KR100373776B1

KR100373776B1 - A Composition for Cosmetics

Info

Publication number: KR100373776B1
Application number: KR10-2000-0083067A
Authority: KR
Inventors: 표형배; 이근수; 김태훈; 박성민; 조영호; 이공주
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2003-02-26
Also published as: KR20020053430A

Abstract

본 발명은 피부 노화의 주요 원인이 되는 생체 내적/외적 유해 환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소종 등)에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 피부 세포의 기능을 정상적으로 회복시켜 주는 보호 단백질의 일종인 열충격 단백질(Heat Shock Protein) 분비를 촉진시키는 화장품에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피부 각질층을 구성하고 있는 케라티노싸이트에 대하여 자외선 등의 스트레스로부터 세포를 보호하고 세포의 기능을 회복시켜 주어 피부 세포의 노화 억제 기능이 우수하고, 피부 진피층을 구성하고 있는 섬유아세포에 대하여 생체 대사과정에서 생성되는 프리라디칼 등의 활성산소종에 의한 단백질의 변성, 막 지질의 산화 등으로 인한 세포 괴사를 억제하여 피부 노화를 지연시키는 기능을 가지는 열충격 단백질의 발현을 촉진시키며, 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수 상승 효과가 있는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산을 유효 성분으로 함유하는 피부 화장료에 관한 것이다.The present invention is a kind of protective protein that protects skin cells from stress on the internal and external harmful environment (heat, ultraviolet rays, heavy metals, reactive oxygen species, etc.), which are the main causes of skin aging, and restores the function of skin cells. It relates to cosmetics that promote the release of heat shock protein (Heat Shock Protein). More specifically, the keratinocytes constituting the stratum corneum of the skin protect the cells from stress such as ultraviolet rays and restore the function of the cells, thereby providing excellent anti-aging function of the skin cells to the fibroblasts constituting the dermal layer of the skin. It inhibits cell necrosis due to protein denaturation and oxidation of membrane lipids caused by free radicals such as free radicals generated during metabolic processes, and promotes the expression of heat shock proteins having a function of delaying skin aging. When used in combination with a product (SPF product) relates to a skin cosmetic containing a mistletoe extract, bamboo shoot extract or glucuronic acid as an active ingredient having an effect of increasing the sun protection index.

Description

A composition for cosmetics

본 발명은 피부 미용 작용이 우수한 천연물 함유 화장료에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부 노화의 주요 원인이 되는 생체 내적/외적 유해 환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소 등)에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 피부 세포의 기능을 정상적으로 회복시켜 주는 보호 단백질의 일종인 열 충격 단백질(Heat Shock Protein) 분비를 촉진시키는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피부 각질층을 구성하고 있는 케라티노싸이트에 대하여 자외선 등의 스트레스로부터 세포를 보호하고 세포의 기능을 회복시켜 주어 피부 세포의 광노화 억제 기능이 우수하고, 피부 진피층을 구성하고 있는 섬유아세포에 대하여 생체 대사과정에서 생성되는 프리라디칼 등의 활성산소종에 의한 단백질의 변성, 막 지질의 산화 등으로 인한 세포 괴사(apoptosis)를 억제하여 피부 노화를 지연시키는 기능을 가지는 열충격 단백질(Heat Shock Protein)의 발현을 촉진시키며, 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수 상승 효과가 있는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 및/또는 글루쿠론산을 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a natural product-containing cosmetics having excellent skin cosmetic action, and more particularly to the skin cells from stress on the in vivo / external harmful environment (heat, ultraviolet rays, heavy metals, free radicals, etc.) that are the main causes of skin aging. The present invention relates to a cosmetic composition that promotes secretion of heat shock protein, which is a type of protective protein that protects and restores normal function of skin cells. More specifically, the keratinocytes constituting the stratum corneum of the skin protect the cells from stress such as ultraviolet rays and restore the function of the cells, so that the fibroblasts constituting the dermal layer of the skin are excellent. Heat Shock Protein has the function of delaying skin aging by inhibiting cell necrosis (apoptosis) due to degeneration of protein by free radical species such as free radicals produced by biological metabolism, oxidation of membrane lipids, etc. The present invention relates to a cosmetic composition containing the mistletoe extract, bamboo shoot extract and / or glucuronic acid as an active ingredient that promotes the expression of and has a sunscreen index synergistic effect when used in combination with a sun protection product (SPF product).

HSP70Kda와 HSC70Kda을 포함하는 일련의 열충격 단백질(이하 "HSP"와 혼용함)은 생명체들이 정상적인 범위 이상의 온도 상승에 반응하여 주로 세포질에서 광범위하게 발현하는 일군의 단백질들이다(Bienz and Pelham, 1987; Bond and Schlesinger, 1987; Lindquist, 1986; Ashburner and onner, 1979). 또한 HSP는 환경적 스트레스와 병리적 스트레스 상황에서도 발현된다. 예를 들면 열 충격과 아미노산 유사체, 중금속, 독소, 산화물과 같은 환경 스트레스에 세포가 노출되었을 경우와 바이러스나 박테리아가 세포에 침입할 경우와 같은 병리적 스트레스와 노화나 염증이 세포에 유발되었을 경우 발현된다(Morimoto 등, 1992).A series of heat shock proteins, including HSP70Kda and HSC70Kda (hereafter referred to as "HSP"), are a group of proteins that are widely expressed in the cytoplasm, mainly in response to temperature rises above the normal range (Bienz and Pelham, 1987; Bond and Schlesinger, 1987; Lindquist, 1986; Ashburner and onner, 1979). HSP is also expressed in environmental and pathological stress situations. Expression of cells when pathological stresses such as heat exposure and environmental stresses such as amino acid analogues, heavy metals, toxins, and oxides, and when sensitization or inflammation occur in the cells, such as when viruses or bacteria enter the cell. (Morimoto et al., 1992).

HSP에 대한 연구는 다양한 분야에서 많은 연구들이 이루어지고 있으며, 특히 암, 면역계, 감염성 질환, 자가면역 질환, 백신과 면역치료, 독물학(toxicology) 등에서 활발히 진행 중이다. Li 등(1999)은 골모세포(osteoblast)에 42℃, 45℃, 48℃의 온도로 10분간 열 충격을 가한 결과, 45℃에서 치료한 세포에서 HSP70Kda이 가장 많은 증가를 보였고 세포 방어 기전이 가장 활발함을 보였다. 이러한 방어 기전은 45℃에서 치료한 세포에서 아폽토시스(apoptosis)를 방지할 수 있지만 48℃에서 치료한 세포에서는 그렇지 못함을 의미한다. 또한 초음파 치료시 관절 연골세포 내의 HSP 생성을 증가 시키며, 연골세포를 보호하고 관절 연골을 회복시키는 초음파의 치료적 효과와 밀접한 관계가 있다(Huang 등, 1999). Yoo 등(1999)은 알츠하이머 환자와 다운증후군 환자에 대한 연구에서 알츠하이머 환자의 측두 대뇌피질에서 HSP70Kda의 유의한 증가를 확인하였으며 이는 HSP70Kda이 신경퇴행성 질환에밀접한 영향을 미친다는 것을 의미한다. 최근 연구에서, 뇌졸중이나 간질에 의해 손상 받은 뇌에서 HSP70Kda의 발현이 증가되며, 이는 국소빈혈(ischemia)이나 간질에 의한 손상에 대해 HSP70Kda가 뇌손상을 방어한다는 것을 의미한다(Yenari 등, 1998).There are many studies on HSPs in various fields, particularly in cancer, immune system, infectious diseases, autoimmune diseases, vaccines and immunotherapy, and toxicology. Li et al. (1999) showed that HSP70Kda was the most increased and the cell defense mechanism was the highest in cells treated with osteoblasts at 42 ℃, 45 ℃ and 48 ℃ for 10 minutes. Showed activity. This protective mechanism means that apoptosis can be prevented in cells treated at 45 ° C. but not in cells treated at 48 ° C. In addition, ultrasound therapy increases HSP production in articular chondrocytes, and is closely related to the therapeutic effect of ultrasound to protect chondrocytes and restore articular cartilage (Huang et al., 1999). Yoo et al. (1999) found a significant increase in HSP70Kda in the temporal cerebral cortex of Alzheimer's patients with Down's syndrome, suggesting that HSP70Kda has a close effect on neurodegenerative diseases. In a recent study, HSP70Kda expression was increased in brains damaged by stroke or epilepsy, indicating that HSP70Kda defends against brain injury against ischemia or epilepsy (Yenari et al., 1998).

HSP의 종류를 분자량과 서열 상동성(sequence homology)에 따라 분류하면 104(HSP100 패밀리), 90(HSP90 패밀리), 70(HSP70 패밀리), 60(HSP60 패밀리), 20(HSP27/28 패밀리)로 나뉜다.The types of HSP are classified according to molecular weight and sequence homology into 104 (HSP100 family), 90 (HSP90 family), 70 (HSP70 family), 60 (HSP60 family), and 20 (HSP27 / 28 family). .

HSP100 패밀리에 속하는 단백질은 최근에 그 기능이 알려지고 있는 군으로 드로소필라(Drosophila)를 제외하고는 박테리아부터 진핵세포에 이르기까지 광범위하게 확인되고 있으며 고온에서의 열 저항성에 필요한 단백질로서 효모에서는 HSP70Kda의 기능을 보완하는 것으로 알려져 있다(Snachez 등, 1992).Proteins belonging to the HSP100 family have recently been identified and are widely identified from bacteria to eukaryotic cells, except for Drosophila, and are required for high temperature heat resistance in yeast. It is known to complement the function of (Snachez et al., 1992).

HSP90 패밀리는 세포질(cytosol)과 내형질 세망(reticulum)에서 발견되며 생체 내 기능은 아직 잘 알려져 있지 않지만 인산화 효소나 글루코코르티코이드 수용체와 같은 전사인자(transcription factor)와 결합되어 있는 것이 밝혀졌다. 이러한 단백질과 결합함으로서 HSP90은 이들의 작용을 조절하며, 또한 이러한 단백질들이 적절한 구조를 가질 수 있도록 하여 이들의 기능을 보조한다(Bohn 등, 1995).The HSP90 family is found in the cytosol and in the reticulum, and its in vivo function is not well known, but it has been found to be associated with transcription factors such as phosphatase or glucocorticoid receptors. By binding to these proteins, HSP90 regulates their actions and also aids their function by ensuring that these proteins have the proper structure (Bohn et al., 1995).

HSP60 패밀리는 미토콘드리아에서 제한적으로 발현되고 있으며 몇몇 질병에서 그 발현 정도가 증가하여 질병의 진단 기준으로서의 역할에 관심을 모으고 있다 (Ellis 등, 1991).The HSP60 family is restricted in mitochondria and has increased in its expression in some diseases, drawing attention to its role as a diagnostic criterion for disease (Ellis et al., 1991).

HSP27/28 패밀리는 정상세포와 암세포 모두에서 발현되는 단백질로서 최근에세포의 분화단계에서 중요한 작용을 한다는 사실이 밝혀지고 있으며 약제 내성(drug resistance)에도 중요한 역할을 할 것임이 제시되고 있다(Ciocca 등, 1993).The HSP27 / 28 family is a protein expressed in both normal and cancer cells and has recently been shown to play an important role in the differentiation stage of cells and has been suggested to play an important role in drug resistance (Ciocca et al. , 1993).

HSP70 패밀리는 다른 HSP 패밀리에 비해 유전학적으로나 생화학적인 면으로 가장 잘 밝혀진 단백질이다. HSP70 패밀리는 여러 개의 HSP으로 나누어지며 세포 내 분포 또한 다르다. 항상 발현되고 주로 세포질에 존재하는 열충격 코그네이트(Heat Shock Cognate; HSC70), 미토콘드리아에 존재하는 p75, 관강(lumen)에 분포하고 포도당(glucose)에 반응하는 grp78/BiP, 열충격에 의해 세포질에서 합성되는 유도성 HSP70Kda이 그것들이다(Kiang and Tsokos, 1998). 그 중 급격하게 자극에 반응하여 그 존재 여부가 좌우되는 것은 HSP72(유도성 HSP70Kda)이다(Beckmann 등, 1990). HSP70Kda은 진핵세포와 원핵세포에서 모두 발현되며 보존성이 높은 단백질로 진핵세포 사이에서는 60-78%의 동일성을 보이며 대장균과 진핵세포 사이에서는 40-60%의 동일성을 보이고 있다(Craig, 1985; Lindquist, 1986; Caplan 등, 1993). 또한 HSP70Kda은 자극을 받았을 때에만 급격하고 민감하게 반응하여 상당한 양의 증가를 보이고 회복시기에는 가장 먼저 감소한다(Welch 등, 1986).The HSP70 family is the best known protein, both genetically and biochemically, compared to other HSP families. The HSP70 family is divided into several HSPs and their intracellular distribution is also different. Heat Shock Cognate (HSC70), always expressed and predominantly in the cytoplasm, p75 present in the mitochondria, grp78 / BiP distributed in the lumen and reacting to glucose, synthesized in the cytoplasm by thermal shock These are the inducible HSP70Kda (Kiang and Tsokos, 1998). Among them, HSP72 (inducible HSP70Kda), which suddenly responds to a stimulus, depends on its presence (Beckmann et al., 1990). HSP70Kda is expressed in both eukaryotic and prokaryotic cells and is a highly conserved protein with 60-78% identity between eukaryotic cells and 40-60% identity between E. coli and eukaryotic cells (Craig, 1985; Lindquist, 1986; Caplan et al., 1993). In addition, HSP70Kda responds rapidly and sensitively only when stimulated, showing a significant increase and decreasing first during recovery (Welch et al., 1986).

HSP70Kda의 주요 기능을 살펴 보면 최근 몇 년 동안 HSP의 증가된 발현은 국소빈혈, 고열과 염증, 대사성 질환, 세포와 조직 손상, 노화, 감염과 암을 포함한 다양한 질병과 관련하여 연구되어 왔다. HSP 발현은 단지 세포 손상의 상태를 반영하거나 특별한 병태생리적 상태에서 생존을 위한 적응이 아니라 생리적 스트레스의탐지를 위한 신호로 판단되어 왔으며, 최근에 HSP이 비천연(non-native) 단백질들의 축적(accumulation)과 응집으로 인해 초래되는 세포 손상을 방지하고 세포의 회복 과정에 관여한다는 것이 밝혀졌다.Looking at the main functions of HSP70Kda In recent years, the increased expression of HSP has been studied in connection with various diseases including ischemia, high fever and inflammation, metabolic diseases, cell and tissue damage, aging, infection and cancer. HSP expression has been judged to be a signal for detection of physiological stress, not merely to reflect the state of cell damage or to adapt to survival in particular pathophysiological conditions, and recently HSP accumulates non-native proteins. And to prevent cell damage caused by aggregation and to participate in the cell's recovery process.

HSP70Kda의 기능 중 가장 중요한 기능은 분자 쉐퍼론(molecular chaperone)으로 변성된 다른 효소 단백질과 결합하여 그 적절한 폴딩(folding)을 유지시켜 세포의 손상을 최소화하는 것이다(Morimoto, 1993; Kiang and Tsokos, 1998). 또한 세포막을 통한 단백질 수송이나 단백질 합성과 같은 세포 내 항성성 유지에 중요한 작용을 한다(Moseley, 1998).The most important function of HSP70Kda is to combine with other enzyme proteins denatured by molecular chaperone and to maintain proper folding to minimize cell damage (Morimoto, 1993; Kiang and Tsokos, 1998). ). It also plays an important role in the maintenance of intracellular starbursts such as protein transport through cell membranes and protein synthesis (Moseley, 1998).

HSP70Kda의 또 다른 기능 중 하나는 세포의 사망이 유전자에 프로그램되어 있는 능동적인 과정으로 프로그램된 세포 사멸(programmed cell death)의 한 형태인 아폽토시스(Steller 등, 1995)를 억제하는 것이다. Samali와 Cotter(1996)는 HSP70Kda이 아폽토시스를 억제하고 세포의 생존을 증가시킨다고 하였으며, 이는 HSP70Kda이 단순한 쉐퍼론(chaperone) 기능에서 벗어나 세포의 운명을 결정해 주는 신호 전달 체계에 관여함을 의미한다(안정혁, 1997). 인간 전단구 세포계(Human premonocytic line) U937 세포에서 열충격을 준 세포는 H₂O₂에 의한 미토콘드리아 막의 변화와 돌기(cristate)의 형성을 감소시키며, 이 효과는 HSP70Kda의 발현과 가장 큰 상관관계가 있다는 보고가 있다(Polla 등, 1996). 그리고 고환(testis)에서 특이적으로 발현하는 HSP70Kda을 결손시킨 생쥐에서 고환의 정모세포 (spermatocyte)에 아폽토시스가 생겼고 또한 수컷 배아세포(germ cell)의 감수분열이 억제되어 불임증이 발생하였다(Dix 등, 1996). 양분의 부족, ATP의 결핍, 열 충격, 그리고 미세소관(microtubule)을 파괴하는 약물인 빈블라스틴(vinblastine)은 EAC(Ehrlich ascites carcinoma) 세포에서 아폽토시스를 유발하는데, HSP70Kda은 이러한 자극에 의한 아폽토시스를 억제한다(Gaba 등, 1995).Another function of HSP70Kda is to inhibit apoptosis (Steller et al., 1995), a form of programmed cell death that is an active process in which cell death is programmed into genes. Samali and Cotter (1996) found that HSP70Kda suppresses apoptosis and increases cell survival, which means that HSP70Kda is involved in a signaling system that determines cell fate from simple chaperone function ( Ahn Jung-hyuk, 1997). Thermal shock cells in the human premonocytic line U937 cells reduce the mitochondrial membrane changes and the formation of crite by H ₂ O ₂ , and this effect is most correlated with the expression of HSP70Kda. There is a report (Polla et al., 1996). In mice with HSP70Kda expressing specifically in the testis, apoptosis occurred in the testis's spermatocytes, and meiosis was suppressed in male germ cells, resulting in infertility. 1996). Vinblastine, a drug that destroys nutrients, lacks ATP, heat shock, and microtubules, causes apoptosis in Ehrlich ascites carcinoma (EAC) cells, and HSP70Kda causes apoptosis caused by this stimulus. Inhibit (Gaba et al., 1995).

HSP70Kda은 고온 이외에도 다양한 자극에 의해 발현이 증가함으로 인해 스트레스 유도성 HSP70Kda이라고도 명명되며, 세포의 차원에서 보면 이들 아폽토시스는 크게 하나의 스트레스로 볼 수 있기 때문에 아폽토시스와 HSP과는 밀접한 관계가 있을 것으로 생각되어, 이에 대한 연구 또한 활발히 진행 중이다.HSP70Kda is also called stress-induced HSP70Kda because its expression is increased by various stimuli in addition to high temperature, and since apoptosis can be regarded as a single stress from the cellular level, it is thought to be closely related to apoptosis and HSP. In addition, research on this is being actively conducted.

이와 같은 생체 내부/외부 스트레스에 대해 체내 항상성 유지와 아폽토시스 억제에 관여하는 열충격 단백질 HSP70Kda와 HSC70Kda는 피부 표피층과 진피층에서도 동일한 기능을 수행하여 외부 유해환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소 등)으로부터 피부 노화 현상을 억제시켜 준다.The heat shock proteins HSP70Kda and HSC70Kda, which are involved in maintaining body homeostasis and suppressing apoptosis in response to internal and external stresses in the body, perform the same function in the skin epidermal and dermal layers, thereby preventing Suppresses the aging phenomenon.

이러한 열 충격 단백질에 관한 선행 기술은 화장품 영역에서는 보고된 바 없으며, 제약업계에서 최근 보고되고 있다. 열 충격 단백질에 관련해서는 종양 및 세포성장억제 목적으로 p53 단백질의 활성화(공개특허번호 1995-703986), 박테리아에 의해 유발된 질병의 진단 및 예방, 처리를 위한 방법으로 스트렙토코커스 속(streptcoccus spec.) 유래의 HSP70Kda 계열의 쇼크 단백질(공개특허 1999-022742), 헬리코박터 감염에 대한 면역원 조성물에 함유되는 폴리펩티드 및 전기 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열(공개특허 1996-700342)등이 보고되고 있다.Prior arts regarding such heat shock proteins have not been reported in the cosmetics field and have recently been reported in the pharmaceutical industry. In relation to heat shock proteins, activation of the p53 protein for the purpose of tumor and cell growth inhibition (Patent No. 1995-703986), streptcoccus spec . As a method for the diagnosis, prevention and treatment of diseases caused by bacteria. Shock proteins derived from the HSP70Kda family (Public Patent 1999-022742), polypeptides contained in immunogen compositions for Helicobacter infection, and nucleic acid sequences encoding the electric polypeptides (Public Patent Nos. 1996-700342) have been reported.

본 발명에서 HSP 생성을 촉진시키는 물질로 사용한 겨우살이 추출물에 관해서는 식품 및 제약에서 적용이 다음과 같이 보고되고 있다. 겨우살이 추출물을 첨가하여 발효시킨 유산균 발효물 및 그 제조 방법(공개특허 1997-064384), 한국산 겨우살이로부터 분리된 렉틴 성분을 함유하는 면역 증강용 의약 조성물(공개특허 1999-034024), 겨우살이 추출물을 함유하는 고지혈증 치료제로서 약학 조성물(공개특허 1999-080547), 경구 투여 면역 증강제로서 겨우살이 추출물의 적용(공개특허 2000-048654) 등이 개시되어 있고, 죽순 추출물의 경우, 화장품에서 죽내피 추출물을 함유하는 미백 화장료(공개특허 2000-007943), 죽염 추출물을 함유한 항여드름 피부 외용제(공개특허 2000-019981)로서 적용이 보고되어 있고, 또한, 화장품에서는 우론산과 관련하여 우론산의 섬유아세포 활성 촉진 효과에 대하여 보고된 바 있다(공개특허 1998-033891). 그러나, 열충격 단백질의 발현을 유도함으로써 세포를 보호하고 회복시키는 기능을 하는 화장료에 대한 연구 보고는 전무하다.As for mistletoe extract used as a substance promoting HSP production in the present invention, the application in food and pharmaceuticals has been reported as follows. Lactobacillus fermented product fermented by the addition of mistletoe extract and a method for preparing the same (Public Patent 1997-064384), A pharmaceutical composition for enhancing immune supplement containing a lectin component isolated from Korean mistletoe (Public patent 1999-034024), Contains a mistletoe extract Pharmaceutical composition (public patent 1999-080547) as an antihyperlipidemic agent, application of mistletoe extract as an orally administered immune enhancer (public patent 2000-048654), and the like, in the case of bamboo shoot extract, whitening cosmetics containing bamboo endothelium extract in cosmetics (Public Patent 2000-007943), Application as an anti-acne skin external preparation containing a salt extract of bamboo (Public patent 2000-019981), and also reported in cosmetics on the effect of promoting the fibroblast activity of uronic acid in relation to uronic acid It has been made (public patent 1998-033891). However, there are no research reports on cosmetics that function to protect and restore cells by inducing expression of heat shock proteins.

지금까지 화장품 분야에서는 피부 노화 현상을 억제하기 위해 가장 일반적인 방법으로 피부 내,외부에서 레티놀, 아미노산, 기능성 프로테인 컴프렉스 등 섬유아세포의 활성을 촉진하는 일종의 촉진제(promoter)를 이용하여 피부 노화를 억제 하였으나, 이는 결과적으로 강제적인 피부 섬유아세포의 활성 강화로 진피층의 콜라겐 섬유 다발이 증가되어 미세 주름 및 피부탄력을 개선시켜 주는 효과는 있으나 피부 윤곽이 자연스럽지 못하다는 문제점을 가지고 있다.Until now, the cosmetic field has suppressed skin aging by using a kind of promoter that promotes the activity of fibroblasts such as retinol, amino acids and functional protein complexes in and out of the skin in order to suppress skin aging. This results in an increase in collagen fiber bundles in the dermis due to forced skin fibroblast activity, which improves fine wrinkles and skin elasticity, but has a problem that the skin contour is not natural.

본 발명자들은 피부 윤곽이 자연스럽고 피부 잔주름 및 탄력 개선에 효과가있는 노화 방지 화장품을 개발하기 위해 기존의 피부 섬유아세포의 활성을 촉진하는 촉진제(promoter)를 이용하여 피부 상태를 개선하는 방법이 아닌 생체 내적/외적 유해 환경(열, 자외선, 중금속, 활성산소 등)에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 피부 세포의 기능을 정상적으로 회복시켜 주는 기능이 있는 보호 단백질의 일종인 열 충격 단백질 분비를 촉진시키고자 천연 물질을 적용한 피부 방어 및 회복 개념의 노화 방지 화장료를 개발하게 되었으며, 30종의 천연물을 선정하여 저자극성이며 열 충격 단백질의 발현 촉진 기능이 뛰어난 물질로 탐색된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 및 글루쿠론산이 피부 노화 방지 원료로서의 가능성을 가짐을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors are not a method of improving skin condition by using a promoter that promotes the activity of existing skin fibroblasts in order to develop anti-aging cosmetics that have a natural skin contour and are effective in improving skin wrinkles and elasticity. To promote the secretion of heat shock proteins, a type of protective protein that protects skin cells from stress on internal and external harmful environments (heat, ultraviolet light, heavy metals, free radicals, etc.) and restores normal function of skin cells. We have developed anti-aging cosmetics based on natural skin protection and recovery concept. Mistletoe extract, bamboo shoot extract and glucuronic acid were selected as 30 substances selected as hypoallergenic and excellent in promoting the expression of heat shock protein. This invention is found to have the potential as an anti-aging material for skin and I became holy.

따라서, 본 발명의 목적은 생체의 방어 단백질인 열 충격 단백질의 발현을 촉진시키고자 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산을 이용하고, 이 물질을 함유함을 특징으로 하는 저자극성이며 피부 노화 방지 및 주름 개선에 효과가 있는 화장료를 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to use the mistletoe extract, bamboo shoot extract or glucuronic acid to promote the expression of the heat shock protein, which is a protective protein of the living body, it is hypoallergenic and skin aging prevention To provide a cosmetic that is effective in improving wrinkles.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 생체 내적/외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 생체 보호 및 회복기능이 있는 열 충격 단백질의 발현 촉진 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.The present invention provides a cosmetic composition comprising a component for promoting expression of a heat shock protein having a function of protecting and recovering from a stress against an in vivo / external harmful environment in order to achieve the above object.

또한, 본 발명은 상기 생체 내·외 유해환경이 열 충격, 활성산소종 또는 자외선인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the harmful environment in vivo and external to the heat shock, reactive oxygen species or ultraviolet light.

또한, 본 발명은 상기 열 충격 단백질이 HSP70Kda 또는 HSC70Kda인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the heat shock protein is HSP70Kda or HSC70Kda.

또한, 본 발명은 상기 열 충격 단백질의 발현 촉진 성분이 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 중의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the expression promoting component of the heat shock protein is at least one of mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid.

또한, 본 발명은 상기 겨우살이 추출물 및 죽순 추출물이 추출 용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 벤젠 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In the present invention, the mistletoe extract and bamboo shoot extract is one selected from purified water, methanol, ethanol, glycerine, methyl acetate, ethyl acetate, butylene glycol, propylene glycol, diethyl ether, dichloromethane, benzene and hexane It provides a cosmetic composition characterized in that the extraction using the above solvent.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열·여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 증발 또는 동결건조하여 얻은 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the extract is a liquid obtained by cooling, heating and filtration at room temperature, an extract obtained by further evaporating or lyophilizing the solvent.

또한, 본 발명은 상기 글루쿠론산이 천연물 유래 또는 합성에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the glucuronic acid is derived from natural products or manufactured by synthesis.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the cosmetic composition is selected from a lotion, gel, water-soluble liquid, oil-in-water (O / W) type and water-in-oil (W / O) type formulation.

또한, 본 발명은 상기 겨우살이 추출물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 내지 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the content of the mistletoe extract is 0.001 to 50.0% by weight based on the entire cosmetic composition.

나아가, 본 발명은 상기 죽순 추추물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대하여0.001 내지 50.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the content of the bamboo shoot extract is 0.001 to 50.0% by weight based on the total cosmetic composition.

또한, 본 발명은 상기 글루쿠론산의 함량이 화장료 조성물 전체에 대하여 0.001 내지 10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a cosmetic composition, characterized in that the content of glucuronic acid is 0.001 to 10.0% by weight based on the entire cosmetic composition.

이하 실시예를 참조로 하여 본 발명의 구성 및 효과를 상세히 설명한다.The configuration and effects of the present invention will be described in detail with reference to the following examples.

겨우살이(Viscum album var.)는 중국, 일본, 한국에 널리 분포하는 상록성 기생관목으로 둥지 모양으로 둥글게 자라며 열매가 붉은색으로 익는 것을 붉은 겨우살이라고 한다. 아미린, 루페올, 렉틴, 글루쿠론산등을 함유하고 있으며 민간에서 고혈압, 요통, 동상, 동맥경화 치료제로서 한방에서 사용해오던 재료로서 체내 섭취에 따른 인체 안정성이 이미 확인되어 있다(약초의 성분과 이용, 일월서각, 1994, 문관심/한국의 자원식물, 서울대학교 출판부, 1996, 김태정).Mistletoe (Viscum album var.) Is an evergreen parasitic shrub widely distributed in China, Japan, and Korea. It grows in a nest shape, and ripened red fruit is called red mistletoe. It contains amiline, lupeol, lectin, and glucuronic acid, and it has been used in Korean medicine as a medicine for treating high blood pressure, back pain, frostbite, and atherosclerosis. Lee Yong, Ilwol Seokji, 1994, Mun Gwan Shim / Korea Plant Resources, Seoul National University Press, 1996, Tae-Jung Kim).

죽순(BAMBUSAE CAULIS IN TAENIAM)은 솜대 또는 왕대의 겉껍질을 제거한 중간층으로 죽순 높이가 30cm정도 되는 4월경에 채취하며 아미노산, 베타인, 과당, 글루쿠론산, 지베렐린 등이 함유되어 있다. 죽순은 오래전부터 소염, 발한, 진통, 보약 등의 한방 생약 원료 및 식용으로 널리 사용하여 체내 섭취에 따른 인체 안정성이 이미 확인되어 있다(한약규격주해, 한국메디칼인덱스, 1998, 지형준 / 일본후지죽류식물원보고 12호, 1967).Bamboo shoots (BAMBUSAE CAULIS IN TAENIAM) is an intermediate layer that removes the outer shell of a cotton rod or a king rod. It is harvested in April, about 30cm in height, and contains amino acids, betaine, fructose, glucuronic acid, and gibberellin. Bamboo shoots have been widely used as raw materials and foods for herbal medicines such as anti-inflammatory, sweating, analgesic, and medicines for a long time and have been confirmed to be stable to human body by ingestion (Herbal Medicine Standards, Korea Medical Index, 1998, Geoje Jun / Japan Report 12, 1967).

또한, 글루쿠론산(glucuronic acid)은 화학식 C₆H₁₀O₇(분자량194.1)으로 표현되며, 간에서 생성되는 포도당의 산화산물로 콘드로이친황산 등의 뮤코다당의 주요 구성성분이기도 하며 아스코르빅산 생합성의 중간 물질로서도 존재하고 창질경이(Plantage lanceolate), 차전자(Plantaginis semen), 황금, 허브의 일종인 에티나세아(Echinacea) 등의 식물류의 구성당 및 세포의 협막 다당류에 함유되어 있는 천연물이다. 넓게는 우론산에 포함된다. 식물류의 경우 추출, 분리, 여과, 정제 과정을 통해 글루쿠론산 함유 액상 조성물을 얻을 수 있으나 액상물 자체만으로는 글루쿠론산의 함량이 미미하여 본 발명의 목적인 열 충격 단백질 발현 촉진 효과를 얻기 힘들다. 그리고 일반적으로 화장품에 보습제로 널리 적용중인 히아루론산과 같은 무코다당류(분자량 30만∼100만)는 글루쿠론산(분자량 194.1)에 비해 분자량이 너무 커서 피부 세포막 투과가 일어나지 않으므로 세포막 내에서 일어나는 열 충격 단백질의 발현을 기대할 수 없다. 따라서 열충격 단백질의 발현을 촉진시키는 유효성분, 즉 글루쿠론산의 함량을 선택적으로 높인 물질을 사용하여 피부 세포내 열 충격 단백질의 발현을 촉진시켜 생체 내적/외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 효과적으로 보호함으로서 피부 노화 방지 및 개선 기능을 발휘하고 인체에도 무해하게 사용할 수 있다면 본 발명의 목적에 적합하게 사용할 수 있다.In addition, glucuronic acid is represented by the chemical formula C ₆ H ₁₀ O ₇ (molecular weight 194.1), and is an oxidative product of glucose produced in the liver and is a major component of mucopolysaccharides such as chondroitin sulfate and biosynthesis of ascorbic acid. It is a natural substance that is also present as an intermediate and is contained in the constituent sugars of the plant species such as plant lanceolate, planttaginis semen, gold, and herbaceous echinacea, and the capsular polysaccharide of cells. It is widely included in uronic acid. In the case of plants, a glucuronic acid-containing liquid composition can be obtained through extraction, separation, filtration, and purification processes, but the content of glucuronic acid is insignificant with the liquid alone, so that it is difficult to obtain a heat shock protein expression promoting effect. In addition, mucopolysaccharides such as hyaluronic acid (molecular weight 300,000 to 1 million), which are widely applied as moisturizers in cosmetics, are heat shock proteins that occur in cell membranes because the molecular weight is too large compared to glucuronic acid (molecular weight 194.1) to prevent skin cell membrane penetration. Can not expect the expression. Therefore, by using an active ingredient that promotes the expression of heat shock protein, that is, a substance which selectively increases the content of glucuronic acid, the expression of heat shock protein in skin cells is promoted, thereby effectively preventing skin cells from stress on the in vivo / external harmful environment. It can be used suitably for the purpose of the present invention as long as it protects the skin against aging and improves its function and can be used harmlessly to the human body.

상기와 같은 천연물 및 글루쿠론산의 세포내 열 충격 단백질의 발현 촉진 여부를 확인하고 피부 노화 예방을 위한 화장료로 혼용하기 위하여 다음의 예를 수행하였다.The following example was performed to confirm whether the natural product and the glucuronic acid to promote the expression of the intracellular heat shock protein and to use as a cosmetic for preventing skin aging.

본 발명에 사용하는 겨우살이 추출물로는 겨우살이 건물을 10∼200 메쉬 크기로 분쇄한 겨우살이 분말에 추출용매를 바람직하게는 정제수, 에탄올, 부탄올, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 디에칠에테르, 디클로로메탄, 벤젠 또는 핵산 중에서 선택된 1종 이상을 첨가하여 24시간 이상 냉침한 후 여과, 농축시켜 제조한 추출물이나, 추출용매에 첨가하여 2시간 이상 가온하여 여과, 농축시켜 제조한 추출물을 사용할 수도 있다.As the mistletoe extract used in the present invention, the mistletoe powder crushed mistletoe building into 10 to 200 mesh size is preferably used as an extraction solvent in purified water, ethanol, butanol, methyl acetate, ethyl acetate, butylene glycol, propylene glycol, glycerin, Extract prepared by adding at least one selected from diethether, dichloromethane, benzene, or nucleic acid, followed by cooling for more than 24 hours, followed by filtration and concentration. You can also use

그러나, 어떤 용매를 이용하여 어떤 방법에 따라 추출물을 얻는가 하는 것은 그리 중요하지 않으며, 추출물 중의 유효성분의 함량을 높여 피부 세포내 열 충격 단백질의 발현을 촉진시킴으로써 생체 내적/외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 효과적으로 보호하여 피부 노화 방지 및 개선을 효과적으로 발휘할 수 있을 뿐만 아니라 인체에도 무해하게 사용할 수 있다면 본 발명의 목적에 적합하게 사용할 수 있다.However, it is not very important to determine which solvent is used according to which method, and by extracting the active ingredient in the extract to promote the expression of heat shock proteins in the skin cells, thereby reducing the stress from the harmful effects in vivo and externally. It can be used suitably for the purpose of the present invention if it can effectively protect the skin cells to effectively prevent and improve skin aging and can be used harmlessly to the human body.

본 발명에서 사용하는 겨우살이 추출물은 각 단계별로 얻어진 추출물을 모두 사용할 수 있지만, 어느 단계의 추출물을 본 발명에 따른 조성물에 적용하는가에 따라 소기의 효과를 달성할 수 있는 데 필요한 함량이 달라진다.Mistletoe extract used in the present invention can be used for all the extracts obtained in each step, depending on which step the extract is applied to the composition according to the present invention, the content required to achieve the desired effect is different.

예를 들어, 용매 추출 후 여과하여 바로 수득한 상기 추출물을 사용하는 경우에는 액상을 기준으로 0.05 내지 20.0중량% 함유시키는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만으로 함유시키면 그 효과가 충분치 않아 소기의 목적을 달성할 수 없으며 20.0중량%를 초과하여 함유시키면 함량 증가에 따른 효과의 증가가 없어 비경제적일 뿐 아니라 제품의 안정성이 저하되어 바람직하지 못하기 때문이다. 또한 감압농축장치와 동결건조기를 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킨 농축 추출물의 경우 그에 바람직한 사용 함량은 0.001 ∼ 2.0중량% 범위이다. 이 범위를 벗어나는 경우에는 상기 추출물에 대해 설명한 것과 동일한 문제점이 발생할 수 있다.For example, when using the extract obtained immediately after filtration after solvent extraction, it is preferable to contain 0.05 to 20.0% by weight based on the liquid phase. If the content is less than 0.05% by weight, the effect is not sufficient to achieve the desired purpose. If the content is more than 20.0% by weight, it is not economical and the stability of the product is deteriorated because there is no increase in effect due to the content increase. Because you can't. In addition, in the case of the concentrated extract selectively increased the content of the active ingredient in the concentration through the concentration process using a vacuum concentrator and freeze dryer, the preferred content thereof is in the range of 0.001 to 2.0% by weight. If outside this range, the same problems as described for the extract may occur.

따라서 본 발명에 따른 겨우살이 추출물을 조성물에 적용하여 노화방지 및 주름개선 그리고 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수 상승 효과를 얻기 위해서는 일반적으로 0.001 내지 20.0중량% 범위의 사용량이 요구된다.Therefore, when the mistletoe extract according to the present invention is applied to the composition to be used in combination with anti-aging and wrinkle improvement and anti-aging products (SPF products), a sunscreen index increase effect is generally required in the range of 0.001 to 20.0% by weight. .

본 발명에 사용하는 죽순 추출물로는 죽순 건물을 10∼ 200 메쉬 크기로 분쇄한 죽순 분말에 추출용매를 바람직하게는 정제수, 엔탄올, 부탄올, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 벤젠 및 핵산 중에서 선택된 1종 이상을 첨가하여 24시간 이상 냉침한 후 여과, 농축시켜 제조한 추출물이나, 추출용매에 첨가하여 2시간 이상 가온하여 여과, 농축시켜 제조한 추출물을 사용할 수도 있다.Bamboo shoot extract for use in the present invention is bamboo shoot powder pulverized bamboo shoots 10 to 200 mesh size extraction solvent is preferably purified water, entanol, butanol, methyl acetate, ethyl acetate, butylene glycol, propylene glycol, glycerin Prepared by adding at least one selected from diethyl ether, dichloromethane, benzene, and nucleic acid, cooling for 24 hours, cooling and concentrating, or filtering and concentrating by adding to an extraction solvent, heating for at least 2 hours. Extracts can also be used.

그러나, 어떤 용매를 어떤 방법에 따라 추출물을 얻는가 하는 것은 그리 중 요하지 않으며, 추출물 중의 유효성분의 함량을 높여 피부 세포내 열 충격 단백질의 발현을 촉진 시킴으로서 생체 내적/ 외적 유해 환경에 대한 스트레스로부터 피부 세포를 효과적으로 보호하여 피부 노화 방지 및 개선을 효과적으로 발휘할 수 있을 뿐만 아니라 인체에도 무해하게 사용할 수 있다면 본 발명의 목적에 적합하게 사용할 수 있다.However, it is not important to determine which solvent and how to obtain the extract, and it is important to increase the content of the active ingredient in the extract to promote the expression of heat shock proteins in the skin cells, thereby preventing the skin cells from being stressed against in vivo / external harmful environment. It can be effectively used for the purpose of the present invention if it can effectively protect and prevent skin aging and improve effectively as well as can be used harmless to the human body.

본 발명에서 사용하는 죽순 추출물은 각 단계별로 얻어진 추출물을 모두 사 용할 수 있지만, 어느 단계의 추출물을 본 발명에 따른 조성물에 적용하는가에 따 라 소기의 효과를 달성할 수 있는데 필요한 함량이 달라진다. 예를 들어, 용매 추 출 후 여과하여 바로 수득한 상기 추출물을 사용하는 경우에는 액상을 기준으로0.05 내지 20.0중량% 함유시키는 것이 바람직하다. 0.05중량% 미만으로 함유시키면 그 효과가 충분치 않아 소기의 목적을 달성할 수 없으며 20.0중량%를 초과하여 함유시키면 함량 증가에 따른 효과의 증가가 없어 비경제적일 뿐 아니라 제품의 안정성이 저하되어 바람직하지 못하기 때문이다. 또한 감압농축장치, 동결건조기 등을 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킨 농축 추출물의 경우 바람직한 사용함량은 0.001 내지 2.0중량% 범위이다. 이 범위를 벗어나는 경우에는 상기 추출물에 대해 설명한 것과 동일한 문제점이 발생할 수 있다.Bamboo shoot extract used in the present invention can be used for all extracts obtained in each step, depending on which step the extract is applied to the composition according to the present invention, the content required to achieve the desired effect is different. For example, in the case of using the extract obtained by filtration immediately after solvent extraction, it is preferable to contain 0.05 to 20.0 wt% based on the liquid phase. If the content is less than 0.05% by weight, the effect is not sufficient to achieve the desired purpose. If the content is more than 20.0% by weight, it is not economical and the stability of the product is deteriorated because there is no increase in effect due to the content increase. Because you can't. In addition, in the case of the concentrated extract selectively increased the content of the active ingredient in the concentration through a concentration process using a vacuum condenser, freeze dryer, etc., the preferred content is 0.001 to 2.0% by weight. If outside this range, the same problems as described for the extract may occur.

따라서 본 발명에 따른 죽순 추출물을 조성물에 적용하여 노화방지 및 주름개선 그리고 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용 시 일광 차단 지수 상승 효과를 얻기 위해서는 일반적으로 0.001 내지 20.0중량% 범위의 사용량이 요구된다.Therefore, when the bamboo shoot extract according to the present invention is applied to the composition to be used in combination with anti-aging and wrinkle improvement and anti-aging products (SPF products), the amount of 0.001 to 20.0% by weight is generally required in order to obtain a sun protection index synergistic effect. do.

본 발명에서 사용하는 글루쿠론산은 단일 성분으로, 글루쿠론산의 함량이 선택적으로 증가되어 있으므로 본 발명의 목적에 바람직한 사용함량은 0.001 내지 10.0중량%의 범위이다. 0.001중량% 미만으로 함유시키면 그 효과가 충분치 않아 소기의 목적을 달성할 수 없으며 10.0중량%를 초과하여 함유시키면 함량 증가에 따른 효과의 증가가 없어 비경제적이다.The glucuronic acid used in the present invention is a single component, and since the content of glucuronic acid is selectively increased, the preferred content of the present invention is in the range of 0.001 to 10.0% by weight. If the content is less than 0.001% by weight, the effect is not sufficient to achieve the desired purpose. If the content is more than 10.0% by weight, it is uneconomical because there is no increase in effect due to the content increase.

본 발명의 화장료 조성물은 크림, 연고, 젤, 로션, 화장수 등으로 제형화되어 사용될 수 있으나, 어떤 제형으로 제조하여 사용하는가는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 극히 용이하게 결정될 수 있는 사항이다.The cosmetic composition of the present invention may be formulated into a cream, an ointment, a gel, a lotion, a lotion, or the like, but which formulation is used may be extremely easily determined by those skilled in the art to which the present invention pertains. .

또한, 본 발명의 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산은 로션, 젤, 에센스, 크림, 화장수 등은 각각 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있으며 기초화장품 등에 편리하게 첨가하여 피부 노화 방지 및 개선제로서 사용될 수 있다.In addition, the mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid, lotion, gel, essence, cream, lotion, etc. of the present invention can be easily prepared in any form according to a conventional manufacturing method, and conveniently added to basic cosmetics, etc. It can be used as an anti-aging and improving agent.

일례로서 크림을 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수(W/O)의 크림베이스에 겨우살이 추출물 및/또는 죽순 추출물을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.For example, in the preparation of creams, mistletoe and / or bamboo shoot extracts are contained in a cream base of general oil-in-water (O / W) or water-in-oil (W / O), and include fragrances, chelating agents, pigments, antioxidants, and preservatives. In addition, synthetic or natural materials such as proteins, minerals and vitamins can be used in combination for the purpose of improving the properties.

예시 1 내지 3 및 비교예 1 :겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산 함유 수용성 리퀴드형 화장료의 제조 Examples 1-3 and Comparative Example 1 : Preparation of Mistletoe Extract, Bamboo Shoot Extract or Glucuronic Acid-Containing Water-Soluble Liquid Cosmetic

하기 표 1에 나타낸 바와 같은 조성비로 하기 실시예 1, 2, 3에서 수득한 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 교반기로 혼합, 교반, 탈기시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 수용성 리퀴드를 조성하였다.A water-soluble liquid was prepared by uniformly mixing the composition by stirring, stirring and degassing the mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid obtained in Examples 1, 2, and 3 with a composition ratio as shown in Table 1 below. .

원료명Raw material name 예시 1Example 1 예시 2Example 2 예시 3Example 3 비교예 1Comparative Example 1 에칠렌디아민테트라초산디나트륨Ethylenediaminetetradiacetic acid sodium 0.020.02 0.020.02 0.020.02 0.020.02 DL-판테놀DL-panthenol 0.30.3 0.30.3 0.30.3 0.30.3 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 카르복시비닐폴리머Carboxy Vinyl Polymer 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 잔탄검Xanthan Gum 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 폴리옥시에칠렌60 경화피마자유Polyoxyethylene 60 Cured Castor Oil 0.50.5 0.50.5 0.50.5 0.50.5 트리에탄올아민Triethanolamine 0.20.2 0.20.2 0.20.2 0.20.2 겨우살이추출물Mistletoe Extract 1.61.6 00 00 00 죽순추출물Bamboo Shoot Extract 00 2.52.5 00 00 글루쿠론산 분말Glucuronic Acid Powder 00 00 0.160.16 00 방부제antiseptic 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 향료Spices 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 정제수Purified water 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount

* 글루쿠론산 분말의 함량은 타 천연물에 포함된 글루쿠론산을 제외한 순수 글루쿠론산 분말 함량만을 의미한다.* The content of glucuronic acid powder means only pure glucuronic acid powder content excluding glucuronic acid contained in other natural products.

* 100g중 각 원료 함량을 g단위로 표시함.* Each raw material content in 100g is expressed in g unit.

예시 4 내지 6 및 비교예 2 :겨우살이 추출물, 죽순 추출물 또는 글루쿠론산 함유 수중유(O/W)형 에센스 화장료의 제조 Examples 4 to 6 and Comparative Example 2 : Preparation of mistletoe extract, bamboo shoot extract or glucuronic acid-containing oil-in-water (O / W) type essence cosmetic

하기 표 2에 나타낸 바와 같은 조성비로 하기 실시예 1 내지 3에서 수득한 겨우살이 추출물 및/또는 죽순 추출물을 호모 믹서기로 유화하여 얻은 수중유(O/W)형 노화 방지 에센스 베이스에 교반기로 조성물질을 균일하게 혼합 시키고 탈기 시킴 으로써 수중유형 에센스를 조성하였다.The composition of the oil-in-water (O / W) type anti-aging essence base obtained by emulsifying the mistletoe extract and / or bamboo shoot extract obtained in Examples 1 to 3 with a composition ratio as shown in Table 2 below with a stirrer The oil-in-water essence was formed by uniformly mixing and degassing.

원료명Raw material name 예시 4Example 4 예시 5Example 5 예시 6Example 6 비교예 2Comparative Example 2 에칠렌디아민테트라초산디나트륨Ethylenediaminetetradiacetic acid sodium 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity DL-판테놀DL-panthenol 0.30.3 0.30.3 0.30.3 0.30.3 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 폴리아크릴아미드/C13-14이소파라핀/라우레쓰-7Polyacrylamide / C13-14 Isoparaffin / laureth-7 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 사이크로메치콘Pyromethicone 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 폴리솔베이트20Polysorbate 20 0.70.7 0.70.7 0.70.7 0.70.7 디메칠실록산/메칠실록산코폴리머Dimethylsiloxane / Methylsiloxane Copolymer 2.02.0 2.02.0 2.02.0 2.02.0 초산토코페롤Tocopherol Acetate 0.30.3 0.30.3 0.30.3 0.30.3 카프릴 카프레이트Capryl Caprate 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 겨우살이추출물Mistletoe Extract 1.61.6 00 00 00 죽순추출물Bamboo Shoot Extract 00 2.52.5 00 00 글루쿠론산 분말Glucuronic Acid Powder 00 00 0.160.16 00 방부제antiseptic 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 향료Spices 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 정제수Purified water 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount

예시 7 내지 9 및 비교예 3 :겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 함유 유중수(W/O)형 일소 방지 크림 화장료의 제조 Examples 7 to 9 and Comparative Example 3 : Mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid-containing water-in-oil (W / O) type sunburn cream cosmetic preparation

하기 표 3에 나타낸 바와 같은 조성비로 하기 실시예 1 내지 3에서 수득한 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 호모 믹서기로 유화하여 얻은 유중수(W/O)형 일소 방지 크림 베이스에 교반기로 조성물질을 균일하게 혼합시키고 탈기시킴으로써 유중수형 일소방지 크림을 제조하였다.To the composition ratio as shown in Table 3, the mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid obtained in the following Examples 1 to 3 were emulsified with a homo blender, and the composition was agitated in a water-in-oil (W / O) type anti-burn cream base. Water-in-oil anti-nitrogen creams were prepared by uniformly mixing the materials and degassing.

원료명Raw material name 예시 7Example 7 예시 8Example 8 예시 9Example 9 비교예 3Comparative Example 3 에칠렌디아민테트라초산디나트륨Ethylenediaminetetradiacetic acid sodium 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity DL-판테놀DL-panthenol 0.30.3 0.30.3 0.30.3 0.30.3 1,3-부틸렌글리콜1,3-butylene glycol 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 옥틸메톡시신나메이트Octylmethoxycinnamate 6.06.0 6.06.0 6.06.0 6.06.0 사이크로메치콘Pyromethicone 25.025.0 25.025.0 25.025.0 25.025.0 디메치콘Dimethicone 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 디메치콘 코폴리올Dimethicone Copolyol 4.04.0 4.04.0 4.04.0 4.04.0 초산토코페롤Tocopherol Acetate 0.30.3 0.30.3 0.30.3 0.30.3 염화나트륨Sodium chloride 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 겨우살이추출물Mistletoe Extract 1.61.6 00 00 00 이산화티탄Titanium dioxide 3.03.0 3.03.0 3.03.0 3.03.0 죽순추출물Bamboo Shoot Extract 00 2.52.5 00 00 글루쿠론산 분말Glucuronic Acid Powder 00 00 0.160.16 00 방부제antiseptic 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 향료Spices 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 적량Quantity 정제수Purified water 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount 잔량Remaining amount

아래에서는 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명의 구성을 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에만 한정되는 것이 아님은 분명하다.Hereinafter, the configuration of the present invention through the examples and comparative examples will be described in detail. However, it is obvious that the scope of the present invention is not limited only to the following examples.

실시예 1: 겨우살이 추출물의 제조Example 1: Preparation of Mistletoe Extract

건조시킨 겨우살이 100g을 생약분쇄기로 분쇄하여 10∼200메쉬 크기의 분말로 만들었다. 분말에 40%(V/V) 부틸렌글리콜 수용액 1ℓ를 가하여 상온에서 72시간 냉침한 후, 와트만(Watman) #2 여과지와 진공여과장치를 이용하여 여과하여 수득하였다. 또한, 기계적인 장치를 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킬 수 있는데 이 경우, 여과된 최종 추출액을 50℃ 이하에서 감압농축한 후 동결건조기를 이용 건조함으로서 겨우살이 추출물 7.80g을 수득하였다. 본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용된 추출물은 농축과정을 거치지 않은 액상물 상태의 여과된 최종 추출물이다.100 g of dried mistletoe was ground with a herbal grinding machine to obtain a powder of 10-200 mesh size. 1 L of 40% (V / V) butylene glycol aqueous solution was added to the powder, and the mixture was cooled at room temperature for 72 hours, and then filtered by using a Wattman # 2 filter paper and a vacuum filter. In addition, it is possible to selectively increase the content of the active ingredient in the extract through the concentration process using a mechanical device, in this case, the mistletoe extract 7.80g by concentrating the filtered final extract at reduced pressure below 50 ℃ and using a freeze dryer. Obtained. Extracts used in Examples and Experimental Examples of the present invention are filtered final extracts in the form of liquid without undergoing concentration.

실시예 2: 죽순 추출물의 제조Example 2: Preparation of Bamboo Shoot Extract

건조시킨 죽순 100g을 생약분쇄기로 분쇄하여 10∼200메쉬 크기의 분말로 만들었다. 분말에 40%(V/V) 에탄올 수용액 1ℓ를 가하여 상온에서 72시간 냉침한 후,와트만(Watman) #2 여과지와 진공여과장치를 이용하여 여과하였다. 다만 기계적인 장치를 이용한 농축과정을 통해 추출물 내 유효성분의 함량을 선택적으로 증가시킬 경우, 여과된 최종 추출액을 50℃ 이하에서 감압농축한 후 동결건조기를 이용, 건조함으로서 겨우살이 추출물 5.5g을 수득하였다. 본 발명의 실시예 및 실험예에서 사용된 추출물은 농축과정을 거치지 않은 액상물 상태의 여과된 최종 추출물이다.100 g of dried bamboo shoots were pulverized with a herbal grinding machine to obtain a powder of 10-200 mesh size. 1 L of 40% (V / V) ethanol aqueous solution was added to the powder, and the mixture was cooled at room temperature for 72 hours, and then filtered using a Wattman # 2 filter paper and a vacuum filter. However, in the case of selectively increasing the content of the active ingredient in the extract through the concentration process using a mechanical device, the mistletoe extract 5.5g was obtained by concentrating the filtered final extract under reduced pressure below 50 ℃ using a freeze dryer. . Extracts used in Examples and Experimental Examples of the present invention are filtered final extracts in the form of liquid without undergoing concentration.

실시예 3: 글루쿠론산 수용액의 제조Example 3 Preparation of Aqueous Glucuronic Acid Solution

글루쿠론산 단일 성분으로 상품화되어 있는 건조물 형태의 분말(제조사 : 시그마, 미국)을 0.001 내지 10.0중량% 내에서 순수에 용해하여 이용하였다.Powder in dry form (manufacturer: Sigma, USA), commercialized as glucuronic acid single component, was used by dissolving in pure water within 0.001 to 10.0% by weight.

실시예 4: 각종 천연 활성 성분의 열 충격 단백질(Heat Shock Protein) 발현 비교 실험Example 4 Heat Shock Protein Expression Comparison Experiment of Various Natural Active Ingredients

본 실시예는 본 발명의 목적을 확인하기 위하여 기존에 항산화제 또는 섬유 세포 활성화제 그리고 보습제로서 화장품에 널리 적용중이며 시중에 상품으로 판매중인 천연활성성분들과 실시예 3의 글루쿠론산의 세포 내에서 열 충격 단백질의 발현 여부를 비교 평가한 것이다.In order to confirm the object of the present invention, the present invention is widely used in cosmetics as an antioxidant or a fibrous cell activator and a moisturizer, and the cells of the glucuronic acid of Example 3 and natural active ingredients on the market. To evaluate the expression of heat shock protein in the comparison.

그리고 일반적으로 글루쿠론산이 함유되어 있다고 문헌에 공개되어 있는 대표적인 천연물 2종(히알루론산 1% 수용액, 황금 추출물) 및 아스코르빅산과 글루쿠론산의 세포 내에서 열 충격 단백질의 발현 여부도 비교 평가하였다.In addition, comparative evaluation of the expression of heat shock proteins in the two representative natural products (1% aqueous solution of hyaluronic acid, golden extract), and ascorbic acid and glucuronic acid, which are generally disclosed in the literature, contains glucuronic acid. It was.

대상 천연활성성분으로 마늘 추출물(一丸製藥, 일본), 콩 추출물(一丸製藥,일본), 버드나무 추출물(브룩스, 프랑스), 토마토 추출물(가테포사, 프랑스), 아스코르빅산 분말(로슈, 스위스), 인삼 추출물(바이오랜드, 한국), 히알루론산 1% 수용액(바이오랜드, 한국), 황금 추출물(一丸製藥, 일본)과 본 발명의 글루쿠론산 분말(시그마, 미국)을 선정하였다.Garlic extract (一丸製藥, Japan), soybean extract (一丸製藥, Japan), willow extract (Brooks, France), tomato extract (Gatefossa, France), ascorbic acid powder (Roche, Switzerland) , Ginseng extract (Bioland, Korea), hyaluronic acid 1% aqueous solution (Bioland, Korea), golden extract (一丸製藥, Japan) and glucuronic acid powder of the present invention (Sigma, USA) were selected.

실험 방법은 SRB 어세이를 이용하여 농도별, 배양시간 등을 달리하여 세포 생존여부를 측정하고 각기 천연활성성분에 대한 웨스턴 분석의 방법으로 열 충격 단백질의 발현 및 SDS-PAGE와 오토래디오그래피로 단백질 합성 패턴을 측정하였다. 또한 플로우 사이토미터(flow cytometer)를 이용하여 세포 사멸양상을 측정하였다. 상세 실험 방법은 이하 실시예들에 나타내었다.Experimental method is to measure the cell viability by using the SRB assay by varying the concentration, incubation time and the like, and the expression of heat shock protein and the protein by SDS-PAGE and autoradiography by Western analysis method for each natural active ingredient. The synthetic pattern was measured. In addition, the cell death pattern was measured using a flow cytometer. Detailed experimental methods are shown in the following examples.

열 충격 단백질의 발현을 촉진하는 시료(활성 성분)의 농도가 지나치게 낮을 경우 열 충격 단백질의 발현을 유도하지 못하며, 반대로 시료의 농도가 너무 높을 경우 급격한 세포독성을 유발하여 열 충격 단백질의 발현 유도하지 못한다.When the concentration of the sample (active ingredient) that promotes the expression of the heat shock protein is too low, it does not induce the expression of the heat shock protein. On the contrary, when the concentration of the sample is too high, the expression of the heat shock protein is not induced by the rapid cytotoxicity. can not do it.

실험 결과, 글루쿠론산 분말은 마늘 추출물, 상황버섯 추출물, 버드나무 추출물, 아스코르빅산 분말, 인삼 추출물, 토마토 추출물보다 높은 농도를 처리해도 단백질 회복(protein recovery)이 나타남으로서 세포 생존율이 높아 세포에 독성을 나타내지 않고 열 충격 단백질을 발현시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 그리고, 일반적으로 글루쿠론산이 함유되어 있다고 문헌에 소개되어 있는 히알루론산 1% 수용액과 황금 추출물 역시 단백질 회복이 나타나지 않았다. 히알루론산 수용액의 경우 분자량이 너무 커서 세포막 투과가 불가능해 단백질 회복이 일어나지 않은 것으로 보인다.As a result of experiment, glucuronic acid powder showed higher protein survival even though garlic extract, situation mushroom extract, willow extract, ascorbic acid powder, ginseng extract, tomato extract were treated at higher concentrations. It has been found to be useful for expressing heat shock proteins without showing toxicity. In addition, the hyaluronic acid 1% aqueous solution and the golden extract, which are generally introduced in the literature as containing glucuronic acid, also showed no protein recovery. The aqueous solution of hyaluronic acid is so large that it is impossible to permeate the cell membrane, so protein recovery does not appear.

실시예 5: 세포배양기술을 이용한 피부 안전성 평가 실험Example 5: Skin safety evaluation experiment using cell culture technology

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 얻어진 겨우살이 추출물, 죽순 추출물 및 글루쿠론산의 열 충격 단백질의 발현을 유도하는 농도에서의 피부 안전성을 평가하기 위한 실험으로서 사람의 피부를 구성하고 있는 세포를 이용하여 세포 독성을 평가한 것이다. 비교 대상으로 기존에 항산화제 또는 섬유 세포 활성화제 그리고 보습제로서 화장품에 널리 적용 중이며 시중에 상품으로 판매 중인 것들을 선정하였다.This Example is an experiment for evaluating skin safety at concentrations that induce the expression of the mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid obtained by Examples 1 to 3, and the cells constituting the human skin. Cytotoxicity was assessed using. For comparison, we have selected those that are widely applied in cosmetics as antioxidants or fibrotic activators and moisturizers and are sold as commercial products.

비교 대상 천연 활성성분으로 버드나무 추출물(제조사:브룩스, 프랑스), 토마토 추출물 (제조사:가테포사, 프랑스), 아스코르빅산 분말(제조사:로슈, 스위스)과 본 발명의 실시예 1 내지 3에 의해서 얻어진 액상물 상태의 여과된 겨우살이 추출물 및 죽순 추출물을 선택하였다.Willow extract (manufacturer: Brooks, France), tomato extract (manufacturer: Gatefossa, France), ascorbic acid powder (manufacturer: Roche, Switzerland) and Comparative Examples 1 to 3 of the present invention as natural active ingredients The filtered mistletoe extract and bamboo shoot extract of the obtained liquid state were selected.

본 실시예에 사용된 Hs68 섬유아세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : CRL 1635)로부터 분양받아 사용하였다.The Hs68 fibroblasts used in this example were used for distribution from the ATCC (American Type Culture Collection, Accession No .: CRL 1635).

Hs68 섬유아세포에 대한 세포 독성 평가는 화장품에 적용하기 위한 전 임상 단계에서 실시하는 피부 안전성 평가 방법으로 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산의 세포에 대한 독성의 평가는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.The cytotoxicity test for Hs68 fibroblasts was a skin safety evaluation method for preclinical application. The toxicity of mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid on the cells was evaluated by the following method.

Hs68 섬유아세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5 ml씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 각각의 농도로 처리하고 24시간동안 배양시킨 다음 세포의 생존율을 확인하기 위하여 Skehan(1990)의 술포로다민 B 어세이(Sulforhodamine B assay; 이하 "SRB 어세이")를 변형하여 평가하였다.Dispense 5 ml of Hs68 fibroblasts at a concentration of 1.2 x 10 ⁶ / ml in a 65 mm dish, attach the cells, treat mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid at different concentrations and incubate for 24 hours. Skehan (1990) was evaluated by modifying the Sulforhodamine B assay (hereinafter referred to as "SRB assay") to confirm cell viability.

즉, 24시간 동안 배양된 세포를 회수하여 96웰 플레이트에 2 x 10⁴개의 세포를 넣고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 각 웰에 50 ml의 50% 트리클로로아세트산(TCA)를 넣고 4℃에서 1시간 동안 단백질을 첨전시키고 세척한 다음 24시간 동안 상온에서 건조시켰다. 각각의 웰에 0.4% SRB(1% 아세트산 용액) 용액 200 ml을 넣고 상온에서 30분간 염색시켰다. 염색된 세포의 세척과 건조과정을 거처 각 웰에 10 mM Tris-Cl(pH 10.5)를 200 ml씩 넣고 5분간 잘 흔들어 염색된 단백질을 물에 용해시킨 후 ELISA 측정기(BIO-TEK, USA)로 565nm에서 흡광도를 측정하였다.That is, cells were cultured for 24 hours, 2 x 10 ⁴ cells were put into 96-well plates, incubated for 48 hours at 37 ℃, 50 ml of 50% trichloroacetic acid (TCA) in each well and 4 ℃ Protein was charged and washed for 1 hour at and then dried at room temperature for 24 hours. 200 ml of 0.4% SRB (1% acetic acid solution) solution was added to each well and stained at room temperature for 30 minutes. After washing and drying the stained cells, 200 ml of 10 mM Tris-Cl (pH 10.5) was added to each well, and shaken well for 5 minutes to dissolve the stained protein in water, followed by ELISA measuring instrument (BIO-TEK, USA). Absorbance was measured at 565 nm.

열 충격 단백질의 발현을 촉진하는 시료의 농도는 지나치게 낮을 경우 열충격 단백질의 발현을 유도하지 못하며, 반대로 시료의 농도가 너무 높을 경우 급격한 세포독성을 유발하여 열 충격 단백질의 발현 유도하지 못한다.If the concentration of the sample to promote the expression of heat shock protein is too low does not induce the expression of heat shock protein, on the contrary, if the concentration of the sample is too high, it causes rapid cytotoxicity does not induce the expression of heat shock protein.

실험 결과, 겨우살이 추출물과 죽순 추출물 및 글루쿠론산은 버드나무 추출물, 아스코르빅산 분말, 토마토 추출물보다 높은 농도를 처리해도 세포 생존율이 높아 세포에 독성을 나타내지 않고 열충격 단백질을 발현시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다.As a result, mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid were found to be useful for expressing heat shock protein without high toxicity to cells even when treated at higher concentrations than willow extract, ascorbic acid powder, and tomato extract.

Hs68 섬유아세포에 대한 겨우살이 추출물과 죽순 추출물의 세포 독성을 평가한 결과는 다음과 같다.The cytotoxicity of mistletoe extract and bamboo shoot extract against Hs68 fibroblasts was as follows.

시료sample 세포사멸을 일으키지 않는 최대 농도(중량%)Maximum concentration (% by weight) that does not cause cell death 겨우살이 추출물Mistletoe Extract 1.6중량%1.6 wt% 죽순 추출물Bamboo Shoot Extract 2.5중량%2.5% by weight 글루쿠론산 분말Glucuronic Acid Powder 0.16중량%0.16% by weight 버드나무 추출물Willow extract 0.025중량%0.025% by weight 아스코르빅산 분말Ascorbic Acid Powder 0.005중량%0.005% by weight 토마토 추출물Tomato extract 0.025중량%0.025% by weight

실시예 6: 열 충격(Heat shock)을 처리한 세포에 대한 사멸 방어 효과Example 6: Death Protection Effect on Cells Treated with Heat Shock

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 얻어진 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산이 열 충격에 의한 세포 사멸에 대한 방어 효과를 평가하는 것으로 외부 열 충격으로부터의 생체 보호 효과를 평가한 것이다.In this example, the mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid obtained in Examples 1 to 3 evaluate the protective effect against cell death due to heat shock, thereby evaluating the bioprotective effect from external heat shock.

NIH3T3 세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5ml씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 실시예 5에 의해서 얻어진 세포에 사멸을 일으키지 않는 농도로 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 처리하고 15시간을 기다린 후 이 세포에 열 충격(45℃ 수욕조에 띄워 0, 15, 30, 45, 60분동안 일정 시간 가열)을 다시 가한 후 바로 37℃로 온도를 내리고, 24시간 동안 세포 배양 조건에서 배양하면서 열 충격에 의한 세포사멸 방어 효과를 평가하였다. 이하 세포사멸 방어 효과에대한 평가는 실시예 5의 SRB 어세이법으로 수행하였다.5 ml of NIH3T3 cells were injected at a concentration of 1.2 x 10 ⁶ / ml in a 65 mm culture dish, and the cells were attached, and mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid were added to the cells obtained in Example 5 at a concentration that does not cause death. After 15 hours of treatment, the cells were subjected to a heat shock (heating for a period of 0, 15, 30, 45, 60 minutes in a 45 ° C water bath) and immediately lowered to 37 ° C. The effect of apoptosis protection by heat shock was evaluated while culturing in culture conditions. Evaluation for the effect of apoptosis protection was carried out by the SRB assay of Example 5.

실험 결과, 겨우살이 추출물 1.6 중량%를 처리하였을 때 열 충격으로 인한 세포의 사멸을 막아 세포의 생존율을 증가시킴으로써 강력한 사멸방어 효과를 나타내었으며, 2.5 중량%의 죽순 추출물을 처리한 세포에서도 동일한 세포 사멸방어 효과를 나타내었다. 또한, 0.16 중량%의 글루쿠론산을 처리하였을 때에도 마찬가지의 사멸방어 효과를 나타내었다.Experimental results show that when 1.6% by weight of mistletoe extract was treated, the cell death was prevented by heat shock and the cell survival rate was increased, and the same cell death defense was obtained even when treated with 2.5% by weight of bamboo shoot extract. The effect was shown. In addition, when treated with 0.16% by weight of glucuronic acid showed the same killing protection effect.

이상의 결과는 겨우살이 추출물과 죽순 추출물 및 글루쿠론산이 열 충격에 의해 야기될 수 있는 피부 세포의 사멸을 억제시키거나 세포를 회복시킴으로서 우수한 피부 보호작용이 있음을 나타낸다. 표 5는 시료의 열 충격(Heat shock) 스트레스 방어 효과를 나타내는 결과이다.The above results indicate that mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid have excellent skin protection by inhibiting the death of skin cells or restoring the cells which can be caused by heat shock. Table 5 shows the results of the heat shock stress protection effect of the sample.

열충격(45℃)Thermal Shock (45 ℃) 0분0 min 15분15 minutes 30분30 minutes 45분45 minutes 60분60 minutes 시료처리농도(중량%)Sample processing concentration (% by weight) 대조군Control 100%100% 44%44% 26%26% 0%0% 0%0% 무처리군(0)No treatment (0) 겨우살이 추출물Mistletoe Extract 100%100% 58%58% 38%38% 14%14% 10%10% 1.61.6 죽순 추출물Bamboo Shoot Extract 100%100% 64%64% 60%60% 24%24% 15%15% 2.52.5 글루쿠론산 분말Glucuronic Acid Powder 100%100% 55%55% 36%36% 13%13% 10%10% 0.160.16 버드나무 추출물Willow extract 100%100% 45%45% 10%10% 0%0% 0%0% 0.0250.025 아스코르빅산 분말Ascorbic Acid Powder 100%100% 48%48% 5%5% 0%0% 0%0% 0.0050.005 토마토 추출물Tomato extract 100%100% 45%45% 15%15% 0%0% 0%0% 0.0250.025

% : 세포 생존율%: Cell viability

실시예 7: 과산화수소(HExample 7: Hydrogen Peroxide (H ₂₂ OO ₂₂ )를 처리한 세포에 대한 사멸 방어 효과Effect of apoptosis on cells treated with

본 실시예는 H₂O₂를 처리하여 유도되는 세포 사멸에 대한 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산의 방어 효과를 평가한 것으로 활성산소종에 의한 세포내부 자극에 대한 세포 보호 및 회복효과를 평가한 것이다.This Example evaluates the protective effects of mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid on cell death induced by treatment of H ₂ O ₂ , and evaluates the cellular protection and recovery effect against intracellular stimulation by reactive oxygen species. It is.

NIH3T3 세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5ml씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 실시예 1 내지 3에서 얻어진 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산을 세포에 사멸을 일으키지 않는 농도로 처리하고, 다시 과산화수소(H₂O₂) 0, 1.25, 2.5, 5.0, 10mM로 각각 처리한 후, 24시간 동안 정상조건 하에서 배양하면서 세포 회복을 평가하였다. 이하 세포 생존율 회복에 대한 평가는 실시예 5의 SRB 어세이법으로 수행하였다.Disperse the NIH3T3 cells in 5 mm aliquots at a concentration of 1.2 x 10 ⁶ / ml in a 65 mm culture dish and attach the cells to the cells without killing the mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid obtained in Examples 1 to 3. After treatment with hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) 0, 1.25, 2.5, 5.0, 10mM, respectively, and then cultured under normal conditions for 24 hours to evaluate the cell recovery. Evaluation for the recovery of cell viability below was performed by the SRB assay of Example 5.

실험 결과, 겨우살이 추출물 1.6 중량%을 처리하였을 때 과산화수소(H₂O₂)로 처리된 세포의 사멸을 막아 세포의 생존율에 대한 회복 효과를 나타내었으며, 2.5 중량%의 죽순 추출물을 처리한 세포에서도 동일한 세포 회복 효과를 나타내었다. 또한, 0.16%의 글루쿠론산을 처리하였을 때에도 역시 우수한 세포 회복 효과를 나타내었다.Experimental results showed that the treatment of 1.6% by weight of mistletoe extract prevented the death of cells treated with hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) and showed a recovery effect on the survival rate of the cells, and the same even in cells treated with 2.5% by weight of bamboo shoot extract. Cell repair effect. In addition, when treated with 0.16% glucuronic acid also showed an excellent cell recovery effect.

이와 같은 결과는 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산이 피부에서 프리 라디칼 등의 활성산소종에 의한 세포막 산화 작용을 강력하게 억제함으로서 세포사멸에 대한 방어 효과가 우수하다는 것을 증명하는 것이다(표 6).These results demonstrate that mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid strongly inhibit cell membrane oxidation caused by free radicals such as free radicals in the skin and thus have an excellent protective effect against apoptosis (Table 6). .

H₂O₂(mM)H ₂ O ₂ (mM) 00 1.251.25 2.52.5 5.05.0 1010 시료처리농도(중량%)Sample processing concentration (% by weight) 대조군Control 100%100% 57%57% 32%32% 0%0% 0%0% 무처리군(0)No treatment (0) 겨우살이 추출물Mistletoe Extract 100%100% 72%72% 42%42% 18%18% 0%0% 1.61.6 죽순 추출물Bamboo Shoot Extract 100%100% 77%77% 48%48% 24%24% 0%0% 2.52.5 글루쿠론산 분말Glucuronic Acid Powder 100%100% 74%74% 40%40% 20%20% 0%0% 0.160.16 버드나무 추출물Willow extract 100%100% 56%56% 10%10% 0%0% 0%0% 0.0250.025 아스코르빅산 분말Ascorbic Acid Powder 100%100% 60%60% 5%5% 0%0% 0%0% 0.0050.005 토마토 추출물Tomato extract 100%100% 45%45% 15%15% 0%0% 0%0% 0.0250.025

% : 세포 생존율%: Cell viability

실시예 8: 자외선(UVB)으로 스트레스 처리한 세포에 대한 사멸 방어 효과Example 8 Death Protection Effect on Cells Stressed with Ultraviolet (UVB)

실시예 1 내지 3에서 수득한 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산의 자외선에 대한 광방어 효과와 자외선 스트레스로 야기되는 세포의 사멸 방어 및 회복 효과를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.Experiments were carried out to evaluate the photoprotective effect of mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid obtained in Examples 1 to 3 against the death and protection of cells caused by UV stress.

본 실시예에 사용된 세포는 피부 표피층을 구성하고 있는 케라티노싸이트이다. 케라티노싸이트는 피부의 표피층을 구성하는 주 세포로 기저층(基底細胞)-유극층(有棘細胞)-과립층(顆粒細胞)각질층(角化細胞)으로 분화되면서 생체 체온유지, 피부면역, 항상성 유지 등의 중요한 기능을 하며 특히 자외선, 미생물, 환경오염물질등에 대한 방어작용을 수행한다. 또한 피부 미용학적으로 각질층의 원활한 분화과정(turnover)을 통하여 피부의 매끄러움과 탄력, 미백을 결정하는 인자로 자외선등에 지나치게 노출될 경우 광독성과 광노화를 유발하는 원인이 된다. 따라서 각질층의 자외선에 대한 방어 및 회복 효과는 피부 세포와 단백질의 변성을 막아 피부에 탄력을 부여함으로써 피부 노화를 지연시킬 수 있다.The cells used in this example are keratinocytes constituting the skin epidermal layer. The keratinocytes are the main cells that make up the epidermal layer of the skin and are differentiated into the basal layer, the pole layer, the granule layer and the stratum corneum, thereby maintaining body temperature, skin immunity and homeostasis. It also plays an important role in protecting against ultraviolet rays, microorganisms, and environmental pollutants. In addition, the skin cosmetically through the smooth differentiation process (turnover) of the stratum corneum as a factor that determines the smoothness, elasticity, whitening of the skin is caused to cause phototoxicity and photoaging when excessively exposed to ultraviolet light. Therefore, the stratum corneum's protective and restoring effect against ultraviolet rays can delay skin aging by imparting elasticity to skin by preventing degeneration of skin cells and proteins.

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 수득된 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산의 자외선에 대한 방어효과 및 회복 효과를 평가한 실험으로 실험방법은 다음과 같이 수행하였다.This Example was an experiment to evaluate the protective effect and recovery effect of the mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid obtained in Examples 1 to 3 by the ultraviolet rays was carried out as follows.

케라티노싸이트를 1x10⁶개의 농도로 24 웰 플레이트에 접종하고 24시간동안 안정화시킨 다음 겨우살이 추출물과 죽순 추출물, 글루쿠론산을 케라티노싸이트에 독성을 유발하지 않는 농도로 처리하고 6시간동안 안정시킨 다음 자외선 B를 20-30 mJ/cm으로 조사하고 24시간동안 배양시킨 후 세포 생존율을 평가하여 각각의 자외선 방어 효과를 평가하였다.Inoculate keratinocytes in a 24-well plate at a concentration of 1x10 ⁶ , stabilize for 24 hours, treat mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid at a concentration that does not cause toxicity to keratinocytes, and stabilize for 6 hours. Ultraviolet B was irradiated at 20-30 mJ / cm and incubated for 24 hours, and then evaluated for cell viability by evaluating cell viability.

글루쿠론산과 겨우살이 추출물과 죽순 추출물의 자외선 스트레스에 의한 회복 효과는 다음과 같이 수행하였다. 케라티노싸이트를 1x10⁶개의 농도로 24 웰 플레이트에 접종하고 24시간동안 안정화시킨 다음 자외선 B를 20-30 mJ/cm으로 조사하고 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 세포에 독성을 유발하지 않는 농도로 처리하고 24시간동안 배양한 다음 자외선을 조사한 후의 회복효과를 시료를 투여하지 않은 세포군의 생존율과 비교하여 자외선 스트레스에 의한 세포 회복효과를 평가하였다.UV-recovery effect of glucuronic acid, mistletoe extract and bamboo shoot extract was performed as follows. Inoculate keratinocytes in a 24-well plate at a concentration of 1x10 ⁶ , stabilize for 24 hours, and irradiate UV B at 20-30 mJ / cm, and mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid do not cause cell toxicity. Cell recovery effect by UV stress was evaluated by comparing the recovery effect after treatment with concentration, incubation for 24 hours, and the survival rate of the cell group which did not receive the sample.

세포 생존율의 평가는 실시예 5에 기재된 SRB 어세이로 수행하였다.Evaluation of cell viability was performed with the SRB assay described in Example 5.

실험 결과, 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 각각 처리하고 자외선에 대한 방어 효과를 평가한 결과 유의할 만한 효과를 얻었으며, 자외선을 조사하고 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 처리하여 자외선 스트레스로 인한 세포의 회복효과를 평가한 결과에서는 매우 우수한 결과를 얻었다.Experimental results showed that mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid were treated separately and evaluated for their protective effect against ultraviolet rays.They obtained significant effects, and were treated with ultraviolet rays and treated with mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid. As a result of evaluating the recovery effect of the cells due to the excellent results were obtained.

이와 같은 실험의 결과는 겨우살이 추출물과 죽순 추출물이 피부 표피세포에 대한 회복효과가 우수하여 광노화 및 광독성에 대한 강한 저항력을 나타냄으로써 노화을 지연시키는 화장료에 혼용시 우수한 노화방지 기능을 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.The results of these experiments show that Mistletoe and Bamboo shoot extracts have excellent recovery effect on skin epidermal cells, and thus have a strong resistance to photoaging and phototoxicity. .

구분division 세포손상율(%)Cell damage rate (%) 자외선(UVB)조사UV (UVB) irradiation 41.041.0 열충격(39℃)+ 자외선(UVB)조사Thermal Shock (39 ℃) + Ultraviolet (UVB) Irradiation 2.72.7 겨우살이 추출물+ 자외선(UVB)조사Mistletoe Extract + Ultraviolet (UVB) Irradiation 3.33.3 죽순 추출물+ 자외선(UVB)조사Bamboo shoot extract + UVB irradiation 4.84.8 글루쿠론산 분말 0.16중량% + 자외선(UVB)조사Glucuronic acid powder 0.16% by weight + ultraviolet (UVB) irradiation 3.93.9

실시예 9: HSP70Kda 생성 유도 효과 평가 실험Example 9: HSP70Kda production induction effect evaluation experiment

본 실시예는 실시예 1 내지 3에 의해서 수득된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 및 버드나무 추출물, 아스코르빅산 분말, 토마토 추출물을 독성을 유발하지 않는 농도로 처리하였을 때 열 충격 방어 단백질의 발현 유무를 평가하기 위하여 실시한 것이다.This example shows the effect of heat shock protection protein when the mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid and willow extract, ascorbic acid powder, and tomato extract obtained in Examples 1 to 3 were treated at a concentration that does not cause toxicity. In order to evaluate the presence or absence of expression.

NIH3T3 세포를 65 mm 배양접시에 1.2 x 10⁶/ml의 농도로 5 ml 씩 분주하고 세포를 부착시킨 후 겨우살이 추출물 1.6중량%, 죽순 추출물 2.5중량%, 버드나무 추출물 0.025중량%, 아스코르빅산 분말 0.005중량%, 토마토 추출물 0.025중량%를 각각 처리하고 45℃ 수욕조에 띄워 0, 15, 30, 45, 60분 동안 일정시간 가열한 후 바로 37℃로 온도를 내리고, 24시간 배양하는 동안 HSP70Kda의 발현을 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 평가하였으며, 플로우 사이토미터를 이용하여 세포의 아폽토시스체(apoptotic body)를 DNA의 크기에 따라서 분석하였다.Dispense NIH3T3 cells into a 65 mm culture dish at a concentration of 1.2 x 10 ⁶ / ml, 5 ml each, and attach the cells to the mistletoe extract 1.6 wt%, bamboo shoot extract 2.5 wt%, willow extract 0.025 wt%, ascorbic acid powder 0.005% by weight, tomato extract 0.025% by weight, respectively, and placed in a 45 ℃ water bath heated for a period of time for 0, 15, 30, 45, 60 minutes and then immediately lowered the temperature to 37 ℃, 24 hours of incubation of HSP70Kda Expression was assessed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the apoptotic body of the cells was analyzed according to the size of the DNA using a flow cytometer.

SDS-PAGE는 Bio-Rad사의 미니프로테인 II(Miniprotein II)를 사용하였으며, Leammil(1970)의 방법을 변형하여 사용하였다. 적층용 젤(Stacking gel)은 분리용 젤(separating gel)의 아크릴 아미드의 농도에 구애받지 않고 4%로 만들어 사용하였다. 그 구성은 2.5ml의 적층용 젤 완충액(0.5M Tris-Cl, pH 6.8, 0.4% SDS) 6.17ml의 증류수, 1.33ml의 30% 아크릴아미드 용액(29.2% 아크릴아미드, 0.8% 비스아크릴아미드)이며, 30ml의 10% 암모늄 퍼설페이트(AP)와 10ml의 TEMED로 구성되어 있고 이를 잘 혼합한 후 상온에서 방치하면서 폴리머화(polymerization)시켜 사용하였다.SDS-PAGE used Mini-protein II (Miniprotein II) of Bio-Rad, was used by modifying the method of Leammil (1970). Stacking gel was used to make 4% irrespective of the acrylamide concentration of the separating gel. It consists of 2.5 ml of lamination gel buffer (0.5M Tris-Cl, pH 6.8, 0.4% SDS) 6.17 ml of distilled water, 1.33 ml of 30% acrylamide solution (29.2% acrylamide, 0.8% bisacrylamide) , 30 ml of 10% ammonium persulfate (AP) and 10 ml of TEMED, which was mixed well and left at room temperature to polymerize (polymerization).

실험에 사용된 세포 1x10⁶개에 젤 시료 완충용액(62.5mM tris-HCl, pH 6.8 2.3% SDS, 10% 글리세롤, 5% β-머캡토에탄올) 150ml를 넣고 98℃에서 15분간 가열한 후 로우리 어세이(Lowry assay)로 단백질 정량하고 각 웰에 10mg의 단백질을 로딩하여 분석하였다. 전기이동 완충용액 내에서 35분동안 전개시킨 후 젤을 꺼내어 염색 완충액(staining buffer)에 1시간 이상 담가 염색한 후 단백질의 밴드가 보일 때 세척 완충액(destaining buffer)로 세척하였다.150 ml of gel sample buffer (62.5mM tris-HCl, pH 6.8 2.3% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol) was added to 1x10 ⁶ cells used in the experiment and heated at 98 ° C. for 15 minutes. Protein quantification was performed by a low assay and 10 mg of protein was loaded into each well for analysis. After developing for 35 minutes in electrophoretic buffer, the gel was taken out, soaked in staining buffer for 1 hour or more, and washed with washing buffer when a band of protein was visible.

SDS-PAGE 실시 후 엑스레이 필름에 오토래디오그래피(autoradiography)하여 각 시점에서의 단백질 합성 양상을 관찰하였다.After SDS-PAGE, autoradiography was performed on the X-ray film to observe the protein synthesis at each time point.

동시에 SDS-PAGE 상에서 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)에 블랏팅한 후 HSP70Kda에 대한 항체로 웨스턴 분석방법을 통하여 총 HSP70Kda 단백질을 확인하였다.At the same time, the proteins isolated on the SDS-PAGE were blotted onto the nitrocellulose membrane, and the total HSP70Kda protein was confirmed by Western analysis with an antibody against HSP70Kda.

그 결과 겨우살이 추출물을 처리한 세포군에서 10시간동안 회복시켰을 때 HSP70Kda 단백질의 발현이 나타나기 시작하여 24시간 회복시켰을 때 최대로 합성되는 것이 확인되었다.As a result, the expression of HSP70Kda protein began to appear when recovered for 10 hours in the cell group treated with mistletoe extract, and it was confirmed that the synthesis was maximized when recovered for 24 hours.

플로우 사이토미터 분석은 세포의 DNA에 삽입(intercalation)되는 형광물질인 요오드화 프로피디움(propidium iodide)을 세포에 처리한 후 각각의 세포를 한 개씩 떨어뜨리면서 단색광 레이저(monochrome laser)를 쏘아 세포로부터 나오는 형광을 측정하는 것이다. 이때 형광의 세기를 X축으로 세포수를 Y축으로 히스토그램을 그리면 아폽토시스가 일어난 세포와 정상의 세포를 구분할 수 있다.Flow cytometer analysis is performed by treating a cell with propidium iodide, a fluorescent material intercalated into the DNA of the cell, and then dropping each cell one by one to shoot a monochrome laser to fluorescence from the cell. To measure. At this time, if the fluorescence intensity is plotted on the X-axis and the histogram is plotted on the Y-axis, apoptosis can be distinguished from normal cells.

플로우 사이토미터 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 세포를 트립신으로 처리하여 수집하고 300 ml의 PBS로 풀어준 후 700ml의 에탄올을 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 고정시켰다. 4000rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 수집한 후 150ml의 에탄올과 혼합한 뒤 형광물질인 요오드화 프로피디움 용액(0.04 mg/ml 요오드화 프로피디움, 17.2 unit/ml RNase A를 함유한 PBS) 1ml를 넣어 37℃에서 3시간 30분동안 배양시켰다. 배양후 4000rpm으로 5분간 원심분리하여 형광용액을 분리시키고 PBS로 희석한 후 플로우 사이토미터로 분석하였다.Flow cytometer analysis was performed in the following manner. Cells were collected by trypsin treatment, freed with 300 ml of PBS and then fixed at 4 ° C. for 24 hours with the addition of 700 ml of ethanol. Cells were collected by centrifugation at 4000 rpm for 5 minutes, mixed with 150 ml of ethanol, and then 1 ml of fluorescent propidium iodide solution (0.04 mg / ml propidium iodide, PBS containing 17.2 unit / ml RNase A) was added. Incubated for 3 hours and 30 minutes at ℃. After incubation, the fluorescent solution was separated by centrifugation at 4000 rpm for 5 minutes, diluted with PBS, and analyzed by a flow cytometer.

SDS-PAGE 실험 결과 및 플로우 사이토미터 분석 결과 본 발명의 HSP 발현 촉진성분들인 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산에 의하여 HSP70Kda 단백질의 발현과 함께 세포의 아폽토시스가 현저하게 감소하고 있음을 확인하였다.As a result of SDS-PAGE experiments and flow cytometry analysis, it was confirmed that the apoptosis of the cells was significantly reduced with the expression of HSP70Kda protein by the mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid, which are HSP expression promoting components of the present invention.

죽순 추출물을 2.5중량% 처리한 세포군 및 글루쿠론산을 0.16중량% 처리한 세포군은 모두 3시간 회복시켰을 때부터 HSP70Kda 단백질이 서서히 합성되기 시작하여 24시간 회복시켰을 때 최대의 합성량을 나타내었다. 또한, 겨우살이 추출물을 1.6 중량% 처리한 세포군은 3시간 회복시켰을 때 HSP70Kda 단백질이 서서히 합성되기 시작하여 10시간 회복시켰을 때 최대의 합성량을 나타내었다.The cell group treated with 2.5% by weight of bamboo shoot extract and the cell group treated with 0.16% by weight of glucuronic acid showed the maximum synthesis amount when HSP70Kda protein began to be synthesized gradually from recovery from 3 hours and recovered after 24 hours. In addition, the cell group treated with 1.6% by weight of mistletoe extract showed a maximum synthesis amount when HSP70Kda protein began to be synthesized slowly when recovered for 3 hours and then recovered for 10 hours.

또, 플로우 사이토미터 분석 결과 상기 본 발명의 HSP 발현 촉진성분들에 의한 Hsp70Kda 단백질의 발현과 함께 세포의 아폽토시스가 유의성 있게 감소하고 있음을 확인하였다.In addition, the flow cytometer analysis confirmed that the apoptosis of the cells significantly decreased with the expression of the Hsp70Kda protein by the HSP expression promoting components of the present invention.

이와 같은 결과는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산이 세포에서 HSP70Kda의 발현을 촉진시킴으로서 다음에 오는 스트레스에 의한 세포의 아폽토시스를 억제하여 세포 사멸에 의한 노화 촉진 작용을 효과적으로 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.These results suggest that mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid promote the expression of HSP70Kda in the cells, thereby inhibiting the apoptosis of cells caused by the following stress and effectively inhibiting the aging-promoting action by cell death. will be.

시료sample 농도(중량%)Concentration (% by weight) HSP발현HSP expression 겨우살이 추출물Mistletoe Extract 1.61.6 ++++++++++ 죽순 추출물Bamboo Shoot Extract 2.52.5 ++++++++ 글루쿠론산 분말Glucuronic Acid Powder 0.160.16 ++++++++++ 버드나무 추출물Willow extract 0.0250.025 ++ 아스코르빅산 분말Ascorbic Acid Powder 0.0050.005 ++ 토마토 추출물Tomato extract 0.0050.005 ++

* +∼++: 약함, +++: 보통, ++++: 우수, +++++: 매우 우수+ +++: weak, +++: normal, ++++: excellent, +++++: very good

실시예 10: 자외선(UVB)에 의해 유도된 스트레스로부터 화장료 조성물에 의한 세포 회복 효과 평가 시험Example 10: Evaluation of Cell Recovery Effect by Cosmetic Composition from Stress Induced by Ultraviolet (UVB)

본 실시예는 예시 1 내지 6과 같이 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 혼용하여 사용하였을 경우와 일반 화장료 조성물 비교예 1, 2에 대하여 자외선에 의해 유발되는 광노화 억제 효과를 평가한 실험이다.This example is an experiment evaluating the effect of inhibiting photoaging induced by ultraviolet rays in the case of using a mixture of mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid as in Examples 1 to 6 and the general cosmetic composition Comparative Examples 1 and 2.

실시예 9와 동일한 방법으로 예시 1 내지 6의 화장료 조성물을 처리한 세포들은 SRB 어세이법에 의한 평가 결과, 39℃에서 열 충격후 자외선을 조사한 세포와 유사한 세포 손상 방어 결과가 나타났으며, 비교예 1, 2의 조성물로 처리한 세포에 비해 자외선(UVB) 조사시 세포 손상이 현저히 감소하였다.Cells treated with the cosmetic compositions of Examples 1 to 6 in the same manner as in Example 9 were evaluated by SRB assay, and showed similar cell damage defense results as those irradiated with UV rays after heat shock at 39 ° C. Compared to cells treated with the compositions of Examples 1 and 2, cell damage was significantly reduced upon UVB irradiation.

결국, 하기 표 9 및 10의 결과로부터, 본 발명에 따라 화장료 조성물의 유효 성분으로 사용된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산이 자외선(UVB)에 의한 광독성 방어 효과 즉 광노화 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있다.As a result, from the results of Tables 9 and 10, it was confirmed that mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid used as an active ingredient of the cosmetic composition according to the present invention is excellent in the phototoxic protective effect by ultraviolet light (UVB), that is, the photoaging inhibitory effect. Can be.

시료sample 세포손상율(%)Cell damage rate (%) 비교예 1 + 자외선(UVB)조사Comparative Example 1 + UVB 40.040.0 비교예 1 + 열충격(39℃) + 자외선(UVB)조사Comparative Example 1 + Thermal Shock (39 ° C) + Ultraviolet (UVB) Irradiation 4.24.2 예시 1 + 자외선(UVB)조사Example 1 + UVB irradiation 6.96.9 예시 2 + 자외선(UVB)조사Example 2 + UVB irradiation 9.09.0 예시 3 + 자외선(UVB)조사Example 3 + UV (UVB) irradiation 6.06.0

시료sample 세포손상율(%)Cell damage rate (%) 비교예 2 + 자외선(UVB)조사Comparative Example 2 + Ultraviolet (UVB) Irradiation 39.039.0 비교예 2 + 열충격(39℃)+ 자외선(UVB)조사Comparative Example 2 + Thermal Shock (39 ° C) + Ultraviolet (UVB) Irradiation 8.08.0 예시 4 + 자외선(UVB)조사Example 4 + UV (UVB) irradiation 11.311.3 예시 5 + 자외선(UVB)조사Example 5 + UVB irradiation 13.513.5 예시 6 + 자외선(UVB)조사Example 6 + UVB irradiation 10.510.5

실시예 11: 자외선 방어 효과에 대한 상승 작용 평가 실험Example 11 Synergy Evaluation Experiments on Ultraviolet Protective Effect

본 실시예는 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 함유한 예시 7 내지 9(표 3)의 일소방지크림(자외선 차단제품, SPF 28)과 상기 유효성분이 없는 일반 화장료 조성물 비교예 3에 대하여 자외선 차단지수의 상승 효과를 평가한 실험이다.This example is UV protection against comparative cosmetic composition Comparative Example 3 without sunscreen cream (ultraviolet ray blocking product, SPF 28) of Examples 7 to 9 (Table 3) containing mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid This experiment evaluates the synergistic effect of the blocking index.

200 - 250g의 백색 기니픽 15마리를 제모기를 이용하여 등과 옆구리를 제모한 다음 한쪽 부위에는 수중유(W/O)형 에멀젼 타입의 일소방지 크림(비교예 3)을 도포하고 다른 한쪽에는 동일한 일소방지 크림에 겨우살이 추출물과 죽순 추출물을 각각 혼용한 제품(예시 5, 6)을 도포한 후 멀티포트 태양자외선 시뮬레이터 (Multiport solar UV simulator; Solar light CO, USA)를 이용하여 동일한 조건으로 자외선을 조사한 후 공시험 일소방지 크림 도포 부위와 겨우살이 추출물과 죽순 추출물을 각각 혼용한 일소방지 크림을 도포한 부위에 대한 최소 홍반양을 측정하여 일광차단지수(SPF 수치)에 대한 상승효과를 평가하였다.15 white guinea pigs (200-250g) are epilated on the back and side using a hair removal machine, and then one part is coated with an oil-in-water (W / O) emulsion type anti-fog cream (Comparative Example 3) and the same After applying mistletoe extract and bamboo shoot extract mixed products (examples 5 and 6) on the cream, irradiate ultraviolet rays under the same conditions using a Multiport solar UV simulator (Solar light CO, USA) We evaluated the synergistic effect on sunscreen index (SPF) by measuring the minimum amount of erythema on the site of anti-sun cream application and the site of application of anti-sun cream on which mistletoe extract and bamboo shoot extract were mixed.

평가 결과, 본 발명에 따라 화장료 조성물의 유효 성분으로 사용된 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산을 자외선 차단제품(일소방지제품, SPF 제품)과 혼용하여 사용할 경우 자외선에 대한 차단효과를 각각 10%이상 상승시키는 것으로 밝혀졌다.As a result of the evaluation, when the mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid used as the active ingredients of the cosmetic composition according to the present invention are used in combination with a sunscreen product (anti-nitrogen product, SPF product), the sunscreen effect is 10%. It was found to elevate above.

시료sample 일광차단지수(SPF)Daylight Blocking Index (SPF) 비교예 3Comparative Example 3 2828 예시 7Example 7 3131 예시 8Example 8 3131 예시 9Example 9 3131

실시예 12: 노화 방지 및 주름 개선 화장료의 피부 미용 효과Example 12 Skin Beauty Effect of Anti-Aging and Anti-Wrinkle Cosmetics

예시 4 내지 6, 그리고 예시 4 내지 6에서 타 화장료 구성 성분은 동일하되 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 대신 일반적으로 피부 미용 효과가 널리 알려져 있는 천연 활성 성분을 함유하는 비교예 4(마늘 추출물 3%, 一丸製藥, 일본)와 비교예 5(인삼 추출물 3%, 바이오랜드, 한국)의 피부 미용 효과를 비교, 측정하기 위해 잘 훈련 받은 20 ∼ 40세 여성 패널 20명을 대상으로 1일 2회, 60일 동안 아침 및 저녁에 세안 후 안면에 골고루 사용하게 한 후 5점 평가법에 의해 피부 미용 효과를 평가하였다. 결과를 표 9에 나타내었다. 숫자가 높을수록 긍정적인 효과를 나타낸다.Comparative Examples 4 (garlic extract 3), in which the other cosmetic constituents are the same in Examples 4 to 6, and Examples 4 to 6, which contain natural active ingredients, which are generally known for their skin beauty effects, instead of mistletoe extract, bamboo shoot extract, and glucuronic acid. %, 一丸製藥, Japan) twice a day for 20 well-trained 20 to 40 year old female panelists to compare and measure the skin care effects of Comparative Example 5 (3% ginseng extract, Bioland, Korea) After washing the skin for 60 days in the morning and evening, the facial beauty effect was evaluated by a 5-point evaluation method. The results are shown in Table 9. The higher the number, the more positive the effect.

예시 4(겨우살이 추출물 3.0%)Example 4 (Mistletoe Extract 3.0%) 예시 5(죽순 추출물 3.0%)Example 5 (3.0% bamboo shoot extract) 예시 6(글루쿠론산 분말 0.16%)Example 6 (0.16% glucuronic acid powder) 비교예 4(마늘 추출물 3.0%)Comparative Example 4 (garlic extract 3.0%) 비교예 5(인삼 추출물 3.0%)Comparative Example 5 (3.0% ginseng extract) 피부의 잔주름Fine lines of the skin 4.14.1 3.83.8 4.54.5 3.73.7 3.03.0 피부의 매끄러움Skin smoothness 4.04.0 3.83.8 4.04.0 3.03.0 2.82.8 피부의 보습감Skin moisture 3.23.2 3.23.2 3.03.0 3.33.3 3.73.7 만족도satisfaction 4.14.1 3.83.8 4.04.0 3.43.4 3.33.3

상기 표 12의 결과로부터, 본 발명에 따른 화장료를 피부에 도포하여 사용했을 때 우수한 피부 미용 효과를 발휘함을 확인할 수 있었다.From the results in Table 12, it was confirmed that when the cosmetic according to the present invention is applied to the skin to exhibit an excellent skin cosmetic effect.

상기와 같이, 본 발명의 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 등을 포함하는 열 충격 단백질 발현 촉진 성분은 피부 각질층을 구성하고 있는 케라티노싸이트에 대하여 자외선 등의 스트레스로부터 세포를 보호하고 세포의 기능을 회복시켜 주어 피부 세포의 노화 억제 기능이 우수하고, 피부 진피층을 구성하고 있는 섬유아세포에 대하여 생체 대사과정에서 생성되는 프리라디칼 등의 활성산소종에 의한 단백질의 변성, 막 지질의 산화 등으로 인한 세포 괴사를 억제하여 피부 노화를 지연시키며, 일소 방지 제품(SPF 제품)과 혼용하여 사용시 일광 차단 지수를 상승시키는 효과가 있다.As described above, the heat shock protein expression promoting component, including mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid, etc. of the present invention protects cells from stress such as ultraviolet rays against keratinocytes constituting the stratum corneum and functions of the cells. It has excellent function of inhibiting aging of skin cells, and due to degeneration of proteins and oxidation of membrane lipids by free radicals such as free radicals generated in the process of metabolism of fibroblasts constituting skin dermis layer It suppresses cell necrosis and delays skin aging, and when used in combination with antiseptic products (SPF products), it increases the sunscreen index.

또한, 상기 본 발명의 겨우살이 추출물, 죽순 추출물, 글루쿠론산 등을 포함하는 열 충격 단백질 발현 촉진 성분을 포함하는 화장료 조성물은 피부의 매끄러움, 보습효과 및 만족도, 잔주름 개선효과가 현저하였다.In addition, the cosmetic composition comprising a heat shock protein expression promoting component including the mistletoe extract, bamboo shoot extract, glucuronic acid, etc. of the present invention, the skin smoothness, moisturizing effect and satisfaction, fine wrinkles improvement effect was remarkable.

Claims

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Mistletoe extract, bamboo shoot extract or glue as a component to promote expression of heat shock protein that functions to protect and recover the body from stress against harmful environment such as heat shock, reactive oxygen species or ultraviolet rays. A cosmetic composition comprising curonic acid as an active ingredient.

The cosmetic composition according to claim 2, wherein the heat shock protein is HSP70Kda or HSC70Kda.

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The mistletoe extract according to claim 2, wherein the mistletoe extract comprises at least one solvent selected from purified water, methanol, ethanol, glycerin, methyl acetate, ethyl acetate, butylene glycol, propylene glycol, diethyl ether, dichloromethane, benzene and hexane. Cosmetic composition, characterized in that extracted using.

The cosmetic composition according to claim 7, wherein the extract is a liquid obtained by cooling, heating and filtration at room temperature, and an extract obtained by evaporating or lyophilizing a solvent.

The method of claim 2, wherein the bamboo shoot extract is at least one solvent selected from purified water, methanol, ethanol, glycerin, methyl acetate, ethyl acetate, butylene glycol, propylene glycol, diethyl ether, dichloromethane, benzene and hexane Cosmetic composition, characterized in that extracted using.

The cosmetic composition according to claim 9, wherein the extract is a liquid obtained by cooling, heating and filtration at room temperature, and an extract obtained by evaporating or lyophilizing a solvent.

The cosmetic composition according to claim 2, wherein the glucuronic acid is derived from a natural product or manufactured synthetically.

The cosmetic composition according to any one of claims 2 to 7, wherein the cosmetic composition is selected from a lotion, gel, water-soluble liquid, oil-in-water (O / W) type and water-in-oil (W / O) type. Cosmetic composition, characterized in that.

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The cosmetic composition according to claim 2, 7 or 8, wherein the content of the mistletoe extract is 0.001 to 50.0 wt% based on the total cosmetic composition.

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The cosmetic composition according to claim 2, 9 or 10, wherein the content of the bamboo shoot extract is 0.001 to 50.0 wt% based on the total cosmetic composition.

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The cosmetic composition according to claim 2 or 11, wherein the content of glucuronic acid is 0.001 to 10.0 wt% based on the total cosmetic composition.

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