JP7479290B2 - Dll3に対するキメラ受容体及びその使用方法 - Google Patents

Dll3に対するキメラ受容体及びその使用方法 Download PDF

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Description

関連出願
2018年4月10日に出願され、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第62/655,725号明細書に対する優先権が主張される。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を包含し、その配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2019年4月10日に作成された前記ASCIIのコピーは、名称がA-2249-WO-PCT_SL.txtであり、サイズが86,327バイトである。
小細胞肺がん(SCLC)は、診断される全肺がん症例のおよそ15%を占めるが、肺癌の攻撃的形態である(Enstone et al.,(2017)Pharmacoecon Open doi:10.1007/s41669-017-0045-0;Bunn et al.(2016)J Thorac Oncol;11:453-74;Siegel et al.,(2016)CA Cancer J Clin;66:7-30)。Delta様3(DLL3)は、Notch受容体に対するDelta/Serrate/Lag-2ファミリーのリガンドのメンバーであり、Notchシグナル伝達において役割を果たすと考えられている。DLL3は、通常、細胞内膜上でのみ発現するNotchシグナル伝達経路の抑制性リガンドである(Geffers et al.(2007)J Cell Biol;178:465-76)。代表的なDLL3タンパク質のオルソログとしては、ヒト(受託番号NP_058637及びNP982353)、チンパンジー(受託番号XP_003316395)、マウス(受託番号NP_031892)及びラット(受託番号NP_446118)が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトでは、DLL3遺伝子は、染色体19q13に位置する9.5kBpにわたる8個のエクソンからなる。最後のエクソン内における選択的スプライシングにより、2つのプロセシングされた転写物が生じ、1つは、2389塩基(受託番号NM_016941)であり、1つは、2052塩基(受託番号NM_203486)である。前者の転写物は、618アミノ酸タンパク質(受託番号NP 058637;配列番号29)をコードし、後者は、587アミノ酸タンパク質(受託番号NP 982353;配列番号30)をコードする。SCLCなどの特定のがんでは、DLL3は、細胞表面で発現し、そのため、これは、高度に腫瘍選択的な細胞表面タンパク質であることが判明している(Saunders et al.(2015)Sci Transl Med;7:302ra136)。
改変免疫細胞は、特に腫瘍分野の治療処置における所望の品質を有することが示されている。改変免疫細胞の2つの主なタイプは、キメラ抗原受容体(「CAR」又は「CAR-T」と称される)及びT細胞受容体(「TCR」)を含有するものである。これらの改変細胞は、標的細胞を認識して死滅させるその能力を保持又は強化しながら、抗原特異性を得るように改変される。キメラ抗原受容体は、例えば、(i)抗原特異的構成要素(「抗原結合分子」)、(ii)1つ以上の共刺激ドメイン、及び(iii)1つ以上の活性化ドメインを含み得る。各ドメインは、異質性、すなわち異なるタンパク質鎖由来の配列からなり得る。キメラ抗原受容体発現免疫細胞(T細胞など)を、がん療法を含む様々な療法に用いることができる。本明細書で定義される共刺激ポリペプチドを使用して、標的抗原に対するCAR発現細胞の活性化を強化し、したがって養子免疫療法の効力を増大させ得ることが理解されるであろう。
T細胞は、1種以上の所望の標的に対する特異性を有するように改変され得る。例えば、T細胞は、1つ以上のシグナル伝達分子及び/又はCD3ゼータなどの1つ以上の活性化ドメインと併せて、抗体の1つ以上の単鎖可変断片(「scFv」)などの抗原結合分子をコードするDNA又は他の遺伝物質を形質導入することができる。
標的細胞を認識し、破壊するCAR-T細胞の能力に加えて、成功したT細胞療法は、抗原に応答して増殖する能力を持続させて維持するCAR-T細胞の能力から利益を得る。
Enstone et al.,(2017)Pharmacoecon Open doi:10.1007/s41669-017-0045-0 Bunn et al.(2016)J Thorac Oncol;11:453-74 Siegel et al.,(2016)CA Cancer J Clin;66:7-30 Geffers et al.(2007)J Cell Biol;178:465-76 Saunders et al.(2015)Sci Transl Med;7:302ra136
DLL3が関連する疾患及び障害を治療するための新規且つ改善された療法を特定する必要性が存在する。
本発明は、改変免疫細胞(CAR又はTCRなど)、DLL3特異性を有する抗原結合分子(これらの抗原結合分子の抗体、scFv、重鎖及び/又は軽鎖並びにCDRが挙げられるが、これらに限定されない)に関する。
本発明のキメラ抗原受容体は、典型的には、(i)DLL3特異性抗原結合分子、(ii)1つ以上の共刺激ドメイン、及び(iii)1つ以上の活性化ドメインを含む。各ドメインは、異質性、したがって異なるタンパク質鎖由来の配列からなり得ることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、本発明は、DLL3に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体に関し、抗原結合分子は、(a)配列番号42、又は配列番号52、又は配列番号62と3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR1;(b)配列番号43、又は配列番号53、又は配列番号63と3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR2;(c)44、又は配列番号54、又は配列番号64と3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含む可変重鎖CDR3;(d)配列番号47、又は配列番号57、又は配列番号67と3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR1;(e)配列番号48、又は配列番号58、又は配列番号68と3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR2;(f)配列番号49、又は配列番号59、又は配列番号69と3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるアミノ酸配列を含む可変軽鎖CDR3の少なくとも1つを含む。
他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、少なくとも1つの共刺激ドメインを更に含む。更なる実施形態では、キメラ抗原受容体は、少なくとも1つの活性化ドメインを更に含む。
特定の実施形態では、共刺激ドメインは、CD28、CD28T、CD8、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CDl-la/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラス1分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド又はこれらの任意の組み合わせのシグナル伝達領域である。
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、4-1BBから誘導される。他の実施形態では、共刺激ドメインは、CD28又はCD28Tから誘導される。の他の実施形態では、共刺激ドメインは、CD8から誘導される。他の実施形態では、共刺激ドメインは、OX40から誘導される。Hombach et al.,Oncoimmunology.2012 Jul.1;1(4):458-466も参照されたい。更に他の実施形態では、Guedan et al.,August 14,2014;Blood:124(7)及びShen et al.,Journal of Hematology&Oncology(2013)6:33に説明されるように、共刺激ドメインは、ICOSを含む。更に他の実施形態では、Song et al.,Oncoimmunology.2012 Jul.1;1(4):547-549に説明されるように、共刺激ドメインは、CD27を含む。
特定の実施形態では、CD28共刺激ドメインは、配列番号2、配列番号4、配列番号6又は配列番号8を含む。追加の実施形態では、CD8共刺激ドメインは、配列番号14を含む。追加の実施形態では、4-1BB共刺激ドメインは、配列番号16を含む。更なる実施形態では、活性化ドメインは、CD3、CD3ゼータ又は配列番号10に記載される配列を有するCD3ゼータを含む。
他の実施形態では、本発明は、共刺激ドメインが配列番号2を含み、及び活性化ドメインが配列番号10を含む、キメラ抗原受容体に関する。
本発明は、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含むベクターに更に関する。ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター又はこれらの任意の組み合わせであり得る。本発明は、ベクターを含む免疫細胞に更に関する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、pGARベクターである。
例示的な免疫細胞としては、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、NK細胞、TCR発現細胞、樹状細胞又はNK-T細胞が挙げられるが、これらに限定されない。T細胞は、自己、同種異系又は異種であり得る。他の実施形態では、本発明は、本明細書で説明される免疫細胞を含む医薬組成物に関する。
特定の実施形態では、本発明は、
(a)1H2.1のVH領域のアミノ酸配列と10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるVH領域及び1H2.1のVL領域のアミノ酸配列と10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるVL領域、
(b)8D2のVH領域のアミノ酸配列と10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるVH領域及び8D2のVL領域のアミノ酸配列と10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるVL領域、
(c)6B2のVH領域のアミノ酸配列と10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるVH領域及び6B2のVL領域のアミノ酸配列と10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基だけ異なるVL領域
の少なくとも1つを含む抗原結合分子(及びこれらの分子を含むキメラ抗原受容体)であって、1つ又は複数のVH及びVL領域は、少なくとも1つのリンカーによって連結される、抗原結合分子(及びこれらの分子を含むキメラ抗原受容体)に関する。
他の実施形態では、本発明は、リンカーがscFv G4Sリンカー及びscFv Whitlowリンカーの少なくとも1つを含む、抗原結合分子(及びこれらの分子を含むキメラ抗原受容体)に関する。
他の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするベクター及びこれらのポリペプチドを含む免疫細胞に関する。好ましい免疫細胞としては、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、NK細胞、TCR発現細胞、樹状細胞又はNK-T細胞が挙げられる。T細胞は、自己、同種異系又は異種であり得る。
他の実施形態では、本発明は、DLL3に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)をコードする単離ポリヌクレオチドに関し、抗原結合分子は、配列番号44又は配列番号54、又は配列番号64のアミノ酸配列を含む可変重(V)鎖CDR3を含む。ポリヌクレオチドは、活性化ドメインを更に含み得る。好ましい実施形態では、活性化ドメインは、CD3、より好ましくはCD3ゼータ、より好ましくは配列番号9に記載されたアミノ酸配列である。
他の実施形態では、本発明は、CD28、CD28T、OX40、CD8、4-1BB/CD137、CD2、CD3(アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CDl la/CD18)、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー14;TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラスI分子、TNF、TNFr、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl-ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl-la、LFA-1、ITGAM、CDl-lb、ITGAX、CDl-lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83リガンドなどの共刺激ドメイン又はこれらの断片若しくは組み合わせを含む。好ましい共刺激ドメインは、以下に引用される。
更なる実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)をコードする単離ポリヌクレオチドに関し、前記CAR又はTCRは、DLL3に特異的に結合する抗原結合分子を含み、抗原結合分子は、配列番号47、配列番号57及び配列番号67から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖(V)CDR3を含む。ポリヌクレオチドは、活性化ドメインを更に含み得る。ポリヌクレオチドは、共刺激ドメインを更に含み得る。
他の実施形態では、本発明は、DLL3に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)をコードする単離ポリヌクレオチドに関し、抗原結合分子重鎖は、CDR1(配列番号42)、CDR2(配列番号43)及びCDR3(配列番号44)を含み、且つ抗原結合分子軽鎖は、CDR1(配列番号47)、CDR2(配列番号48)及びCDR3(配列番号49)を含む。
他の実施形態では、本発明は、DLL3に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)をコードする単離ポリヌクレオチドに関し、抗原結合分子重鎖は、CDR1(配列番号52)、CDR2(配列番号53)及びCDR3(配列番号54)を含み、且つ抗原結合分子軽鎖は、CDR1(配列番号57)、CDR2(配列番号58)及びCDR3(配列番号59)を含む。
他の実施形態では、本発明は、DLL3に特異的に結合する抗原結合分子を含むキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)をコードする単離ポリヌクレオチドに関し、抗原結合分子重鎖は、CDR1(配列番号62)、CDR2(配列番号63)及びCDR3(配列番号64)を含み、且つ抗原結合分子軽鎖は、CDR1(配列番号67)、CDR2(配列番号68)及びCDR3(配列番号69)を含む。
本発明は、本明細書に記載される少なくとも1つの可変重鎖CDR3又は可変軽鎖CDR3配列を含むDLL3に対する抗原結合分子に更に関する。本発明は、本明細書で説明される少なくとも1つの可変重鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含むDLL3に対する抗原結合分子に更に関する。本発明は、本明細書で説明される少なくとも1つの可変軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列を含むDLL3に対する抗原結合分子に更に関する。本発明は、本明細書に記載される可変重鎖CDR1、CDR2、CDR3及び可変軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3配列の両方を含むDLL3に対する抗原結合分子に更に関する。
本発明によるDLL3結合分子に使用するのに好適な追加の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン並びにCDRポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は、2015年7月31日出願の米国仮特許出願第62/199,944号明細書に見出される。
本発明は、疾患又は障害の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、本発明による抗原結合分子、CAR、TCR、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物を対象に投与することを含む方法に更に関する。治療に好適な疾患としては、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺(例えば、前立腺腺癌)、膵臓、肺(小細胞及び非小細胞の両方)、甲状腺、癌腫、肉腫、グリア芽腫、頭頸部腫瘍、大細胞神経内分泌癌(LCNEC)、甲状腺髄様がん、グリア芽腫、神経内分泌前立腺がん(NEPC)、高悪性度胃腸膵がん(GEP)及び悪性黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
健康なドナーからのT細胞におけるDLL3 CARの発現を示す。 健康なドナーからのT細胞におけるDLL3 CARの発現を示す。 健康なドナーからのレンチウイルス形質導入CAR T細胞の細胞溶解活性を示す。 健康なドナーからのレンチウイルス形質導入CAR T細胞の細胞溶解活性を示す。 健康なドナーからのレンチウイルス形質導入CAR T細胞の細胞溶解活性を示す。 健康なドナーからのCAR T細胞によるサイトカイン産生を示す。 健康なドナーからのCAR T細胞によるサイトカイン産生を示す。 健康なドナーからのCAR T細胞によるサイトカイン産生を示す。 DLL3発現標的細胞に応答するT細胞増殖のフローサイトメトリー分析を示す。 DLL3発現標的細胞に応答するT細胞増殖のフローサイトメトリー分析を示す。 ヒトSCLCのマウス異種モデルにおけるDLL3 CAR T細胞のインビボ抗腫瘍活性を示す。 DLL3 CAR T細胞治療後のマウスSCLC異種モデルの生存率分析を示す。 pGARのベクターマップを示す。
キメラ抗原受容体(CAR又はCAR-T)及びT細胞受容体(TCR)は、遺伝子改変された受容体であることが理解されるであろう。これらの改変された受容体は、当技術分野で既知の技法に従い、T細胞を含む免疫細胞に容易に挿入することができ、その免疫細胞によって容易に発現され得る。CARを用いて、特定の抗原を認識することと、その抗原と結合したとき、その抗原を有する細胞を攻撃して破壊するように免疫細胞を活性化することとの両方を行うように単一の受容体をプログラムすることができる。これらの抗原が腫瘍細胞上に存在すると、CARを発現する免疫細胞は、その腫瘍細胞を標的化して死滅させることができる。
CARは、標的化された抗原(細胞表面抗原などの)と相互作用する抗原結合分子を組み込むことにより、抗原に結合するように改変することができる。好ましくは、抗原結合分子は、その抗体断片、更に好ましくは1つ以上の単鎖抗体断片(「scFv」)である。scFvは、一体に連結された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を有する単鎖抗体断片である。米国特許第7,741,465号明細書及び同第6,319,494号明細書並びにEshhar,et al.,Cancer Immunol.Immunotherapy(1997)45:131-136を参照されたい。scFvは、標的抗原と特異的に相互作用する親抗体の能力を保持する。scFvは、他のCAR成分と共に単鎖の一部として発現されるように改変され得るため、キメラ抗原受容体での使用に好ましい。同上、Krause et al.,J.Exp.Med.,Volume 188,No.4,1998(619-626);Finney et al.,Journal of Immunology,1998,161:2791-2797も参照されたい。抗原結合分子は、典型的には、それが対象の抗原を認識して、その抗原と結合することができるようにCARの細胞外部分内に含有されることが理解されるであろう。2つ以上の対象の標的に対する特異性を有する二重特異性及び多重特異性のCARが本発明の範囲内で検討される。
共刺激ドメイン。キメラ抗原受容体は、共刺激(シグナル伝達)ドメインを組み込んでその効能を高めることができる。米国特許第7,741,465号明細書及び同第6,319,494号明細書並びにKrause,et al.及びFinney,et al.(上記)、Song et al.,Blood 119:696-706(2012);Kalos et al.,Sci Transl.Med.3:95(2011);Porter et al.,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)及びGross et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)を参照されたい。例えば、CD28は、T細胞上で天然に見出される共刺激タンパク質である。CD28の完全なネイティブアミノ酸配列は、NCBI参照配列:NP_006130.1に記載される。完全なネイティブのCD28核酸配列は、NCBI参照配列:NM_006139.1に記載される。
特定のCD28のドメインがキメラ抗原受容体で使用されている。本発明によれば、「CD28T」と称される新規のCD28細胞外ドメインは、CARコンストラクト中で利用されると特定の利益を予想外に提供することが見出されている。
細胞外CD28Tドメイン並びにCD28膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むCD28T分子のヌクレオチド配列は、配列番号1に記載される。
Figure 0007479290000001
対応するアミノ酸配列は、配列番号2に記載される。
Figure 0007479290000002
CD28Tの細胞外部分のヌクレオチド配列は、配列番号3に記載される。
Figure 0007479290000003
CD28Tの細胞外ドメインの対応するアミノ酸配列は、配列番号4に記載される。
LDNEKSNGTI IHVKGKHLCP SPLFPGPSKP
CD28の膜貫通ドメインのヌクレオチド配列は、配列番号5に記載される。
Figure 0007479290000004
CD28の膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号6に記載される。
FWVLVVVGGV LACYSLLVTV AFIIFWV
CD28の細胞内シグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列は、配列番号7に記載される。
Figure 0007479290000005
CD28の細胞内シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、配列番号8に記載される。
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
本発明で使用するのに好適な追加のCD28配列としては、配列番号11に記載されるCD28のヌクレオチド配列が挙げられる。
Figure 0007479290000006
対応するアミノ酸配列は、配列番号12に記載される。
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
他の好適な細胞外又は膜貫通配列は、CD8に由来し得る。好適なCD8の細胞外及び膜貫通ドメインのヌクレオチド配列は、配列番号13に記載される。
Figure 0007479290000007
対応するアミノ酸配列は、配列番号14に記載される。
Figure 0007479290000008
他の好適な細胞内シグナル伝達配列は、41-BBから誘導され得る。好適な41-BBの細胞内シグナル伝達ドメインのヌクレオチド配列は、配列番号15に記載される。
Figure 0007479290000009
対応するアミノ酸配列は、配列番号16に記載される。
RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
本発明の範囲内の好適な共刺激ドメインは、供給源の中でもとりわけ、CD28、CD28T、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD33、CD37、CD40、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CDl la/CD18)、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー14;TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラスI分子、TNF、TNFr、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl-ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl-la、LFA-1、ITGAM、CDl-lb、ITGAX、CDl-lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83リガンド又はこれらの断片若しくは組み合わせから誘導され得る。
活性化ドメイン。
CD3は、ネイティブT細胞上のT細胞受容体の一要素であり、CARにおいて重要な細胞内活性化要素であることが示されている。好ましい実施形態では、CD3は、CD3ゼータであり、そのヌクレオチド配列は、配列番号9に記載される。
Figure 0007479290000010
細胞内CD3ゼータの対応するアミノ酸は、配列番号10に記載される。
Figure 0007479290000011
ドメイン配向
構造的に、これらのドメインは、免疫細胞に対する位置に対応することが理解されるであろう。したがって、これらのドメインは、(i)「ヒンジ」若しくは細胞外(EC)ドメイン(EC)、(ii)膜貫通(TM)ドメイン、及び/又は(iii)細胞内(細胞質)ドメイン(IC)の一部であり得る。細胞内構成要素は、部分的にCD3ファミリーのメンバー、好ましくはCD3ゼータを含むことが多く、これは、抗原結合分子がその標的に結合する際にT細胞を活性化することができる。一実施形態では、ヒンジドメインは、典型的には、本明細書で定義される少なくとも1つの共刺激ドメインからなる。
ヒンジ領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgMなどの免疫グロブリンファミリーのメンバー又はこれらの断片の一部若しくは全部を含有し得ることも理解されるであろう。
本発明による例示的なCARコンストラクトは、表1に記載される。
Figure 0007479290000012
細胞に対するドメイン
受容体を有する細胞に対して、本発明の改変T細胞は、抗原結合分子(scFvなど)、細胞外ドメイン(「ヒンジ」ドメインを含み得る)、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むことが理解されるであろう。細胞内ドメインは、少なくとも部分的に活性化ドメインを含み、これは、好ましくは、CD3ゼータ、CD3イプシロン、CD3ガンマ又はそれらの一部などのCD3ファミリーメンバーからなる。更に、抗原結合分子(例えば、1つ以上のscFv)は、分子/コンストラクトの細胞外部分内に位置するように改変されるため、その標的を認識して結合することができることも理解されるであろう。
細胞外ドメイン。細胞外ドメインは、シグナル伝達及び抗原に対するリンパ球の効率的な応答にとって有益である。本発明の特定の使用の細胞外ドメインは、CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CDl-la/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラス1分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド又はこれらの任意の組み合わせから誘導され得る(すなわちこれらを含み得る)。細胞外ドメインは、天然の供給源又は合成の供給源のいずれかから誘導され得る。
本明細書で説明されるように、細胞外ドメインは、ヒンジ部分を含む場合が多い。これは、「スペーサー」領域と呼ばれる場合のある細胞外ドメインの一部である。上記で論じた共刺激分子及び免疫グロブリン(Ig)配列又は他の好適な分子を含む様々なヒンジを本発明に従って採用し、標的細胞からの所望の特定の距離を達成することができる。いくつかの実施形態では、全細胞外領域がヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、CD28T又はCD28のECドメインを含む。
膜貫通ドメイン。CARは、CARの細胞外ドメインに融合される膜貫通ドメインを含むように設計され得る。これは、CARの細胞内ドメインにも同様に融合され得る。一実施形態では、CARのドメインの1つと天然に会合する膜貫通ドメインが使用される。場合により、アミノ酸置換によって膜貫通ドメインを選択又は修飾して、同一の又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのこうしたドメインの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にすることができる。膜貫通ドメインは、天然の供給源又は合成の供給源のいずれかから誘導され得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質から誘導され得る。本発明の特定の使用の膜貫通領域は、CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CDl-la/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラス1分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド又はこれらの任意の組み合わせから誘導され得る(すなわちこれらを含み得る)。
任意選択的に、短いリンカーは、CARの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインのいずれか又はいくつかの間で結合を形成し得る。
一実施形態では、本発明のCARにおける膜貫通ドメインは、CD8の膜貫通ドメインである。一実施形態では、CD8の膜貫通ドメインは、配列番号13の核酸配列の膜貫通部分を含む。別の実施形態では、CD8の膜貫通ドメインは、配列番号14内に含有される膜貫通アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
特定の実施形態では、本発明のCARにおける膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通ドメインである。一実施形態では、CD28の膜貫通ドメインは、配列番号5の核酸配列を含む。一実施形態では、CD28の膜貫通ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。別の実施形態では、CD28の膜貫通ドメインは、配列番号6のアミノ酸配列を含む。
細胞内(細胞質)ドメイン。本発明の改変T細胞の細胞内(細胞質)ドメインは、免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を提供することができる。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
好適な細胞内分子としては、CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、プログラム死-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1、CDl-la/CD18)、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igアルファ(CD79a)、DAP-10、Fcガンマ受容体、MHCクラス1分子、TNF受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(SLAMタンパク質)、活性化NK細胞受容体、BTLA、Tollリガンド受容体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、IL-2Rベータ、IL-2Rガンマ、IL-7Rアルファ、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83と特異的に結合するリガンド又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる(すなわちこれらを含む)が、これらに限定されないことが理解されるであろう。
好ましい実施形態では、CARの細胞質ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインを、単独で又は本発明のCARとの関係において有用な任意の他の所望の細胞質ドメインとの組み合わせで含むように設計され得る。例えば、CARの細胞質ドメインは、CD3ゼータ鎖部分及び共刺激シグナル伝達領域を含むことができる。
本発明のCARの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、互いにランダムな又は特定の順序で連結され得る。
好ましい一実施形態では、細胞質ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインとCD28のシグナル伝達ドメインとを含むように設計される。別の一実施形態では、細胞質ドメインは、CD3ゼータのシグナル伝達ドメインと4-1BBのシグナル伝達ドメインとを含むように設計され、細胞質CD28は、配列番号15に記載された核酸配列及び配列番号16に記載されたアミノ酸配列を含む。別の一実施形態では、本発明のCARにおける細胞質ドメインは、CD28の一部とCD3ゼータを含むように設計され、細胞質CD28は、配列番号7に記載された核酸配列及び配列番号8に記載されたアミノ酸配列を含む。CD3ゼータの核酸配列は、配列番号9に記載されており、アミノ酸配列は、配列番号8に記載されている。
本発明によるCARの好ましい配向の1つは、共刺激ドメイン及び活性化ドメインと並行して抗原結合分子(scFvなど)を含むことが理解されるであろう。共刺激ドメインは、細胞外部分、膜貫通部分及び細胞内部分の1つ以上を含むことができる。複数の共刺激ドメインが並行して利用され得ることが更に理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、抗原結合分子と、少なくとも1つの共刺激分子と、活性化ドメインとをコードする第1のポリヌクレオチドに操作可能に連結されたプロモータを含む核酸が提供される。
いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、ウイルスベクター内に含有される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、マウス白血病ウイルスベクター、SFGベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸は、プラスミド内に含有される。
本発明は、キメラ抗原受容体をコードする単離ポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含むベクターに更に関する。当技術分野で既知の任意のベクターが本発明に好適であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター(pMSVG1など)、DNAベクター、マウス白血病ウイルスベクター、SFGベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス随伴(AAV)ベクター、レンチウイルスベクター(pGARなど)又はこれらの任意の組み合わせである。pGARのベクターマップを図7に示す。pGARの配列は、以下の通りである。
Figure 0007479290000013
Figure 0007479290000014
Figure 0007479290000015
Figure 0007479290000016
Figure 0007479290000017
好適な追加の例示的ベクターとしては、例えば、pBABE-puro、pBABE-neo largeTcDNA、pBABE-hygro-hTERT、pMKO.1 GFP、MSCV-IRES-GFP、pMSCV PIG(Puro IRES GFP空プラスミド)、pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE、MSCV IRESルシフェラーゼ、pMIG、MDH1-PGK-GFP_2.0、TtRMPVIR、pMSCV-IRES-mCherry FP、pRetroX GFP T2A Cre、pRXTN、pLncEXP及びpLXIN-Lucが挙げられる。
いくつかの実施形態では、改変免疫細胞は、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、NK細胞、TCR発現細胞、樹状細胞又はNK-T細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血から得られるか又は調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)から得られるか又は調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄から得られるか又は調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、臍帯血から得られるか又は調製される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃(例えば、遺伝子銃)、脂質形質移入、ポリマー形質移入、ナノ粒子又はポリプレックスからなる群から選択される方法を用いて、核酸ベクターによって形質移入又は形質導入される。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、本出願の核酸を含む改変免疫細胞中で発現される。本出願のこれらのキメラ抗原受容体は、いくつかの実施形態では、(i)抗原結合分子(scFvなど)と、(ii)膜貫通領域と、(iii)T細胞活性化分子又は領域とを含み得る。
抗原結合分子
抗原結合分子は、本発明の範囲内にある。
本明細書で使用する場合、「抗原結合分子」は、特定の標的抗原と結合する任意のタンパク質を意味する。本出願では、特定の標的抗原は、DLL3タンパク質又はその断片である。抗原結合分子としては、抗体及び免疫機能性断片などのその結合部分が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチボディ(すなわちペプチド結合ドメインを含むFc融合分子)は、好適な抗原結合分子の別の例である。
いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、腫瘍細胞上の抗原と結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、過剰増殖性疾患に関与する細胞上の抗原又はウイルス性若しくは細菌性抗原と結合する。特定の実施形態では、抗原結合分子は、DLL3と結合する。更なる実施形態では、抗原結合分子は、その相補性決定領域(CDR)の1つ以上を含む、その断片の抗体である。更なる実施形態では、抗原結合分子は、単鎖可変断片(scFv)である。
抗原結合分子の用語「免疫機能性断片」(又は「断片」)は、完全長鎖中に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが、なお抗原に特異的に結合することができる抗体の一部(その部分がどのように得られるか又は合成されるかに関わらず)を含む抗原結合分子の種である。そのような断片は、それが標的抗原に結合するという点で生物学的に活性であり、所与のエピトープへの結合に関してインタクトな抗体を含む他の抗原結合分子と競合し得る。いくつかの実施形態では、断片は、中和断片である。いくつかの実施形態では、断片は、DLL3の活性を遮断又は低減することができる。一態様では、このような断片は、完全長軽鎖又は重鎖中に存在する少なくとも1つのCDRを保持し、いくつかの実施形態では単一の重鎖及び/若しくは軽鎖又はその一部を含むであろう。これらの断片は、組み換えDNA技法によって生成することができるか、又はインタクトな抗体を含む、抗原結合分子の酵素的若しくは化学的な切断によって生成することができる。
免疫機能性の免疫グロブリン断片としては、scFv断片、Fab断片(Fab’、F(ab’)など)、1つ以上のCDR、ダイアボディ(同一鎖上の2つのドメインを対合するには短すぎる短いペプチドリンカーを介して接続された軽鎖可変ドメインと同じポリペプチドにおける重鎖可変ドメイン)、ドメイン抗体及び単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらの断片は、ヒト、マウス、ラット、ラクダ又はウサギが挙げられるが、これらに限定されない任意の哺乳類供給源から誘導され得る。当業者によって理解されるように、抗原結合分子は、非タンパク質成分を含むことができる。
例えば、本明細書に記載される配列のアミノ酸配列とそれぞれ少なくとも70~80%、80~85%、85~90%、90~95%、95~97%、97~99%又は99%超の同一性を有する可変軽鎖及び/又は可変重鎖などの抗原結合分子の変異体も本発明の範囲内にある。いくつかの場合、そのような分子は、少なくとも1つの重鎖及び1つの軽鎖を含み、他の場合、変異形態は、2つの同一の軽鎖及び2つの同一の重鎖(又はその下位部分)を含む。当業者であれば、よく知られる手法を使用して、本明細書に記載される抗原結合分子の好適な変異体を決定することができるであろう。特定の実施形態では、当業者は、活性に重要でないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を損なうことなく変更が可能な分子の好適な領域を同定し得る。
特定の実施形態では、抗原結合分子のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書では「抗体模倣体」と称される場合がある)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物(本明細書では「抗体コンジュゲート」と称される場合がある)及びそれぞれその断片を含むが、これらに限定されない抗体に基づく。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、アビマーを含むか又はアビマーからなる。
いくつかの実施形態では、DLL3に対する抗原結合分子は、単独で投与される。他の実施形態では、DLL3に対する抗原結合分子は、CAR、TCR又は他の免疫細胞の一部として投与される。このような免疫細胞では、DLL3に対する抗原結合分子は、同じプロモータ領域又は別々のプロモータの制御下にあり得る。特定の実施形態では、DLL3に対するタンパク質物質及び/又は抗原結合分子をコードする遺伝子は、別々のベクターにあり得る。
本発明は、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、保存料及び/又は補助剤と共に、DLL3に対する抗原結合分子を含む医薬組成物を更に提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、DLL3に対する2つ以上の異なる抗原結合分子を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、DLL3に対する抗原結合分子が2つ以上のエピトープを結合する、DLL3に対する2つ以上の抗原結合分子を含む。いくつかの実施形態では、様々な抗原結合分子は、DLL3への結合に関して互いに競合しない。
他の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達、吸入又は経口などの消化管を介した送達のために選択され得る。こうした薬学的に許容可能な組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。特定の実施形態では、緩衝剤は、組成物を生理学的pH又は僅かに低いpH、典型的には約5~約8のpH範囲内に維持するために使用される。特定の実施形態では、非経口投与が検討される場合、治療組成物は、追加の治療剤の有無に関わらず、薬学的に許容可能なビヒクル中でDLL3に対する所望の抗原結合分子を含む、発熱物質を含まない、非経口で許容可能な水溶液の形態であり得る。特定の実施形態では、非経口注入のためのビヒクルは、少なくとも1つの追加の治療剤の有無に関わらず、DLL3に対する抗原結合分子が適正に保存された無菌の等張溶液として配合されている無菌蒸留水である。特定の実施形態では、調製は、所望の分子と、その後、蓄積注射を介して送達され得る生成物の制御放出又は持続放出を提供することができるポリマー化合物(ポリ乳酸又はポリグリコール酸など)、ビーズ又はリポソームとの配合を伴い得る。特定の実施形態では、所望の分子を導入するために、埋め込み可能な薬剤送達デバイスが使用され得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合分子が診断ツール又は検証ツールとして使用される。抗原結合分子を用いて、試料及び/又は対象中に存在するDLL3の量をアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、診断用抗原結合分子は、中和性ではない。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている抗原結合分子は、DLL3レベルの変化に関連する疾患又は障害をスクリーニング/診断するために、哺乳類の組織又は細胞中でDLL3を検出するためのアッセイキット及び/又は方法で使用又は提供される。キットは、存在する場合にはDLL3との抗原結合分子の結合及び任意選択的にDLL3タンパク質レベルを示す手段と共に、DLL3を結合する抗原結合分子を含むことができる。
抗原結合分子は、以下の定義及び記載を考慮することで更に理解されるであろう。
「Fc」領域は、抗体のCH1及びCH2ドメインを含む2つの重鎖断片を含む。2つの重鎖断片は、2つ以上のジスルフィド結合及びCH3ドメインの疎水性相互作用によって一体にまとめられる。
「Fab断片」は、1つの軽鎖と、1つの重鎖のCH1及び可変領域とを含む。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Fab’断片」は、1つの軽鎖と、VHドメイン及びCH1ドメイン並びに加えてCH1ドメインとCH2ドメインとの間の領域も含む1つの重鎖の一部とを含み、その結果、2つのFab’断片の2つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成することでF(ab’)分子を形成することができる。「F(ab’)断片」は、2つの軽鎖と、CH1ドメインとCH2ドメインとの間の定常領域の一部を含む2つの重鎖とを含み、その結果、鎖間ジスルフィド結合が2つの重鎖間に形成される。そのため、F(ab’)断片は、2つの重鎖間のジスルフィド結合によって共にまとめられた2つのFab’断片からなる。
「Fv領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
「単鎖可変断片」(「scFv」、「単鎖抗体」とも称される)は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが可動性リンカーによって連結されることで、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するFv分子を指す。その開示全体が参照により組み込まれる国際公開第88/01649号パンフレット並びに米国特許第4,946,778号明細書及び同第5,260,203号明細書を参照されたい。
「二価の抗原結合分子」は、2つの抗原結合部位を含む。いくつかの場合、2つの結合部位は、同一の抗原特異性を有する。二価の抗原結合分子は、二重特異性であり得る。「多特異性抗原結合分子」は、2つ以上の抗原又はエピトープを標的とするものである。「二重特異性(bispecific)」、「二重特異性(dual-specific)」又は「二重特異性(bifunctional)」の抗原結合分子は、それぞれ2つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッドの抗原結合分子又は抗体である。二重特異性抗原結合分子の2つの結合部位は、同一の又は異なるタンパク質標的上に存在し得る2つの異なるエピトープに結合する。
抗原結合分子は、解離定数(K)が約1×10-7Mである場合、その標的抗原と「特異的に結合する」と言われる。抗原結合分子は、Kが1~5×10-9Mである場合には「高親和性」で、且つKが1~5×10-10Mである場合には「非常に高い親和性」で抗原と特異的に結合する。一実施形態では、抗原結合分子は、10-9MのKを有する。一実施形態では、オフレートは、<1×10-5である。他の実施形態では、抗原結合分子は、約10M-7~10-13MのKでヒトDLL3に結合し、更に別の実施形態では、抗原結合分子は、K1.0~5×10-10で結合する。
抗原結合分子は、それが第2の標的に結合するよりも強固に1つの標的に結合する場合、「選択的」であると言われる。
用語「抗体」は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン又は標的抗原への特異的結合についてインタクトな抗体と競合することができるその断片を指し、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体及び二重特異性抗体を含む。「抗体」は、本明細書で定義される抗原結合分子の一種である。インタクトな抗体は、一般に少なくとも2つの完全長の重鎖と2つの完全長の軽鎖とを含むが、場合により重鎖のみを含むことができるラクダに天然に存在する抗体などのより少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源のみに由来する場合があるか、又はキメラ、すなわち以下に更に記載されるように、その抗体の異なる部分が2つの異なる抗体に由来し得るものである場合がある。抗原結合分子、抗体又は結合断片は、ハイブリドーマ中において、組み換えDNA手法又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的な切断により生成され得る。別段の指摘がない限り、用語「抗体」としては、2つの完全長重鎖と2つの完全長軽鎖とを含む抗体に加えて、その例が以下に記載されるその誘導体、変異体、断片及び突然変異タンパク質が挙げられる。更に、明示的に除外されない限り、抗体としては、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書では「抗体模倣体」と称される場合がある)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物(本明細書では「抗体コンジュゲート」と称される場合がある)及びこれらの断片がそれぞれ挙げられる。
可変領域は、典型的には、3つの超可変領域(すなわち「CDR」)によって連結された、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同じ一般構造を示す。各対の2つの鎖由来のCDRは、典型的には、特定のエピトープへの結合を可能にし得るフレームワーク領域によって整列されている。N末端からC末端まで、軽鎖及び重鎖可変領域の両方は、典型的には、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。慣例により、重鎖におけるCDR領域は、典型的には、HC CDR1、CDR2及びCDR3と称される。軽鎖におけるCDR領域は、典型的には、LC CDR1、CDR2及びCDR3と称される。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、典型的には、Kabat(Seqs of Proteins of Immunological Interest(NIH,Bethesda,MD(1987 and 1991))又はChothia(J.Mol.Biol.,196:901-917(1987);Chothia et al.,Nature,342:878-883(1989))の定義に従う。Kabat又はChothiaのみならず、AbMの定義も含む種々の解析方法を使用して、CDR領域を特定するか又は見積もることができる。
用語「軽鎖」は、完全長軽鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン(V)及び定常領域ドメイン(C)を含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、κ鎖及びλ鎖が含まれる。
用語「重鎖」は、完全長重鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長重鎖は、可変領域ドメイン(V)並びに3つの定常領域ドメイン(CH1、CH2及びCH3)を含む。Vドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、Cドメインは、カルボキシル末端にあり、CH3は、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、IgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4サブタイプを含む)、IgA(IgA1及びIgA2サブタイプを含む)、IgM及びIgEを含む任意のアイソタイプからなり得る。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の軽鎖及び/又は重鎖の一部を指し、典型的には重鎖中にほぼ120~130のアミノ末端アミノ酸を含み、軽鎖中に約100~110のアミノ末端アミノ酸を含む。抗体の可変領域は、典型的には、その標的に対する特定の抗体の特異性を決定する。
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」(CDR)と呼ばれる。可変ドメインのより保存された(すなわち非超可変の)部分は、「フレームワーク」領域(FRM又はFR)と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における6つのCDRのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置をとる4つのFRM領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する3つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、FRMによって近接して一体で保持されており、他の鎖の超可変領域と共に抗原結合部位の形成に寄与する(前掲のKabat et al.を参照されたい)。
用語「CDR」及びその複数形「CDRs」は、そのうちの3つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し(CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3)、3つが重鎖可変領域の結合特性を構成する(CDRH1、CDR-H2及びCDR-H3)相補性決定領域を指す。CDRは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。CDRは、抗原特異性の主要な決定基である。
CDRの境界及び長さの厳密な定義は、各種の分類及び付番方式に従う。したがって、CDRは、本明細書に記載される付番方式を含む、Kabat、Chothia、接触又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分においてある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるCDRの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Kabat(異種間の配列可変性に基づく手法)、Chothia(抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法)及び/又はMacCallumを参照されたい(Kabat et al.,前掲;Chothia et al.,J.MoI.Biol,1987,196:901-917;及びMacCallum et al.,J.MoI.Biol,1996,262:732)。抗原結合部位の特性決定のための更に別の基準は、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって用いられるAbM定義である。例えば、Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering Lab Manual(Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelbergを参照されたい。2つの残基同定技法が、重複するが、同一ではない領域を定義する限り、それらを組み合わせてハイブリッドCDRを定義することができる。しかしながら、いわゆるKabat方式に従う付番が好ましい。
典型的には、CDRは、カノニカル構造として分類することのできるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合(CDR)ループによって取られる主鎖コンホメーションを指す。比較構造研究から、6つの抗原結合ループの5つは、限られたレパートリーのコンホメーションのみが利用可能であることが分かっている。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特性決定することができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分において、高いアミノ酸配列の可変性が見られるにも関わらず、非常に類似した三次元構造を有し得る(Chothia and Lesk,J.MoI.Biol.,1987,196:901;Chothia et al.,Nature,1989,342:877;Martin and Thornton,J.MoI.Biol,1996,263:800)。更に、取られるループ構造と、その周囲のアミノ酸配列との間には、関連性がある。特定のカノニカルクラスのコンホメーションは、ループの長さにより、且つそのループ内及び保存されたフレームワーク内(すなわちループ外)の重要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。
用語「カノニカル構造」は、例えば、Kabat(Kabat et al.,前掲)により分類される通り、抗体の線状配列に関する検討も含み得る。Kabatの付番スキーム(方式)は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている基準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるように本発明で適用される好ましいスキームである。更なる構造の検討が抗体のカノニカル構造を決定するために使用される場合もある。例えば、Kabatの付番法では十分に反映されない相違をChothiaらの付番方式によって記載することができ、且つ/又は他の技術、例えば結晶学及び二次元若しくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、(例えば、種々のカノニカル構造をライブラリに含めるという要求に基づいて)適切なシャーシ配列の同定が可能であるカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のKabat付番法及びChothia et al.,(前掲)に記載される構造の検討並びに抗体構造のカノニカルな側面の解釈に対するそれらの意義については、文献に記載されている。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当技術分野でよく知られている。抗体構造の概説については、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,eds.Harlow et al.,1988を参照されたい。
軽鎖のCDR3及び特に重鎖のCDR3は、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定基となる場合がある。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖CDR3が抗原と抗体との間の主要な接触領域になると思われる。CDR3のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させることができるか、又はいずれの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、CDR3は、典型的には抗体結合部位内における分子多様性の最大の供給源である。例えば、H3は、2個のアミノ酸残基ほど短いもの又は26個超のアミノ酸であり得る。
用語「中和」は、リガンドに結合し、そのリガンドの生物学的作用を妨げるか又は低下させる抗原結合分子、scFv又は抗体をそれぞれ指す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接遮断することにより、又はリガンドに結合し、間接的手段によってリガンドの結合する能力を変化させること(リガンドにおける構造的又はエネルギー的変化など)により行うことができる。いくつかの実施形態では、この用語は、それが結合するタンパク質が生物学的機能を実施することを妨げる抗原結合分子を意味することもできる。
用語「標的」又は「抗原」は、抗原結合分子によって結合され得る分子又は分子の一部を指す。特定の実施形態では、標的は、1つ以上のエピトープを有し得る。
用語「競合する」は、同じエピトープに関して競合する抗原結合分子との関連で用いられる場合、試験されている抗原結合分子(例えば、抗体又はその免疫機能性断片)が、抗原に対する参照抗原結合分子の特異的な結合を妨げるか又は阻害する(例えば、減らす)アッセイによって判定される、抗原結合分子間の競合を意味する。多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相直接又は間接放射線免疫アッセイ(RIA)、固相直接又は間接酵素免疫アッセイ(EIA)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli,et al.,1983,Methods in Enzymology,9:242-253);固相直接ビオチン・アビジンEIA(Kirkland,et al.,1986,J.Immunol.137:3614-3619)、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press);1-125標識を用いた固相直接標識RIA(Morel,et al.,1988,Molec.Immunol.25:7-15);固相直接ビオチン・アビジンEIA(Cheung,et al.,1990,Virology,176:546-552);及び直接標識RIA(Moldenhauer,et al.,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)を用いて、一方の抗原結合分子がもう一方の抗原結合分子と競合するかどうかを判定することができる。用語「エピトープ」には、本発明のscFv、抗体又は免疫細胞などの抗原結合分子によって結合され得る任意の決定基が含まれる。エピトープは、その抗原を標的とする抗原結合分子によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合分子と直接接触する特定のアミノ酸を含む。
本明細書で使用する場合、用語「標識」又は「標識される」は、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込みによるか、又は印を付けられたアビジン(例えば、光学法又は比色分析法によって検出することができる蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン)によって検出され得るビオチン部分のポリペプチドの連結による、検出可能なマーカーの組み込みを指す。特定の実施形態では、標識又はマーカーは、治療のためのものでもあり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で既知であり、また使用され得る。
本発明によれば、オン・オフタイプ又は他のタイプの制御スイッチ技法が本明細書に組み込まれ得る。これらの技法は、二量体化ドメイン及びそのようなドメイン二量体化の任意の活性化剤の使用を採用し得る。これらの技法としては、例えば、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、特定の細胞中でFKBP/ラパログ二量体化系を用いるWu,et al.,Science,2014 350(6258)によって説明されるものが挙げられる。更なる二量体化技術は、例えば、その内容全体が参照により同様に本明細書に組み込まれるFegan,et al.Chem.Rev.2010,110,3315~3336並びに米国特許第5,830,462号明細書、同第5,834,266号明細書、同第5,869,337号明細書及び同第6,165,787号明細書で説明される。追加の二量体化ペアとしては、シクロスポリンA/シクロフィリン、受容体、エストロゲン/エストロゲン受容体(任意選択的にタモキシフェンを用いる)、グルココルチコイド/グルココルチコイド受容体、テトラサイクリン/テトラサイクリン受容体、ビタミンD/ビタミンD受容体が挙げられ得る。二量体化技術の更なる例は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に更に組み込まれる国際公開第2014/127261号パンフレット、同第2015/090229号パンフレット、米国特許出願公開第2014/0286987号明細書、同第2015/0266973号明細書、同第2016/0046700号明細書、米国特許第8,486,693号明細書、米国特許出願公開第2014/0171649号明細書及び同第2012/0130076号明細書で見出され得る。
治療方法
養子免疫療法を用いて、ネイティブのT細胞を(i)患者から取り出し、(ii)少なくとも1つの腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子改変し、(iii)エクスビボで改変T細胞の大きい集団に増殖させ、且つ(iv)患者に再導入することができる。例えば、米国特許第7,741,465号明細書及び同第6,319,494号明細書、Eshhar et al.(Cancer Immunol、上記);Krause et al.(上記); Finney et al.(上記)を参照されたい。改変T細胞が患者に再導入された後、これらは、腫瘍抗原を発現している細胞に対する免疫応答を媒介する。例えば、Krause et al.,J.Exp.Med.,Volume 188,No.4,1998(619-626)を参照されたい。この免疫応答としては、T細胞によるIL-2及び他のサイトカインの分泌、腫瘍抗原を認識するT細胞のクローン増殖及びT細胞が媒介する特異的な標的陽性細胞の殺傷が挙げられる。Hombach et al.,Journal of Immun.167:6123-6131(2001)を参照されたい。
したがって、いくつかの態様では、本発明は、患者における望ましくない及び/又は上昇したDLL3レベルに関連する状態を治療又は予防する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書で開示される有効量の少なくとも1つの単離抗原結合分子であるCAR又はTCRを投与することを含む方法を含む。
がんを含む疾患又は障害を治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本発明は、本出願の有効量の改変免疫細胞を対象に投与することを含む、対象中でT細胞が媒介する免疫応答を生成することに関する。いくつかの実施形態では、T細胞が媒介する免疫応答は、標的細胞に向けられる。いくつかの実施形態では、改変免疫細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)を含む。いくつかの実施形態では、標的細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの態様では、本発明は、悪性腫瘍を治療又は予防する方法を含み、前記方法は、それを必要とする対象に、本明細書で説明される有効量の少なくとも1つの単離抗原結合分子を投与することを含む。いくつかの態様では、本発明は、悪性腫瘍を治療又は予防するための方法を含み、前記方法は、それを必要とする対象に、有効量の少なくとも1つの免疫細胞を投与することを含み、ここで、免疫細胞は、本明細書に記載される少なくとも1つのキメラ抗原受容体、T細胞受容体及び/又は単離抗原結合分子を含む。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載される少なくとも1つの抗原結合分子と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、追加の活性剤を更に含む。
本発明の抗原結合分子、CAR、TCR、免疫細胞などは、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺(例えば、前立腺腺癌)、膵臓、肺(小細胞及び非小細胞の両方)、甲状腺、癌腫、肉腫、グリア芽腫、頭頸部腫瘍、大細胞神経内分泌癌(LCNEC)、甲状腺髄様がん、グリア芽腫、神経内分泌前立腺がん(NEPC)、高悪性度胃腸膵がん(GEP)及び悪性黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない骨髄性疾患を治療するのに用いられ得る。
CAR/CAR-T/TCR細胞の標的用量は、好ましくは、1×10~2×1010個の細胞/kg、より好ましくは2×10個の細胞/kgの範囲であり得ることが理解されるであろう。特定の対象には、この範囲を上回る及び下回る用量が適当である場合があり、適当な用量のレベルは、必要に応じて医療サービス提供者によって決定され得ることが理解されるであろう。更に、本発明に従って細胞の複数回用量を提供することができる。
対象における腫瘍の寸法を低減する方法であって、対象に本発明の改変細胞を投与することを含む方法も提供され、ここで、細胞は、キメラ抗原受容体、T細胞受容体を含むか、又は抗原結合分子を含むT細胞受容体ベースのキメラ抗原受容体は、腫瘍上の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、対象は、固形腫瘍又はリンパ腫若しくは白血病などの血液悪性腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、改変細胞は、腫瘍床に送達される。いくつかの実施形態では、がんは、対象の骨髄中に存在する。
いくつかの実施形態では、改変細胞は、自己T細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、同種異系T細胞である。いくつかの実施形態では、改変細胞は、異種T細胞である。いくつかの実施形態では、本出願の改変細胞は、インビボで形質移入又は形質導入される。他の実施形態では、改変細胞は、エクスビボで形質移入又は形質導入される。
方法は、1つ以上の化学療法剤を投与することを更に含み得る。特定の実施形態では、化学療法剤は、リンパ球枯渇(前条件付け)化学療法剤である。有益な前条件付け治療計画は、相関関係にある有益な生体マーカーと共に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第62/262,143号明細書及び同第62/167,750号明細書に記載されている。これらは、例えば、患者に特定の有益用量のシクロホスファミド(200mg/m/日~2000mg/m/日)及び特定用量のフルダラビン(20mg/m/日~900mg/m/日)を投与することを含む、T細胞療法を必要とする患者を条件付けする方法を説明している。好ましい投薬計画は、治療有効量の改変T細胞を患者に投与する前に約500mg/m/日のシクロホスファミド及び約60mg/m/日のフルダラビンを3日間患者に毎日投与することを含む、患者を治療することを伴う。
他の実施形態では、抗原結合分子、形質導入した(又は他の場合には改変した)細胞(CAR又はTCRなど)及び化学療法剤をそれぞれ有効量で投与して、対象における疾患又は状態を治療する。
特定の実施形態では、本明細書で開示されるCARを発現する免疫エフェクター細胞を含む組成物を任意の数の化学療法剤と併用して投与し得る。化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標))などのアルキル化剤;ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート;ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパなどのアジリジン;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチルオロメラミンレジュメを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン;クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード;カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア;アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質;メトトレキサート及び5-フルオロウラシル(5-FU)などの代謝抗物質;デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体;フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体;アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FUなどのピリミジン類似体;カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン;アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤;フォリン酸などの葉酸補充剤;アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトラキセート;デフォファミン;デメコルシン;ジアジクオン;エルフォルミチン;酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシ尿素;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリン酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標);ラゾキサン;シゾフィラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2’,2’’-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン;アラビノシド(「Ara-C」);サイクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル(TAXOL(商標)、Bristol-Myers Squibb)及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer);クロラムブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メソトレキセート;シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イフォスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロネート;CPT-11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチロミチン(DMFO);Targretin(商標)(ベキサロテン)、Panretin(商標)(アリトレチノイン);ONTAK(商標)(デニロイキンディフティトックス)などのレチノイン酸誘導体;エスペラミシン;カペシタビン;並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体が挙げられる。タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン及びトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン;並びに例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン;並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体などの腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤もこの定義に含められる。必要に応じて、CHOP、すなわちシクロホスファミド(Cytoxan(登録商標))、ドキソルビシン(ヒドロキシドキソルビシン)、ビンクリスチン(Oncovin(登録商標))及びプレドニゾンが挙げられるが、これに限定されない化学療法剤の組み合わせも投与される。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、改変細胞又は核酸の投与と同時に又はそれから1週間以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、改変細胞又は核酸の投与後から1~4週間又は1週間~1ヵ月、1週間~2ヵ月、1週間~3ヵ月、1週間~6ヵ月、1週間~9ヵ月若しくは1週間~12ヵ月で投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、細胞又は核酸の投与から少なくとも1ヵ月前に投与される。いくつかの実施形態では、方法は、2つ以上の化学療法剤を投与することを更に含む。
本明細書に記載されている組成物と併せて様々な追加の治療剤が使用され得る。例えば、潜在的に有用な追加の治療剤としては、ニボルマブ(Opdivo(登録商標))、ペムブロリズマブ(Keytruda(登録商標))、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ及びアテゾリズマブなどのPD-1阻害剤が挙げられる。
本発明と併用して使用するのに好適な追加の治療剤としては、イブルチニブ(Imbruvica(登録商標))、オファツムマブ(Arzerra(登録商標))、リツキシマブ(Rituxan(登録商標))、ベバシズマブ(Avastin(登録商標))、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))、トラスツズマブエムタンシン(KADCYLA(登録商標))、イマチニブ(Gleevec(登録商標))、セツキシマブ(Erbitux(登録商標))、パニツムマブ(Vectibix(登録商標))、カツマキソマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アキシチニブ、マシチニブ、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ、レスタウルチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、エントレクチニブ、カボザンチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ラドチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ルキソリチニブ、パクリチニブ、コビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、ビニメチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、アフリベルセプト、アジポチド、デニロイキンディフティトックス、エベロリムス及びテムシロリムスなどのmTOR阻害剤、ソニデジブ及びビスモデジブなどのヘッジホッグ阻害剤、CDK阻害剤(パルボシクリブ)などのCDK阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
追加の実施形態では、CAR含有免疫を含む組成物を抗炎症剤と共に投与することができる。抗炎症剤又は抗炎症薬としては、ステロイド及びグルココルチコイド(ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン酢酸塩、ハイドロコルチゾン、ハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む)、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗TNF薬物、シクロホスファミド及びミコフェノレートを含む非ステロイド性抗炎症薬(NSAIDS)が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なNSAIDとしては、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Cox-2阻害剤及びシアル酸塩が挙げられる。例示的な鎮痛剤としては、アセトアミノフェン、オキシコドン、塩酸プロポルキシフェンのトラマドールが挙げられる。例示的なグルココルチコイドとしては、コルチゾン、デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン又はプレドニゾンが挙げられる。例示的な生物反応調節剤としては、細胞表面マーカー(例えば、CD4、CD5など)に向けられた分子、TNF拮抗剤(例えば、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))及びインフリキシマブ(REMICADE(登録商標))などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤並びに接着分子阻害剤が挙げられる。生物反応調節剤としては、モノクローナル抗体のみならず、分子の組み換え形態が挙げられる。例示的なDMARDとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、ゴールド(経口(アウラノフィン)及び筋肉内)及びミノサイクリンが挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書で説明される組成物は、サイトカインと併用して投与される。本明細書で使用するとき、「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する1つの細胞集団によって放出されるタンパク質を指すことを意味する。サイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含められるのは、ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インスリン;プロインスリン;レラキシン;プロレラキシン;卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)及び黄体形成ホルモン(LH)などの糖タンパク質ホルモン;肝細胞増殖因子(HGF);線維芽細胞増殖因子(FGF);プロラクチン;胎盤性ラクトゲン;ミュラー管抑制物質;マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF-ベータなどの神経増殖因子(NGF);血小板増殖因子;TGF-アルファ及びTGF-ベータなどの形質転換増殖因子(TGF);インスリン様増殖因子I及びII;エリスロポイエチン(EPO);骨誘導因子;インターフェロンアルファ、ベータ及びガンマなどのインターフェロン;マクロファージCSF(M-CSF)などのコロニー刺激因子(CSF);顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF);並びに顆粒球-CSF(G-CSF);IL-1、IL-1アルファ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15などのインターロイキン(IL);TNF-アルファ又はTNF-ベータなどの腫瘍壊死因子;並びにLIF及びkitリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子である。本明細書で使用するとき、用語サイトカインは、天然供給源由来タンパク質、組み換え細胞培養物由来タンパク質及びネイティブ配列のサイトカインの生物学的に活性な均等物を含む。
いくつかの態様では、本発明は、100pMより小さいKでDLL3に結合する抗原結合分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合分子は、10pMより小さいKで結合する。他の実施形態では、抗原結合分子は、5pM未満のKで結合する。
製造方法
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、抗原結合分子、免疫細胞、組成物などを製造するために様々な既知の技法を利用することができる。
本明細書に記載される免疫細胞のインビトロ操作又は遺伝子組み換え前に対象から細胞を入手し得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、T細胞を含む。T細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を含む多くの供給源から入手することができる。特定の実施形態では、T細胞は、FICOLL(商標)分離などの当業者に既知の任意の数の技法を用いて、対象から採取した血液の単位から入手することができる。細胞は、好ましくは、アフェレーシスによって個人の循環血液から入手され得る。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球、顆粒球、B細胞を含むリンパ球、他の有核白血球、赤血球及び血小板を含有する。特定の実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞は、洗浄して血漿分画を取り除き、その後の処理のために適当な緩衝液又は培地に入れられ得る。細胞は、PBSで洗浄され得る。理解されるように、半自動化フロースルー遠心機、例えばCobe(商標)2991細胞処理機、Baxter CytoMate(商標)などを使用することなどによって洗浄工程が用いられ得る。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液又は緩衝液を含むか若しくは含まない他の生理食塩水溶液に再懸濁され得る。特定の実施形態では、アフェレーシス試料の望ましくない成分を取り除き得る。
特定の実施形態では、T細胞は、赤血球を溶解し、例えばPERCOLL(商標)勾配を介した遠心分離を用いて単球を枯渇させることによってPBMCから単離される。CD28、CD4、CD8、CD45RA及びCD45ROT細胞などのT細胞の特定の亜集団を、当技術分野で既知の正又は負の選択技法によって更に単離することができる。例えば、負の選択によるT細胞集団の富化は、負に選択される細胞に固有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせによって達成することができる。本明細書で使用するための1つの方法は、負に選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫付着又はフローサイトメトリーによる細胞の選別及び/又は選択である。例えば、負の選択によってCD4細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的にはCD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及びCD8に対する抗体を含む。フローサイトメトリー及び細胞選別は、本発明で使用するための対象の細胞集団を単離するためにも使用され得る。
PBMCは、本明細書に記載される方法を用いた免疫細胞(CAR又はTCRなど)による遺伝子組み換えに直接使用され得る。特定の実施形態では、PBMCを単離した後、Tリンパ球を更に単離することができ、細胞傷害性Tリンパ球及びヘルパーTリンパ球の両方を遺伝子組み換え及び/又は増殖前又は後のいずれかでナイーブ、メモリー及びエフェクターのT細胞亜集団に選別することができる。
いくつかの実施形態では、CD8細胞のナイーブ、セントラルメモリー及びエフェクターの型のそれぞれに関連する細胞表面抗原を特定することにより、CD8細胞は、これらの細胞に更に選別される。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーT細胞の表現型マーカーの発現は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及びCD127を含み、グランザイムBに対して陰性である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーT細胞は、CD45RO、CD62L、CD8T細胞である。いくつかの実施形態では、エフェクターT細胞は、CD62L、CCR7、CD28及びCD127に対して陰性であり、グランザイムB及びパーフォリンに対して陽性である。特定の実施形態では、CD4T細胞は、亜集団に更に選別される。例えば、CD4Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することにより、ナイーブ、セントラルメモリー及びエフェクター細胞に選別することができる。
T細胞などの免疫細胞は、既知の方法を用いて単離した後で遺伝子組み換えすることができるか、又は遺伝子組み換え前にインビトロで免疫細胞を活性化又は増殖(又は前駆細胞の場合には分化)させることができる。別の実施形態では、T細胞などの免疫細胞を、本明細書に記載されているキメラ抗原受容体によって遺伝子組み換えし(例えば、CARをコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで形質導入し)、続いてインビトロで活性化及び/又は増殖させる。T細胞を活性化及び増殖させる方法は、当技術分野で既知であり、これらは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,905,874号明細書、同第6,867,041号明細書、同第6,797,514号明細書及び国際公開第2012/079000号パンフレットに記載されている。一般に、こうした方法としては、IL-2などの適切なサイトカインを含む培養培地中において、PBMC又は単離されたT細胞と、ビーズ又は他の表面に概ね付着させた抗CD3及び抗CD28抗体などの刺激剤及び共刺激剤とを接触させることが挙げられる。同じビーズに付着させた抗CD3及び抗CD28抗体は、「代理」抗原提示細胞(APC)としての役割を果たす。1つの例は、ヒトT細胞の生理学的活性化に対するCD3/CD28活性化剤/刺激剤システムであるDynabeads(商標)システムである。
他の実施形態では、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,040,177号明細書及び同第5,827,642号明細書並びに国際公開第2012129514号パンフレットに記載されるものなどの方法を使用し、フィーダー細胞並びに適切な抗体及びサイトカインによってT細胞は、活性化及び刺激されて増殖し得る。
本発明のコンストラクト及び改変免疫細胞を製造する特定の方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるPCT出願PCT/米国特許出願公開第15/14520号明細書に記載されている。コンストラクト及び細胞を製造する追加の方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第62/244036号明細書に見出すことができる。
PBMCは、NK細胞又はNKT細胞などの他の細胞傷害性リンパ球を更に含み得ることが理解されるであろう。本明細書で開示されるキメラ受容体のコード配列を運ぶ発現ベクターをヒトドナーのT細胞、NK細胞又はNKT細胞の集団に導入することができる。発現ベクターを運ぶ成功裏に形質導入されたT細胞は、CD3陽性T細胞を単離するためにフローサイトメトリーを用いて選別し、続いて本明細書の他の箇所に記載される当技術分野で既知の抗CD3抗体及びIL-2又は他の方法を用いた細胞活性化に加えて、これらのCAR発現T細胞の数を増やすために更に繁殖させることができる。CAR発現T細胞を、ヒト対象において使用するために保存及び/又は調製するために凍結保存するために、標準の手順が用いられる。一実施形態では、T細胞のインビトロ形質導入、培養及び/又は増殖は、ウシ胎児血清(fetal calf serum)及びウシ胎仔血清(fetal bovine serum)などの非ヒト動物由来生成物の不在下で実施される。
ポリヌクレオチドのクローニングの場合、ベクターを宿主細胞(単離された宿主細胞)に導入してベクター自体の複製を可能にし、それによってその中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅させることができる。クローニングベクターは、複製開始点、プロモータ配列、転写開始配列、エンハンサ配列及び選択可能なマーカーが一般的に挙げられるが、これらに限定されない配列成分を含有し得る。これらの要素は、当業者により必要に応じて選択され得る。例えば、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を促進するために複製開始点を選択し得る。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるベクターを含有する単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクターに含有されるポリヌクレオチドの発現又はクローニングに有用であり得る。好適な宿主細胞としては、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞又は哺乳類細胞などの高等真核細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。この目的のための好適な原核細胞としては、グラム陰性又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば腸内細菌科(Enterobactehaceae)、例えばエシェリキア属(Escherichia)、例えば大腸菌(E.coli)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、プロテウス属(Proteus)、サルモネラ属(Salmonella)、例えばサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア属(Serratia)、例えばセラチア・マルセッセンス(Serratia marcescans)及びシゲラ属(Shigella)並びにバチルス属(Bacilli)、例えばB.サブチリス(B.subtilis)及びB.リケニフォルミス(B.licheniformis)、シュードモナス属(Pseudomonas)、例えば緑膿菌(P.aeruginosa)並びにストレプトミセス属(Streptomyces)が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターは、DEAE-デキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介形質移入、エレクトロポレーション、微粒子銃、受容体媒介遺伝子送達、ポリリシン、ヒストン、キトサン及びペプチド媒介送達が挙げられるが、これらに限定されない当技術分野で既知の任意の好適な方法を用いて、宿主細胞に導入することができる。対象とするベクターを発現させるための、細胞の形質移入及び形質転換のための標準方法は、当技術分野で周知である。更なる実施形態では、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子組み換えするのに様々な発現ベクターの混合物を使用することができ、ここで、各ベクターは、本明細書で開示されるように異なるCARをコードする。得られる形質導入された免疫エフェクター細胞は、改変細胞の混合集団を形成し、改変細胞の一部は、2つ以上の異なるCARを発現する。
一実施形態では、本発明は、DLL3タンパク質を標的とするCAR又はTCRを発現する遺伝子改変細胞を保存するための方法を提供する。これは、解凍時に細胞が生存可能なままであるように免疫細胞を凍結保存することを伴う。CARを発現する免疫細胞の画分を、当技術分野で既知の方法によって凍結保存し、悪性腫瘍を患う患者の将来の治療のための、こうした細胞の永続的な供給源を提供することができる。必要に応じて、凍結保存した形質転換された免疫細胞を解凍し、成長させ、更に多くのこうした細胞に増殖させることができる。
本明細書で使用するとき、「凍結保存する」とは、(典型的には)77ケルビン又は-196℃(液体窒素の沸点)などの氷点下温度に冷却することによる細胞の保存を指す。氷点下温度では、低温での凍結又は室温への加温による損傷から保存された細胞を保護するために凍結保護剤を用いることが多い。凍結保護剤及び最適な冷却速度により、細胞損傷に対する保護が可能である。本発明に従って使用できる凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシド(DMSO)(Lovelock&Bishop,Nature,(1959);183:1394-1395;Ashwood-Smith,Nature,(1961);190:1204-1205)、グリセロール、ポリビニルピロリジン(Rinfret,Ann.N.Y.Acad.Sci.(1960);85:576)及びポリエチレングリコール(Sloviter&Ravdin,Nature,(1962);196:48)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい冷却速度は、1℃~3℃/分である。
用語「実質的に純粋な」は、所与の成分が高濃度で存在することを示すために用いられる。成分は、望ましくは、組成物中に存在する主要成分である。好ましくは、これは、30%超、50%超、75%超、90%超又は更に95%超の濃度で存在し、前記濃度は、検討中の全組成物に対する乾燥重量/乾燥重量基準で決定される。非常に高い濃度(例えば、90%超、95%超又は99%超の濃度)では、その成分は、「純粋形態」であると見なすことができる。本発明の生物学的に活性な物質(ポリペプチド、核酸分子、抗原結合分子、部分を含む)は、他の場合には物質が結合される場合のある1つ以上の不純物を実質的に含まない形態で提供され得る。組成物が所与の不純物を実質的に含まない場合、不純物は、低濃度(例えば、上記で設定した乾燥重量/乾燥重量基準で10%未満、5%未満又は1%未満のレベル)となる。
いくつかの実施形態では、細胞は、最初にこれらの培養培地からこれらを採取し、続いて洗浄し、治療有効量での投与に好適な培地及び容器システム(「薬学的に許容可能な」キャリア)中で細胞を濃縮することによって配合される。好適な注入媒体は、任意の等張媒体配合物、典型的には生理食塩水、Normosol(商標)R(Abbott)又はPlasma-Lyte(商標)A(Baxter)であり得るが、5%デキストロース水溶液又は乳酸リンゲル液を利用することもできる。注入媒体にヒト血清アルブミンを補充し得る。
組成物における細胞の所望の治療量は、一般的には少なくとも2個の細胞(例えば、少なくとも1個のCD8セントラルメモリーT細胞及び少なくとも1個のCD4ヘルパーT細胞のサブセット)であるか、又はより典型的には10個超の細胞及び最大10個、最大10若しくは10個までの細胞であり、また1010個超の細胞であり得る。細胞の数は、組成物が意図される所望の用途及びそれに含まれる細胞の種類に依存する。所望の細胞の密度は、典型的には10個超の細胞/mlであり、一般には10個超の細胞/ml、一般には10個以上の細胞/mlである。免疫細胞の臨床的に関連する数は、累積すると10、10、10、10、10、1010、1011又は1012個の細胞と等しいか又はこれを上回る複数回の注入に分割することができる。本発明のいくつかの態様では、特に注入される細胞の全てが特定の標的抗原(DLL3)に再指向されるため、10/キログラム(患者当たり10~1011)の範囲でのより少ない数の細胞が投与され得る。CAR治療は、これらの範囲内での投与量で複数回投与され得る。細胞は、治療を受ける患者に対して自己、同種異系又は異種であり得る。
本発明のCAR発現細胞集団は、単独で投与され得るか、又は希釈剤及び/又はIL-2、若しくは他のサイトカイン、若しくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。本発明の医薬組成物は、1つ以上の薬学的又は生理的に許容できるキャリア、希釈剤又は賦形剤との組み合わせで、本明細書に記載されるT細胞などのCAR又はTCRを発現する細胞集団を含み得る。こうした組成物は、中性緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などといった緩衝液;グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTA又はグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);及び保存剤を含み得る。本発明の組成物は、好ましくは、静脈内投与のために配合される。
医薬組成物(溶液、懸濁液など)は、注射用水、生理食塩水溶液、好ましくは生理学的生理食塩水、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウムなどの無菌希釈剤、溶媒又は懸濁媒としての役割を果たし得る合成モノグリセリド又はジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の溶媒;ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝液及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの浸透圧を調整するための剤の1つ以上を含み得る。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は複数回投与バイアルに封入することができる。注射可能な医薬組成物は、好ましくは、無菌である。
有害事象は、自殺遺伝子を免疫細胞(1つ以上のCAR又はTCRを含有する)に形質導入することによって最小化され得ることが理解されるであろう。更に、誘導性の「オン」又は「促進」スイッチを免疫細胞に組み込むことが望まれる場合もある。好適な技法としては、細胞に本発明のCARコンストラクトを形質導入する前、後又はそれと同時に誘導性のカスパーゼ-9(米国特許出願公開第2011/0286980号明細書)又はチミジンキナーゼを使用することが挙げられる。自殺遺伝子及び/又は「オン」スイッチを導入する追加の方法としては、TALENS、亜鉛フィンガー、RNAi、siRNA、shRNA、アンチセンス技法及び当技術分野で既知の他の技法が挙げられる。
本明細書の記述は、例示的且つ説明的であるに過ぎず、特許請求される本発明を限定するものでないことが理解されるであろう。本出願では、単数形の使用は、特に断りのない限り複数形を含む。
本明細書で使用される項目の見出しは、単に構成を目的とするものに過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍及び学術論文が挙げられるが、これらに限定されない、本出願で引用される全ての文献又は文献の一部は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本開示に従って利用される場合、以下の用語は、特に断りのない限り、以下の意味を有するものとして理解される。
本出願では、「又は」の使用は、特に断りのない限り「及び/又は」を意味する。更に、用語「含んでいる」並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」又は「構成要素」などの用語は、特に断りのない限り、1つのユニットを含む要素及び構成要素並びに2つ以上のサブユニットを含む要素及び構成要素の両方を包含する。
用語「DLL3活性」には、DLL3の任意の生物学的効果が含まれる。特定の実施形態では、DLL3活性には、基質又は受容体と相互作用又は結合するDLL3の能力が含まれる。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖のヌクレオチドポリマーと二本鎖のヌクレオチドポリマーとの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又はいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。前記改変には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基改変、2’,3’-ジデオキシリボースなどのリボース改変並びにホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホロアニラダート及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間連結の改変が含まれる。
用語「オリゴヌクレオチド」は、200以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築において使用するための一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのための放射標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原性標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRプライマー、クローニングプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
「制御配列」という用語は、それが連結されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物用制御配列は、プロモータ、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物用制御配列は、転写因子のための認識部位を1つ又は複数含むプロモータ、転写エンハンサ配列及び転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列(シグナルペプチド)及び/又は融合パートナー配列を含み得る。
本明細書で使用される「作動可能に連結される」は、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれがその固有機能を実施することが可能になる関係にあることを意味する。
「ベクター」という用語は、宿主細胞へのタンパク質コード情報の導入に使用される任意の分子又は実体(例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス)を意味する。「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、そこに作動可能に連結される1つ又は複数の異種性コード領域の発現を(宿主細胞と協働して)誘導及び/又は制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現コンストラクトは、転写、翻訳に影響を及ぼすか又はそれを制御し、且つイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のRNAスプライシングに影響を及ぼす配列を含み得るが、これらに限定されない。
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されているか又は形質転換され得、それによって目的遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、子孫の形態又は遺伝的構成が元の親細胞と同一であるか否かに関わらず、親細胞の子孫が含まれる。
用語「形質転換」は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、細胞が新しいDNA又はRNAを含有するように修飾されている場合、細胞は、形質転換されている。例えば、形質移入、形質導入又は他の技法を介して新しい遺伝物質を導入することにより、細胞がそのネイティブな状態から遺伝子組み換えされている場合、細胞は、形質転換されている。形質移入又は形質導入に続いて、形質転換しているDNAは、細胞の染色体に物理的に組み込むことによって細胞のDNAと再結合することができるか、又はエピソーム要素として複製することなく一時的に維持されることができるか、又はプラスミドとして独立して複製することができる。形質転換しているDNAが細胞の分裂と共に複製する場合、細胞は、「安定して形質転換」されていると見なされる。
用語「形質移入」は外来性又は外因性DNAの細胞による取り込みを指す。多くの形質移入の技法が当技術分野で周知であり、また本明細書で開示されている。例えば、Graham et al.,1973,Virology 52:456;Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(上述);Davis et al.,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier;Chu et al.,1981,Gene13:197を参照されたい。
用語「形質導入」は、それによってウイルスベクターを介して外来性DNAを細胞に導入するプロセスを指す。Jones et al.,(1998).Genetics:principles and analysis.Boston:Jones&Bartlett Publを参照されたい。
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ネイティブ配列の1つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加及び/又はその置換を含む、タンパク質のアミノ酸配列を有する巨大分子を指す。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、具体的には、DLL3抗原結合分子、抗体又は抗原結合タンパク質の1つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加及び/若しくはその置換を有する配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長のネイティブタンパク質と比較してアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び/又は内部の欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片は、ネイティブタンパク質と比較して改変されたアミノ酸も含み得る。有用なポリペプチド断片としては、抗原結合分子の免疫機能性断片が挙げられる。有用な断片としては、1つ以上のCDR領域、重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の他の部分の一部などが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「単離された」は、(i)通常、それと共に見出される少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、(ii)例えば同一種などの同一源に由来する他のタンパク質を実質的に含まないか、(iii)天然ではそれに結合しているポリヌクレオチド、脂質、糖質若しくは他の物質の少なくとも約50パーセントから分離されているか、(iv)天然ではそれに結合していないポリペプチドと(共有結合的若しくは非共有結合的な相互作用によって)作動可能に結合しているか、又は(v)天然には生じないことを意味する。
ポリペプチド(例えば、抗原結合分子又は抗体)の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列に1つ又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失及び/又は置換が生じたアミノ酸配列を含む。変異体には、融合タンパク質が含まれる。
「同一性」という用語は、配列を整列させ、比較することによって決定される、2つ以上のポリペプチド分子又は2つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較分子におけるアミノ酸又はヌクレオチド間で残基が同一であるパーセントを意味し、比較される分子中で最小のもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、整列におけるギャップ(存在する場合)は、好ましくは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム(すなわち「アルゴリズム」)によって対処される。
同一性パーセントを計算するために、比較される配列は、典型的には配列間の最大の一致が得られる方法で整列される。同一性パーセントを決定するのに使用することができるコンピュータプログラムの一例は、GAPを含むGCGプログラムパッケージである(Devereux et al.,1984,Nucl.Acid Res.12:387;Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)。コンピュータアルゴリズムであるGAPは、配列同一性パーセントが決定されることになる2つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを整列するために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドが最適に一致するように整列される(アルゴリズムによって決定される「一致スパン」)。特定の実施形態では、標準比較マトリックス(PAM 250比較マトリックスについては、Dayhoff et al.,1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352を参照されたい;BLOSUM 62比較マトリックスについては、Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919を参照されたい)もアルゴリズムによって使用される。
本明細書で使用するとき、20種の従来の(例えば、天然に存在する)アミノ酸及びそれらの略称は、慣例的な用法に従う。あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられるImmunology-A Synthesis(2nd Edition,Golub and Gren,Eds.,Sinauer Assoc.,Sunderland,Mass.(1991))を参照されたい。20種の従来のアミノ酸の立体異性体(例えば、D-アミノ酸)、アルファ-、アルファ-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸などの非天然アミノ酸、乳酸及び他の従来のものではないアミノ酸も本発明のポリペプチドにとって好適な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例としては、以下:4-ヒドロキシプロリン、[γ]-カルボキシグルタミン酸、[ε]-N,N,N-トリメチルリシン、e-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、[σ]-N-メチルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプロリン)が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な用法及び慣例に従い、左手方向は、アミノ末端方向であり、右手方向は、カルボキシ末端方向である。
保存的アミノ酸置換は、非天然起源のアミノ酸残基も包含し得、こうした非天然起源のアミノ酸残基は、一般的には、生物学的な系における合成によってではなく、化学的なペプチド合成によって組み込まれる。こうしたものには、ペプチド模倣体及びアミノ酸部分が逆転又は反転した他の形態が含まれる。天然起源の残基は、下記の共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる:
a)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
b)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
c)酸性:Asp、Glu;
d)塩基性:His、Lys、Arg;
e)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;及び
f)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
例えば、非保存的置換は、こうしたクラスの1つのメンバーと、別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。そのような置換残基は、例えば、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域又は分子の非相同領域に導入することができる。
特定の実施形態による、改変T細胞の抗原結合分子、共刺激ドメイン又は活性化ドメインに変化を加える上でアミノ酸の疎水性指標が検討され得る。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシー指数が割り当てられている。これらは、イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(-0.4);トレオニン(-0.7);セリン(-0.8);トリプトファン(-0.9);チロシン(-1.3);プロリン(-1.6);ヒスチジン(-3.2);グルタミン酸(-3.5);グルタミン(-3.5);アスパラギン酸(-3.5);アスパラギン(-3.5);リシン(-3.9);及びアルギニン(-4.5)である。Kyte et al.,J.Mol.Biol.,157:105-131(1982)を参照されたい。特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシー指数又はハイドロパシースコアを有する他のアミノ酸の代わりとなり得、依然として類似の生物学的活性を保持し得ることが知られている。同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効率的に実施できることも当技術分野において理解されており、特に、それによって創出される生物学的機能性タンパク質又はペプチドの意図は、今回の場合のように免疫学的な実施形態における使用である場合、当技術分野においてそのようにも理解される。表2に例示的なアミノ酸置換を記載する。
Figure 0007479290000018
用語「誘導体」は、アミノ酸(又は核酸)の挿入、欠失又は置換以外の化学修飾を含む分子を指す。特定の実施形態では、誘導体は、ポリマー、脂質又は他の有機若しくは無機部分との化学結合が挙げられるが、これらに限定されない共有結合の修飾を含む。特定の実施形態では、化学的に修飾された抗原結合分子は、化学的に修飾されていない抗原結合分子よりも長い循環半減期を有し得る。いくつかの実施形態では、誘導体の抗原結合分子は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない1つ以上の水溶性ポリマーの連結を含むように共有結合で修飾される。
ペプチド類似体は、テンプレートペプチドの特性に類似する特性を有する非ペプチド薬剤として製薬業界で商業的に使用されている。非ペプチド化合物のこれらのタイプは「ペプチド模倣薬(peptide mimetics)」又は「ペプチド模倣物(peptidomimetics)」と呼ばれる。Fauchere,J.,Adv.Drug Res.,15:29(1986);Veber&Freidinger,TINS,p.392(1985);及びEvans et al.,J.Med.Chem.,30:1229(1987)(これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる)。
用語「治療有効量」は、哺乳類において治療応答を生じると決定されたDLL3抗原結合分子の量を指す。こうした治療有効量は、当業者によって容易に確認される。
用語「患者」及び「対象」は、互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物対象並びに正式に診断された障害を有する対象、正式に認識された障害を有さない対象、治療を受けている対象、障害を発症するリスクのある対象などを含む。
用語「治療する」及び「治療」は、治療、予防的治療及び対象が障害又は他のリスク因子を発症する危険性を低減する適用を含む。治療は、障害の完全な治癒を要求されず、症状又は内在するリスク因子を低減する実施形態を包含する。「予防」という用語は、事象の可能性を100%排除することを要求しない。むしろ、それは、事象の発生の可能性が化合物又は方法の存在下で低減されたことを意味する。
組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成並びに組織培養及び形質転換に標準的な手法(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)を使用することができる。酵素反応及び精製手法は、製造業者の仕様書に従って又は当技術分野で一般に行われているように若しくは本明細書に記載されているように行うことができる。上記手法及び手順は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従い、また本明細書全体にわたって引用され、説明されている様々な一般的且つより具体的な参考文献に記載されるように実施することができる。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))を参照されたい(この文献は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる)。
以下の配列は、本発明を更に例示するであろう。
CD28T DNA 細胞外、膜貫通、細胞内
Figure 0007479290000019
CD28T 細胞外、膜貫通、細胞内 AA:
Figure 0007479290000020
CD28T DNA - 細胞外
Figure 0007479290000021
CD28T AA - 細胞外
Figure 0007479290000022
CD28 DNA 膜貫通ドメイン
Figure 0007479290000023
CD28 AA 膜貫通ドメイン:
Figure 0007479290000024
CD28 DNA 細胞内ドメイン:
Figure 0007479290000025
CD28 AA 細胞内ドメイン
Figure 0007479290000026
CD3ゼータ DNA
Figure 0007479290000027
CD3ゼータ AA
Figure 0007479290000028
CD28 DNA
Figure 0007479290000029
CD28 AA
Figure 0007479290000030
CD8 DNA 細胞外及び膜貫通ドメイン
Figure 0007479290000031
CD8 AA 細胞外及び膜貫通ドメイン
Figure 0007479290000032
4-1BB DNA 細胞内ドメイン
Figure 0007479290000033
4-1BB AA 細胞内ドメイン
Figure 0007479290000034
クローン1H2.1 HC DNA
Figure 0007479290000035
クローン1H2.1 HC AA - CDRは、下線付き
Figure 0007479290000036
クローン1H2.1 HC AA CDR1:
Figure 0007479290000037
クローン1H2.1 HC AA CDR2:
Figure 0007479290000038
クローン1H2.1 HC AA CDR3:
Figure 0007479290000039
クローン1H2.1 LC DNA
Figure 0007479290000040
クローン1H2.1 LC AA(CDRは、下線付き)
Figure 0007479290000041
クローン1H2.1 LC CDR1 AA:RASQSVSSSYLA(配列番号47)
クローン1H2.1 LC CDR2 AA:GASTRAT(配列番号48)
クローン1H2.1 LC CDR3 AA:QQYGTSPLT(配列番号49)
クローン8D2 HC DNA
Figure 0007479290000042
クローン8D2 HC AA(CDRは、下線付き)
Figure 0007479290000043
クローン8D2 HC AA CDR1:GYYMH(配列番号52)
クローン8D2 HC AA CDR2:WIDPNSGDTNYAQKFQG(配列番号53)
クローン8D2 HC AA CDR3:DPNRRSWYYGMDV(配列番号54)
クローン8D2 LC DNA
Figure 0007479290000044
クローン8D2 LC AA(CDRは、下線付き)
Figure 0007479290000045
クローン8D2 LC AA CDR1:QASQDIRNYLN(配列番号57)
クローン8D2 LC AA CDR2:DASNLET(配列番号58)
クローン8D2 LHC AA CDR3:QHYDNLPLTF(配列番号59)
クローン6B2 HC DNA
Figure 0007479290000046
クローン6B2 HC AA(CDRは、下線付き)
Figure 0007479290000047
クローン6B2 HC AA CDR1:GYYMH(配列番号62)
クローン6B2 HC AA CDR2:WINPNSGDTSYAQRFLG(配列番号63)
クローン6B2 HC AA CDR3:EDDSSWYGSFDY(配列番号64)
クローン6B2 LC DNA
Figure 0007479290000048
クローン6B2 LC AA(CDRは、下線付き)
Figure 0007479290000049
クローン6B2 LC AA CDR1:RASQGIRNYLG(配列番号67)
クローン6B2 LC AA CDR2:AASSLQS(配列番号68)
クローン6B2 LC AA CDR3:LQHDSDLRTF(配列番号69)
コンストラクト1H2.1 4-1BB DNA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000050
コンストラクト1H2.1 4-1BB AA(シグナル配列は、太字、CDRは、下線付き)
Figure 0007479290000051
コンストラクト1H2.1 CD28T DNA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000052
コンストラクト1H2.1 CD28T AA(シグナル配列は、太字、CDRは、下線付き)
Figure 0007479290000053
コンストラクト8D2 4-1BB DNA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000054
コンストラクト8D2 4-1BB AA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000055
コンストラクト8D2 CD28T DNA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000056
コンストラクト8D2 CD28T AA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000057
コンストラクト6B2 CD28T DNA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000058
コンストラクト6B2 CD28T AA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000059
コンストラクト6B2 4-1BB DNA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000060
コンストラクト6B2 4-1BB AA(シグナル配列は、太字)
Figure 0007479290000061
ヒトDLL3 イソ型 1 NM_016941 AA(618個のアミノ酸)
Figure 0007479290000062
ヒトDLL3 イソ型 2 NM_203486 AA(587個のアミノ酸)
Figure 0007479290000063
CAR シグナルペプチド DNA
Figure 0007479290000064
CAR シグナルペプチド:MALPVTALLLPLALLLHAARP(配列番号32)
scFv G4Sリンカー DNA
GGCGGTGGAGGCTCCGGAGGGGGGGGCTCTGGCGGAGGGGGCTCC(配列番号33)
scFv G4sリンカー:GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号34)
scFv Whitlowリンカー DNA
GGGTCTACATCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGTGGCGAAGGTAGTACAAAGGGG(配列番号35)
scFv Whitlowリンカー:GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号36)
4-1BB 核酸配列(細胞内ドメイン)
Figure 0007479290000065
4-1BB AA(細胞内ドメイン)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(配列番号38)
OX40AA
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI(配列番号39)
参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれることが示された場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる参考文献において提供される定義又は用語が、本明細書において提供される用語及び考察と異なる限り、本用語及び定義が優先される。
均等物
前述の本明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳細に説明し、本発明者らによって考えられた最良の形態を記載するものである。しかし、前述の内容がいかに詳細に記載されていたとしても、本発明は、多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って本発明が解釈されるべきであることが理解されるであろう。
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例1
異なるCARコンストラクトを含有する第3世代レンチウイルス導入ベクターをViraPower Lentiviral Packaging Mix(Life Technologies)と共に使用して、レンチウイルス上清を生成した。手短に言えば、600μlのOptiMEM培地中で15μgのDNAと22.5μlのポリエチレンイミン(Polysciences、1mg/ml)とを混合することによって形質移入混合物を生成した。この混合物を室温で5分間インキュベートした。同時に、293T細胞(ATCC)をトリプシン処理し、計数し、合計で10×106個の全細胞を形質移入混合物と共にT75フラスコに入れた。形質移入から3日後、上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過し、使用するまで-80℃で保存した。製造元の指示に従い、Ficoll-paque密度遠心分離を用いて健康なドナーのロイコパック(leukopaks)(Hemacare)からPBMCを単離した。R10培地+IL-2(300IU/ml、Proleukin(登録商標)、Prometheus(登録商標)Therapeutics and Diagnostics)中でOKT3(50ng/ml(Miltenyi Biotec))を用いてPBMCを刺激した。刺激から48時間後、MOI=10でレンチウイルスを用いて細胞に形質導入した。活性アッセイで使用する前に細胞を0.5~2.0×106個の細胞/mlに維持した。CARの発現を調べるため、4℃で30分間、染色緩衝液(BD Pharmingen)中のDLL3-Fc検出試薬(Amgen,Inc.)又はビオチン化タンパク質L(Thermo Scientific)によってT細胞を染色した。続いて、細胞を洗浄し、4℃で30分間、染色緩衝液中の抗-Fc-PE(Miltenyi Biotec)又はPEストレプトアビジン(BD Pharmingen)によって染色した。続いて、細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen)によって染色緩衝液中で再懸濁させてからデータを取得した。健康なドナーに由来するT細胞中のDLL3 CARの発現を図1に示す。各欄中の数字は、陽性集団の割合を示す。
実施例2
レンチウイルスで形質導入したDLL3 CAR T細胞における細胞溶解活性を調べるために、エフェクター細胞をR10培地中で1:1のE:T比で標的細胞と共に培養した。共培養から16時間及び40時間後、上清をLuminex(EMD Millipore)によって分析し、CD3陰性細胞によるヨウ化プロピジウム(PI)取り込みのフローサイトメトリー分析によって標的細胞の生存率を評価した。健康なドナーに由来するレンチウイルスで形質導入したCAR T細胞の平均細胞溶解活性を図2に示し(EoL1細胞、は対照であり、H82及びEoL1-DLL3は、その表面にDLL3を発現する)、健康なドナーに由来するCAR T細胞によるサイトカインの産生を図3に示す。
実施例3
DLL3を発現している標的細胞に応答したCAR T細胞の増殖を評価するために、R10培地中で1:1のE:T比で標的細胞と共培養する前にT細胞をCFSEで標識した。5日後、CFSEの希釈のフローサイトメトリー分析によってT細胞の増殖を評価した(図4)。DLL3 CAR T細胞の増殖を図5に示す。
実施例4
インビボ抗腫瘍活性を調べるために、ヒトSCLCの異種モデルで使用するためのDLL3 CAR T細胞を生成した。ルシフェラーゼで標識したSHP-77細胞(2×106個/動物)を5~6週齢のメスNSGマウスに静脈内注射した。6日後、200μlのPBS中の6×106個のT細胞(約50%CAR+)を静脈内注射し、生物発光画像法を用いて動物の全身腫瘍組織量を毎週測定した。図6に示すように、DLL3 CAR T細胞の注射により、調べた全ての時点で全身腫瘍組織量は、有意に低下した(nt=形質移入されていない対照;CAR1=1H2.1-C28T-CD28-CD3ζ;CAR2=1H2.1-C28T-4-1BB-CD3ζ;CAR3=1H2.1-C8k-CD28-CD3ζ;CAR4=1H2.1-C8k-4-1BB-CD3ζ)。図6に示すように、1H2-CD28T又は1H2-4-1BBを発現するCAR T細胞の注射により、疑似形質導入された細胞を受けた動物と比較して有意な延命効果が得られたという生存率分析により、これは、更に裏付けられた。

Claims (15)

  1. DLL3に特異的に結合する抗原結合分子を含む、キメラ抗原受容体であって、
    前記抗原結合分子は、以下の(a)~():
    a)それぞれ配列番号42、配列番号43、及び配列番号44のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、2、及び3を含む可変重鎖領域、及び、それぞれ配列番号47、配列番号48、及び配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR1、2、及び3を含む可変軽鎖領域;又は
    b)それぞれ配列番号52、配列番号53、及び配列番号54のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、2、及び3を含む可変重鎖領域、及び、それぞれ配列番号57、配列番号58、及び配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR1、2、及び3を含む可変軽鎖領域;又は
    c)それぞれ配列番号62、配列番号63、及び配列番号64のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、2、及び3を含む可変重鎖領域、及び、それぞれ配列番号67、配列番号68、及び配列番号69のアミノ酸配列を有するCDR1、2、及び3を含む可変軽鎖領域;又は
    d)配列番号41のVH領域及び配列番号46のVL領域;又は
    e)配列番号51のVH領域及び配列番号56のVL領域;又は
    f)配列番号61のVH領域及び配列番号66のVL領域;又は
    g)(d)において特定された配列に対して少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有するVH領域及びVL領域であって、それぞれ配列番号42、配列番号43、及び配列番号44のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、2、及び3を含むVH領域、及び、それぞれ配列番号47、配列番号48、及び配列番号49のアミノ酸配列を有するCDR1、2、及び3を含むVL領域;又は
    h)(e)において特定された配列に対して少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有するVH領域及びVL領域であって、それぞれ配列番号52、配列番号53、及び配列番号54のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、2、及び3を含むVH領域、及び、それぞれ配列番号57、配列番号58、及び配列番号59のアミノ酸配列を有するCDR1、2、及び3を含むVL領域;又は
    i)(f)において特定された配列に対して少なくとも90%の同一性、又は少なくとも95%の同一性を有するVH領域及びVL領域であって、それぞれ配列番号62、配列番号63、及び配列番号64のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)1、2、及び3を含むVH領域、及び、それぞれ配列番号67、配列番号68、及び配列番号69のアミノ酸配列を有するCDR1、2、及び3を含むVL領域
    から選択されるVH領域及びVL領域を含み、
    前記キメラ抗原受容体は、少なくとも1つの共刺激ドメインを更に含み、
    前記共刺激ドメインは、配列番号2、配列番号4、又は、配列番号6若しくは配列番号8と組み合わせた配列番号4の配列を有する配列を含む、又は、配列番号14、又は配列番号8と組み合わせた配列番号14の配列を有するCD8共刺激ドメインを含む、キメラ抗原受容体。
  2. 少なくとも一つの活性化ドメインをさらに含む、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
  3. 活性化ドメインはCD3を含み、前記CD3は、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1又は0個以下のアミノ酸残基において配列番号10の配列と異なるCD3ゼータを含む、請求項2に記載のキメラ抗原受容体。
  4. 性化ドメインは、配列番号10の配列を含む、請求項に記載のキメラ抗原受容体。
  5. 請求項1に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
  6. 請求項5に記載のポリヌクレオチドを含み、レトロウイルスベクター、DNAベクター、プラスミド、RNAベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルス随伴ベクター、レンチウイルスベクター又はこれらの任意の組み合わせであるベクター。
  7. 請求項6に記載のベクターを含み、T細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、NK細胞、TCR発現細胞、樹状細胞又はNK-T細胞である、免疫細胞。
  8. 同種異系のT細胞である、請求項7に記載の免疫細胞。
  9. 自己のT細胞である、請求項7に記載の免疫細胞。
  10. ベクターは、患者の身体から単離された細胞、又は患者の身体から採取された試料から増殖された細胞に導入される、請求項9に記載の免疫細胞。
  11. 請求項8に記載の免疫細胞を含む医薬組成物。
  12. VH及びVL領域は、少なくとも1つのリンカーによって連結され、リンカーは、scFv G4Sリンカー又はscFv Whitlowリンカーを含む、請求項1に記載のキメラ抗原受容体。
  13. 請求項1に記載のキメラ抗原受容体、請求項7に記載の細胞、又は請求項8に記載の免疫細胞を含む、治療が必要な対象における疾患又は障害を治療するための医薬組成物であって、前記疾患又は障害ががんである、医薬組成物。
  14. がんは、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頸部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺(例えば、前立腺腺癌)、膵臓、肺(小細胞及び非小細胞の両方)、甲状腺、癌腫、肉腫、グリア芽腫、頭頸部腫瘍、大細胞神経内分泌癌(LCNEC)、甲状腺髄様がん、グリア芽腫、神経内分泌前立腺がん(NEPC)、高悪性度胃腸膵がん(GEP)及び悪性黒色腫である、請求項13に記載の医薬組成物。
  15. ベクターはレンチウイルスベクターであり、前記レンチウイルスベクターは、pGARベクターである、請求項6に記載のベクター。
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