOM7h-24 (서열 491), DOM7h-25 (서열 492), DOM7h-26 (서열 493), DOM7h-21 (서열 494), DOM7h-27 (서열 495) (본 단락에서의 서열 번호는 WO2007080392 (US20070003549)에 나타난 것이다),
dAb7h21, dAb7h22, dAb7h23, Ab7h24, Ab7h25, Ab7h26, dAb7h27, dAb7h30, dAb7h31, dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14.
더욱 특정한 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 Vκ dAb이다:
DOM7h-2 (서열 482), DOM7h-6 (서열 485), DOM7h-1 (서열 486), DOM7h-7 (서열 487), DOM7h-8 (서열 496) (본 단락에서의 서열 번호는 WO2007080392 (US20070003549)에 나타난 것이다),
dAb2, dAb4, dAb7, dAb38, dAb41, dAb54, dAb7h1, dAb7h2, dAb7h6, dAb7h7, dAb7h8, dAb7h9, dAb7h10, dAb7h11, dAb7h12, dAb7h13 및 dAb7h14.
더욱 특정한 실시양태에서, dAb는 인간 혈청 알부민에 결합하고 dAb7h30 및 dAb7h31로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 VH dAb이다.
더욱 특정한 실시양태에서, dAb는 dAb7h11 또는 dAb7h14이다.
다른 실시양태에서, dAb, 리간드, 효능제 또는 길항제는 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 아미노산 서열들 중 임의의 것의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개, 예를 들어 dAb7h11 또는 dAb7h14의 CDR 중 1개, 2개 또는 3개를 포함한다.
혈청 알부민에 결합하는 적절한 낙타류 VHH에는 WO2004/041862 (애블링스 엔.브이.(Ablynx N.V.)) (US2009238829) 및 WO2007080392 (US20070003549)에 개시된 것들 (이러한 VHH 서열 및 이의 핵산 대응물은 본원에 참고로 포함되고, 본 명세서의 개시내용의 일부분을 형성한다), 예컨대 서열 A (서열 518), 서열 B (서열 519), 서열 C (서열 520), 서열 D (서열 521), 서열 E (서열 522), 서열 F (서열 523), 서열 G (서열 524), 서열 H (서열 525), 서열 I (서열 526), 서열 J (서열 527), 서열 K (서열 528), 서열 L (서열 529), 서열 M (서열 530), 서열 N (서열 531), 서열 O (서열 532), 서열 P (서열 533), 서열 Q (서열 534) (이러한 서열 번호는 WO2007080392 또는 WO 2004/041862 (애블링스 엔.브이.)에서 언급된 것에 상응한다)가 포함된다. 특정 실시양태에서, 낙타류 VHH는 인간 혈청 알부민에 결합하고, WO2007080392에 개시된 ALB1 또는 서열 518-534 (이러한 서열 번호는 WO2007080392 또는 WO 2004/041862에서 언급된 것에 상응한다) 중 임의의 것과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상, 또는 약 96% 이상, 또는 약 97% 이상, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리간드, 효능제 또는 길항제는 혈청 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민)에의 결합에 대해 임의의 본원에 개시된 항-혈청 알부민 dAb와 경쟁하는 항-혈청 알부민 dAb를 포함한다.
별법적인 실시양태에서, 효능제, 길항제 또는 리간드는 표적 항원 (예를 들어, 인간 TNFR1)에 대해 특이적인 결합 모이어티를 포함하고, 이때 상기 모이어티는 공동-계류 중인 PCT/GB2008/000453 출원 (2008년 2월 8일 출원)에 기술된 바와 같은 비-면역글로불린 서열을 포함하며, 이러한 결합 모이어티, 이의 제조 및 선택 방법 (예를 들어, 다양한 라이브러리로부터의 선택), 및 이의 서열의 개시 내용은 본 명세서의 개시내용의 일부분으로서 본원에 참고로 포함된다.
반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민)에의 접합
한 실시양태에서, (하나 이상의) 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이들의 단편 및 유사체)가 본 발명의 표적 항원-결합 폴리펩티드, dAb, 효능제 또는 길항제와 접합 또는 회합된다. 표적 항원-결합 포맷에서 사용하기 위한 적절한 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 WO 2005077042 (US2005186664)에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함되고, 본 명세서의 개시내용의 일부를 형성한다. 특히, 하기의 알부민, 알부민 단편 또는 알부민 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다:
ㆍ 서열 1 (WO 2005077042에 개시되고, 이러한 서열은 명확하게 본 개시내용에 참고로 포함된다);
ㆍ WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 1-387을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 알부민 단편 또는 변이체;
ㆍ 하기로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체: (a) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 54 내지 61; (b) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 76 내지 89; (c) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 92 내지 100; (d) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 170 내지 176; (e) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 247 내지 252; (f) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 266 내지 277; (g) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 280 내지 288; (h) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 362 내지 368; (i) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 439 내지 447; (j) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 462 내지 475; (k) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 478 내지 486; 및 (l) WO 2005077042의 서열 1의 아미노산 560 내지 566.
표적 항원-결합 포맷에서 사용하기 위한 적절한 알부민, 단편 및 유사체의 추가적인 예가 WO 03076567 (US2008108560)에 기술되어 있고, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함되고, 본 명세서의 개시내용의 일부를 형성한다. 특히, 하기의 알부민, 단편 또는 변이체가 본 발명에서 사용될 수 있다:
ㆍ WO 03076567, 예를 들어, 도 3에 기술된 인간 혈청 알부민 (이러한 서열 정보는 명확하게 본 개시내용에 참고로 포함된다);
ㆍ 화학식 분자량이 66,500인, 아미노산 585개의 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 사슬로 구성된 인간 혈청 알부민 (HA) (문헌 [Meloun, et al., FEBS Letters 55:136 (1975)]; [Behrens, et al., Fed. Proc. 34:591 (1975)]; [Lawn, et al., Nucleic Acids Research 9:6102-6114 (1981)]; [Minghetti, et al., J. Biol. Chem. 261:6747 (1986)] 참조);
ㆍ 문헌 [Weitkamp, et al., Ann. Hum. Genet. 37:219 (1973)]에 기술된 알부민의 다형성 변이체 또는 유사체 또는 단편;
ㆍ EP 322094에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어, HA(1-373), HA(1-388), HA(1-389), HA(1-369), 및 HA(1-419), 및 1-369 및 1-419 사이의 단편;
ㆍ EP 399666에 기술된 알부민 단편 또는 변이체, 예를 들어, HA(1-177) 및 HA(1-200), 및 HA(1-X) [식중 X는 178 내지 199 사이의 임의의 숫자이다] 사이의 단편.
(하나 이상의) 반감기 연장 모이어티 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린 및 이들의 단편 및 유사체)가 본 발명의 표적 항원-결합 폴리펩티드, dAb, 효능제 및 길항제를 포맷화하는데 사용되는 경우, 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예컨대 표적 항원-결합 모이어티 (예를 들어, 항-TNFR1 dAb)에 대한 직접적인 융합에 의해 이러한 모이어티가 접합될 수 있고, 이러한 직접적인 융합은 예를 들어 융합 단백질을 코딩하는 단일 뉴클레오티드 구축물을 사용함으로써 이루어지며, 이때 융합 단백질은 반감기 연장 모이어티가 표적 항원 결합 모이어티에 대해 N-말단에 또는 C-말단에 위치하는 단일 폴리펩티드 사슬로서 코딩된다. 별법적으로, 모이어티들 사이의 펩티드 링커, 예를 들어, WO 03076567 (US2008108560) 또는 WO 2004003019에 기술된 펩티드 링커 (이러한 링커 개시내용은 본 발명에서 사용하기 위한 예를 제공하기 위해 본 개시내용에 참고로 포함된다)를 사용함으로써 접합이 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, 나선형 링커 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 나선형 링커를 통해 접합이 이루어질 수 있다. 이러한 목적에 유용할 수 있는 기타 링커에 글리신-세린 풍부 링커와 같은 것들이 포함된다는 것이 또한 이해될 것이다. 한 실시양태에서, 링커는 프로테아제 저항성 링커일 수 있다. 전형적으로, 생체내 혈청 반감기를 강화하는 폴리펩티드는 생체 내에서 천연적으로 발생하는, 그리고 원치 않는 물질을 생물 (예를 들어, 인간)에서 제거하는 내인성 메커니즘에 의한 분해 또는 제거에 대해 저항하는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 생체내 혈청 반감기를 강화하는 폴리펩티드는 세포외 매트릭스로부터의 단백질, 혈액에서 발견되는 단백질, 혈액 뇌 장벽 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질, 신장, 간, 폐, 심장, 피부 또는 뼈에 국소화된 단백질, 스트레스 단백질, 질환-특이적 단백질, 또는 Fc 운반에 수반되는 단백질로부터 선택될 수 있다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 기술된 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 효능제, 길항제 또는 리간드에서 항-표적 항원 "dAb"을 사용하는 것 대신, 당업자가 표적 항원에 결합하는 본 발명의 dAb의 CDR (예를 들어, 적절한 단백질 스캐폴드 또는 골격, 예를 들어 어피바디, SpA 스캐폴드, LDL 수용체 클래스 A 도메인 또는 EGF 도메인 상에 그래프트된 CDR) 중 1개 이상 또는 3개 모두를 포함하는 폴리펩티드 또는 도메인을 이용할 수 있는 것으로 고려된다. 총괄적인 본 개시내용은 따라서 dAb 대신 이같은 도메인을 사용하는 효능제 또는 길항제의 개시내용을 제공하는 것으로 해석되어야 한다. 이와 관련하여, WO2008096158 (US2009259026)을 참조하고, 이의 개시내용은 거명에 의해 포함된다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 효능제 또는 길항제는 표적 항원에 대한 결합 특이성이 있는 면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 도메인 항체 (dAb) 또는 이같은 dAb의 상보성 결정 영역을 적절한 포맷으로 포함한다. 효능제 또는 길항제는 이같은 dAb로 구성되거나 또는 이같은 dAb로 본질적으로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다. 효능제 또는 길항제는 적절한 포맷, 예컨대 항체 포맷 (예를 들어, IgG-유사 포맷, scFv, Fab, Fab', F(ab')2)의 dAb (또는 dAb의 CDR)를 포함하는 폴리펩티드, 또는 표적 항원에 결합하는 dAb 및 또 다른 단백질, 항원 또는 에피토프 (예를 들어, 혈청 알부민)에 결합하는 제2 dAb를 포함하는 이중 특이적 리간드일 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, dAb, 효능제 및 길항제는 당업계에 공지된 다양한 적절한 항체 포맷, 예컨대 IgG-유사 포맷, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 단일쇄 항체, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 동종이량체 및 이종 이량체, 상기의 것들 중 임의의 것의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fv 단편 (예를 들어, 단일쇄 Fv (scFv), 디술피드 결합 Fv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편), 단일 가변 도메인 (예를 들어, VH, VL), dAb 및 상기의 것들 중 임의의 것의 변형판 (예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜) 또는 기타 적절한 중합체의 공유결합 부착에 의해 변형됨)으로 포맷화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 IgG-유사 포맷인 리간드 (예를 들어, 항-TNFR1 길항제)를 제공한다. 이같은 포맷은 IgG 분자의 통상적인 4쇄 구조 (2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)일 수 있고, 이때 가변 영역들 중 하나 이상 (VH 및/또는 VL)이 본 발명의 dAb로 교체된다. 한 실시양태에서, 각각의 가변 영역 (2개의 VH 영역 및 2개의 VL 영역)이 dAb 또는 단일 가변 도메인으로 교체되고, 이들 중 하나 이상은 본 발명에 따른 항-표적 항원 dAb이다. IgG-유사 포맷 내에 포함되는 dAb(들) 또는 단일 가변 도메인(들)은 특이성이 동일할 수 있거나 또는 특이성이 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, IgG-유사 포맷은 4가이고, 1가지 (항-표적 항원 단독), 2가지 (예를 들어, 항-표적 항원 및 항-SA), 3가지 또는 4가지의 특이성이 있을 수 있다. 예를 들어, IgG-유사 포맷은 단일 특이적이고, 특이성이 동일한 4개의 dAb를 포함하거나; 이중특이적이고, 특이성이 동일한 3개의 dAb 및 특이성이 상이한 또 다른 dAb를 포함하거나; 이중특이적이고, 특이성이 동일한 2개의 dAb 및 특이성이 공통적이지만 상이한 2개의 dAb를 포함하거나; 삼중특이적이고, 특이성이 동일한 제1 dAb 및 제2 dAb, 특이성이 상이한 제3 dAb, 및 제1 dAb, 제2 dAb 및 제3 dAb와 특이성이 상이한 제4 dAb를 포함하거나; 또는 4중특이적이고, 각각 특이성이 상이한 4개의 dAb를 포함할 수 있다. IgG-유사 포맷 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fab', Fv, scFv)의 항원-결합 단편이 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, IgG-유사 포맷 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 항원을 가교시키지 않고, 예를 들어, 포맷은 표적 항원에 대해 1가일 수 있다. 보체 활성화 및/또는 항체 의존적 세포형 세포독성 (ADCC) 기능을 원하는 경우, 리간드는 IgG1-유사 포맷일 수 있다. 원한다면, IgG-유사 포맷은 Fc 수용체에 결합하는 것 및/또는 보체를 고정하는 능력을 최소화하기 위해 돌연변이된 불변 영역 (변이체 IgG 중쇄 불변 영역)을 포함할 수 있다 (예를 들어 윈터(Winter) 등의 GB 2,209,757 B; 모리슨(Morrison) 등의 WO 89/07142; 모건(Morgan) 등의 WO 94/29351 (1994년 12월 22일) 참조).
본 발명의 리간드 (폴리펩티드, dAb, 효능제 및 길항제)는 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 융합 단백질로 포맷화될 수 있다. 원한다면, 이같은 포맷은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 혈청 알부민에 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인에 직접적으로 융합된 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.
일반적으로, 표적에 대한 결합 특이성이 있는 결합 부위가 있는 폴리펩티드 도메인의 배향, 및 리간드가 링커를 포함하는지 여부는 디자인 선택의 문제이다. 그러나, 링커가 있는 또는 링커가 없는 일부 배향은 다른 배향보다 더 양호한 결합 특징을 제공할 수 있다. 모든 배향 (예를 들어, dAb1-링커-dAb2; dAb2-링커-dAb1)이 본 발명에 포함되고, 원하는 결합 특징을 제공하는 배향을 함유하는 리간드는 스크리닝에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드 및 dAb (dAb 단량체, 이량체 및 삼량체 포함)는 CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 양쪽 모두를 포함하고 힌지(hinge) 영역을 임의적으로 포함하는 항체 Fc 영역에 연결될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역에 단일 뉴클레오티드 서열로서 연결된 리간드를 코딩하는 벡터가 이같은 폴리펩티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 상기 언급된 dAb 단량체의 이량체, 삼량체 및 중합체를 또한 제공한다.
실시예
실시예 1
연구 목적
본 연구의 목적은 파지를 다양한 프로테아제 (발현 숙주에서 천연적으로 발생하는 것 포함)로 처리하는 것과 조합하여 DPP IV 저항성 GLP-1 (본원에서 *GLP-1로 지칭됨)을 포함하는 GLP-1 변이체로부터 유래된 라이브러리 상에서 파지 선택을 수행함으로써 GLP-1 AlbudAb™ 융합물의 프로테아제 저항성 변이체를 수득하는 것이었다. 본원에 기술된 바와 같이, AlbudAb™은 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
GLP -1 수용체
글루카곤-유사 펩티드-1 수용체 (GLP-1R)는 7가지 막횡단 G 단백질-커플링 수용체의 B1 패밀리에 속한다. 이러한 수용체와 이의 천연 효능제 리간드 GLP-1 간의 결합 상호작용은 수용체의 세포외 N-말단 도메인 (ECD GLP-1R)에 리간드가 결합하는 것에 의해 시작되고, 막횡단 부분의 코어와의 상호작용이 이어진다 (문헌 [Al-Sabah et al., 2003; FEBS Lett; 553(3):342-6]). 막횡단 코어가 제거된 경우에, 비록 친화력은 감소되지만, 단리된 N-말단 도메인에 대한 GLP-1 결합이 유지되는 것으로 나타났다 (문헌 [Lopez de Maturana et al., 2003; J. Biol. Chem; 278(12): 10195-200]). 가용화 세제 없이는 수용액 내에서의 막횡단 도메인이 있는 수용체의 용액 용해도가 불량하기 때문에, 전체 수용체의 사용이 용액에서의 파지 선택에 바람직하지 않으므로, 실험을 단순화하고 ECD GLP-1R에 대한 친화력이 있는 분자를 디스플레이하는 파지를 강화하기 위해 단리된 세포외 도메인이 파지 포획에 사용되었다.
ECD GLP-1R의 His 태그가 부착된 Fc 단량체에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 하기와 같다:
뉴클레오티드 서열 (서열 1):
Figure 112011050858866-pct00001
아미노산 서열 (서열 2):
Figure 112011050858866-pct00002
GLP-1R ECD가 IgG Fc 태그와 함께 또한 발현되었고, 이는 단백질 A 아가로스 상에서의 초기 정제를 가능하게 하였다. 파지 선택 동안, 가용성 수용체를 단백질 A가 코팅된 비드를 사용하여 포획할 수 있었다.
테스트 파지 선택
GLP-1 수용체의 세포외 도메인이 파지 디스플레이 라이브러리 선택에 사용될 수 있음을 증명하기 위해 테스트를 수행하였다
파지 벡터
필라멘트형 파지 (fd) 디스플레이 벡터인 pDOM34 (pDOM4의 유도체임)를 사용하였고, 이는 myc 태그가 있는 fd 벡터를 기초로 하고, 이때 단백질 서열이 제한 부위들 사이에 클로닝되어 단백질-유전자 III 융합물을 제공할 수 있다. (WO 2007/085815에 기술된 pDOM4는 유전자 III 신호 펩티드 서열이 효모 당지질 고정 표면 단백질 (GAS) 신호 펩티드 (WO 2005/093074)로 교체된 Fd 파지 벡터의 유도체이다. 이는 유전자 III을 다시 프레임 내에 놓는, 리더 서열과 유전자 III 사이의 c-myc 태그를 또한 함유한다.)
pDOM34에 이르는 pDOM4의 변형에는 하기의 것들이 포함된다:
1.) pDOM4의 7476nt 위치의 NcoI 부위의 녹아웃(knock-out)
2.) cpIII의 N'말단에 융합된 Myc 태그의 결실
3.) 신호 펩티드에 바로 이어지는 클로닝을 용이하게 하기 위한 NcoI 제한 부위의 도입.
라이브러리 레퍼토리를 코딩하는 유전자들을 NcoI / NotI 단편으로서 클로닝하였다.
벡터를 대장균 MachI 세포에서 증식시키고, 플라스미드 메가 프렙(Plasmid Mega Prep) 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 단리하고, 수퍼코일드(supercoiled) 분획을 표준 기술을 사용하여 염화세슘 구배 초원심분리에 의해 단리하였다 (문헌 [Sambrook and Maniatis, 1989]). 벡터를 NcoI 및 NotI 효소에 이어서 PstI로 절단하여, 자가 라이게이션율을 감소시켰다. 페놀/클로로포름 추출 후, DNA를 에탄올 침전시키고, 크로마스핀(Chromaspin) TE-1000 칼럼 (클론테크(Clontech)) 상에서 NcoI 부위와 NotI 부위 사이의 필요하지 않은 "스터퍼(stuffer)" DNA 단편으로부터 정제하였다. 정제 후, 다양화된 DAT-X DNA 단편들과의 라이게이션을 벡터 DNA를 사용하여 테스트하였다.
DAT -X 라이브러리 구축
DPP IV 저항성 GLP-1 (추가로 *GLP-1로 추가로 칭해짐)을 포함하는 DAT-X 어버이 분자를 기초로 18개의 레퍼토리를 구축하였다.
* GLP -1 (7-37):
아미노산 서열
Figure 112011050858866-pct00003
뉴클레오티드 서열:
Figure 112011050858866-pct00004
DAT-X 어버이 분자는 DOM7h-14 (혈청 알부민에 결합하는 도메인 항체 (dAb) (albudab; AlbudAb™))와의 융합물을 추가로 포함한다.
DOM7h -14:
아미노산 서열:
Figure 112011050858866-pct00005
뉴클레오티드 서열:
Figure 112011050858866-pct00006
DAT-X 어버이 분자 내의 *GLP-1 및 DOM7h-14는 나선형 링커에 의해 연결된다:
나선형 링커:
아미노산 서열:
Figure 112011050858866-pct00007
뉴클레오티드 서열:
Figure 112011050858866-pct00008
*GLP-1의 전체 서열 (수용체 결합에 중요한 것으로 공지된 부위 (예를 들어, 문헌 [Sarrauste de Menthiere et al. Eur J Med Chem. 2004 Jun;39(6):473-80]; [Neidigh et al. Biochemistry. 2001 Nov 6;40(44):13188-200]; [Hjorth et al. J Biol Chem. 1994 Dec 2;269(48):30121-4] 및 [Gallwitz et al. Regul Pept. 1996 May 7;63(1):17-22]에 기술되어 있음) 제외)을 다루기 위해, 50 ㎕ 반응 부피로 퓨전(Phusion) 고-충실도 폴리머라제 (NEB)를 사용하여 어셈블리 PCR 프로토콜을 사용하여 17개의 레퍼토리를 구축하였다. 라이브러리 당 4개의 무작위화 뉴클레오티드를 1차 PCR에서 프라이머에 의해 도입한 후, 비오틴화 프라이머로 어셈블리를 수행하였다. 뮤타자임(Mutazyme) II 키트 (스트라타진), 비오틴화 프라이머 및 50 ㎕ 반응에 대해 5-50 pg의 주형을 사용하는 에러-경향 PCR로 무작위 돌연변이가 *GLP-1 내에 도입되었다. *GLP-1 뉴클레오티드 서열의 짧은 길이로 인해, 돌연변이율을 증가시키기 위해 에러-경향 PCR이 2회 수행되었다.
NcoINotI로의 소화 후, 삽입물을 소화되지 않은 생성물로부터 스트렙타비딘이 코팅된 비드로 정제하였다. 테스트 라이게이션을 수행하였고, 이때 소화된 생성물이 상응하는 부위에서 pDOM34 내로 라이게이션되었다.
테스트 라이게이션 클론의 서열분석에서 모든 라이브러리 내의 예상된 다양화가 확증되었고, 따라서 라이브러리의 전체 규모 라이게이션 및 형질전환이 이어졌다. 1 ㎍의 1:2 비율의 소화된 벡터 및 삽입물 + T4 DNA 리가제 (NEB)로 500 ㎕의 전체 부피로 라이게이션이 수행되었다. 각각의 라이브러리를 10 ㎕/100 ㎕의 전기적격(electrocompetent) 대장균 TB1 세포로 2회의 샷(shot)으로 형질전환시키고, 1시간 동안 37℃에서 진탕시킨 100 ㎖의 배지를 회수한 후, 라이브러리를 2×TY Tet 한천을 함유하는 대형 (22 ㎝) 사각 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 하룻밤 동안 성장시킨 후, 스톡 제조를 위해 5 ㎖의 2×TY + 15% 글리세롤 내로 스크레이핑하였다. 라이브러리 크기는 107-108개의 형질전환체 범위였다.
파지 라이브러리 제조를 위해, 접종 직후의 배양물의 최종 밀도가 OD60O=0.1을 초과하지 않도록 글리세롤 스톡 100 ㎕를 항생제를 함유하는 2×TY 배지 200 ㎖ 내로 접종함으로써 라이브러리 배양이 시작되었다. 라이브러리를 약 18시간 동안 37℃에서 진탕하면서 배양하였다. 배양물을 원심분리에 의해 펠렛화하고, 파지 라이브러리를 PEG로의 이중 침전에 의해 제조하고, PBS에 재현탁시켰다.
선택되지 않은 라이브러리로부터의 여러 클론을 성공적인 라이브러리 구축을 확인하기 위해 무작위로 선택하였고, 파지 라이브러리 제조 후 제1 라운드의 패닝이 이어졌다.
패닝 방법, 글리세롤 스톡 제조 및 파지 증폭은 달리 언급되지 않는 한 하기 기술된 대로였다.
GLP-1 수용체의 세포외 도메인이 패닝에 사용되었다. 100 ㎕의 파지 라이브러리를 100 nM GLP-1R을 함유하는 2% 마벨(Marvell) PBS와 함께 인큐베이션하였다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션을 수행한 후, 파지를 예비 차단 (2% 마벨 PBS, 1h, 실온)된 단백질 A 다이나비드(dynabead) (다이날(Dynal))과 조합하였다. 회전 휠 상에서 실온에서 1시간 인큐베이션한 후, 비드를 킹피셔(KingFisher) 정제 시스템 (써모 일렉트론 코포레이션(Thermo Electron Corporation)) (이러한 킹피셔 로봇은 자기 프로브를 사용하여 비드를 세정 용액에서 세정 용액으로 전달함으로써 세정 공정을 자동화한다)에서 0.1% 트윈(Tween) PBS로 8회 세정하고, 특이적 파지를 500 ㎕의 0.1 M 글리신 pH 2.0에서의 용출에 의해 회수하였다. 100 ㎕의 1M 트리스(Tris)-Cl pH 8.0으로의 중화 후, 파지를 45분 동안 37℃에서 로그 단계의 대장균 TG1 세포를 감염시키는데 사용하였다. 감염된 세포를 한천 Tet 플레이트 상에 플레이팅하고, 이를 하룻밤 동안 37℃에서 성장시켰다. 라이브러리의 역가, 투입량, 산출량 및 라이브러리 크기가 하기 표에서 제시된다.
Figure 112011050858866-pct00009
Figure 112011050858866-pct00010
1차 선택 라운드에서 모든 라이브러리에 대해 타당한 산출량이 생산되었다.
15% 글리세롤을 함유하는 2 ㎖의 2×TY 배지와 함께 한천 플레이트로부터 콜로니를 스크레이핑함으로써 글리세롤 스톡을 제조하였고, 냉동(cryogenic) 바이알 내에 분취하였다.
풀링된 파지 상에서 하기의 선택을 수행하였다. 증폭된 파지를 18개 모두의 라이브러리로부터의 1차 선택으로부터의 산출물을 함유하는 대장균 글리세롤의 조합된 배양물에 의해 수득하였다. 1 ℓ의 2×TY 배지 내의 50 ㎕의 각각의 패닝된 라이브러리 글리세롤 스톡에 항생제를 접종함으로써 배양이 시작되었다. 배양물을 2개의 2ℓ 쉐이커 플라스크 내로 각각 0.5 ℓ씩 나누고, 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. PEG로의 단일 침전 및 PBS 내의 재현탁에 의해 18-20h의 배양 후 파지를 제조하였다.
프로테아제로의 DAT -X 파지 디스플레이 라이브러리 선택
1차 선택 산출물로부터의 증폭된 파지를 100 nM의 일정한 농도의 GLP-1R로의 추가적인 선택에 사용하였다. 추가적으로, 트립신으로의 선택 전에, 1차 선택 산출물로부터의 파지 뱃치를 AlbudAb 서열 내의 R108W 돌연변이와 함께 서브클로닝하였다. 이러한 돌연변이는 V카파 AlbudAb 클론을 파지 상에 디스플레이될 때 트립신 처리에 더욱 저항성이게 한다. 이는 도메인 항체를 pIII 단백질에 연결하는 dAb의 카르복시 말단에서의 아르기닌 잔기가 트립신 민감성이기 때문이다. 이러한 부위에서의 돌연변이는 트립신 절단 부위를 제거하고, 표적 펩티드의 원하는 영역에 대한 프로테아제 선택물의 표적화를 개선시킨다. 따라서, AlbudAb 내의 R108W 돌연변이가 있는 또는 이러한 돌연변이가 없는 2개의 파지 뱃치가 2차 선택 라운드에서 준비되어 사용되었다.
파지를 상이한 농도의 트립신 또는 키모트립신 프로테아제로 처리하거나 처리하지 않고 방치한 후, 수용체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 2차 선택 역가 (φ/㎖)가 하기 표에서 제시된다.
Figure 112011050858866-pct00011
각각의 선택으로부터의 파지 산출물 (0 ㎍/㎖ - 10 ㎍/㎖)을 50 ㎕의 글리세롤 스톡을 50 ㎖의 2×TY + Tet 내로 접종하고 20시간 동안 37℃에서 진탕하면서 하룻밤 동안 배양함으로써 증폭시켰다. 정제된 파지를 동일한 인큐베이션 조건으로 3차 선택 라운드에 사용하였다.
3차 선택 역가 (φ/㎖)가 하기 표에 제시된다.
Figure 112011050858866-pct00012
Figure 112011050858866-pct00013
대표적인 클론 셋트의 콜로니 서열분석에 의해 확인된 바와 같이, 클론의 다양성이 3차 라운드 후 이미 감소되었기 때문에, 선택 산출물로부터의 몇몇 클론이 하기와 상술된 바와 같이 가용성 단백질로 발현되었다.
DAT -X 파지 디스플레이 라이브러리 선택 산출물
여러 *GLP-1 변이체가 AlbudAb와의 융합물로서 클로닝되도록 선택되었지만, 하기 기술된 바와 같은 별법적인 링커와 함께 GLP-1 수용체 분석법에서 발현, 정제 및 분석되었다. 이들의 아미노산 서열이 1-10번 서열로 기재된다 (도 1 참조). 1개의 *GLP-1 서열 변이체 (7번 서열)가 키모트립신 및 트립신 양쪽 모두로 처리된 선택물로부터의 산출물 내에 풍부하게 존재하였고, 융합물로서 DMS7149로 칭해지고, 키모트립신이 사용되었을 때 2개가 존재하였고 (DMS7150 (8번 서열) 및 51 (9번 서열)), 파지 발현 및 선택 동안 천연 프로테아제만 작용하였고 트립신 또는 키모트립신 처리는 사용되지 않은 산출물에서 1개가 관찰되었으며 (DMS7148 (6번 서열)), 1개가 트립신 절단 부위의 녹아웃을 생성시키기 위해 클로닝되었다 (DMS7152 (10번 서열)).
아미노산 서열 1-4번 (도 1 참조)의 단백질이 분석되었고, GLP-1 및 대조군 DAT-X 변이체에 비해 낮은 효능을 나타냈다. 에드만(Edman) 서열분석은 단백질들이 잘못 프로세싱되었음을 시사하였다.
아미노산 서열 PSS (서열 9) 및 뉴클레오티드 서열 CCAAGCTCG (서열 10)의 별법적인 링커에 의해 DOM7h-14에 연결된 *GLP-1을 포함하는 DAT-Y 클론 내로 돌연변이를 도입함으로써 클로닝을 수행하였다.
선택된 돌연변이를 1차 PCR에서 프라이머에 의해 *GLP-1 서열에 도입하였고, 어셈블리 PCR에서 NcoI 및 BamHI 소화 부위를 융합 서열의 5' 및 3' 밀단 각각에 도입하였다.
어셈블리 PCR을 NcoI 및 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다.
발현 벡터 pDOM35를 클로닝용으로 제조하였다. 벡터 pDOM35는 변형이 있는 pET12a의 유도체이다:
ㆍ OmpT 신호 펩티드의 마지막 3개의 잔기가 SFA에서 AWA로 변화되고, 이는 대장균의 신호 펩티다제에 의한 정확한 부위에서의 프로세싱을 개선시킨다.
ㆍ 신호 펩티드에 바로 이어지는 클로닝을 용이하게 하기 위해 NcoI 부위가 도입되었다.
ㆍ '스터퍼'가 NcoI 부위와 BamHI 부위 사이에 존재한다.
pDOM35를 NcoI 및 BamHI로 소화시키고, 절단된 어셈블리 PCR을 퀵 라이게이션 키트(Quick Ligation Kit) (NEB)를 사용하여 벡터 내로 라이게이션시켰다. 2 ㎕의 라이게이션물을 MachI 세포의 형질전환에 사용하였고, 회수 후 세포를 카르베니실린을 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 하룻밤 동안 성장시켰다. 콜로니들의 서열을 분석하였고, 정확한 서열을 함유하는 것들이 플라스미드 증식 및 이의 단리에 사용되었다 (플라스미드 미니 프렙(Plasmid Mini Prep) 키트, 퀴아젠). BL21 (DE3) 세포를 플라스미드 DNA로 형질전환시키고, 생성된 콜로니를 발현 배양물의 접종에 사용하였다.
100 ㎍/㎖의 카르베니실린 및 오버나이트 익스프레스(Overnight Express)™ 자가유도 용액 (1 ㎖의 용액 1 (카탈로그 # 71298), 2.5 ㎖의 용액 2 (카탈로그 # 71299), 50 ㎕의 용액 3 (카탈로그 # 71304), 노바젠(Novagen))이 보충된 2×TY 배지의 50 ㎖ 배양물의 접종에 의해 발현을 수행하였다. 37℃에서 하룻밤 동안 배양을 수행한 후, 배양 상등액을 3700×g에서 45분 동안의 원심분리에 의해 청정화하였다. 그 후, 발현된 단백질을 청정화된 상등액으로부터 단백질 L 스트림라인(streamline) (GE 헬스케어(GE Healthcare), 카탈로그 # 28-4058-03, 단백질 L 커플링)을 사용하여 정제하고, 0.1M 글리신 pH 2.0을 사용하여 단백질 L로부터 용출시킨 후, 0.2 부피의 1M 트리스 pH 8.0을 사용하여 중화시켰다.
DMS7148로부터의 *GLP-1 변이체 부분이 더 높은 친화력의 albudab인 DOM7h-14-10과의 융합물 DMS7161 (11번 서열)로서 또한 클로닝되었고, 앞서 기술된 바와 같이 별법적인 PSS 링커에 의해 pDOM35 내로 연결되었다.
DOM7h-14-10
아미노산 서열 (서열 22):
Figure 112011050858866-pct00014
뉴클레오티드 서열 (서열 23):
Figure 112011050858866-pct00015
DMS7161의 서열을 포함하는 플라스미드 DNA pDOM35를 BL21(DE3) 내로 형질전환시킨 후, 콜로니를 글루코스가 있는 최소 배지 내로 스크레이핑하고 글리세롤을 첨가함으로써 글리세롤 스톡을 제조하였고, 최종 농도는 약 15%였다. 이러한 글리세롤을 OD600=0.024의 출발 배양물 밀도가 수득되도록 최소 배지 (DMS7161 A) 또는 10 g/ℓ의 최종 농도로 효모 추출물이 보충된 최소 배지 (DMS7161 B) 50 ㎖ 내로 접종함으로써 DMS7161의 발현이 시작되었다. 배양물을 30℃에서 약 1.4의 OD600으로 성장시킨 후, 0.1 mM 이소프로필-베타-d-티오갈락토시드의 첨가에 의해 유도시켰다. 추가로 24시간 동안 23℃에서 계속 배양한 후, 배양 상등액을 3700 x g에서 45분 동안 원심분리에 의해 청정화시켰다. 그후, 발현된 단백질을 청정화된 상등액으로부터 단백질 L을 사용하여 정제하고, 0.1M 글리신 pH 2.0을 사용하여 단백질 L (GE 헬스케어, 카탈로그 # 28-4058-03, 단백질 L 커플링)로부터 용출시킨 후, 0.2 부피의 1M 트리스 pH 8.0을 사용하여 중화시켰다.
DMS7148 -52의 품질 제어
단백질 DMS7148-52를 발현시키고 비-환원 SDS-PAGE 상에서 가시화시켰다. DMS7148 및 DMS7161 클론이 대장균에서 잘 발현되었고, 이때 대부분의 물질이 예상 크기로 이동하였다 (도 2, 3 및 4). 질량 분광법 (도 5 a)) 및 에드만 서열분석에서 서열의 통합성이 확인되었다. DMS7148이 W25-D 돌연변이를 함유한 경우에 모든 다른 단백질은 25-트립토판의 아미노 및 카르복실 부위에서 분해되었고 (각각 생성물 24-142 및 26-142), 아스파르트산은 대장균 세포 상에서 작용하는 천연 프로테아제에 대한 절단 부위를 생성시키지 않았다 (도 5 a) 내지 f)). 분해 생성물28-142가 나머지 클론에서 또한 관찰되었다.
단백질 DMS7148을 하기 프로토콜에 따라 GLP-1 수용체 결합 검정에서 활성에 대해 평가하였다:
배경: GLP-1R은 CHO 세포 상에서 발현되는 7TM G-단백질 커플링 수용체이다. GLP-1 또는 유사체에 의한 수용체의 활성화는 이러한 수용체에 커플링된 아데닐레이트 시클라제에 의한 ATP의 cAMP로의 전환에 이른다. CHO 세포는 6CRE/luc 리포터 유전자로 안정적으로 형질감염된다. 수용체의 GLP-1 활성화에 이어지는 cAMP 생산 시, 프로모터 유전자 (cAMP 응답 요소의 카피 6개를 함유함 - 6CRE)가 루시퍼라제 리포터 유전자의 생산을 구동시킨다. 이어서 이는 루시페린과의 반응을 촉매하여, 발광분석기 상에서 측정할 수 있는 빛을 발생시킨다.
프로토콜: CHO 6CRE GLP1R 세포 (루시퍼라제 리포터 유전자를 구동시키는 6개의 cAMP 응답 요소로 안정적으로 형질감염되고 또한 인간 GLP-1 수용체로 형질감염된 CHO K1 세포)를 2×105 개의 세포/㎖로 현탁 배지에 시딩(seeding)하였다. 현탁 배양을 48시간 동안 유지시켰다. 그후, 세포를 15 mM HEPES, 2 mM L 글루타민 (2.5×105개의 세포/㎖) 내로 희석하고, 10 ㎕/웰의 분석될 화합물을 함유하는 384웰 플레이트 내에 분배하였다. 분석법 대조군의 첨가 후, 플레이트를 3시간 동안 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터로 돌려보냈다. 인큐베이션 후, 스테디 글로(steady glo) 루시퍼라제 기질 (프로메가(Promega))을 키트에 기술된 바와 같이 웰에 첨가하고, 플레이트를 자가-접착성 플레이트 밀봉제로 밀봉하였다 (웨버 마킹 시스템즈 인코포레이티드(Weber Marking Systems Inc.) 카탈로그 # 607780). 플레이트를 판독기 (패커드 탑카운트(Packard TopCount)) 내에 놓고, 5분 동안 예비-인큐베이션한 후, 형광을 판독하고 결과를 플롯팅하였다. 피팅(fitting)될 광범위한 농도 응답 곡선에서 화합물을 평가하였고, 이로부터 pC50을 계산하였다.
단백질 DMS7148이 활성인 것으로 발견되었지만, GLP-1 펩티드보다는 덜 활성이었다 (도 6, 및 하기 요약):
Figure 112011050858866-pct00016
DMS7161을 하기 프로토콜에 따라 GLP-1 검정에서 활성에 대해 평가하였다:
방법:
CHO 6CRE GLP1R 세포를 바이알(들)을 37℃ 수조에 절반 함침시킴으로써 신속하게 해동시키고, 바이알(들)의 내용물을 50 ㎖ 팔콘 튜브로 옮기고, 바이알 당 10 ㎖ RPMI (페놀 레드 프리) 분석법 배지 (시그마(Sigma), 카탈로그 # R7509) + 2 mM L-글루타민 (깁코(Gibco), 카탈로그 # 25030) + 15 mM HEPES (시그마, 카탈로그 # H0887)를 첨가하였다. 카운팅 및 1200 rpm에서 5분 동안의 원심분리 후, 1×106개의 세포/㎖을 제공하도록 세포를 적합한 부피의 RPMI 분석법 배지에 재현탁시키고, 50 ㎕를 백색 96웰 편평 바닥 조직 배양 플레이트 (코스타(Costar) 96웰 조직 배양 플레이트, 백색 무균성, 카탈로그 # 3917)의 각각의 웰 내로 분배하였다. 세포를 하룻밤 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 인큐베이터에서 제거하고, 50 ㎕의 미리 제조된 대조군/샘플을 웰에 첨가하고, 플레이트를 3시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이터로 돌려보냈다.
GLP -1(7-36) 대조군의 제조 (시그마, 카탈로그 # G814)
V형 바닥의 96웰 플레이트에서, 2 ㎕의 1 ㎎/㎖ GLP-1(7-36)을 18 ㎕ RPMI 분석법 배지에 첨가하여, 30 μM 용액을 제공하였다. 2 ㎕의 30μM 용액을 298 ㎕ RPMI 분석법 배지에 첨가하여, 200 nM 용액을 제공하였다 (100 nM의 분석법에서의 최종 농도를 위해). 플레이트 아래쪽으로 대조군을 1:10으로 단계 희석하여 (15 ㎕ 대조군 + 135 ㎕ RPMI 분석법 배지), 8점 곡선을 생성시켰다.
엑센딘 -4 대조군의 제조 (시그마, 카탈로그 #E7144)
V형 바닥의 96웰 플레이트에서, 2 ㎕의 1 ㎎/㎖ 엑센딘-4를 198 ㎕ RPMI 분석법 배지에 첨가하여, 2.39 μM 용액을 제공하였다. 2 ㎕의 2.39 μM 용액을 237 ㎕ RPMI 분석법 배지에 첨가하여 20 nM 용액을 제공하였다 (10 nM의 분석법에서의 최종 농도를 위해). 플레이트 아래쪽으로 대조군을 1:10으로 단계 희석하여 (15 ㎕ 대조군 + 135 ㎕ RPMI 분석법 배지), 8점 곡선을 생성시켰다.
미지 샘플의 제조
미지 샘플의 제조를 위해 대조군의 제조에 대한 것과 동일한 지침을 사용하였다. 최상 농도를 필요한 최종 분석법 농도의 2배로 만들고, 플레이트 아래쪽으로 1:10 희석하였다.
루시퍼라제 제조 (프로메가(Promega), 카탈로그 # E2620)
필요한 개수의 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시퍼라제 분취물을 냉동기로부터 제거하고, 암실의 실온에서 해동시켰다. 1개의 5 ㎖ 바이알이 1개의 분석법 플레이트에 충분하였다.
인큐베이션 시간 후, 50 ㎕의 브라이트-글로 루시퍼라제 시약을 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 3분 동안 인큐베이션하여, 세포 용해가 일어나도록 하였다. 발광 (초 당 카운트)을 M5e 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하였고, 이때 각각의 웰을 0.1초 동안 판독하였다. 세포만 함유하는 배경 웰의 CPS를 모든 다른 웰로부터 차감하였다. 대조군 웰 (GLP-1(7-36) 또는 엑센딘-4)인 최고 농도에서 최대 자극을 나타내야 한다. 미지 샘플의 농도 효과 곡선을 피팅하였고, 이로부터 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 또는 엑셀피트(ExcelFit) 소프트웨어를 사용하여 EC50을 계산하였다.
DMS7161이 도 7에 제시되고 하기에 요약된 바와 같이 1.6 내지 3.4 nM의 EC50으로 효능이 있었다.
Figure 112011050858866-pct00017
DMS7161이 DMS7148만큼 활성인 것으로 발견되었다.
요약
천연적으로 프로테아제에 대해 매우 민감성이었고 대장균에서의 발현 동안 분해되는 다양화된 펩티드 융합물의 파지 선택이 천연 박테리아 프로테아제에 대해 저항성인 *GLP-1 변이체-융합물을 확인하도록 하였고, 이는 대장균에서 발현가능하다. 이러한 클론에서 녹-아웃된 프로테아제 부위는 트립신 및 키모트립신에 의해 인식되는 것과 유사하지만, 이러한 서열은 추가적인 트립신 또는 키모트립신 처리로의 선택물로부터의 산출물 내에 존재하지 않았다.
Figure 112011050858866-pct00018
SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited Enever, Carolyn Jespers, Laurent Pupecka, Malgorzata Tomlinson, Ian <120> Methods for selecting protease resistant polypeptides <130> DB00064WO <150> 61/120,135 <151> 2008-12-05 <160> 23 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> His tagged Fc monomer of ECD GLP-1R Nucleotide sequence <400> 1 atggccggcg cccccggccc gctgcgcctt gcgctgctgc tgctcgggat ggtgggcagg 60 gccggccccc gcccccaggg tgccactgtg tccctctggg agacggtgca gaaatggcga 120 gaataccgac gccagtgcca gcgctccctg actgaggatc cacctcctgc cacagacttg 180 ttctgcaacc ggaccttcga tgaatacgcc tgctggccag atggggagcc aggctcgttc 240 gtgaatgtca gctgcccctg gtacctgccc tgggccagca gtgtgccgca gggccacgtg 300 taccggttct gcacagctga aggcctctgg ctgcagaagg acaactccag cctgccctgg 360 agggacttgt cggagtgcga ggagtccaag cgaggggaga gaagctcccc ggaggagcag 420 ctcctgttcc tcaagcttga gcccaaatcg gccgacaaaa ctcacacatc accaccgtca 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaacatcac 1140 catcatcatc actga 1155 <210> 2 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His tagged Fc monomer of ECD GLP-1R Amino acid sequence <400> 2 Met Ala Gly Ala Pro Gly Pro Leu Arg Leu Ala Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Met Val Gly Arg Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu 20 25 30 Trp Glu Thr Val Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg 35 40 45 Ser Leu Thr Glu Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu Phe Cys Asn Arg 50 55 60 Thr Phe Asp Glu Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Glu Pro Gly Ser Phe 65 70 75 80 Val Asn Val Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala Ser Ser Val Pro 85 90 95 Gln Gly His Val Tyr Arg Phe Cys Thr Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln 100 105 110 Lys Asp Asn Ser Ser Leu Pro Trp Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu 115 120 125 Ser Lys Arg Gly Glu Arg Ser Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu 130 135 140 Lys Leu Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser 145 150 155 160 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 165 170 175 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 180 185 190 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 195 200 205 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 210 215 220 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 225 230 235 240 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 245 250 255 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 260 265 270 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 275 280 285 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 290 295 300 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 305 310 315 320 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 325 330 335 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 340 345 350 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 355 360 365 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys His His His His His His 370 375 380 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> *GLP-1 (7-37) Amino acid sequence <400> 3 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> *GLP-1 (7-37) Nucleotide sequence <400> 4 catggtgaag ggacctttac cagtgatgta agttcttatt tggaaggcca agctgccaag 60 gaattcattg cttggctggt gaaaggccga gga 93 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM7h-14 Amino acid sequence <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM7h-14 Nucleotide sequence <400> 6 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtgcggcgt tgcctaggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Helical linker Amino acid sequence <400> 7 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Glu Leu Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 20 25 30 Ala Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala 35 40 <210> 8 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Helical linker Nucleotide sequence <400> 8 aaagaagcgg cggcgaaaga agcggcggcg aaagaagcgg cggcgaaaga attggccgca 60 aaagaagcgg cggcgaaaga agcggcggcg aaagaagcgg cggcgaaaga attggccgca 120 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSS <400> 9 Pro Ser Ser 1 <210> 10 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSS nucleotide sequence <400> 10 ccaagctcg 9 <210> 11 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7190 <400> 11 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Ser Glu Glu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 35 40 45 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 50 55 60 Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys 65 70 75 80 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln 85 90 95 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 100 105 110 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 115 120 125 Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 130 135 140 Val Glu Ile Lys Trp 145 <210> 12 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7191 <400> 12 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Gly Ala Asp Leu Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 35 40 45 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 50 55 60 Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys 65 70 75 80 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln 85 90 95 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 100 105 110 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 115 120 125 Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 130 135 140 Val Glu Ile Lys Arg 145 <210> 13 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7192 <400> 13 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ala Thr Ala Cys Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Cys Leu Val Lys Gly Arg Gly Lys 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu 35 40 45 Leu Ala Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 50 55 60 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile 65 70 75 80 Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 85 90 95 Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 100 105 110 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 115 120 125 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala 130 135 140 Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 145 150 155 <210> 14 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7193 <400> 14 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Thr Gly Leu Glu Arg 20 25 30 Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala Asp Ile 35 40 45 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 50 55 60 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser 65 70 75 80 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp 85 90 95 Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 115 120 125 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe 130 135 140 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 145 150 <210> 15 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7194 <400> 15 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Phe Val Thr Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Lys Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 35 40 45 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala 50 55 60 Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 65 70 75 80 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly 85 90 95 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 100 105 110 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 115 120 125 Gln Gly Ala Ala Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 130 135 140 Ile Lys Trp 145 <210> 16 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7148 <400> 16 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Asp Leu Val Glu Gly Arg Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 35 40 45 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly 50 55 60 Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 <210> 17 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7149 <400> 17 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Glu Phe Val Thr Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 35 40 45 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly 50 55 60 Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 <210> 18 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7150 <400> 18 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Met Thr Ser Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 35 40 45 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly 50 55 60 Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 <210> 19 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7151 <400> 19 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Thr Gly Leu Glu Pro 20 25 30 Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 35 40 45 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly 50 55 60 Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 <210> 20 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7152 <400> 20 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Ser Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Val Asp Gly Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 35 40 45 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly 50 55 60 Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Ala Ala Leu 115 120 125 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 <210> 21 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMS7161 <400> 21 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Asp Leu Val Glu Gly Arg Gly Pro 20 25 30 Ser Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 35 40 45 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly 50 55 60 Ser Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 65 70 75 80 Leu Ile Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 85 90 95 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Leu Arg His 115 120 125 Pro Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 <210> 22 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM7h-14-10 Amino Acid sequence <400> 22 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Ser Gln 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Met Trp Arg Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Gly Leu Arg His Pro Lys 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 23 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DOM7h-14-10 Nucleotide sequence <400> 23 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg tctcagttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatcatgtgg cgttcctcgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtgctcag ggtttgaggc atcctaagac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

Claims (56)

  1. 삭제
  2. 서열 22에 기재된 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  3. 제2항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제2항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 포유동물에서 개선된 약동학적 (PK) 프로파일을 갖는 의약.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제2항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 또는 재조합 핵산 분자.
  12. 삭제
  13. 제11항에 따른 단리된 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  14. 제2항에 따른 면역글로불린 단일 가변 도메인, 또는 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 경구, 설하, 직장 또는 비경구로 투여하기 위한, 당뇨병 또는 비만의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 의약.
  15. 서열 23에 기재된 핵산 서열을 포함하는 단리된 또는 재조합 핵산 분자.
  16. 제15항에 따른 단리된 또는 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  17. 제15항에 따른 단리된 또는 재조합 핵산 분자 또는 이를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 피치아(Pichia) 종인 숙주 세포.
  19. 삭제
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