JPH03206961A - 液体中のリガンドの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は検体に対するイムノアッセイに関する。

さらに詳細には．本発明は．膜イムノアッセイ及び膜イ
ムノアッセイにおいて有用な薬剤に関する。

液体サンプル中に低濃度で存在する物質（一般に検体と
呼ばれる）の濃度を求めるために．迅速且つ感度の良い
アッセイシステムが開発されている，イムノアッセイは
，抗原又はハプテンを特定の抗体に結合させることによ
って行われ，高いレベルの特異性と感度を与えるので特
に有用である．これらのアッセイにおいては，上記薬剤
の１つが標識した形態で使用され，！！識した薬剤はト
レーサーと呼ばれている． 酵素は，イムノアフセイにおいてはラベルとしてしばし
ば使用されている．従来のエンザイムイムノアッセイ（
Ｅｌ＾）では．酵素は，特異的に結合した抗原一抗体対
の一方の戒分と電子対を共有した形で複合しており，こ
うした得られた酵素複合体が基質と反応してシグナルを
生威し．このシグナルが検出・定量される．このシグナ
ルは色の変化であることもあり（肉眼又は分光測光広に
より検出される），またａｔのある生戊物への転化であ
ることもある（蛍光により検出される）。

ＥＩＡに対する適切なフォーマットは，アッセイ用薬剤
の１つが固相担体に固定化される固相イムノアッセイで
ある．固相担体は，計量捧，試験管もしくはキュベット
の内壁，又はマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔ
ｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）のくぼみ等．いずれの形態でも
よい．特に有用な固相担体は微孔性膜である． 膜イムノアッセイは　フロースルー・アッセイ（ｆｌｏ
ｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｓｓａｙ）と呼ばれることが多
い。毛細管作用によって流れが生戒されるフロースルー
ＥＩＡＯ例が．バフグショー（Ｂａｇｓｈａ＋ｓ）によ
る米国特許第３．８８８，６２９号明細書，コール（ｃ
ｏｌｅ）らによる米国特許第４．２４６，３３９号明細
書，及びバルカーズ（Ｖａｌｋｉｒｓ）　らによる米国
特許第４，６３２，９０１号明細書等に記載されている
。グレー（Ｇｒａｙ）による米国特許第４，２７７，５
６０号明細書とマクローリン（ＭｃＬａｕｒｉｎ）らに
よる米国特許第４，８１２，２９３号明細書は，それぞ
れ圧力と減圧を利用したフロースルー・アッセイの例で
ある。

１９［！ＩＡにおいては，いくつかの液体に膜を通過さ
せて，アッセイ或分の結合，分離．及び洗浄が行われる
。殆どの膜ＥＩＡ手順における最終工程は，色原体のよ
うな発色剤を膜に通すことである．色原体が膜上に捕捉
された酵素と反応して．色の変化を生し５この色の変化
が検体の存在している証拠として検出されるかあるいは
検体の濃度として測定される。

現在までに開示されている殆どの比色定量による膜ＥＴ
Ａ手順において見受けられる問題点は，検体によって発
現される色とバックグラウンドの色との間のコントラス
トが一時的なものであるということである。色が薄れた
り過度に発色したりあるいはバックグラウンドの色が検
体による色に近づいたりする前に，アッセイを直ちに読
み取ることがしばしば必要とされる．特に多数のアッセ
イが行われる場合，あるいは後でアフセイを読み取るこ
とが必要とされる場合．膜ＥＩＡ技術においてはコント
ラストを安定化する方法の開発が強く求められている。

本発明は，こうした問題を解決するための薬剤と方法を
提供する． 液体中に存在していると思われるリガンドを定量するた
めのフロースルー・アッセイ法は，酵素を含んだトレー
サーと該液体を．不活性蛋白質を塗被した膜に通し，こ
れによってリガンドが膜に結びつき　そしてトレーサー
に結合することを含んでなる．本方法の他の実施態様に
おいては，膜にはさらに，該リガンドに特異的に結合す
るアンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）が塗被され
ている．本発明においては．不活性蛋白質とは，アッセ
イの他のいかなる威分に対しても免疫学的に非反応性で
あって且つアッセイ媒体中の他の蛋白質に実質的に非特
異的に結合しない蛋白質を表わし，従って不活性蛋白質
は．本発明のアッセイの一部でない他の＠ｆｆ質に対し
ては免疫学的に反応性を有していてもよい．結合させた
後，液体を膜から分離し，膜上の酵素をインドキシル誘
導体を含んだ基質と接触させ，このインドキシル誘導体
が不溶性の有色生成物に転化され，この有色生戒物が膜
上に視認可能なスポットとして沈澱する。スポットの色
とバックグラウンドの色とのコントラストは，酸を含ん
だカラー・ストンピング（ｃｏｌｏｒ　ｓｔｏｐｐｉｎ
ｇ）を膜に通して溶液を安定化させることによって後で
も読取りができるよう安定化される。

好ましいリガンドは．トレーサーの酵素或分が特定の抗
体に複合されるというアッセイフォーマントによって検
出されるウィルス抗原である．好ましい酵素は，β−ガ
ラクトシダーゼやアルカリ性ホスファターゼ等のヒドロ
ラーゼであり，好ましい基質はとしてはさらにテトラゾ
リウム塩が含まれる． 安定剤は，種々の無機酸又は好ましくは有機酸のいずれ
でもよく，最も好ましいのはクエン酸であり，アルコー
ルのような有機溶媒を含んでもよい． 本発明には，本発明のアッセイを行うのに有用な材料の
キットも含まれる。

従って本発明は，リガンドにより膜上に生戒するスポノ
トの色とハンググラウンドの色が後で読取りできるよう
安定化されるフロースルーＥＩＡを提供する．いちいち
読取りを行うことなく多数のアッセイを実施することが
でき，ある患者からのサンプルに関して異なる時点で実
施された一連のアッセイを同時に比較して，薬物投与よ
る治療の経過を追跡することができる。

本発明は多くの異なる形の実施態様によって適切に実施
しうるけれども，ここでは本発明の好ましい実施態様に
ついて詳細に説明する。従って，以下に記載の開示内容
は本発明の原理の代表的なものと考えるべきであり．本
発明は以下に説明する実施態様に限定されるものではな
い．本発明の範囲は，特許請求の範囲及びそれらの等価
物によって規定される． 本発明の１つのＢ様は．液体中のリガンドに対して比色
定量法によるフロースルー・イムノアシセイを行うため
の方法であり，この場合，アッセイシグナルは膜上に付
着した有色沈澱物である．有色沈澱物の色とバックグラ
ウンドの色との間のコントラストは，最高２４時間又は
それ以上実質的に不変のまま保持されるよう特定の安定
剤で処理することによって安定化させることができ，こ
れによってアッセイ結果を後で読み取ることが可能とな
る，ということを発明者らは見出した．これとは対照的
に，従来技術によるフロースルー・アッセイは．コント
ラストが安定していないために直ちに読取りを行わなけ
ればならない．本発明のアッセイは．当業界にて知られ
ている，フロースルー・アッセイを実施すべくなされた
いかなる適切なアッセイ装置でも行うことができる．好
ましい装置においては，アッセイ用液体の流れが，膜の
下に配置された吸収材料のパンドにより引き起こされる
毛管作用によって促進される．好ましい装置の代表的な
ものは．前記の米国特許第４，６３２，９０１号明細書
に記載のＩＣＯＮ”装置である。

リガンドはいかなる存在源からのものでもよく．また抗
原．抗体，又はハブテン等いずれであってもよい。例え
ば，リガンドは体液中に存在する抗原でもよく．あるい
はリガンドを体液から単離して別の液体（例えば緩衝溶
液）中に導入してもよい。他の場合においては．リガン
ドは体液以外の存在源（例えば，クラミジアような微生
物又はその細胞抽出物の培地）からのものであってもよ
い。

好ましいリガンドは抗原であって，最も好ましくは体液
中に存在するウィルス抗原であり，例えばアデノウィル
ス．バラインフルエンザ３ウィルス（Ｐａｒａｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａ　３　ｖｉｒｕｓ）　，単純ヘルペスウィル
ス、（ＨｓＶ）　，　ＲＳウィルス（ＲＳＶ）　，　　
及びインフルエンザＡ　（Ｆｌｕ　Ａ）等がある。本発
明はこれより以後．ウィルス抗原に関して包括的に説明
する．さて，アッセイ或分に関する詳細な説明に戻る．
多孔性膜は．他のいかなる成分に対してもその妨害とな
らないような，あるいはアッセイ工程を妨げないような
材料であればいかなる材料でもよい。

適切な膜材料としては例えば，ガラス繊維．ニフフ化ポ
リビニリデン．ポリカーボネート，ニトロセルロース，
及びナイロン等がある。このような膜は当業界ではよく
知られており，ポール（Ｐａ　ｌ　ｌ）　，グレンコー
ブ（Ｇｌｅｎ　Ｃａｖｅ）　，　ニューヨーク州；　ミ
リボアー（ＭＨＩｉｐｏｒｅ）．べ／ドフオード（Ｂｅ
ｄｆｏｒｄ）　，マサチューセソツ州；及びシュライヒ
ヤー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎ
ｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ），キーネ（Ｋｅｅｎｅ）ニューハ
ンプシャー州；等のメーカーから市販されている． リガンドに対して特異的なアンチリガンドを膜に塗被す
ることができる。リガンドが好ましいウィルス抗原であ
る場合，アンチリガンドは．抗原に対して特異的に結合
して抗原を膜上に捕捉する抗体であってもよい。膜にさ
らに不活性蛋白賞を塗被して，捕捉抗体によって占めら
れていない膜上の結合座を満たすことができる。適切な
不活性蛋白質の代表的な例としてはカゼインとアルブミ
ンがあるが，当技術者にとっては他の不活性蛋白質も公
知である。不活性蛋白質と抗体の塗被は，適切な方法に
よって．好ましくは膜を蛋白質の溶液でインキユベート
することによって（これによって蛋白質が膜表面のボリ
マーマトリックス中に物理的に吸収される）行うことが
できる．本発明の好ましい実施態様においては．不活性
蛋白質が膜に塗被され，抗原がこの表面に直接吸収され
．そして捕捉用抗体を使用せずにアッセイが行われる．
捕捉用抗体の存在しないフロースルー・イムノアッセイ
は．　１９８８年１１月１７日付け提出の同時係属中の
特許出願第２７２，　３８０号明細書に開示されている
。

浦捉用抗体及び／又は不活性蛋白質を塗被した膜が，ウ
ィルス抗原を含有していると思われるサンプルにさらさ
れる。好ましくは，塗被された膜が．一時的なフロース
ルーフォーマットにて約１〜１５分（好ましくは約５分
）．約Ｏ〜５０℃にて（好ましくは約周囲温度にて）サ
ンプルと共にインキユベートされる．この手順により，
サンプル中の抗原が，その濃度に比例した量にて塗被膜
上に捕捉される．さらに，サンプルが大過剰の無関係蛋
白質を含有している場合でも（例えばサンプルが体液で
ある場合），ウィルス抗原が優先的に吸収されることが
見出された， トレーサーは，抗原又は検出用抗体に複合した酵素を含
む。抗原又は抗体に複合させることのできるいかなる酵
素も使用することができ，そしてその酵素に対して，有
色生成物に転化しつる基質が存在する．適切な酵素とし
ては例えば，ペブチダーゼ，エステラーゼ．ホスファタ
ーゼ，及びグリコシダーゼ等のヒドロラーゼがある。最
も好ましいトレーサーとしては，アルカリ性ホスファタ
ーゼやカルボキシェステラーゼがある。抗原又は抗体に
対する酵素の複合はよく知られており．当技術者には充
分に理解されていることである。

基質の選択は，トレーサーの酵素或分によって決まり．
各クラスの酵素に対して多種多樺な基質が知られている
。好ましい基質は，膜上に不溶性の沈澱物を形威するよ
うな基質である。ヒドロラーゼに対する適切な基質はイ
ンドキシル誘導体である。例えば，酵素がβ−ガラクト
シダーゼであるとき，好ましい基質はインドキシルーβ
−Ｄガラクトピラノシドである。酵素がアルカリ性ホス
ファターゼであるとき．好ましい基質はインドキシルホ
スフェートである。酵素がエステラーゼであるとき，好
ましい基質はインドキシルアセテ一トとインドキシルブ
チレートである．当業界にて知られている他のインドキ
シル基質も使用スることができ，例えば５−プロモー４
−クロローインドキシル誘導体がある。適切なインドキ
シル誘導体を標準法によって作製するのに有用なインド
キシル化合物の一覧表が，ボルト（Ｈｏｌｔ）らによる
「ロン　ン　ＩＡ”　　　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　ｓ　ｏ
ｆ　ｔｈｅＲｏ　ａｌ　Ｓｏｃｉｅｔ　　ｏｆ　Ｌｏｎ
ｄｏｎ）＋　Ｂ＋　１９５８＋　ＪｊＪｉ＋　４８１４
９４」に記載されている。基質は．水，塩水，又は適切
な緩衝液中に溶解させるのが好ましい。

インドキシル基質の開裂により生しる色は，基質組戒物
中にテトラゾリウム塩を組み込むことによって強めるの
が好ましい。適切なテトラゾリウム塩としては例えば．
ｐ−ヨードニト口テトラゾリウム・バイオレット（ｐ−
ｉｏｄｏｎｉｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｖｉｏｌｅ
ｔ；　ＩＮＴ）及びニトロブルー・テトラゾリウム（ｎ
ｉｔｒｏｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ；　ＮＢＴ
）等がある。テトラゾリウム塩が存在しなくても視認で
きるだけの充分な強度の有色スボノトが発現するけれど
も　この薬剤を組み込むと，より簡単に視認できる深い
色のスポントが得られ，従ってアッセイの感度が増大す
る。

本発明のアッセイは，競争法（ｃｏｍｐｅｔｉ　ｔｉｖ
ｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）又はサンドインチ法（ｓａｎｄ
ｗｉｔｃｈ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により行うことがで
きる。本発明の競争アッセイにおいては．トレーサーは
複合した酵素を有する抗原であって，このとき抗原とト
ンーサーが塗被された膜上で結合座を競争して得ようと
する。本発明の好ましいアッセイ法においては．捕捉さ
れたウィルス抗原を有する塗被膜が，サンドイッチフォ
ーマントにてトレーサーの溶液と共にインキユベートさ
れて，抗原と検出用抗体の免疫学的結合を起こす。これ
とは別に，塗被膜を抗原及びトレーサーと共に同時にイ
ンキニベートしてもよい。次いで，液体に膜を通過させ
ることによって．膜をアッセイ媒体の液相から分離する
ことができる。膜を通過する液体の流れは，重力による
ものでもよいし，あるいは好ましくは，膜の下に配置さ
れた吸収材料により引き起こされる毛管作用によって強
めることもできる．次いで，基質組或物を膜に通す．膜
上の酵素により．基質が色によって検出可能な生成吻に
転化される。色形成の程度は抗原の濃度に比例するが，
抗原の濃度は７所定量の抗原を有する液体サンプルを検
定し，そして色の強度を比較することにより求めること
ができる． 従来技術の比色定量によるフロースルー・アノセイにお
いては，酵素と未反応の基質が存在する限り，膜上にて
色が発現し続ける。本発明によれば．色形或反応は停止
させることができ，安定剤の溶液を膜に通すことによっ
て膜上の色を実質的に安定化させることができる．さら
に，時間の経過に従ってバックグラウンドの色が徐々に
強くなること（比色定量による膜アッセイにおいてしば
しば見受けられ，シグナルを速やかに読み取らなければ
．ポジティブシグナルをバックグラウンドシグナルと区
別するのが困難となる）も少なくなり実質的に安定化さ
れる． 本発明に従った適切な安定剤は．塩酸．硫酸リン酸．及
びピロリン酸等の無機酸である．好ましい安定剤は．有
機酸の水溶液を含んだ溶液（必要に応して有機溶媒を含
有する）である．適切な有機酸としては例えば，酢酸，
Ｗｓ石酸，シュウ酸コハク酸，安息香酸．及びクエン酸
等があり，好ましいのはクエン酸である。適切な有機溶
媒としては，メタノール　エタノール．イソブロパノー
ル．アセトン．及びテトラヒド口フラン等がある．有機
酸の濃度は．水中又は緩衝岐（必要に応して約３０〜７
０重量％の．好ましくは約４５〜５５重量％の有機溶媒
を含んでもよい）中．約０．１〜０，５モル濃度．好ま
しくは約０．１−０．２モル濃度である．本溶液は．好
ましくは約０〜４のｐｕ，最も好ましくは約２〜３．５
のｐＨを有し，従って所望のｐＨを得るために充分な量
の塩基（例えば水酸化ナトリウム）を含有してもよい。

本発明の他のＢｐＪは，本発明の方法に従ってリガンド
に対するアソセイを行うための薬剤キットすなわち材料
パノケージである，本キントは，不活性蛋白質及び必要
に応して捕捉用アンチリガンドを塗被した膜；該リガン
ド又は検出用アンチリガンドの一方に複合した酵素を含
むトレーサー；該酵素に対する基賞；並びに酸の溶液（
好ましくは水溶液）を含んだ安定剤；を含んでなる．酸
の溶液には溶媒を加えてもよい．本キットはさらに，該
リガンドに対する標準物（例えば．既知濃度の１つの以
上のリガンドサンプルとして）を含んでもよいし，また
アッセイを実施するのに有用な他の薬剤．酵素基質，も
しくは塩水や緩衝液のような溶液を含んでもよい。膜は
好ましくはプラスチック製のハウジング内に収容し．膜
の下に吸取紙のような材料を配置させて，毛管作用によ
って膜を通過するアッセイ液体の流れを起こし易くする
．以下に実施例を挙げつつ本発明をさらに詳細に説明す
るが，本発明はこれらの実施例によって限定されるもの
ではない。

以下の配置構或に従って膜フィルター積重ね物（ｍｅｍ
ｂｒａｎｅ　ｆｉｌｔｅｒ　ｓｔａｃｋ）を作製した。

上層−３ミクロンのイムノダイン・イムノアフィニティ
ー・メンプレン（ＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅＩｍｍｕｎｏａ
ｆｆｉｎｉｔｙ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ）　（ポールグレン
コーブ．ニューヨーク州： １１ＢＩＡＯＯ３０Ｈｃ５）．　　０．３％のカゼイン
を含有したホスフェート緩衝による塩水中 に．周囲温度にて３０分浸漬することにより予備塗被。

中層一不織レーヨンのシート（シュライヒヤー・アンド
・シュエル．キーネ，ニュ ーハンプシャー州；　１１５−Ｓ）。

下層一セルロース吸収剤パッド（２）　（フイルトレー
シゴン・サイエンス（ＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＳｃｉｅｎ
ｃｅ＋マウント・承りー・スプリングス（Ｍｏｕｎｔ　
Ｈｏｌｌｙ　Ｓｐｒｉｎｇｓ），ペンシルバニア州．　
＃ＥＤ３２０−２００）　．上層の上に形戒された受け
用くぼみ（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇｗｅｌｌ）を含むプラス
チック製ホルダー中に膜層を入れた．この受け用くぼみ
内に，受け用くぼみより狭い開口を有し，且つ上層に対
してフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）を設けた流れ制限用イン
サートを取りつけた． ２５０ｎ＋Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン塩酸塩（トリスＨＣＩ），　１５０ｍＭの塩化ナトリ
ウム（ＮａＣ１），　１（ｌａＭのエチレンジアミンテ
トラアセテート（ＨＤＴＡ），　　４％（Ｖ／Ｖ）のポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン
２０），１％のＮ−アセチルシステイン，及び０．２％
のアジ化ナトリウム（ＮａＮｘ）を含有した緩衝液（ｐ
Ｈ　８．５）中に，ＲＳウィルス（ＲＳＶ）感染のＨＥ
ｐ−２細胞を希釈して．抗原ストックを作製した．ｉ染
していないＨＥρ−２細胞を使用して．類似の方法で対
照標準の抗原を作製した。

１５０ａｌアリコートの抗原（又は対照標！１！）を装
置にかけ，流れ制限用インサートを通して上膜層に排出
させた（吸収剤担持屡の毛管作用によって液体が上膜層
を通して抜き取られる）．次いで，流れ制限用インサー
トを取り外し，　５０＋ｗＭのトリスＨＣＩ，　１５０
ｍＭのＮａＣ１，及び０．２％のＮａＮ．を含み（ｐＨ
７．２）（｝リス緩衝塩水（ＴＢＳ）），さらに１　ｍ
ｇ／ｍｌのラビットＩｇＧを含んだ１５０μｌの洗浄溶
液を加えアルカリ性ホスファターゼと複合した形のアン
チーＲＳＶ抗体を２７μｇ／ｍｌ含有した溶液を，　５
０ｍＭのトリスＨＣＩ，　１００ｍＭのＮａＣｌ，　２
００ｍＭのリン酸ナトリウム．１％のカゼイン，１ｍＭ
の塩化マグネシウム，０．１ｍＭの塩化亜鉛，及び１ｍ
Ｍの２一メルカプトエタノールを含有した緩衝液（ｐＨ
　７．５）中に希釈して作製した。本准合物のｌ５０μ
１アリコートを装置に加え．１１！スタックに吸収させ
た。短時間（２分）インキュベートを行った後，３００
μｌのＴＢＳ（ＩｇＧを含まない）を使用して装置を洗
浄した。

０．３３ｍｇ／ｍｌ　のニトロブルーテトラゾリウム．
１％のメタノール，及び０．２％のＮａＮ１を含有した
１５０μｌの溶液を装置に加えた。次いで，２　ｍｇ／
ｍｌのインドキシルホスフェート，　１２ｎ＋Ｍのレバ
ミソールを５０ｍＭの２−アミノー２−メチル−１−プ
ロバノール（ＡＭＰ）アセテートに混合して得た溶液，
０．２％のＮａＮ３＋及び１９ｍＭの塩化マグネシウム
を含有した溶液（ｐＨ　９．８）の１５０μｌを加えた
．周囲温度にて５分インキユベートした後．　１００ｍ
Ｍのクエン酸ナトリウムと０．４％の安患香酸を混合し
て得た溶液（ｐＨ　３．３）の１５０μ１を加えること
によって色形戒反応を停止させ，種々の容積のエタノー
ル（０，２０．　４０，　６０，及び８０％；　５％の
２−プロバノールと５％のメタノールを変性剤として含
有）と混合した．通常の蛍光を使用して装置を照射し．
７２時間後に読取りを行った。以下にその観察結果を記
載する． ０，　２０，及び４０％のエタノール性停止溶液で処理
した装置は，バノクグラウンド暗色化をきたした（内側
シグナル部分を取り巻いた部分）．６０％のエタノール
性停止溶液で処理した装置は，明るいバックグラウンド
を与えたが５膜の端部（膜とプラスチック上部との接触
箇所）においてやや青／緑色を示した。

８０％のエタノール性溶液で処理した装置は．明るいバ
ックグラウンドを与えたが，端部における青／緑色が゛
６０％”装置の場合より鮮明であった。

エタノールの濃度（４０，　４５，　５０，　５５．　
６０！）だけでなくクエン酸塩の濃度も変えて（１００
，ｓＭ）別の実験を行った。

２００， ３００ ３００ ＫＬＭＮＯ この場合も，通常の蛍光を使用して約７２時間装置を照
射した。以下にその観察結果を記載する．１０ｈＭのク
エン酸塩／エタノールで処理した装置（Ａ−Ｅ）は．　
２００ｍＭ及び３００ｌＩＩＭのクエン酸塩で処理した
装置（Ｆ−０）よりはっきりした緑色のバックグラウン
ドを与えた．これは．５５％及び６０％エタノールで処
理した装置（Ｄ−Ｅ）に対して特によく当てはまる． １００ｍＭクエン酸塩／４０％エタノールのサンプル（
Ａ）は．他の装置よりはるかに暗色のバックグラウンド
を与えた． ０．４重量％の安息香酸を含有した３００ｍＭのクエン
酸ナトリウム溶液（ｐＨ　３．１）を等量のエタノール
と混合することによって作製した溶液を使用すると最良
の結果が得られ．このときアッセイシグナルを表わして
いるパープルーグレー（ρｕｒｐｌｅ−ｇｒａｙ）のス
ポットの周囲を淡黄色のハノクグラウンドが取り巻いた
状態であった。

本実施例では．膜が３ミクロンのパイオダインＣメンブ
レン（Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）　（ボ
ール，カタログ番号ＢＮＰＣＨ５）であること以外は．
実施例１に記載のフィルタースタンクとプラスチンク製
ホルダーを使用した． ２５０ｍＭのトリスＨＣＩ，　１０ｍＭのＥＤＴＡ，　
　１　ｍＭのエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）
テトラアセテート（ＥＧＴＡ），　４ｚ（ｖ／ｖ）　の
ツイーン２０．　ＬＸのＮーアセチルーＬ−システイン
，及び０．２ｚのアジ化ナトリウム（ＮａＮｚ）を含有
した緩衝液（ρ１１　８．５）中に希釈した，Ａ型のイ
ンフルエンザウィルス（Ｆｌｕ−Ａ）（ＭＳＮストレイ
ン）に感染させたマディンーダービ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａ
ｒｂｙ）犬の腎ｉｉ　（Ｍ［ｌＣＫ）の細胞を使用して
，抗原ストンク（ａｎｔｉｇｅｎ　ｓｔｏｃｋ）を作製
した．感染していないＭＤＣＫ細胞を使用して．類似の
方法で対照標準の抗原を作製した． この抗原（又は対照標準）の１５０μｌアリコートを装
置に加え，流れ制限用インサートを通して上層膜に排出
させた。次いで流れ制限用インサートを取り外し，さら
にｌ　ｍｇ／ｍｌのラビント１ｇＧを含有したＴＢＳの
１５０μｌを装置に加えた．アルカリ性ホスファターゼ
と複合した形のアンチーＦｌｕ−Ａ抗体を２７　ｇ　ｇ
／ｍｌ含有した溶液を，１００ｍＭのトリスＨＣＩ，　
１５０−のＮａＣｌ，　２００ｍＭのリン酸ナトリウム
，１％のカゼイン，１ｍＭの塩化マグネシウム，　０．
１ｍＭの塩化亜鉛，１ｍＭの２−メルカプトエタノール
，及び０．２％のＮａＮｉを含有した緩衝液（ｐＨ　７
．２）中に希釈して作製した。本混合物の１５０〃１ア
リコートを装置に加え，膜スタックに吸収させた。短時
間（２分）インキュベートを行った後，３００μｌのＴ
ＢＳ（ＩｇＧを含まない）を使用して装置を洗浄した。

０．３３ｍｇ／ｍｌ　のニトロプルーテトラゾリウム．
１％のメタノール．及び０．２％のＮａＮ３を含有した
１５０μ１の溶液を装置に加えた，次いで，　　２　ｍ
ｇ／ｍｌ　のインドキシルホスフェート，　１６ｍＭの
レバミソールを５Ｏｎ＋ＨのＡＭＰアセテートに混合し
て得た溶液，０．２％のＮ　ａ　Ｎ　３　１　及び１ｍ
Ｍの塩化マグネシウムを含有した溶液（ｐｉｔ　９．８
）の１５０μｌを加えた。周囲温度にて５分インキユベ
ートした後．　１５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有
した安定化溶液（ρＨ　３．０）を１５０μ１加えるこ
とによって色形戒反応を停止させた．反射率デンシトメ
ーター〔グレタング（Ｇｒｅｔａｇ）シアトル．ワシン
トン州．モデル１８３〕を使用して　得られたシグナル
スポットの相対的な色濃度を測定した。一連の抗原希釈
液を使用して行った実験の結果が図簡に示してある。

本実施例においては，実施例２に記載の膜フィルタース
タノクとブラスチノク製ホルダーを使用した。

２５０ｍ門のトリスＨＣＩ，　１５０ｍ門の塩化ナトリ
ウム（ＮａＣ１），　１０ｍＭのＥＤＴＡ，　４Ｘ（ｖ
／ｖ）　　のツイーン２０，　１％のＮ−アセチルーし
一ノステイン，及び０．２χのアジ化ナトリウム（Ｎａ
Ｎ，ｌ）を含有した緩衝液（ｐＨ　８．５）中に希釈し
た，単純ヘルペスウィルス、（■型）に感染させたヴ工
口細胞（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌｓ）を使用して抗原ストッ
クを作製した。感染していないヴエロ細胞を使用して．
類似の方法で対照標準の抗原を作製した。

１２０ｎｇの細胞を含有した抗原（又は対照標準）の１
５０　ｕｌアリコートを装置に加え，流れ制限用インサ
ートを通して上層膜に排出させた。次いで１５％の過酸
化水素を５０ｍＭのＴＢＳに准合して得た液の３００μ
ｌを加えた。次いで，流れ制限用インサートを取り外し
，さらにｌ　ｍｇ／ｍ＋　のラビットＩｇＧを含有した
ＴＢＳ洗浄液の１５０μｌを装置に加えた．アルカリ性
ホスファターゼと複合した形のアンチーＨＳＶ抗体を４
０　ｕ　ｇ／ｍ＋含有した溶液を，　５０ｍＭのトリス
｝ＩｃＩ，　１００ｍＭのＮａＣＬ　２００ｍＭのリン
酸ナトリウム．１％のカゼイン，１ｍＭの塩化マグネシ
ウム，０．　１ｍＭの塩化亜鉛，及び１ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含有した緩衝液（ｐＨ　７．５）中
に希釈して作製した。木？昆合物の１５０μｌアリコー
トを装置に加え．膜スタックに吸収させた。短時間（２
分）インキュヘートを行った後，　３００　ｕ　ｌ　の
ＴＩＩＳ（ＩｇＧを含まない）を使用して装置を洗浄し
た。

０．３３ｍｇ／ｍｌのニトロブルー・テトラゾリウム，
１％のメタノール，及び０．２％のＮａＮ３を含有した
溶液１５０μｌを装置に加えた。次いで，２Ｂ／ｍｌの
インドキシルホスフェート．　２０ｍＭのレバミソール
を５０ａＭのＡＭＰアセテートに混合して得た溶液，０
．２％のＮａＮｆｆ＋及びＩＩＩＩＭの塩化マグネシウ
ムを含有した溶液（ｐＨ　９．８）の１５０μ１を加え
た。周囲温度にて５分インキユヘートした後，以下に記
載の安定化溶液を１５０μｌ加えることによって色形或
反応を停止させた。

１２． １５０ｍＭ のピロリン酸 ｐＨ　　ｉ．ｒ 安定化溶液を加えた直後（０時間）．並びに０．５１．
５．　４，及び２４時間後に，デンシトメーターを使用
して，得られたングナルスポノトとバンクグラウンド部
分の相対的な色濃度を測定した。本実験の結果を次表に
示す。

安定剤を使用しない場合（エントリー１）又は膜に水だ
けを加えた場合（エントリー２）．シグナルの色もハノ
クグラウンドの色もある程度発現し続けるが，４時間後
には実質的に識別できなくなる．ということが容易にわ
かる。これとは異なり．本発明の酸安定剤をρ１１４以
下で使用すると，シグナルとバンクグラウンドの色が安
定化される。

好ましいクエン酸安定剤を弱酸性のｐｌ＋で使用すると
（エントリー９と１０），同し安定剤をｐＨ４未満で使
用した場合（エントリー６，　７．　８）より安定化し
にくくなる。

【図面の簡単な説明】

図面は，本発明のアノセイに従って行ったインフルエン
ザウィルスに対するアッセイ結果を示している。 （外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）リガンドを含有していると思われる第１の液
   体を、不活性蛋白質を塗被した多孔性膜及びヒドロラー
   ゼを含んだトレーサーと結合させる工程、これにより前
   記リガンドが前記塗被膜及び前記トレーサーに結びつい
   て、前記酵素を前記膜上にて含んだ結合フラクションが
   得られる； （ｂ）前記第１の液体に前記膜を通過させ ることによって、前記膜を前記第１の液体から分離する
   工程； （ｃ）テトラゾリウム塩とインドキシル誘 導体を含んだ前記ヒドロラーゼ用基質を含有した第２の
   液体を前記膜に通す工程、このとき前記膜上の前記ヒド
   ロラーゼによって前記基質が有色生成物に転化される； （ｄ）酸を含んだ色安定剤を前記膜に通す 工程；及び （ｅ）前記膜上の前記有色生成物を検出す ることによって、前記第１の液体中における前記リガン
   ドの存在量を定量する工程； の各工程を含んでなる、液体中のリガンドの定量方法。 ２、前記リガンドが、単純ヘルペスウィルス、ＲＳウィ
   ルス、及びＡ型インフルエンザウィルスからなる群から
   選ばれるウィルス抗原である、請求項１記載の定量方法
   。 ３、前記トレーサーがさらに、前記ヒドロラーゼを前記
   リガンドと複合した形で有する前記リガンドに対して特
   異的なアンチリガンドを含み、前記ヒドロラーゼが、ペ
   プチダーゼ、エステラーゼ、ホスファターゼ、及びグリ
   コシダーゼからなる群から選ばれる、請求項１記載の定
   量方法。 ４、前記酸が無機酸及び有機酸からなる群から選ばれる
   、請求項１記載の定量方法。 ５、前記色安定剤がさらに有機溶媒を含む、請求項１記
   載の定量方法。 ６、（ａ）ウィルス抗原を含有していると思われる第１
   の液体を、不活性蛋白質、及び、それに複合したアルカ
   リ性ホスファターゼを有する前記抗原に対して特異的な
   抗体を塗被した膜と結合させる工程、これにより前記ウ
   ィルス抗原が前記塗被膜及び前記抗体に結びついて、前
   記アルカリ性ホスファターゼを前記膜上にて含んだ結合
   フラクションが得られる； （ｂ）前記第１の液体に前記膜を通過させ ることによって、前記膜を前記第１の液体から分離する
   工程； （ｃ）インドキシルホスフェートとニトロ ブルーテトラゾリウムを含有した第２の液体を前記膜に
   通す工程、このとき前記アルカリ性ホスファターゼによ
   って、前記のインドキシルホスフェートとニトロブルー
   テトラゾリウムが前記膜上にて有色生成物に転化される
   ； （ｄ）クエン酸を含んだ溶液を前記膜に通 す工程；及び （ｅ）前記膜上の前記有色生成物を検出す ることによって、前記第１の液体中における前記抗原の
   存在量を定量する工程； の各工程を含んでなる、液体中のウィルス抗原の定量方
   法。 ７、（ａ）不活性蛋白質と第１のアンチリガンドの少な
   くとも一方を塗被した膜； （ｂ）リガンド及び第２のアンチリガンド の一方に複合したヒドロラーゼを含んだトレーサー； （ｃ）前記酵素に対する基質；及び （ｄ）酸を含んだ色安定剤： を含んでなる、液体中のリガンドに関してアッセイを行
   うための材料キット。 ８、前記基質がインドキシル誘導体を含む、請求項７記
   載のキット。 ９、前記基質がさらにテトラゾリウム塩を含む、請求項
   ７記載のキット。 １０、前記膜に隣接配置された吸収材料を収容したハウ
   ジングをさらに含む、請求項７記載のキット。