【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は血小板凝集抑制剤に関するものであ
る。
近年、我が国における食生活の変化や高齢化現
象に伴い、心筋梗塞や脳血栓症等の血栓性疾患の
急増が大きな社会問題になつている。
また、この血栓性疾患の治療薬が、その薬理作
用上あらゆる面から検討され、開発されている。
本発明者等は、血栓性疾患の治療に有用な薬剤
を開発すべく、鋭意研究を重ねた結果、一般式で
表される化合物がすぐれた血小板凝集抑制作用を
有することを見出し、これに基づいて本発明を完
成するに到つた。
すなわち、本発明は、一般式
The present invention relates to a platelet aggregation inhibitor. In recent years, with changes in dietary habits and aging of the population in Japan, the rapid increase in thrombotic diseases such as myocardial infarction and cerebral thrombosis has become a major social problem. In addition, therapeutic agents for this thrombotic disease have been investigated and developed from all aspects of their pharmacological action. The inventors of the present invention, as a result of extensive research in order to develop a drug useful for the treatment of thrombotic diseases, discovered that the compound represented by the general formula has an excellent platelet aggregation inhibiting effect, and based on this, As a result, we have completed the present invention. That is, the present invention provides the general formula
【化】
〔ただし、一般式中、Ｒは水素原子、または式[ka]
[However, in the general formula, R is a hydrogen atom, or
【式】
（式中、Ａはリノレオイル基またはオレオイル
基、Ｂはトリコサノイル基、リノレオイル基また
はオレオイル基を意味する）
を意味する〕
で表される化合物を有効成分とする血小板凝集抑
制剤である。
一般式で表される化合物のうち、Ｒが式であ
り、式中Ａがリノレオイル基、Ｂがトリコサノ
イル基である、１，３−ジトリコサノイル−２−
リノレオイル−グリセロールは、例えば漢方薬で
ある紫陥湯などに配剤される漢薬の１つ、ウリ科
の植物キカラスウリ（Trichosanthes kirillowii
MAXIMOWICZ var.japonicum
KITAMURA）、オオカラスウリ
（Trichosanthes bracteata VOIGT）または、
Trichosanthes kirillowii MAXIMOWICZの乾
燥種子である〓楼仁から、例えば次のようにして
得ることができる。
〓楼仁を、水、メタノール、エタノール、アセ
トン、酢酸エチル、エーテル、塩化メチレン、ベ
ンゼン、ｎ−ヘキサン、石油エーテルから選ばれ
る単独もしくはそれ以上の混合溶媒を用いて、０
℃から使用する溶媒の沸点以下の温度に加熱して
抽出するか、あるいは０℃から室温で、超音波抽
出して抽出液を得る。この抽出液をそのまま、も
しくは濃縮、あるいは乾燥してシリカゲル、アル
ミナ、ODS−シリカゲル等の吸着剤を使用した
カラムクロマトグラフイーに付し、溶出液を分取
して粗分画を得る。この際、溶出溶媒として、水
またはメタノール、エタノール、アセトン、テト
ラハイドロフラン、酢酸エチル、エーテル、クロ
ロホルム、塩化メチレン、ベンゼン、ｎ−ヘキサ
ン、石油エーテル等の単独もしくはそれ以上の混
合溶媒を使用し得る。
こうして得た粗分画をそのまま、もしくは濃
縮、乾燥して、シリカゲルまたはODS−シリカ
ゲルをカラム充填剤として使用し、水、アセトニ
トリル、テトラハイドロフラン、メタノール、ア
セトン、酢酸エチル、エーテル、クロロホルム、
塩化メチレン、ベンゼン、ｎ−ヘキサン、石油エ
ーテル等の単独もしくはそれ以上の混合溶媒を移
動相として使用した分取液体クロマトグラフイー
に付し、溶出したフラクシヨンを高速液体クロマ
トグラフイーで分析し、１，３−ジトリコサノイ
ル−２−リノレオイル−グリセロールを含むフラ
クシヨンを合併し、溶媒を留去することにより
１，３−ジトリコサノイル−２−リノレオイル−
グリセロースを得る。
この１，３−ジトリコサノイル−２−リノレオ
イル−グリセロールの製造の具体例を示す。
具体例 １
〓楼仁（キカラスウリTrichosanthes
kirillowii MAXIMOWICZ var.japonicum
KITAMURAの種子）２Kgを粉砕し、石油エー
テル（沸点45℃以下）10を加え２時間加熱還流
抽出し、抽出液を冷却した後、過した、抽出
液の溶媒を減圧下に留去し、乾燥エキス501.9ｇ
（収率25.1％）を得た。この石油エーテル抽出エ
キス101ｇをシリカゲル（Kieselgel60、70−230
メツシユ、メルク社製）550ｇを使用したカラム
クロマトグラフイーに付し、ｎ−ヘキサンと酢酸
エチルとの混合溶媒で酢酸エチルの混合比率を順
次増加させて溶出した。ｎ−ヘキサン：酢酸エチ
ル（92：８）の混合溶媒で溶出したフラクシヨン
のうち、薄層クロマトグラフイー［プレート、
Kieselgel60F254（メルク社製）；展開溶媒、ｎ−
ヘキサン：酢酸エチル（９：１）；検出、紫外線
（254nｍ）照射］でRf値0.8に吸収を示すスポツト
が認められるフラクシヨンを合併し、減圧乾燥
し、乾燥エキス35.69ｇを得た。
上記乾燥エキス35.69ｇを分取高速体クロマト
グララフイー［カラム、ウオーターズ社製Prep
PAK−500／C18（径5.7cm、長さ30cm）；移動相、
アセトニトリル：テトラハイドロフラン（４：
１）；流速、150ml／min；検出、示差屈折検出
器；装置、ウオーターズ社製Prep LC／
System500A］に付し、保持時間18分に溶出した
フラクヨンを分取し、減圧下に溶媒を留去し、無
色の油状物質を8.23ｇを得た。この無色油状物質
の理化学的性質は文献［池谷幸信、田口平八郎、
遠藤徹、吉岡一郎、日本生薬学会第27回年会講演
要旨集、29頁（1980年）］記載の１，３−ジトリ
コサノイル−２−リノレオイル−グリセロールの
理化学的性質に一致した。
フイールドデソープシヨンマススペクトル
（FD−MS）：ｍ／z874（M+）
赤外線吸収スペクトルνCHCl 3naxcm-1：
1735、1460、1168、993
プロトン核磁気共鳴スペクトル（δppnin
CDCl3）：
0.89（9H、ｍ）、1.33（38H、brs）、1.60（6H、
ｍ）、1.85−2.45（18H、ｍ）、2.77（2H、ｔ−
like、Ｊ＝5.5Hz）、4.22（4H、ｍ）、5.08−5.63
（9H、ｍ）、5.87−6.55（8H、ｍ）13
C−核磁気共鳴スペクトル（δppnin CDCl3）
13.96(q)×２、14.08(q)、22.35(t)、22.61(t)、
24.87(t)、25.67(t)、27.23(t)、27.61(t)、27.85(t)、
29.08(t)、29.13(t)、29.38(t)、29.65(t)、31.55(t)、
31.89(t)、34.04(t)、34.21(t)、62.13(t)×２、
68.96(d)、127.87(d)、127.96(d)、128.01(d)×２、
128.14(d)、128.82(d)×２、128.93(d)、130.01(d)、
130.25(d)、132.45(d)×２、132.69(d)×２、
172.82(s)、173.22(s)×２
次に一般式で表される化合物のうちＲが水素原
子であるトリコサン酸は例えば以下のようにして
得ることができる。
前述の１，３−ジトリコサノイル−２−リノレ
オイル−グリセロールを水酸化カリウム、水酸化
ナトリウム等のアルカリ試薬を用いて加水分解す
るか、又はブタ膵臓リパーゼ等の酵素を用いて加
水分解することにより得られる遊離酸をODS−
シリカゲルをカラム担体に使用した分取液体クロ
マトグラフイーで精製することによりトリコサン
酸を得る。分取液体クロマトグラフイーの移動相
溶媒としては水、酢酸、ギ酸、リン酸、アセトニ
トリル、テトラハイドロフラン、メタノール、酢
酸エチル等の単独もしくはそれ以上の混合溶媒を
使用し得る。
トリコサン酸の製造の具体例を示す。
具体例 ２
上記具体例１で得た１，３−ジトリコサノイル
−２−リノレオイル−グリセロールを３％エタノ
ール性水酸化カリウム100mlに溶解させ、窒素気
流下で50℃に２時間加熱した。この反応液を水
500mlで希釈し、1N塩酸で酸性とし、エーテル１
で２回抽出した。エーテル抽出液は水洗、無水
硫酸ナトリウムで乾燥した後、溶媒を減圧下に留
去した。得られた残渣を分取高速液体クロマトグ
ラフイー［カラム、ウオーターズ社製semi prep
μ−Bondapak C18（径7.8mm、長さ30cm）；移動
相、アセトニトリル：1.5％酢酸（４：１）；流
速、2.8ml／min；検出、示差屈折検出器；温度、
室温］に付した。保持時間11.0分に溶出される物
質を含むフラクシヨンを合併し、減圧下に溶媒を
留去し、無色油状物質480mgを得た。この無色油
状物質をヘプタンから再結晶し、無色プリズム晶
を得た。この無色プリズム晶の理化学的性質は文
献［A.P.Tulloch and L.Bergter、Lipids、14、
996（1979）．L.Crombie and A.G.Jacklin、J.
Chem.Soc.、1632（1957）．］記載のトリコサン酸
の理化学的性質に一致した。
次に、一般式で表される化合物のうちＲが式
であり、式中Ａがリノレオイル基、Ｂがオレオ
イル基である、１−トリコサノイル−２−リノレ
オイル−３−オレオイル−グリセロールは例えば
以下のようにして得ることができる。
〓楼仁を、水、メタノール、エタノール、アセ
トン、酢酸エチル、エーテル、塩化メチレン、ベ
ンゼン、ｎ−ヘキサン、石油エーテルから選ばれ
る単独もしくはそれ以上の混合溶媒を用いて０℃
から使用する溶媒の沸点以下の温度に加熱して抽
出するか、あるいは０℃から室温で超音波抽出し
て抽出液を得る。この抽出液をそのまま、もしく
は濃縮、あるいは乾燥してシリカゲル、アルミ
ナ、ODS−シリカゲル等の吸着剤を使用したカ
ラムクロマトグラフイーに付し、溶出液を分取し
て粗分画を得る。この際、溶出力媒として、水ま
たはメタノール、エタノール、アセトン、テトラ
ハイドロフラン、酢酸エチル、エーテル、クロロ
ホルム、塩化メチレン、ベンゼン、ｎ−ヘキサ
ン、石油エーテル等の単独もしくはそれ以上の混
合溶媒を使用し得る。
こうして得た粗分画をそのまま、もしくは濃
縮、乾燥して、蛍光剤入りシリカゲル（メルク社
製、Kieselgel PF254等）、またはアルミナ（メル
ク社製、アルミニウムオキシド60PF254等）を薄
層板の担体に、水、アセトニトリル、メタノー
ル、アセトン、テトラハイドロフラン、酢酸エチ
ル、エーテル、クロロホルム、塩化メチレン、ベ
ンゼン、ｎ−ヘキサン、石油エーテルから選ばれ
る単独もしくはそれ以上の混合溶媒を展開溶媒に
使用して分取薄層クロマトグラフイーに付し、展
開後紫外線（254nｍ）照射により識別される１
−トリコサノイル−２−リノレオイル−３−オレ
オイル−グリセロールを含有する部分を剥離し、
エーテル、塩化メチレン、石油エーテル等の低沸
点溶媒の単独もしくは混合溶媒により抽出し、抽
出液より溶媒を留去することにより粗トリグリセ
ロール分画エキスを得る。この粗トリグリセロー
ル分画エキスをODS−シリカゲルをカラム担体
に、水、アセトニトリル、テトラハイドロフラ
ン、メタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロ
ホルム、ｎ−ヘキサンから選ばれる単独もしくは
それ以上の混合溶媒を移動相に使用した分取液体
クロマトグラフイーに付し、溶出したフラクシヨ
ンを高速液体クロマトグラフイーで分析し、１−
トリコサノイル−２−リノレオイル−３−オレオ
イル−グリセロールを含むフラクシヨンを合併
し、溶媒を留去することにより粗１−トリコサノ
イル−２−リノレオイル−３−オレオイル−グリ
セロールの乾燥オイルを得る。この乾燥オイルを
再度、ODS−シリカゲルをカラム担体に、水、
アセトニトリル、テトラハイドロフラン、アセト
ン、ｎ−ヘキサンの単独もしくはそれ以上の混合
溶媒を移動相に使用した分取高速液体クロマトグ
ラフイーに付し、溶出したフラクシヨンを高速液
体クロマトグラフイーで分析し、１−トリコサノ
イル−２−リノレオイル−３−オレオイル−グリ
セロールを含むフラクシヨンを合併し、溶媒を留
去することにより１−トリコサノイル−２−リノ
レオイル−３−オレオイル−グリセロールが得ら
れる。
この１−トリコサノイル−２−リノレオイル−
３−オレオイル−グリセロールの製造の具体例を
示す。
具体例 ３
〓楼仁（Trichosanthes kirillowii
MAXIMOWICZ var.japonicum KITAMURA
の種子）480ｇを粉砕し、エーテル2.5を加え、
６時間加熱還流抽出し、抽出液を冷却した後、
過した。抽出残渣を同様にしてさらに２回エーテ
ルで抽出した。抽出液を合併し、減圧下に溶媒
を留去し、乾燥エキス118.46ｇを得た。このエー
テル抽出乾燥エキス118.46ｇをシリカゲル
（Kieselgel60、70−230メツシユ、メルク社製）
700ｇのカラムクロマトグラフイーに付し、ｎ−
ヘキサンと酢酸エチルの混合溶媒で酢酸エチルの
混合比率を順次増加させて溶出した。このうちｎ
−ヘキサン：酢酸エチル（94：６）0.6で溶出
したフラクシヨンを合併し、減圧下に溶媒を留去
し、乾燥エキス32.51ｇを得た。
上記乾燥エキス25.44ｇを分取薄層クロマトグ
ラフイー［プレート、Kieselgel60PF254（メルク
社製）；展開溶媒、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル
（９：１）］に付し、紫外線（254nｍ）照射下で
吸収を示す部分を剥離し、エーテルを加えて抽出
した。この抽出液より溶媒を留去して得た残渣
17.86ｇを分取高速液体クロマトグラフイー［カ
ラム、ウオーターズ社製semi prep μ−
Bondapak C18（径7.8mm、長さ30cm）；移動相、ア
セトニトリル：テトラハイドロフラン：水（50：
50：７）；流速、3.0ml／min；検出、示差屈折検
出器；温度、室温］に付した。保持時間10.1分に
溶出される物質を含むフラクシヨンを合併し、減
圧下に溶媒を留去して得た残渣6.33ｇを再度分取
高速液体クロマトグラフイー［カラム、ウオータ
ーズ社製semi prep μ−Bondapak C18（径7.8
mm、長さ30cm）；移動相、アセトニトリル：テト
ラハイドロフラン（９：１）；流速、3.0ml／
min；検出、示差屈折検出器；温度、室温］に付
した。保持時間29分に溶出する物質を含むフラク
シヨンを合併し、減圧下に溶媒を留去し、無色油
状物質1.20ｇを得た。この無色油状物質の理化学
的性質は文献［池谷幸信、田口平八郎、遠藤徹、
吉岡一郎、日本生薬学会第27回年会講演要旨集、
29頁（1980年）］記載の１−トリコサノイル−２
−リノレオイル−３−オレオイル−グリセロール
の理化学的性質に一致した。
フイールドデソープシヨンマススペクトル
（FD−MS）：ｍ／z878（M+）
赤外線吸収スペクトルνCHCl 3naxcm-1：
1737、1462、1163、997
プロトン核磁気共鳴スペクトル（δppnin
CDCl3）：
0.88（9H、ｍ）、1.32（54H、brs）、1.83−2.43
（18H、ｍ）、2.77（2H、ｔ−like、Ｊ＝5.5Hz）、
4.22（4H、ｍ）、5.10−5.63（9H、ｍ）、5.85−
6.60（4H、ｍ）13
C−核磁気共鳴スペクトル（δppnin CDCl3）：
13.92(q)、14.06(q)、14.12(q)、22.34(t)、22.61(t)、
22.70(t)、24.87(t)、25.66(t)、27.22(t)、27.61(t)、
27.86(t)、29.00(t)、29.09(t)、29.13(t)、29.20(t)、
29.30(t)、29.36(t)、29.54(t)、29.65(t)、29.75(t)、
31.55(t)、31.89(t)、34.05(t)、34.21(t)、62.15(t)
×２、68.96(d)、127.82(d)、127.92(d)、127.98
(d)、128.12(d)、128.78(d)、128.89(d)、129.72(d)、
130.00(d)、130.24(d)、132.43(d)、132.68(d)、
172.87(s)、173.26(s)×２
次に、本発明の血小板凝集抑制剤が血小板凝集
抑制作用を有することを実験例を挙げて説明す
る。
実験例
洗浄血小板浮遊液の調製
常法に従い、血液に対して1/10量の3.8％ク
エン酸ナトリウムと最終濃度が0.1μｇ／mlとな
るようにプロスタグランジンI2ナトリウム（以
下PGI2−Naと略す）を加え、健常人の前腕部
静脈から採血した新鮮血を150G、10分間遠心
し、多血小板血漿（platelet rich plasma、
PRP）を得た。更に、PGI2−Naを0.1μｇ／ml
となるように加え、室温で900G、10分間遠心
して、血小板の沈渣を得た。これを0.1μｇ／ml
のPGI2−Naを含有するタイロード（Tyrode）
液を用いて再浮遊させ、室温で800G、10分間
遠心した。その沈渣をPGI2−Naを含まないタ
イロード液を用いて、血小板数が５×105個／
μとなるように再浮遊させて、洗浄血小板浮
遊液を得た。
血小板凝集能の測定
上記のようにして得た洗浄血小板浮遊液を用
い、２チヤンネルアグリゴメーター（Sienco
社製）にて、血小板凝集に伴う血漿の透過率変
化を記録した。凝集惹起剤として、10μｇ／ml
コラーゲン（Collagen）溶液（SKF緩衝液に
溶解）または5μMアラキドン酸溶液（50ｍＭ
トリス塩酸緩衝液PH7.4に溶解）を用いた。
洗浄血小板浮遊液225μに具体例１〜３で
得た薬剤のエタノール溶液0.5μを加え、直ち
に凝集惹起剤25μを添加して５分間反応させ
た後、最大凝集率を求めた。尚、コントロール
として、本発明の薬剤を含まないエタノールを
用いた。
そしてコントロールの最大凝集に対する本発
明の薬剤の50％抑制濃度をIC50として求めた。
その結果、具体例２で得たトリコサン酸のコラ
ーゲンによつて惹起される血小板凝集に対する
IC50は30μMであり、アラキドン酸による血小
板凝集に対するIC50は90μMであつた。また、
具体例１で得た１，３−ジトリコサノイル−２
−リノレオイル−グリセロールのコラーゲンに
よつて惹起される血小板凝集に対するIC50は
220nMであり、具体例３で得た１−トリコサ
ノイル−２−リノオイル−３−オレオイル−グ
リセロールのコラーゲンによつて惹起される血
小板凝集に対するIC50は220nMであつた。
これらの結果から、本発明の薬剤にすぐれた血
小板凝集抑制作用があることが認められた。
以上、本発明の血小板凝集抑制剤のうち具体例
２で得た薬剤を挙げて説明したが、一般式で表さ
れる化合物の脂肪酸のエステル結合は、体内で代
謝される場合、胃液等の酸や、膵臓リパーゼ等の
酵素により容易に加水分解されるため［H.B.S.
Conacher、F.D.Gunstone、G.M.Hornby and
F.B.Padley、Lipids、５、434（1970）］、一般式
で表される化合物は、同様の薬理作用を示すこと
は明らかである。
次に本発明の薬剤を有効成分である具体例１〜
３で得た化合物の急性毒性試験をddY系雄性マウ
スを用いて行つたところ、いずれも２ｇ／Kgの経
口および腹腔内投与で死亡例はなかつた。
このように、本発明の薬剤は極めて毒性が低
く、安全性の高いものである。
次に、本発明の薬剤の投与量および製剤化につ
いて説明する。
一般式で表される化合物はそのまま、あるいは
慣用の製剤担体と共に動物および人に投与するこ
とができる。投与形態としては、特に限定がな
く、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カ
プセル剤、顆粒剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の
非経口剤が挙げられる。
経口剤として所期の効果を発揮するためには、
患者の年令、体重、疾患の程度により異なるが、
通常成人で１回20〜200mgを、１日３回までの内
服が適当と思われる。
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の
経口剤は常法に従つて製造される。錠剤は一般式
で表される化合物をゼラチン、でん粉、乳糖、ス
テアリン酸マグネシウム、滑石、アラビアゴム等
の製剤学的賦形剤と混合し賦形することによりつ
くられ、カプセル剤は、上記化合物を不活性の製
剤充填剤、もしくは希釈剤と混合し、硬質ゼラチ
ンカプセル、軟質ゼラチンカプセル等に充填する
ことによりつくられる。シロツプ剤、エリキシル
剤は、一般式で表される化合物をシヨ糖等の甘味
剤、メチルおよびプロピルパラベン類等の防腐
剤、着色剤、調味剤、芳香剤、補助剤と混合して
製造される。
非経口剤として所期の効果を発揮するために
は、患者の年令、体重、疾患の程度により異なる
が、通常成人で１日２〜60mgまでの静注、皮下注
射、筋肉注射が適当と思われる。
この非経口剤は常法に従つて製造され、希釈剤
として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、デキス
トロース水溶液、プロピレングリコール等を用い
ることができる。さらに必要に応じて、殺菌剤、
防腐剤、安定剤を加えてもよい。また、この非経
口剤は安定性の点から、カプセル等に充填後冷凍
し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使
用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することも
できる。
その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等
の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げら
れ、常法に従つて製造される。
一般式で表される化合物を有効成分とする血小
板凝集抑制剤は、文献に未載であり、顕著な薬理
作用および安全性を有することより、血小板凝集
抑制剤として産業上非常に有用な薬剤である。
次に用例を示して本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれによりなんら制限されるもので
はない。
用例 １
具体例１で得た薬剤20ｇを150mlのポリソルベ
ート80に溶解させ、これに60℃に加温した滅菌生
理食塩水4.85を加えてよく振盪し、これを無菌
的にバイアルに具体例１で得た薬剤が2.5mg含有
する様に分配し、密封して注射剤を製造した。
本注射剤は用時振盪し、１日当たり症状に応じ
て0.5〜15ml静脈内投与する。
用例 ２
具体例２で得た薬剤10ｇを無水ケイ酸10ｇと混
合し、これにトウモロコシデンプン75ｇを加え、
さらに混合する。この混合物に10％ハイドロキシ
プロピルセルロース・エタノール溶液を50ml加
え、常法通りねつ和し、押し出し、乾燥し、篩別
することにより20〜50メツシユの粒子の顆粒剤を
得た。
この顆粒剤は、症状に合わせて１回量0.2〜２
ｇ（トリコサン酸として20〜200mgに相当）とし
て１日３回服用する。
用例 ３
具体例３で得た薬剤20ｇを無水ケイ酸20ｇと混
合し、これに微結晶セルロース10ｇ、ステアリン
酸マグネシウム0.5ｇ、乳糖49.5ｇを加え混合し、
この混合物を単発式打錠機にて打錠して径７mm重
量100mgの錠剤を製造した。
本錠剤１錠は、１−トリコサノイル−２−リノ
レオイル−３−オレオイル−グリセロール20mgを
含有する。本錠剤は、１回１〜10錠、１日３回服
用する。
用例 ４
具体例２で得た薬剤20mgを無水ケイ酸200mgと
混合し、これに乳糖80mgを加え混合し、No.０のゼ
ラチンカプセルに充填してカプセル剤を得た。
本カプセル剤は、症状に合わせて１回１〜10カ
プセルを１日３回まで服用する。A platelet aggregation inhibitor containing a compound represented by the following formula as an active ingredient: be. Among the compounds represented by the general formula, R is the formula, A is a linoleoyl group, and B is a tricosanoyl group, 1,3-ditricosanoyl-2-
Linoleoyl-glycerol is derived from Trichosanthes kirillowii, a plant in the Cucurbitaceae family, which is one of the Chinese medicines used in the Chinese herbal medicine Shiwato.
MAXIMOWICZ var.japonicum
KITAMURA), Trichosanthes bracteata VOIGT, or
It can be obtained from the dried seeds of Trichosanthes kirillowii MAXIMOWICZ, for example, in the following manner. 〓Roujin is purified using a single or mixed solvent selected from water, methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, ether, methylene chloride, benzene, n-hexane, and petroleum ether.
Extraction is carried out by heating to a temperature from 0.degree. C. to below the boiling point of the solvent used, or ultrasonic extraction is performed at 0.degree. C. to room temperature to obtain an extract. This extract is subjected to column chromatography using an adsorbent such as silica gel, alumina, ODS-silica gel, etc., either as it is, concentrated, or dried, and the eluate is collected to obtain a crude fraction. At this time, as the elution solvent, water or a mixed solvent of more than one such as methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, ethyl acetate, ether, chloroform, methylene chloride, benzene, n-hexane, petroleum ether, etc. may be used. . The crude fraction thus obtained is used as it is, or concentrated and dried, and then purified using silica gel or ODS-silica gel as a column packing material.
It was subjected to preparative liquid chromatography using a single or mixed solvent of methylene chloride, benzene, n-hexane, petroleum ether, etc. as a mobile phase, and the eluted fraction was analyzed by high performance liquid chromatography. , 3-ditricosanoyl-2-linoleoyl-1,3-ditricosanoyl-2-linoleoyl- by combining the fractions containing glycerol and distilling off the solvent.
Get glycerose. A specific example of the production of this 1,3-ditricosanoyl-2-linoleoyl-glycerol will be shown. Specific example 1 Trichosanthes
kirillowii MAXIMOWICZ var.japonicum
KITAMURA seeds) were crushed, 2 kg of petroleum ether (boiling point below 45°C) was added, and extracted under reflux under heating for 2 hours. After cooling the extract, the solvent of the strained extract was distilled off under reduced pressure and dried. Extract 501.9g
(yield 25.1%). 101g of this petroleum ether extract was added to silica gel (Kieselgel60, 70-230).
The mixture was subjected to column chromatography using 550 g of methane (manufactured by Merck & Co.), and eluted with a mixed solvent of n-hexane and ethyl acetate by increasing the mixing ratio of ethyl acetate. Among the fractions eluted with a mixed solvent of n-hexane: ethyl acetate (92:8), thin layer chromatography [plate,
Kieselgel60F 254 (manufactured by Merck); developing solvent, n-
Hexane:ethyl acetate (9:1); detection, ultraviolet (254 nm) irradiation] The fractions in which a spot showing absorption at an Rf value of 0.8 was observed were combined and dried under reduced pressure to obtain 35.69 g of a dry extract. 35.69 g of the above dried extract was subjected to preparative high performance chromatography [column, Waters Prep].
PAK-500/C 18 (diameter 5.7cm, length 30cm); mobile phase,
Acetonitrile: Tetrahydrofuran (4:
1); Flow rate, 150ml/min; Detection, differential refraction detector; Equipment, Waters Prep LC/
System 500A], the fraction eluted at a retention time of 18 minutes was collected, and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 8.23 g of a colorless oily substance. The physical and chemical properties of this colorless oily substance are described in the literature [Yukinobu Ikeya, Heihachiro Taguchi,
The physicochemical properties of 1,3-ditoricosanoyl-2-linoleoyl-glycerol were consistent with those described in Toru Endo and Ichiro Yoshioka, Abstracts of the 27th Annual Meeting of the Japanese Society of Pharmaceutical Pharmacology, p. 29 (1980). Field desorption mass spectrum (FD-MS): m/z874 (M + ) Infrared absorption spectrum ν CHCl 3nax cm -1 : 1735, 1460, 1168, 993 Proton nuclear magnetic resonance spectrum (δ ppn in
CDCl 3 ): 0.89 (9H, m), 1.33 (38H, brs), 1.60 (6H,
m), 1.85-2.45 (18H, m), 2.77 (2H, t-
like, J=5.5Hz), 4.22 (4H, m), 5.08−5.63
(9H, m), 5.87−6.55 (8H, m) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (δ ppn in CDCl 3 ) 13.96(q)×2, 14.08(q), 22.35(t), 22.61(t),
24.87(t), 25.67(t), 27.23(t), 27.61(t), 27.85(t),
29.08(t), 29.13(t), 29.38(t), 29.65(t), 31.55(t),
31.89(t), 34.04(t), 34.21(t), 62.13(t)×2,
68.96(d), 127.87(d), 127.96(d), 128.01(d)×2,
128.14(d), 128.82(d)×2, 128.93(d), 130.01(d),
130.25(d), 132.45(d)×2, 132.69(d)×2,
172.82(s), 173.22(s)×2 Next, among the compounds represented by the general formula, tricosanoic acid in which R is a hydrogen atom can be obtained, for example, as follows. Obtained by hydrolyzing the aforementioned 1,3-ditricosanoyl-2-linoleoyl-glycerol using an alkaline reagent such as potassium hydroxide or sodium hydroxide, or by hydrolyzing using an enzyme such as porcine pancreatic lipase. Free acid ODS−
Tricosanoic acid is obtained by purification by preparative liquid chromatography using silica gel as a column carrier. As a mobile phase solvent for preparative liquid chromatography, water, acetic acid, formic acid, phosphoric acid, acetonitrile, tetrahydrofuran, methanol, ethyl acetate, and the like can be used alone or in a mixed solvent of more than one solvent. A specific example of the production of tricosanoic acid will be shown. Specific Example 2 1,3-Ditricosanoyl-2-linoleoyl-glycerol obtained in Specific Example 1 above was dissolved in 100 ml of 3% ethanolic potassium hydroxide and heated to 50°C for 2 hours under a nitrogen stream. Add this reaction solution to water.
Dilute with 500ml, acidify with 1N hydrochloric acid, add ether 1
Extracted twice. The ether extract was washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, and then the solvent was distilled off under reduced pressure. The resulting residue was subjected to preparative high-performance liquid chromatography [column, Waters semi-prep].
μ-Bondapak C 18 (diameter 7.8 mm, length 30 cm); Mobile phase, acetonitrile: 1.5% acetic acid (4:1); flow rate, 2.8 ml/min; detection, differential refraction detector; temperature,
room temperature]. Fractions containing the substance eluted at a retention time of 11.0 minutes were combined and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 480 mg of a colorless oil. This colorless oily substance was recrystallized from heptane to obtain colorless prism crystals. The physical and chemical properties of this colorless prismatic crystal are described in the literature [AP Tulloch and L. Bergter, Lipids, 14 ,
996 (1979). L. Crombie and AG Jacklin, J.
Chem.Soc., 1632 (1957). The physical and chemical properties of tricosanoic acid were consistent with those described in ]. Next, 1-tricosanoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol in which R is the formula and A is a linoleoyl group and B is an oleoyl group among the compounds represented by the general formula is, for example, as follows: You can get it like this. 〓Rin is heated to 0°C using a single or mixed solvent selected from water, methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate, ether, methylene chloride, benzene, n-hexane, and petroleum ether.
An extract is obtained by heating to a temperature below the boiling point of the solvent used, or by ultrasonic extraction at 0°C to room temperature. This extract is subjected to column chromatography using an adsorbent such as silica gel, alumina, ODS-silica gel, etc., either as it is, concentrated, or dried, and the eluate is collected to obtain a crude fraction. At this time, water or a single or mixed solvent of methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran, ethyl acetate, ether, chloroform, methylene chloride, benzene, n-hexane, petroleum ether, etc. is used as the solvent. obtain. The crude fraction thus obtained can be used as it is, or concentrated and dried, and then coated with fluorescent agent-containing silica gel (manufactured by Merck & Co., Ltd., Kieselgel PF 254 , etc.) or alumina (manufactured by Merck & Co., Ltd., Aluminum Oxide 60PF 254, etc.) as a thin plate carrier. For separation, a single or mixed solvent selected from water, acetonitrile, methanol, acetone, tetrahydrofuran, ethyl acetate, ether, chloroform, methylene chloride, benzene, n-hexane, and petroleum ether is used as a developing solvent. 1, which is identified by ultraviolet (254 nm) irradiation after development by thin layer chromatography.
- peeling off the part containing tricosanoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol,
A crude triglycerol fraction extract is obtained by extracting with a low boiling point solvent such as ether, methylene chloride, petroleum ether, etc. alone or in combination, and distilling off the solvent from the extract. This crude triglycerol fraction extract was used as a column carrier on ODS-silica gel and a mobile phase as a single or mixed solvent selected from water, acetonitrile, tetrahydrofuran, methanol, acetone, ethyl acetate, chloroform, and n-hexane. The eluted fraction was analyzed using high performance liquid chromatography, and 1-
The fractions containing tricosanoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol are combined and the solvent is distilled off to obtain a dry oil of crude 1-tricosanoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol. This dry oil was added to ODS-silica gel as a column carrier, water,
It was subjected to preparative high performance liquid chromatography using a single or mixed solvent of acetonitrile, tetrahydrofuran, acetone, and n-hexane as the mobile phase, and the eluted fraction was analyzed using high performance liquid chromatography. The fractions containing -tricosanoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol are combined and the solvent is distilled off to obtain 1-tricosanoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol. This 1-tricosanoyl-2-linoleoyl-
A specific example of the production of 3-oleoyl-glycerol will be shown. Specific example 3 Trichosanthes kirillowii
MAXIMOWICZ var.japonicum KITAMURA
(seeds), crush 480g, add 2.5 ether,
After heating under reflux for 6 hours and cooling the extract,
passed. The extraction residue was extracted twice more with ether in the same manner. The extracts were combined and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 118.46 g of dry extract. 118.46 g of this ether-extracted dry extract was added to silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh, manufactured by Merck & Co., Ltd.).
Subjected to 700g column chromatography, n-
Elution was carried out using a mixed solvent of hexane and ethyl acetate while increasing the mixing ratio of ethyl acetate. Of these, n
The fractions eluted with 0.6 - hexane:ethyl acetate (94:6) were combined and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 32.51 g of dry extract. 25.44 g of the above dried extract was subjected to preparative thin layer chromatography [plate, Kieselgel 60PF 254 (manufactured by Merck & Co., Ltd.]; developing solvent, n-hexane:ethyl acetate (9:1)) under ultraviolet (254 nm) irradiation. The part showing absorption was peeled off and extracted with ether. Residue obtained by distilling off the solvent from this extract
17.86 g was subjected to preparative high performance liquid chromatography [column, Waters semi prep μ-
Bondapak C 18 (diameter 7.8 mm, length 30 cm); mobile phase, acetonitrile: tetrahydrofuran: water (50:
50:7); flow rate, 3.0 ml/min; detection, differential refraction detector; temperature, room temperature]. The fractions containing the substance eluted at a retention time of 10.1 minutes were combined and the solvent was distilled off under reduced pressure. The resulting residue (6.33 g) was subjected to preparative high performance liquid chromatography [column, Waters semi prep μ-Bondapak]. C 18 (diameter 7.8
mm, length 30 cm); Mobile phase, acetonitrile:tetrahydrofuran (9:1); flow rate, 3.0 ml/
min; detection, differential refraction detector; temperature, room temperature]. Fractions containing the substance eluted at a retention time of 29 minutes were combined and the solvent was distilled off under reduced pressure to obtain 1.20 g of a colorless oil. The physical and chemical properties of this colorless oily substance are described in the literature [Yukinobu Ikeya, Heihachiro Taguchi, Toru Endo,
Ichiro Yoshioka, Abstracts of the 27th Annual Meeting of the Japanese Society of Herbal Pharmaceutical Sciences,
1-tricosanoyl-2 described in [Page 29 (1980)]
-Linoleoyl-3-oleoyl-glycerol was consistent with the physical and chemical properties. Field desorption mass spectrum (FD-MS): m/z878 (M + ) Infrared absorption spectrum ν CHCl 3nax cm -1 : 1737, 1462, 1163, 997 Proton nuclear magnetic resonance spectrum (δ ppn in
CDCl 3 ): 0.88 (9H, m), 1.32 (54H, brs), 1.83−2.43
(18H, m), 2.77 (2H, t-like, J=5.5Hz),
4.22 (4H, m), 5.10−5.63 (9H, m), 5.85−
6.60 (4H, m) 13 C-nuclear magnetic resonance spectrum (δ ppn in CDCl 3 ): 13.92(q), 14.06(q), 14.12(q), 22.34(t), 22.61(t),
22.70(t), 24.87(t), 25.66(t), 27.22(t), 27.61(t),
27.86(t), 29.00(t), 29.09(t), 29.13(t), 29.20(t),
29.30(t), 29.36(t), 29.54(t), 29.65(t), 29.75(t),
31.55(t), 31.89(t), 34.05(t), 34.21(t), 62.15(t)
×2, 68.96(d), 127.82(d), 127.92(d), 127.98
(d), 128.12(d), 128.78(d), 128.89(d), 129.72(d),
130.00(d), 130.24(d), 132.43(d), 132.68(d),
172.87(s), 173.26(s)×2 Next, the fact that the platelet aggregation inhibitor of the present invention has a platelet aggregation inhibiting effect will be explained with reference to experimental examples. Experimental example Preparation of washed platelet suspension According to the conventional method, prostaglandin I disodium (hereinafter referred to as PGI 2 -Na Fresh blood collected from the forearm vein of a healthy person was centrifuged at 150G for 10 minutes to collect platelet rich plasma.
PRP) was obtained. Furthermore, 0.1 μg/ml of PGI 2 -Na
The platelets were added and centrifuged at 900G for 10 minutes at room temperature to obtain a platelet precipitate. This is 0.1μg/ml
Tyrode containing PGI 2 −Na of
The cells were resuspended using solution and centrifuged at 800G for 10 minutes at room temperature. Using Tyrode's solution that does not contain PGI 2 -Na, the sediment was collected until the platelet count was 5 × 10 5 /
The platelets were resuspended to obtain a washed platelet suspension. Measurement of platelet aggregation ability Using the washed platelet suspension obtained as described above, a 2-channel aggregometer (Sienco
Changes in plasma permeability due to platelet aggregation were recorded using a 100-μm (Company). As an aggregation inducing agent, 10μg/ml
Collagen solution (dissolved in SKF buffer) or 5μM arachidonic acid solution (50mM
(dissolved in Tris-HCl buffer pH 7.4) was used. 0.5μ of the ethanol solution of the drug obtained in Examples 1 to 3 was added to 225μ of the washed platelet suspension, and immediately 25μ of the aggregation-inducing agent was added and allowed to react for 5 minutes, after which the maximum aggregation rate was determined. As a control, ethanol containing no drug of the present invention was used. Then, the 50% inhibitory concentration of the drug of the present invention against the maximum aggregation of the control was determined as IC50 .
As a result, tricosanoic acid obtained in Example 2 was found to be effective against platelet aggregation induced by collagen.
The IC 50 was 30 μM, and the IC 50 for platelet aggregation induced by arachidonic acid was 90 μM. Also,
1,3-Ditricosanoyl-2 obtained in specific example 1
- The IC 50 of linoleoyl-glycerol against collagen-induced platelet aggregation is
The IC 50 of 1-tricosanoyl-2-linoyl-3-oleoyl-glycerol obtained in Example 3 against collagen-induced platelet aggregation was 220 nM. From these results, it was confirmed that the drug of the present invention has an excellent platelet aggregation inhibiting effect. As described above, among the platelet aggregation inhibitors of the present invention, the drug obtained in Specific Example 2 has been mentioned. However, when the compound represented by the general formula is metabolized in the body, the ester bond of the fatty acid is It is easily hydrolyzed by enzymes such as pancreatic lipase [HBS
Conacher, FDGunstone, GM Hornby and
FBPadley, Lipids, 5 , 434 (1970)], it is clear that compounds of the general formula exhibit similar pharmacological effects. Next, specific examples 1 to 1 in which the drug of the present invention is an active ingredient
When an acute toxicity test of the compound obtained in 3 was conducted using ddY male mice, there was no death in either case after oral and intraperitoneal administration at 2 g/Kg. As described above, the drug of the present invention has extremely low toxicity and high safety. Next, the dosage and formulation of the drug of the present invention will be explained. The compound represented by the general formula can be administered to animals and humans as is or together with a conventional pharmaceutical carrier. The dosage form is not particularly limited and may be selected and used as appropriate, and includes oral dosage forms such as tablets, capsules, and granules, and parenteral dosage forms such as injections and suppositories. In order to exert the desired effect as an oral agent,
Although it varies depending on the patient's age, weight, and severity of the disease,
Oral administration of 20 to 200 mg at a time up to three times a day is considered appropriate for adults. In the present invention, oral preparations such as tablets, capsules, and granules are manufactured according to conventional methods. Tablets are made by mixing the compound represented by the general formula with pharmaceutical excipients such as gelatin, starch, lactose, magnesium stearate, talc, gum arabic, etc., and capsules are made by mixing the above compound It is made by mixing it with an inert pharmaceutical filler or diluent and filling it into hard gelatin capsules, soft gelatin capsules, etc. Syrups and elixirs are manufactured by mixing the compound represented by the general formula with sweeteners such as sucrose, preservatives such as methyl and propylparabens, colorants, seasonings, aromatics, and auxiliaries. . In order to achieve the desired effect as a parenteral agent, it is usually appropriate for adults to administer 2 to 60 mg per day by intravenous, subcutaneous, or intramuscular injection, although this will vary depending on the age, weight, and severity of the disease of the patient. Seem. This parenteral preparation is produced according to a conventional method, and distilled water for injection, physiological saline, aqueous dextrose solution, propylene glycol, etc. can generally be used as a diluent. In addition, if necessary, disinfectant,
Preservatives and stabilizers may be added. In addition, from the viewpoint of stability, this parenteral preparation may be filled into capsules, etc., frozen, water removed by ordinary freeze-drying techniques, and a liquid preparation prepared from the freeze-dried product immediately before use. Other parenteral preparations include liquid preparations for external use, liniments such as ointments, and suppositories for intrarectal administration, which are manufactured according to conventional methods. Platelet aggregation inhibitors containing compounds represented by the general formula as active ingredients have not yet been published in the literature, and are industrially very useful as platelet aggregation inhibitors due to their remarkable pharmacological effects and safety. be. Next, the present invention will be specifically explained with reference to examples, but the present invention is not limited thereto in any way. Example 1 Dissolve 20 g of the drug obtained in Specific Example 1 in 150 ml of polysorbate 80, add 4.85 ml of sterile physiological saline heated to 60°C, shake well, and aseptically transfer the solution into a vial according to Specific Example 1. The obtained drug was distributed to contain 2.5 mg and sealed to produce an injection. Shake this injection before use and administer 0.5 to 15 ml intravenously per day depending on the symptoms. Example 2 Mix 10 g of the drug obtained in Example 2 with 10 g of silicic anhydride, add 75 g of corn starch,
Mix further. To this mixture, 50 ml of 10% hydroxypropyl cellulose in ethanol solution was added, and the mixture was wetted in a conventional manner, extruded, dried, and sieved to obtain granules of 20 to 50 mesh particles. This granule is available in a dosage of 0.2 to 2 depending on the symptoms.
g (equivalent to 20 to 200 mg of tricosanoic acid) three times a day. Example 3 20g of the drug obtained in Example 3 was mixed with 20g of silicic anhydride, 10g of microcrystalline cellulose, 0.5g of magnesium stearate, and 49.5g of lactose were added and mixed.
This mixture was compressed using a single-shot tablet machine to produce tablets with a diameter of 7 mm and a weight of 100 mg. One tablet of the present invention contains 20 mg of 1-tricosanoyl-2-linoleoyl-3-oleoyl-glycerol. This tablet is taken 1 to 10 tablets at a time, three times a day. Example 4 20 mg of the drug obtained in Example 2 was mixed with 200 mg of silicic anhydride, 80 mg of lactose was added and mixed, and the mixture was filled into No. 0 gelatin capsules to obtain capsules. This capsule formulation is taken at a time of 1 to 10 capsules up to 3 times a day, depending on the symptoms.