KR100374813B1 - 디프테리아, 파상풍 톡소이드, 정제백일해 및비형간염표면항원을 포함한 4가 혼합백신 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 디프테리아, 파상풍 톡소이드와 정제백일해 및 B형간염표면항원을 포함한 4가 혼합백신과 그 제조 방법으로서 파상풍 톡소이드의 함량과 알루미늄 하이드록사이드 젤 흡착제의 함량을 미세 조절하여 상기 혼합백신중 B형간염표면항원의 면역원성을 안정하게 유지시키고 동시에 독성을 감소시킨 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 혼합백신은 B형간염표면항원 면역원성의 경우 유효항체 형성율을 90% 이상으로, 기하평균항체가를 270 mIU/mL 이상으로 유지시키면서 마우스 체중감소독성을 10 BWDU/mL이하로 유지할 수 있다.

Description

디프테리아, 파상풍 톡소이드, 정제백일해 및 비형간염표면항원을 포함한 4가 혼합백신 및 그 제조 방법{THE PREPARATION METHOD OF QUADRIVALENT COMBINATION VACCINE INCLUDING DIPHTHERIA TOXOID, TETANUS TOXOID, ACELLULAR PERTUSSIS ANTIGENS AND HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN}

본 발명은 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형간염을 동시에 예방할 수 있는 4가 혼합백신(이하 "DTaPH 혼합백신"이라고 한다) 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

B형간염은 한국을 포함한 동남아시아, 중앙아시아, 아프리카 및 남미 지역에서 주로 발생하고 잠재적으로 간암의 원인이 되는 질병이지만, 면역에 의해 감염으로부터 방어될 수 있으므로 현재 세계보건기구에서는 B형간염 백신을 EPI(Expanded program on immunization) 프로그램에 포함하여 전 세계적인 면역 활동을 벌이고 있다.

B형간염 백신은 과거에는 혈장으로부터 정제하여 제조하였지만, 재조합기술의 발달로 현재는 재조합효모 유래의 값싸고 안전한 B형간염 백신(녹십자 백신(주) 헤파박스진주)이 대량으로 생산되고 있다.

B형간염이 만연한 국가에서는 B형간염의 효율적인 면역을 위해서 현재와 같이 단가 백신 위주의 제제를 탈피할 필요성이 대두되게 되었다.

따라서 전세계 거의 모든 국가의 기초백신이자 세계보건기구의 EPI 프로그램에 포함되어 있는 DTP(디프테리아, 파상풍, 백일해) 백신과 혼합한 혼합백신인 DTaPH를 제조하여 병원에 쉽게 접근할 수 없는 저 개발국가에 공급하고, 또한 백신 가격을 낮춤으로써 이들 백신주사율을 높일 수 있도록 하고 있다(유럽 특허공보 642355, 1998. 7. 15 ; 특허공보 1992-0009729, 주식회사 녹십자).

B형간염표면항원을 포함하는 DTaPH 혼합백신에서 가장 큰 문제점은 단가백신에 비해 B형간염표면항원의 면역원성이 감소되고 독성이 증가된다는 것이다(WHO headquarters, Informal consultation on quadrivalent diphtheria-tetanus- pertussis-hepatitis B vaccine, 1992)

특히, DTaPH 혼합백신에서는 B형간염표면항원의 DTP와의 낮은 양립성(compatibility)으로 인해 그 면역원성이 단가백신 및 각 단가백신의 동시투여방식 보다 낮은 결과를 보이는 문제점이 있다.

본 발명자들은 도 1에 도시한 바와 같이, 혼합백신의 총 단백농도가 증가할수록 마우스 체중 감소 독성이 증가하며, 도 3에 도시한 바와 같이 마우스 체중 감소 독성이 증가할수록 B형간염표면항원의 면역원성이 증가함을 발견하였다.

또한 도 2에 도시한 바와 같이, 알루미늄 하이드록사이드 젤(이하 "알루미늄젤"이라 한다)의 농도가 증가할수록 마우스 체중감소 농도가 증가함을 발견하였다.

이는 혼합백신에 있어서 독성이 증가되는 원인이 첫째, 각 단백질간의 상호작용, 둘째, 각 성분의 충분한 면역원성을 확보하기 위해 사용하는 과량의 알루미늄 흡착제에 기인함을 의미한다.

본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 파상풍 톡소이드의 함량과 알루미늄 흡착제의 함량을 미세 조절하여 DTaPH 혼합백신중 B형간염표면항원의 면역원성을 안정하게 유지시킴과 동시에 마우스 체중감소로 표현되는 독성을 감소시키는 새로운 혼합백신 및 그 제조방법을 제공한다.

도 1은 디프테리아, 파상풍 톡소이드, 정제백일해 및 B형간염표면항원을 포함한 4가 혼합백신(이하 " DTaPH 혼합백신"이라 한다)의 총 단백농도와 마우스 체중감소독성과의 상관관계를 나타낸 그래프.

도 2는 DTaPH 혼합백신의 알루미늄젤 농도와 마우스 체중감소독성과의 상관관계를 나타낸 그래프.

도 3은 마우스 체중감소독성과 DTaPH 혼합백신중 B형간염표면항원의 면역원성의 상관관계를 나타낸 그래프.

도 4는 본 발명의 DTaPH 혼합백신중 B형간염표면항원에 대한 항체의 기하평균치를 시간에 따라 나타낸 그래프.

도 5는 본 발명의 DTaPH 혼합백신중 B형간염표면항원에 대한 유효항체 형성율을 시간에 따라 나타낸 그래프.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 혼합백신은 디프테리아, 파상풍, 백일해및 B형간염의 혼합백신으로 파상풍 톡소이드의 함량이 4 내지 6 Lf/mL 인 것을 특징으로 한다.

전술한 구성에서, 디프테리아, 정제백일해 및 B형간염표면항원의 농도는 각각 30 내지 50 Lf/mL, 10 내지 12 ㎍PN/mL 및 20 내지 24㎍/mL 인 것이 바람직하다(PN은 단백질소(Protein Nitrogen)를 의미한다).

알루미늄젤의 함량은 500 내지 600 ㎍Al/mL 인 것이 바람직하다(Al 젤의 농도는 수산화알루미늄젤 중에서 Al 함량의 농도를 의미한다).

본 발명의 다른 특징은 디프테리아, 파상풍, 백일해, B형간염의 혼합백신의 제조방법으로 (a) 디프테리아 알루미늄젤 흡착액, 파상풍 톡소이드 알루미늄젤 흡착액 및 정제백일해 알루미늄젤 흡착액을 혼합하고, (b) 단계(a)에서 혼합된 흡착액과 B형간염표면항원 알루미늄젤 흡착액을 혼합하는 것으로 이루어진 혼합백신을 제조하는 방법이다.

전술한 구성에서, 파상풍 톡소이드의 함량은 4 내지 6 Lf/mL인 바람직하다.

디프테리아, 정제백일해, B형간염표면항원의 농도는 각각 30 내지 50 Lf/mL, 10 내지 12 ㎍PN/mL 및 20 내지 24㎍/mL 인 것이 바람직하다.

또한, 알루미늄젤의 함량은 500 내지 600 ㎍Al/mL 인 것이 바람직하다.

이하에는 본 발명에 대하여서 상세하게 설명한다.

본 발명에 사용되는 디프테리아 원액은Corynebacterium diphtheriaePark Willium strain을 배양하여 제조한다. 이 배양 상등액에 포르말린을 처리하여 무독화한 후 여과, 침전 및 정제 과정을 거쳐 제조한 디프테리아 톡소이드가 적합하다.또한, 상이한 strain을 사용하여 제조된 디프테리아 원액뿐만 아니라, 이 제조 방법에 의하지 않는 디프테리아 원액도 사용할 수 있다.

파상풍 원액은Clostridium tetaniHarvard strain을 배양하여 제조한다. 이 배양액에 포르말린을 처리하여 무독화 한 후 여과, 침전 및 정제 과정을 거쳐 제조한 파상풍 톡소이드 원액이 적합하다. 또한 상이한 strain을 사용하여 제조된 파상풍 원액뿐만 아니라, 이 제조 방법에 의하지 않는 파상풍 원액도 사용할 수 있다.

정제백일해 원액은Bordetella pertussis를 배양하여 제조한다. 황산암모늄 침전, 자당구배 초 원심분리, 투석 및 미세여과 등의 일련의 방법을 이용하여, 이 배양액의 발열성 물질과 불순물 등을 제거한다. 여기에 포르말린 처리에 의해 무독화하여 제조한 정제백일해 원액이 적합하다. 또한 이 제조 방법에 의하지 않는 정제백일해 원액도 사용할 수 있다.

B형간염표면항원은 B형간염표면항원 유전자로 형질전환된 재조합효모를 배양한 후, 세포파쇄를 통하여 B형간염만을 추출하여, 이온 크로마토그래피, 한외여과, 투석여과, 초원심분리 및 젤 여과 크로마토그래피 등의 일련의 방법을 이용하여 제조한다. 또한 이 제조 방법에 의하지 않는 B형간염뿐만 아니라 혈장 유래의 B형간염표면항원도 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 흡착제로서는 알루미늄젤이 적합하다. 알루미늄젤은 상업적으로 구입할 수도 있고 또한 기 알려진 방법 등을 통해 자체 제조할 수도 있다.

DTaPH 혼합백신은 먼저 디프테리아, 파상풍, 정제백일해, B형간염표면항원등의 각 원액을 알루미늄젤에 완전히 흡착시킨 후 각각의 흡착원액을 각각의 단가백신이 적절한 농도가 되도록 혼합함으로써 제조한다.

이때, DTaPH 혼합백신의 디프테리아 및 파상풍 톡소이드의 함량이 각각 30 내지 50 Lf/mL, 4 내지 6 Lf/mL, 또한 정제백일해 단백농도는 10 내지 12 ㎍PN/mL, B형간염표면항원의 농도는 20 내지 24㎍/mL, 알루미늄젤의 농도가 500 내지 600 ㎍Al/mL이 되도록 제조한다.

상기 방법으로 제조한 본 발명의 혼합백신은 각 백신 성분의 역가가 생물학적 제제기준(식품의약품 안전청, 1999)을 만족하게 되는 것은 물론 독성이 저하되고 B형간염표면항원의 면역원성도 안정하게 유지할 수 있게 된다. 이 때 "안정"이라 함은 혼합백신제조 후 4℃에서 3개월 동안 보관하였을 때 면역원성이 저하되지 않고 일정 또는 초기치 이상으로 유지됨을 뜻한다.

본 제제의 접종량은 1회당 0.5mL이며, 접종방법은 근육 및 피하 주사가 적합하다.

이하 본 발명의 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 구체적으로 기술하나 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 디프테리아 톡소이드 원액의 제조

본 발명에서 사용한 디프테리아 원액은 Corynebacterium diphtheriae Park Willium strain을 배양하여 제조하였다. 이 배양 상등액에 포르말린을 최종 0.9%가 되도록 첨가하여 36C에서 28일간 방치하여 무독화 한 후, 한외여과 및 투석여과, 황산암모늄 침전, 젤 여과 크로마토그래피, 투석에 의하여 정제하여 디프테리아 톡소이드 원액을 제조하였다.

실시예 2 : 파상풍 톡소이드 원액의 제조

파상풍 원액은 Clostridium tetani Harvard strain을 배양하여 제조하였다. 이 배양액에 포르말린을 최종 0.45%가 되도록 첨가하여 36C에서 28일간 방치하여 무독화 한 후, 미세여과, 한외여과 및 투석여과, 황산암모늄 침전, 젤 여과 크로마토그래피, 투석에 의하여 정제하여 파상풍 톡소이드 원액을 제조하였다.

실시예 3 : 정제백일해 원액의 제조

정제백일해 원액은 Bordetella pertussis를 배양하여 제조하였다. 황산암모늄 침전, 자당구배 초 원심분리, 투석 및 미세여과에 의하여 이 배양액의 발열성 물질과 불순물 등을 제거하였다. 여기에 포르말린을 최종 0.6%가 되도록 첨가하여 36C에서 21일 이상 방치하여 무독화 하여 정제백일해 원액을 제조하였다.

실시예 4 : B형간염표면항원 원액의 제조

B형간염표면항원은 재조합 Hansenula polymorpha를 배양한 후, 세포파쇄, 이온 크로마토그래피, 한외여과, 투석여과, 초원심분리 및 젤 여과 크로마토그래피에 의하여 제조하였다.

실시예 5 : 디프테리아, 파상풍 톡소이드 및 정제백일해 흡착액의 제조

디프테리아, 파상풍 톡소이드 및 정제백일해 원액은 각각 알루미늄젤과 혼합 후 교반하여 흡착시킨 후, 필요하면 염화나트륨 등장액으로 희석하였다. 각각의 흡착액은 2 내지 8℃ 냉실에서 혼합백신 제조 전까지 보관하며 최종 흡착액의 단백 및 톡소이드 농도는 적절하게 조정이 가능하지만 디프테리아 톡소이드의 경우 대략500Lf/mL, 파상풍 톡소이드의 경우 대략 50Lf/mL, 정제백일해의 경우 대략 120㎍PN/mL로 조절하였다.

실시예 6 : B형간염표면항원 흡착액의 제조

B형간염표면항원의 면역원성을 높이기 위해 알루미늄젤에 흡착시켰다. 흡착은 적량의 알루미늄젤과 B형간염표면항원을 혼합한 후 교반 함으로써 이루어지고 필요하면 염화나트륨 등장액으로 희석하였다. 제조된 흡착액은 pH를 5 내지 7로 조정한 후에 2 내지 8℃ 냉실에 보관하였다. 최종 흡착액의 B형간염표면항원의 농도는 적절하게 조정 가능하지만 본 발명에서는 대략 72 ㎍/mL이 되도록 조절하였다.

실시예 7 : DTaPH 혼합백신 최종원액의 제조

실시예 1내지 실시예 6을 통하여 제조한 각각의 흡착원액을 DTaPH 혼합백신의 최종원액을 제조하는데 이용하였다.

먼저 디프테리아 알루미늄젤 흡착액, 파상풍 알루미늄젤 흡착액 및 정제백일해 알루미늄젤 흡착액을 혼합한 후, B형간염표면항원 흡착액을 첨가한다. 여기에 알루미늄젤 흡착제를 추가로 넣어 최종 알루미늄젤 농도를 조정하여 아래의 조성으로 이루어진 DTaPH 혼합백신을 각각 제조하였다.

구분	조성 A	조성 B(참고예)
디프테리아 톡소이드(Lf/mL)	30	50
파상풍 톡소이드(Lf/mL)	5	15
정제백일해(㎍PN/mL)	10	12
B형간염표면항원(㎍/mL)	24	24
알루미늄젤(㎍Al/mL)	500	800

본 실시예에서 제조한 DTaPH 최종원액에는 생리식염수 또는 인산염완충액을,방부제로서 치메로살(0.05mg/mL 내지 0.1mg/mL)을 첨가하여 각 원액을 원하는 농도로 조절할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제로서 2-phenoxyethanol(3 내지 6mg/mL)을 첨가할 수 있다. 이때 최종원액의 pH는 6.0 내지 7.0 이다.

시험예 1 : DTaPH 혼합백신 최종원액의 마우스 체중 감소 독성 측정

실시예 7에서 제조한 DTaPH 혼합백신(조성 A, 조성 B)의 독성을 백일해 독성 측정치로 사용되는 마우스체중감소 시험법(생물학적 제제기준, 흡착 디프테리아, 파상풍 톡소이드 및 정제백일해 혼합백신, 5.7항, 1999, 식품의약품 안전청)을 이용하여 "단위 부피 당 마우스체중감소단위(이하 BWDU/mL로 약칭)"로 측정하였다.

그 결과, 조성 A의 경우 독성이 9.6 BWDU/mL로 생물학적 제제기준의 "흡착 디프테리아, 파상풍 톡소이드 및 정제백일해의 혼합백신 5.7항"의 마우스 체중감소 기준인 "10 BWDU/mL 이하"에 적합하게 나타났다.

구분	조성 A	조성 B
마우스 체중감소 독성(BWDU/mL)	9.6	34.2

시험예 2 : DTaPH 혼합백신 최종원액의 B형간염표면항원에 대한 면역원성 측정

실시예 7에서 제조한 DTaPH 혼합백신(조성 A, 조성 B)에서 B형간염표면항원의 면역원성을 측정하기 위하여 4 내지 5주령의 ICR 마우스 30마리에 각 0.5mL을 복부 피하주사 한 후 4주후 채혈하여 Abbott사의 Ausab IMx kit를 이용하여 면역원성, 즉, 기하평균항체가(Ab GMT)및 유효항체가 형성율을 측정하였다. 이때 기하평균항체가는 1mIU/mL 이상인 각 마우스의 항체가의 기하평균치이고, 유효항체가 형성율은 전체 마우스중 10mIU/mL 이상인 마우스의 분율을 의미한다.

도 4, 도 5 및 아래 표에서 볼 수 있듯이 조성 A의 B형간염표면항원의 면역원성(기하평균항체가, 유효항체가 형성율)의 안정성이 조성 B에 비해 현저히 상승되었음을 알 수 있다.

구분	시간(일)
	0	15	45	75	105
기하평균항체가(mIU/mL)	조성 A	351	407	396	376	423
	조성 B	472	553	225	197	150
유효항체가 형성율(%)	조성 A	90	90	97	90	97
	조성 B	100	93	83	83	73

시험예 3 : DTaPH 혼합백신의 역가시험

실시예 7에서 제조한 DTaPH 혼합백신(조성 A, 조성 B)중 디프테리아, 파상풍 정제백일해, B형간염표면항원에 대한 역가시험은 식품의약품 안전청에서 제시하고 있는 "생물학적 제제기준" (흡착 디프테리아, 파상풍 톡소이드 및 정제백일해의 혼합백신, 125 내지 130, 1999 ; B형간염 백신, 310 내지 313, 1999, 식품의약품 안전청)에 따라 측정하였다.

측정 결과 디프테리아, 파상풍 정제백일해 및 B형간염표면항원에 대하여 각각 2-4 units/ml, 4 units/ml이상, 10IU/mL이상, 표준품(녹십자백신(주) 사내 표준품)동등이상으로 상기 생물학적 제제기준에 적합한 것으로 나타났다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명에 따르면, 파상풍 톡소이드 농도와 흡착제인 알루미늄젤 함량을 조절하여 B형간염표면항원의 안정성을 증가시키고 독성을 감소시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 각각의 단가백신원액을 개별적으로 알루미늄젤에 흡착시킨 후 B형간염표면항원의 알루미늄 흡착원액을 혼합함으로써 혼합원액 내 각 항원 및 불순물들의 상호작용에 의한 각 항원의 역가 저하 및 B형간염표면항원의 면역원성에 미치는 영향을 방지할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 제조 방법은 헤모필루스 인플루엔자 비형백신(Hib), 불활화 폴리오백신(IPV) 등의 단가백신을 추가로 혼합하거나, 주사 직전에 혼합한 후 면역할 경우에도 적용이 가능하다

Claims (7)

1. 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형간염의 혼합백신에 있어서,

   30 내지 50Lf/mL의 디프테리아 톡소이드, 4 내지 6Lf/mL의 파상풍 톡소이드, 10 내지 12㎍PN/mL의 정제백일해 단백, 20 내지 24㎍/mL의 B형간염표면항원 및 500 내지 600 ㎍Al/mL의 알루미늄젤을 포함하는 것을 특징으로 하는 혼합백신.
2. 삭제
3. 삭제
4. 디프테리아, 파상풍, 백일해 및 B형간염의 혼합백신을 제조하는 방법에 있어서,

   (a) 30 내지 50Lf/mL의 디프테리아 톡소이드 알루미늄젤 흡착액, 4 내지 6Lf/mL의 파상풍 톡소이드 알루미늄젤 흡착액 및 10 내지 12㎍PN/mL의 정제백일해 단백 알루미늄젤 흡착액을 혼합하고,

   (b) 단계(a)에서 혼합된 흡착액과 20 내지 24㎍/mL의 B형간염표면항원 알루미늄젤 흡착액을 혼합하되, 알루미늄젤의 최종농도가 500 내지 600 ㎍Al/mL가 되도록 하는 것을 특징으로 하는 혼합백신의 제조방법.
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