JPS597693B2 - 抗トロンビン製剤及びその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人山来アンテイトロンビン−■を主成分として
凍結乾燥した抗トロンビン製剤及びその製法に関するも
のである。

血液の凝固トロンビンがフイブノゲンに作用してフイブ
リンモノマーを作り、このものが重合することにより網
目状のフイブリン糸が形成され、同時にこの中に血液が
抱込まれて血栓を生じ、止血することは広く知られてい
る。

トロンビンは通常は不活性なプロトロンピンとして生体
内に存在しているが、時に僅かずつ活性化されてトロン
ピンとなるものもある。

しかしこれらは生体内に同時に存在する抗トロンビン類
によって中和されるので、活性トロンビンのために直ち
に凝固が起ることはない。

しかし消耗性凝固異常症（ＤＩＣ）や脱フイブリン症な
どでは、生体内でのグロトロンビンの活性化が異常に充
進し、抗トロンビン類による中和作用に打勝って凝固が
起り、生体内の随所に血栓が生じることになる。

従ってＤＩＣなどの異常症は抗トロンビン作用を補強す
ることにより治療することができる。

生体内において抗トロンビン作用を有するものとしては
アンテイトロンビンー■、フイブリン又はその分解産物
、α２−マクログロプリンなどがあるが、これらの中で
アンテイトロンビンー■が最も強い作用を有し、従って
安定な形で製剤化されることが期待されている。

アンテイトロンビン−■の精製法としては、水酸化アル
ミニウム吸着法、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロ
マトグラフイー法およびヘパリンセファロース吸着法（
特開昭４８−３５０１７号公報）などがある。

これらの方法で得られたアンテイトロンビンー■の安定
性をみると、液状では比較的安定ではあるが、一般的に
蛋白質などの長期安定化に最も有利とされている凍結や
凍結乾燥では、アンテイトロンビンー■は損失が大きい
。

アンテイトロンビンー■は液状ではある程度安定なため
、液状で製剤化することも可能ではあるが、液状の製剤
は長期間保存すると活性の低下を招き、かつロットによ
っては不溶物を析出するなどの欠点があるため好ましく
ない。

このようにアンテイトロンビンー■の精製法は既にい《
つか報告されているものの、得られたものを長期間安定
化させる方法が未開発であったため、医薬としての製剤
化は未だ完成されていなかった。

本発明者らはアンテイトロンビンー■の製剤化及び凍結
乾燥における安定化の研究を続けた結果その安定化剤を
見い出し、安全でかつ長期間安定化された形でアンテイ
トロンビンー■を主成分として凍結乾燥した抗トロンビ
ン製剤を開発することに成功し、本発明を完成した。

本発明は人由来アンテイトロンビンー■を主成分として
凍結乾燥した抗トロンビン製剤からなり、製剤の安定化
剤又は／及び賦形剤として蛋白質、糖類、アミノ酸の群
から選択し、これらの安定化剤及び／又は賦形剤を１又
は２以上含有することを特徴とするのである。

本発明はさらに人由来アンテイトロンビンー■の安定化
剤として蛋白質、糖類、アミノ酸の群から選択し、これ
らの安定化剤の１又は２以上の存在下に凍結乾燥処理を
行なうことを特徴とする抗トロンビン製剤の製法からな
っている。

本発明においてアンテイトロンビンー■とはトロンビン
を不活性化する物質であって、人の全血、血漿あるいは
血清の中から回収され、凝固した血液から圧搾される血
清にはこの物質を含んでおり、純化した繊維素原を凝固
し得ないが、それに等量の０． Ｉ Ｎ水酸化ナトリウ
ムを加えると再び凝固し得る。

アンテイトロンビンー■は公知のあらゆる方法によって
高度に精製されたものであればよ《、アンテイトロンビ
ンー■自体は特に限定されるものではない。

アンテイトロンビンー■の凍結乾燥処理における安定化
剤のうち、蛋白質としてはアルブミン、ウロキナーゼ、
プラスミノーゲン又はゼラチンのいずれかを使用し、糖
類としてはマニトール、グルコース又はサツ力ロースの
いずれかを使用し、アミノ酸としてはグリシン又はリジ
ンを使用する。

なお製剤の安定化剤として塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナト
リウム等の無機塩、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリ
ウム、酢酸ナトリウム、シュウ酸カリウム等の有機塩を
併用することは好ましい。

各安定化剤はアンテイトロンビンー■の１重量部に対し
て０．１〜５．０重量部を添加することで十分である。

こＮに例示した蛋白質、糖類及びアミノ酸は製剤の賦形
剤ともなるから、これらの１つ又は２つ以上を賦形剤と
してアンテイトロンビンー■０１重量部に対し０．１〜
５．０重量部含有させてもよい。

なお２つ以上の安定化剤及び／又は賦形剤を混合して使
用する場合においても添加物の総量がそれぞれ上記範囲
内であればよい。

これらの添加物は相応する量を適当な濃度とｐＨの水溶
液に調整して使用する。

この水溶液の濃度は等張の１／１０から３倍高張の範囲
とし、より好ましくは等張濃度である。

水溶液のｐＨは６．２〜９．０に調整し、特にｐＨ７〜
８に調整するのが好ましい。

アンテイトロンビンに安定化剤及び／又は賦形剤を添加
したものを必要あれば除菌Ｐ過を行った後、包装単位に
従い１００〜１０００００単位のアンテイトロンビンー
■を含むように分注し、この分注液を急速に凍結乾燥し
て粉末製剤とする。

このようにして得た抗トロンビン製剤の組成は、主成分
となるアンテイトロンビンー■０１重量部に対して０．
１〜５．０重量部の安定化剤及び／又は賦形剤を含有す
る。

こ＼に製剤の安定化剤及び／又は賦形剤はさきに例示し
た蛋白質、糖類、アミノ酸であり、安定化剤として０．
１〜５重量部の範囲内でさきに例示した無機塩や有機塩
を含むものもある。

本発明製剤を使用する際は注射用蒸留水によってアンテ
イトロンビンー■の約１〜１０％Ｗ／Ｖ溶液を調整し、
より好ましくは生埋的に等張な塩濃度に調整して静脈内
に投与する。

投与量は必要に応じて適宜に選択できるものであり、一
般的には包装単位に従って使用する。

本発明製剤は凍結乾燥処理においてその活性を少しも損
失することなく、経時安定性については３７℃で約３か
月間保存しても全く安定であり、アンテイトロンビンー
■を主成分とする抗トロンビン製剤として医療分野にお
いて極めて有益である。

本発明においてアンテイトロンビンー■の力価はトロン
ピンと試料とを２８℃で５分間反応させ、これにフイブ
リノゲンを加えた時に凝固時間がどの程度延長されるか
を測定し、予め作成しておいた検量線よりその力価を算
出した。

この時の単位は正常人血漿を５６℃で３分間加熱処理し
、脱フイブリンを行った上清液の示す抗トロンビン活性
を便宜上１００単位／ｍｌとして表示した。

次に実施例及び実験例を挙げて本発明をさらに詳しく説
明する。

実施例 １ コーンの冷アルコール分画法で得られた画分■１のペー
スｌ’ｌｏｋｇを生埋食塩水１００ｌに懸濁し、硫酸バ
リウムを５Ｗ／Ｖ％になるように加え、室温で３０分間
攪拌し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウム
に吸着させて除去した。

この上清液にポリエチレングリコール＃４０００を１３
Ｗ／Ｖ％になるように加え、生じた沈殿を遠心分離して
除き、さらにポリエチレングリコール＃４０００を３０
Ｗ／Ｖ％になるように加え、生じた沈殿を遠心分離して
回収した。

この沈殿を冷生埋食塩水約２０ｌに溶解し、予め生埋食
塩水で調製されたヘパリンセファロースのカラムへ注入
し、アンテイトロンビンー■をカラムに吸着させた。

このカラムを０．４Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄して
不純蛋白を除いたのち、２．０Ｍの塩化ナトリウム溶液
なカラムに流して溶出してくる部分をアンテイトロンビ
ンー■の画分として集めた。

収量は５１０Ｘ１０’単位であり、出発原料の約５０％
の回収率であった。

このようにして得られた精製アンテイトロンビンー■の
水溶液をクエン酸ナトリウム０． ５ Ｗ／Ｖ％及び塩
化ナトリウム０．４Ｗ／Ｖ％に対して１液透析を行ない
つつ濃縮してＩＷ／Ｖ％水溶液とし、このアンテイトロ
ンビンー■のＩＷ／Ｖ％水溶液にヒトアルブミンＩＷ／
Ｖ％加え、必要あればＩＮの塩酸又はＩＮの水酸化ナト
リウムでｐＨ７．４となし、滅菌したミリポアフィルタ
ーを用いて除菌沢過し、５００Ｃ）０単位ずつ分注し、
凍結乾燥を行なって乾燥製剤とした。

凍結乾燥後の力価は５０１００単位であり、凍結乾燥に
よる力価の損失は認められなかった。

このものは３７℃で１０か月間以上放置しても力価の低
下および溶解性の悪化は全くみられず、極めて安定であ
った。

またこの凍結乾燥製剤を注射用蒸留水に溶解し、５匹の
マウスに４００００単位／ｋｇ相当量を尾静脈より投与
して７日間観察を続けたが、何ら異常は認められなかっ
た。

また同じ溶解液を家先に５０００単位／ｋ９投与して２
４時間観察したが、体温の異常変化を認めなかった。

実施例 ２ 正常人血漿１ｌを５６℃で３分間加熱処理して析出して
きたフイブリンを遠心分離して除き、その上清に硫酸バ
リウムを５Ｗ／Ｖ％に加え、１時間攪拌を行なった。

遠心分離して硫酸バリウムを除き、この上清にモンクハ
ウム（ Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ ）らの方法を用いて水酸
化アルミニウム吸着を行ない、溶出処理を経て準精製ア
ンテイトロンビンー■を得た。

この溶出液を０．０２Ｍの酢酸緩衝液で平衡化させたＤ
ＥＡＥ−セルロース力ラムへ注入し、アンテイトロンビ
ンー■をカラムに吸着させた。

次に同じ緩衝液でカラムを洗浄した後、ＩＭの塩化ナト
リウムを用いて濃度勾配溶出操作を行ない、アンテイト
ロンビンー■の活性の高い部分を回収した。

収量は２．３Ｘ１０’単位であった。このアンテイトロ
ンビンー■の水溶液にクエン酸ナトリウムを０．６Ｍの
濃度に加え、ｐＨ７．８に調整した後６０℃で１０時間
の加熱処理を施し、続いて０．９％塩化ナトリウム溶液
に対し１夜透析を行ないつつ濃縮してアンテイトロンビ
ンー■のＩＷ／Ｖ％水溶液を得、必要に応じ沢過又は遠
心分離を行なって澄明な液とした。

このアンテイトロンビンー■のＩＷ／Ｖ％水溶液にマン
ニトール２Ｗ／Ｖ％とクエン酸ナトリウム０．２Ｗ／Ｖ
％を加え、塩化ナトリウムが０．５％になるように少量
の冷蒸留水で希釈し、ＩＮの水酸化ナトリウムでｐＨ７
．６に調整した後、滅菌したミリポアフィルターで除菌
沢過し、５０００単位ずつ分注し、凍結乾燥を行なって
乾燥製剤とした。

凍結乾燥後の力価は４９５０単位で僅かな損失しか生じ
なかった。

また室温で６か月間以上放置しても溶解性に変化なく、
力価の損失もみられなかった。

実施例１と同様にしてマウスにｉｏｏｏｏ単位／ｋｇを
投与して７日間観察を続けたが異常はな《、正常に体重
は増加し安全であつｊＱ又同じ溶解液を家兎に２０００
単位／ｋｇを投与して２４時間観察したが、異常は認め
られなかった。

実施例 ３ 実施例１で得られた精製アンテイトロンビンー■のＩＷ
／Ｖ％水溶液にグリシンＩＷ／Ｖ％、塩化ナトリウム０
．２Ｗ／Ｖ％およびヒトアルブミンＩＷ／Ｖ％とを加え
、ｐＨを７．２に調整した後、滅菌ミリポアフィルター
で除菌Ｐ過し、５００００単位ずつ分注し、凍結乾燥を
行なって乾燥製剤とした。

乾燥後の力価の損失はなくかつ溶解性も良好であった。

☆・実施例 ４ 実施例１で得られた精製アンテイトロンビンー■の水溶
液に■ミドリ十字製のウロキナーゼ５ ０ ０ ０Ｕ／
ｍｌ（ ０．５Ｗ／Ｖ％）、塩化ナトリウム０．３Ｗ／
Ｖ％おヨヒマンニトールＩＷ／Ｖ％とを加え、ｐＨを７
．２に調製した後、滅菌ミリポアフィルターで除菌沢過
を行ない、５００００単位ずつ分注し、凍結乾燥を行な
って乾燥製剤とした。

乾燥後の力価に損失はなくかつ溶解性も良好であった。

又３７℃で６か月間放置してもアンテイトロンビンー■
の活性は安定であった。

実験例 実施例１により精製回収したアンテイトロンビンー■を
使用し、各種安定化剤の添加による経時安定性を比較し
た。

この実験はアンティトロンビンー■の液状バルクに各種
安定化剤を添加して凍結乾燥を行ない、乾燥直後の活性
残存率及び３７℃での１年間の経時試験による活性残存
率を調べた。

試料はアンテイトロンビンーＩＩＩ５００００単位を含
有する１０７７１ｌの０．５Ｗ／Ｖ％水溶液をｐＨ７．
５〜７．７に調整し、各種安定化剤を表中に記入した割
合で添加した。

これらの実験結果をまとめると次の表の通りである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 凍結乾燥した人山来アンテイトロンビン−■を主成
   分とし、製剤の安定化剤又は／及び賦形剤として蛋白質
   、糖類、アミノ酸の群から選択し、これらを１つ又は２
   つ以上含有することを特徴とする抗トロンビン製剤。 ２ 製剤の安定化剤又は／及び賦形剤として選択する蛋
   白質がアルブミン、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン又
   はゼラチンのいずれかである特許請求の範囲第１項に記
   載の抗トロンビン製剤。 ３ 製剤の安定化剤又は／及び賦形剤として選択する糖
   類がマンニトール、グルコース又はサツ力ロースのいず
   れかである特許請求の範囲第１項に記載の抗トロンビン
   製剤。 ４ 製剤の安定化剤又は／及び賦形剤として選択するア
   ミノ酸がグリシン又はリジンである特許請求の範囲第１
   項に記載の抗トロンビン製剤。 ５ 人由来アンテイトロンビンー■の安定化剤として蛋
   白質、糖類、アミノ酸の群から選択し、これらの安定化
   剤の１つ又は２つ以上の存在下に凍結乾燥処理を行なう
   ことを特徴とする抗トロンビン製剤の製法。 ６ 製剤の安定化剤として選択する蛋白質がアルブミン
   、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン又はゼラチンのいず
   れかであり、安定化剤の糖類がマンニトール、グルコー
   ス又はサツ力ロースのいずれかであり、安定化剤のアミ
   ノ酸がグリシン又はリジンである特許請求の範囲第５項
   に記載の抗トロンビン製剤の製法。