JPH07501204A - 局所的オリゴヌクレオチド療法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 局所的オリゴヌクレオチド療法 光里傅！景 本発明は、疾病の治療に有用な、インビボであらかじめ選定した部位（ｆｏｃｕ ｓ）にアンチセンスオリゴヌクレオチドを到達させるための方法に関する。

ここ数年、組織培養系でオリゴヌクレオチドが、明らかにウィルスを複製を阻害 できることが確認されている０例えば、Ｚａｍｅｃｎｉｋと５ｔｅｐｈｅｎｓｏ ｎは、ラウス肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ　５ａｒｃｏｓａＶｉｒｕｓ）を用いて、 組織培養中のウィルス複製のオリゴヌクレオチド媒介性阻害を確認している（Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｔ＋、ｓＪ、１７５、；２８０−２８ ４．１９７８）　。Ｚａｍｅｃｎｉｃらは、エイズの原因であるＨＴＬＶ−Ｉ１ １ウィルス（現在は旧ｖ−１）の組織培養中での抑制を確認している（Ｚａｍｅ ｃｎｉｃ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ 、Ｓ、Ａ、　８３　；４１４５−４１４６．１９８６）。さらにオリゴヌクレオ チドは、遺伝子によってエンコードされている蛋白質の阻害的翻訳によって特異 的非ウィルス性遺伝子の発現を抑制するためにも用いられている。

Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄらは、無細胞系でオリゴヌクレオチドによって、ウサギ−グ ロブリン合成を阻害することができることを報告している（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、２６４ｉ４０１−４０９．１９８８）　、アンチ センスｃ−ｍｙｂ処理は、インビトロでヒト骨髄性白血病細胞様の増殖を抑制す る（Ｇ、　Ａｎｆｏｓｓｉ　、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｌｌ、Ｓ、Ａ、、８鮫；３３７９．１９８９）。この方法の問題点は、オリゴヌ クレオチドが細胞内ヌクレアーゼにより分解または失活化されやすいことである 。この問題に対する対策として、ある研究者らは、変異オリゴヌクレオチ即ち、 天然に得ることのできるホスホジエステル連鎖が別の連鎖によって置換されてい る、変異させたヌクレオチド内連鎖を有している物質を用いている。例えばＡｇ ｒａｗａ　ｌ　らはオリゴヌクレオチドのホスホラミドやホスホロチオエートを 用いて、組織培養中のＩＩＩＶ−１の抑制を増強することを示している（Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５　；７０７９−７ ０８３゜１９８８）。５ａｒｉｎらは、オリゴヌクレオチドのメチルホスホネー トが、ＨＩＶ−１の抑制を増強することを示している（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、八、、８５．　；７４４Ｂ−７４５１，１９８８ ）。Ａｇｒａｗａｌ　らはヌクレオチド配列特異的なオリゴヌクレオチドのホス ホロチオエートを用いて、初期感染と慢性的な感染性細胞培養のいずれにおいて も、ＨＩＶ−１の複製を抑制することを示している（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８６　；７７９０−７７９４．１９８９ ）。Ｌｅｉｔｈｅｒ　らはオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートを用いて、 組織培養でインフルエンザウィルスの復製を阻害を報告している（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａ　ｔ　Ｉ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、八、、８７．；３４３０−３４３４．１９９０）。

人為的な連鎖を有するオリゴヌクレオチドは、インビボでの分解に対して抵抗性 があることが確認されている。例えばＳｈａｗらは、明確なキャッピング構造に よって３゛末端が保護されていいる場合には、一方で未変異オリゴヌクレオチド はインビボでヌクレアーゼに対してより抵抗性を持ち、さらにキャッピングされ ていないオリゴヌクレオチドホスホロチオエートはインビボで分解されなことを 報告している（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　１７４７−７５０． １９９１）。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは蛋白質合成を選択的に干渉することが可能で あり、そして有意な進歩がその細胞内安定性を改善している一方で、オリゴヌク レオチドは、生体内で機能するためには、その意図とした細胞内作用部位に到達 しなければならないという問題が解決していない。目的とした治療効果は全身的 であって、オリゴヌクレオチドは全身的に投与することができる。しかし、生体 内の特異的な頭載にオリゴヌクレオチドを投与することが必要であるか好ましい 場合には、システミソクな投与では、通常はうまくいかないことが予想される。

標的組織と同様に、正常細胞中に標的ｍＲＮ＾が存在する場合、および正常細胞 に結合するアンチセンス曽ＲＮＡが、必要としない生理的作用を誘導する場合に は、このことは特にはっきりとした真実である。別の表現をすれば、局所的に有 効な作用をもたせるために充分な量を、全身的に投与したアンチセンスオリゴヌ クレオチドの投与量は、患者にとっては毒性を示すかもしれない。

標的組織に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を制限している方法を 改善することは大いなる利益をもたらす。

このような治療指針としては、循環器障害に引き続いて起こる再発狭窄を誘導す る平滑筋細胞の増殖抑制を例示することができる。

動脈硬化と高血圧を包含する多数の病理学的な形態変化に主要な機能を演じてい る平滑筋細胞の増殖過程は、殆ど明らかにされていない。平滑筋細胞の増殖は、 冠状血管バイパス移植と同様な、冠状および抹消血管形成術に対して長期間の障 害を誘発する。

成熟動物の血管平滑筋の細胞は、豊富な収縮性蛋白質によって特徴付けられてい るはっきりした表現型を有している。この蛋白質は主として筋アクチンとミオシ ンであり、Ｓ、Ｍ、　Ｓｃｌ＋ｗａｒｔｚらによって解説されている（Ｓ、Ｍ、 　Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｇ、Ｒ，Ｃａ５ｐｂｅｌｌ。

Ｊ、Ｈ，Ｃａ５ｐｂｅｌｌ＋　Ｃｒ１ｃ、　Ｒｅｓ、＋　５８＋　４２７＋　１ ９８６）。さらに、あきらかに小胞体が欠失している。傷害に対してインビボで 傷害状態となるかあるいはインビトロの細胞培養に置いた場合、成熟平滑動細胞 （ＳＭＣ）ははっきりした表現型の変化をきたし、その分化状態を喪失する。細 胞は小胞体を大量に獲得し、そして活発に細胞外マトリックスを形成しはじめる 。さらに、細胞は、非筋肉性のアクチンやミオシン、さらにＲ，Ｊ、　Ｄｉｌｌ ｅｙら（＾ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、　６３：９９．１９８７）およびＰ 、　Ｌｉｂｂｙ他（Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、。

３１針１４９３．１９８７）によって報告されたようにＰＤＧＦの＾鎖を含む複 数の新しい蛋白質を発現し始め、一方Ｋｕｒｏ−ｏら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、　２６４：１Ｂ２７２．　１９８９）　や＾Ｊ、ＣＩｏｗら（Ｊ、 Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、、　ＩＣどｔ：１９３９．１９８８）が示したように、 平滑筋ミオシン重鎮及びαアクチンのような、平滑筋特異的収縮性蛋白質の発現 が減少する。

核内の癌遺伝子ｃ−ｍｙｂはこれらの変化に重要な役割を果たしている可能性が ある。癌遺伝子は鳥類骨髄飽性ウィルスの形質転換遺伝子と均質である。さらに 、本来は血液幹細胞のみ発現していることを考慮したにもかかわらず、ｃ−Ｂｂ は増殖しているＳＭＣと同様に鳥胚線維芽細胞中に存在していることが確認され ている（Ｃ，Ｂ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ＋　３１ ９：３７４．１９８６＋　およびＣ，Ｆ、Ｒｅ１ｌｌｙ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６４：６９９０２．１９８９）。

ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子が単離され、クローン化され、シーケンスされている　（ Ｍａｊｅｌｉｏ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＩＪＳＡ＋８３：９６３６−９６４０．１９８６）　、　ｃ−ｍｙｂの 発現は、増殖に依存的である。

この遺伝子は静止期の細胞中には低レベルでしか存在していないが、細胞の増殖 が始まり、速やかな増殖が進むと、細胞周期の最終時期の６１期近くにはピーク に達する（Ｃ，Ｆ、Ｒｅ１ｌｌｙ、　ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、 、　２６４：６９９０２．１９８９）　、さらにまた、ｃ−ｗｙｂの発現は細胞 の分化状態と関係していることを示している。骨髄芽球細胞は、分化誘導され、 その結果ｃ−ｍｙｂの発現が抑制される。

ヘパリンやヘパリンと密接に関連したプロテオグリカンは、インビトロでもイン ビボでも平滑筋細胞の増殖をブロックするＲ、Ｇｕｙｔｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、＋ ｃｉｒｉｃ、　Ｒｅｓ、＋　４６：６２５，１９８０　、およびり、Ｍ、Ｓ。

Ｆｒ１ｔｚｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　１００：１０ ４１．１９８５）、この抑制は細胞周期の後！ｌｌｌＧ１期に起こり、ｃ−ｍｙ ｂの発現レベル（ｃ−ｆｏｓやｃ−ｗｙｃのレベルではない）の減少を促進させ （Ｃ，Ｒ，Ｒｅ１ｌＬｙ＋ｅｔ　ａｌ、＋Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ、、　２６虹 ６９９０．１９８９を参照）、さらに、部分的に平滑筋特異的収縮性蛋白質の発 現を回復させる（Ｍ、にｔｌｒｏ−０＋　ｅｔ　ａｌ−＋Ｊ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｅ ｍ、、　２６４：１９８９および＾Ｊ、　ＣＩｏｗｅｓ＋　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、Ｃｅ１ｌ。

Ｒｉａｌ、、　１０７：１９３９．１９８８）。ｃ−ｓｙｂは、静止期の平滑筋 細胞の増殖のイニシェーシヨンを含んでいることが明らかになっているため、ヘ パリンがｃ−ｍｙｂのその作用により、抗増殖性作用を働かすかもしれない。イ ンビボで、特異的な部位にオリゴヌクレオチドを到達させるための方法を提供し 、それによってウィルス性遺伝子、癌遺伝子、疾病やその他病理的状態をもたら す蛋白質をコードする遺伝子の発現の局所的抑制を提供することが本発明の目的 である。

光所Ω要豹 本発明は、インビボで、局所（ｌｏｃｕｓ）における、優先性標的的核酸即ちア ンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に対して相補的な核酸配列を 有している特異的オリゴヌクレオチドの外科的あるいはカテーテル投与方法を用 いた、標的組織に対する直接的な投与をも包含する。オリゴヌクレオチドは、発 現を阻害されることになる遺伝子から転写されたメツセンジャー１１Ｎ＾（ＩＲ ＮＡ）に特異的なアンチセンス配列である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは 標的ＴｌＲＮＡにハイブリダイズして、これによってそのエンコードしている蛋 白質への翻訳を抑制している。このように本発明の方法は、選択された遺伝子に よって、エンコードした蛋白質への発現されることを抑制している。さらに、動 物実験では、インビボで劇的な局所治療効果示している。

好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼやインビボで存 在するその他の酵素によって分解および／または拡張に対して抵抗性を示すよう に変異させている。これは、技術的には公知の方法で達成可能である。たとえば 、連鎖中のリン酸塩を硫黄に置換するような１またはそれ以上の内部の人工のヌ クレオチド内連鎖を一体化するか、および／または、キャッピング構造を有する オリゴヌクレオチドの３′末端をブロックすることによる、などを上げることが できる。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約１４から３８ヌクレオ チドの長さであり、さらに好ましくは１５から３０のヌクレオチドの長さである 。

オリゴヌクレオチドは、周辺領域中の選択された蛋白質の発現を抑制するために 、局所的に投与される。好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチ ドは生物適合性のマトリックスまたはキャリアーに配置して、局所に、組織表面 に投与する。マトリックスまたはキャリアーはポリ（プロピレンオキサイド−エ チレンオキサイド）ゲルのようなヒドロゲル素材ヲ使用できる。例えば室温また はそれ以下の温度では液体であり、体温またはそれ以上の温度ではゲルとなるよ うな物質である。

この用法では、オリゴヌクレオチドは、ヒドロゲル素材と混合し、混合物を手術 またはカテーテルにより必要な部位に投与する。オリゴヌクレオチドもまたゲル を液化させること、すなわち冷却することによって溶液中に供給することができ る。そしてゲル化固体として投与部位に保持される。使用可能なその他のキャリ アーとしては、例えば、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、およびこれら の類似物を上げることができる。オリゴヌクレオチドは、直接注射によって局所 的に投与することができるし、移植ステンッやカテーテルのような装置を用いて 放出することが可能であり、また注入ポンプを用いて患部へ直接到達させても良 い。

本発明の方法は、蛋白質をエンコードしている遺伝子発現を阻害するためには、 正常な配列である非エンコーディングＤＮＡを調節することと同様に有用である 。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的な定められた局所に到達するゆえ に、これらのオリゴヌクレオチドは全身的投与が不可能な場合にもインビボで使 用することが可能である。例えば全身的に投与されたオリゴヌクレオチドは、標 的部位に到達する前に、それらを無効にしてしまうエンドヌクレアーゼによって 不活性化されてしまうかもしれない。患者にとって有害もしくは毒性作用を示す であろうオリゴヌクレオチドの大量投与が、全身的療法を成功させるためには必 須と考えられる。オリゴヌクレオチドの到達を特徴とする特定の局所に、アンチ センス配列を到達させることによるオリゴヌクレオチド療法を用いて、多数の特 定疾病を治療するための手段を、本発明方法は提供する。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＢは、種々の濃度でアンチセンスＮＭＭＨＣ（Ａ）とアンチセンス ｃ−ｍｙｂ（Ｂ）で処理をしたＳｖ−平滑筋細胞（ＳＭＣ）ついて、細胞数をカ ウントした結果を示すグラフである。

図２ＡおよびＢは、アンチセンスＩＩＮＭＭＨｃ（八）とｃ−ｍｙｂ（Ｂ）処理 をしたＳＶ４０ＴＬ−３ＭＣ細胞、ＢＣ３Ｈ１細胞、うｙト大動脈ＳＭＣおよび マウス大動脈Ｓ？ＩＣについて、それぞれ細胞数をカウントした結果を示すグラ フである。

図３Ａは、アンチセンスｃ１ｙｂとＮＭＭＨＣを異なった時間間隔で処理したＳ Ｖ−３ＭＣ細胞の増殖におよぼす効果を示すグラフである。

図３Ｂは、成長抑制を解除した後１６時間および４０時間後、非変異アンチセン スｃ−ｍｙｂ（明るい棒）とＮＭＭＨＣ（ｉｌい棒）で処理したＳＶ−５ＭＣに およぼす効果を示した棒グラフである。

図４は、センスｃ−＊ｙｂ（Ｓ　Ｍｙｂ）、アンチセンスｃ−ｗｙｂ（＾Ｓ　Ｍ ｙｂ）およびヘパリン処理を行ったＳＶ−５ＭＣ細胞に存在するｍＲＮＡの量を 未処理（コントロール）および成長抑制（Ｇ＾）細胞と比較して、ｃ−＆Ｉｙｂ 　ＲＮＡ　ドツトプロットの結果を示す棒グラフである。

図５は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）１２７ゲルマトリックスからのオリゴヌ クレオチドの放出速度を示したグラフである。

図６は、ＥＶＡｃマトリックスからのオリゴヌクレオチドの放出速度を示したグ ラフである。

図７は、傷害のある動脈へオリゴヌクレオチドの投与のための到達システムとし て、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルとエチレンビニル酢酸マトリックス（ＥＶＡｃ）を用 いてアンチセンスｃ−ｓｙｂ（ＡＳ　Ｍｙｂ）のラット動脈に及ぼす効果を、疑 似内膜性増殖の測定として内＃／媒質比率によって示た棒グラフである。

図８は、薬荊を含まないゲルとセンスｃ−ｍｙｂを含むゲル、未処理動脈を比較 するため、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルを用いてアンチセンスｃ−ｖｙｂをラット動脈 へ投与した場合の効果の棒グラフである。

図９は、バルーン血管形成処置後の動脈内細胞の増殖に及ぼす効果を見るために 、アンチセンスｃ−ｓｙｂとヒトＮＭＭＨＣ（各２００μＭ）を混合した物をウ サギ動脈に投与した結果を示した棒グラフである。

光朋ｍ吸 アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、蛋白質をエンコードする遺伝子の、 発現を阻害するための方法を説明する。この方法は、インビボで特異的部位にオ リゴヌクレオチドの局所投与を行うことを基本としている。オリゴヌクレオチド は、好ましくは、移植＆１１織またはゲルとの混合物を、直接標的組織に投与す るかあるいは直接投与や注入によって投与する。さらにまた、オリゴヌクレオチ ドは、細胞内酵素による分解や変質に対して、インビボで抵抗性を示すように処 理されている。

オリゴヌクレオチ′ アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療のアプローチは、遺伝子によって コードされている蛋白質の翻訳を妨げることによって、遺伝子の機能を破壊する ことが可能であるという原理に基づいている。これは、遺伝子から転写されるメ ツセンジャーＲＮ＾（ｓＲＮＡ）の、少なくとも一部分に対して相補的である、 適切な長さを持つオリゴヌクレオチドを供給することで、達成可能となる。アン チセンスストランドはｍＲＮＡにハイブリダイズして、破壊するために＋ｎＲＮ ＾を標的とする。それによって、リボシーマルトランスレージョンとそれに続く 蛋白質合成が妨げられる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性は、標的核酸上での、オリゴヌクレオ チドの複素環塩基と相補的塩基相互のＨａ　ｔｏｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対の形 成に由来している０例えば、１６ヌクレオチドの長さを持つヌクレオチド配列は 、約４１ｋまたは４×１０９毎にランダムに生じると思われる。従って、このよ うな配列は、ヒトゲノムであっても一つしかないものと予想される。

これとは対照的に、１０のクレオチドをもつヌクレオチド配列は、約４１６また は１×１０ｈのヌクレオチド毎にほぼ出現する。このようなシーケンスはヒトゲ ノムの数千倍存在する。従って、より長い鎖長のオリゴヌクレオチドはより短い 鎖長のオリゴヌクレオチドより特異的であり、必要としないハイブリッド形成に よりもたらされる毒性合併症を誘発することが少ない。そのため、本発明のオリ ゴヌクレオチドは、１４塩基以上の長さを有していることが好ましい。約１４か ら約３８塩基からなっているオリゴヌクレオチドが好ましく、さらに約１５から ３０塩基のオリゴヌクレオチドが特に好ましい。

オリゴヌクレオチド配列は、阻害しようとする遺伝子の配列分析に基づいて選定 される。遺伝子配列は、例えば、遺伝子の単離とシーケンシングや、もし公知で あれば文献によって決定することができる。オリゴヌクレオチド配列は「アンチ センスｊ配列であり、この配列は、分子のコーディングストランドに対して相補 性を有している。このようなオリゴヌクレオチドの配列は、少なくとも遺伝子配 列の一部分対して実質的に一致している。そして遺伝子から転写されるｍＲＮＡ に対して相補的である。

感染や複製のために必須であるウィルスおよび微生物の遺伝子、疾患の過程に関 係する蛋白質をエンコードしている遺伝子、自己免疫障害や循環器疾患のような 疾病やその他の障害に関係する蛋白質の発現をコントロールしている制御配列な どの発現を抑制するために、オリゴヌクレオチド療法を用いることができる。

本発明における有用なオリゴヌクレオチドは、核酸合成のための複数の公知技術 によって合成することができる。オリゴヌクレオチドは、好ましくは実施例に詳 細に説明する自動合成装置モデル８７００　（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａ ｒｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）のような自動合成装置、あるいは制御さ れた多孔質ガラス（ＣＰＧ）上でのＨ−リン酸化学法を用いたＡＢＩモデル３８ ０Ｂのような自動合成装置を用いて、良好に合成できる。オリゴヌクレオシドの チオリン酸化合成のためのＨ−ホスホネートのアプローチの詳細な説明は、Ａｇ ｒａｗａｌ　とＴａｎｇによって開示されている（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌ ｅｔｔｅｒｓ＋３１ニア５４１−７５４４．１９９０）。ここに開示されている 内容も本発明に包含されるものである。オリゴヌクレオシドのメチルホスホネー ト、ホスホロジチオネート、ホスホラミディト、ホスフェートエステルおよび架 橋ホスホロチオエートの合成は、先行技術により公知である。以下の文献を例示 する。Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋２８：３５３９，１９８７、 　Ｎ１ｅｌｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　 ２９：２９１１゜１９８８、Ｊａｇａｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｏｒｙ匡７２３７，１９８８　、Ｕｚａｎｓｋｙｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２敗３４０１，１９８７　、Ｂａｎｎｗａｒｔｈ＋ Ｈｅ１ｖ。

Ｃｈｔｍ、Ａｃｔａ、、７旦１５１７，１９８８　、Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ　ａｎ ｄ　Ｖｙｌｅ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、３０：４６９３，１９ ８９、　＾ｇｒａｗａ１．ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ ｉ。

ＵＳＡ、、８互１４０１−１４０５．１９９０゜以上の文献の記載する内容につ いても本発明と一体化しているものである。上記方法以外の合成または調製方法 も使用可能である。リボ核酸（ＲＮＡ）も合成でき、供給できるが、好ましい実 例において、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

本発明における有用なオリゴヌクレオチドは、好ましくは細胞内核酸分解酵素に よる分解に、抵抗するよう設計される。オリゴヌクレオチドのインビボ分解は、 長さの減少したオリゴヌクレオチド分解物を産生ずる。このような分割物は、非 特異的ハイブルダイゼーションで結合させることが好ましい。そして、標準的長 さの相手側に対して、実質的に有効性を減少させて置くことが望ましい。このよ うに、生体中の分解に対して抵抗性があり、標的細胞に到達できるオリゴヌクレ オチドを使用することが望ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、天然のホス ホジエステル連鎖を１またはそれ以上の人工的なヌクレオチド内連鎖で置換する ことによって、例えば連鎖中でリン酸を硫黄で置き換えることによって、インビ ボでより一層の分解抵抗性を示すことができる。使用することのできる連鎖の例 として、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、硫酸塩、ケチル 、ホスホロジチオエート、種々のホスホラミデート、ホスフェートエステル、架 橋ホスホロチオエートおよび架橋ホスホラミデートが含まれる。その他のヌクレ オチド間連鎖は先行技術として公知であるため、このような上記例示は、限定と してではなく実証例である。公知文献として、ｒｃｏｈｅｎ＋　Ｔｒｅｎｄｓｉ ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）」を参照することができる。ホス ホジエステルのヌクレオチド連鎖を１またはそれ以上置換したオリゴヌクレオチ ドの合成は、ヌクレオチド内連鎖がミックスされているオリゴヌクレオチドを調 製するための合成工程を含む、先行技術によって公知である。

オリゴヌクレオチドは、「キャッピング」するか、あるいは５゛または３゛末端 ヌクレオチドに同様の基を結合させることによって、細胞内酵素による延長に対 して抵抗性を作り出すことができる。キャッピングのための試薬としてＡｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＋Ｔｎｃ、、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃ＾、 から１１ｗ１ｎｏ−Ｌｉｎｋ　１１（登録商１）の商品名で販売されているもの を市場で購入可能である。キヤンピングの方法は、例えばＳｈｏｗ　ｅｔ　ａｌ 、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１氾７４７−７５０．１９９１、 　Ａｇｒａｗａｌ＋ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、、旦旦（１７）　ニア５９５−７５９９．１９９１に述べられている。以 上の文献の記載する内容についても本発明と一体化しているものである。

オリゴヌクレオチドの１　゛ 本発明によれば、用量をより低く抑え、全身的作用を最小にするように、インビ ボで目的とする部位に対してアンチセンス化合物の作用量を制限することで、塩 基が対を作ることが特徴であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの本来の結合特 異性は、促進される。か（して、オリゴヌクレオチドは所望の効果を達成するた めに、局所的に投与される。所望の部位のオリゴヌクレオチドの濃度は、オリゴ ヌクレオチドが全身的に投与された場合よりも充分に高くなる。そして治療効果 が有意に低い全投与量を用いて達成できる。オリゴヌクレオチドの局所的高濃度 は、標的細胞への浸透性と標的核酸配列の翻訳の効果的ブロックを促進する。

オリゴヌクレオチドは、薬剤の局所投与のために適した方法によって、その部位 に到達させることができる。例えば、オリゴヌクレオチドの溶液は直接局所に注 入できるし、また注入ポンプを用いる点滴により到達させることもできる。さら にオリゴヌクレオチドは、移植可能な装置と組み合わせることもできる。この装 置は、必要とする部位に設置された場合、周辺の部位のオリゴヌクレオチドが放 出されるようになっている。

オリゴヌクレオチドの最も好ましい投与は、ヒドロゲル素材を用いることである 。ヒドロゲルは、非炎症性であって、生物分解性である。このような素材の多く が、天然および合成ポリマーから調製されたものを含めて公知である。好ましい 実施態様における方法は、体温より低い温度では液体であって、体温または体温 付近の温度では、形を残している半固体状ヒドロゲルを構成するような、ゲル化 するヒドロゲルを利用している。

好ましいヒドロゲルとしては、エチレン　オキサイド−プロピレン　オキサイド の繰り返し単位を持つポリマーが上げられる。

該ポリマーの特性は、ポリマーの分子量と、ポリマー中のボする。好ましいヒド ロゲルは約１０−約８０重量％のエチレンオキサイドと約２０−約９０重量％の プロピレンオキサイドを含有している。特に好ましいヒドロゲルは約７０χのポ リエチレンオキサイトド３０χのポリプロピレンオキサイドを含有している。利 用可能なヒドロゲルは、例えば、ＲＡＳＦ　Ｃｏｒｐ、、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ ＋ＮＪから商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃとして発売されているものを入手できる。

本発明の実例において、ヒドロゲルは、液状に冷却されており、ヒドロゲル１グ ラム当たりオリゴヌクレオチドを１ｍｇの濃度にオリゴヌクレオチドを混合する 。ついで、得られた混合液は、例えばスプレー、手術中の塗布や噴霧、カテーテ ルや内視鏡法の使用によって、処置部の表面に投与される。ポリマーが温まると 固形化してゲルとなり、オリゴヌクレオチドは、ゲルの組成により決まった時間 が経過後、ゲルから周辺の細胞に拡散して行く。

オリゴヌクレオチドは、市場で購入可能であって、科学文献に開示されているリ ポソーム、マイクロカプセルおよび移植可能なデバイスである移植体を、用いる 手段によっても投与可能である。例えば、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、 ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびこれらの共重合体、コラーゲン、蛋白質ポ リマーなどの生物分解性素材、エチレンビニＪＬ／アセテ−ｌ−（ＥＶＡｃ）、 ポリビニルアセテート、エチレンビニルアルコール、これらの誘導体などの非生 物分解性素材が、オリゴヌクレオチド局所的到達の目的で使用することができる 。重合又は固形化する素材に、融解または溶媒蒸発技術の使用、又は素材と機械 的混合などによって、オリゴヌクレオチドは素材中に一体化させることができる 。一つの実施態様として、オリゴヌクレオチドは、シリカゲルコート化デキスト ラン、ステツク、カテーテルのような移植可能なデ）＜イスに混合するか、被覆 して投与する。

以下の実施例に述べるように、オリゴヌクレオチドの投与量はオリゴヌクレオチ ドのサイズとそれを投与する目的に依存して決められる。一般的には、投与範囲 は治療する組織の表面積に基づいて計算される。オリゴヌクレオチドの有効量は 、多少オリゴヌクレオチドの長さと化学的組成に依存しているが、通常は組織表 面の平方センナメーター当たり３０−３０００μｇの範囲である。ラットモデル のバルーン血管形成術により傷ついた血管への、ハイドロゲル中のアンチセンス ＋ｓｙｂの投与に用いる計算に従えば、組織の平方センナメーター当たりに投与 するオリゴヌクレオチド量は約３２０μｇであって、この投与量でｃ−＋ｗｙｂ 遺伝子産物の発現を抑制する。オリゴヌクレオチドは、治療と予防の両方の目的 で患者に全身的に投与される場合がある。例えばｃ−ｍｙｂ　、　ＮＭＭＨＣ及 び／またはＰＣＮＡＣＮ的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血管形成術かそ の他の方法に対して再発狭窄のために、危険をおかしている患者に投与されるこ とがある。

オリゴヌクレオチドは、効果的な方法により投与される０例えば、非経口的に（ 静脈、腹腔、筋肉経由）あるいは経口、経鼻、または発病に対するオリゴヌクレ オチド投与に許容され、そして患者の血流中に循環させるためのその他の経路か らの投与がある。オリゴヌクレオチドの全身的投与は、好ましくは局所投与に加 えてされるが、局所投与がなくとも有益である。一般的には、ヒト成人−人当た り０．１１−１ｏの範囲で投与すればこの目的には有効である。

冶凰↓■段与 本発明の方法は、遺伝子による蛋白質の発現に関係するか、基づいている種々の 疾患の処置に利用可能である。血管性の疾、患、特に血管再狭窄に対して特に本 方法は有用である。次の非限定実施例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、 バルーン血管再形成術処置によって誘導されたような、血管障害に続く血管再狭 窄の、非常にはっきりした阻害または予防に使用した例を示している。これは、 局所的に到達させたアンチセンスを使用して、血管再狭窄に関係していることが 確認されている蛋白質をエンコードしている遺伝子の発現を阻害することにより 達成したものである。この遺伝子はｃ−ｍｙｂ　、非筋肉性ミオシン重鎖（Ｎ？ ＩＭＨＣ）および成長性細胞核抗原（ＰＮＡＣ）を含む。しかしながら、本発明 方法は、その他多数の用途がある。

特異的な１１１４Ｍにおける特異的遺伝子の発現は、標的遺伝子の転写−ＲＮＡ に対して相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドによって抑制さ れる。ｃ−ｍｙｂと非筋肉ミオシン蛋白質の両方とも、平滑筋細胞の成長のイニ シェーションに、明らかに関係していることをはっきりしている。アンチセンス オリゴヌクレオチドによるこれらの蛋白質の生産阻害は、平滑筋の増殖が関係し ていると考えられる血管形成術の再狭窄、および動脈硬化、高血圧、一時的原性 高血圧および増殖性糸球体性腎臓のような慢性病の過程を処置するための方法を 提供する。本発明方法により処置することのできるその他の状態の実例として、 次のような原性疾患を上げる。急性呼吸困難性症候群、特発性肺線維症、肺気腫 、−次性肺性高血圧症。これらの症状は、例えば、吸入器によるエアゾールと組 み合わせた、局所的に投与できる適切なアンチセンスにより治療することができ る。これらの疾患は、肺胞（空気の側）、下側にある基底膜と平滑筋細胞、およ び近くの上皮細胞表面（血液側）の間で起こっている病理的な事実の？！！雑な 積み重ねによって誘発される。肺胞マクロファージは、Ｔ細胞レセプターを介し て特異的な抗原を認識し、活性化され、線維芽細胞を刺激するような白血球を集 合させるＰＤＧＦのような、種々の物質を生産することが推測されている。白血 球は、現存している抗プロテアーゼをしょじょに圧倒し、肺胞フエノモサイトに ダメージを与えるプロテアーゼを分泌する。線維芽細胞は線維増多を誘発させる 細胞外マトリックスを分泌する。　ＰＩ）ＧＰのような選択された成長因子と、 肺胞膜に対するダメージをおこすためには二次的である、引き続いておこる血液 酸素の減少は、平滑筋の増殖を誘発する。これが微小血管系の血液血管を圧迫し 、肺の血流を減少させる。これは、さらに血液中の酸素の移送を減少させる。上 記概略を示した分子上におこる事象は、血液凝固をイニシェートするＡｌｌ織因 子の存在と同様に、セレクチンとインテグリンの存在によって、微小血管系内皮 細胞表面の活性化を誘導する。これらのセレクチンとインテグリンの表面レセプ ターは、白血球細胞を微小血管系内皮細胞に接着させ、そしてこれらの細胞にダ メージを与えるその他の分子と同様にプロテアーゼを放出させ、肺胞内に液体を 蓄積させる。上記の事象もまた血管の閉塞による微小血管系の血栓形成の引き金 となる。これらの過程の最終結果として、さらに一層、酸素交換が妨害される。

肺胞／微小血管領域へ局所的に到達したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、次 の標的に対して、上記に概略を説明した病理学理論で干渉させることができる。

これは、選択されたすべての標的のｃＤＮ＾ＤＮＡ配列していることによるもの である。このように、遺伝子から転写されたｍＲＮＡに特異的なアンチセンスオ リゴヌクレオチドは、上記事象のイニシェーションを予防することで肺胞マクロ ファージのＴ細胞レセプター生産を阻害する他、次のような作用を示す。肺胞白 血球の活性化を予防することによる蛋白質生産の阻害、肺胞膜の破損を予防する ことによるエラスターゼ生産の阻害、白血球の動員あるいはその結果としての線 維化を予防することによるＰＤＧＦ生産の阻害、ＳＭＣ増殖を抑制するためのｃ −ｍｙｂの生産阻害、肺胞性微小血管内皮細胞への白血球細胞の接着を予防する ためのｐ−セレクチン、ｅ−セレクチンあるいは種々のインテグリンの生産阻害 、微小血管血栓の抑制のためのティッシュファクターおよびＦＡＩ−１の生産阻 害。

追加の例として、ティッシュファクター（ＴＦ）が凝固系活性化を必要としてい ることを示す。血栓形成部位でのＴＦ断片の５ＲＮＡまたはＤＮＡを標的として いるアンチセンスの局所投与は、さらなる凝集を予防することができる。この療 法は、全身的な抗凝固療法の付随方法として、あるいは代替法として、あるいは 血栓溶解療法の後に、採用することができ、それにより全身的な副作用を避ける ことができる。

プラスミノーゲンアクチヘータインヒビター（ＦＡＩ−１）　は組織プラスミノ ーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）の局所濃度を減少させることが知られている。ヒ トＦＡＩ−１のｃＤＮＡ配列は公知である。ＰＡＩ−１の−ＲＮＡまたはＤＮＡ を標的とするアンチセンスの局所投与は、標的部位でのＴＰＡの増強を行わせる 。これは、全身的な副作用を起こさせないで、自然に血栓を溶解させるために充 分なＴＰ＾の生産を結果としてもたらす。

アンチセンスＴＦとアンチセンスＰＡ［−１の組み合わせは、局所的な血栓溶解 療法後および予防的血管形成処置後を含む種々の疾患の治療の有効性を最大にす るために有効であるかもしれない。

多くのその他の血管性疾患は、標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を特定することに よって、上記に説明したことと同様な方法で治療することが可能である。アンチ センス療法はつぎのような疾患の治療に有用である。心筋性障害、末梢筋肉障害 、末梢血管形成、血栓性静脈炎、脳血管障害（卒中、栓塞）、血管炎（側頭動脈 炎）、アンギナおよびバッド＝チアリ症候群。

以下の実施例は、本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定すること を意図としたものではない。

実施± 林粁旦走グ方抜 ＳＶ４０ＬＴ−ＳＭＣ（ラット平滑筋細胞、Ｃ，Ｒｅ１ｌｌｙ、Ｍｅｒｃｋ＋　 ５ｈａｒｐ　ａｎｄＤｏｈ＋ｍｅ、　Ｗｅｓｔ　Ｐｏ１ｎｔ、　ＰＡから分与を 受けた）は、加熱失活させたウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓ ｄａ、ＭＯ）を１０χ含むダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培 養した。ＢＣ３Ｈ１マウス平滑筋細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１４４３．Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）は、加熱失活させたウシ胎児血清（ＦＢＳ）　２０ χを含むＤＭＥＭを用いて培養した。細胞培養は３７°Ｃで、５χ二酸化炭素雰 囲気で行った。

初代の大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ 平均体重３５０ｇ）およびＦＶＢマウス（平均体重５０ｇ）から体外移植技術を 使って単離した（Ｒｏｓｓ、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、５０：１７２−１８ ６．１９７１）。

培養物は血管ＳＭＣの特有の形態学的な特徴を呈した（紡錘形および　ヒルアン ドバレーパターン）。血管ＳＭＣは平滑筋αアクチンアイソフオームの存在をノ ーザン分析によって確認した。

初代大動脈ＳＭＣは第二化継代に用いた。

アンチセンスおよびセンス１８−ｍｅｒチオリン酸化オリゴヌクレオチドはＡＢ Ｉ　ＤＮＡ　シンセサイザーで合成した。オリゴヌクレオチドは装置上で脱保護 し、乾燥させ、ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋　ｐＨ７，５＋１ｓＭ　ＥＤＴ＾、 　ｐｉ＋　８．０）に再懸濁させ、吸光度計とゲル電気泳動で定量した。次の配 列を採用した。

アンチセンスｃ１ｙｂオリゴヌクレオチド聞舅１号」− ＧＴＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣアンチセンスＮＭＭ）ＩＣオリゴヌクレ オチド配ＩＩＬＬＩ− ＣＡＴＧＴＣＣＴＣＩＩ：ＡＣＣＴＴＧＧＡアンチセンストロンボモジュリン（ ＴＭ）オリゴヌクレオチドｙ死菫号」− ＡＣＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＧマウスｃ−ｍｙｂと比較して２つ のミスマツチを持つ、アンチセンスヒトｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド配ＪＡＪ Ｌ号」− ＧＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣ配列番号１は、マウスｃ−ｍｙｂヌクレ オチド４−２２の相補鎖である（Ｂｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｌ、八ｃ ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　墨３２０４−３２０８．１９８６）。

配列番号２は、ヒトＮＭＭ１１Ｃ−＾ヌクレオチド２３２−２５０の相補鎖であ る（Ｓｉｍｏｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｉｒ、　Ｒｅｓ、６敗５３０−５３９． １９９１）　、配列番号３は、マウスＴＭ　４−２５の相補鎖である（Ｄｉｔｔ ｍａｎ　ａｎｄ　Ｍａｊｅｒｕｓ。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１７：８０２．１９８９）。配列番号４は、ヒ トｃ−ｍｙｂの相補鎖であり、マウスｃ−ｍｙｂと比較して２塩基がミスマツチ している。ＮＭＭＨＣ配列は、公知の非筋肉性ミオシン配列とのホモロジーが最 も近接した領域のものから選択した。配列はヒトＮＭＭＨＣ−Ｂ（Ｓｉｍｏｎｓ 　ｅｔ　ａｌ、、同上）と１ヌクレオチドが異なっており、ニワトリ　ＮＭ門Ｈ Ｃ−八とＮＭＭＨＣ−Ｂと２ヌクレオチドが異なっている。対応するセンス配列 をコントロールとして用いた。

実施例１：インビトロでのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたｃ−ｍｙｂ とＮＭＭＨＣの阻害 増殖勇足 初代大動脈ＳＭＣの早期継代細胞と同様な、両方のセルラインとも、６ウエルプ レー）　（Ｃｏａｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍ＾）中のＩＯＸＦＢＳ−Ｄ ＭＥＭ　（ＢＣ３Ｈ１細胞用ニハ２０２ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）　ニ、１ウヱル当た り２５．０００細胞密度になるようにシーディングを行った。翌日細胞をリン酸 緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、培地を増殖抑制培地である０、５χＦＢＳ −ＤＭＥＭ培地に交換した。細胞は、増殖抑制培地中で９６時間保持した。次い で培地を１０χまたは２ｏχＦＢＳ−ＤＭＥＨに交換し、合成ｃ−１Ｉｌｙｂ　 、　ＮＭＭＨＣアンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドを加えた。細胞は ７２時間増殖させ、トリプシン処理し、コールタ−カウンターで計数した。

２種類のセルラインとＳＭＣ細胞は、１０χと２０２ＦＢＳ−ＤＭＥＭ　テ増殖 することができ、オリゴヌクレオチドを加えた。細胞数は上記したように５−８ 日後にカウントした。それぞれの実験は、３連で行い、少なくとも付加的に２回 繰り返し行った。データーは平均埴土標準偏差値で表した。

結果（図１を参照）は次の通りである。インビトロでｃ−ｍｙｂ（配列番号１） とＮＭＭＨＣ（配列番号２）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実質 的に細胞増殖を抑制した。一方センスオリゴヌクレオチドは作用を示さず、ちょ うどＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ　Ｍ清液を用いて得られた結果と同様の結果となった。

使用したオリゴヌクレオチドはヒト／ニワトリＩＩＭＭＨｃまたはマウスｃ−ｍ ｙｂ　ｃＤＮ＾のヌクレオチド配列から由来しているものであった。、１８塩基 のｃ−ｎ＋ｙｂアンチセンス配列の２塩基を、ランダムに変化させた場合に（配 列番号４）、抗増殖性作用が完全に喪失することから、アンチセンスオリゴヌク レオチドの特異性の重要性を示すことができた。この試験の結果は次の通りであ る。

７７　チセンスｃ−ｍｙｂ　４７５，６００　＋２５，０００細胞、ミスマツチ アンチセンスｃ−ｍｙｂ　９５８，８００±１２．０００細胞、センスｃ−ｍｙ ｂ　９３５＋２００±２２．０００細胞。このようにミスマツチアンチセンスｃ −ｍｙｂ（配列番号４）は、確実にＳＭＣ細胞の増殖を阻害できない。アンチセ ンスおよびセンス　ホスホロチオレートトロンボモジュリン（ＴＭ）オリゴヌク レオチドはＳＭＣの増殖に効果を示さなかった（アンチセンスＴ？ｌ　３６４， ５８０±１９，０００細胞、センスＴＭ　３７６．２９０±１１　、０００細胞 ）。

ｃ−閘ｙｂと比較した場合の、Ｎ　Ｍ　ｌ’ｌ　ＩＩ　Ｃに対して直接作用する アンチセンスチオリン酸化オリゴヌクレオチドの阻害作用は、明らかに濃度依存 性であった（アンチセンスＮＭＭＨＣ；２μ門と２５μＨのそれぞれの抑制率は ３２χと６５χである。アンチセンスｃ−ｍｙｂ；２μ門と２５μ−のそれぞれ の抑制率は３３χと５０χである）。これら２つのメツセージの相対的な割合の 、おおよその予測は、以下のことを示している。ｃ−密ｙｂ　ｍＲＮＡは、指数 的に増殖するＳＭＣ中では極めて低い濃度しか得られない（ポリ４＋ＲＮＡの０ ．０１％以下）、シかしＮＭＭＨＣｍＲＮＡは明らかに高いレベルで存在する。

成育阻害に関わる２つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの観察された濃度依存 性は、２つのｍＲＮＡの相対的な量に一致していた。

アンチセンスおよびセンスホスホロチオレートオリゴヌクレオチドの抗増殖効果 は、初代ラットおよびマウス大動脈ＳＭＣを用いると同様に、ＢＣ３１１１セル ラインを用いて評価した。次のデータが得られた。即ち３種の細胞の増殖は、ホ スホロチオレートアンチセンスによって明らかに抑制されたが、センスＮＭＭＨ Ｃまたはｃ−Ｂｂオリゴヌクレオチドでは抑制されなかった（図２）。

アンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドは、ラット大動脈ＳＭＣとラットＳ Ｖ４０ＬＴ−５ＭＣに比較して、マウス大動脈ＳＭＣおよびマウスＢＣ３旧細胞 に、より強い抗増殖作用を示した（図２Ｂ）。増殖抑制の違いは、選択した範囲 で、ラットとマウスｃ−＋ｗｙｂ配列間のアンチセンスヌクレオチドのミスマツ チの大きさの程度に殆どが由来している。

アンチセンスＮＭＭ）ＩＣまたはｃ−ｍｙｂホスホロチオレートオリゴヌクレオ チドに対して、ＳＶ４０ＬＴ−ＳＭＣを接触させて、最大の成長抑制を達成する ために必要な最短時間が決定された。上記に示した検討では、細胞は、添加によ り成長抑制培地から１０χＦＢＳ−ＤＭＥへ移動の時点から増殖抑制効果を細胞 数をカウントして測定するまでの７２時間、持続的にオリゴヌクレオチドに接触 させた。次の実験では、ＳＶ４０ＬＴ−ＳＭＣは、成長抑制からのシフトの後一 定の期間アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、その後ＰＢＳで２回洗浄し 新鮮なオリゴヌクレオチドを含まない１０χＦＢＳ−ＤＭＥＨに置き換え、７２ 時間後に細胞数をカウントすることで成長抑制効果を評価した。図３Ａに示した 結果は、有意な抗増殖効果を生じさせるためには、１時間かそれより短い時間、 ２５μＨのアンチセンスＮＭＭＨＣまたはｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドを加え ることで良いことが６１ＨＥされた。アンチセンスＮＭＭ）ＩＣオリゴヌクレオ チドで処理をした２時間後の増殖阻害の程度は、７２時間連続的に接触させたと 同程度であった（細胞成長を６５χ抑制）。

アンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド混合物は、４時間で抗増殖効果を得 た。この効果は、７２時間持続的に接触させて観察される結果であった（細胞増 殖の５０χ抑制）。

アンチセンスホスホロチオレートオリゴヌクレオチドの増殖阻害が容易に回復可 能か否か確認するために、実験を行った。

この実験の最終段階で、ＳＶ４０ＬＴ−３Ｍを、増殖抑制から解放させた後、２ ５μ−のアンチセンスまたはセンスＮＭＭ）ＩＣあるいはｃ−ｍｙｂオリゴヌク レオチドに対して４時間接触させた。細胞は、引き続いてＰＢＳで２回洗浄し、 オリゴヌクレオチドを含まない新鮮な１０χＦＢＳ−ＤＭＥ？ｌ培地に交換し、 ３日後および５日後細胞数を測定した。アンチセンスＮＭＭＨＣまたはｃ−ａ＋ ｙｂ処理を行ったＳＶ４０ＬＴ−ＳＭＣの増殖は、相当するセンスオリゴヌクレ オチドと比較した場合に、３日後にそれぞれ約６５χ、５０χと明らかな増殖の 初期抑制を示していることが、このデータから明らかになった。しかしアンチセ ンスＮＭＭＨＣまたはｃ−ｍｙｂを用いて処理したＳＶ４０ＬＴ−ＳＭＣの３日 目と５日目の間の倍化時間は、対応するセンスオリゴヌクレオチドと比較した場 合には、２２時間で同しであった。

成長抑制から解放された後１６時間、２５μ門の未変成アンチセンスＮＭＭ）Ｉ ｃまたはｃ−ｉｙｂオリゴヌクレオチドでＳＶ−４０ＬＴ−ＳＭＣを処置すると 、７２時間目に識別可能な抗増殖効果は得られなかった。

一方、２つのオリゴヌクレオチドで同しレベルで４０時間持続して接触させた場 合、チオリン酸化誘導体を用いて観察された効果と同し阻害効果を得た（図３Ｂ ）。

アンチセンスＮＭＭＨＣとｃ−ｍｙｂチオリン酸化オリゴヌクレオチドの抗増殖 性力に対する増殖抑制の重要性を評価した。１０μＨのアンチセンスＮＭＭＨＣ またはｃ−Ｂｂオリゴヌクレオチドに対して露出させて、細胞数を７２時間と１ ２０２０時間目ウントしたところ、５Ｖ４０ＬＴ−５Ｉ’ＩＣは指数的に増殖し た。アンチセンスＮ？ＩＭＨＣオリゴヌレオチドを用いたＳｌ’ＩＣの処理は、 どちらの時点においても、増殖阻害効果を示さなかった。ところが、アンチセン スｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチドに対する接触は、７２時間目の増殖を１９％抑 制し、１２０２０時間目殖を４０Ｘ抑制させた。

ＲＮＡ分扼 Ｃｈｏ＊ｚｙｎｓｋｉと５ａｃｈ　ｉの方法（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏ ｌ、　１４２：３４２．１９９０）により、１０１１０１ＦＢＳ−Ｄで増殖誘導 させたのち２４時間培養したＳＶ４０ＬＴ−ＳＭＣから全細胞１２Ｎ八を測定し た。　ＲＮＡは分光光度計により定量した。そして全１０μｇをドツトプロット 装置を用いて、ニトロセルロースにプロットした。プロットは、１０χデキスト ラン硫酸と４０χホルムアミド中のランダムプライム化したｃ−ＩＩＩｙｂ、Ｎ ＭＭＨＣ、ラージＴ抗原、ＧＡＰ［ｌＨおよび７Ｍプローブを用いて４２゛Ｃで １６時間、ハイブリダイズさせた。ノーザンプロットとＲＮＡのドツトプロット は、ｃ−ａ＋ｙｂには５０°Ｃおよび０．５ＸＳＳＣ、ＮＭ聞Ｃには５５°Ｃお よびＱ、５ＸＳＳＣ、ラージＴ抗原には５５°Ｃおよび０．２ＸＳＳＣ、ＧＡＯ Ｐｔｌには５０°Ｃおよび０．２ＸＳＳＣ、、ＴＭには５０°Ｃおよび０．２　 Ｘ５ＳＣで行う最終洗浄をＳＳＣ中で洗浄した。ノーザンプロットはオートラジ オグラフィーを行った。ＲＮＡプロットは、ベスタスコーブ６０３アナライザー （ＢｅｓｔａｇｅｎＪａｌｔｈａｍ、ＭＡ）をイ史用してラージＴ抗原の計数値 に対する正常化したｃ−ｍｙｂまたはＧＡＰＤＨの計数値を用いて定量した。計 数はそれぞれのドツトを全カウントで表した。全実験を２回繰り返した。次の処 理をした細胞についての結果を得た。センスｃ１ｙｂオリゴヌクレオチド（２５ μＭ）、アンチセンスｃ−ｍｙｂオリゴヌクレオチド（２５μＭ）、ヘパリン（ １００μｇ／ｍｌ）　、細胞はコンフルエントに達するまで培養し、２日間静置 した。

アンチセンスｃ−Ｉｌｙｂオリゴヌクレオチドに対して接触させた細胞は、放射 性ラヘル化ｃ−ｍｙｂプローブを用いたＩＩＮ八　ドツトプロットハイブリダイ ゼーションによって測定すると、ｃ−Ｂｂメソセージの量が明らかに減少してい た。結果を図４に示した。

図４はそれぞれのドツト数を示し、それぞれのサンプルのＩＩＮＡの量に一致し た。このサンプルは次のものである。センスｃ−＋ｗｙｂ（Ｓ−Ｍｙｂ）および アンチセンスｃ−ｎ＋ｙｂ（Ａ−Ｍｙｂ）により処理した同調化増殖ＳＶ−５Ｍ Ｃ、ヘパリン抑制（ヘパリン）、増殖抑制（ＧＡ）細胞。

細胞増殖は、ｃ−ＩＩｌｙｂメソセージの存在量と同程度の量が存在するヘパリ ンを用いたと同程度にアンチセンスｃ−ｍｙｂにより、抑制される。同様にして 、アンチセンスＮＭＭＩＩＣオリゴヌクレオチドは、ノーザンブロソトで検出さ れたＮＭＭＩＩＣメソセージの顕著な減衰を引き起こす。アンチセンスｃ−Ｂｂ で処理した細胞中のｃ−ｍｙｂ蛋白質の量は、顕著に減衰し、間接免疫蛍光法で 分析したところ、この蛋白質は、アンチセンスＮＭＭＨＣ−８で処理した細胞の 非筋肉性ミオシン蛋白質であった。

Ｃ−ｌｌ１ｂおよびＪ　ミオシンに　まｉｓ匹ノリ硬え筬ル斯鷹。

鎗跋翌 ＳＶ４０ＬＴ−ＳＭＣは２χホルムアルデヒドＩＰＢＳを用いて室温１５分間で 固定化し、２χトリドアＸ−１００／ＰＢＳを浸透させ、１χＢＳＡ／ＰＢＳ　 テ３回洗浄し、１χＢＳＡ／ＰＢＳで１：２５０または１　：　１０００に希釈 した抗町すまたは抗ＮＭＭＨＣ抗血清に２−４時間接触させた。抗−ｙｂ抗血清 はＣａｍｂｒｉｄｖ、ｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉ ｌ＋＊ｔｎｇｔｏｎ、ＤＥ）から入手した。マウスｃ−ｍｙｂアミノ酸残基３３ ２−３４５に対応する合成ペプチド旧５−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−旧５−５ｅｒ−丁ｈｒ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｖａｔを用い てウサギを免疫して得たものである。

抗非筋肉性ミオシン抗血清はＲ５ＡｄｅｒｓｔｅｉｎとＪＳ　Ｓｅｌｌｅｒｓ（ ＬＭＣ。

Ｎ１１（、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）から供与を受けた。この抗血清は精製ヒ ト血小板ミオシンをウサギに免疫して調製したものである。この抗血清はウェス タンブロンド分析により、モノスペシフィックであることを確認した。細胞は、 過剰な一次抗体を除去するために１χＢＳへ／ＰＢＳで３回洗浄した。次いで１ χＢＳＡ／ＰＢＳで１００倍希釈した第２抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋ ａ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣから入手した、ローダミン−コンジュゲート化したヤギ 抗ウサギＩｇＧとＦＴＴＣ−コンジュゲート化したヒツジ抗ウサギｒｇＧ）を加 えて２時間インキュヘーションを行った。１χＢＳＡ／ＰＢＳで３回洗浄した後 、サンプルをニコン　オプチフォト　蛍光顕微鏡写真装置で試験を行った。

アンチセンスオリゴヌクレオチドにより誘導されたＮＭＭ）Ｉｃとｃ−ｍｙｂ　 ｍＲＮＡ１ｌ！！度の減少は、特異的蛋白質のレベルに減少として示された。こ の効果を確認するために、ＳＶ４０ＬＴ−５ＭＣ細胞を低密度（１０，０００／ ｃｍ２）で、２ウエルのガラススライド（Ｎｕｎｃ、　Ｉｎｃ、＋Ｎａｐｅｒｖ ｉｌｌｅ、　ＩＬ）に置床した。０．５χＦＢＳ−ＤｆｌＥＭで９６時間、成長 を抑制させ、２５μ門のアンチセンスまたはセンスＮＭＭＩＩＣまたはｃ−ｔａ ｙｂチオリン酸化オリゴヌクレオチドを添加した１０χＦＢＳ−ＤＩＩＩＥＨに 移した。２４時間後（ｃ−ｍｙｂ）または７２時間後（ＮＭＭＭＣ）　、ＳＭＣ をＮ　ｌ’ｌ　Ｍ　ＩＩ　Ｇまたはｃ−ｍｙｂに対する特異的抗血清を使用して 、間接的免疫蛍光顕微鏡による観察を行った。アンチセンスオリゴヌクレオチド 処理を行った殆どの細胞で、センスオリゴヌクレオチド処理と比較して、Ｎ？Ｉ ＭＩＩＣまたはｃ−ｍｙｂ蛋白質の濃度が、劇的に減少したことをはっきりと確 認できた。しかし、それぞれのパネルにおける特別な細胞は、蛋白質の実質的な 量を持っていることがはっきりした。この観察は、増殖抑制からこのサブポピユ レーションの成熟前のエスケープそして標的ｍＲＮＡ５のレベルで続いておこる 増加には、おそらく２次的なことである。−次抗体が存在しないか、あるいは、 最小のバックグラウンドシグナルを示す精製抗原が大量に存在する場合に、未処 理ＳＭＣで上記方法を実行することで、免疫蛍光法の特異性は証明される。

実施例２：重合化マトリックスからのオリゴヌクレオチドの放出 ＰｌｕｒＯｎｉＣ゛ルマトト・クス４（Ｄｔ　’　ｊ　’９．９　ｋ、９Ｃ−鋼 ｙｂおよびＮＭＭＨＣアンチセンスオリゴヌクレオチド（材料および方法の箇所 で説明した）を含有する（エチレンオキサイド−プロピレンオキサイド）ポリマ ーを、マトリックスからのオリゴヌクレオチド放出比率を試験するために調製し た。試験用サンプルは、シンチレーションバイアルに入れたＵシ殺菌済ＰＩｕｒ ｏｎｉｃ１２７粉末（ＢＡＳＦ　Ｃｏｒｐ、、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ、Ｊ、 ）１．２５ｇと精製水３．２５ｍ１で調製した。溶解は振盪しながら氷上で冷却 して行った。

これらの溶液に対して、オリゴヌクレオチド（５，０４１ａ＋ｌ１５００μｍ） を含む殺菌水溶液５００μｍを添加した。最終のゲルはポリマー２５χ（Ｗ／Ｗ ）およびｌ＋ｓｇ／ｇのオリゴヌクレオチドを含有していた。

オリゴヌクレオチドを含むゲルの放出速度はＰＢＳにゲルを置き換えて時間経過 ごとの吸光度（ＯＤ２６０）を測定することによって決定した０図５に示した４ つの試験ゲルの結果は、オリゴヌクレオチドが１時間以内にゲルから放出される ことを示していた。

ＥＶＡＣマトリックスか”のオリゴヌクレオチドの　１エチレンビニルアセテー ト（ＥＶＡｃ）からのオリゴヌクレオチドの放出を以下に示した。

マトリックスを構築し、Ｍｕｒｒａｙらにより開示されている方法（Ｉｎ　Ｖｉ ｔｒｏ、、１９　、７４３−７４８．１９８３）で放出を測定した。

エチレンビニルアセテート（ＥＶＡｃ）共重合体（ＥＬＡＶＡＸ　４０Ｐ、Ｄｕ ｐｏｎｔＣｈｅｍｉｃａｌｓＪｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）は、液体容量でｌＯ χになるようにジクロルメタンに溶解させた。ウシ血清アルブミンとオリゴヌク レオチドは１０００−２０００：１の比率で、いっしょに脱イオン水に熔解させ 、液体窒素で凍結させた。次いで乾燥粉末の状態とするため、凍結乾燥した。粉 末は、直径４００ミクロン以下の粒子が均質に分布するような形態とするために 粉砕した。既知量の粉末は、２２１のガラス製シンチレーシぢンバイアル１ｏχ （Ｗ／１４）ＥＶＡｃ共重合体溶液の４−４−１Ｏと一緒にした。バイアルは、 ポリマー溶液中で薬物粒子の均質なサスペンションとするために１０秒間、攪拌 混合させた。このサスペンションはガラス製型に移し、ドライアイスの板の上で 予備冷却させた。混合物の凍結後、１０分間放置し、型をとりはずし、−２０″ Ｃの冷凍庫中の金網の上に２日間静置した。このスラブは、残存するジクロルメ タンを除去するために、６００　ミリトールの真空度で、２３°Ｃ２さらに２日 間乾燥させた。完全に乾燥した後、１１３のコルクポーラで、５＋＋ｗ　Ｘｏ、 　８＋ｍｓの円型スラブを切り抜いた。

図６に示した結果は、オリゴヌクレオチドの３４χが４８時間以内に放出された ご七を示している。

実施例３：ラットでのｃ−ｍｙｌ）およびＮＭＭＨＣ阻害のためのオリゴヌクレ オチドのインビボ投与 ■、動物モデル インビボの血栓形成モデルとして、ラット頚動脈のバルーンストリンピングを用 いた。ラットはネンブタール（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した。左頚部動脈切開を 行い、２Ｐ　Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを頚部動脈内に動脈切開によって導入し た。カテーテルは大動脈弓まで入れ、バルーンを膨らませ、カテーテルを動脈切 開部位まで引き戻した。これを２回くり返した。続いてバルーンを引き、蓮部動 脈内部に残置し、止血を行い、傷口を閉じた。

＋＋、オリゴヌクレオチドの到達 オリゴヌクレオチドはハイドロゲルおよび移植可能エチレンビニルアセテート（ ＥＶＡｃ）マトリックスと共に投与した。ハイドロゲルとしてポリエチレンオキ サイドーポリエチレンオキサイドポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　１２７＋　ＢＡ ＳＦ、　Ｐａｒｓｉｐａｎｙ＋　ＮＪ）を用いた。

Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルマトリックスは実施例２の方法で調製した。Ｕｖ殺菌した ＰＩｕｒｏｎｉｃ粉末１．２５ｇを、シンチレーションバイアルに秤量し、３． ２５剛Ｉの無菌水を加えて、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　１２７の無菌溶液を調製した。

溶解液を振盪しながら氷上で冷却を行い、ポリマーを重量の２７．７χ含む溶液 をつくった。これらの溶液には、アンチセンスｃ−Ｂｂ（実施例１参照）オリゴ ヌクレオチド（５，０４１ｍｇ１５００μｍ）の無菌水溶液を５００μＩ添加し た。最後のゲルはＰｌｕｒｏｎｉｃポリマーを２５χ（Ｗ／Ｗ）と１ｍｇ／ｇの オリゴヌクレオチドからなる。

薬物を含まない２５χ（Ｗ／Ｗ）ゲルをコントロールとして調製した。

ＥＶＡｃマトリックスは、実施例２で開示した方法で調製した。さらに２０ｇｇ のオリゴヌクレオチドを含有させた。

バルーン傷害後直ちに、２００　μｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ／オリゴヌクレオチド 溶液（２００μｇのオリゴヌクレオチドを含む）は、動脈の外膜表面に投与して 、ゲル化物を形成させた。アンチセンス／ＥＶＡｃマトリックス（オリゴヌクレ オチド４０μｇを含む）と薬物を含まないゲルを同様に投与した。

ＩＩ＋、効果の測定 １４日後に動物を層殺し、頚部動脈を乳酸塩リンゲル液で、１２０ｍｍＨｇの圧 力で散布した。両方の頚部動脈を取り出して、３χホルマリンで固定化した。一 般的な方法で、光学顕微鏡用切片を調製した。スライドを映像化し、デジケーテ ンドコンピュータシステムと小型プレニメーターを用いてデジタル化し、疑似血 管内膜の増殖の範囲を計算した（平方＋１１ＲＩ）。

結果を図７に示した。処理していないコントロール動物、薬物を含まないゲル処 理動物は、再狭窄が拡大し、傷害動脈の完全な部分にそって対称的な疑似内膜が 形成され、内腔の６０χが狭くなっており、内膜／内管の比率が１．４になって いることが特徴的であった。

アンチセンスｃ−ｍｙｈオリゴヌクレオチド処理動物では、再狭窄と境界部の増 殖は最小であり（内腔の１０％以下）、これはオリゴヌクレオチドに直接接触し た動脈の部分に限られたことであり、内膜／内管の比率は０．０９であった。図 ７に示すように、この結果は、アンチセンス／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ処理動物には特 にはっきりとしていた。ＥＶＡｃ／アンチセンスを用いて得られた内膜／内管の 比率は０．４５であった。しかし４０／／ｇのオリゴヌクレオチドを含むＥＶＡ ｃマトリックスは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルで投与された２００μｇのオリゴヌク レオチドと比べると、違いがはっきりしていた。

図８はこの実験を拡大して、ラット２８匹を上記と同様の処理を行った時の結果 を示している。各処理群７匹のラットにバルーン血管形成術を行った。次いで動 脈壁に次の処置を行った。

薬物を含まないヒドロゲル（上記に示したＰｌｕｒｏｎｉｃ　１２７）　、セン スｃ−＋＊ｙｂを含むヒドロゲル、アンチセンスｃ−ｍｙｂを含むヒドロゲル、 未処理。図８に示すように、疑似内膜増殖の同様な高いレベルは、アンチセンス ｃ−Ｂｂ処理以外であった。アンチセンスＣ−＋１ｌｙｂ処理は、増殖のレベル が劇的に低かった。

実施例４：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＮＡの阻害実施例１と 同様の方法により次の配列をもつＰＣＮ＾アンチセンスを培養中の５Ｖ−３ｌＩ Ｃ細胞に投与した。

配力ｍ ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＴＧＣＣＴＣ＾＾＾ネガティブコントロールとしてセ ンスＰＣＮＡを用いた。ＮＭＭＨＣはポジティブ（阻害）コントロールとして用 いた。

ネガティブコントロールは平滑筋細胞増殖を抑制しなかった。

アンチセンスＮｌ’１ＭＨＣ−８は５２χ抑制し、アンチセンスＰＣＮ＾は５８ χの抑制を示した。

実施例５：ウサギの平滑筋細胞増殖阻害に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ ドのインビボ投与 ニュージーランドホワイトラビント（１−１、５ｋ　ｇ　）をケタミンとザイラ ジンの混合物で麻酔を行い、実施例３に開示したように、頚部動脈を切開した。

Ａ　５Ｆ　Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテルを挿入し、螢光導子で下行動脈に設置 した。Ｓ＠ａｎ−Ｇａｎｚカテーテルは３．０＋ｕｅのバルーンを備えた血管形 成カテーテル用のワイヤーに交換した０通常の腸骨大動脈は、１回それぞれ９０ 秒間１００ＰＳＩで、３回血管形成術を行った。−ｏ１ｉｎｓｋｙカテーテルを 導入し全量５ｃｃの生理食塩水中のオリゴヌクレオチド液を付加した。外側の下 行大動脈中のコントロールとして生理食塩水を注入した。オリゴヌクレオチドは アンチセンスマウスｃ−ＢｂとヒトＮＭＭＩ（Ｃ混合物（各２００μＭ）を上記 のように用いた。混合物は６０秒をかけて、５気圧の圧力で注入した。２匹のウ サギをアンチセンスオリゴヌクレオチド処理を行った。動物は４週間後層殺し、 実施例３で説明したラット動脈と同様に処理した。

図９に結果を示したが、生理食塩水単独と比較すると、アンチセンス処理ウサギ 動脈の疑似内膜は５０χ減少していることが確認された。

実施例６：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒヒ平滑筋細胞の増殖抑制 実施例１に示したと同様の方法を用いて、初代ヒヒ平滑筋細胞（叶、　Ｈａｗｋ ｅｒ、Ｅｍｏｒｙ　ｔｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙより分与）をアンチセンスヒ）ｗｙ ｂ（配列番号４）とヒ）　ＮＭＭＨＣ（配列番号２）を用いて処理した。

細胞はオリゴヌクレオチド処理後７２時間増殖させ、次いで実施例１に記載した 方法でカウントした。ヒヒ細胞に対して、ＮＭＭＨＣは６５％の増殖抑制を示し 、ｃ−ｓｙｂは５７．９％の増殖抑制を示した。

聾 当業者は、先の詳細な説明からの本発明方法について複数の均等、変更、変動と して理解される。このような均等、変更、変動は以下のクレームによって包含さ れることを意図している。

配列表 （１）一般情報 （ｉｉ）発明の名称二局所的オリゴヌクレオチド療法（ｉｉｉ）配列の数：５ （ｉ　ｖ）連絡先： （Ｃ）　レファレンス／書類番号：旧Ｔ−５５８３ＣＰ２（２）配列番号１に間 する情報 （ｔｉ）分子種：　Ｉ）ＮＡ（合成） （ｉｉｉ）ハイボセティカル：無 （ｘｉ）配列：配列番号Ｉ ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＣＣＧ　ＧＧＣ（２）配列番号２に関する情 報 （ｉｉ）分子種：ＤＮＡ（合成） （ｉｉｉ）ハイボセティカル：無 （ｉｖ）アンチセンス：有 （ｉｘ）特徴： （ｘｉ）配列：配列番号２ ＣＡＴ　ＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣ丁Ｔ　ＧＧＡ（２）配列番号３に関する情報 （ｉｉ）分子種＝ＤＮＡ（合成） （ｉｉｔ）ハイボセティカル：無 （ｉｖ）アンチセンス：有 （ｘｉ）配列：配列番号３ ＡＣＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＣＣＣＡＡＧ（２）配列番号４に関す る情報 （ｉｔ）分子種：ＤＮ＾（合成） （ｉ　ｉ　ｉ）ハイボセティカル：無 （ｉｖ）アンチセンス：有 （ｘｉ）配列：配列番号４ ＧＴＧ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＴＣＧ　ＧＧＣ（２）配列番号５に関する情 報 （ｉｔ）分子種：　ＤＮＡ（合成） （ｉｉｉ）ハイボセティカル：無 （ｉｖ）アンチセンス：有 標準名称冨アンチセンスＰＣＮＡ （ｘｉ）配列：配列番号５ ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＴＧＣＣＴＣＡＡＡＦＩＧ、　ＩＡ ０１ｉｇｏ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　（ｕＭ）（Ａｓ　ＮＭＭＨＣ） ＦＩＧ、ｌＢ ％ＣＥｕＣ０ＬＪＮＴ 特表千７−５０１２０４　（１３） ＦＩＧ、３Ａ ＴＩＭＥ　ＴｏＷＡＳＨＯＵＴ　（ｈｒ）ＦＩＧ、３Ｂ ＣＯＮＴＲＯＬ　１６　ｈｒｓ　４０　ｈｒｓＴＩＭＥ　Ｔｏ　ＷＡＳＨＯｔＪ Ｔ ＦＩ　Ｇ、４ ＦＩＧ、５ ＴＩＭＥ　（ｍｉｎ） ＦＩＧ、６ ０　２４　４８　７２　％　＋２０　１４４ＴＩＭＥ（ｈｏｕｒｓ） ＦＩＧ、７ ＣＯＮＴＲＯＬ　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ／ＡＳＭｙｂ　ＥＶＡＣ／ＡＳＭｙｂＦＩＧ 、８ ０ＣＯＮＴＲＣＬ ＴＲＥＡ工ＭＥＮＴ　ＧＲＯＬＩＰＳ ＦＩＧ、９ 特表千７−５０１２０４　（１５） ■−１−１１−ＰＣＴ／υＳ　９２１０５３０５フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１／６８　 ９４５３−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　シモンズ、ミツシェルアメリカ合衆国　０２１６７　マサチュ ・−セッツ、チェスナツト　ヒル、グローブ　ストリート１１５ ＦＩ （７２）発明者　エデルマン、エレイザーアメリカ合衆国　０２１４６　マサチ ューセッツ、プルツクライン、バックスター　ロード　９１ （７２）発明者　ランガー、ロバート　ニス。

アメリカ合衆国　０２１５９　マサチューセッツ、ニュートン、ロンバード　ス トリート（７２）発明者　デキーサー、ジーンーラックベルギー国　ブリュッセ ル　１０８０．エイブイ、デス　グロイアーズ　ナショナルズ。

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．インビボで、優先的に局所（ｌｏｃｕｓ）で標的核酸配列の翻訳を阻害する 方法であって、約１４−３８核酸塩基からなり、標的配列に相補的で、組織細胞 に充分に浸透する量のオリゴヌクレオチドを哺乳動物の体内の局所の組織に直接 投与して、該標的核酸とハイブリダイズさせ、該標的配列の細胞内翻訳を阻害す る方法。
2. ２．オリゴヌクレオチドが、生理的に受け入れられる溶液中にあり、注射により 投与されるクレーム１の方法。
3. ３．該溶液が、注入ポンプ、ステンツまたはカテーテルを用いて投与される、ク レーム１の方法。
4. ４．組織が、平滑筋組織からなるクレーム１の方法。
5. ５．オリゴヌクレオチドが、ｃ−ｍｙｂ、ＮＭＭＨＣおよびＰＣＮＡからなる群 から選ばれる遺伝子配列に相補的なアンチセンス配列からなるクレーム１の方法 。
6. ６．オリゴヌクレオチドが、細胞内酵素による分解または伸展に抵抗できるよう 処理されるクレーム１の方法。
7. ７．該処理が、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの骨格ホスホジエステル連 鎖が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、スルホン、硫酸塩、ケチル、 ホスホロジチオエート、種々のホスホラミデート、ホスフェートエステル、架橋 ホスホロチオエートおよび架橋ホスホラミデート連鎖からなる群から選ばれる連 鎖で置換することよりなるクレーム６の方法。
8. ８．該処理が、ヌクレオチドの付加に抵抗性の構造を有する３′ヌクレオチドを キャッピングすることよりなるクレーム６の方法。
9. ９．オリゴヌクレオチドを、組織表面積平方センチ当たり、約３０−３０００μ ｇの間の濃度で組織に到達させるクレーム１の方法。
10. １０．標的核酸配列が、ｍ−ＲＮＡからなるクレーム１の方法。
11. １１．ｍ−ＲＮＡが、ｃ−ｍｙｂ蛋白質、非筋肉ミオシン重鎖およびＰＣＮＡか ら選ばれる蛋白質をコードするクレーム１０の方法。
12. １２．インビボで、優先的に局所（ｌｏｃｕｓ）で標的核酸配列の翻訳を阻害す る方法であって、約１４−３８核酸塩基からなり、標的配列に相補的であるオリ ゴヌクレオチドを、哺乳動物の体内の該局所で組織の表面に直接沈積させ、充分 な量を組織細胞に浸透させて該標的核酸と結合させ、その細胞内翻訳を阻害する 方法。
13. １３．オリゴヌクレオチドが、注射、カテーテル、ステンツまたは注入により局 所に到達させるクレーム１２の方法。
14. １４．オリゴヌクレオチドが、担体に組み入れられているクレーム１２の方法。
15. １５．担体が、移植可能なマトリックスからなるクレーム１４の方法。
16. １６．担体が、ヒドロゲルからなるクレーム１４の方法。
17. １７．ヒドロゲルが、３７℃より低い温度で液体である素材からなるクレーム１ ６の方法。
18. １８．ヒドロゲル素材が、ポリオキシエチレンオキサイドーポリプロピレンオキ サイド共重合体からなるクレーム１７の方法。
19. １９．ポリマーが、約１０−約８０重量％のポリエチレンオキサイドと約２０− 約９０重量％のポリエチレンオキサイドからなるクレーム１８の方法。
20. ２０．ポリマーが、約７０重量％のポリエチレンオキサイドと約３０重量％のポ リプロピレンオキサイドからなる、クレーム１９の方法。
21. ２１．標的核酸が、ｃ−ｍｙｂ、ＮＭＭＨＣおよびＰＣＮＡからなる群から選ば れる遺伝子から転写されたｍＲＮＡ配列を含むクレーム１２の方法。
22. ２２．オリゴヌクレオチドが血管外に沈積するクレーム１２の方法。
23. ２３．オリゴヌクレオチドが、血管系の血管外膜の表面の上または下に沈積する クレーム１２の方法。
24. ２４．インビボで、血管系の標的領域において平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖を阻 害する方法であって、ＳＭＣに必要で発現する核酸に相補的なアンチセンスオリ ゴヌクレオチドを、その増殖をイニシエイト若しくはサポートし、ＳＭＣ内で選 択的アンチセンスー核酸結合を誘発して、充分な時間増殖を阻害する充分な量直 接標的領域に投与することよりなる方法。
25. ２５．核酸が、ｃ−ｍｙｂ蛋白質、非筋肉ミオシンおよびＰＣＮＡからなる群か ら選ばれるｍＲＮＡをコードしたタンパク質であるクレーム２４の方法。
26. ２６．アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む担体からなるアンチセンスオリゴ ヌクレオチドを局所に持続的に到達させるための移植体
27. ２７．担体がポリマーであるクレーム２６の移植体。
28. ２８．ポリマーが、３７℃より低い温度で液体であり、体温でゲルであるヒドロ ゲル素材からなるクレーム２７の移植体。
29. ２９．ヒドロゲルが、ポリエチレンオキサイドーポリプロピレンオキサイド共重 合体であるクレーム２８の移植体。
30. ３０．オリゴヌクレオチドが、組織面積平方セソ／チ当たり約３０−約３０００ μｇ沈積するよう表面に放出するための充分な濃度で該ポリマーに存在するクレ ーム２６のデバイス。
31. ３１．非筋肉ミオシンおよびＰＣＮＡからなる群から選ばれるｍＲＮＡをコード した蛋白質からなる、細胞に浸透性かつ細胞内分解に抵抗性であるオリゴヌクレ オチド。
32. ３２．平滑筋細胞の増殖をイニシエイト若しくはスポートするために必要な蛋白 質を発現する細胞内核酸に相補的であるヌクレオチド塩基からなる、細胞に浸透 性かつ細胞内分解に抵抗性であるオリゴヌクレオチド。
33. ３３．蛋白質が、ｃ−ｍｙｂ蛋白質、非筋肉ミオシンまたはＰＣＮＡからなるク レーム３２のオリゴヌクレオチド。
34. ３４．生理的に受け入れられる担体と組織のヌクレオチド配列に相補的であるオ リゴヌクレオチドと組み合わせてなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを持続的 に到達させる移植デバイス。
35. ３５．担体が、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、ポリグリコール 酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、コラーゲン、デキストラン、蛋白 ポリマー、エチレンビニル酢酸、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコール 、プロピレングリコールとエチレンオキサイドの重合体およびそれらの誘導体か らなる群から選ばれるポリマーからなるクレーム３４のデバイス。
36. ３６．標的ヌクレオチド配列が再狭窄を誘発する分子をコードするクレーム３４ のデバイス。
37. ３７．標的ヌクレオチド配列が血栓症を誘発する分子をコードするクレーム３４ のデバイス。
38. ３８．標的ヌクレオチド配列が肺の疾病の発生もたらす分子をコードするクレー ム３４のデバイス。
39. ３９．標的ヌクレオチド配列が循環器疾患の発生もたらす分子をコードするクレ ーム３４のデバイス。
40. ４０．平滑筋組織の標的ヌクレオチド配列の翻訳を阻害する医薬の製造のための 、平滑筋組織の標的ヌクレオチド配列に相補的である約１４から約３８個のヌク レオチド塩基を有するオリゴヌ