KR100467068B1 - 락토코쿠스 락티스 씨비티-19, 이를 이용한 항균 배양액분리 농축물의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents
락토코쿠스 락티스 씨비티-19, 이를 이용한 항균 배양액분리 농축물의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스균 (Propioni bacterium acnes)의 생육을 특이적으로 억제하는 항균활성물질의 생산을 위한 유산균 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19균과 유산균 배양액의 분리농축물 제조방법 및 그 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 분리농축물 제조방법은 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19균을 중량비 3%~5% 범위의 포도당, 0.5%~1% 범위의 효모추출물, 1%~1.5% 범위의 육엑기스, 0.5~1% 범위의 단백가수분해물, 0.01%~0.1% 범위의 이온성분을 첨가하여 물에 용해시키고 혐기적 발효관에서 살균 하여 제조한 배양액에 상기 본 발명에 의한 균주를 접종하여 유산균을 배양하는 단계와, 상기 유산균 배양액에 대하여 고속원심분리 또는 한외여과에 의해서 균체를 제거하여 획득한 배양여액에 대하여 배제분자량 10,000dalton의 한외여과 membrane에 통과시켜 획득한 투과액에 대하여 다시 배제분자량 1,000dalton의 nanometer membrane에 통과시키고 그 농축액에 대하여 다시 무균수를 연속적으로 가하는 단계와, 상기 배제분자량 1,000dalton의 nanometer membrane에 통과시켜 젖산을 제거하여 분자량 1,000~10,000dalton 범위의 중성 pH를 나타내는 항균물질 분리농축액을 획득하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 여드름 원인균에 대한 항균기능을 갖는 유산 균주인 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19, 이를 이용한 항균 배양액 분리농축물의 제조방법 및 상기 농축물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는, 여드름의 원인균이 되는 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)의 생육을 특이적으로 저해할 수 있어서, 여드름 원인균에 대한 항균기능을 갖는 락토코쿠스 락티스 CBT-19, 이를 이용한 항균 배양액 분리 농축물의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
종래부터, 유산균의 배양액 등이 화장품에 적용되어 왔는데, 상기 배양액 등을 화장품에 적용함에 있어서는, 균체 및 불용성 성분을 제거한 유산균 배양액이 주로 이용되어 왔다. 이러한 유산균의 배양액에는 주요 성분으로써 젖산, 유당, 아미노산, 인산염 등이 포함되어 있는 바, 이들 성분은 피부의 각질성분에 친화적으로 작용하거나, 피부의 항산화작용, 보습작용, pH 조절 작용 및 피부균총의 조절 작용 등을 할 수 있어서, 화장품에 유용하게 이용되어 왔으며, 이에 따라, 여러 가지 유산균의 배양액이 그 성분에 따라, 여러 종류의 화장품용 소재로서 개발되어 왔다. 특히, 여러 가지 유산균 중에서도 스트렙토코쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium)속에 속하는 미생물 중에서 보습효과, 활성 산소 제거 효과 및 면역 부활 기능을 가지는 유산균의 배양액이 화장품에 주로 적용되어 왔으며, 다만, 계속적인 연구의 결과로 적용되는 미생물의 범위는 점차로 넓어지고 있다.
상기 종래 기술에 의한 화장품용 유산균의 배양 방법 및 이를 이용한 화장료 조성물의 제조 방법에 관하여 좀 더 살펴보면 다음과 같다.
[표 1]
종래 기술에 의한 유산균 배양액을 이용한 화장료 조성물의 제조 공정
| 화장품용 유산균배양 →균체분리→배양여액 또는 여액건조물 제조→화장료 조성물 제조 |
상기 표에서 볼 수 있는 바와 같이, 유산균 배양액을 이용한 화장료 조성물을 제조하기 위해서는 우선, 적절한 유산균을 선택하여 이를 배양하게 되는 바, 종래 기술에 있어서, 이러한 유산균 배양은 일반적으로 펩톤류, 육엑기스, 효모추출물, 포도당 및 무기이온이 조합된 발효배지를 이용하여 혐기적 발효장치 내에서 이루어지게 되며, 이러한 배양 단계를 진행한 후, 그 배양액으로부터 균체를 분리하게 된다. 상기 분리 단계는 원심분리 또는 한외여과기를 이용하여 이루어지게 되며, 이러한 방법으로 균체가 분리된 유산균 배양액을 건조분말화 시키거나 액체 상태에서 화장품 성분, 증점제, 유화제 등과 혼합하여 화장료 조성물을 제조하게 된다.
한편, 염증성 여드름 질환에 관련된 임상적 치료요법에 있어서는, 주로 테트라사이클린(tetracycline), 신다마이신(cindamycine), 에리스로마이신 (erythromycin)등의 항생제가 주로 이용되어 왔으나, 이러한 항생제를 장기간 투여할 경우, 여드름의 원인균이 내성을 가지게 됨으로써, 치료효과가 떨어지는 문제점이 있었으며, 여드름 유발균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)는 그 인위적 배양이 어려워서, 이들 약제에 대한 감수성 실험이 미약할 수 밖에 없으므로, 적절한 약제선정에 어려움이 따랐고, 더구나,. 상기 약제들은 모두 항생제이므로 화장품으로서의 이용이 불가능한 문제가 있었다.
이와 같이, 종래 기술에 있어서, 유산균 배양액의 화장품 이용은 그 배양액에 포함된 여러 가지 성분을 통하여 보습 효과, 면역 부활 기능, 활성 산소 제거 기능, 유기산 등에 의한 정균 작용 등의 부수적인 효과를 거두기 위한 것에 국한될 뿐, 특정 균주의 생육을 저해함으로써, 여드름 등의 피부 질환을 치유하기 위한 적용은 없었던 것이 사실이다. 이 때문에, 여드름 등의 피부 질환은, 그 치료를 위하여 주로 항생제가 이용되어 왔으나, 항생제의 과다 투여로 인한 내성의 발생, 화장품에는 적용할 수 없는 한계 등 그 문제점이 많았으며, 이러한 종래 기술의 문제점으로 인하여, 항균 미생물의 배양액이 적용됨으로써, 여드름 등의 피부 질환을 유발하는 원인균의 생육을 저해할 수 있고, 이에 따라, 부작용이 없이 여드름 등의 피부 질환을 근본적으로 치유할 수 있도록 하는 기능성 화장품의 개발이 절실히 요구되어 왔다.
특히, 이러한 항균 미생물의 배양액은 내성 등의 부작용이 없고, 항생제에 비하여 일상 생활에서 사용되는 화장품에 비교적 쉽게 적용될 수 있어서, 여드름 등의 치료에 있어서, 그 효용이 크다고 할 것인 바, 이러한 효능을 가질 수 있는 유산균주, 그 배양액 분리 농축물의 제조 방법 및 이를 이용한 화장료 조성물의 필요성은 더욱 크다고 할 것이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 안출한 것으로써, 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)를 선택적으로 사멸시킬 수 있어서, 상기 여드름 원인균의 생육을 특이적으로 억제할 수 있는 유산균주 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19와 상기 본 발명에 의한 균주의 배양액 분리 농축물 및 이러한 분리 농축물을 포함함으로써, 여드름 예방 및 치료 효과를 가지게 되는 화장료 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)의 생육을 특이적으로 억제할 수 있는 유산균주인 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19를 제공한다.
또한, 본 발명은 3~5중량%의 포도당, 0.5~1중량%의 효모추출물, 1~1.5중량%의 육엑기스, 0.5~1중량%의 단백가수분해물 및 0.01~0.1중량%의 이온성분을 물에 용해시켜, 혐기적 발효관에서 살균하여 제조한 배양액에 상기 본 발명에 의한 균주를 접종하여 유산균을 배양하여 항균물질을 발생시키는 단계와, 고속원심분리 또는 한외여과(Ultrafiltration)를 통하여 상기 유산균 배양액으로부터 균체를 제거하는 단계와, 상기 균체가 제거된 배양여액을 배제분자량 10,000의 한외여과막(Ultrafiltration membrane)에 통과시키고, 상기 투과액을 다시 배제분자량 1,000의 나노미터막(Nanometer membrane)에 통과시켜, 상기 배양여액을 농축시키는 단계와, 상기 농축액에 무균수를 연속적으로 가하고, 그 결과물을 다시 배제분자량 1,000의 나노미터막(Nanometer membrane)에 통과시키면서 젖산을 제거함으로써, 분자량 1,000~10,000 범위의 중성 pH를 나타내는 항균물질 분리농축액을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 배양액의 분리농축물 제조방법을 제공한다.
상기 본 발명에 의한 분리 농축물 제조 방법에 있어서, 상기 이온성분으로는, 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스테이트, 마그네슘설페이트, 망간 설페이트, 소디움 클로라이드로 이루어진 그룹에서 선택된 물질을 사용함이 바람직하다.
또한, 상기 본 발명에 의한 분리 농축물 제조 방법은 상기 항균물질 분리농축액을 제조하는 단계를 진행한 후에, 제조된 분리농축물을 동결건조하거나 분사식 유동층 건조하는 단계를 부가적으로 포함하여 구성될 수도 있다. 이러한 단계를 부가적으로 포함함으로써, 제조된 분리 농축액의 저장 안정성을 향상시킬 수 있게 된다.
본 발명은 또한, 상기의 방법에 의하여 제조된 유산균 배양액의 분리 농축물을 0.01중량% 이상의 농도 또는 10Au/G이상의 항균 활성을 가지도록 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 이러한 화장료 조성물은 여드름 원인균의 생육을 억제할 수 있으므로, 이러한 조성물을 이용하여 화장품을 제조함으로써, 여드름에 대한 치료 효과를 거둘 수 있게 되는 것이다.
상기 본 발명에 의한 조성물에 있어서, 상기 조성물은 적용되는 화장품의 종류에 적합하도록 W/O, O/W 유화제형, 투명스킨, 현탁스킨, 젤제형 등으로 제조될 수 있으며, 유해세균에 대한 정균작용, 미백, 보습, 항산화 효과를 나타내는 보조 성분으로서 소디움히알루로닉산(Sodium hyaluronic acid), 락토페린(Lactoferrin), 혈청 단백질(Serum protein), 판테틴(Pantethine), 살리실산(Salicylic acid), 트리클로산(Triclosan) 등을 부가적으로 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명에 의한 균주인 락토코쿠스 락티스 CBT-19의 배양액 분리 농축물을 제조하고, 상기 농축물을 포함하는 화장료 조성물을 제조하는 공정을 나타낸 순서도이고,
도 2는 락토코쿠스 락티스 CBT-19의 전자현미경 관찰도이며,
도 3은 락토코쿠스 락티스 CBT-19의 항균 물질 발효 경시변화를 나타내는 그래프이고,
도 4는 락토코쿠스 락티스 CBT-19 배양액 분리 농축물의 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 에크니스(Propionibacterium acnes)에 대한 생육저지환 관찰도이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명에 의한 유산균주, 배양액 분리농축물의 제조 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관해 좀더 상세하게 설명하기로 한다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 여드름 원인균에 특이적 저해활성을 지닌 신규한 유산균주의 개발, 상기 균주에 대한 최적 발효배지 및 발효공정의 구성, 상기 발효를 통해 형성된 배양액으로부터, 항균활성을 가진 배양액 분리농축물을 제조하는 방법, 상기 분리 농축물을 포함하며 화장료 조성에 용이한 액제 또는 수용성 분말 상태의 조성물과, 이를 이용하여 제조되는 다양한 제형의 화장료에 관한 것이다.
이러한 본 발명에 사용되는 유산균주는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로 동정되는 락토코쿠스 락티스 CBT-19 유산구균으로서, 여드름 원인균으로 알려진 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)에 대하여 특이적 저해활성을 발휘하는 물질을 생산한다. 상기 균주에 대한 최적 발효배지 및 발효조건은 여드름 원인균에 대한 생육 억제 물질의 대량생산에 적합하도록 구성되었으며, 항균물질의 분리 농축 과정은 원심분리 또는 한외여과를 통한 균체 및 불용성 성분의 제거, 배제분자량을 이용한 항균활성분획의 포집 및 농축, 유기산의 제거 공정으로 구성된다. 건조분체화 공정은 농축액의 살균 후 수용성 포집제를 이용한 분사식 유동층 건조 또는 동결건조를 통하여 이루어 진다.
이와같은 공정으로 획득되어진 유산균 배양 분획건조물은 유화제 및 기타 화장품 원료 등과 혼합하여 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 크림, 로션, 메이크업, 색조 화장품 등의 모든 화장품 제형 등의 화장료로 제조되어질 수 있다.
상기와 같은, 본 발명에 의한 균주, 분리 농축물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관해 상세하게 설명하면 다음과 같다.
1) 균주선발(101)
락토코쿠스 락티스의 상기 배양액으로부터 균체를 분리한 유산균 배양 여액에 대해, 지시균으로서 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)를 반유동 배지에서 배양하여가며, 저지환 시험을 진행한다. 위와 같은 시험 결과 800Au/ml이상의 항균활성을 발휘하는 유산종균을 선별하여, 선별된 균주를 락토코쿠스 락티스 CBT-19 (Lactococcus lactis CBT-19)라고 명명하고, 이를 부다페스트 조약에 의한 국제 기탁기관(KCTC: 한국생명공학연구원 유전자원센터 유전자은행)에 기탁하여, 기탁 번호 (KCTC10180BP)를 부여받았다.
2) 균주의 특성 조사
상기와 같은 방법으로 제조된 유산균주 락토코쿠스 락티스 CBT-19에 관련한 생리학적, 생화학적 특성 등을 조사하여, 이를 하기의 표 1, 2에 나타내었으며, 상기 균주의 전자 현미경 사진을 도 2에 표시하였다.
표 1. 락토코쿠스 락티스 CBT-19균의 효소활성 시험
| 기질 | 반응/효소 | 결과4시간/24시간 |
| 피루베이트 | 아세토인생성 | + |
| 히퓨레이트 | 가수분해 | - |
| 에스쿠린 | 베타-글루코시데이즈 | + |
| 피로리도닐 2-나프틸아마이드 | 피로리도닐아릴아미데이즈 | + |
| 6-브로모-2-나프틸 알파-디-갈락토피라노사이드 | 알파-갈락토시데이즈 | _ |
| 베타-디-글루쿠론산 | 베타-글루쿠로니데이즈 | _ |
| 2-나프틸-베타-디-갈락토피라노사이드 | 베타-갈락토시데이즈 | _ |
| 2-나프틸 포스페이트 | 알카린 포스페테이즈 | _ |
| 엘-루이신-2-나프틸 아마이드 | 루이신 아릴아미데이즈 | _ |
| 아르지닌 | 아르지닌 디하이드로레이즈 | + |
| 라이보즈 | 산생성 | + |
| 엘-아라비노즈 | 산생성 | + |
| 만니톨 | 산생성 | + |
| 솔비톨 | 산생성 | _ |
| 락토즈 | 산생성 | + |
| 트리할로즈 | 산생성 | + |
| 이뉼린 | 산생성 | _ |
| 라피노즈 | 산생성 | + |
| 전분 | 산생성 | Weak |
| 글리코겐 | 산생성 |
표 2. 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19균의 당자화능 시험
| 기질 | 결과 | |
| 1 | 글리세롤 | Weak |
| 2 | 에리스리톨 | _ |
| 3 | 디 아라비노즈 | _ |
| 4 | 엘 아라비노즈 | + |
| 5 | 라이보즈 | + |
| 6 | 디 자이로즈 | _ |
| 7 | 엘 자이로즈 | _ |
| 8 | 아도니톨 | _ |
| 9 | 베타 메틸 -디 자일로사이드 | _ |
| 10 | 갈락토즈 | + |
| 11 | 글루코즈 | + |
| 12 | 프럭토즈 | + |
| 13 | 만노즈 | + |
| 14 | 솔보즈 | - |
| 15 | 람노즈 | - |
| 16 | 듈시톨 | - |
| 17 | 이노시톨 | - |
| 18 | 만니톨 | Weak |
| 19 | 솔비톨 | - |
| 20 | 알파-메틸-디 만노사이드 | - |
| 21 | 알파-메틸-디 글루토사이드 | - |
| 22 | 엔 아세틸 글루코사민 | + |
| 23 | 아미고달린 | Weak |
| 24 | 알부틴 | + |
| 25 | 에스쿠린 | + |
| 26 | 살리신 | + |
| 27 | 셀로비오즈 | + |
| 28 | 말토즈 | + |
| 29 | 락토즈 | Weak |
| 30 | 멜리비오즈 | + |
| 31 | 수크로즈 | + |
| 32 | 트리할로즈 | Weak |
| 33 | 이뉼린 | - |
| 34 | 멜레지토즈 | - |
| 35 | 라피노즈 | + |
| 36 | 전분 | - |
| 37 | 글리코겐 | - |
| 38 | 자이리톨 | - |
| 39 | 젠티오비오즈 | Weak |
| 40 | 디 튜라노즈 | - |
| 41 | 디 라익소즈 | - |
| 42 | 디 타가토즈 | - |
| 43 | 디 퓨코즈 | - |
| 44 | 엘 퓨코즈 | - |
| 45 | 디 아라비톨 | - |
| 46 | 엘 아라비톨 | - |
| 47 | 글루코네이트 | - |
| 48 | 2케토 글루코네이트 | + |
| 49 | 5케토 글루코네이트 | - |
3) 항균활성 물질의 발효(102)
상기한 바와 같이, 본 발명에 사용된 유산균주는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19로서, 이는 락토코쿠스 락티스를 혐기적으로 배양한 후, 이를 통해 제조된 유산균 배양여액에 대해 지시균으로 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)를 사용하여, 반유동배지에서 저지환 시험을 진행함으로써, 800Au/ml이상의 항균활성을 발휘하는 유산균을 선별하여 제조된 것이다. 상기 균주에 의한 항균물질 생산은 3~5중량%의 포도당, 0.5~1중량%의 효모추출물, 1~1.5중량%의 육엑기스, 0.5~1중량%의 단백가수분해물 및 0.01~0.1중량%의 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스테이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트 또는 소디움 클로라이드 등의 이온성분을 물에 용해시켜 제조된 배양용 배지에, 상기 본 발명에 의한 균주를 접종하고 산소가 제거된 혐기적 조건으로 16시간 발효함으로써 이루어진다. 항균물질 발효공정의 경시변화는 도 3에 나타내었는데 16시간 경과시 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)에 대하여 최대 1600 Au/ml의 저해활성을 나타내는 항균활성 물질이 생산되었다.
4)발효액 분리농축 및 젖산제거(103-106)
상기와 같은 방법으로 발효 단계를 진행한 후, 상기 발효액은 15,000 RPM 이상의 고속원심분리기 또는 균체분리용 한외여과기에 의해 균체와 여액으로 분리된다. 균체가 분리된 발효여액은 배제분자량 10,000의 한외여과막(Ultrafiltrationmembrane)으로 1차 여과하고, 1차 여과한 투과액에 대하여 배제분자량 1,000을 지닌 나노미터막(Nanometer membrane)으로 분리, 농축시켜 분자량 1000~10,000사이의 활성분획만을 포집하여 농축하고, 상기 농축액에 대해서는 5배량의 무균수를 연속적으로 가하여, pH가 6.0이상이 될 때까지 Dia-filtration함으로써, 젖산 성분을 완전 제거 한 후, 유기산이 제거된 최종 농축액의 부피를 발효원액에 대비하여 1/10의 부피로 조절한다. 발효액으로부터 항균물질을 분리 포집하고 젖산을 제거하는 공정에서의 항균활성 물질의 경시변화는 표 3에, 최종 농축액의 항균활성 관찰도는 도 4에 나타내었다.
표 3. 락토코쿠스 락티스 CBT-19의 발효에 의한 항균물질 농축액 제조시 공정별 항균활성의 경시도
| 공 정 | 항 균 활 성 | |
| 16시간 발효원액 | 1,600 Au/ml | |
| 균체제거 발효여액 | 1,600 Au/ml | |
| 배제분자량 10,000 Dalton한외여과(Hydrosart cassette) | 농 축 액 | 1,600 Au/ml |
| 투 과 액 | 1,600 Au/ml | |
| 배제분자량 1,000 Dalton한외여과여과 (Hydrosulfone) | 농 축 액 | 16,000Au/ml |
| 투 과 액 | 0 | |
| 젖산제거 Dia-filtration(Hydrosulfone) | 농 축 액 | 16,000Au/ml |
| 투 과 액 | 0 Au/ml |
5)건조분체화(107)
상기한 농축액에 대비하여 중량비 1~10%의 유당, 말토덱스트린, 만니톨, 탈지분유를 혼합하여 용해시키고 80℃ 온도조건에서 교반하여 가면서, 2회 30분간 열처리 하여 기타 잡균 및 유산균 등을 살균하고 동결건조기에 투입하여 건조시키거나 또는 분사식 유동층건조기에서 건조하고 분쇄하여 분말을 제조한다. 경우에 따라 항균활성 물질의 농축액을 화장료 원료로 직접사용하는 경우에는 건조분체화 공정을 생략할 수 있다.
8)화장료 제조(108)
상기 항균물질 농축물을 원료로 포함한 화장료 제형에 있어서 특별히 한정되는 것은 없다. 본 발명에 의한 화장료의 제형에는 구체적으로 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 크림, 로션, 메이크업, 색조 화장품 등의 모든 화장품 제형이 가능하며, 각 제형의 화장료 제조에 있어서 점증제, 방부제, 향료, 착색료 등의 일반적인 원료성분들은 화장료의 제조방법, 제형, 사용목적 등에 따라 적절하게 선택하여 배합할 수 있다. 화장료의 제조시 본 발명의 핵심성분인 항균물질 농축물은 전체 조성물에 대하여 0.01% 이상의 농도 또는 10Au/g 이상의 항균활성을 유지하도록 배합하며, 추가적으로 기타 유해세균에 대한 정균작용, 미백, 보습, 항산화 효과를 나타내는 보조 성분으로서 소디움히알루로닉산(Sodium hyaluronic acid), 락토페린(Lactoferrin), 혈청 단백질(Serum protein), 판테틴(Pantethine), 살리실산(Salicylic acid), 트리클로산(Triclosan) 등을 단독 또는 혼합하여 화장료를 제조한다.
실시예 1) 락토코쿠스 락티스 CBT-19 균에 의한 여드름 원인균을 저해하는 농축 발효액 및 농축건조물의 제조
포도당 25Kg, 육엑기스 5Kg, 효모추출물 2.5Kg, 카제이펩톤 2.5kg, 소이펩톤2.5kg, 디포타슘 포스페이트 0.25kg, 암모니움 시트레이트 0.25kg, 소디움 아세테이트 0.25kg, 마그네슘 설페이트 0.05kg, 망간 설페이트 0.05kg을 물 500L에 첨가하여 용해시키고 800L 용량의 혐기적 발효관에 이송하여 121℃에서 15분간 살균하고 미리 배양한 종균 10L를 접종하여 20시간 발효하였다. 발효액을 60L/Hr의 유속으로 연속식 원심분리기에 이송시키면서 균체를 제거하고 배양여액을 배제분자량 10,000의 한외여과기 필터에 통과시키고 투과액을 회수하여 다시 배제분자량 1,000의 나노미터 필터에 통과시켜 분자량 1000~10,000사이의 항균물질 농축액을 50L를 획득하였다. 농축액에 대하여 다시 5배량의 무균수를 연속적으로 가하며 배제분자량 1,000의 나노미터 필터에 통과시켜 투과액과 농축액을 재분리하였다. 이 공정에서 잔존유기산, 색소, 불용성 성분 등이 완전히 제거되었고 여드름 원인균에 대하여 항균활성을 지닌 분자량 1000~10,000사이의 항균물질분획이 선택적으로 분리농축 되었다. 분리농축된 항균물질 포집액은 최종 부피를 발효원액의 1/10수준으로 농축하였고 여드름 원인균에 대한 항균활성 또한 10배로 농축되었다. 항균물질 분리 농축액에 대하여 중량비 5~50% 범위의 만니톨, 유당 등의 수용성 부형제를 사용하여 동결건조 또는 분사식 유동층 건조하여 수용성 분말화 하였다. 이때 항균활성은 최종 분말의 경우 1,600~16,000Au/g이 되도록 희석비를 조정하였다.
실시예 2)-5) 유산균 배양액 농축건조물을 함유하는 일반 화장수의 제조
표 4. 실시예2)-5)에 따른 조성비
| 성 분 | 조성비(w/w %) | |||
| 실시예 2 | 실시예 3 | 실시예 4 | 실시예 5 | |
| 1)정제수 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 |
| 2)글리세린 | 10.0 | 10.0 | 10.0 | 10.0 |
| 3)소디움 하이얼 유론산 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 4)녹차 추출물 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 5)락토패드(1000~2000Au/g) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 6)에탄올 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 7)살리시릭 산 | - | 0.5 | - | 0.5 |
| 8)트리클로잔 | - | - | 0.3 | 0.3 |
| 9)경화 비버유 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 10)방부제 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 |
| 11)향 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 |
원료 1)~5)을 혼합하여 균질하게 용해시켰다. 별도의 용기에서 원료 6)~11)을 40℃ 이하의 온도로 가열하면서 혼합하여 용해시킨 후, 먼저 제조된 1)~5)원료 용액에 서서히 투입하고 Agi-mixer에서 균질화 시켜 화장수를 제조하였다. 이때, 여드름 원인균인Propionibacterium acnes를 포함한 피부 유해세균에 대한 항균작용에 관련한 활성성분으로서 주 성분인 5)Lactopad에 대하여 보조성분으로서 7)Salicylic acid, 8)Triclosan을 단독 또는 동시에 일정한 농도로 혼합하여 화장수를 제조하였다.
실시예 6)-9) 항균물질 농축건조물을 함유하는 영양화장수의 제조
표 5. 실시예 6)-9)에 따른 조성비
| 성 분 | 조성비(w/w %) | |||
| 실시예 6 | 실시예 7 | 실시예 8 | 실시예 9 | |
| 1)세토스테아릴 알코올 | 1.7 | 1.7 | 1.7 | 1.7 |
| 2)폴리솔베이트 60 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 3)솔비탄 스테아릴산e | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 4)스테아릴산 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 5)트리글리세라이드 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
| 6)세틸-에틸 헥사노에이트 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| 7)메틸파라벤 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| 8)프로틸파라벤 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 9)사이클로메티콘 | 3.0 | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
| 10)정제수 | To 100 | To 100 | To 100 | To 100 |
| 11)글리세린 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 12)락토패드(1000~2000AU/g) | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| 13)살리시릭 산 | - | 0.5 | - | 0.5 |
| 14)트리클로산 | - | - | 0.3 | 0.3 |
| 15)향 | 적량 | 적량 | 적량 | 적량 |
| 16)점증제 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
원료 1)~9)를 혼합하고 가열하여 65~70℃까지 온도를 상승시켜 용해시켰다. 별도의 용기에서 원료 10)~11)를 혼합하여 용해시키고 가열하여 65~70℃까지 온도를 상승시키고 앞서 제조한 용액에 서서히 투입하면서 homo-mixer에서 균질화 시켜 에멀젼을 형성시켰다. 이 형성된 에멀젼 용액에 대하여 원료 12)~16)을 순서대로 혼합하여 점증있는 에멀젼을 제조하였다. 이때 일반화장수의 제조와 마찬가지로 여드름 원인균인 Propionibacterium acnes를 포함한 피부 유해세균에 대한 항균작용에 관련한 활성성분으로서 주 성분인 5)Lactopad에 대하여 보조성분으로서 7)Salicylic acid, 8)Triclosan을 단독 또는 동시에 일정한 농도로 혼합하여 영양화장수를 제조하였다.
이상 실시예 2)~9)에 의하여 만들어진 화장료 조성물들은 각각 실온, 5℃, 37℃, 그리고 45℃에서 한달 이상 보관하면서 제품 중의 층분리 현상을 비교 측정하였는데 모두 안정하여 층분리 등의 현상은 없었으며 항균활성도 그대로 유지되었다. 락토패드(LACTOPAD)를 사용한 화장료 조성물의 제형안정성 및 임상자료는 표6-7에 나타내었다.
표 6. 유산균 배양 농축물을 함유한 화장료 조성물의 제형 안정성
| 화장료 | 경과일 | ||||||
| 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | ||
| 로션 | 층분리 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 |
| 항균활성(Au/g) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| 색상 | White | White | White | White | White | White | |
| 크림 | 층분리 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 |
| 항균활성(Au/g) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| 색상 | White | White | White | White | White | White | |
| 에센스 | 층분리 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 | 없음 |
| 항균활성(Au/g) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| 색상 | White | White | White | White | White | White |
표 7. 유산균 배양농축물을 함유한 화장료 조성물의 임상시험
| 화장료 | 항 목 | 매우 개선 | 약간 개선 | 변화 없음 | 나빠짐 |
| 로션(항균활성100Au/g포함) | 탄력성 | 4 | 6 | 8 | 2 |
| 보습성 | 8 | 8 | 4 | 0 | |
| 여드름개 선 | 10 | 4 | 4 | 1 | |
| 미백효과 | 6 | 6 | 7 | 1 | |
| 피부신선도 | 8 | 8 | 2 | 2 |
(성인여성 20명에 대하여 이틀 간격으로 15일간 처리)
이와같이, 본 발명인 여드름원인균에 대한 항균기능을 갖는 유산균 배양액의 분리농축물 제조방법 및 그 조성물은 여드름 예방 및 치료효과를 가진 기능성 제품의 사용상 효율성을 극대화 한다.
본 발명인 여드름원인균에 대한 항균기능을 갖는 신규한 유산 균주, 상기 균주의 배양액 분리농축물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 에크네스(Propionibacterium acnes)에 대하여 특이적 저해활성 기능을 가지고 있어 피부에 서식하는 여드름 원인균 및 유해세균에 대하여 항균작용을 발휘하여 여드름 질환을 치료하고 예방하며, 본 수용성 항균성분의 분리농축물은 화장료 조성에 적합한 물성이므로 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 크림, 로션, 메이크업, 색조 화장품 등의 모든 화장품류로 제조될 수 있어 사용자의 사용상 효율성을 극대화 하는 매우 훌륭한 발명이다.
Claims (7)
- 프로피오니박테리움 애크니스(Propionibacterium acnes)의 생육을 특이적으로 억제할 수 있는 유산균주인 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) CBT-19(KCTC10180BP).
- 3~5중량%의 포도당, 0.5~1중량%의 효모추출물, 1~1.5중량%의 육엑기스, 0.5~1중량%의 단백가수분해물 및 0.01~0.1중량%의 이온성분을 나머지 함량의 물에 용해시켜, 혐기적 발효관에서 살균하여 제조한 배양액에 제 1 항의 균주를 접종하여 유산균을 배양하는 단계와;고속원심분리 또는 한외여과를 통하여 상기 유산균 배양액으로부터 균체를 제거하는 단계와;상기 균체가 제거된 배양여액을 배제분자량 10,000의 한외여과막에 통과시키고, 상기 투과액을 다시 배제분자량 1,000의 나노미터막에 통과시켜, 상기 배양여액을 농축시키는 단계와;상기 농축액에 무균수를 연속적으로 가하고, 그 결과물을 다시 배제분자량 1,000의 나노미터막에 통과시키면서 젖산을 제거함으로써, 분자량 1,000~10,000 범위의 중성 pH를 나타내는 항균물질 분리농축액을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균 배양액의 분리농축물 제조방법.
- 제 2항에 있어서,상기 이온성분은, 암모니움 시트레이트, 소디움 아세테이트, 디포타시움 포스테이트, 마그네슘 설페이트, 망간 설페이트, 소디움 클로라이드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 물질임을 특징으로 하는 유산균 배양액의 분리농축물 제조방법.
- 제 2항에 있어서,상기 항균물질 분리농축액을 제조하는 단계를 진행한 후에, 제조된 분리농축물을 동결건조하거나 분사식 유동층 건조하는 단계를 부가적으로 포함하여 구성됨을 특징으로 하는 유산균 배양액의 분리농축물 제조방법.
- 제 2 항에 의하여 제조된 유산균 배양액의 분리 농축물을 0.01중량% 이상의 농도 또는 10Au/G이상의 항균 활성을 가지도록 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제 5항에 있어서,상기 화장료 조성물은,W/O, O/W 유화제형, 투명스킨, 현탁스킨, 젤제형의 형태를 가짐을 특징으로 하는 화장료 조성물.
- 제 5항에 있어서,상기 화장료 조성물은 부가적으로 소디움히알루로닉산(Sodium hyaluronic acid), 락토페린(Lactoferrin), 혈청 단백질(Serum protein), 판테틴(Pantethine), 살리실산(Salicylic acid), 트리클로산(Triclosan)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 물질 또는 둘 이상의 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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