JPS6058077A - Ｇａｌ１酵母菌プロモ−タ−の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ組換え工業技術の発展により種々な遺伝子の自然
な遺伝情報指定配列を有するノζクチリアの無性生殖が
可能になった。〔スイバーダ　Ｐ−Ｈ−、シャイン　Ｊ
−％マーシャルＪ−Ａ−＋ハクスターＪ−Ｄｏ、および
グツドマンＨ，Ｍ−１「ネイチャー２７０Ｊ　、４８６
−４９４、（１９７７）、および、シャイン　Ｊｏ、ス
イバーグ　Ｐ−Ｈ，、マーシャル　Ｊ’−Ａ、、バクス
ター　、ｊｌ）−およびグツドマン　Ｈ−Ｍ、１ネイチ
ヤー２７０Ｊ　、４９４−４９９（１９７７）；　ケシ
エツト　Ｅｏ、ロズナー　Ａｏ、バーンスタイン　Ｙ、
、ゴレツキ　Ｍ、およびアビズＨ０「核酸研究」９．１
９（１９８１）；ミラー　Ｗ−Ｌｏ、マーシャルＪ、Ａ
、およびバクスターＪ−Ｄ−「Ｊ、生化学Ｊ　２５５゜
７５２１−７５２４（１９８０）参照〕。最近ではＤＮ
Ａ組換え工業技術において異質のタン・ξり質が酵母菌
の中で無性生殖され出現したことが記載されている。酵
母菌の中に異質の遺伝子が出現したことの証拠は、酵母
菌プラスミド媒介体上のサツカロミセス・セレビシェの
中に導入されたうさぎのグロビン遺伝子の生体内での写
しに関する研究から明らかにされた。〔イッグズＪ、Ｌ
）１、ヴアン・デン・バーブＪ０、ヴアン・オビエンＡ
、およびワイズマンＣ１［ネイチャー２８３Ｊ　８３５
−８４０（１９８０）参照。］ 酵母菌の中に異質の遺伝子を最大限に出現させてみよう
として、遺伝子の５７−プロモーフ領域、移動開始およ
び信号はプチド配列が酵母菌ゲノムの類似の領域と取り
換えられた。ウシの成長ホルモンに関して、上記領域が
酵母菌アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）遺伝子
の領域と取り換えられた。完全な長さをもった生物学的
に活動的なウシの成長ホルモン分子が酵母菌の中に生成
された。〔ハイツツマンＲ，Ａ１、ハキイＦ−Ｅ６、レ
バイｙＨ，Ｌ−、−ｆ−ｆルＤ−Ｖ−１７ｙｗ−ラーＧ
、＊−ルＢ、Ｄ、　（−ネイチャー２９５Ｊ　７１７−
７２２（１９８１）参照。〕他のプロモーターも使用さ
れたが、遺伝子の出現はずっと少なかった２−個の強力
なプロモーターを有する能力が酵母菌の中に種々な遺伝
子をかなりの水準で出現させることができるのに非常に
役立っている。

ＧＡＬＩガラクトキナーゼ遺伝子のためのプロモーター
が上記のようなプロモーターであることが発見された。

さらにこのプロモーターはグルコース抑制下にある。従
って、ウシの成長ホルモン、インターフェロン、フレプ
ロレニン、およびプロレニンを含む種々の遺伝子のいず
れも酵母菌に無性生殖させ、酵母菌のシ咀１プロモータ
ーの指示により最大限に出現させることが実用化してい
る。

本発明の目的は所望のタンパク質を出現させるために使
用する酵母菌ガラクトキナーゼ遺伝子のＧＡＬ１プロモ
ーターを有する遺伝組換え物質を提供することである。

本発明のもう一つの目的はガラクトキナーゼ遺伝子以外
の遺伝子が酵母菌の菌体の中に出現することを指示する
ためにこの遺伝子に結合したい旦１プロモーターを有す
るＤＮＡ分節を提供することである。

本発明のさらに別の目的はウシの成長ホルモン、又は他
のポリイゾチドをこれに相当するクシの成長ホルモン遺
伝子、インターフェロン遺伝子、プロレニン遺伝子、プ
レプロレニン遺伝子、又は他の遺伝子に結合した一ＣＡ
ｌｔＣＡｌ−ターを使用して酵母菌の菌体の中に出現さ
せる方法を提供することである。

本発明の別の目的は酵母菌ガラクトキナーゼ遺伝子の−
ＧＡＬＩプロモーターに制御されて所望のポリペプチド
生成物を生成するサツカロミセス・セレビシェの変種株
を提供することである。

本発明の別の目的はＧＡＬＩプロモーターを使うＤ　Ｎ
　Ａ組換え工業技術により酵母の中に例えばウシの成長
ホルモン、インターフェロン、フロレニン、プレプロレ
ニンなどのような生成物を生成１−る方法を提供するこ
とである。

本発明により、所望のポリペプチド生成物を得るための
遺伝子の出現は例えばサツカロミセス・セレビシェのよ
うな酵母菌株のＧＡＬＩプロモーターにより制御される
。ＧＡＬ１プロモーターは酵母含むＤＮＡ分節である。

ＧＡＬＩプロモーターの配列情報は第−表に示される。

上記の特性を有する酵母菌株の構造は大規模な酵母発酵
技術が存在するし、またサツカロミセス・セレビシェが
低毒性でもあるのでポリ慇プチド生成物の商業的生産に
は特に望ましい。

ここに記載の遺伝子工学の方法によって用意された微生
物としては、メリーランド州ロックビル市パークローン
・ドライブ　１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションに現在類けである培養菌が挙げられ
る。これらの培養菌は、コラボラテイメ・リサーチ社に
預けられ、次のようなものがある。

受入れ番号　２０６４３、株名称　ＣＧＹ１９６、預け
た日　１９８２年９月。

受入れ番号　２０６６１、株名称　ＣＧＹ４５７、預け
た日　１９８３年２月。

受入れ番号　２０６６２、株名称　ＣＧＹ４６１、預け
た日　１９８３年２月。

受入れ番号　２０６６３、株名称　ＣＧＹ５２８、預け
た日　１９８３年２月。

酵母菌体中の遺伝子の出現を指示するための酵母菌ゲノ
ムにとって異質の遺伝子に結合したＧＡＬ１プロモータ
ーを含むＤＮＡ分節が提供される。

この分節はＧＡＬＩ遺伝子をｍ　ＲＮ　Ａに写し、次に
このｍＲＮＡを移動させる信号を有する酵母菌ゲノムか
ら取った０、７５５、又は０．８２キロベ一スＤＮＡ分
節であることが好ましい。このＤＮＡの切片にはガラク
トキナーゼの遺伝情報を指定する配列は存在しない。

酵母菌の中に所望のホリイプチド生成物を出現させる方
法では、酵母菌ＧＡμｍプロモーターは生体内で染色体
あるいはプラスミドに含まれるこのポリペプチド生成物
の遺伝子の前に挿入される。

これら媒介体は菌体を別のものにするために使用され、
この新しい遺伝情報はその菌体の中に保持されその子孫
に伝えられる。

ＧＡＬＩプロモーターを使うポリ４プチド生成物の合成
は次のいくつかの理由で有益である、すなわち、 ＧΔ見１プロモーターは強力で、かなりの量のポリペプ
チド生成物の合成をもたら１−０ＧＡＬ　】プロモータ
ー活性は、過度のポリペプチド生成物が菌体にとって毒
性があるので、ポリ４プチド生成物よる有害な影響を及
ぼさないで、酵母菌を増殖させるための酵母菌の炭素源
を変えることにより調節される、 以下に詳細に述べであるように、特別のＤＮＡ分節は酵
母菌ゲノムにとって異質の遺伝子に結合され、サツカロ
ミセス・セレビシェの変種株に入れられると、酵母菌ガ
ラクトキナーゼ遺伝子のＧＡＬＩプロモーターの制御の
下でポリ被プチド生成物を生成する。このサツカロミセ
ス・セレビシェは一般に新しいＤＮＡ組換えプラスミド
で変えられる。このプラスミ自家、エシェリキア・コリ
プラスミ）”　ＢＲ３２２、酵母菌ゲノムとプラスミド
ＤＮＡの　および合成のＤＮＡ連結子から取られたＤＮ
Ａ分節を結紮して作られた。Ｊ、Ｇ−サトクリフ、「コ
ールド・スプリング・ハーバ−・シンポジウム　４３Ｊ
　７７−９０（１９７９）によるプラスミド″ＰＢＲ３
２２の構造は第２表に図式で示されて第２表 Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ 第３表 Ｐ■ｌｌｌ 一般に、外生の遺伝子と結合するプラスミドを作る場合
に、結合力のある末端を形成する、あるいは導入するこ
とを含めたさまざまな技術が使われる。丸くなった末端
が結合できる。もしくは、二つの鎖が別々の位置で開裂
され、それぞれの端部に延長部分を残しておき結合力の
ある末端とし　−て役立つというような方法でプラスミ
ドと遺伝子が開裂されてもよい。また結合力のある末端
が二つの鎖の反対側の端部から核酸を取り除いて、ある
いは反対側の端部に核酸を入れることによって導入され
てもよい。裂かれたＤＮＡ分節を結合するために使用さ
れる方法は、以下恍も述べるように、末端の性質によっ
て左右される。

「丸くなった末端」とは二個の塩基が一組になった末端
を有するＤＮＡ分子を指す。（スガラメラｖ０、ヴアン
・デ・サンプＪ、Ｈ，、およびコラナＨ，Ｇ、　「プロ
セス・ナショナル・アカデミ−・サイエンス　ＵＳＡ　
６７　１４６８−１４７５（１９７０）参照。）ＤＮＡ
の丸くなった末端は約５０μＭＤ　Ｎ　Ａ　５’−末端
部の明白なｋｍを有するＴ４ＤＮＡリガーゼによって結
合してもよい。（スギノＡ０、グツト５マンＨ，Ｍｌ、
ヘイネツカーＨ１Ｌ、、シャインエ１、ポイヤー）１．
Ｖ／０、およびコツツアレリＮ−ｆ（−１［Ｊ、生化学
　２５２Ｊ　３９８７−３９９４（１９７７）参照。） 丸い末端のＤＮＡは例えばＨＨｅＩＩＩのような多数の
ｔｌｆｌＪ　ｌ（Ｍエンドヌクレアーゼのいずれかで開
裂により一生成される。さもなければ、不ぞろいな剪断
、又は例えば差部ＲＩ、旦ｉｎｄｍ、又はＢａｍＨＩの
ような制限酵素によるくい違い切断などが使われるが、
Ｄ　Ｎ　Ａ末端は後で生化学的方法で丸くされなければ
ならない。このような生化学的方法には単独成分特定ヌ
クレアーゼＳ１で培養する方法があるが、以下の記事に
記載されている。すなわち、ユルプリツチＡ１、シャイ
ンＪ０、チャーウィンＪ１、ピクテットＲ１、タイシャ
ーＥ０、ラツターＷｊ、。

およびグツドマンＨ６Ｍ０、「サイエンス１９６Ｊ１３
１３（１９７７）；マニアテイスＩｌｌ　、、ハージソ
ン１−ｉ、Ｇ、、レイシイＥ０、ロウアーＯ０、オコ／
ネルラテイアデイスＡ１、「細胞１５Ｊ　６８７、（１
９７Ｂ）；シェラ−Ｒ６Ｈ０、トマスＴ、Ｌ、、ソーＡ
、Ｓ０、フレインＷ、Ｈ，、ナイルＷ、Ｄ、、プリテン
ｉ（、Ｊ、、およびダビドソンＨ０、「サイエンス１９
６Ｊ　１９７（１９７７）；およびチャーネイＰ、、ｏ
リコデットＭ１、ガリパートＦ０、およびテイオレスＰ
０、「核酸研究５Ｊ　４４７９（１９７８）。もしくは
、丸い末端はＴ　４ＤＮＡポリメラーゼで培養して創り
出せるし〔イタクラに０、ヒロセ゛１“１、クリアＲ０
、リッグズＡ、Ｄ−、ハイネツカーＨ，Ｌ−、ポリバー
Ｆ＃　、およびボイヤーＨ，Ｗ、　「サイエンス１９８
Ｊ１０５６（１９７７）；フレイザ−Ｔ−Ｈ，およびブ
ルースＢ−Ｊ、　ｌプロセス・ナショナル・アカデミ−
・ＵＳＡ　７５Ｊ　５９３６（１９７８）参照〕、エシ
ェリキア・コリＤ　Ｎ　Ａ　ｓＦリメラーゼで培養しで
も創り出せるし〔スイバーグＰ、Ｈ１，シャインＪ２、
マーシャルＪ、Ａ、　、バクスターＪ、Ｌ）−、および
グツドマン）１．Ｍ、［ネイチャー２７０Ｊ　４８６（
１９７７）；ヘラクロンｂ′１、ソーＭ９、およびマツ
カーシーＢ、Ｊ、、ス　ＵＳＡ７５Ｊ　６０１２、（１
９７８）；およびバックマンに０、タラシュンＭ６、オ
ヨヒキルハ−）Ｗｏ、Ｕプロセス・ナショナル・アカデ
ミ−・サイエンス　ＵＳＡ７３Ｊ　４１７４　（１９７
６）参照〕、および逆転写酵素で創り出せるが〔ユルブ
リツチＡ０、シャインＪ０、チャーウィンＪ０、ピクテ
ットＲ８、タイシャーＥ０、ルツターＷ、Ｊ、、および
グツドマンＨ，Ｍ、　［サイエンス　１９６Ｊ　１３１
３（１９７７）参照］、この際チオキシヌクレオチド８
・トリフオスフェートを添加する。

「結合力のある末端」とは、単独線維の末端を有するＤ
ＮＡ分子を指す。単独線維の延長は相互に補足し合い、
逆平行である。〔メルノＪ−Ｅ、、およびディビスＲＬ
Ｗ０、「プロセス・ナショナル・アカデミ−・サイエン
ス・ＵＳＡ６９Ｊ　３３７０−３３７４　（１９７２）
参照。） 塩基対複合体の結合が起こるのは、５′末端のヌクレオ
シドがリン酸塩基を有し、この反対の補足的なヌクレオ
シドが遊離の３′−ヒドロキシ基を有する場合である。

２個のホスホジエステル結合がほとんど同時に行われ、
結合した複合体は相互に転化されるヌクレオシド配列を
有する。

ＤＮＡＫ結合力のある末端を創造するための３種類の一
般的方法がある。

１、独自の配列のくい違い切断を導入する■型制限エン
ドヌクレアーゼでＤＮＡを消化する； ２、線状のＤＮＡ分子を末端デオキシヌクレオチド移転
酵素で処理して、違った割合でＤＮＡ分子を有する３′
−ヒドロキシル末端での４’Ｊ（ｄＡ）とポリ（ａＴ）
あるいはＪ　ＩＪ（ｄＧ）とポ！Ｊ　（ｄＧ）のいずれ
か一方の単独線維の尾部を生成する： ３、丸い末端の分子に連結子を加えるが、これは制限エ
ンドヌクレアーゼ開裂位置を有する短い複合体である。

このような連結子はＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ触媒化丸い末
端結合によってＤＮＡに結合される。この連結子を開裂
する制限酵素で生成物を消化した後、このＤＮＡは結合
力のある末端を有する・これらの方法は、次の記事に例
示されるように周知のことである。すなわち、サドラー
Ｊ　、Ｒ１、ペッツＪ、Ｌ、　、テイクレンバーグＭ０
、ＪラブルＤ、Ｖ、　、　ヤ７スラＤ、Ｇ、、　オヨヒ
カル？−スＭ、Ｈ，、［遺伝子３Ｊ　２１１（１９７８
）；バールＣ９Ｐ０、マリアンに、Ｊ、：クーＲ１、ス
タフィンスキＪ、およびナラングＳ−Ａ、　「遺伝子１
」８１、（１９７６）；およびシェラ−ＲｏＨ，、デイ
ツカーソンＲ１Ｅ０、ボイヤーＨ，Ｗ、、リツダズＡ、
Ｄ、およびイタクラに、「サイエンス　１９６Ｊ　１７
７（１９７７）。

「連結子Ｊとは、長さが６から１４の塩基対の複合した
丸い末端のＤＮＡ分子のことで、結合力のある末端を生
成する制限エンドヌクレアーゼの認識位置を有する。

本発明の好ましい実施態様では、プラスミドは異質の遺
伝子を酵母菌体に導入するための担体としての役割を果
す。しかし、酵母菌に写しのできる分子ならどんなもの
でも使用できるので、プラスミドを使う必要はない。Ｄ
ＮＡ分子はプラスミ知られているものとしてウィルス、
又はコスミドが挙げられるし、あるいは、染色体に結合
することもできる。

組換えプラスミド８、又はプラスミド・キメラは生体内
で構成される。焼きなまして結紮する方法は組換えプラ
スミドを生成するばかりでなく、プラスミド担体を再び
円形にするので、元のプラスミドと異質のＤＮＡを含む
結紮生成物の混合物が得られる。元のプラスミドとシラ
スミド担体および連結異質ＤＮＡから成るＤＮＡキメラ
とだけならば正常に複製をすることができるであろう。

この混合物がバクテリアの変形のために使用される場合
は、プラスミド担体の遺伝子型と異質の遺伝子型の両方
の複製ができるであろう。

バクテリア菌体の変形はバクテリア菌体の混合物に起こ
るが、大部・分は変形しない。変形した菌体の部分のほ
とんどが、あるいは、ある場合は少しだけが組換えプラ
スミドによって変形されたと思われる。ともかく、菌体
全体のうちの極めて僅ＤＮＡキメラ、又は元のプラスミ
ド９を含むノミクチリアだけを単離するために、例えば
抗生物質や重金属に対する耐性などのように元のプラス
ミドに選択的に作用する遺伝子標識が含有される。次に
、菌体は成長抑制物質を含有する寒天培地で培養される
。本発明において変形のためのバクテリアとしてエシェ
リキア・コリが使用されるので、その成長抑制物として
アンピシリンが使用される。

耐性のある遺伝子型を有する菌体だけが生き残る。

もし異質の遺伝子がプラスミド９担体によって変形した
菌体とプラスミド８キメラによって変形した菌体とを識
別できる表現型特性を提供しない場合には、さらに複製
されたプラスミドキメラを複製されたプラスミド担体か
ら単離する工程が必要である。工程には、菌体の溶解お
よび従来の方法によるＤＮＡの単離分離あるいは変形バ
クテリアの無作為選択およびどの菌体が分子キメラを含
有しているかを測定するため変形したものからＤＮＡを
識別することなどがある。これは電気泳動、傾斜遠心分
離、配列分析、又は電子顕微鏡検査などによってＤＮＡ
を物理的に識別することによって行われる。

種々のクローンから菌体が集められ、これら変形物から
プラスミｌ”ＤＮＡが単離される。次に、プラスミ）”
　Ｄ　Ｎ　Ａはいろいろな方法で分析される。

一方法としては、プラスミドを適切な制限酵素で処理し
、得られた切片に異質の遺伝子が存在するか分析する方
法がある。その他の技術方法についてはすでに述べた。

ひとたび組換えプラスミド８がエシェリキア・コリに複
製され単離されると、このエシェリキア・コリは培養さ
れ増殖されるが、組換えプラスミド８はサツカロミセス
・セレビシェ株の変形用に使用される。

本発明で使われるＧＡＩ≧１プロモーターという用語は
’ＧＡＬＩとも表示されるが、この里１遺伝子をｍ　ｋ
’ｌ　Ｎ　Ａに写し、次にこのｍ　ｆ（Ｎ　Ａを移動さ
せるための信号を有する酵母菌ゲノムがら得られた０、
７５５あるいは０．８２キロば−スのいずれかのＤＮＡ
配列であるのが好ましい。ガラクトキナーゼの遺伝情報
を指定する配列はこのＤＮＡの断片には存在しないが、
この断片は異質遺伝子の出現を指示できるし、その規則
はＧＡＬＩ遺伝子の様態に従う。〔Ｓｔ＃ジョンＴ−Ｐ
、およびディビスｈ−ｗ。

１”Ｊ−モル・ビオロジイ　１５２Ｊ　２８５−３１５
（１９８１）参照。〕 本発明で使用されるプロモーターによって促進される前
述のウシ成長ホルモン遺伝子は下垂体前葉製剤で合成さ
れた約２２，０００ダルトンのタンパク質である。この
ホルモンは成人前の成長に必要である。ウシ成長ホルモ
ン（ＢＧＨ）は、最初に２６個のアミノ酸残基のアミの
末端延長を有する前成長ホルモンとして合成された２個
のジスルフィド橋を持った１９１個のアミノ酸から成る
単独のポリペプチドを含有している。〔ミラーＷ、Ｌ−
、マーシャルＪ、Ａ、および）之りスターＪ、Ｄ−ｒＪ
。

生化学２５５Ｊ　７５２１−７５２４（１９８０）；ケ
シエツトＥ０、ロズナーＡ８、ノζ−ンスタインＹ、　
、ゴレツキＭ、およびアビプＨ０「核酸研究９」ＩＱ−
’Ｊ（ＩＣＩＱＲｌｌ）＋に？ｒにｌＩ　ン＃−ソ、ｅ
ＶＲ−ＦビラーーシアソーＡ、およびプロベルＧ、［プ
ロセス　ナショナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳＡ７
４Ｊ　２４３２−２４３６（１９７７）参照。〕本発明
で使用されるプロモーターによって促進される前述のイ
ンターフェロン遺伝子は以下に記載の３糧類のインタフ
エロン遺伝子のいずれのものでもよい。

（α）白血球−白血球あるいはリンパ芽球細胞から誘導
され、ＬｅｉＦＮ又はＩＦＮ−αと表示される。

（ｈ）　繊維芽細胞−線維芽細胞から誘導され、ＦＩＦ
ＮあるいはＩＦＮ−βと表示される。

（Ｃ）免疫−分裂促進剤あるいは抗原刺激リンパ系細胞
から誘導され、ＩＦＮ−γと表示される。

このようなインターフェロンについての記載は以下の文
献中に見られる。

ゴーデルＤ、Ｖ＃、ラングＤ、Ｗ、、トゝレルＴ、Ｊ０
、グロスＭ、、ローンＲ６Ｍ、、マツカントリスＲ１、
スィーパ−，／Ｒ，ｆ（、ｓニルフリツーＦ−Ａ、、イ
エルバートンＥ１、およびダレイＰ、Ｗ、「ネイチャー
２９０Ｊ　２０−２６　（１９８１）。・アレンＧ、お
よびファンタスに、Ｈ，［ネイチャー２８７Ｊ　４０８
−４１１　（１９８０）および前出の文献。

ズーンに、Ｃ０「−サイエンス　２０７Ｊ　５２７−５
２８　（１９８０） マンティＮ、、シュパーツスタインＭ１、ストロ−’）
”−、パナムＳ０、ナガタＳ、およびワイズマンＣ１「
遺伝子　１０Ｊ　１−１０（１９８０）。

ストローリＭ１、ナガタＳ、およびワイズマンＣ０［サ
イエンス　２０９Ｊ　１３４３−１３４７（１９８０）
。

本発明の方法において、プレプロレンニンおよびプロレ
ンニンはそれぞｈ−）’レプロレンニンＤＮＡ物質の単
離によって得られるのが好ましい。プレプロレンニンは
プロレンニンの先行物質である。

プレプロレンニンはＮＡの部分を除去することＫより、
プロレンニンの遺伝情報を指定する遺伝子物質を得るこ
とができた。

本発明によるプレプロレンニンあるいはプロレンニン遺
伝子はプレプロレンニンあるいハフロレンニンそれぞれ
のアミノ酸配列の遺伝子情報を指定するヌクレオチド配
列から成り、プレプロレンニンあるいはプロレンニンを
それぞれ暗号に変えるゲノムＤＮＡの中に存在する干渉
ヌクレオチド配列は含まない。また、これらの遺伝子は
適当な宿主細胞の中に複写する媒介体に耐着して提供さ
れる。

本発明の目的のために、プロレンニン遺伝子はプロレン
ニン分子の遺伝情報を指定するヌクレオチドの配列であ
ると定義されるが、このアミノ酸配列は次の文献に記載
されている［Ｂ、ホルトマン、Ｖ−Ｂ−ベダーセン、Ｈ
，ヤユプソン、Ｄ、カウフマン、およびＧ、ライプラン
ト　［プロセスナショナル　アカデミ−サイエンス　Ｕ
ＳＡ　７４Ｊ２３２１−２３２４　（１９７７）］。

プレプロレンニン遺伝子はプロレンニンの遺伝子情報を
指定するヌクレオチドの配列を有するが、また、プレプ
ロレンニン酵素上に見られるアミノ末端先行物質ポＩＪ
−＜プチドの遺伝子情報を指定するヌクレオチドをさら
に４８個を５′−末端の位置に有する。

本発明の好ましい実施態様において宿主細胞として使用
された酵母菌株はサツカロミセス・セレビシェで、これ
は低毒性で周知の遺伝子特性を有するため普通に研究室
で使われる菌株である。この菌株は大規模に培養するの
が容易である。しかし、実り〕プロモーターを有する本
発明の組換えＤＮＡ物質は、規則を変える酵母菌の突然
変異体を含有するポリペプチド生成物を変形を可能にす
る酵母菌菌体に出現させるために使用される。

サツカロミセス・セレビシェは多数の発芽細胞によって
無性再生する酵母菌である。このような細胞は通常は対
になって、あるいは小さ〜な群をなしている。この種は
通常は生殖細胞が直接無性の細胞の中で生成する二培体
であるが、この種はまたより高い項数性でも培養される
。さらに、サツカロミセス・セレビシェは子のりを形成
するが、各子のうの中に１から４個の球状の生殖細胞を
有する。＝稗の子のりは成熟しても破れない。この酵母
菌は呼吸４１謝作用と同種に強力ｔｒ亮酸作用を有する
。選ばれた菌株には蒸留酒製造業者の酵母菌とパン屋の
酵母菌がある。

酵母菌の大部分は比較的一様な条件で普通の研究室用培
地で培養される。酵母菌の通常発育に必要なものは次の
通りである。

（α）炭素とエネルギー用有機炭素化合物、（ｂ）　タ
ンバク質と核酸の合成用の有機、又は、無機窒素、 （Ｃ）各種ミネラル（極微量の要素を供給する化合物を
含む）、 （ｄ）　たびたび、ビタミンの混合物を添加。

このような発育に必要なものは酵母窒素をベースにした
もの（ディフコから入手できるＹＮＢ）、すなわち、多
数の微量要素、９種のビタミ／、より好みする酵母菌の
成長を刺激する極微量のアミノ酸、およびリン酸カリウ
ム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウ
ムなどの主要ミネラルを含む化学的に定義された培地に
よって与えられる。窒素源は硫酸アンモニウムである。

所望の炭素源が添加されなければならないが、普通その
濃度は０．５−３％である。特に菌株に必要なものがあ
れば、この培地に添加される。培地のｐＨの範囲は普通
ｐＨ３−８である。好ましくは、ｐＨ４，５−６，５で
ある。

本発明の細胞を得るために先ず周知のＤＮＡ組換え技術
を使って所望の遺伝子物質を得て、これを宿主細胞に挿
入し、その後、この宿主細胞は無性生殖される。

酵母菌の中に最後に無性生殖したい遺伝子は第一段階で
第一の源からの遺伝子のメツセンジャーＨＩＩ　Ａを得
ることにより単離されるのが好ましい。

ウシ成長ホルモンの場合、これはウシ下垂体前葉製剤か
ら単離して得られる。メツセンジャーＨＮＡはディージ
ー外の方法（Ｒ−（、、ディリー、Ｊ、Ｉ。

ボート８〕、Ａ、Ｔ、）（、バーンズ、Ｋ、Ｐ、ムリエ
ックス、Ｍ、ヒナ−スタイン、１（、Ｆ、　コールドゝ
〕ζ−ガー、「Ｊ、生化学　２５２．Ｊ　８３１０−８
３１９（１９７７）１により単離され、ポリＡ強化ＲＮ
Ａは、Ｒ−Ｃ，デスロジャ、Ｋ、ｋ（−フリドリチ、お
よびＦｏＭ、ロットマン、「生化学　１４４４３６７−
４３７４（１９７５）に記載の方法によりオリゴ（ａＴ
）セルロースでクロマトグラフィ分析をして得られる。

次に、このメツセンジャーＲＮＡは従来の方法により二
重線維ＤＮＡに変えられる。まず、ＤＮＡの見本がＡＭ
Ｖ逆転写酵素を使用するような従来の組換えＤＮＡ方法
によってメツセンジャー１（ＮＡから作られる。例えば
、Ａ、エフストラテイアデイス、Ｆ、Ｇ、カシアトス、
　ＡｏＭ、マクサム、およびＴ、マニアテイス、「細胞
７」２７９＝２８８（１９７６）、Ｒ，ヒグチ、Ｃ１Ｖ
、バトック、Ｒ，ウオール、およびＷ、サルサー、［プ
ロセス　ナショナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳＡ　
７３Ｊ３１４６−３１５０（１９７６）、ＩＪ−Ｌ、カ
シアン、およびＪ、（３，メイヤーズ「プロセス　ナシ
ョナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳＡ　７３Ｊ　２１
９１−２１９５（１９７６）、Ｍ−Ｐ、ウィッケンズ、
Ｇ−Ｎ、ノーエル、および）（、Ｔ、シムク［Ｊ、生化
学　２５３Ｊ２４８３−２４９５（１９７８）、Ｇ−Ｍ
、ワール、ｌ（、Ａ、パジェットおよびＧ、Ｒ，スタッ
ク、「Ｊ、生化学　２５４Ｊ８６７９−８６８９（１９
７９）に記載の方法がコピイＬＩ　Ｎ　Ａ　（ｃＤＮＡ
）を得るために使用される。１（ＮＡ部分は上記方法の
いずれかを使って当該技術で周知の方法にまり線維を切
って、あるいはウイッケンズ外（１９７８）の方法によ
り熱変性することによりきちんと並べられる。

次に、エシェリキア・コリＤ　ｌｉ　Ａ　、ｅリメラー
ゼエあるいはＡＭＶ逆転写酵素のような酵素を使用し”
〔、上記記載の方法およびＪ、Ｉ、ボート９ン、／Ｊ’
ｌ’、Ｈ，バーンズ、Ｊ、Ｌ、クリストマンおよびＲｏ
Ｇ、ディーソー、「Ｊ、生化学２５３Ｊ８６２９−８６
３９（１９７５）Ｋ記載の方法により、ｃＤＮＡを二重
線維ＤＮＡに変換する。

第三に、合成連結子が従来の方法によりＨｉｎｄｆ■１
あるいはＥｃｏＲＩ合成オリゴヌクレオチド連結子を使
用して二重線維ＤＮＡの両端に付けられるが、従来の方
法としては例えば次のようなものがある。すなわち、Ｒ
ｊ（−シェラ−１Ｔ、Ｌ、）７ｖ’ス、Ａ、Ｓ、ソー、
Ｗ、）Ｉ、フレイン、Ｗ、Ｄ、ナイルス、ｆ（、Ｊ　、
ノリテン、およびＥ、ｌ（、ダビドソン「サイエンス　
１９６１１９７−２００（１９７７’）−Ｔ　Ｈプレイ
ザーおよびＢ、Ｊ、ブルース［プロセス　ナショナル　
アカデミ−サイエンス　ＵＳＡ７５Ｊ５９３６−５９４
０（１９７８）、Ａ、ユルノリツチ、Ｊ、シャイン、む
　チャーゲイン、Ｒ，ピクテット、Ｅ、タイシャー、　
ＩＮ、Ｊ、ルッターおよびＨ，Ｍ−グツトマン、「サイ
エンス１９６Ｊ　１３１３−１３１９（１９７７）、Ｊ
。

シャイン、Ｐ、Ｈ，スイパーグ、Ｊ−Ａ、マーシャル、
Ｊ、Ｄ−バクスターおよびＨｌＭ、グツドマン「ネイチ
ャー２７０Ｊ４９４−４９９（１９７７）、又はＰ、Ｈ
，スイバーグ、Ｊ、シャイン、Ｊ、Ａ、マーシャル、Ｊ
−Ｄ、バクスターおよびＨ，Ｍ、グツトマン「ネイチャ
ー２７０ｊ　４８６−４９４（１９７７）。

第四に、ＤＮＡ分子は染色体に合成されるか、あるいは
当該技術で周知のプラスミド、ウィルス、又はコスミド
などの媒介体に句けられる。このような媒介体には次の
ようなものがある。

ＰＢＲ３２２（Ｆ、　ポリバー、ｌ（、Ｌ、ロドリグズ
、Ｐ、Ｊ、グリーン、Ｍ−Ｃ，ベトラッチ、ｌ（、Ｌ、
ヘイネカー、Ｈ，Ｗ、ボイヤー、Ｊ−Ｈ，クロサ、Ｓ、
フォルコラ、１９７７ｒ遺伝子２Ｊ　９５−１１９）Ｐ
ＭＢ９　（Ｒ−Ｌ、ロドリダズ、Ｆ、ポリバラ、ＨｌＭ
、グア）−ｖｙ、Ｈ，Ｊボイ−？−１Ｍ、０．−！　）
　ラッチ「遺伝子出現の制御における分子機構」（Ｄ。

Ｐ、ニールリッチ、Ｗ、Ｊ、マツター、Ｃ０Ｆ、７オツ
クス編集）４７１ア力デミツク出版ニューヨー　り、１
９７６） ｐＳＣ１０１（６，Ｎ、：ｉ−ヘｙ、Ａ、Ｃ，Ｙ、チャ
ｙ　／’、Ｈ，Ｗ、ポイヤー、Ｒ，Ｂ、ヘリング１９フ
３ｒプロセスナシヨナル　アカデミ−サイエンスＵＳＡ
７０Ｊ３２４０） λｇｔｌ：Ｓ（Ｉ）、ティミニ、Ｌ、エングイスト、Ｐ
、レダー「ネイチャー２６３Ｊ　５２６−５２７　（１
９７６）λシャロンフエイジス（Ｆ、Ｒ，プラットナ、
外「サイエンス１９６Ｊ１６１−１６９（１９７７）ｆ
ＩＲ２２９＜　、ｘ、Ｄ、ポエク「分子一般遺伝学１８
月２８８−２９１）（１９８１） ＰＪＧ７５−５８（Ｊ、コリンズ「酵素化学の方法６８
Ｊ３０９−３２６）（１９７９） この工程は再び最終宿主細胞の外側で行われる。

この方法の役に立つ技術は以下の記載と同様に連結子に
関する上記文献に記載されている。すなわち、■、バー
ジフィールド、）１．Ｗ、ボイヤー、Ｃ。

ヤノフスキイ、Ｍ、Ａ、ロベット、およびＰ、Ｒ，ヘリ
ンスキ「フロセス　ナショナル　アカデミ−サイエンス
　ＵＳＡ　７１Ｊ３４５５−３４５９（１９７４）、Ｎ
−Ｅ、ムレイおよびに、ムレイ、「ネイチャー２５１Ｊ
　４７６−４８２（１９７４）、Ｆ、Ｒ，プラットチー
外「サイエンス１９６Ｊ　、１６１−１６９（１９７７
）。

第五工程では、ＤＮＡ組換え分子は宿主細胞系の細胞質
に従来の方法を使って導入されるが、この方法に２いて
は以下の記事に記載されている。

すなわち、Ｍ、マンテル、およびＡ、ヒガ（１９７０）
「Ｊ０分子生物学　５３Ｊ１５９−１６２、Ｐ、Ｃ，ウ
エンス、インク、Ｄ−Ｊ、フイネガン、ＪＪ：、　）ゞ
ネルソンおよびり、Ｓ、ホグネス「細胞３Ｊ　、３１５
−３２５（（１９７４）、Ｓ、Ｎ、コーヘン、Ａ、Ｇ、
Ｙ、チャンクおよびり、スー「プロセス・ナショナル　
アカデミサイエンス　ＵＳＡ６９Ｊ　２１１０−２１１
４（１９７２）、Ｈ，Ｍ、グツト８マン、およびＲ，Ｊ
−マクドナルド「酵素化学の方法６８Ｊ７５−９０（１
９７９）、Ｉ！：、Ｍ。

レダーバーブおよびＳ、Ｎ、コーヘン、「Ｊ、バクテリ
ア１１９Ｊ　１０７２−１０７４（１９７４）。

正確なりローンであることの認識は交雑選択の方法ある
いは合成オリゴヌクレオクドで精査することにより行わ
れる。（Ｔ、タニグチ、Ｙ、フジイ、クリャマ、および
Ｍ、ムラマツ、「プロセスナショナル　アカデミ−サイ
エンス　ｔＪｓＡ７７Ｊ４００３−４００６（１９８０
）、Ｈ，Ｐ、リツキャルデイ、Ｊ、Ｓ、ミラーおよびＢ
、Ｉ！：、ロバーツ、「プロセスナショナル　アカデミ
−サイエンス　ＵＳＡ７６Ｊ４９２７−４９３１（１９
７９）、Ｄ、Ｌ、モノトゴメリ、Ｂ、ｔ＋、ホール、Ｓ
、ギジン、およびＭ、スミス「細胞１４Ｊ６７３　６８
０（１９７８）。

次に、新しく変えられた宿主細胞は無性生殖され、所望
の物質が出現した。例えば、ラクト−ス・オはロン・プ
ロモーターを使うガレンテ外の方法で（１９８０）（Ｌ
、ガレンテ、Ｇ、ローア−１Ｔ０Ｍ、ロバーツ、および
Ｍ、クツシン「細胞２０」５４３−５５３（１９８０）
、Ｌ、カレンテ、’ｆ）１．ｏＡｘｉ　Ｊｒ　）　ｙ＜
　ｋＡ　カ　−ｙ　Ｓノ　ｙ　ｒ（：Ｌ＠！Ｔ　Ｑ１’
ｌＱｌ　Ｉ　Ａ　９Ｒ−１４３０（１９８０）］、異質
のＤＮＡを出現させこれを最も効果的に活用する。

本発明において、ＤＮＡ分節をプラスミド構造に並べた
ものが第４表に図式的に示される。

第４表 この構造は、例えばエシェリキア・コリ、又は酵母菌の
いずれか一方の中に保持されるプラスミドなどの「シャ
トル」媒介体で一般に使用されるいくつかの成分から成
る。第４表に記載のプラスミ白よ、Ｋ、ストルール、　
Ｄ、Ｔ、ステインチコム、Ｓ、シャーシー、およびＲＪ
、ディビス「プロセス　ナショナル　アカデミ−ＬＩＳ
Ａ７６Ｊ１０３５−１０３９（１９７９）に記載のプラ
スミド”ＹＩ　５の変形構造である（第３表参照）。分
節ｆｌ）はプラスミドｐＢ８３２２　の２．４キロベ一
ス断片で、ＤＮＡ複製元とβ−ラクタメーゼ遺伝子を含
有し、ＤＮＡをエシェリキア・コリに増殖させ、アンピ
シリン耐性によりＩ）ＮＡ−ｉ選択的に存在させ続ける
ことができる。分節（２１は酵母菌の中に最初に写しを
開始始する位置を有する酵母菌２μプラスミドの１．６
キロベースの）（ｐａｉからＨｉｎｍまでの断片である
。

〔２μプラスミドについては、Ｊ、Ｌ、、ハートレイお
よびＪ、Ｅ、ドネルソンにより「ネイチャー２８６」８
６０−８６５（１９８０）に記載されている。〕分節（
３）は酵母菌ゲノム（１，１ｋｂの長さ）からのμ値３
遺伝子で、宿主株中の三３−　の変形を補足するおかげ
でプラスミドを有する酵母菌を選択することができる。

〔−見旦Ａ３遺伝子については、Ｍ、バッハ、Ｆ、ラフ
ロート、およびり、ポットスタインにより［プロセス　
ナショナル　アカデミ−サイエンス　ＵＳＡ７６Ｊ　３
８６−３９０（１９７９）に記載されている。］ 分節（４）は、ＧＡＬＩ遺伝子をｍ）ＩＮＡに転写し次
にこのｍＲＮＡを移動させる信号を有する酵母菌ゲノム
から得られたＤＮＡの０．７５５ｋｂ、又は０．８２ｋ
ｂの断片である。このＧＡＬ１遺伝子は酵母菌が強化グ
ルコース培地で培養される場合は抑制される。ガラクト
キナーゼの遺伝情報指定配列は０．７５５ｋｂ、又は０
．８２ｋｂの断片には存在しない。これらＤＮＡの切片
は異質の遺伝子の出現を指示でき、その規則はここに記
載の通りＧＡＬ］遺伝子の様態に従う。

分節（５）は所望のポ＋７はプチド生成物配列を暗号化
するＤＮＡの断片である。このＤＮＡ切片は一定の方向
を向いているので、ｍＲＮＡの転写はＧＡＬ−１プロモ
ーターによって制御される。信号はプチドの遺伝情報を
指定する配列は取り除かれ、ＡＴＧ移動開始コビンが挿
入された。従って、メチオニンによって開始される遺伝
子は研究用に使われる。

プラスミドは各橿原および合成連結子からＤＮＡ切片を
結紮して構成される。０．８２ｋｂのＧＡＬ　１プロモ
ーターと異質の遺伝子の配列の結合点での配列は次のと
おりである。

（１）　ＰｏＡＬｌ−Ａ６ＣＯＯ（３ＧＧＡＴ（３ＴＣ
ＧＡＣＣ−ＡＴＧ−Ｘ（Ｘは異質遺伝子である。配列Ｔ
ＧＧＡＣＯは合成湯引Ｉ連絡子の一部であり、ｃｃｃｃ
ｔ；ＧＡ’ｒｃはｊ三Ｈ１連結子の一部である。） ０．７５５ｋｂ　の旦Δ見１プロモーターと異質の遺伝
子の配列の結合点での配列は次のとおりである。

Ｐ、、、−ＴＴＡ’ｒ’Ｉ’（３Ｇ’ｒＣＴＡＧＯＧＧ
Ａ’Ｉ’０ＡＡ−ＡＴＧ−Ｘ　。

（Ｘは異質の遺伝子である。） プラスミドはまずエシェリキア・コリの中で無性生殖さ
れ増殖され、次に酵母菌の中で変形される。出現規準が
類似の構造を使う各種遺伝子に関して測定された。ウシ
成長ホルモンの場合は、例えば、ウシ成長ホルモン１ａ
ｃＺの融合遺伝子は第３図でウシ成長ホルモン遺伝子に
（Ｘ位置で）とって代わった。この構造は本質的にウシ
成長ホルモンの全配列を有しくＮ−末端用の４アミノ酸
の遺伝情報を指定する配列だけが欠けている）、はとん
ど完全な１ａｃＺ遺伝子を有する。β−ガラクトシダー
ゼ（ｌａｃＺ遺伝子生成物）活性を監視したところ、は
ぼｓ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏ分子の融合タンパク質が菌株ＣＧ
Ｙ１５０（α１ｅｕ２−３ｕｒａ３−５２　ＧＡＬ”）
中の細胞１個につき生成された。

酵母菌の中でポＩＪ−？プチド生成物を生成する場合に
許可できる変更は次のとおりである。

・違う末端材が使用できる。

一ウシ成長ホルモンに関して、Ｎ−末端アミノ酸はウシ
成長ホルモンにとって異種であり、フェニルアラニン（
Ｐｈｅ）およびアラニンの両方が観察された。この異種
混成は先行物分子（前成長ホルモン）の不明確な処理法
の結果である。

上記の遺伝子はＰｈｅ　−ＢＧＨの遺伝情報を指定する
。Ａｌａ−ＢＧＨの他の遺伝子も出現のために使用でき
る。

・−９Δ旦１”プロモーターの突然変異体（第４表の要
素（４）は出現の規準あるいは規則の様態に影響を与え
ることができる。染色体のゲノム中の他の突然変異体も
同じ効果がある。事実、里１プロモーターが構成を開始
させるのに役立つ突森変異体もある。このような菌株は
より高い出現規準を得るために使用される。

・異質の遺伝子に連結したＰユゆ１を有するＤＮＡ分節
（第４表の要素（４）および（５））は臨時染色体プラ
スミド上にこの分節を置くことよりむしろ安定した構造
を得るために酵母菌染色体中に合体される。

・異質の遺伝子中のＡＴＧ開始コドンは信号４プチドの
遺伝情報を指定する配列などのような他の配列と取り代
えられる。さらに、タンパク質が酵母菌体から培地へ分
泌された。

・いろいろ長さや配列の違ったＤＮＡがＧＡＬ、ｌプロ
モーターと異質の遺伝子配列の結合点で生成の水準を層
も効果的に活用するために使用される。例えば、配列（
１）は次のように変えられた。

（ＩＩ）　ＰｏＡＬ、−Ａ６ＧＣＣＱＸ３ＡＡＧＯ’ｒ
’ｒＡＴＣ；Ｇ−ＡＴＧ−Ｘ。

この領域の他の配列は突然変異誘発を行うことにより誘
導される。

・種々の長さの庄酊１プロモーターが使用できる。

・酵母菌ゲノムからの転写用の末端月はウシ成長ホルモ
ンのＣ−末端に加えられる。

・ここに使われているＧＡＬｌプロモーターの用語は、
酵母菌中にガラクトキナーゼの出現をうながす作用をす
る０、７５５あるいは０．８２キロベースのＤＮＡ配列
の部分を指１゜ ここに記載の酵母菌株は、培地にガラクトースが含まれ
る場合に所望のポＩ）ハプチド生成物を生成する。培地
には６．７１／１１の酵母窒素基剤、２チのガラクトー
ス、および適切なアミノ酸が含まれる。もしそのポリペ
プチド生成物が宿主株に有害であるとわかったら、酵母
菌を２％のグルコースと６．７１１７１３の酵母窒素基
剤を含有″１−る培地で培養し、次にその酵母菌をガラ
クトース培地に移して培養を止めた後でポリ投プチド生
成物の製造を誘発することによって、ポリはプチト９生
成物の生成を抑制することができる。細胞は遠心分離さ
れ、細胞のない抽出液はガラスのビーズで激しくかき回
わして細胞をくだいて得られる。

例　１゜ 牛の成長ホルモンの製造 １、牛の成長ホルモンｍＲＮＡの単離 中の脳下垂体が牛の屠殺直後に集められて、それをドラ
イアイスで直ちに凍結した。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、　ｐＨ７，５，８Ｍのグアニジｙ　ＨＧｌｊおよび
１ｍＭのヂチオスレイトールとから成る２００−　ｍｌ
の冷緩衝液（１０°Ｃ）の中にＷａｒｉｎｇメレンダー
を使用して１４．４１！の組織を粉砕して入れた。

このようＫして得られた溶液を次に、１０．０−００　
ｒｐｍの５ｏｒｖａｌ　ＳＡ６００　ローター中で５℃
の温度で１７分間遠心分離した。分離した物質を再分散
して均質化し、それは２０　ｍＭの醋酸ソーダと２０ｍ
ＭのＥＤＴＡとから成る４０ｍの冷緩衝液中で１時間氷
を入れて静置された。それからその液はその半量の水冷
１００チエタノールで処理した。

−２０℃で１時間放置後、沈澱物は一１０℃の温度で３
０分間３０００ｒｐｍの遠心分離を行ってはレット化し
た。このベレットは２０ｍ１の前述の緩衝液の中に２個
再分散され、次にその半量の氷冷１０（ｌメタノールで
処理され、その後−２０’Ｃ。

で１時間培養された。ペレットは前述の方法で集められ
た。この最終ペレットを８１ｎｌの０．ＩＭＥＤＴＡ中
に６０℃で加熱しながら再分散し、次に０．１容積の２
Ｍ醋酸ソーダ、ｐＨ５，０と２容積の水冷１００％エタ
ノールとを加え、この溶液を一２０℃で一晩放置した。

この）（ＮＡ沈り物は一１０℃のｍｅで２０分間の８０
０　Ｏｒｐｍ遠心分離によって集められて、次にそれを
５ｍｌの水に溶解した。収量はｓダＲＮＡであった。こ
のＲＮＡ溶液は５ｍｌの２倍濃厚結合緩衝液（２０ｍＭ
の°Ｉ’ｒｉｓ−ＨＧｌ、　ｐＨ７，５；　２　ｍＭ　
〕Ｅｌ）’ｒＡ＋　ｐＨ７，０７０，４％ＳＤＳおよび
０．２４　Ｍ　ＮａＧ／　）で稀釈した。

このＲＮＡ溶液を１．５−のオリゴ−ａＴ−カラムに通
した。このカラムを１倍濃度結合緩衝液で洗滌した後、
ポリＡ含有ＲＮ　Ａ　（ｍ　ＲＮ　Ａ　）　％：、　Ｎ
ａｐ／を含まない緩衝液によるカラム洗滌によって溶出
した。約１００■のポリＡ含有ＲＮＡを得た。このｙｓ
＋）Ａ含有ＦｉＮＡの一部をガラス管中で兎の網赤血球
溶解物系［Ｐｅｌ−ｈａｍ、　Ｈ，Ｈ−ＢおよびＪａｃ
ｋｓｏｎ。

Ｒ，Ｊ、、欧州生物化学雑誌、６７．２４７−２５６（
１９７６））中において翻訳して牛の成長ホルモンを指
定するｍＲＮＡの単離を確認した。

２、二重に撚られたコピーＤＮＡ（ＧＤＮＡ）の製造ポ
リＡ含有ＲＮＡから、それを５０　ｍＭのトリ：ｘ　−
ＨＧＩＩ　、　ｐＨ８，３；　１００　ｍＭのＫＧＩ　
；　８　ｍＭノＭｇＧ１１２；　０．４　ｍＭのヂチオ
スレイトール；各５ｍＭのａＡＴＰ、　ａＧＴＰおよび
ｄＴＴＰ；および１００単位の逆転写酵素および１．３
μＣｉα−Ｐ−ａＣＴＰ（１，８０ｉ／ｍ　モル）を含
有する２０μｇ／ｍｌのオリ−ＩＣ−ｄＴ）　ｔ　とか
ら成る液の中で４２℃で１２−１８ 時間保温することによって、約２．５μｇのＣＤＮＡが
合成された。この反応混合物を１００℃で３．５分間加
熱し、次にそれを約３分量水で急冷し、次に沈澱した蛋
白を遠心分離して除いた後、その上澄み液にＨＥＰＥＳ
　−ＮａＯＨ，ｐＨ６，９を１００　ｍＭまで；　Ｍｇ
Ｇ１２を５ｍＭまで；ヂチオスレイトールを０．５ｍＭ
まで；およびデオキシヌクレオシド三燐酸エステルを０
．１２５ｍＭまでそれぞれ加えた。

この液と３００単位の大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　４１Ｊメラー
ゼ１との混合物を１５℃で２．５時間培養すると１．８
μｇの二重に撚られたＣＤＮＡを生成した。このＤＮＡ
をフェノールで抽出し、次に５ｅｐｈａｄｅｒｃＧ−１
００上のクロマトグラフィー（１３，５−のカラム、０
．７ｃｍＸ３５ｃＩｒＬを使用、２０ｍＭのＮａＣｌで
溶出）でこの生成物にとりこまれていない三燐酸エステ
ルから生成物ＤＮＡを分離し、次に１／１０容の２Ｍの
醋酸ソーダ、ｐＨ５と２．５容の冷エタノールとを生成
物溶液に添加して一２０℃の温度にして一晩かけてこの
ＤＮＡのエタノール沈澱を行った。この２重に撚られた
ＣＤＮＡは次に緩衝液（０，３ＭのＮａＣＡ’　ｓ　３
０　ｍＭの醋酸ソーダ、ｐＨ４，６および３ｍＭのＺｎ
ＳＯ４とから成る）の中で３７℃で８０００単位のＳｌ
　ヌクリアーゼを用いて１時間処理された。この反応は
ＫＤＴＡを１０ｎｎＭまでさらにトリス−Ｈｅ／、ｐＨ
８，３を２００　ｍＭまで添加して停止され、その混合
物は平衝させられたビオゲルＡ−１５０ｍカラム（０，
７５ｃｎＬＸ　４０ｃｒｆＬ）に通して吸着させ、次に
それを１０ｍＭのトリス−ＨＣＡ’、　Ｊ）Ｈ７，５と
２５０　ｍＭのＮａＣ１と１ｍＭのＥＤＴＡとで溶離し
た。高分子量のＤＮＡの゛複数のピークフラクション（
各Ｑ、　５　ｍｌ　）はプールされて、それに１／１ｏ
容の２Ｍの醋酸ソーダ、ｐＨ５と２．５倍容の冷１００
チエタノールの添加によりＤ　Ｎ　Ａのエタノール沈澱
が行われた。

３、とＲＩリンカ−の添加 Ｓｌ処理した二重に撚られたｃＤＮＡ（０，２１Ｍｇ）
を緩衝液（６０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５；８
ｍＭのＭｇＧ４　ｔ　５　ｍＭノヂチオスレイトール；
１ｍＭのＡＴＰ＃よび５ｍＭの各デオキシヌクレオシド
９三燐酸塩）の中で９単位の大腸菌ＤＮＡｙｇリメラー
ゼとともに１０℃で１０分間培養し、その抜水上で冷却
した。この「鈍い端末を有する」（ｂｌｕｎｔ−１ｕｄ
ｅｄ）二重に撚られたＣＤＮＡは次に、６５　ｍＭのト
リス−ＨＯ４ｐＨ７，５；　６　ｍＭのＭｇＣｒ１２；
　５　ｍＭのｒチオスレイト−／ｌ／　；　１　ｍＭの
ＡＴＰＯ中で、１６０ｐモルの　Ｐ−置換識別されたＥ
ＣｏＲＩ合成リンカ−（ＣＤＮＡ端末より１００ｘ過剰
）および４「鈍い端末」単位のＴ４ＤＮＡ　ＩＪガーゼ
ととも１ｃ１５℃で５時間培養され、次に氷上で冷却さ
れ、次に１００　ｍＭのトリス−ＨＯ２。

ｐＨ７，５，５０ｍＭのＮａＧ１および５．６ｍＭのＭ
ｇＣ１２との中でＥｃｏＲＩ限定内ヌクレアーゼにュー
イングランドビオラボ、９単位）を用いて３７℃で４時
間４５分処理され、次にフェノール抽出された。この抽
出物はビオゲルＡ−１５０ｍカラム（０，７σＸ３１．
５ｃｍ）上で分溜された。

高分子量のＤＮＡを含む複数の部分（各０．５　ｍｌ　
）はプールされ、次にエタノール沈澱が行われた。

ＥＣｏＦｔＩ凝集末端を有するこの二重に撚られたｃＤ
ＮＡは、ＥｃｏＲＩ限定内ヌクレアーゼで切り開かれて
いた流動性のファージＣＧＦ４の二重に撚られたＤＮＡ
に結紮され、次にそれはＨ、ｇｏｏｄｍａｎおよびｆ（
、Ｊ、ＭｃＤｏｎａｌｄの方法［ｇｏｏｄｍａｎ　、　
Ｈ，Ｍ、およびＭａｃＤｏｎａｌｄ　、　Ｒ，Ｊ　、酵
素学の方法、６８．７５−９１（１９７９））によって
子牛の腸のアルカリ性燐酸酵素を用いて処理されて末端
の燐酸エステルが除かれた。その結紮反応らは６０　ｍ
Ｍのトリス−Ｈｏｌ、ｐＨ７，５；　６　ｍＭのｂＡｇ
ｏｌｚ　；　７　ｍＭのヂチオスレイトール；０．１２
μｇの二重に撚られたｃＤＮＡ；　１．２μｙのＧ（ｓ
　Ｆ　４　ＤＮＡ　ｔ　ｏ、　５　ｍＭのＡ１’Ｐおよ
び４５０凝集端単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼが含まれた
。結紮反応は１５℃で１９時間であった。

４、組換えＣＧＦ４ＤＮＡＫよる大腸菌ＤＢ４５４８の
トランスノェクション 大腸菌株Ｇ　ＧＥ６　（ＤＢ４５４８　）　ｈ　ｓｄ　
ＲＴ　ｈｓ　ｄＭ＋ＴｓｕｐＥ　、　５ｕｐＦ　、　Ｂ
ｌｌ　、　ｍｅｔ、）を１５０ｍ１のｔｒｙｐｔｏｎ肉
汁中で３７℃で振動しながら成長させ、０Ｄ７ｏｏ−０
，５で４℃の温度での１０分間の７００゜ｒｐｍの遠心
分離でそれを収穫した。その細胞は７０ｆｆ＋７！の氷
冷５０　ｍＭのＣａＣｌ２中忙再分散して、０℃で３０
分間靜装した。この懸濁液は次に４℃で１０分間７００
０　ｒｐｍで遠心分離して、さらに分離した細胞を３−
の氷冷５０ｍＭのｃａ　Ｃ／　２中に再分散した。０℃
で２時間そのま瓦装置された後、細胞はトランスノェク
ションに使用された。５０ｍＭのトリス−ＨＣ４，ｐＨ
７，５中の結紮反応液の１＝４０稀釈液の１μｌか２μ
ｌのいずれかを、５０祷の滅菌した５０ｍＭ）リス−Ｈ
Ｇ１．　ｐＨ７，５を入れた１２本のチューブのおのお
のの中に入れた。あのＯａＣ／　２処理した細胞の１／
’ｔｏＵＡを上のおのおののチューブに加え、その混合
物は３０分間氷上に置かれた。次にそれを２分間３７℃
に加熱後、終夜培養されたＣｅＦ２　（ＪＭＩ　０１　
：　Ｊ−Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９７９）、Ｖ　（ｌａｃ
　ｐｒｏ）ＳｕｐＥ　ｔｈｉ−バックグランド中のＦ’
ｔｒａＤ３６　ｐｒｏＡＢ　１ａｃＩＺＶＪ５）　の０
．２　ｍｌと０．７％のソフト寒天培地の３ｍｌとがそ
れに加えられた。次にその混合物はｔｒｙｐｔｏｎｅ　
寒天培地板の中に注がれた。それを終夜３７℃で培養し
たところ３０００以上のブックを生じた。

５、牛の成長ホルモン記号系列を保持する組換えＣＣ，
Ｆ４の同定 ブックはニトロセルローズに移され、Ｂｅｎｔｏｎおよ
びＤａｖｉｓによりｒ　Ｂｅｎｔｏ＋、Ｖ／、Ｄ−およ
び（１９７７））述べられたとおりに　Ｐ−置換識別さ
れた牛の成長ホルモンＣＤＮＡを用いて探られた。

ｃＤＮＡプローメに強く雑種繁殖するファージを板より
つまみあげ、ＴＹ培地中で貯えた。健全なファージのサ
ンプルはＣＧＥ５細胞上で終夜成長させて増強され、遠
心分離によって収穫し、次にそれは、０．３７Ｍのトリ
ス−グリシン、ｐ）（９，５を含みさらに０．２　Ｎ　
ＮａＯＨ中で１時間処理し、０，５Ｍのトリス−ＨＧｌ
、　ｐＨ７，４中で中和したあとのエシジューム臭化物
で着色した０、６％のアガローズゲル中で電気泳動にか
けられた。泳動はファージＤＮＡの大きさのロックに逆
比例し、それは、６００〜１２０００基本対の大きさを
もつ牛の成長ホルモｙＤＮＡ挿入柳を保持する約４５種
類のファージの選別を可融にした。−重に撚られたＤＮ
Ａが堀内らの方法〔堀内、　Ｋ、、Ｖｏｖｉｓ　、　Ｇ
Ｊ−およびＺｉｎｄｅｒ　、　Ｎ、Ｄ　、　、生物化学
雑誌、２４９．５４３−５５２（１９７４））　により
作られ、混成物の選別が行われた。溶離されたｆ（ＮＡ
は網赤血球溶解物系中でＰｅｌｈａｍおよびＪａｃｋｓ
ｏｎの方法ｒ　Ｐｅｌｈａｍ。

Ｈ−Ｒ，Ｄ、およびＪａｃｋｓｏｎ　、　ＲｏＪ　、、
欧州生物化学雑誌、６７．２４７−２５６）Ｋよって翻
訳され、そのたん白質生成物の分析により真正の免疫沈
殿性牛成長ホルモンの生成が明らかＫされた。２重に撚
られたＲＦＩＤＮＡがそのファージからＭＯｓｅｓらの
方法［ＭＯ８６ｐ　、　Ｐ、Ｂ　、　、　Ｂｏｃｋｅ　
、　Ｊ−Ｄ　、　ｒ堀内、に、およびＺｉｎｄｅｒ、　
ｔｊＤ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１０４．２６７−２
７３（１９８０））により作られた。各ＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩおよびＰＳｔＩ限定内ヌクレアーゼを用いて切断し
、得られた破片をアガローズゲル上で分析してその挿入
物はＰ６ｊ１６重を含むことを確認した。約３５０基本
対のセグメントを有するある一つ（ｂｐ）のファージＤ
ＮＡを選択してそれを更に検討した。ＤＮＡ挿入物が表
６に示ずようにｆ１４ａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの
方法ｒ　Ｍａｘａｍ、　Ａ−Ｍ−およびＧ１１ｂｅｒｔ
　、　Ｗ　、、酵素学の方法、６８，４９９−５６０（
１９８０）〕によって順序どおりに並べられた。

６、サツカロミケスセレヴイジエ中の牛の成長ホルモン
の表示 表５に見られるとおり酵母中の牛の成長ホルモンの表示
をつかむのを容易にするよう考案された遺伝子副体　Ｃ
ＧＳ］４４が組立てられた。酵母中Ｋ牛の成長ホルモン
を生成するため、ＡＴＧ開始コードンが最初のアミノ酸
（フェニールアラニン）の５′−側にとりこまれた。Ｈ
ａｅｌｌは最初のコード／の３′−側で切断するという
事実にもとづいて、Ｐｈｅコードンの５′一端を開くた
めＨａｅｌｌ消化が行われた。６．６ｍＭのトリスＨＣ
４ｐＨ７，５１６，６ｍＭのＮａ０１１　ｐ　６．６　
ｍＭのＭｇＣｌ２および６６　ｍＭのヂチオスレイトー
ルの中で０．５ｍＭのｄＡ’ｌ’Ｐの存在の下でＤＮＡ
を４単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ］　（Ｋｌｅｎｏｗ
断片）を使用して室温で３０分間処理してその凝集端を
摘んで整えた。

それからＳｌヌクレアーゼを用いて鈍い端末を有するよ
うにした。

ＡＴＧ開始開始コードセン有するＣｌａｌ合成リンカ−
（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）　が、６６　ｍＭのトリス−ＩＯ
Ａ！、ｐＨ７，５；　１０ｍＭのｕｇｃ１２Ｆ　１０　
ｍＭの２−メルカプトエタノール；５００ｐモル３２Ｐ
−Ｃｏａｌリンカ−とともに１ｍＭのＡＴＰ；　４９モ
ルのＤＮＡ　（２０μＩ）および４鈍り、）１１端末単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む液の中で１７℃で終夜、
その鈍い端末の断片に結紮された。この結紮はＡＴＧ開
始開始コードセンり出し最初のコードンＴＧＴを復活さ
せた。Ｃｌａｌ　Ｊ　リリンカーは、１０ｍＭのトリス
−ＨＧＩＩ　、　ｐＨ７，５；　１０　ｍＭのＭｇＱ、
／２および０．１■／−の牛の血清アルブミンを含有す
る２０μｌの反応液中で３７℃で２０単位の限定内ヌク
レアーゼ魚１を用いてこの断片を３時間処理して、とり
除かれた。得られた断片は遺伝子剛体（プラスミド”）
ｐＢＲ３２２のＣＡ’ａ１部位にクローンされた。この
プラスミド（遺伝子剛体）（１０ｐｇ）は、１０ｍＭの
トリス−ＨＧＩＩ　、　ｐＨ７、５ｙ　１０　ｍＭ　ｆ
）　Ｍｇｃｉ２’Ｍ　Ｊ：　ヒ０．１　”Ｅ／　／　”
）　牛の血清アルブミンを含有する２０μノの反応液中
で限定内ヌクレアーゼＣ１ａｌにューイングランドビオ
ラボ、２０単位）を用いて３７℃２時間で切断された。

限定切断プラスミド９の調剤はフェノール抽出され次に
エタノール沈澱され、次にそれはＨ、Ｇｏｏｄｍａｎお
よびＲ，Ｊ、ＭａｃＤｏｎａｌｄの方法［Ｇｏｏｄｍａ
ｎ　、　Ｈ，Ｍ、およびＭａｃＤ’ｏｎａｌｄ　、　Ｒ
，Ｊ　、　ｓ　１９￥素学の方法、６８．７９−９１（
１９７９）ＩＩＣより小中の腸の燐酸酵素で処理されて
末端の燐酸エステルが除かれた。約０．５ｐモルの迎グ
１処理断片と０．３ｐモルのＣ１ａｌ切断プラズミ１と
は、６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，５；　６
　ｍＭのＭｇＧ／２；１０ｍＭのヂチオスレイトー、ｚ
；１ｍＭのＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼにューイン
グラント８ビオラボ、３００単位）を含有する２０μノ
の反応液中で１５℃で３時間互に結紮されてプラスミド
ｐＣＧｇ２７　を作りだした。

形質転換の能力のある大腸菌株ＣＧＥ４３　（ＬＧ９０
　；　Ｆ’　Ｖ　（／ａｃ−ｐｒｏ　Ｘ１ｌｌ　）が、
ＧｅＦ４に対して前に述べたとおりにして作られた。５
μｌの結紮されたＤＮＡが２００μｌのその細胞な０℃
で３０分間混合され、次に３７℃で２分間熱処理され、
次に室温で１０分間培養されてから新鮮なトリプトン肉
汁で５倍に稀釈された。３７℃で振動しながら３０分間
培養後、細胞はアンピシリン（２０μｍ１／ｍｌ）を含
有するトリプトン板上に５すく延ばされた。アンピシリ
ンに抵抗性のあるコロニーが選び出されてプラスミドＤ
ＮＡが製造されて限定酵素消化によって分析された。こ
れらの判定規準によって数個の細胞は希望のプラズミ゛
ドｐｃＧＥ２７を保持していた。１０　ｍＭのトリス−
ＨＧＩＩ、ｐＨ７，５：　１０　ｍＭのＭｇＣＡ！２；
　６０　ｍＭのＮａＣ；ｌ；および０．１〜／Ｔｎｌ！
の牛の血清アルブミンを含有する２０μｌの反応液の中
で、プラスミドｐＣＧＥ２７ＤＮＡ　（１０ｐｇ）が限
定内ヌクレアーゼＨｉｎｄ　ＩＩＩ（コラボラチブ研究
会社、１２単位）を使用して３７℃で２時間切断された
。このＤＮＡは次に、１００　ｍＭのトリ／（−ＨＧＩ
、ｐＨ７，６；　１０ｍＭのＭｇＣｌ１２　ｐ　５０　
ｍＭ　ｆ）　Ｎａｃｌｌ　ｐ　オヨヒ１　ｍ９　／　”
の牛の血清アルブミンを含有する反応液中で、内ヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩ　（コラポラチプ研究会社、１５単位
）を用いて３７℃で３時間消化された。

この限定切断ＤＮＡは、前述のように０．５ｍＭのａ　
’Ｅ”Ｉ’　Ｐの存在下に大腸菌ＤＮＡｙｄリメラーゼ
１（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を用いて端末を摘んで植えられ
さら［８１ヌクレアーゼを用いて鈍い端末を有するもの
Ｋされた。このＤＮＡは次にフェノール抽出され次にエ
タノール沈澱され、次にそれは水に再溶解されてから予
備の水平の１．５チアガローズゲルに加えられた。その
ゲルは、４０　＋ｎｌＪのトリス−アセテ−）、ｐＨ７
，２中で２−３時間電気泳動後、エシジューム臭化物で
着色して長波長紫外光線を使って検査された。この消化
されたＤＮＡはゲルピースを凍結してから解か丁こと［
Ｔｈｕｒｉｎｇら、分析生化学、６６．２１３（１９７
５））によって抽出された。このＤＮＡ断片はエタノー
ル沈澱され次釦水に再溶解された。ｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲＩ／Ｐｖｕ　１１部位に挿入されたＰｌａｃの９５
基本対を含有するゾラズミト”（１）ＧＬＩＯＩ；　２
０μ１１）が限定内ヌクレアーゼＰｖｕｌｌにューイン
グラン）＃ヒオラボ、２４単位）を使用して３７℃で６
分間切断された。この限定切断ＤＮＡはフェノール抽出
され、次にエタノール沈澱され、次に水に再溶解された
。このｐｖｕ　ＩＩで開かれたベクトル（保菌生物）は
ゲル電気泳動により分析され、ゲル（上を見よ）から切
り取られた。牛の成長ホルモンを指定する前述のＤＮＡ
断片の約０．２５ｐモルが、６６ｍＭのトリス−ＨＣ；
ｌ、　ｐＨ７，６；　６．６のｍＭのＭｇＧ１２；１０
ｍＭのヂチオスレイトール；１ｍＭのＡＴＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼにューイングランビビオラボ、３００単
位）を含有する２０μｌの反応液中で１４℃で４時間Ｐ
ｕｖ　Ｕ部位で開けられたゾジズミ）ＰＧＬ、１０１　
（上を見よ）中に結紮された。

形質転換の能力のある大腸菌株ＣＧＥ４３細胞が上述と
全く同様にして調製された。あの結紮されたＤＮＡの５
μｌがこの細胞の１００μｌと０℃で３０分間混合され
、次に３７℃で２．５分間熱処理され１次に新鮮なトリ
プトン肉汁で１０倍に稀釈された。この細胞は振動しな
がら３７℃で３０分間培養後、アンピシリン（２０μ’
ｊ／ｍｌ）を含有するトリジトン板上にうすく延ばされ
た。アンピシリンに抵抗性のあるコロニーが選び出され
てプラズミ）’ＤＮＡが作られ、次にその正しい定位が
限定酵素消化によって分析された。これらの判定基準に
よって数個の株は希望されたプラズミドｐ　ＣＧＥ　２
２　を保持していた。このプラズミ白まＰｌ、Ａ（−ニ
ーＰｈｅ−牛成長ホルモン遺伝子を含有した。

プラズミトｊｐＣＧＥ２２　を上のとおり限定内ヌクレ
アー竺心ｒｕＩＩおよび’Ｐｓｔｌを用いて３７℃で部
分切断することによって、このプラズミド（３０ｐｇ）
から牛の成長ホルモン用遺伝子含有の断片を単離した。

この限定切断ＤＮＡはフェノール抽出され、次にエタノ
ール沈殿され、次に水に再溶解されてから予備の０．５
チアガローズゲルに加えられた。そのゲルは、４０　ｍ
Ｍのトリス−アセテート、ｐＨ７，２中で電気泳動後、
それはエシジウム臭化物で着色し、次に長波長紫外光線
下で試験した。バンドが切り嵌られそのＤＮＡは、ゲル
ピースを凍結してから解かすこと［Ｔｈｕｒｎｉｎｇら
、分析生化学、６６．２１３（１９７５）’］　によっ
て、抽出された。このＤＮＡ断片はエタノール沈殿され
次に水に再溶解された。この桓ｕ　／　Ｐｓｔ　Ｉ断片
の約０，５ｐモルが、Ｐ□、Ａｒ−／　Ｚ’領領域、１
ｌｌＩ接したＥｃｏＲＩ部位および乃匹夏部位で開かれ
たプラズミト″’ｐＣＧＥ４１中に結紮された。ＥＣｏ
ＲＩ部位は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１で充填されてい
た。結紮反応は、６６ｍＭのトリｙ、　−ＨＣ４ｐＨ７
，６；６．６ｍＭのＭｇＣｌ２　；１０ｍＭのヂチオス
レイト−／ｌ／　；　１　ｍＭのＡ　Ｔ　ＰおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（コラボラチブ研究会社、１０単位）を
含有する２０μｌの反応液中で１４℃で２．５時間行わ
れた。

この結紮されたＤＮＡは、望まれたプラズミドのｐＣＧ
Ｅ５１　を含有することが確められた要求にかなう大腸
菌細胞の形質転換するために使用された。

プラズミ）”ｐＧＧＥ２７がＧ＃ａ　］限定酵素を用い
て切断され、−得られた断片はｓ４　ヌクレアーゼを用
いて鈍い端末を有するものにされた。５Ｂｌ１合成リン
カー（ＧＧＴＣｅＡＣＣ）がこの鈍い端末を有する断片
に結紮された。２０単位の限定内ヌクレアーゼＳａ／　
］による処理によって５ａｌＩポＩＪ　ＩＪンカーがと
り除かれた。それは次にＰｓｔｌを用いて切断された。

得られた断片はｐＧＲ：５１のＰｓｉｘ／Ｘｈｏ１牛成
長ホルモ／″Ｚ断片とともに前述したように酵母の連続
往復式ベクトル（保菌生物）ｐｃＧｓ４０の中にクロン
を発生させられた。

プラスミドｐＣＧＳ４０は、大腸菌中の選別のためのＤ
ＮＡ応答根源およびβ−ラクトマーズ遺伝子とを含有す
るｐＢＲ３２２０大部分を含んでおり、一方酵母２μプ
ラズミドの１．６キロベ一ス断片は酵母中の応答の開始
部位を含んでおり、酵母の染色体のＤＮＡからの１．１
キロベ一ス断片は酵母の選別のための思込３遺伝子を保
持しており、さらに酵母の染色体のＤＮＡからの０．９
キロベ一ス断片は酵母転化酵素遺伝子の下見見２プロモ
ーターをきんでいる。このプラスミドｐＣＧＳ４０は６
０μｇのプラスミドｐＲ８１１８を最初に切断すること
［Ｃａｒｌｓｏｎ　、　Ｍ−およびＢｏｔｓｔｅｎ　、
　Ｄ　、　、　１ｍ＠、　２８゜１４５−１５４（１９
８２）］　によって作られた。そしてその切断は限定内
ヌクレアーゼＨｉｎｄ　ｍを用いて３７℃で３０分間行
われ次に限定内ヌクレアーゼＥｃｏＨ１（上を見よ）を
用いてさらに行われた。

この限定切断ＤＮＡはフェノール抽出され、次にエタノ
ール沈殿され、次に水に再溶解してからゲル電気泳動を
行って精製された。５ＵＧ２遺伝子のプロモーターを含
有するこの消化されたＥｃｏＲＩ対Ｈｉｎｄ　１１　Ｑ
０ｇキロイースパン白土切り取られ、そのＤＮＡはガラ
スビートゝによって抽出された。

［Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　、　Ｂ、およびＧ１１ｌｅ＋
ｐｉｅ、　Ｄ−ＰＮＡＳ。

７６．６１５−６１９（１９７９）。〕５ｔｙｃｚプロ
モーターを含有するこの０．９キロベ一スＤＮＡ断片は
、プラスミドＹＩＰ５（甚籾へ３遺伝子の存在によって
酵母用に選択されてその中に保持されあるいはＡｍｐ遺
伝子の存在によって大腸菌用に選択されてその中に保持
されることができる連続往復式（クトル）の上に載せら
れた。結紮および形質転換後に得られた生成プラスミド
ｐＧＧｓ４６　は精製され、その構造が確認された。

プラスミド”ｐＣＧＳ４Ｑ　は限定内ヌクレアーゼＪ＼
隻■を用いてプラスミドｐｃＧｓ４６　を３７℃で１時
間切断して組み立てられた。プラスミドＹＥＰ１３（こ
れはスタッフォード大学のＲ−Ｄａｖｉｓ氏から入手し
たものであるが）からの２μＤＮＡの１．５６キロイ一
ス断片が、Ｈｐａ　］とＨｉｎｄ　ｌｌ＋を用いてＹＫ
ｐ１３を切断してとり出された。この得られた断片はゲ
ル精製され、フェノール抽出され、さらにエタノール沈
殿され、次に旦幻槙■限定切断が行われた切目に鈍い端
末を作り出すためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（上を見よ
）を用いて処理された。

フェノール抽出とエタノール沈殿後のＰｖｕ　ｎ切断Ｄ
ＮＡと鈍い端末を有する２μＤＮＡ断片とはゲル電気泳
動によって精製され、次に終夜お互に結紮された。かく
て得られたプラスミドｐＣＧＳ４０は成長させることが
でき、大腸菌中またはサツカロミケスセレヴイジエ（ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中におけるその存在は選別される
ことができる。形質転換と制限分析のあと、牛の成長ホ
ルモン伐を含有する要望されたプラスミドｐｃＧｓ７５
　が得られた。

このプラズミ）’　ｐｃＧｓ７５はＳａＡ！　］を用い
て切断され、次に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＫよる処
理によって鈍い端末を有するものＫされた。

この鈍い端末を有するＤＮＡはそれからス巨１を用いて
切断され、その断片はゲル精製された。この同一プラス
ミドはまたＥｃｏ　ＲＩ　／Ｘｂａ　Ｉを用いて切断さ
れて断片を生じた。そしてその断片は、前釦単離された
。　Ｓａ／　Ｉ−鈍い端末の／−淘四工■断片やｐＢＭ
１２５　のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ　断片との結紮で直
ちに酵母の連続往復式ベクトル上に、Ｐユッ、牛成長ホ
ルモメｌＺを含有するｐｃＧｓ１］８を生じた。

包や、プロモーター（８２０ｂｐ）はｐＢＭ１２５（ス
タンフォート９大学のＲ，Ｄａｖｉｓ氏の好意）から作
った。ｐＢＭ１２５はＢａｍ　ＨＩ　で切断され、次に
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を充填され、次にＥｃＯＲ
Ｉを用いて切断された。

鷺１によって機能を促進される牛の成長ホルモン遺伝子
を含有するｐＣＧｓ１４４０組み立ては三分子反応によ
って成遂げられた。ＧＡＬＩプロモーターと牛の成長ホ
ルモ／遺伝子の一部とはｐＧＧＳ１１８からＸｂａ　Ｉ
およびＰｓｔｌによる限定切断によりとり出された。牛
の成長ホルモンの残りはＰｓｔｌおよびＣ／ａｌを用い
てのｐＣＧＥ２７の切断によって得た。これらのゲル精
製された断片は２μの一部分と−ＵＲ八３へ伝子とを含
有するｐＣＧＳ５７　のＸｂａ　Ｉ　／　ＣＡ’ａ　１
断片と結紮された。

［Ｗ母株ＧＧＹＩ　５０　（ＭＡＴα、　ｌ　ｅｕ２−
３．　／ｅｕ２−１１２．　ｕｒａ３−５０）は、Ａ、
Ｈｌｎｎｅｎ　、　Ｊ−Ｂ、ＨｉｃｋｓおよびＧ　、Ｉ
”　ｉ　ｎｋの方法［Ｈｉｎｎｅｎ　、　Ａ　、　、　
Ｈｉｃｋｓ　。

Ｊ、Ｂ、およびＦｉｎｋ　、　ＣＩ、Ｆ　、、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

尤ＳＡユあ１９２９−１９３３（１９７８）’）によっ
て牛の成長ホルモンプラスミドＤＮＡを用いて形質転換
された。酵母の形質転換された菌ｃｇＹ１ｇ６が採取さ
れたが、これはプラズミド上１ｉＵＲＡ３遺伝子が存在
するためウラシルを添加しなくても成長が可能である。

（プラスミド”ｐｃＧｓ１４４を保持する１ＣＧＹ１９
６は米国類型培養コレクション（ＡＴＧＣ）に預けられ
ている。受は入れ番号２０６４３゜１９８２年９月預は
入れ。）との酵母の細胞を、６．７９／ｌ酵母窒素ベー
ス。

３０７Ｑ／７のＬ−ロイシンおよび２チのガラクトース
を含有する培地中で攪拌下３０℃で成長させた。牛の成
長ホルモンの合成はガラクトースの存在によってひきお
こされた。攪拌下３０℃でクレツ）　（Ｋｌｅｔｔ）＝
　５０まで成長後、その細胞は遠心分離で集められ、０
．０５Ｍのトリス−ＨＣＪ　、　ｐＨ７，６，２（ｌグ
リセリンおよび１ｍＭのＰ−ＭＳＦから成る０、２５ｍ
Ｊ中に再分散され、次に一２０℃で凍結された。Ｆｔ、
Ｒｏｓｅらの方法［Ｒｏｓｅ、Ｍ。

Ｃａ５ａｄａｂａｎ　、　Ｍ＋Ｊ、およびＢｏｔｓｔｅ
ｉｎ、　Ｄ、Ｐｒｏｅ＋Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ　７８．２４６０−”２４６４（１９８１））によ
ってガラスのビードでその細胞は分裂させられた。細胞
の抽出物中の牛の成長ホルモンの活性度の量は免疫沈殿
により測定された。

製造された牛の成長ホルモン遺伝子を順序とおりに並べ
る情報は表６に示す。

例２゜ インターフェロンの製造 １、ＩＦＮ　ｍｆ（ＮＡ　ｆ）単離 ３．５５ｇのせんだいウィルスに誘導されたりんば球が
ドウンスホモゲナイザーでｓ　５　Ｑ　ｍＭの醋！ソー
タ、ｐＨ５，２；　６　Ｍ＋７）り７＝ジ／　ＨｃＩＩ
　ｐ　オよび０．１Ｍの２−メルカプトエタノールから
成る冷緩衝液（１０℃）の中で分裂させられた。得られ
た溶液は６０Ｗのパルズされた電力で２×３０秒の間超
音波処理され、次にそれは、０．１ＭのＥＤＴＡを含む
５．８ＭのＣｓ０１　、　ｐＨ７，２の３−〇薄層の上
に流した。その混合液を、ベックマンタイプの５０Ｔｉ
ｏ−ターの中で４０，０００　ｒｐｍ　チー晩生１５℃
で遠心分離した。このベレットは上の冷緩衝液に２０　
ｍＭのＥＤＴＡをプラスしたものの６、６　ｍｌ中で氷
冷したが２０分間再分散された。次にそれは水冷１００
％エタノールの３．３−で処理された。それを−２０℃
に冷却して１時間置いたのち、その沈殿物は、−ｉｏ℃
で２θ分間８０００ｒｐｍで遠心分離して小粒状にされ
た。このベレットは１８ｒｕｌの前の緩衝液中に２回再
分散された。

その分散液は水冷１００％エタノールの９ｍｌで処理さ
れ、次に一２０℃に１時間冷却され１次にそのベレット
は上述したようにして集められた。その最終のベレット
は６０°ＧＫ加熱された８−の０．１　Ｍ　（７）　Ｅ
ＤＴＡ（７）中に再分散され、次Ｋ　Ｏ，１容の２Ｍ醋
酸ソーダ、ｐＨ５，０と２倍容の氷冷１０，０チエタノ
ールとが加えられ、次にその溶液は一２０℃で一晩おか
れた。１（ＮＡ沈殿物が、−１０’Ｃで８ｎｎｌｌｒｎ
ｍの一＋＊　＋ｌゝ、Ａ−１１！１ｔ　ｔｙ　９１’ｌ
　ｌ；Ｌ　＋１１１　鍔へ”ＬＶＰりて集められた。そ
れは５Ｍの水に溶かされた。収量は３９ｆ１１７のＲＮ
Ａであった。このＲＮＡ水溶液は２×濃厚結合緩衝液（
２０ｍＭのトリス−ＨＣＪ、ｐＨ７，５；２ｍＭのＥＤ
ＴＡ　；　０．４　％〕ＳＤＳ；および０．２４ＭのＮ
ａＣ／　）の５ｍｌで稀釈された。

このＲＮＡはＩＷＬｌのオリゴ−ｄＴ−セルローズカラ
ムに通して吸着させた。次にカラムはＩＸ濃厚結合緩衝
液で洗滌したのち、ポリへ−含有ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は
、ＮａＣ／を含有しない結合緩衝液でカラムを洗滌して
溶離された。約３９ｍ９のポＩＪ　Ａ−含有ＲＮ　Ａが
得られた。ポ１７　Ａ−含有ＲＮＡの一部が、ガラス管
中で兎の網赤球溶解物系［Ｐｅｌｈａｍ＋　Ｈ，Ｒ０Ｂ
、およびＪａｃｋｓｏｎ　、　Ｒ，Ｊ−欧州生物化学雑
＊　６７．２４７−２５６（１９７６）］の中で翻訳さ
れてインターフェロンを指定するｍＲＮＡの単離が確認
された。

２、二重に撚られたコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の製造２
５μｇのりんば球ポリＡ−含有ＲＮＡから、それを５０
　ｍＭのトリス−ＨＯｌ、ｐＨ８，３；１００ｍＭのＫ
ＧＩＩ　；　８　ｍＭのｋｃ＋ｊｌ！Ｑ：　０．４　ｍ
Ｍのヂチオスレイトール；各１．２　ｍＭのｄＡＴＰ　
。

ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；および１００単位の逆転写酵
素および０．２５ｍＭのα−Ｐ−ｄＧ’ｌ’Ｐ　（１，
８Ｃｉ／ｍモル）を含有する２０μＩ／−のオリゴ（−
ｄＴ）１□−□８〆とから成る液中で４２℃で１時間培
養することによって、約２．５μｇのｃＤＮＡを合成し
た。この反応混合物を１００’Ｃで３．５分間加熱し、
次九氷上で約３分間それを急冷し、次に沈殿したたん白
質を遠心分離して除いた後、上澄み液Ｋ　Ｈｅｐｅｓ−
ＮａＯＨ，ｐＨ６，９を１００ｍＭまで；ＭｇＧ１２を
５ｍＭまで；ヂチオスレイトールを０．５ｍＭまで；お
よびデオキシヌクレオシドの三燐酸エステルを上述のと
おりそれぞれ加えた。この混合物を３００単位の大腸菌
Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉＥ　＋）メラーゼ１と共に１５℃で２．
５時間培養した結果１．８μｓの二重に撚られたｃ　Ｄ
ＮＡを生成した。このＤＮＡはフェノール抽出され、次
にそのＤＮＡは、とりこまれていない三燐酸エステルか
ら、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００上のクロマトグラフ
ィー（１３ｄカラム。

０．６８ｃｍＸ　３７ｃｍ、２０　ｍＭのトリス−ＨＣ
ＩＩ　。

ｐＨ７，５と３．５ｍＭのＥＤＴＡとで溶＃）ＫＪ：ら
て分離された。次にそれは、名。容の２Ｍの醋酸ソー！
、ｐＨ５，と２．５倍容の冷エタノールと’ｘｆＡ加し
て一２０℃に冷却して一晩放置してエタノール沈殿を行
った。この二重に撚られたＣＤＮＡは次Ｋ、緩衝液（０
，３ＭのＮａ１ｌ　、　’３０　ｍＭの醋酸ソーダ、ｐ
Ｈ４，６、および３　ｍＭのｚｎｓｏ４）中で８０００
単位のｓ７　ヌクレアーゼを用いて３７℃で処理された
。この反応は、Ｈ）ＴＡを１０ｍＭまでおよびトリｘ　
ＨＯ２ｐＨ８，３を２００ｍＭまで添加して停止させら
れた。次にこの混合物は平衡されたビオゲルＡ−１５０
ｍカラム（ｏ、７儂×３５儒）に通して吸着させ、次に
それは１０ｍＭのトリス−ＨＯ２ｐＨ７，５、２５０ｍ
Ｍ　（７）　ｔＪａＧｌおよび１ｍＭＥＤＴＡからなる
液を用いて溶離した。

高分子量のＤＮＡの複数のフラクション（各０．５Ｍ）
はプールされ、それは次に”／１．０容の２Ｍの醋酸ソ
ーダｙｐＨ５ｔおよび２．５倍容の冷ｉｏｏチのエタノ
ールを加えてエタノール沈殿を行った。

３、Ｈｉｎｄｆｆｌリンカ−の添加 ＳＺ処理された二重に撚られたＣＤＮＡ（０，２１μ！
りは、緩衝液（６０ｍＭのトリス−ＨＧＩＩ、　ｐＨ７
，５ｐ８ｍＭのＭｇ０１２ｐ　５　ｍＭのヂチオスレイ
トール；ＩｍＭのＡＴＰおよび１ｍＭの各デオキシヌク
レオシド）の中で９単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１
とともＶＣ１０℃で１０分間培養され、次にそれは氷上
で冷却された。この鈍い端末を有する二重に撚られたｃ
ＤＮＡは次に、６５ｍＭのトリス−Ｈａｔｔ　＋　ｐＨ
７，ｓ　ｚ　Ｍｇ０１２ｐ　ｓ　ｍＭのヂチオスレイト
ール；および１ｍＭのＡＴＰから成る液中で１６０ｐモ
ルの　Ｐ−置換識別された合成リンカ−（ｃＤＮＡ端よ
り１００×過剰）および４鈍い端末単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼと共に１５℃で５分間培養され、次に氷上で冷却
され、次に熱処理してリガーゼを不活性化し、次に５．
６ｍＭのトリス−ＨＯ２，ｐＨ７，５，および５．６ｍ
ＭのＭｇＣ７！２より成る液中でＨｉｎｄ　ｍ限定内ヌ
クレオシドにューイングラント９ビオラボ、９単位）を
使用して３７℃で４時間４５分間処理し、次にそれをフ
ェノール抽出した。この抽出液はビオゲルＡ−１５０ｍ
カラム（（Ｊ、７ｃＩｒＬＸ　３１．５ｃＷｔ）上で分
別された。高分子量のＤＮＡを含有する複数のフラクシ
ョン（各０、５　ｍＡ！　）はプールされてエタノール
沈殿された。

Ｂｉｎｄｌ［Ｉ　凝集末端を有するこの二重に撚られた
ＣＤＮＡは、Ｈｉｎｄｌｌｌ限定内ヌクレ限定上ヌクレ
アーゼ開かれていた流動性ファージＣＧＦ４の二重に撚
られたＤＮＡに結紮され、次にそれはＨ，Ｇｏｏｄｍａ
ｎおよびＲ，Ｊ−ＭａｃＤｏｎａｌｄの方法［Ｇｏｏｄ
ｍａｎ　、　Ｈ，Ｍ。

およびＭａｃＤｏｎａｌｄ　、　ＲｌＪ　、、酵素学の
方法、乱シフ５−９１（１９７９）］によって小牛の腸
のアルカリ性燐酸酵素を用いて処理されて末端の燐酸エ
ステルが除かれた。（註：ファ一：）にｅＦ’４を作る
ために、流動性ファージＲ２２９ｒ　Ｂｏｃｋｅ　、　
Ｊ−Ｄ　、　。

Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１８１．２８８−２９１
　（１９８１）］がＥｃｏＲＩを用いて切断され、次に
Ｔ４ＤＮｌｔ”’Ｊメラーゼを用いて鈍い端末を有する
ものにされ、次にコラポラチで研究会社（マサチューセ
ッツ州レキシントン）からの旦■ｈｄｍ合成オリゴヌク
レオチドリンカーと結紮された。）その結紮反応には６
０ｍＭのトリス−Ｈ（Ｊ、ｐＨ７，５；　６ｍＭのＭｇ
Ｇ１２ｔ　７　ｍＭのヂチオスレイトール；０．１２μ
ｇの二重に撚られたＣＤＮＡ；　１．２μｇの０（、Ｆ
４ＤＮＡ；０．５ｍＭのＡＴＰおよび４５０凝集端単位
のＴ０ｎ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼが含まれた。結紮反応は
１５℃で１９時間であった。

４、組換えＣＧＦ４ＤＮＡによる大腸菌ＤＢ４５４８の
トランスフェクション ＋ 大腸菌株ＣＧＥ６（ＤＢ４５４８；ｈｓｄ、Ｒ、ｈｓｄ
Ｍ　。

５ｕｐＥ　、　５ｕｐＦ　、　Ｂｌ　、　ｍｅｔ　）が
１５０７ｍのトリプトン肉汁の中で振動しながら３７℃
で生長させられ、ＯＤ　７ｏｏ＝　０．５で４℃１０分
間の７００Ｏｒｐｍ遠心分離によって収穫された。その
細胞は７０献の氷冷５０　ｍＭ　ｆ）　Ｃａ（Ｊ２中に
再分散され、０℃で３０分間靜置きれた。この懸濁液は
それから４℃で７００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離され
、次に３ｍｌの氷冷５０ｍＭのＣａＣ／２中に再び分散
された。

０℃で２時間放置後、その細胞はトランスフェクション
に用いられた。

５０　ｍＭのトリス−ＨＧＪ、ｐＨ７，５中の結紮反応
液の１＝４０稀釈液の１μ）か２μノが、５０！Ｅｌ　
（７）無菌５０ｍＭのトリス−ＨＧｌ、ｐＨ７，５を入
れである１２本のチューブのおのおのに加えられた。あ
のＣａ（３１２処理した細胞懸濁液の／１０”を上のお
のおののチューブに加え、その混合物は３０分間氷上で
冷却された。その混合物を３７℃に２分間加温したのち
、終夜培養されたＧＧＥ５（ＪＭＩＯＩ：ＪｌＭｅｓｓ
ｉｎｇ　（１９７９）、△（ｌａｃ　ｐｒｓ）ＳｕｐＥ
　ｔｈｉ−バックグランビ中のＦ’ｔｒａｄ　３６ｐｒ
ｏＡＢ　／ａｃ　Ｉ　ＺＶＭ　１５　）の０．２ｍｌと
０６７％の柔い寒天培地の３Ｎとがその混合物に加えら
れ、次にその混合物はトリプトン寒天培地プレートに注
がれた。３７℃で一晩培養したところ１２８０以上のプ
ラクを生じた。

５、　白血球インターフェロン記号系列を保持する組換
えＣｅＦ２の同定 ブックはニトロセルローズに移すれ、Ｂｅｎｔｏｎおよ
びＤａｖｉ　ｓが述べたようにして［Ｂｅｎｔｏｎ　、
　Ｗ。

Ｄ、およびＤａｖｉｓ、　Ｈ，Ｗ　、、科学　１９６．
１８０−１８２（１９７７）］、ＬｅＩＦＮの既知のセ
グメントニ対応する　Ｐ−置換識別された合成オリゴヌ
クレオチド”　（ＣＡＴＧＡＴＴＴＵＴＧＣＴＣＴＧＡ
Ｃの記号系列を有する。コラボラチゾ研究会社製。）を
使用してそれは探索された。６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ
　。

ｐＨ７，５と１０ｍＭのＭｇＣ／２とを含有する２０μ
ｌの反応液中で６単位のＴ　４　、Ｉｆ　＋）ヌクレオ
チドキナーゼ（Ｐ−Ｌビオケミカル）を使用してオリゴ
ヌクレオチド（１μＩ）ＫＯ，５ｍＧ　γ−Ｐ−ＡＴＰ
を転移させた。この合成オリゴヌクレオチドプローブに
強く雑種繁殖したファージが板から採取されて４°Ｃで
ＴＹ培地中で貯えられた。健全なファージのサンプルが
ａｔ；ｇｓ細胞上で一晩成長させて増強されて遠心分離
で収穫され、次ＫＯ，３７Ｍのトリス−グリシン、　ｐ
Ｈ９，５を含む０．６％のアガローズゲル中で電気泳動
にかけられ、次に０，２ＮＮａＵＨで１時間処理しさら
に０．５１１１１のトリス−Ｈ（４！、ｐＨ７，４中で
中和したのちエシジューム臭化物で着色された。移動は
ファー：）Ｄ　Ｎ　Ａの大きさの１３ｏｇ、に逆比例す
るので、それＫより１０００〜１２００基本対の大きさ
をもつ挿入されたＩＦＮＤＮＡファージから、Ｐｉ（ｏ
ｓｅｓらの方法ＣＭｏ５ｅｓ　、　ｐ、Ｂ、。

Ｂｏｅｋｅ　、　Ｊ、Ｄ　、、堀内、に、およびＺｉｎ
ｄｅｒ　、　Ｎ、Ｄ　、。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０４．２６７−２７３　（１９８
０）　１により二重に撚られたＲＦＩＤＮＡが作られた
。このＤＮＡがＨｉｎｄＩ［ｒ限定的ヌクレアーゼを用
いて切断され、得られた断片をアガローズゲル上で分析
して挿入物はＨｉｎｄｍの部位にあって予想された大き
さであったことを確認した。ファー：）ＤＮＡの中の１
つで約１２００基本対（ｈｐ）の挿入物を有するものが
選択されて更に検討された。このＤＮＡ挿入物はＭａｘ
ａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの方法ＣＭａｘａｍ　、　Ａ
。

Ｍ、およびＧ１１ｂｅｒｔ　、　Ｗ　、　、酵素学の方
法　６８゜４９９−５６０（１９８０）］によって順序
どおりに並べられた。

表７ ６、サツカロミケスセレビジエ中のＬｅ　インターフェ
ロンの表示 表７に見られるとおり酵母中のり、インターフェロンの
表示をつかむのを容易にするよう考案されたプラスミド
ｐｃＧｓ２６１が組立てられた。酵母中ＫＬｅ　インタ
ーフェロンを生成するため、ＡＴＧ開始開始コードケン
熟した加工さねたインターフェロン（ＩＦＮ）の最初の
コードン（システィン用のＴＧＴ）の５′−側面にとり
込まれた。−ラ丑３Ａ＃はこの最初のコードンの３′−
側面で切断するという事実にもとすいて、コラボラチノ
研究会社によって、Ｃ７ａＩによって認識されかつＡＴ
Ｇ−ＴｔｅＴ系列を含有するオリゴヌクレオチド″’　
（ＡＣＡＣＡＴＣＧＡＴＧＴＧＴ）が合成された。アミ
ノ酸残基の２から６１までをコート５化する５ａｕ３Ａ
ｌ断片は、１０　ｍＭのトリス−ＨＧｌ、　ｐＨ７，５
；　１０　ｍＭのＭｇＣｌ２；および６０　ｍＭのＮａ
ｐｌを含む５０μｌの反応液の中で１０単位のＳａｕ　
３　ＡＡ’限定内ヌクレアーゼを使用してＨｉｎｄｍ　
１．２キロベ一ス断片の３０μｓを３７℃で４時間消化
すること釦よって、精製された。そのＤＮＡ断片はポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製された。この
ＤＮＡはフェノール抽出され、次に水冷１００チエタノ
ールで沈殿させられた。６６ｍＭのトリ、；ｒ、　−Ｈ
ＧＡ！、ｐＨ７，５；６６ｍＭのＮａＧ１；　６６　ｍ
ＭのＭｇＣｊｌ　２および６６　ｍＭのヂチオスレイト
ールを含む液中で４単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
　（Ｋｌｅｎｏｗ断片）と０．１ｍＭの各ヌクレオシド
三燐酸エステルとを用いてそのＤＮＡを室温で３０分間
処理することによってその凝集端はふさがれた。

６６　ｍＭのトリスＨＯ１，ｐＨ７，５；　１０　ｍＭ
のＭｇＣ７！２　ｔ　１０　ｍＭ　（’）　２−　メｋ
　カブ）　エタノール；５００ｐモルの　Ｐ−オリゴヌ
クレオチド（５μｇ）と共１ｃ１ｍＭのＡＴＰ；４ｐモ
／’のＤＮＡ　（２０ｐｇ）および４鈍い端末単位のＴ
４ＤＮＡＩＪガーゼを含む液中で、上記の合成オリゴヌ
クレオチドがＳａｕ　３　Ａｌｌ断片に１７℃で一晩生
結紮された。この結紮反応はＡＴＧ開始開始コードケン
しく作り、最初のコードンＴＧＴを復活した。１０ｍＭ
のトリス−ＨＣ６＝　ｐＨ７，５；　１０　ｍＭのＭｇ
Ｇ１１２；　オヨヒ１〜／ａの牛の血清アルブミンを含
む２０μｌの反応液中で２０単位の限定内ヌクリアーゼ
魚１を用いてこの断片を３７℃で３時間処理することＫ
よってＣＪａ　ＩポリＩＪンカーは除かれた。この得＋
−、Ｌ、、　Ｊ−ｗ−ｗ　＋＞　Ｊ’　ニー／　ｓ　ｔ
々−０Ｑｉ　Ｑ　ｌ）　小１”！ｌ＋　’ｒ　ｔｒＪＩ
／ｒ’ｒＫクローンされた。このプラスミド（１０ｐｇ
）は、１０　ｍＭのトリス−ＨＧＩ、　ｐＨ７，５；　
１０　ｍＭのＭｇＣＪ２および１＃Ｗ／−の牛の血清ア
ルブミンを含む２０μｌの反応液中で限定内ヌクレアー
ゼ（ＪａＩにューイングラント９ビオラボ、２０単位）
を用いて３７℃で２時間切断された。限定切断されたプ
ラスミドのこの製剤はフェノール抽出され、次にエタノ
ール沈殿させられ、次にそれはＨ。

ＧｏｏｄｍａｎおよびＲ＋Ｊ　＋ＭａｃＤｏｎａｉａの
方法［’Ｇｏｏｄｍａｎ　。

ＨｏＭ、およびＭａｃＤｏｎａｌｄ、　ＲｏＪ　、　、
酵素学の方法６８．７５−９１（１９７９）１によって
牛の腸の燐酸酵素を用いて処理されて末端の燐酸エステ
ルがとり除かれた。上述のＧ７ａＩ処理断処理的０．５
ｐモルとこのＣＪａ　Ｉ切断プラズミドの約０．３ｐモ
ルとが６６ｍＭのトリス−ＨＧｌ、　ｐ’Ｈ７，５；　
６　ｕ＋Ｍの”ｇｃ’Ａ’２　ｙ　１０　ｍＭのヂチオ
スレイトール；１ｍＭのＡＴＰ；およびプラスミドｐｃ
（：ＴＥ３２　を新しく作る°Ｉ’４ＤＮＡリガーゼに
ニーイングランドビオラボ、３００単位）を含有する２
０μｌの反応液中で１５℃で３時間お互に結紮された。

形質転換の能力のある大腸菌株０ＧＥ４３（ＬＧ９０；
Ｆ−へ（ｌａｃ−ｐｒｏ）　ｍ　）がＧＧＥ６に対して
前に述べたとおりにして調製された。あの結紮されたＤ
ＮＡの５μノがこの細胞の２００μｌと０℃で３０分間
混合され、次忙３７℃で２分間熱処理され、次に１８℃
で１０分間培養され、次に新鮮なトリプトン肉汁で５倍
に稀釈された。振動しながら３７℃で３０分間培養後、
この細胞はアンピシリン（２０μＥｌ／ｒｌｌ）を含有
するトリプトン板上にうすく延ばされた。アンピシリン
産抵抗性のあるコロニーが採取されてプラズミ）ＦＤＮ
Ａが調製され、次にそれは限定酵素消化により分析され
た。この判定基準により数個の細胞は要望されたプラズ
ミドｐＣにＥ３２を保持した。

インターフェロン遺伝子の残りは、アミノ酸残基３７を
指定する領域忙位置するＥｃｏＲＩ部位を使用して元に
戻された。プラズミドｐＣＧＥ３２−ＤＮＡ（１０μｇ
）は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；ｊ。

ｐＨ７，５；　１０　ｍＭのＭｇ（３Ｊ２；　６０　ｍ
ＭのＮａ（３；はび１〜／耐の牛の血清アルブミンを含
む２０μｌの反応液中で限定内ヌクレアーゼＨｉｎｄｌ
ＩＩ　（コラボラチプ研究会社、１２単位）を用いて３
７℃で２時間切断された。このＤＮＡは次に、１００ｍ
Ｍのトリス−ＨＯ２ｐＨ７，６；　１０　ｍＭのＭｇＧ
１２；３０ｍＭのＮａＣ／　；および１ｍ９／ｄの牛の
血清アルブミンを含む２０μｌの反応液中で内ヌクレア
ーゼＥｃＯＲＩ　（コラボラチズ研究会社、１５単位）
を用いて３７℃で３時間消化された。この限定切断ＤＮ
Ａはフェノール抽出され、次にエタノール沈殿され、次
に水圧再溶解されてから予備の水平の１．５チアガロー
ズゲルに加えられた。４０ｍＭのトリス−アセテ−）、
ｐＨ７，２中で２−３時間電気泳動後、そのゲルはエシ
ジニーム臭化物を用いて着色し、次にそれは長波長の紫
外光線の下で試験された。アミノ酸残基３７にＡＴＧ−
ＴＧＴのコードを指定する消化されたＨｉｎｄ工■から
ＥｃｏＲ’ｒまでのバンドは切り取られ、そしてこのＤ
ＮＡはゲルピースを凍結して次に解かすこと［Ｔｈｕｒ
ｉｎｇら、分析生物化学　６６、２１３（１９７５））
によって抽出された。このＤＮＡ断片はエタノール沈殿
され、次に水に再溶解された。インター７エロンクロー
ンを含有するこのプラズミトＩＣ２０μＩ）は上と同様
に限定内ヌクレアーゼＢｉｎｄｌｌ＋にニーイングラン
ドビオラボ、１８０単位）を用いて３７℃で２時間切断
され、次にこのＤＮＡ（１２ｐｇ）は限定ヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩ　（＝　ニーイ／グランド９ビオラボ、２４
単位）を用いて３７℃で６分間切断された。この限定切
断ＤＮＡはフェノール抽出され、次にエタノール沈殿さ
れ、次釦水に再溶解された。このＥＣ０ＲＩから旦■＋
ｄｌｌｌまでの断片はインターフェロンの３′−翻訳し
ない領域にアミノ酸残基３７を指定するものであるが、
その断片はゲル電気泳動により分析されてゲルから切り
取られた（上を見よ）。

各断片の約０．２５ｐモルがともｉＣ，６６ｍＭのトリ
ス−ｔ［ｌ、ｐＨ７，６；　６．６　ｍＭのＭｇＣ／２
；１０ｍＭのヂチオスレイトール；１ｍＭのＡ７［’Ｐ
およびＴ４ＤＮＡリガーゼにニーイングランドピオラボ
、３００単位）を含有する２０μｌの反応液中で、Ｈｉ
ｎｄｍ部位（上を見よ）で開かれたプラズミ）”ｐＢＲ
３２２に結紮された。

形質転換の能力のある大腸菌株ＣＧＥ４３細胞が正確に
上述したとおりにして調製された。そしてこの結紮され
たＤＮＡの５μｌがこの細胞の１００μｌと０℃で３０
分間混合され、次に３７℃で２．５分間熱処理され、次
に新鮮なトリプトン肉汁で１０倍に稀釈された。振動し
ながら３７℃で３０分間培養後、細胞はアンピシリン（
２０ｐｇ／ｌ）を含むトリプトン板上にうすく延ばされ
た。

アンピシリンに抵抗性のあるコロニーが採取されてプラ
ズミ・ｐＤＮＡが調製され、それは限定酵素消化によっ
て分析された。この判定基準により数個の株は要望され
たプラズミ）”ｐＧＧＥ３Ｂを保持した。

ＰｏＡＬ□が＆ｏＲＩおよび垣Ｈ１部位の間に挿入され
た標準の連続往復式ベクトルであるｐＣＧＳ１０９の中
にＨｉｎｄ　ｍ部位が組立てられた。ベクトルｐ（ＧＳ
１０９はＢａｍＨＡ’限定酵素を用いて切断され、Ｓｌ
　ヌクレアーゼを用いて消化されて凝集端を除いて鈍い
端末を有するものにし、次にＨｉｎｄｌｌｌリンカ−に
結紮された。このベクトルは曳二更限定酵素を用いて処
理され、次に凝集端が互に結紮されてベクトルｐｃＧｓ
１３５を生成した。プラスミド５ｐｃＧＥ３８を限定内
ヌクレアーゼＨｉｎｄｍを用いて上と同様に３７℃で１
．５時間切断することによって、そのプラスミド（３０
μｇ）からＬｅインターフェロンの遺伝子を含有する１
、１キロヘースＨｉｎｄ　ｍ断片が単離された。この制
限切断ＤＮＡはフェノール抽出され、次にエタノール沈
殿され、次に水に再溶解されて予備の１チアガローズゲ
ルに加えられた。４０　ｍＭのトリス−アセテート中で
電気泳動後、このゲルはエシジニーム臭化物で着色され
て長波長紫外線の下で試験された。１．１キロベースバ
ント９が切り取られ、このＤＮＡは、ゲルを凍結して次
に解かす方法［Ｔｈｕｒｎｉｎｇら・分析生物化学　６
６．２１３（１９７５））　により抽出された。このＤ
ＮＡ断片はエタノール沈殿さ朴、次に水に再溶解された
。このＨｉｎｄｌｌＩ断片の約０．２μｓが、ＰＧＡＬ
１領域に隣接した旦ｉｎｄｍ部位で開かれたプラスミド
ｐｃＧｓ１３５　（１μｇ）に結紮された。このベクト
ルとインターフェロン断片との結紮は、６６ｍＭのトリ
ス−ＨＧＩＩ、ｐＨ７，６；６．６ｍＭのＭｇｃｚ２ｙ
　１０　ｍＭのヂチオスレイトール；１ｍＭのＡＴＰお
よびＴ４ＤＮＡリガーゼ（コラボラチブ研究会社、１０
単位）を含む２０μノの反応液中で１４℃で行われた。

コノプラズミ）”ＤＮＡを使用してＡ、Ｈｉｎｎｅｎ　
。

Ｊ、Ｂ、ＨｉｃｋｓおよびＧ、Ｆｉｎｋの方法［Ｈｉｎ
ｎｅｎ　、　Ａ、。

Ｈｉｃｋｓ　、　Ｊ、Ｂ、およびＦｉｎｋ　Ｇ、Ｆｏ、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｌ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５，１９２９−１９３３
（１９７８））により、酵母菌ＣＧＹ５２８（αｕｒａ
３−５２．　ｈｉｓ４−２９、　ｐｅｐ４−３．　ＧＡ
Ｌ＋）が形質転換サレタ。フラズミド上にＵＲＡ３が存
在するためウラシルが添加されなくても成長が可能な酵
母の形質転換品のＣＧＹ５２８が採取された。（プラス
ミドｐｃＧｓ２６１を保持する株Ｇ（）Ｙ５２Ｂは米国
類型培養コレクション（ＡＴＯＣ）　に預けである。受
入れ番号２０６６３．１９８３年２月預は入れ。）この
酵母細胞は、６．７１１／ＩＩの酵母窒素ベースと２０
μＩｆ／１１のヒスチジンと２％のガラクトースとを含
有する培地中で振動しながら３０°Ｃで成長させた。イ
ンターフェロンの合成をまクレット＝５０（１０細胞／
ｄ）まで成長させたこの細胞を遠心分離して集めること
によって確認された。

すなわち集めた細胞は０．０５Ｍのトリス−Ｈ（Ｊ　。

ｐＨ７，６；２０％のグリセリンおよび１ｍＭのＰＭＳ
Ｆを含む０．２５ｍ１の液中に再分散させ、次に一２０
℃で凍結した。この細胞は、Ｍ、Ｒｏｓｅらの方法［Ｒ
ＯＳ　ｅ　ｇ　Ｍ　、　＊　Ｃａ５ａｄａｂａｎ　ｇ　
Ｍ　、Ｊ　、およびＢｏｔｓｔｅｉｎ　、　Ｄ、＋Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ−８ｃｉ−ＵＳＡ　７８゜２４
６０−２４６４（１９８１）１によりガラスビードで分
裂させられた。細胞の抽出物中のインターフェロン活性
度の量は常法により定量され可溶たん白質１〜当り１０
　単位であった。

生成された人間の白血球のインターフェロン遺伝子を順
序とおりに並べる情報を表８に示す。

実施例３ プロレンニンの製造 １、　ＲＮＡの単離 乳汁−飼養の子牛からの異組織を他方の畜殺場から新し
く入手した。即ち第４．胃の粘液を胃壁から切開して取
出し、ドライアイス中で冷凍した。

２１ｇの粘液質組織を混合機によってｐＨ７，５のトリ
ノ塩酸塩５０ミリモル、グアニジン塩酸塩８Ｍおよびジ
チオスレイトール１ミリモルとからなる緩衝液（１０℃
）２００１ｄの中に崩解させた。

不溶性物質をツルパル（８０マａｌｌ　）　５Ａ−６０
０回転子の中に１０．００　Ｏｒｐｍで１２分間遠心分
離により除去した。スピンからの上澄液２００威に水冷
無水エタノール１００ｍ／を添加した。−２０℃で１．
５時間後、沈殿を一１０℃で３０分間３０００ｒｐｍで
遠心分離によりはレット化した。はレットを蓼ＵＴＡ２
０ミリモル、ｐＨ７のＮａ０Ａｃ　２０ミリモル、ｐＨ
７のグアニジン塩酸塩８モル及びジチオスレイトール１
ミリモルよりなる水冷緩衝液（’に’、（：Ａｎ　）　
ｒ４ｍｌ　！−−％ｈ４＋ｃ壺−ｃＪ　／　−ル９　を
−ｍｉを添加し、溶液を一２０℃に４５分間放置した。

沈殿は一１０℃で２０分間３０００　ｒｐｍで遠心分離
によりはレット化した。はレットは４０−の冷Ｅ（、Ａ
Ｄ緩衝液中に再溶解し、冷エタノール２０＃＋７！によ
る沈殿、遠心分離及びＥＧＡＤ緩衝液中に於けるベレッ
トの再溶解を更に２回反復した。最後にベレットをｐＨ
７，２０ミリモルのｇＤ’ｒＡ　ｌ　６ｍｌに溶解しク
ロロホルム：イソブタノール（４：１）により３回抽出
した。次に、２容緻の４．５モルｐＨ５，２のＮａ０Ａ
ｃを水層に添加し、溶液は一２０℃で一夜放置した。Ｒ
ＮＡの沈殿は一１０℃で１０．００　Ｏｒｐｍで２５分
間遠心分離により収集し、水３ＱｍＪ中に溶解した。収
量は、ＲＮＡ４５ｍｇであった。ＨＮＡはｐＨ５の２モ
ルのＮａ０Ａｃ１、．１及び無水エタノール７５ｉＪの
添加により沈殿させ、続いて一２０℃で一夜培養した。

ＲＮＡは遠心分ｍ＆　（１０，００Ｏｒｐｍ、　−１０
℃１０分）によりベレット化し、水２０−に再溶解し、
６０℃に１０分間加熱し、氷上で迅速に冷却し２倍の濃
度の結合緩衝液（ＤＨ７，５のトリス塩酸塩２０ミリモ
ル、ＤＨ７０２ミリモ／ｌ／のＥＤＴＡ、　０．４　％
　Ｓ　Ｄ　Ｓ及びＮａＣｌ０１２４モル）で希釈した。

１（ＮＡを４Ｍ（７）オリｄ−ａＴ−セルロースカ２ム
ニ添加し、カラムを１倍＃度の結合緩衝液４５ｍ７！で
洗滌し、次いで塩を含まぬ結合緩衝液でカラムを洗滌す
ることによりポリへ−含有ＲＮＡを溶離した。約ＩＩｎ
ｇのポリＡ−含有ＲＮＡが得られた。ポリＡ含有ＲＮＡ
の１部を試験管内でうさぎの網状赤血球溶解質系に翻訳
した（エッチ・アール・ビー・ベルハム（Ｈ，Ｒ８Ｂ−
Ｐｅｌｈａｍ　）及びアール・ジエ・ジャクソン（）１
−Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ　）　（１９７６）　（Ｅｕｒ−
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

６７．２４７−２５６）。タンパク質生成物は１０％ポ
リアクリルアミド９ゲル上で分析した。主要の単一タン
パク質バンドが観察され、これはレンニンｍＲＮＡがｙ
ｄすＡ−含有ＲＮＡ中に存在することを示すレンニン抗
血清により沈殿した。

２、二重鎖複写ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の製造ｃＤＮＡ約８
．７　＃！　ヲ子牛ｆ）　胃ホ！Ｊ　Ａ　−含有ＲＮＡ
２０μＩから逆トランスクリプターゼ１００単位及びＩ
　Ｃｔ／　ミ＋）モルα　ｐ−ｄｃ’ｒｐを含有するｐ
Ｈ８，３のトリス・塩酸塩５０ミリモル、ＭｇＧ１１２
８ミリモル、ジチオスレイトール０．４ミリモル、各デ
オキシヌクレオシド３リン酸塩１ミリモル、オリゴ（−
ｄＴ）　１２−１８２０μｂ匂中で４２℃で１時間培養
することにより合成した。反応混合物を１００℃で３０
分間加熱した後氷上で３分間冷却し、遠心分離により沈
殿したタンパク質を除去し上澄液物質の半量にｐＨ６，
９のへブスＫＯＨ１００ミリモル迄、ＭｇＧ１２５ミリ
モル迄、ジチオスレイトール０．５ミリモル迄、デオキ
シヌクレオシド３リン酸塩０．１２ミＩＪモルを添加し
た。この混合物を３００単位の大腸菌Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｊ　
リメラーゼ■により１６℃で２時間培養し二重鎖ｃＤＮ
Ａ８．６μｇを生産した。ＤＮＡはフェノール抽出しセ
ファデックスＧ−１’００上でクロマトグラフィにより
混合しない３リン酸塩から分離した（１２ｍｌカラム。

０．７ｃ１ｆＬＸ　３０ｖａ、ｐＨ７，５のトリス・塩
酸塩を２０ミリモル、ＥＤＴＡＱ、５ミリモルにより溶
離した）、かつｐＨ５の２モルのＮａ０Ａｃ１／１ｏ容
量及び冷エタノール２．５容量を添加し一２０’Ｃで一
夜エタノール沈殿を行った。２重鎖ｃＤＮＡ（４，６μ
ｇ）を次に３７℃で１時間緩衝液Ｓ　（ＮａＣ１０，３
モル、ｐＨ４，６のＮａ０Ａｃ　３０ミリモル。

Ｚｎ５Ｏ３ミリモル）中で１０００単位のｓ７ヌクレア
ーゼで処理した。反応はＥＤＴＡＩＯミリモル迄、ｐＨ
８，３のトリス・塩酸塩２００ミリモル迄を添加して終
結させ、混合物をビオゲルＡ−１５０ｍカラム（０，７
ｃＩｒＬＸ　３３ＣＩＩＬ）に加えｐｉ（７，５０トリ
ス・塩酸塩１０ミリモル、ＥＤＴＡｌミリモル及びＮａ
ＣＪ　２５０ミリモルにより平衡かつ溶離した。

大分子量ＤＮＡのピークの留分（各０．５　Ｉｌｌ　）
はプールし、かつｐＨ５のＮａ０Ａｃ　２モル１／１０
ｙ量及び冷無水エタノール２．５容量を添加しエタノー
ル沈殿させた０ ３、男功生■結鎖剤の付加 Ｓ／処理した二重鎖ＣＤＮＡ（１，７Ｍｇ）を緩衝液Ｔ
（ｐＨ８，のトリス・塩酸塩２５ミリモル、ＭｇＯ１２
６，６ミリモル、ＥＤＴＡ　０．５ミリモル、２−メル
カプトエタノール５ミリモル及び各デオキＴ４ＤＮＡｙ
Ｎリメラーゼ２単位により室温で３０分間培養した。こ
の物質をフェノール抽出し、ｐＨ５，２モルのＮａ　Ｏ
Ａ　ｃ　１／１ｏ容量及びエタノール２．５容量を添加
しエタノール沈殿した。プラント終了２重鎖ＣＤＮＡは
次にｐＨ７，６０トリス・塩酸塩６．６ミリモル、Ｍｇ
Ｃ／２６．６ミリモル、２−メルカゾトエタノール５ミ
リモル、Ａ　Ｔ　Ｐ　０．５ミリモル中で３００ｐモル
の　Ｐ−標識Ｈｉｎｄ　ｉｌｌ　合成結鎖剤（ｃＤＮＡ
末端に１００倍過剰）及びプラント終了９単位の゛ｒ４
ＤＮＡＩＪガーゼにより１２℃で一夜培養した。

反応はＥＤＴＡｌ　０ミリモルｐＨ８に調節し、ビオゲ
ルＡ−１５０ｍカラム（０，７ｃＩＩＬＸ　２０ｃＩｒ
Ｌ）上で分留した。高分子量ＤＮＡ含有留分をプールし
、エタノール沈殿した。この物質はｐＨ７，６０トリス
・塩酸塩５．６ミリモル、ＭｇＣ１□５．６ミリモル中
テＨｉｎｄｍ制限エンドヌクレアーゼ（９単位）により
３７℃で４５分間処理し、次いでエタノール抽出し、ｐ
Ｈ５の１モルのＮａ０ＡＣ／１ｏ　容量’ＫＬ　ＹＶ　
ｋ↓、す１−一航り仁カ塾わ祈１ｗ＋　ｌ　丁Ａノール
沈殿した。Ｈｉｎｄｍ　凝集末端を有する二重鎖ｃＤＮ
Ａは次にＨｉｎｃｌｌ１１制限エンド９ヌクレアーゼに
より切り開かれたｆｌファー：）ＣＧ　Ｆ　４二重鎖Ｄ
ＮＡに結紮され、エッチ・グツドマン（ＨｌＧｏｏｄｍ
ａｎ）及びアール・ジエ・マクドナルト責Ｒｊ、ＭｃＤ
ｏｎａｌｄ）の方法（Ｈ，Ｍ、Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ
　Ｒ，ＪｌＭａｃＤｏｎａｌｄ　＋Ｍｅｔｈｏｄｓｉｏ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　６８．７５−９１　（１
９７９）により牛の腸のホスファターゼにより２回処理
し末端リン酸塩を除去した（註：ファージＣＧＦ４を製
造するため、ｆｌファージＩ（２２９［ジエ・ディ・ベ
ツク（Ｊ、Ｄ、Ｂｏｅｃｋｅ）、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇ
ｅｎｅｔ、１８１＋２８８−２９１（１９８１）］はＩ
ｉ：Ｃ０）（Ｉエンドヌクレアーゼにより切断しＴ　４
　Ｄ　Ｎ　Ａ　ポリメラーゼによりプラント終了しマサ
チュセット州つオルサムのコラボラチブ・リサーチ社か
らのＨｉｎｄｍ合成オリゴヌクレオチド９結鎖剤により
結紮した）。結紮反応液はｐＨ７，６０トリス・塩酸塩
６６ミリモル、ＭｇＣ／２６，６ミリモル、メルカプト
エタノール５ミリモル、二重鎖ｃＤＮＡ０．３μｙ、　
０ＧＦ４ＤＮＡ０．２μ、９．ＡＴＰｏ、５ミリモル及
び凝集末端３００単位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを包含し
た。結紮は１６℃で２９時間であった。

４、組換え−ＣＧＦ４　ＤＮＡによる大腸菌ＢＮＮ４５
のトランスフェクション 大腸菌系統の（３ＧＥ６　（ＢＮＮ４５　；ｈｓｄＲ−
、ｈｓｄＭ”。

５ｕｐＥ　、　５ｕｐＦ　、　ＢＬ　、　ｍｅｔ　）は
トリプトンプロス中で３７℃で振盪しつ又増殖させ、４
℃で７００Ｏｒｐｍで１０分間遠；υ分離により０Ｄ７
ｏｏ＝０．５で回収した。細胞は氷冷ＣａＣｌ２５０ミ
リモル中（元の培養容量の２分の１）で再懸濁し、０°
Ｃで３０分間に静置させた。懸濁液は次に４℃で１０分
間７０００ｒｐｍで遠心分離し元の培養容量の１／２ｏ
の氷冷ｃａｃｚ２５０ミリモル中に再懸濁させた。０℃
で６０分間放置した後、細胞をトランスフェクションの
為に使用した。２０μｌ結紮反応物の２分の１ミクロリ
ツトルをｐＨ７，６の５０ミリモルの無菌トリス・塩酸
塩５０μｌを包含する８本の各々の試験管に添加した。

ｃａ　Ｃ／　２処理細胞の１０分の１ミリリツトルを各
管に添加し、混合物を氷上に３０分間靜静置た。３７℃
に２分間加温した後、０．２１ＬｌのＯＧＦ：５　（Ｊ
、ＭＩＯＩ　：　：）工・メツシング（ＪｏＭｅｓｓｉ
ｎｇ（１９７９）、　Ｆｔｒａ　Ｄ３６　ｐｒ。

ＡＢ　Ａ’ａｃ　ＩＺ△Ｍ１５ｉｎａ△（ｌａｃ　ｐｒ
ｏ）　５ｕｐＥｔｈｉ　ｂａｉｋｇｒｏｕｎｄ）を−夜
培養し、０．７チの柔かな寒天３ｒＬｌを加え混合物を
８本のトリプトン寒天プレート上に注加した。３７℃−
夜培養してプレート当り約２５０斑点が生成した。

５、　レンニン−コード付は配列を保有する組換えＯＧ
Ｆ４の同定 ブラックをニトロセルロースに移植シヘントン及びダビ
ス（ＪＤ、Ｂｅｎ’ｌ’ｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖ
ｉｓ（１９７７）ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６，１８０−１
８２）により記載された如くα　ｐ−ｄｃ’ｒｐ及び逆
トランスクリプターゼ（Ｔ、Ｐ、ｓｔ、Ｊｏｈｎａｎｄ
　Ｈ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ（１９７９）Ｃｅｌｌ、１６，４
４３−４５２）を使用する子牛の胃ポリＡ含有ＲＮＡか
ら製造した　Ｐ標識ＣＤＮＡを使用し試験した。標識Ｃ
ＤＮＡに強＜ノ・イブリッド形成した約８０の組換えフ
ァージをプレートから取りＴＹ媒体中に４℃で貯蔵した
。完て増幅し、遠心分離により回収し、　ｐＨ９，５０
トリス・グリレン０．３７モルを含有する２’１のアガ
ロースゲル中で電気泳動にかけ、０．２規定のＮａＯＨ
中に１時間処理し、かつｐＨ７，４のトリス・塩酸塩０
．５モル中で中和した後、臭化エチジウムで染色した。

遊走はファージＤＮＡの大きさの対数に逆比例し、大き
さ１０００−２０００ベースの対の挿入ＤＮＡを伴なう
８フアージの選択ができた。２重鎖ＲＦＩＤＮＡはこれ
らの８フアージからモーセス等の方法（Ｐ、Ｂ、Ｍｏ５
ｅｓ　、　Ｊ、Ｄ、Ｂｏｅｋｅ　。

に、Ｈｏｒｉｕｃｈ　Ｎ−Ｄ、Ｚｉｎｄｅｒ（１９８０
）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１０４．２６７）により製造した。このＤＮＡはＢｉｎ
ｄＩ［Ｉ　で切断し、得られたフラグメントはアガロー
スゲル上で分析し挿入がＨｉｎｄ１１１部位にあり、予
期した大きさであることを確認した。最俵に、４個の組
換えファージからのＤＮＡ　（各々から約５−１０μ１
１）及び媒介ＣＧＦ４からのＤ！すＡをＢｉｎｄｌｌ＋
　で切断し、フラグメントは４５分間沸騰し、ドライア
イス／エタノール中で冷凍することにより腎性Ｌｆｖ後
−２０倍のＳＳＣで予備処理し乾燥したニトロセルロー
スの小片上に水中のＤＮＡを点滴することによりニトロ
セルロースに結合させた。真空中で７５℃に１．５時間
焼成した後ニトロセルロースに結合したＤＮＡはミラー
等により記載されたバイブリド選択法により（Ｊ、Ｓ。

Ｍｉｌｌｅｒ　、　Ｈ，Ｐ、Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ　、　
Ｂ、Ｅ、Ｒｏｂｅｒｔｓ　、　Ｂ。

Ｍ＋Ｐａｔｅｒｓｏｎ　Ｎ、Ｂ−Ｍａｔｈｅｗｓ（１９
８０）　ＪＪｏｌ＋Ｂｉｏｌ、１４２，４５５−４８８
）各々のハイズリラド形成にｙｆ　＋）　八−の豊富な
子牛の胃のＲＮＡ２μｇを使用して実施した。溶離した
ＲＮＡは次にベルハム及びジャクソンの方法により（Ｈ
，Ｒ，Ｐｅｌｈａｍ２４７−２５６）　Ｓ−メチオニン
で標識した網状赤血球溶解質系に翻訳し、得られたタン
パク質生成物はレムリイ（Ｕ、Ｌａｅｍｍｌｉ　（１９
７０）　Ｎａｔｕｒｅ２２７　６８０−６８５）０．１
チＳＯ８を含有する１０チのポリアクリルアミビゲル上
で分析した。ゲル分析の結果は試験したファージＤＮＡ
５の４個全ては選択した４種全体がうさぎの網状赤血球
溶解質に翻訳中に大きさ及び免疫学的規準においてプレ
ープロレニンに同一なタンパク質製品を生ずるＲＮＡ系
を選択したのでレニンｍＲＮＡにハイゾリッド形成した
ことを示した。４種の中２種、約１４００−！７（ｈＰ
）ｆ）挿入を有する２９３−２０７　及び約１２５０ｈ
ρの挿入を有する２９３−１１８／３７が将来の研究の
ため選択された。ＤＮＡ挿入はマキサム及びギルバート
の方法により配列された（　ＳｏＭｏＭａｘａｍ　ａｎ
ｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　、　６８．４９９−５６
０　）。

ヌクレオチド２０５から１３５０まではプレープロプレ
ニンＡ遺伝子に対するＤＮＡ配列である（第９表参照）
ヌクレオチド９の配列１−２０４及び１３５１−１４６
０はプレープロプレニンに付着されるがもし望ましけれ
ば除去でき式中の遺伝子の利用には重要でない。第９０
表のＤＮＡ物質の有用な部分は分離し、かつ既知の技術
で利用できる。

この表には２９３−２０７両者からの情報が組合わされ
ている。即ち組換えファージ２９３−２０７は削除され
るヌクレオチド’８４８−９６１を除いて第９表に示さ
れた配列を帯びる挿入部をヌクレオチ）１番から少なく
ともヌクレオチド１３６０番まで保有しＣいるが、ファ
ージ２９３−１１８／３７はヌクレオチド２２９番から
ヌクレオチｒ１４６゜番迄の配列を帯びる挿入部を保有
する。配列した結果により示された如く、レニン合成の
開始はメチオニンコード（ヌクレオチ）’２０５−２０
７）に起り精製プロレニンに比較し更に付加した１６の
アミノ酸を持つプレープロレニンを生スる。

（フロフロレニンＢアミノ酸配列はビー・フォルトマン
等（Ｂ　、Ｆｏｌｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ　、　Ｐｒｏｃ
＋Ｎａｔ＋Ａｃａｄ−８ｃｉ、ＵＳＡ　７４．２３２１
−２３２４（１９７７）及びビー・フォルトマン等（Ｂ
、Ｆｏｌｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌにより発表された。即ち
、第９表のヌクレオチド配列データはプレープロレニン
の存在の最初の表示である。２種の組換えｆｉｔファー
ジ２９３−２０７及び２９３−１１８７３７　は共に全
ブレープロレニンへ分子に対しＤＮＡの配列を保有する
。プレープロレンニンＡのプロレンニン部分＆！’７　
ミノ酸２９０番に於けるプロレンニンＢとは異なる（フ
ォルトマン等（上記参照）により記載された如くレニン
Ａ中のアスラギン酸塩及びレニンＢ中のグリシン、即ち
アミノ酸の位置番号は７オルトマンのそれである）。ア
スパラギンコードンはアミノ酸位置２０４番に示された
が、フォルトマンはその位置にアスノξラギン酸塩を報
告した。然しなから、これはアスノξラギン酸塩及びグ
ルタミン酸塩のアミドはそれらの酸形態と区別すること
は困難であるからアミノ酸配列の誤りであるが、ヌクレ
オチドの配列は容易にそのコードンを容易に区別できる
。

ファー：）２９３−１１８／３７　により代表されるク
ローンのレンニン遺伝子はウシゲノムの複写またはレン
ニン遺伝子の複写の性質を調査するのに使用された。こ
れらの実験は種々の制限酵素はより切断し、アガロース
ゲルにより分離し、サウザーンの方法（Ｅ、Ｍ、５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ［１９７５１ＪｌＭｏｌ　、Ｂｉｏｌ　−９
８５０３−５１７）により翻訳したクシＤＮＡに対し刻
み目−翻訳の方法（Ｐ−Ｗ、Ｊ、ｆ（ｉｇｂｙ　、　Ｍ
−Ｄｉｅｃｋｍａｎ　、　Ｃｊ（ｈｏｄｅｓ　ａｎｄ　
Ｐ、Ｂｅｒｇ　ｒ　１９７７　”ＩＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、１１３．３２７−２５１）により　Ｐにより標識し
たクローンのレニンＤＮＡをハイブリッド形成すること
により実施した。その結果はクローンのプレープロレン
ニンｃＤＮＡ配列を切断りないＳａｃ　］及びＢｇ１１
の如き酵素によるウシＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ
の配列はそれにも拘わらずレンニン配列にハイブリッド
形成するＤＮＡの１以上のバンドを屡々生ずることを示
した、これは（α）レンニン情報のゲノムの複写が更に
ＤＮＡを包含し、恐らくレンニンｃＤＮＡには見出され
ない制限酵素位置を含有する配列が介在するか、（ｂ）
１個以上のレンニン遺伝子が複写間で切断したゲノム及
び制限酵素中に存在することを示唆している。仮者の可
能性はクローンのし／ニンｃ　ＤＮＡの５′及び３′末
端から誘導された　Ｐ標識リッド形成することにより除
去された。例えば制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ　
及びＢａｍ　Ｈを使用したこれらの結果はレンニンコー
ド付は情報の単一のゲノム複写と一致した。これはビ、
フォルトマン等により観察されたレンニンのＡ及びＢ形
態（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈｅｍ、２５４．８４４７−８４
５６ｒ　１９７９］　）がレンニン遺伝子の２種の異な
る対立遺伝子の製品に最も類似することを意味する。更
にレンニン遺伝子のウシゲノムの複写は介在する配列を
含有し、その観点でゲノムの複写はプレープロレンニン
に対する伝令ＲＮＡに一致する我々のクローンのＣＤＮ
Ａと異なる。

６、酵母におけるプロレンニンノ表現法組換えｆｌ　フ
ァージＧＧＦ２９３−２０７　ＲＦ　ＩＤＮＡ（４０μ
幻をＨｉｎｄ’ＪＭ　（Ｎ、　Ｅ生物研、１５単位）及
びＢｇｌｎ　（Ｎ、Ｅ、生物研、１４単位）により前記
の如（１０３μｌの反応容量で３７℃で１時間切断した
。制限カッ）　Ｄ　ＩＱ　Ａを予備の水平のアガロース
ゲルに添加しｈｐ　２９３−２０７　の４３５ｔｒｚ　
し０ｗ　モＪ−Ｔｌ　ｈ　ｆＩｂ　ｈ　−ｒ　Ｊ＋　＋
　Ｊ−ｒ＋　ＬＬ　ａ、　ｖ／＋　−＋　ｘ＋　＋＋す
ることにより溶離した。エタノール沈殿をさせた後、Ｄ
ＮＡは水に再溶解し、約１μｓをＨｈａ　１（ｔｊＥ−
生物研、０．０６単位）により３７℃で１５分間部分的
に切断してＰＲ発端培養を含有する１　９０　ｈ　Ｐ　
Ｈｈａ　Ｉ　＝　ＢｇｅＵ切片を得た。コノＤＮＡフラ
グメントを前記の如（ゲルにより単離し、ｐＨ７，５の
’ｌ’ｒｉｓ　−ＨＣｌ　６０ミリモル、ＭｇＣＪ２８
ミリモル、ジテオスレイトール１０ミリモル及び各デオ
キシヌクレチ）”３リン酸塩０．２ミリモルを含有する
反応液３０μｌ中でＤＮＡポリメラーゼｌ　（Ｂｏｅｈ
ｖｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　＋　１４単位）によ
り室温で３０分間処理することによりプラント終了させ
た。ＤＮＡはフェノール抽出し、エタノール沈殿した。

ＡＴＧＧ（例えばＣＯＡ’ｒ（３ＴＡＧＡＴＧＧ　）で
終るＸｈａ　］制限エンドヌクレアーゼ配列を保持する
合成オリゴヌクレオチド９はコラボラチブ・リサーチ社
によるトリエステル法（Ｋ　、　ＩＴａｋｕｒａ等、Ｊ
、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５０　４５９２［１９７５］）により合成
し、５μｇを６単位の゛ｒ４ポリヌクレオチド　キナー
ゼ（Ｐ　−Ｌ　Ｂｊ、ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用し
ｐＨ７，６のＴｒｉｓ　ＨｃｌＪ　、　ＭｇＣＡ’２１
０ミリモル、２メル力プトエタノール１０ミリモル及び
２ｎモルのＡＴＰを含有する反応液３５μ！中でＸ　Ｐ
−ＡＴＰによりキナーゼ化した。この５′一体織オリゴ
ヌクレオチド”（２２Ｐ−モル末端）を約０．５ｐモル
の１９０Ａ７）フラグメントに緩衝液プラス５００単位
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎ、Ｅ−生物研）と共に添加し
た。反応液は１５℃で１時間次に４℃で一夜培養し、次
いでＮａＣ１１８０ミリモル、Ｍｇ（Ｊ２７ミリモル及
びｐＨ８のＴｒｉｓ　５ミリモルの４容量で希釈した。

６５℃で５分間加熱した後、１２単位のＸｂａ　Ｉ制限
エンドヌクレアーゼ（１，５時間の全消化に対し１時間
後に更に５単位を添加した）で処理した。最後にオリゴ
ヌクレオチド単量体を結鎖した１９０ｂＰＤＮＡからゲ
ル電気泳動（７チポリアクリルアミド・ゲル）により除
去した。ＤＮＡフラグメントはアクリルアミド切片から
緩衝液中に２４時間浸漬することにより溶離した。ＤＮ
Ａはエタノール沈殿させ、水１５μｌに再溶解し、Ｘｂ
ａ　１の位置で開口したＣａＦ２２−ｆｌ媒体を含有す
る結紮反応液中で培養し、次いで前記のようにアルカリ
性ホスファターゼで処理した。結紮反応のアリコートを
上記の如（ＬＧ９Ｑ系の形質変換適格細胞に使用した。

形質変換細胞をｆｌｌ能能細胞ＪＭＩＯＩ）を含有する
トリプトン−酵母抽出プレート上に置いた。多数のファ
ージプラークを採取し、各々の培養株を少量のＦＲＩ・
ＤＮＡを与えるまで増殖した。制限エンドヌクレアーゼ
消化（ＸｂａＩ及びＨａｅｌｌｌ）及びアガローズゲル
電気泳動は若干のファージクロンは望ましい１９０　ｈ
Ｐフラダメントを望ましい配位（００２１２０１個のＥ
ｃＯＲＩ位置に隣接するプロレンニン遺伝子の５７−末
端）に保有した。かＮる１個の単離体をＣａＦ２１と称
した。

約１０μＩのＧＣ，Ｆ２１ＤＮＡを前記の反応液４０ｍ
１中で１ｉｃＩ（Ｎ、Ｅ、生物研、１０単位）により３
７℃で４５分間切断した。１００　ｈｐＰｓｔｌ／Ｅｃ
ｏＲＩ　フラグメントをアクリ−ルアミド９ゲルに１−
　ｈ　１Ｍ１１１ｉｔｌ　Ｊ−−／　Ｑ　−ｒ　Ｓ　Ｌ
”−ＱＲＱＱＱ　／　Ｑ　ＩＩＱまで）を反応容量３０
μ！中でＥｃｏＲＩ　（Ｎ−Ｅ、生物研、７．５単位）
及び月月脱１１１（Ｎ、Ｅ生物研ｊ　７．５単位）によ
り３７℃で１時間切断した。得られた旦胆炉／多、ＯＲ
Ｉ　フラグメント（４，３Ｋｂ）はアガロースゲルで精
製した。Ｃ（１’２９３−１１８／３７ＤＮＡ　（ｌ　
Ｑμｇ）は反応容量３０μｌ中でＰｓｔ　１　（Ｎ、Ｅ
、生物研、８単位）及びＨｉｎｄｌｌｌ（１１，Ｅ生物
研、１０単位）により３７℃で１時間切断した。１．１
　ｋｂ　Ｐｓｔｌ　／Ｈｉｎｄ［ＤＮＡ　７ラグメント
はアガロースゲルにより精製した。３個のＤＮＡフラグ
メントを３−分子結合反応液中に加えｐＣＧ６８を生じ
た。３分子結紮（反応容量２７μｌ）は等モル比の３ラ
グメント合計１．５μｌＤＮＡを含有した。結紮反応を
４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎ、Ｅ−生物研）に
より１２℃で８時間実施した。結紮反応のアリコートは
記載したようにＬＥ３９２系の形質変換適格細胞に使用
した。制限酵素消化（工特１．摩遅１．十μす及びＫｐ
ｎｌ）及びアガロースゲルによるプラスミドＤＮＡの分
析は若干の単離体が望ましいプラスミ）”Ｔ）ＣＧＥ６
８　を保有した。このプラスミ白まＤＮＡコード付けす
るＭｅｔ−プロレンニンを含有する。

ｐＧＣ，Ｅ６ＢＤＮＡ（１０μｇ）はＸｂａＩ（Ｎ、Ｅ
、生物研、１０単位により３７℃で２時間切断した。エ
タノールによる沈殿後、ｓ７ヌクレアーゼ（３０単位）
で３７℃で３０分間の処理によりブランクを終了させた
。フェノール抽出及びエタノール予備沈殿の後、ＤＮＡ
を５′−加リン酸反応した５ａ１１結鎖剤（コラボラチ
ゾ・リサーチ社、２．５μｇ）により培養した。鎮剤剤
はｐＨ７，６Ｔｒｉｓ−ＨＯ１１０ミリモル、ＭｇＣ／
２１０ミリモル、２−メルカプトエタノール１０ミリモ
ル及びＡＴＰｏ、１２℃モルを含有する反応液１０μｌ
中で２．５単位のＴ、　＄０　リヌクレオチド９キナー
ゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカル）を使用し、γ−Ｐ−ＡＴＰ
　によりキナーゼ化している。鎮剤剤は反応液２５μノ
中プラント終了ｐＯＧＥ６ＢＤＮＡに１４℃で８時間結
紮した。

得られた結紮されたＤＮＡ含有ＳａＡ！　］結鎮剤はＢ
ＮＮ４５株の形質転換適格細胞に使用した。制限酵素（
Ｓａｉｌ）及びアガロースゲルは所望のプラスミド、ｐ
Ｃ，ＧＥ９１を確認するのに使用した。

酵母におけるプロレンニンの組立を新しく開始した。問
題の第１酵母媒介体、ｐＣＧＳ１２８　は３切片の結紮
から作成した。最初にｐｃＧＥ９１を５ａｉｌ　（Ｎ、
Ｅ−生物研、１０単位）により３７℃で３時間切断した
。このＤＮＡフラグメントは次にｐＨ７，５Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌｌ　１０ミリ−Ｅ：）Ｉ／、　ＭｇＧ１１２８ミ
リモル、ジチオスレイトール１０ミリモル及び０．２ミ
リモルの各デオキシヌクレオチドを含有する反応液５０
μ！中でＤＮＡポリメラーゼ１（ベーリンガー／マンハ
イム、１０単位）により室温で１時間の処理でプラント
を終了した。プラント終了ＤＮＡは次にエタノール沈殿
し再溶解し男と環Ｉｌｌ　（Ｎ、Ｅ−生物研、７．５単
位）で３７℃で１時間切断した。１２００ｂｐ　プラン
ト終了５ａｌＩ　／Ｈｉｎａ　ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメ
ントをアガロースゲル電気泳動により精製した。シャト
ル媒介体の必要な成分を含有する次のＤＮＡフラグメン
トはｃ　（３ＧＳ４０から精製した。この後者の媒介体
はＥｃｏＨＩ及びＨｉｎｄｌｌ＋　により切断され、得
られた７０００ｂｐフラグメントはアガロースゲル電気
泳動により精製した。Ｂａｍ　ＨＩにより切断されたｐ
ＢＭ１２５（スタンホード大学アール・デービス（Ｈ，
Ｄａｖｉｓ）の好意）から得られたＰ。ＡＬプロモータ
ーヲ含有する第３ＤＮＡフラグメントはＤＮＡポリメラ
ーゼＩプラス全４デオキシヌクレオチド３リン酸塩でプ
ラントし、次いでＥｃｏＲＩで切断し、ＰｏＡＬ１２５
と名付けられた８　２０　ｂｐ切片を生じた。

プロモーターの長さを画（ヌクレオチド９配列は第１表
に示した。ＤＮＡの３切片（ｐ（３ＧＥ９１．　プラン
ト終了Ｓａｄ　ｌ　／Ｈｉｎｄｍからの１２００ｂｐ。

ｐＯＧｓ４０　ＥｃｏＲＩ／ｆ旦ｎｄｌｌｌからの７０
００　ｂｐ及びＰ。ＡＬ１２５からの８２０　ｂｐ）を
Ｔ４ＤＮＡ＋）カーゼ（コラボラチプ・リサーチ社、プ
ラント終了２単位）及び適当な緩衝液及びＡＴＰを含有
する反応液２５μ！中で等モル量のフラグメントを使用
して互に結紮し、１４℃で１８時間培養した。

結紮したＤＮＡは菌株ＣＧＥ１２９の適格細胞を転換す
るのに使用した。制限酵素消化及びアガロースゲルによ
るプラスミド”　Ｄ　Ｎ　Ａの分析は所望のプラスミド
″ｃＧＹ１５０　を保有する単離体を示した。ｐＧＧ８
１２８　（７）ＤＮＡは酵母菌株ＣＧＹ１５０を転換す
るのに使用した。変換したスフエロブラスタを選択した
。酵母菌株はプロレンニン（〜０．０２％）を保有する
ことを示した。

プロレンニンの表現を増加するため更に組立を実施した
。ｐ（３Ｇ８１２８　ＤＮＡをＨｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｋ　
ヨリ切断した。５ｕｃ２遺伝子の３′末端がらのフラグ
メントはＨｉｎｄ　ＩＭにより切断し、大腸菌Ｄ　Ｎ　
Ａポリメラーゼ１によりプラント−終了を作成し次いで
Ｓａ／　Ｉ鎮剤剤が結紮された。得られた）２グメント
はＳａＡ’　ｌ及びＢａｍＨＩ及びＳａ／　Ｉで切断さ
れたｐｃＧｓｄＱ　中に結紮されたゲル精製１ｋｂＤＮ
Ａフラグメントを生成した。

得られたベク）ル、ｐＧＧｓ１０８をＨｐａｌ　及びＳ
ａＡ：　１で切断し大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１でプラ
ントを作成しゲル精製した。Ｈｉｎｄｌｌｌ結鎖剤（コ
ラ鎮剤チプ・リサーチ、長さ１ｏヌクレオチド）が次に
旦堕」川で切断されたＤＮＡフラググメントに結紮され
、ゲル精製されてｐＣＧＳ１２８のＨｉｎｄ　ｍ位置に
結紮されてｐＣＧＳ１０８を生産する６　５０　ｂｐフ
ラグメントを生産した。

１部のＥｃｏＲＩ及びＳａＡ’　Ｉ切片はｐｃＧｓ１６
８媒介体よりなり、ＰｏＡＬ１２５及びプロレンニンを
含有する２、６ｋｂＤＮＡフラグメントを単離した。

１部のＥｃｏＲＩ切片は２μｆ）ＮＡフラグメント上に
ＬＥＵ２遺伝子を含有するゲル精製した２、３ｋｂ　フ
ラグメントを生成するＰＪＤＢ２１９から製造された。

これらの２個のＤＮＡフラグメントは共にＥｃｏＲＩ乙
ら１１消化によりＹ／ｐ５　（ＬＩＢＡ３がｐＯＧｓ２
４１．及びｐｃＧｓ２４２を生成する選択を包含する）
に結紮された。（第１０表）構造における差異は２．３
ｋｂフラグメントの２つの配位に依る。両ベクトルは別
々に形質変換ＣＧＹ１５０　に使用された。制限酵素消
化及びアガロースゲルによルフラスミドＤＮＡの分析は
西部分析によるプロプレンニン表現の水準をもつ所望の
プラスミドが０．２％の可溶性タンパク質に増加したこ
とを示した。そのタンパク質はレンニンに変換後、乳汁
凝塊活性を示した。

プラスミ）’ｐＯＧｓ２４２を保有する菌株ＣＧＹ４６
１　はアメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション
（ＡＴＧＣ）　に寄託中であり、１９８３年２月に寄託
した。受入番号２０６６２゜実施例４ この実験には実施例３０工程１−５を反復した。

６、酵母中のプレプロレンニンの表現 組換え体ｆｉｔファージ（３ＣＦ”２９３／２０７ＦＲ
ＩＤＮＡ（２０μＩｌ）は反応液１００μノ中でＡｖａ
ＩＩ（Ｎ、Ｅ。

生物研、５単位）により切断した。２５６　ｂｐＡＶａ
■フラグメントはゲル電気泳動により精製し、大腸菌Ｄ
ＮＡ＃？リメラーゼ］　Ｋｌｅｎｏｗフラグメントによ
りプラン終了フラグメントを作った。フェノール抽出及
びエタノール沈殿の後、ＤＮＡは退１ｎｄｌｌｌ結鎖剤
（コラボラチプ・リサーチ。

ＣＡＡＧＣＴＴＧ　）により結紮し、次にＨｉｎｄｌｌ
ｆ　（Ｎ、Ｊ生物研、１５単位）及びＢｇｌｎ　（Ｎ、
Ｅ−生物研。

３．６単位）により切断した。２４５　ｂｐフラグメン
トはプレプロレンニン遺伝子の一部を包含スるゲル電気
泳動により精製した。プラスミドｐｅａｓ２８ＤＮＡ　
［ビー・アルフォード（Ｂ、Ａｌｆｏｒｄ）等により１
９８１年１２月１日出願した米国特許出願番号第３２５
，４８１号）はＢｇｌｎ　（ＮＪ、生物研、　゛５５単
）及びＳａＡ！］　（Ｎ、Ｅ、生物研、１０単位）によ
り切断し残部のプレプロレンニン遺伝子を含有する１０
００ｂｐＤＮＡフラグメントはゲルにより精製した。こ
れら２個のＤＮＡ７ラグメントは互にＨｔｎｄｍ　（Ｎ
、Ｅ、生物研、１２単位）及び５ａｌＪ（Ｎ、Ｅ、生物
前、８単位）により切断したＰＢＲ３２２により結紮し
た。この媒介体は形質変換適格性大腸菌細胞に使用され
、多数の大腸菌クローンからのプラスミ）”ＤＮＡの得
られた制限酵素分析は大腸菌菌種ＣＧＥ１３０　中に所
望のプラスミド９ｐＣＧＥ６３を示した。

プレプロレンニン遺伝子はＰ。ＡＬ１２６であるプレプ
ロレンニンであるｐＧＧＥ３ＤＮＡを組立てるのに使用
した。プラスミ）’ｐＧＧＥ６３ＤＮＡ　によりＨｉｎ
ｄｌＵ及びＳａＡ！　］により切断しプレプロレンニン
ＤＮＡを一声する１２００ｂｐ　フラグメントを得た。

Ｅｃｏ　ＲＩ　／Ｈｉ　ｎｄ　Ｉｌｌの２重消化はＰｓ
ｕｃ　２を含有する８　５０　ｂｐフラグメントを得る
ためｐＨ８１１８に実施した。これらのフラグメントは
記載した３分子反応液中でシャトル媒介体の特性を取り
入れるｐｃｃｓ４０のＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ］　７７グメ
ントにより結紮した。この混合物は形質変換適格性のＣ
ＧＥｌ、２９　大腸菌細胞に使用した。所望のプラスミ
ド”ｐＧＧｓ６４　を保有する大腸菌のクローンは多数
の被変換体からのプラスミドＤＮＡの制限消化により同
定した。

ｐｃＧｓ６４　（１）ＢｇｌＪｎ／５ａｉｌ　７ラグメ
ント（〜９ｋｂ）　はゲル電気泳動により精製しプレプ
ロレンニン遺伝子並びにｐｃＧｓＥｃｏＲＩ／ＳａＡ！
ｌフラグメントの一部を含有した。大腸菌β−ガラクト
シダーゼ遺伝子のプレプロレンニン遺伝子の水蒸気中で
Ｓｍａ　１位置で融合したプレプロレンニンの残分を含
有すルｐｃＧＥ７４　ノＢ３／ＩＩイＸｈｏ−１３６０
０ｂｐフラグメントはｐＯＧＳ６４からの一片に結紮し
た。

形質変換を実施し、制限分析は所望の酵母プラスミドｐ
ｃＧｓｓｓ　の存在を示した。

Ｐｓｕｃ２は最初にＨｉｎｄｌｌｌによる制限により、
続いて大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ　７
．、ラグメ／トにより充填することによりｐＣＧＳ８１
　から除去した。開口したプラスミドは次にＥｃｏｆ（
Ｉによ゛り制限し、大フラグメント　マイナスＰｓｕｃ
２をゲルｆｆＩ製した。ＰｏＡＬ１２６はｐＢＭ１２６
（アール・デービス、スタッフォード大学の好意）の制
限により収得した。プラスミドｐＢＭ１２６はＢａｍＨ
Ｌにより切断し、大腸菌ＤＮＡＪリメラーゼ　Ｉ　Ｋｌ
ｅｎｏｗフラダメントＣ充填し、ついでとＲＩ　により
切断し所望の７５　Ｑ　ｂｐＰｏＡＬ１２６を得た。こ
れら２個の７ラグメントは互に結紮し−（ｐ。ＡＬ１２
６プレプロレンニメＺ（絃に°２は１部のβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を表わす）を含有するｐＯＧ８１４ｓ　
を得た。

ＤＮＡの１０００ｂｐの１片はｐＧＧＳｘ　４８をＥｃ
ｏＨＩ及びＢｇｌｌｎ　による消化により得た。更にｐ
ＧＧ８１６Ｂ　のＢｇＡ　ＩＩ　／ＳａＡ］１８００ｂ
ｐはゲル精製した。これら２個のフラグメントは剰剰の
ｐＣＧＳ４０の８ｋｂ県王ＲＩ／Ｓ閃１フラダメントに
結紮した。適格性の大腸菌ｃＸ：Ｔｇｘｚｃ＋　の形質
変換を実施して制限分析は所望のプラスミドｐＣＧＳ２
４０を所有するクローンを示した。ｐにＧ５２４０を所
有する大腸菌から製造したプラスミドＤＮＡは酵母菌株
ＧＧＹ１５０　を形質変換するのに使用した。酵母菌株
ＣＧＹ４５７はその形質変換から得られプラスミド″’
ｐＣＧｓ２４０　を保有する。レンニン抗体による西欧
のノ・イブリッド形成により実証されたようにＧＡＬＩ
促進剤からのタンパクの表現の水準は可溶性タンパク質
０．２迄であった。

プラスミドｐＣＧＳ２４ｏ　を帯びた菌株０ＧＹ４５７
はアメリカン　タイプ　カルチャーコレクション（ＡＴ
ＣＣ）　に寄託中で、１９８３年２月に寄託し受付番号
は２０６６１である。

薗２表 ＡＬＩ 本発明の特定の態様が明示され、“かつ記載されている
が、多くの変化が可能である。例えば本発明は主として
ウシ生長ホルモン、インターフェロン、フロレンニン及
ヒ酵母中の−Ｊ’Ｖ−７’ロレンニンの如きポリはブチ
トリ製造における４宙１促進剤の使用に関するものであ
る。明らかに、他のタンノξり質製品は規定された操作
関係において本発明のＧＡＬＩ促進剤を使用して収得し
、かつ表現できる。か瓦るポリペプチドは酵素または他
の生物学的に活性タンパク質である。前記実施例はか〜
る機構の操作の実例である。

第１頁の続き Ｑｌｎｔ、Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号０発　明
　者　ジエラルド・ラルフ・　アメリカ合衆国フインク
　ン、アストン・ ０発　明　者　アリソン・タウント　アメリカ合衆国ン
・リグビー　ン、ファー１７ ０発　明　者　ロパート・ジエントリ　アメリカ合衆国
−・ノウルトン　ン、ジャー１４ ０発　明　者　ジエン・イ・マオ　アメリカ合衆国−ド
、ゴールド ０発　明　者　ドナルド・ティラー争　アメリカ合衆国
モア　ム、ヴアージニ二 〇発　明　者　クリストファー・ボッ　アメリカ合衆国
ドフソー・ボッ　オード、ナンバ・ マサチューセッツ　０２１６７、プルックリロード　４
０ マサチューセッツ　０１７７３．リンコル・ロード　（
番地なし） マサチューセッツ　０２１７３％レキシント・ストリー
ト　３０ マサチューセッツ　０１７３０．ベッドフオ・ロード　
３５ マサチューセッツ　０１７３０．ウオルサｒ−ロード　
３９ ペンシルヴアニア　１９０４１、ハヴアーフー・ツー・
カレッジ・アヴエニュー　７７３手続補正書 昭和５９年５月６１日 昭和５９年特許願第　３５４７２　号 ２、発明の名称 ＧＡ山−１酵母菌プロモーターノ使用 ３、補正をする者 事件との関係：特許出願人 名　称　コラゼラテイヴ・リサーチ・インコーホレイテ
ッド霞が関ビル内郵便局、私書箱第４９月

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）酵母菌体中の遺伝子の出現を指示するガラクトキナ
   ーゼ遺伝子以外の遺伝子に連結したＧＡＬ１プロモータ
   ーを含有することを特徴とするＤＮＡ分節。 ２）前記遺伝子がウシ成長ホルモン遺伝子であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分節。 ３）前記遺伝子がインターフェロン遺伝子であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分節。 ４）前記遺伝子がプロレンニン遺伝子であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分節、 ５）前記遺伝子がプレプロレンニン遺伝子であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の１）ＮＡ分節
   。 ６）前記ＧＡＬ１プロモーターが７５５塩基対ＤＮＡ配
   列であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   のＤＮＡ分節。 ７）前記ＧＡＬ１プロモーターが８２０塩基対ＤＮＡ配
   列であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
   のＤＮＡ分節。 ８）所望のタンノξり質を出現させるために使用するＤ
   ＮＡ分節に連結したＧＡＬＩプロモーター、９）ＧＡＬ
   １プロモーターをＤＮＡ分節中に導入し、この分節が染
   色体あるいは媒介体中の遺伝子に該染色体あるいは媒介
   体が複製され細胞によってその遺伝子情報の一部として
   運ばれその遺伝子が出現されるような方法で連結される
   ことがら成ることを特徴とする酵母菌中にポリ投プチド
   を出現させる方法。 １０）　前記遺伝子が酵母菌ゲノムにとって異質である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第９功に記載の方法。 １１）　前記ポリイプチドがウシ成長ホルモンで前記遺
   伝子がウシ成長ホルモン遺伝子でアルコトを特徴とする
   特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １２、特許請求の範囲第１１項の方法で製造されること
   を特徴とするポリはプチト８生成物。 １３）　前記ポリはプチト９がインターフェロンであり
   、前記遺伝子がインターフェロン遺伝子であることを特
   徴とする特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １４）特許請求の範囲第１３項の方法により製造される
   ことを特徴とするポリはプチト９生成物。 １５）　前記ポリはプチト９がプロレンニンであり前記
   遺伝子がプロレンニン遺伝子であることを特徴とする特
   許請求の範囲第９項に記載の方法。 １６）特許請求の範囲第１５項に記載の方法で製造され
   ることを特徴とするポリはプチド生成物。 １７）　前記ポリはゾチドがプレプロレンニンで前記遺
   伝子がプレプロレンニン遺伝子であることを特徴とする
   特許請求のＪｐ囲第９項に記載の方法。 １８）％許請求の範囲第１７項に記載の方法で製造され
   ることを特徴とするポリペプチド生成物。 １９）　前記酵母がサツカロミセス・セレビシェ株であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の方法
   。 ２０）　ＤＮＡ分節が酵母菌体に入れられ、この酵母菌
   体をグルコースを含有する培地で培養するがこの場合建
   前記酵母菌体は前記グルコースを代謝作用で変化させ、
   次に前記菌体が前記ｙｉ’？　ＩＪ　Ｓプチドを培地に
   ガラクトースが存在するときに出現させることを特徴と
   する酵母菌ゲノムに異質の遺伝子に連結したＤＮＡ分節
   中のＧＡＬ１プロモーターを使用して酵母菌中にポリペ
   プチドを得る方法。 ２１）　前記ポリペプチド８がウシ成長ホルモンで、前
   記遺伝子がウシ成長ホルモン遺伝子であることを特徴と
   する特許請求の範囲２ｏに記載の方法。 ２２）　前記ポリはプチドがインターフェロンで、前記
   遺伝子がインターフェロン遺伝子であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２３）　前記ポリペプチドがプロレンニンで、前記遺伝
   子がプロレンニン遺伝子であることを特徴とする特許請
   求の範囲第２０項に記載の方法。 ２４）　前記ポリペプチドがプレプロレンニンで、前記
   遺伝子がプレプロレンニン遺伝子であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第２０項に記載の方法。 ２５）受入れ番号２０６４３、菌株名称ｃＧｙ１ｇ６で
   アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに預け
   られている酵母菌株。 ２６）受入れ番号２０２６６１、菌株名称ＧＧＹ４５７
   、でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
   預けられた酵母菌株。 ２７）受入番号２０６６２、菌株名称（３ＣＸＹ４６１
   でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに預
   けられた酵母菌株。 ２８）受入れ番号２０６６３、菌株名称ＣＧＹ５２８で
   アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに預け
   られた酵母菌株。 ２９）合成りＮＡ配列 ＰＧＡＬＩ　ＡｓＱＣＣＣ弱ＡＴＣ’１ＣＧＡＯＣ−Ａ
   ＴＧ−Ｘ（Ｘはガラクトキナーゼ遺伝子以外の遺伝子。 ）３０）　を片１）　Ｎ　Ａ　ｆｉ？ＪＩｌＰ払以−Ｔ
   ＴＡＴＴＣＣＴ（３ＴＡＯＧ弱ＡＴＣＡＡ−ＡＴしＸ（
   Ｘはガラクトキナーゼ遺伝子以外の遺伝子。）３１）　
   ＤＮＡ組換え配列 ＰｏＡＬｌ−Ａ６（３ＣＣＣＸＥｌｃｒＡ’ｒｃＴ（Ｊ
   ＡＣＣ；−ＡＴＧ−Ｘ、（気□はガラクトキナーゼのＧ
   ＡＬ１プロモーターの８２０塩基対ＤＮＡ配列であり、
   Ｘは酵母菌に出現されるポリペプチドのＤＮＡ配列であ
   る。）３２）　前記ポリペプチドがウシ成長ホルモンで
   あることを特徴とする特許請求の範囲３１に記載のＤＮ
   Ａ組換え配列。 ３３）　前記ポリはプチドがインターフェロンであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲３１に記載のＤＮＡ組換
   え配列。 ３４）　前記ポリペプチドがプロレンニンであることを
   特徴とする特許請求の範囲第３１項に記載のＤＮＡ組換
   え配列。 ３５）　ＤＮＡ組換え配列 鷺１−ＴＴＡＴＴＣＣＴＧＴＡＣＧ弱ＡＴＣＡＡ−ＡＴ
   Ｇ−Ｘ・（鷺１はガラクトキナーゼのＧＡＬ１プロモー
   ターの７５５塩基対ＤＮＡ配列であり、Ｘは酵母菌に出
   現されるポリペプチド９のＤ　Ｎ　Ａ配列である）。 ３６）　前記ポリはプチト９がプレプロレンニンである
   特許請求の範囲第３５項に記載のＤＮＡ組換え配列。 ３７）異質の遺伝子に連結されたガラクトキナーゼ遺伝
   子の調節された主なメツセンジャーＲＮＡの写しのため
   のプロモーターを運ぶ酵母菌ゲノムから誘動されたＧＡ
   Ｌｌプロモーターから成るＤＮＡ分節。 ３８）　前記異質の遺伝子がウシ成長ホルモン遺伝子で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の
   ＤＮＡ分節。 ３９）　前記異質の遺伝子がインターフェロン遺伝子で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の
   ＤＮＡ分節。 ４０）　前記異質の遺伝子がプロレンニン遺伝子である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載のＤＮ
   Ａ分節。 ４１）　前記異質の遺伝子がプレゾロレンニン遺伝子で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第３７項に記載の
   ＤＮＡ分節。 ４２）　前記ＧＡＬ１プロモーターが０．８２キロベ一
   スＤＮＡ配列を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第３７項に記載のＤＮＡ分節。 ４３）　前記当１プロモーターが０．７５５キロベ一ス
   ＤＮＡ配列を有することを特徴とする特ｎ′Ｉ−請求の
   範囲第３７項に記載のＤＮＡ分節。 ４４　）　Ｐｖｕ　ｎの位置に酵母菌の写し開始位置を
   有する酵母菌２μプラスミドの断片、およびＥＣ０ＲＩ
   　の位置にカル１プロモーターを有する酵母菌染色体Ｄ
   ＮＡからの断片から成る変形個所を有するプラスミド″
   ＹＩＰ５から成るシラスミド。 ４５）　前記当１プロモーターに連結したウシ成長ホル
   モン遺伝子を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   ４４項に記載のプラスミド″′０４６）　前記ＧＡＩ、
   ｌプロモーターに連結したインターフェロン遺伝子を有
   することを特徴とする特許請求の範囲第４４項に記載の
   プラスミド。 ４７）前記ＧＡＬＩ　フロモーターに連結したプロレン
   ニン遺伝子を有することを特徴とする特＃′ｌ：請求の
   範囲第４４項に記載のシラスミド。 ４８）　前記り虫１プロモーターに連結したプレプロレ
   ンニン遺伝子を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第４４項に記載のプラスミド。 ４９）　ＥＣ（ＩＲＩ　の位置にＣＡＬ、　ｌプロモー
   ターを有する酵母菌染色体ＤＮＡからの断片からなる変
   形個所を有するプラスミ）”ＹＩＰ５から成ることを特
   徴とするプラスミド。 ５０）　酵母菌中の選択用遺伝子がＵｒａ３遺伝子から
   成るＤＮＡ分節であることを特徴とする特許請求の範囲
   第４９項に記載のプラスミド。 ５１）　前記−ｑΔ旦１プロモーターに連結したウシ成
   長ホルモン遺伝子を有することを特徴とする特許請求の
   範囲第４９項に記載のプラスミド。 ５２）　前記ＧＡＬＩプロモーターに連結したインター
   フェロン遺伝子を有することを特徴とする特許請求の範
   囲第４９項に記載のプラスミド。 ５３）前記ＧＡＬ１プロモーターに連結したプロレンニ
   ン遺伝子を有することを特徴とする特許請５４）　前記
   馬１プロモーターに連結したプレプロレンニン遺伝子を
   有することを特徴とする特許請求の範囲第４９項に記載
   のプラスミド。 ５５）　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
   ン受入れ番号２０６４３、菌株名称ＣＧＹ１９６の酵母
   菌中に見出されたＤＮＡ組換え物質。 ５６）前記物質がウシ成長ホルモン遺伝子に連結した馬
   １プロモーターから成ることを特徴とする特許請求の範
   囲第５５項に記載のＤＮＡ組換え物質。 ５７）　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
   ン受入れ番号２０６６１．菌株名称ＣＧＹ４５７の酵母
   菌株中に見出されたＤＮＡ組換え物質。 ５８）　前記物質がインクフエロン遺伝子に連結した聾
   １プロモーターから成ることを／Ｉ？徴とする特許請求
   の範囲第５７項に記載のＤＮＡｍ’Ｊ’Ａえ物質。 ５９）　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
   ン受入れ番号２０６６２、菌株名称ＵＧＹ４６１ハ諺ｍ
   蓄榛山１ｆ日山々ムＪ−ｒｌ　ｈＪ＾す１贈己官ｍノｄ
   】６０）　前記物質がプロレンニン遺伝子に連結した（
   、ＡＬ］プロモーターから成ることを特徴とする特許請
   求の範囲第５９項に記載のＤＮＡ組換え物質。 ６１）　アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
   ン受入れ番号２０６６３、菌株名称ＣＧＹ５２８の酵母
   菌中に見出されたＤＮＡ組換え物質。 ６２）前記物質がプレプロレンニン遺伝子に連結した再
   １プロモーターから成ることを特徴とする特許請求の範
   囲第６１項に記載のＤＮＡ組換え物質。 ６３）　酵母菌およびバクテリアに挿入可能であること
   を特徴とする酵母菌ゲノムへ異質の遺伝子に連結した四
   １プロモーターを運ぶ媒介体。 ６４）　前記遺伝子がウシ成長ホルモン遺伝子であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第６３項に記載の媒介体
   。 ６５）　前記遺伝子がインターフェロン遺伝子であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第６３項に記載の媒介体
   。 ６６）　前記遺伝子がプロレンニン遺伝子であることを
   特徴とする特許請求の範囲第６３項忙記載の媒介体。 ６７）　前記遺伝子がプレプロレンニン遺伝子であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第６３項に記載の媒介体
   。 ６８）下記のウシ成長ホルモン・ヌクレオチド配列から
   成ることを特徴とするＤＮＡ組換え物質：６９）特許請
   求の範囲第６８項に記載のヌクレオチド配列の酵母菌中
   に出現して生成されることを特徴とするポリイプチト９
   生成物。 ７０）　前記ＧΔ互１プロモーターが下記のヌクレオチ
   ド配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   に記載のＤＮＡ分節：