JP7333547B2 - Amino acid quantification method and amino acid quantification kit - Google Patents
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Description
本発明は、アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット等に関する。 The present invention relates to an amino acid quantification method, an amino acid quantification kit, and the like.
Ｌ－アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）は、生体内のタンパク質の構成成分として重要な役割を担っており、その種類は２０種類である。Ｌ－アミノ酸の機能性に関し多くの研究がなされ、Ｌ－アミノ酸は、医薬品、加工食品、健康食品など様々な産業で使用されている。例えば、食品中の遊離のＬ－アミノ酸は、味、加熱後の香り、保存性、摂取後の生体調節機能等に関係しており、食品科学や栄養科学分野における重要な要素として注目されている。また、近年、疾病により血液中のＬ－アミノ酸濃度が変化することが見いだされ、血液中のアミノ酸濃度を測定することで、肺がん、胃がん、大腸がんなどのがん診断を可能とするバイオマーカーとしても活用されている。その為、アミノ酸定量技術は、アミノ酸を使用する製品開発、品質管理、診断などの様々な分野で必要不可欠な技術となっている。 L-amino acids (L-AA) play an important role as constituents of proteins in vivo, and there are 20 types of them. Many studies have been made on the functionality of L-amino acids, and L-amino acids are used in various industries such as pharmaceuticals, processed foods, and health foods. For example, free L-amino acids in food are related to taste, aroma after heating, preservability, bioregulatory function after ingestion, etc., and are attracting attention as an important factor in the fields of food science and nutritional science. . In recent years, it has been found that the L-amino acid concentration in the blood changes depending on the disease, and by measuring the amino acid concentration in the blood, it is a biomarker that enables cancer diagnosis such as lung cancer, stomach cancer, and colon cancer. It is also used as Therefore, amino acid quantification technology has become an indispensable technology in various fields such as product development, quality control, and diagnosis using amino acids.
Ｌ-アミノ酸のアミノ酸定量技術として、アミノ酸を液体クロマトグラフィーで分離し、ニンヒドリンや蛍光誘導体化剤オルトフタルアルデヒドによる呈色反応で検出する方法が知られている（非特許文献１）。しかし、該方法は、１検体の分析時間が２時間程度必要なため分析時間がかかり、多数の検体を測定するには不向きであるという問題点があった。 As an amino acid quantification technique for L-amino acids, a method is known in which amino acids are separated by liquid chromatography and detected by color reaction with ninhydrin or a fluorescent derivatizing agent, orthophthalaldehyde (Non-Patent Document 1). However, this method has the problem that it takes about 2 hours to analyze one specimen, and thus it is not suitable for measuring a large number of specimens.
別のアミノ酸定量技術として、Ｌ-アミノ酸に作用する酵素を利用するアミノ酸の測定方法が知られている（特許文献１）。しかし、該方法は目的基質とするアミノ酸に対する選択性が低く、目的以外のアミノ酸にも反応する、また、２０種類のアミノ酸に対応する酵素がないという問題点があった。 As another amino acid quantification technique, a method for measuring amino acids using an enzyme acting on L-amino acids is known (Patent Document 1). However, this method has problems in that it has low selectivity for amino acids as target substrates, reacts with amino acids other than target amino acids, and there is no enzyme corresponding to 20 types of amino acids.
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）は、生体内のタンパク質合成に係る酵素であり、以下の反応式１及び２に従って、アミノアシルｔＲＮＡを産生する。２０種類のＬ-アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）に対し特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在する。その為、標的とするアミノ酸及び転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）に対する選択性が極めて高い酵素であるとされている。
ＡＡＲＳの内、グルタミン酸に作用するグルタミルｔＲＮＡ合成酵素、グルタミンに作用するグルタミニルｔＲＮＡ合成酵素及びアルギニンに作用するアルギニルｔＲＮＡ合成酵素の３種類のＡＡＲＳについては、以下の反応式３～５に従って、ｔＲＮＡとＡＡＲＳが予め会合し、活性化されなければＡＡＲＳ反応が起こらないことが報告されている（非特許文献２）。
当該反応では、ピロリン酸（ＰＰｉ）が産生されると共に、ＡＡＲＳにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、Ｌ-アミノ酸（Ｌ-ＡＡ）及びｔＲＮＡが１分子ずつ作用することで、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体という反応中間体を形成する。該複合体に於いて、アミノアシルＡＭＰは、通常、ＡＡＲＳに強く結合しているため、ｔＲＮＡ又は求核剤（アミン類）を加えて複合体を分解しない限り上記のＡＡＲＳ反応は進まないとされている（特許文献２、非特許文献３～４）。
In the reaction, pyrophosphate (PPi) is produced, and adenosine triphosphate (ATP), L-amino acid (L-AA), and tRNA act on AARS one molecule each to produce aminoacyl adenylic acid (aminoacyl AMP )-AARS-tRNA complex. In the complex, aminoacyl AMP is usually strongly bound to AARS, so the above AARS reaction does not proceed unless tRNA or a nucleophilic agent (amines) is added to decompose the complex. (
このようなＡＡＲＳが関与する反応（ＡＡＲＳ反応）については、非特許文献５や非特許文献６のように放射線ラベルを使用した方法で確認されており、本方法を利用したＬ-アミノ酸の定量技術がこれまで開発されてきた。例えば、非特許文献７では、反応式１と反応式２のＡＡＲＳ反応に基づき、放射線ラベルをした測定対象アミノ酸を用い、ＡＴＰ、ｔＲＮＡとＡＡＲＳを作用させ、産生したアミノアシルｔＲＮＡをビーズに吸着させ、その放射線量を測定することで測定対象アミノ酸を測定する方法が記載されている。しかしながら、該方法では、放射線ラベルした測定対象アミノ酸が不可欠であり、放射線ラベルをした測定対象アミノ酸が取り扱える施設や設備が必要である。また、ビーズの吸着、分離などの煩雑な操作も必要である。さらに反応式１と２のＡＡＲＳ反応に基づくため、ＡＡＲＳが1分子のアミノ酸とＡＴＰと反応し、1分子のアミノアシルｔＲＮＡを産生するため、試料中のｔＲＮＡと同量かそれ以下のピロリン酸しか産生されない。従って、該方法では、微量な反応産物であるアミノアシルｔＲＮＡを検出する必要があり、放射線ラベルをした測定対象アミノ酸が必要不可欠だとされている（特許文献２の段落番号００１２）。
Such reactions involving AARS (AARS reactions) have been confirmed by methods using radiolabels, as in
また、例えば、以下の反応式６で示される反応に基づくアミノ酸の分析方法が特許文献３に記載されている。
該方法に於いては、ＡＡＲＳがＡＴＰ及びＬ-アミノ酸と結合する際に生じるピロリン酸を指標とすることによりＬ-アミノ酸を分析する（特許文献３、非特許文献８、９、１０）。しかしながら、反応式６からも分かるように、当該方法は、ｔＲＮＡを添加せず反応させる方法であり、ｔＲＮＡとＡＡＲＳが予め会合し、活性化されなければならないＡＡＲＳでは、反応が起こらない方法である。 In this method, L-amino acids are analyzed using pyrophosphate produced when AARS binds to ATP and L-amino acids as an index (Patent Document 3, Non-Patent Documents 8, 9, 10). However, as can be seen from reaction formula 6, this method is a method of reacting without adding tRNA, and is a method in which tRNA and AARS are pre-associated with AARS, which must be activated, so that no reaction occurs. .
更に、ｔＲＮＡを添加せず、反応式１と２のＡＡＲＳ反応に基づいてＬ-アミノ酸を定量する方法が、特許文献２及び特許文献４に記載されている。即ち、前述の通りアミノアシルＡＭＰは、通常、ＡＡＲＳに強く結合してアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成している。そこで、該方法では、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンなどのアミン類（求核剤）を添加することで、ＡＡＲＳを再び反応可能な状態とし、その結果、少量のＡＡＲＳでＬ-アミノ酸を定量することを特徴とする。しかしながら、特許文献２及び特許文献４に記載の該複合体分解試薬が複合体のＬ-アミノ酸と反応して化合物が産生される（例えば、特許文献２の段落番号００３７に示されるように、該複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンを使用した場合は、「アミノ酸ヒドロキサム酸」が産生される）ため、Ｌ-アミノ酸は再利用することが出来ず、その結果、試料中のＬ-アミノ酸と同等量の産生物であるピロリン酸しか得られない（特許文献２の段落番号００２３）。
Furthermore,
また、該方法はｔＲＮＡを添加せず反応させる方法であり、ｔＲＮＡとＡＡＲＳが予め会合し、活性化されなければならないＡＡＲＳでは、反応が起こらない。因みに、特許文献２では、ｔＲＮＡとＡＡＲＳが予め会合し、活性化されなければならないＡＡＲＳについては、ｔＲＮＡを添加すれば良いとしており、添加するｔＲＮＡは、測定対象のアミノ酸と同等に高いモル濃度にする必要がなく、ＡＡＲＳと同等に低いモル濃度添加すれば十分であることが記載されている（特許文献２の段落番号００１２）。また、反応式１と２のＡＡＲＳ反応に基づく該方法において、ｔＲＮＡを使用する場合、アミノアシルｔＲＮＡを構成するｔＲＮＡは再利用することが出来ず、その結果、試料中のｔＲＮＡ量に反応が制限されることとなり、ｔＲＮＡと同等量の産生物であるピロリン酸しか得られない。以上のことから、反応式１と２のＡＡＲＳ反応に基づく該方法は、ｔＲＮＡやＬ-アミノ酸の再利用をしないため、ｔＲＮＡ又はＬ-アミノ酸と同等量のピロリン酸しか得ることができない、また、ＡＡＲＳ反応で生じたピロリン酸を多段階の酵素反応により検出しているため、煩雑であるとともに、血中の夾雑物やその他の外部要因により各酵素が影響を受けやすいことが懸念される。
In addition, this method is a method of reacting without adding tRNA, and reaction does not occur with AARS, which must be pre-associated with tRNA and AARS and activated. Incidentally, in
実際に、特許文献２には、こうして予めｔＲＮＡと会合されたＡＡＲＳから形成されるアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体にヒドロキシルアミンなどのアミン類（求核剤）を作用させた場合に、該複合体からＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物が遊離されて、これらが再び反応可能な状態となり、その結果、Ｌ-アミノ酸が定量出来ることは何ら記載ないし示唆されていないし、また、そのような事実を示した実施例は開示されていない。
In fact, in
一方、別のＡＡＲＳ反応としては、例えば、以下の反応式７と８の反応が知られている。当該反応では、ＡＡＲＳにＡＴＰ及びＬ-アミノ酸が１分子ずつ作用することで、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成する。次いで該複合体にＡＴＰ、ＧＴＰ等を作用させることによって、医薬品や医薬品原料として期待されているジアデノシン四リン酸（Ａｐ４Ａ）等のジアデノシンポリリン酸（ＡｐｎＡ）及びアデノシングアノシンテトラリン酸（Ａｐ４Ｇ）等が合成・製造されている（特許文献５、特許文献６、非特許文献１１、非特許文献１２）。
当該反応の反応式７は、ピロリン酸の存在下では逆反応が促進され、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からアミノ酸、ＡＡＲＳ及びＡＴＰが産生される。その為、当該反応を進めるためには、逆反応を生じなくさせる必要があり、上記の公知文献に記載の技術では、反応式７で産生される不必要なピロリン酸を分解するため、ピロリン酸を分解する無機ピロホスファターゼが使用されている。更に、これら公知文献に記載された技術は、あくまで、ＡｐｎＡ及びＡｐ４Ｇ等の合成・製造に関するものであって、アミノ酸の定量に関する技術的課題を解決することを目的とするものではない。実際に、これら公知文献には、上記の反応式７と８のＡＡＲＳ反応を活用したアミノ酸の定量については何ら言及されておらず、反応式８に於いて生じるアミノ酸及びＡＡＲＳの再利用に関しても一切触れられていない。 In Reaction Scheme 7 of the reaction, the reverse reaction is promoted in the presence of pyrophosphate to produce amino acids, AARS and ATP from the aminoacyl AMP-AARS complex. Therefore, in order to proceed with the reaction, it is necessary to prevent the reverse reaction from occurring. Inorganic pyrophosphatase is used to degrade Furthermore, the techniques described in these publications relate only to synthesis and production of ApnA, Ap4G, etc., and are not intended to solve technical problems related to quantification of amino acids. In fact, these known documents do not mention the quantification of amino acids utilizing the AARS reactions of the above reaction schemes 7 and 8, and there is no mention of the reuse of the amino acids and AARS generated in reaction scheme 8. not touched.
また、反応式７と８のＡＡＲＳ反応に基づいた、Ｌ体及びＤ体のアミノ酸を定量する方法が、特許文献７に記載されている。この方法では、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体からＡＡＲＳ及びアミノ酸を遊離させ、それらを再度、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体の形成に利用することによって、最終的に、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させることを特徴とする。しかしながら、該発明は、ｔＲＮＡとＡＡＲＳが予め会合し、活性化されなければならないＡＡＲＳに関して何ら触れられていない。更に、特許文献７には、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体から、ＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物が遊離され、これらが再利用できる可能性については記載ないし示唆されていない。 Further, a method for quantifying L- and D-amino acids based on the AARS reactions of Reaction Schemes 7 and 8 is described in Patent Document 7. In this method, the AARS and amino acids are released from the once-formed aminoacyl AMP-AARS conjugate, and these are again used to form the aminoacyl AMP-AARS conjugate, thereby finally obtaining pyrophosphate, which is the object of measurement. It is characterized in that the reaction product such as is produced up to the number of moles greater than the number of moles of amino acids contained in the sample. However, the invention makes no mention of AARS, in which tRNA and AARS must be pre-associated and activated. Furthermore, in Patent Document 7, AA and at least one or more compounds selected from the group consisting of AARS, AARS-tRNA complex and tRNA are released from the aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, and these are regenerated. No mention or suggestion of availability.
本発明は、上記のアミノ酸定量法に関する従来技術に於ける様々な問題点を解決し、ＡＡＲＳを用いて、測定対象のアミノ酸を選択的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供することを目的とする。 The present invention solves various problems in the prior art related to the above amino acid quantification method, and provides a method and a kit for amino acid quantification that selectively, easily, and highly sensitively quantifies an amino acid to be measured using AARS. intended to provide
発明者らは、種々の検討を行った結果、ＡＡＲＳを用いて試料中のアミノ酸（Ｌ体及びＤ体）、特に、グルタミン酸、グルタミン及びアルギニンの量を定量する方法に於いて、図１に示すように、試料中のアミノ酸（ＡＡ）に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）及び転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を反応させて、ＡＡＲＳとｔＲＮＡから成る複合体（ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体）を形成させ、このＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体とアミノ酸及びＡＴＰと反応させてアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体を形成させ、次いで、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体（該複合体から生成され得るＡＡＲＳ及びアミノアシルｔＲＮＡも含む）とアミノ酸再生試薬（ヌクレオチド又は、アルカリ性化合物）を反応させることによって、該複合体から、ＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させ、それらを再度、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体の形成に利用することによって、最終的に、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物が、反応液中に含まれるｔＲＮＡ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生され得ることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of various studies, the inventors have found a method for quantifying the amount of amino acids (L-form and D-form) in a sample using AARS, particularly glutamic acid, glutamine and arginine, as shown in FIG. As described above, aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) and transfer RNA (tRNA) corresponding to amino acids (AA) in a sample are reacted to form a complex (AARS-tRNA complex) composed of AARS and tRNA. The AARS-tRNA complex is reacted with amino acids and ATP to form an aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, and then the once-formed aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex (AARS and aminoacyl tRNA) and an amino acid regeneration reagent (nucleotide or alkaline compound) are reacted to obtain at least one selected from the group consisting of AA, AARS, AARS-tRNA complex and tRNA from the complex. By liberating the compounds and using them again to form an aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, the reaction product such as pyrophosphate to be measured is finally converted into tRNA and / Or, they found that they can be produced up to a larger number of moles than amino acids, and completed the present invention.
本発明は、以下の［１］～［７］の態様に関する。
［１］以下の各工程を含む工程（Ｉ）：
（工程Ｉ－１）試料中のアミノ酸（ＡＡ）に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）及び転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を反応させて、ＡＡＲＳとｔＲＮＡから成る複合体（ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
（工程Ｉ－２）二価陽イオンの存在下、該ＡＡ、該ＡＡに対応するＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体から成る複合体（アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体）を形成させる反応（反応２）を含む工程；
（工程Ｉ－３）反応２及び／又は反応４で形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体（該複合体から生成され得るＡＡＲＳ及びアミノアシルｔＲＮＡも含む）にアミノ酸再生試薬を作用させて、ＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させる反応（反応３）を含む工程；
（工程Ｉ－４）反応３で遊離されたＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を反応１及び/又は反応２において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体反応を形成させる反応（反応４）を含む工程；及び、
（工程Ｉ－５）工程Ｉ－３及び工程Ｉ－４を繰り返す工程、並びに、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）、
を含む、試料中のアミノ酸定量方法。
［２］工程（Ｉ）で用いるアミノ酸再生試薬が、ヌクレオチド及びアルカリ性化合物であることを特徴とする、態様［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［３］工程（Ｉ）で用いるｔＲＮＡが、ＡＡＲＳのモル数の０.２５倍以上であることを特徴とする、態様［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［４］吸光度法により吸光度変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定する、態様［１］～［３］に記載のアミノ酸定量方法。
［５］工程（Ｉ）で生じる反応産生物として、ピロリン酸又は水素イオンの少なくとも何れか１つを測定する、態様［１］～［４］の何れか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［６］工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が反応液中に含まれるｔＲＮＡ及び／又はアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、態様［１］～［５］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［７］態様［１］～［６］に記載のアミノ酸定量法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、アミノ酸再生試薬、並びに、該アミノ酸に対応するＡＡＲＳ及びｔＲＮＡを含む、アミノ酸定量用キット。The present invention relates to the following aspects [1] to [7].
[1] Step (I) including the following steps:
(Step I-1) Aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) corresponding to an amino acid (AA) in a sample and transfer RNA (tRNA) are reacted to form a complex composed of AARS and tRNA (AARS-tRNA complex) A step comprising a reaction (Reaction 1) to cause;
(Step I-2) reacting the AA, the AARS-tRNA complex corresponding to the AA, and adenosine triphosphate (ATP) in the presence of a divalent cation to form aminoacyl adenylic acid (aminoacyl AMP); a step comprising a reaction (reaction 2) to form a complex consisting of an AARS-tRNA complex (aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex);
(Step I-3) The aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex formed in
(Step I-4) Reusing the AA released in Reaction 3 and at least one or more compounds selected from the group consisting of AARS, AARS-tRNA complex and tRNA in Reaction 1 and/or
(Step I-5) repeating steps I-3 and I-4, measuring the amount of the reaction product produced in step (I), and determining the amount of amino acid based on the measured amount of the reaction product; step (II) comprising determining
A method for quantifying amino acids in a sample, comprising:
[2] The method for quantifying amino acids according to aspect [1], wherein the amino acid regeneration reagent used in step (I) is a nucleotide and an alkaline compound.
[3] The method for quantifying amino acids according to aspect [1], wherein the amount of tRNA used in step (I) is 0.25 or more times the number of moles of AARS.
[4] The method for quantifying amino acids according to aspects [1] to [3], wherein the amount of the reaction product produced in step (I) is measured by measuring absorbance change by an absorbance method.
[5] The method for quantifying amino acids according to any one of aspects [1] to [4], wherein at least one of pyrophosphate and hydrogen ions is measured as the reaction product generated in step (I).
[6] Any one of aspects [1] to [5], wherein the number of moles of the reaction product produced in step (I) is greater than the number of moles of tRNA and/or amino acid contained in the reaction solution. The method for quantifying amino acids according to item 1.
[7] An amino acid quantification kit for performing the amino acid quantification method according to aspects [1] to [6], comprising ATP, an amino acid regeneration reagent, and AARS and tRNA corresponding to the amino acid. Quantitative kit.
本発明に係るアミノ酸定量方法に於いては、試料中のアミノ酸に対応するＡＡＲＳ及びｔＲＮＡと反応させて、ＡＡＲＳとｔＲＮＡから成る複合体（ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体）を形成させ、二価陽イオンの存在下、該ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体、該アミノ酸及びＡＴＰを反応させて、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体を形成させる。次いで、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体（該複合体から生成され得るＡＡＲＳ及びアミノアシルｔＲＮＡも含む）とアミノ酸再生試薬（ヌクレオチド又はアルカリ性化合物）を反応させて、ＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させ、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、反応液中に含まれるｔＲＮＡ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生させることができる。その結果、従来技術のような放射線ラベルをした測定対象アミノ酸は不必要となる。また、従来技術に比べてより簡便な手段でこれら反応産生物を測定する場合であっても、従来技術の多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析のアミノ酸定量法のアミノ酸定量範囲と同等の範囲での定量が可能であり、このような高感度分析は不必要となる。従って、本発明によって、グルタミン酸、グルタミン、及び、アルギニンを特異的且つ簡便、高感度に定量する方法及びその定量用キットを提供することが可能となる。 In the method for quantifying amino acids according to the present invention, AARS and tRNA corresponding to amino acids in a sample are reacted to form a complex (AARS-tRNA complex) composed of AARS and tRNA, and divalent cations are produced. In the presence, the AARS-tRNA complex, the amino acid and ATP react to form an aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex. Next, the once-formed aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex (including AARS and aminoacyl-tRNA that can be produced from the complex) is reacted with an amino acid regeneration reagent (nucleotide or alkaline compound) to produce AA, AARS, By liberating at least one or more compounds selected from the group consisting of AARS-tRNA complexes and tRNAs and repeatedly using them to form aminoacyl AMP-AARS-tRNA complexes, pyrophosphate, etc. to be measured Reaction products can be produced up to more moles than the tRNA and/or amino acids contained in the reaction. As a result, radiolabeled amino acids to be measured as in the prior art are no longer necessary. In addition, even if these reaction products are measured by a simpler means than the conventional technology, the amino acid quantification range of the amino acid quantification method of high-sensitivity analysis by fluorescence method using multi-step enzymatic reaction of the conventional technology can be quantified in a range equivalent to , and such high-sensitivity analysis becomes unnecessary. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a method and kit for quantifying glutamic acid, glutamine, and arginine specifically, simply, and with high sensitivity.
本発明方法の反応１では、試料中のアミノ酸（ＡＡ）に対応するＡＡＲＳ及び該ＡＡＲＳに対応する転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を反応させて、ＡＡＲＳとｔＲＮＡから成るＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体を形成させる。本発明方法に使用するＡＡＲＳは、グルタミン酸に特異的に作用するグルタミルｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｕＲＳ）、グルタミンに特異的に作用するグルタミニルｔＲＮＡ合成酵素（ＧｌｎＲＳ）、アルギニンに特異的に作用するアルギニルｔＲＮＡ合成酵素（ＡｒｇＲＳ）などアミノ酸に対し特異的に作用するＡＡＲＳを用いる。また、本発明に使用するＡＡＲＳは、ウシ、ラット、マウスなどの動物由来、Ｌｕｐｉｎ Ｓｅｅｄ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｕｓなどの植物由来、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの微生物由来など、生物由来のＡＡＲＳであれば、いずれのＡＡＲＳでも良く、特に取扱及び生産性の面の観点から、微生物由来のＡＡＲＳが好ましい。また、組換え型ＡＡＲＳでも良く、合成したＡＡＲＳでも良い。可溶性酵素が好ましいが、不溶性酵素に界面活性剤を組み合わせても良く、可溶化タンパクとの融合又は膜結合部分の削除等により不溶性酵素を可溶化させた酵素でも良い。ＡＡＲＳの公知のアミノ酸配列を利用でき、組換え型のＡＡＲＳは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の同一性を有する配列を有し、ＡＡＲＳ活性を有するタンパク質を使用しても良い。 In reaction 1 of the method of the present invention, an AARS corresponding to an amino acid (AA) in a sample and a transfer RNA (tRNA) corresponding to the AARS are reacted to form an AARS-tRNA complex consisting of the AARS and tRNA. The AARS used in the method of the present invention are glutamyl-tRNA synthetase (GluRS) that specifically acts on glutamic acid, glutaminyl-tRNA synthetase (GlnRS) that specifically acts on glutamine, and arginyl-tRNA synthetase that specifically acts on arginine. An AARS that specifically acts on amino acids such as (ArgRS) is used. In addition, the AARS used in the present invention is derived from animals such as bovine, rat, and mouse, from plants such as Lupin Seed and Phaseolus aurus, and from microorganisms such as Escherchia, Thermus, Thermotoga, and Saccharomyces. Any AARS may be used as long as it is AARS, and microorganism-derived AARS is particularly preferable from the viewpoint of handling and productivity. Alternatively, it may be a recombinant AARS or a synthetic AARS. Soluble enzymes are preferred, but surfactants may be combined with insoluble enzymes, and enzymes obtained by solubilizing insoluble enzymes by fusion with solubilizing proteins or deletion of membrane-binding portions may be used. Known amino acid sequences of AARS are available, and recombinant AARS have sequences with greater than 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% identity. , proteins with AARS activity may be used.
本発明に使用するＡＡＲＳとしては、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、ＡＡＲＳを含む対象物に加水し、粉砕機、超音波破砕機などで粉砕後、破砕した破砕物を遠心分離、濾過などで固形物を取り除いた抽出物、さらに当該抽出物をカラムクロマトグラフィーなどにより精製、単離したＡＡＲＳなどを用いることができる。即ち、本発明の主な技術的特徴は、ＡＡＲＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体中から、ＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させて、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、反応液中に含まれるｔＲＮＡ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、ＡＡＲＳの調製方法は何ら限定されるものではない。 The AARS used in the present invention can be any method or means known to those skilled in the art, for example, adding water to an object containing AARS, crushing it with a crusher, ultrasonic crusher, etc., and then centrifuging the crushed product. , an extract from which solid matter has been removed by filtration or the like, and AARS obtained by purifying and isolating the extract by column chromatography or the like can be used. That is, the main technical feature of the present invention is that, in an amino acid quantification method using AARS, AA from the formed aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, and from AARS, AARS-tRNA complex and tRNA By liberating at least one or more compounds selected from the group consisting of and repeatedly using them to form an aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, the reaction product such as pyrophosphate to be measured is converted into the reaction solution. The method of preparing AARS is not limited in any way, as it is to produce more moles than the tRNA and/or amino acids contained therein.
当該反応に使用される反応液中のＡＡＲＳ濃度は、試料の種類、推定される試料中のアミノ酸濃度、ＡＴＰ濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。工程（Ｉ）の反応２における逆反応を出来るだけ抑えるためには、試料中のアミノ酸濃度が低濃度と予想される場合は、ＡＡＲＳ濃度を高濃度とすることが好ましく、逆に試料中のアミノ酸濃度が高濃度と予想される場合は、ＡＡＲＳ濃度は低濃度で良い。また、ＡＡＲＳ濃度を高濃度することによって反応を短時間に完了させることが出来、逆に反応時間が長時間でも良い場合は、ＡＡＲＳ濃度は低濃度で良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属などの微生物由来のＡＡＲＳの濃度は、０．１μＭ以上、より好ましくは０．２５μＭ以上、さらに好ましくは１．０μＭ以上、特に好ましくは３．０μＭ以上、最も好ましくは５.０μＭ以上とすることができる。いずれにしても、本発明方法では、ＡＡＲＳが繰り返し使用されるので、予想される試料中のアミノ酸量に対して、過剰量のＡＡＲＳを添加する必要はない、という利点を有する。従って、ＡＡＲＳ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
The AARS concentration in the reaction solution used for the reaction can be appropriately determined by a person skilled in the art according to the type of sample, the estimated amino acid concentration in the sample, the ATP concentration, and various reaction conditions such as reaction time and temperature. be done. In order to suppress the reverse reaction in
また、本発明方法の反応１ではＡＡＲＳと共にｔＲＮＡを用いる。本発明に使用するｔＲＮＡは、各アミノ酸に対し特異的に作用するＡＡＲＳに対応するｔＲＮＡを用いる。例えば、グルタミン酸に特異的に作用するＧｌｕＲＳに対応するｔＲＮＡ、グルタミンに特異的に作用するＧｌｎＲＳに対応するｔＲＮＡ、アルギニンに特異的に作用するＡｒｇＲＳに対応するｔＲＮＡが挙げられる。また、本発明に使用するｔＲＮＡは、ウシ、ラット、マウスなどの動物由来、Ｌｕｐｉｎ Ｓｅｅｄ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ａｕｒｕｓなどの植物由来、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの微生物由来など、生物由来のｔＲＮＡであれば、いずれのｔＲＮＡでも良く、特に取扱及び生産性の面の観点から、微生物由来のｔＲＮＡが好ましい。また、合成したｔＲＮＡでも良い。ｔＲＮＡの公知の塩基配列を利用でき、合成したｔＲＮＡは、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％以上の同一性を有する配列を有し、ＡＡＲＳに結合、ＡＡＲＳ反応を引き起こすｔＲＮＡであれば良い。 Also, in Reaction 1 of the method of the present invention, tRNA is used together with AARS. The tRNA used in the present invention is a tRNA corresponding to AARS that specifically acts on each amino acid. Examples thereof include tRNA corresponding to GluRS that specifically acts on glutamic acid, tRNA corresponding to GlnRS that specifically acts on glutamine, and tRNA corresponding to ArgRS that specifically acts on arginine. In addition, the tRNA used in the present invention is derived from organisms such as animal-derived bovine, rat, mouse and the like, plant-derived such as Lupin Seed and Phaseolus aurus, and microorganism-derived such as Escherchia, Thermus, Thermotoga and Saccharomyces. Any tRNA may be used as long as it is tRNA, and microorganism-derived tRNA is particularly preferable from the viewpoint of handling and productivity. Alternatively, a synthesized tRNA may be used. A known nucleotide sequence of tRNA can be used, and the synthesized tRNA has a sequence identity of 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% or more, and the AARS Any tRNA that binds to and causes an AARS reaction may be used.
本発明に使用するｔＲＮＡとしては、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、ｔＲＮＡを含む対象物を抽出用緩衝液とフェノールとの混合液に混ぜ、超音波ホモジナイザーなどで粉砕後、破砕した破砕物を遠心分離、濾過などで取得したｔＲＮＡ、さらに当該ｔＲＮＡをカラムクロマトグラフィーなどにより精製、単離したｔＲＮＡなどを用いることができる。即ち、本発明の主な技術的特徴は、ＡＡＲＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体中から、ＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させて、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、反応液中に含まれるｔＲＮＡ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、ｔＲＮＡの調製方法は何ら限定されるものではない。更に、以下の実施例に於いて「ｔＲＮＡ混合物」と示されるような、各アミノ酸に対応する複数の種類のｔＲＮＡが任意の割合で混在する混合物を本発明の方法に於ける「ｔＲＮＡ」として使用することも可能である。 As the tRNA used in the present invention, any method or means known to those skilled in the art can be used, for example, a subject containing tRNA is mixed with a mixture of an extraction buffer and phenol, pulverized with an ultrasonic homogenizer or the like, and then pulverized. tRNA obtained by centrifugation, filtration, or the like of the disrupted product, and further purified and isolated tRNA by column chromatography or the like can be used. That is, the main technical feature of the present invention is that, in an amino acid quantification method using AARS, AA from the formed aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, and from AARS, AARS-tRNA complex and tRNA By liberating at least one or more compounds selected from the group consisting of and repeatedly using them to form an aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, the reaction product such as pyrophosphate to be measured is converted into the reaction solution. The method of preparing tRNA is not limited at all, as it is to produce more moles than the tRNA and/or amino acids contained therein. Furthermore, a mixture in which multiple types of tRNAs corresponding to each amino acid are mixed in an arbitrary ratio, as shown in the following examples as a "tRNA mixture", is used as the "tRNA" in the method of the present invention. It is also possible to
当該反応に使用される反応液中のｔＲＮＡの濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ヌクレオチド濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。例えばｔＲＮＡ濃度は、０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは０.５μＭ以上、特に好ましくは１.０μＭ以上、最も好ましくは２.０μＭ以上とすることができる。又、ｔＲＮＡ混合品の場合には、ｔＲＮＡ全体の濃度は、１μＭ以上、より好ましくは５μＭ以上、さらに好ましくは１０μＭ以上、特に好ましくは５０μＭ以上、最も好ましくは１００μＭ以上とすることができる。尚、ｔＲＮＡの濃度は、平均分子量２５，０００により算出した。ｔＲＮＡ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。また、反応条件に依存するが、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を試料中に含まれるアミノ酸より多くのモル数まで産生させるために、ｔＲＮＡのモル数がＡＡＲＳのモル数の０.２５倍以上、より好ましくは、０.５倍以上、更に好ましくは、１倍以上であることが望ましい。更に、反応条件に依存するが、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を試料中に含まれるｔＲＮＡより多くのモル数まで産生させるために、ｔＲＮＡのモル数がＡＡＲＳのモル数の０.１倍以上、より好ましくは、０.２５倍以上、更に好ましくは、０.５倍以上であることが望ましい。 The concentration of tRNA in the reaction mixture used in the reaction will vary depending on the type of sample, expected amino acid concentration, AARS concentration, nucleotide concentration, and various reaction conditions such as reaction time and temperature. determined by the contractor as appropriate. For example, the tRNA concentration can be 0.01 μM or higher, more preferably 0.1 μM or higher, even more preferably 0.5 μM or higher, particularly preferably 1.0 μM or higher, and most preferably 2.0 μM or higher. In the case of a tRNA mixture, the concentration of the total tRNA can be 1 μM or higher, more preferably 5 μM or higher, still more preferably 10 μM or higher, particularly preferably 50 μM or higher, and most preferably 100 μM or higher. The concentration of tRNA was calculated based on the average molecular weight of 25,000. The upper limit of the tRNA concentration can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of economic efficiency and the like. In addition, although it depends on the reaction conditions, in order to produce reaction products such as pyrophosphate to be measured in more moles than amino acids contained in the sample, the number of moles of tRNA should be 0.5 times the number of moles of AARS. It is desirable to be 25 times or more, more preferably 0.5 times or more, still more preferably 1 time or more. Furthermore, although it depends on the reaction conditions, in order to produce reaction products such as pyrophosphate to be measured up to a larger number of moles than tRNA contained in the sample, the number of moles of tRNA should be adjusted to 0.5 moles of AARS. It is desirably 1 time or more, more preferably 0.25 times or more, still more preferably 0.5 times or more.
本発明方法の反応２では、二価陽イオンの存在下、試料中のアミノ酸（ＡＡ）、該ＡＡに対応するＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体を形成させる。
本発明に使用する試料に特に制限はなく、例えば、血液、生鮮食品、加工食品及び飲料などがあげられる。各試料中のアミノ酸濃度は、各アミノ酸により異なる。例えば、血液中のグルタミン酸は１１～４４ｎｍｏｌ／ｍＬ、グルタミンは４８８～７３３ｎｍｏｌ／ｍＬである。生鮮食品中の遊離アミノ酸含量は、例えば、ニンニクでは、アルギニンは１３６ｍｇ／１００ｇなどである。トマトでは、グルタミンは９４ｍｇ／１００ｇである。乾燥シイタケでは、グルタミン酸は３８６ｍｇ／１００ｇである。加工食品や飲料中の遊離アミノ酸含量は、例えば、醤油では、グルタミン酸は７８２ｍｇ／１００ｇである。煎茶では、アルギニンは３１４ｍｇ／１００ｇ、グルタミン酸は２５８ｍｇ／１００ｇである。これら各試料中の予想されるアミノ酸濃度によって、適宜、希釈調製し、本発明の試料として使用できる。In
Samples used in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include blood, fresh foods, processed foods and beverages. The amino acid concentration in each sample is different for each amino acid. For example, blood glutamic acid is 11-44 nmol/mL and glutamine is 488-733 nmol/mL. The content of free amino acids in fresh food, for example, in garlic is 136 mg/100 g for arginine. In tomatoes, glutamine is 94 mg/100 g. In dried shiitake, glutamic acid is 386 mg/100 g. The content of free amino acids in processed foods and beverages, for example, in soy sauce, is 782 mg/100 g of glutamic acid. Sencha contains 314 mg/100 g of arginine and 258 mg/100 g of glutamic acid. Depending on the expected amino acid concentration in each of these samples, appropriate dilutions can be prepared and used as the samples of the present invention.
本発明に使用するＡＴＰは、ナトリウム塩、リチウム塩などが使用できる。当該反応に使用される反応液中のＡＴＰの濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ヌクレオチド濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、予想される試料中のアミノ酸濃度に対して過剰となるように添加するのが好ましい。例えば試料が血液の場合、ＡＴＰ濃度は、０.０１ｍＭ以上、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは１.０ｍＭ以上、特に好ましくは５.０ｍＭ以上、最も好ましくは１０.０ｍＭ以上とすることができる。ＡＴＰ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。 ATP used in the present invention may be sodium salt, lithium salt, or the like. The concentration of ATP in the reaction solution used in the reaction depends on various reaction conditions such as the type of sample, expected amino acid concentration, AARS concentration, nucleotide concentration, and reaction time and temperature in the sample. The manufacturer can appropriately determine the amount, but it is preferable to add the amino acid in an excess amount relative to the expected amino acid concentration in the sample. For example, when the sample is blood, the ATP concentration should be 0.01 mM or higher, more preferably 0.1 mM or higher, still more preferably 1.0 mM or higher, particularly preferably 5.0 mM or higher, and most preferably 10.0 mM or higher. can be done. The upper limit of the ATP concentration can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of economic efficiency and the like.
また、本発明に使用する二価イオンは、マグネシウム、マンガン、コバルト、カルシウムなどが使用できる。二価イオンは、各ＡＡＲＳにより要求性が異なるため、使用するＡＡＲＳに適した二価イオンを適宜使用すれば良いが、ＡＡＲＳ共通に要求性のあるマグネシウムやマンガンの使用がより好ましい。さらには二価イオンと同様な作用をするスペルミン、スペルミジン、プトレッシンなどのポリアミンも使用できる。当該反応に使用される反応液中の二価イオンの濃度は、適宜決められるが、ＡＴＰ濃度に対して同等以上に添加するのが好ましい。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属などの微生物由来のＡＡＲＳにおけるＡＴＰ：二価陽イオンの比率は、少なくとも１：１、より好ましくは少なくとも１：３、さらに好ましくは少なくとも１：５、特に好ましくは少なくとも１：７、最も好ましくは少なくとも１：１０とすることができる。 Divalent ions used in the present invention can be magnesium, manganese, cobalt, calcium and the like. Since each AARS has different requirements for divalent ions, divalent ions suitable for the AARS to be used may be appropriately used, but it is more preferable to use magnesium and manganese, which are required in common by AARS. Furthermore, polyamines such as spermine, spermidine, and putrescine, which act similarly to divalent ions, can also be used. The concentration of divalent ions in the reaction solution used in the reaction can be appropriately determined, but it is preferable to add the divalent ions in an amount equal to or higher than the ATP concentration. For example, the ATP: divalent cation ratio in AARS from microorganisms such as Escherchia, Thermus, Thermotoga is at least 1:1, more preferably at least 1:3, even more preferably at least 1:5, particularly preferably can be at least 1:7, most preferably at least 1:10.
続いて、本発明方法の反応３では、反応２及び／又は反応４で形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体、並びに、反応条件等によって該複合体から生成され得るアミノアシルｔＲＮＡ、に対しアミノ酸再生試薬を作用させ、該複合体を分解し該複合体からＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させる。当該反応のアミノ酸再生試薬としては、例えば、ＡＴＰ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）及びグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）などのヌクレオチドや、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム及び緩衝剤などの水酸化物イオン（アルカリ性水溶液）を発生するアルカリ性化合物を使用できる。また、アルカリ性化合物は、反応の場（反応系）をｐＨ７以上にできれば良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属、Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属のＡＡＲＳの場合では、好ましくはｐＨ７.０以上、より好ましくはｐＨ７.５以上、さらに好ましくは、ｐＨ８.０以上であることが好ましい。尚、反応ｐＨは、当業者に公知の任意の緩衝剤などを使用して調整することが出来る。当該反応に使用される反応液中のアミノ酸再生試薬の濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＡＡＲＳ濃度、ＡＴＰ濃度、ｔＲＮＡ濃度及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、反応２で使用するＡＴＰと当該反応に使用するアミノ酸再生試薬の総量は試料中のアミノ酸濃度に対して過剰に添加するのが好ましい。例えば、試料が血液の場合、ヌクレオチド濃度は、０.０１ｍＭ以上、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは１.０ｍＭ以上、特に好ましくは５.０ｍＭ以上、最も好ましくは１０.０ｍＭ以上とすることができる。従って、本発明方法では、ＡＡＲＳを再び反応可能な状態とさせるために、特許文献２に記載されているようなアミン類等のアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体分解試薬を添加する必要がなく、更に、遊離したアミノ酸が該試薬と反応することがないので、遊離したアミノ酸をアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体の形成に再び利用することができる。
Subsequently, in Reaction 3 of the method of the present invention, the aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex formed in
本発明方法の反応４では、反応３で遊離したＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を反応１及び/又反応２において再び使用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体反応を形成させる。更に、本発明方法の工程（Ｉ）において、当業者に公知の任意の方法によって、反応２又は４で生じたピロリン酸及び反応系中のＡＭＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸ジキナーゼとを反応させることによって産生されるＡＴＰを、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体形成及び該複合体からのＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物の遊離に再利用すること、及び/又は、反応３でヌクレオチドから生成されるＡｐ４Ａに対しＡｐ４Ａピロホスホヒドラーゼを作用させることによって産生されるＡＤＰを、反応３におけるヌクレオチドとして再利用することもできる。
In Reaction 4 of the method of the present invention, the AA liberated in Reaction 3 and at least one compound selected from the group consisting of AARS, AARS-tRNA complex and tRNA are used again in Reaction 1 and/or
その結果、前述のＡＴＰなどのヌクレオチド及び該アミノ酸に対応するＡＡＲＳの組成等の反応条件において、工程（Ｉ）に於ける反応の結果、ピロリン酸及び/又は水素イオン等の夫々の反応産生物の各々について、反応液中に含まれているｔＲＮＡや測定対象のアミノ酸のモル数より多いモル数の分子が産生され得る。その結果、本発明方法では、従来技術より低濃度である１μＭ程度の極めて低いアミノ酸濃度から定量可能となる。従って、この点は従来技術と比較して本発明の顕著な効果といえる。 As a result, under the reaction conditions such as the composition of nucleotides such as ATP and the AARS corresponding to the amino acids, the reaction in step (I) results in the production of respective reaction products such as pyrophosphate and/or hydrogen ions. For each, more moles of molecules can be produced than the moles of tRNA or amino acid to be measured contained in the reaction solution. As a result, the method of the present invention enables quantification from extremely low amino acid concentrations of about 1 μM, which are lower than those of the prior art. Therefore, this point can be said to be a remarkable effect of the present invention as compared with the prior art.
しかしながら、当該反応条件下で産生されるピロリン酸等の反応産生物が、反応液中のｔＲＮＡやアミノ酸のモル数以下の量であっても、該反応産生物に基づきアミノ酸の定量が可能であれば、ピロリン酸等の反応産生物が当該アミノ酸のモル数以上に産生される必要はない。従って、本発明の工程（Ｉ）に於いて産生されるピロリン酸や水素イオンの量は、工程（ＩＩ）に於ける該反応産生物の適当な測定方法によってアミノ酸の定量が可能となる限り、特に限定されない。従って、本発明方法の（工程Ｉ－５）に於ける、反応３（工程Ｉ－３）及び反応４（工程Ｉ－４）の繰り返しの回数に特に制限はない。 However, even if the amount of reaction products such as pyrophosphate produced under the reaction conditions is less than the number of moles of tRNA and amino acids in the reaction solution, it is possible to quantify amino acids based on the reaction products. For example, reaction products such as pyrophosphate need not be produced in amounts greater than or equal to the number of moles of the amino acid. Therefore, the amounts of pyrophosphate and hydrogen ions produced in step (I) of the present invention are as long as amino acids can be quantified by an appropriate method for measuring the reaction product in step (II). It is not particularly limited. Therefore, the number of repetitions of reaction 3 (step I-3) and reaction 4 (step I-4) in (step I-5) of the method of the present invention is not particularly limited.
本発明方法の工程（Ｉ）における反応温度は、各反応が生じるような任意の温度で良い。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ属のＡＡＲＳの場合、１０～６０℃、好ましくは、４０～５０℃Ｔｈｅｒｍｕｓ属及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ属のＡＡＲＳの場合では、１０～９５℃、好ましくは、４０～７０℃が適している。また、当該反応時間も試料中のアミノ酸とＡＡＲＳ反応が生じるような任意の時間で良いが、好ましくは１～９０分程度、より好ましくは５～７０分程度、さらに好ましくは、１０～６０分程度であることが望ましい。 The reaction temperature in step (I) of the process of the present invention may be any temperature at which each reaction occurs. For example, AARS of the genus Escherchia is 10 to 60°C, preferably 40 to 50°C, and AARS of the genus Thermus and Thermotoga is 10 to 95°C, preferably 40 to 70°C. In addition, the reaction time may be any time during which the amino acids in the sample react with the AARS, preferably about 1 to 90 minutes, more preferably about 5 to 70 minutes, still more preferably about 10 to 60 minutes. is desirable.
本発明方法の工程（Ｉ）に含まれる各工程で使用する試薬・酵素等の各反応成分は、ＡＡＲＳ反応が生じる添加方法である限り、当業者に公知の任意の手段・手順等で反応系に添加することができる。例えば、各成分を反応開始前に一度に反応系に予め添加するか、又は、ＡＡＲＳ又はアミノ酸を最後に添加し反応させても良い。 Reaction components such as reagents and enzymes used in each step included in step (I) of the method of the present invention can be added to the reaction system by any means, procedures, etc. known to those skilled in the art, as long as the addition method causes the AARS reaction. can be added to For example, each component may be added to the reaction system at once before starting the reaction, or the AARS or amino acid may be added last and allowed to react.
本発明方法の工程（ＩＩ）では、工程（Ｉ）で生じたピロリン酸及び水素イオン等の各反応産生物の夫々の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定する。工程（ＩＩ）は、測定方法等に応じて、工程（Ｉ）に於ける試料中のアミノ酸とＡＡＲＳとの反応を当業者に公知の任意の方法・手段で停止させた後、あるいは、工程（Ｉ）に於ける反応が進行中の任意の段階で適宜、実施することが出来る。 In step (II) of the method of the present invention, the amount of each reaction product such as pyrophosphate and hydrogen ion produced in step (I) is measured, and the amount of amino acid is determined based on the measured amount of the reaction product. do. Step (II) is performed after stopping the reaction between the amino acid in the sample and AARS in step (I) by any method or means known to those skilled in the art, or after step ( It can be suitably carried out at any stage during the reaction in I).
本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸の量の測定には、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、モリブデン酸とピロリン酸を反応させ産生した青色の錯体の吸光度を測定するモリブデンブルー法、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ又はキサンチンデヒドロゲナーゼを組みわせる方法などが使用できる。また、本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸を無機ピロホスファターゼなどで２分子のリン酸とし、そのリン酸を測定することで、より高感度の測定ができる。例えば、ルミノールと無機ピロホスファターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを組み合わせ産生物の発光を測定する方法などのピロリン酸を測定できる酵素法などが使用できる。さらに酵素反応などで酸化還元反応を起こし、その酸化還元反応に由来する電流値を検出する多電極電位計測計により電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。また、当該反応で産生された水素イオンの測定には、水素イオンを検出するガラス電極やイオン感応性電界効果トランジスタにより電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。当該反応で産生されたアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の測定には、アデノシン一リン酸を検出する発光を利用したＡＭＰセンサで測定するなどを使用することができる。本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸、水素イオン、ＡＭＰなどは、反応溶液から分離し、測定することができる。反応溶液からのピロリン酸、水素イオン、ＡＭＰなどの分離方法としては、測定に影響の無い方法であれば特に限定されないが、例えば、酸処理による除タンパク質、ペーパークロマトグラフィー分離、マイクロ流体デバイスでの分離などが挙げられる。本発明の主な技術的特徴は、ＡＡＲＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体中からＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ-ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させて、これら化合物を、再度、該複合体の形成に繰り返し利用することにより、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、反応液中に含まれるｔＲＮＡ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、反応産生物の量の測定方法は何ら限定されるものではない。 The amount of pyrophosphate produced in step (I) of the present invention can be measured by any method or means known to those skilled in the art, for example, by measuring the absorbance of a blue complex produced by reacting molybdic acid and pyrophosphate. The molybdenum blue method, a method combining hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, xanthine oxidase or xanthine dehydrogenase can be used. Further, the pyrophosphate produced in the step (I) of the present invention is treated with inorganic pyrophosphatase or the like to convert it into two molecules of phosphoric acid, and the resulting phosphoric acid is measured, whereby a more sensitive measurement can be performed. For example, an enzymatic method that can measure pyrophosphate, such as a method that combines luminol with inorganic pyrophosphatase, pyruvate oxidase, and peroxidase and measures the luminescence of the product can be used. Furthermore, a measurement method of causing an oxidation-reduction reaction by an enzyme reaction or the like and measuring a potential change by a multi-electrode potential measuring instrument that detects a current value derived from the oxidation-reduction reaction can be used. In addition, for the measurement of the hydrogen ions produced in the reaction, it is possible to use, for example, a measurement method of measuring a potential change using a glass electrode or an ion-sensitive field effect transistor that detects hydrogen ions. Adenosine monophosphate (AMP) produced in the reaction can be measured using an AMP sensor that uses luminescence that detects adenosine monophosphate. Pyrophosphate, hydrogen ions, AMP, etc. generated in step (I) of the present invention can be separated from the reaction solution and measured. The method for separating pyrophosphate, hydrogen ions, AMP, etc. from the reaction solution is not particularly limited as long as it is a method that does not affect the measurement. separation and the like. The main technical features of the present invention are, in the amino acid quantification method using AARS, AA from the formed aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex, and from the group consisting of AARS, AARS-tRNA complex and tRNA By liberating at least one or more selected compounds and repeatedly using these compounds to form the complex, the reaction product such as pyrophosphate to be measured is included in the reaction solution. The method of measuring the amount of the reaction product is not limited at all, as it is to produce more moles than tRNA and/or amino acids.
本発明は、上記の本発明方法を実施するための、試料中のアミノ酸定量に必要な前述の各成分を含む、アミノ酸定量用キットを提供する。当該キットは、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、前記酵素等試薬成分の安定性を高めても良い。測定に影響の無い成分であれば特に限定されないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、糖類、糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、酸化防止剤、界面活性剤、又は酵素と作用性のないアミノ酸類等を例示できる。また、当該キットの一例として前述のピロリン酸や水素イオンを測定するためのキットを挙げることが出来る。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に
よって限定されるものではない。The present invention provides an amino acid quantification kit for carrying out the above-described method of the present invention, which contains the aforementioned components necessary for quantifying amino acids in a sample. The kit may appropriately contain other optional components known to those skilled in the art, such as stabilizers or buffers, to enhance the stability of reagent components such as enzymes. Although there are no particular limitations as long as it is a component that does not affect the measurement, for example, bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, sugars, sugar alcohols, carboxyl group-containing compounds, antioxidants, surfactants, or enzymes and activity can be exemplified by amino acids without Further, as an example of the kit, the aforementioned kit for measuring pyrophosphate and hydrogen ions can be mentioned.
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited by the following examples.
（大腸菌由来のＡＡＲＳの調製）
大腸菌Ｋ１２株由来の変異株（ＮＢＲＣ３９９２）のＡＡＲＳ配列をもつプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ株に遺伝子導入し、発現株として用いた。各発現株について、選択マーカーとしてカナマイシン、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で３７℃培養し、ＯＤ６００が約０．６に到達後、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、ＩＰＴＧを添加して２５℃で一晩誘導培養を行った。培養終了後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。さらに遠心分離を行い、得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、ＡｒｇＲＳ（配列番号１）、ＧｌｕＲＳ（配列番号２）、ＧｌｎＲＳ（配列番号３）を得た。(Preparation of AARS derived from E. coli)
A plasmid (pET28b) having an AARS sequence of a mutant strain (NBRC3992) derived from E. coli K12 strain was introduced into E. coli BL21(DE3) pLys strain and used as an expression strain. Each expression strain was cultured at 37°C in LB medium containing kanamycin and chloramphenicol as selection markers, and after OD600 reached about 0.6, IPTG was added to a final concentration of 1 mM. Induction culture was performed overnight at 25°C. After the culture was completed, the cells were collected, and the obtained cells were sonicated to prepare a cell-free extract. After further centrifugation, expression of the target enzyme was confirmed by electrophoresis using a portion of the resulting supernatant. Next, the remaining supernatant was treated with a His-tag column (trade name: TALON superflow, manufactured by GE Healthcare) to remove contaminant proteins, resulting in ArgRS (SEQ ID NO: 1), GluRS (SEQ ID NO: 2), and GlnRS (SEQ ID NO: 3). Obtained.
（大腸菌由来のｔＲＮＡの調製）
大腸菌Ｋ１２株由来のｔＲＮＡ遺伝子配列をコードするオリゴヌクレオチドから、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでｔＲＮＡを転写した。電気泳動法により、目的ｔＲＮＡの転写を確認した後、ゲルろ過カラムを用いて、未反応ＮＴＰ、塩などを除去した。次いで、イオン交換体カラムを用いて、目的ｔＲＮＡ以外の核酸断片を除去することにより、アルギニン、グルタミン酸及びグルタミンの各アミノ酸に夫々対応するｔＲＮＡ（配列番号４～６）を調製した。(Preparation of tRNA derived from E. coli)
tRNA was transcribed in vitro from an oligonucleotide encoding the tRNA gene sequence from E. coli strain K12. After confirming transcription of the target tRNA by electrophoresis, unreacted NTPs, salts and the like were removed using a gel filtration column. Next, by removing nucleic acid fragments other than the target tRNA using an ion exchanger column, tRNAs (SEQ ID NOS: 4 to 6) corresponding to amino acids of arginine, glutamic acid and glutamine, respectively, were prepared.
（大腸菌由来のｔＲＮＡ混合品の調製）
大腸菌由来ｔＲＮＡ数十種類の混合品（商品名：ｔＲＮＡ，ｆｒｏｍ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００，１００ｍｇ、Ｒｏｃｈｅ製）をＮｕｃｌｅａｓｅフリー水に溶解させることにより、ｔＲＮＡ混合品を調製した。(Preparation of E. coli-derived tRNA mixture)
A tRNA mixture was prepared by dissolving a mixture of dozens of E. coli-derived tRNAs (trade name: tRNA, from E. coli MRE600, 100 mg, manufactured by Roche) in nuclease-free water.
（ｔＲＮＡを用いた各種ＡＡＲＳ反応により生じるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｌ-グルタミン酸、２．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び１８μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品１（本発明品）を調製した。(Amount of pyrophosphate produced by various AARS reactions using tRNA: Step (I) of the method of the present invention)
150 μL of reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 10 mM ATP, 100 mM MgCl 2 , 50 μM L-glutamic acid, 2.0 μM GluRS and 18 μM tRNA was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After the reaction was stopped, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Working Product 1 (the product of the present invention).
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２．５ｍＭ ＡＴＰ、１２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び１０μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品２（本発明品）を調製した。150 μL of a reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 12.5 mM MnCl 2 , 50 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 10 μM tRNA was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. . After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After the reaction was terminated, the precipitate was removed by centrifugation to prepare a working product 2 (product of the present invention).
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ ＡＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｌ-グルタミン、２.０μＭ ＧｌｎＲＳ、及び８.２μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３（本発明品）を調製した。150 μL of reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 3 mM ATP, 30 mM MgCl 2 , 50 μM L-glutamine, 2.0 μM GlnRS and 8.2 μM tRNA was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Working Product 3 (product of the present invention).
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例４、５、６で調製した実施品１～３の反応溶液１５０μＬに１Ｍメルカプトエタノール１５μＬ、発色液（２．５％モリブデン酸アンモニウム／５Ｎ硫酸）６０μＬを混合し、室温で２０分間静置した後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。なお、基質アミノ酸の代わりに水を添加したサンプルの吸光値を、ブランクとして各サンプルの吸光値から差し引いた値から、反応溶液中のピロリン酸量を求めた。その結果、図２に示す通り、ＧｌｕＲＳ、ＡｒｇＲＳ及びＧｌｎＲＳにおいて単に、反応液中のｔＲＮＡ分子又は/及び各基質アミノ酸が一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。(Measurement of pyrophosphate by molybdenum blue method: step (II) of the method of the present invention)
150 μL of the reaction solution of Examples 1 to 3 prepared in Examples 4, 5, and 6, 15 μL of 1 M mercaptoethanol, and 60 μL of a coloring solution (2.5% ammonium molybdate/5N sulfuric acid) were mixed and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. After that, absorbance at 580 nm was measured. The amount of pyrophosphate in the reaction solution was determined from the value obtained by subtracting the absorbance value of the sample to which water was added instead of the substrate amino acid as a blank from the absorbance value of each sample. As a result, as shown in FIG. 2, in GluRS, ArgRS and GlnRS, pyrroline produced only when the tRNA molecule and/or each substrate amino acid in the reaction solution was used (not reused) in the enzymatic reaction only once. More pyrophosphate was produced than the theoretical amount of acid.
（ｔＲＮＡ混合品を用いた各種ＡＡＲＳ反応により生じるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品４（本発明品）を調製した。(Amount of pyrophosphate produced by various AARS reactions using tRNA mixtures: step (I) of the method of the present invention)
150 μL of reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM ATP, 250 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Working Product 4 (the product of the present invention).
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２．５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品５（本発明品）を調製した。150 μL of reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mixture was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. . After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Working Product 5 (the product of the present invention).
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ ＡＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン、２.０μＭ ＧｌｎＲＳ、及び３２０μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品６（本発明品）を調製した。150 μL of a reaction solution containing a mixture of 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 3 mM ATP, 30 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamine, 2.0 μM GlnRS and 320 μM tRNA was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Working Product 6 (product of the present invention).
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例８、９、１０で調製した実施品４～６のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図３に示す通り、ＧｌｕＲＳ、ＡｒｇＲＳ及びＧｌｎＲＳにおいて単に、反応液中の各基質アミノ酸が一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。(Measurement of pyrophosphate by molybdenum blue method: step (II) of the method of the present invention)
The pyrophosphate of Examples 4-6 prepared in Examples 8, 9 and 10 was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 3, in GluRS, ArgRS and GlnRS, the theoretical value of the amount of pyrophosphate produced when each substrate amino acid in the reaction solution was used (not reused) in the enzymatic reaction only once More pyrophosphate was produced.
（各種ｔＲＮＡ濃度によるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２.５ｍＭ ＭｎＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、及び２．５μＭ ＡｒｇＲＳを含む反応溶液に、夫々、０μＭ ｔＲＮＡ、０.２５μＭ ｔＲＮＡ、０．６３μＭ ｔＲＮＡ、１．２５μＭ ｔＲＮＡ、１．８８μＭ ｔＲＮＡ、２．５μＭ ｔＲＮＡ、又は、５．０μＭ ｔＲＮＡを添加した各反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）７、８、９、１０、１１、１２、及び１３を調製した。(Amount of Pyrophosphate Produced at Various tRNA Concentrations: Step (I) of the Method of the Present Invention)
0 μM tRNA, 0.25 μM tRNA, 0.63 μM tRNA, 0.63 μM 150 μL of each reaction solution containing tRNA, 1.25 μM tRNA, 1.88 μM tRNA, 2.5 μM tRNA, or 5.0 μM tRNA was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 7, 8, 9, 10, 11, 12, and 13 were prepared.
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｌ-グルタミン酸、及び２．０μＭ ＧｌｕＲＳを含む反応溶液に、夫々、０μＭ ｔＲＮＡ、６μＭ ｔＲＮＡ、１２μＭ ｔＲＮＡ、又は、１８μＭ ｔＲＮＡを添加した各反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１４、１５、１６、及び１７を調製した。0 μM tRNA, 6 μM tRNA, 12 μM tRNA, or 18 μM tRNA was added to a reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 10 mM ATP, 100 mM MgCl 2 , 50 μM L-glutamic acid, and 2.0 μM GluRS, respectively. 150 μL of each reaction solution was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 14, 15, 16 and 17 were prepared.
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ ＡＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０μＭ Ｌ-グルタミン、及び２．０μＭ ＧｌｎＲＳを含む反応溶液に、夫々、０μＭ ｔＲＮＡ、４μＭ ｔＲＮＡ、８μＭ ｔＲＮＡ、又は、１６μＭ ｔＲＮＡを添加した各反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１８、１９、２０、及び２１を調製した。0 μM tRNA, 4 μM tRNA, 8 μM tRNA, or 16 μM tRNA was added to a reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 3 mM ATP, 30 mM MgCl 2 , 50 μM L-glutamine, and 2.0 μM GlnRS, respectively. 150 μL of each reaction solution was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 18, 19, 20, and 21 were prepared.
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭgＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、及び２．５μＭ ＡｒｇＲＳを含む反応溶液に、夫々、０μＭ ｔＲＮＡ混合品、１００μＭ ｔＲＮＡ混合品、２００μＭ ｔＲＮＡ混合品、又は、４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を添加した各反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）２２、２３、２４、及び２５を調製した。A reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine, and 2.5 μM ArgRS was added with 0 μM tRNA mixture, 100 μM tRNA mixture, and 200 μM tRNA mixture, respectively. 150 μL of each reaction solution to which the product or 400 μM tRNA mixture was added was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 22, 23, 24, and 25 were prepared.
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ ＡＴＰ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン、及び２．０μＭ ＧｌｎＲＳを含む反応溶液に、夫々、０μＭ ｔＲＮＡ混合品、１６０μＭ ｔＲＮＡ混合品、２４０μＭ ｔＲＮＡ混合品、又は、３２０μＭ ｔＲＮＡ混合品を添加した各反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）２６、２７、２８、及び２９を調製した。0 μM tRNA mixture, 160 μM tRNA mixture, 240 μM tRNA mixture, Alternatively, 150 μL of each reaction solution to which 320 μM tRNA mixture was added was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 26, 27, 28, and 29 were prepared.
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例１２、１３、１４、１５、１６で調製した実施品７～２９のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図４、５、６、７、８に示す通り、ＡｒｇＲＳ、ＧｌｕＲＳ及びＧｌｎＲＳにおいてｔＲＮＡ濃度の増加と共にピロリン酸の増加が認められた。ｔＲＮＡが無添加の場合、ＡｒｇＲＳ、ＧｌｕＲＳ及びＧｌｎＲＳのいずれにおいてもピロリン酸の増加が認められなかったことから、これらのＡＡＲＳ反応には、ｔＲＮＡが必須であることが分かった。また、単に、反応液中のｔＲＮＡ又は/及び各基質アミノ酸の全てが酵素反応に一回きり使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。(Measurement of pyrophosphate by molybdenum blue method: step (II) of the method of the present invention)
The pyrophosphate of Examples 7-29 prepared in Examples 12, 13, 14, 15 and 16 was determined by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIGS. 4, 5, 6, 7 and 8, pyrophosphate increased with increasing tRNA concentration in ArgRS, GluRS and GlnRS. In the absence of tRNA, no increase in pyrophosphate was observed in any of ArgRS, GluRS and GlnRS, indicating that tRNA is essential for these AARS reactions. In addition, more pyrophosphate is produced than the theoretical value of the amount of pyrophosphate produced simply when all of the tRNA and/or each substrate amino acid in the reaction solution is used once (not reused) in the enzyme reaction. It had been.
［比較例１］
（本発明と公知文献記載のＡＡＲＳ反応におけるピロリン酸の産生量の比較）
非特許文献６記載の反応に於いて、測定対象として放射線ラベルをしない通常のアミノ酸を使用したこと以外は、該文献に記載の条件に従い、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７.４）、２ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、１５.４μＭ ＡｒｇＲＳ、及び２μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３７℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１を調製した。[Comparative Example 1]
(Comparison of the amount of pyrophosphate produced in the AARS reaction described in the present invention and known literature)
100 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 2 mM ATP, 10 mM 150 μL of reaction solution containing MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 15.4 μM ArgRS and 2 μM tRNA was prepared and treated at 37° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare a comparative product 1.
［比較例２］
特許文献２記載の反応条件に従い、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、１.０μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００ｍＭ ヒドロキシアミンを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品２を調製した。[Comparative Example 2]
150 μL of a reaction solution containing 20 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 0.5 mM ATP, 5 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 1.0 μM ArgRS, and 400 mM hydroxylamine was prepared according to the reaction conditions described in
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２.５ｍＭ ＭｎＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び１０μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品３０（本発明品）を調製した。150 μL of a reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 12.5 mM MnCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 10 μM tRNA was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. . After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare Working Product 30 (product of the present invention).
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
比較例１、比較例２及び実施例１８で調製した比較品１、比較品２及び実施品３０のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図９に示す通り、本発明の方法では、添加したｔＲＮＡ及びアミノ酸の全てが一回きり反応に使用された（再利用されない）場合に産生されると推測されるピロリン酸量である理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。一方、比較品１の産生したピロリン酸は、ｔＲＮＡの理論値に近く、アミノ酸の理論値以下であった。また、比較品２では、ピロリン酸は、全く産生されなかった。(Measurement of pyrophosphate by molybdenum blue method: step (II) of the method of the present invention)
The pyrophosphates of
（各種ＡＴＰ濃度によるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１.２５ｍＭ ＡＴＰ、１.２５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び１０.０μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、６.２５ｍＭ ＡＴＰ、６.２５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び１０.０μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液、又は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２.５ｍＭ ＭｎＣｌ２、５０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び１０.０μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）３１、３２、及び３３を調製した。(Amount of Pyrophosphate Produced at Various ATP Concentrations: Step (I) of the Method of the Present Invention)
Reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 1.25 mM ATP, 1.25 mM MnCl 2 , 50 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 10.0 μM tRNA, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0) , 6.25 mM ATP, 6.25 mM MnCl 2 , 50 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 10.0 μM tRNA, or 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 12 150 μL of reaction solution containing 5 mM MnCl 2 , 50 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS and 10.0 μM tRNA was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation to prepare working products (products of the present invention) 31, 32, and 33.
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１.２５ｍＭ ＡＴＰ、１２.５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ ＡＴＰ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＡＴＰ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、又は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＡＴＰ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）３４、３５、３６、及び３７を調製した。Reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 1.25 mM ATP, 12.5 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mix, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0) , 2.5 mM ATP, 25 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 5 mM ATP, 50 mM MgCl 2 , 20 μM L- Reaction solutions containing glutamate, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mix, or 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 10 mM ATP, 100 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamate, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mix. 150 μL of reaction solution containing the product was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 34, 35, 36, and 37 were prepared.
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例２０、２１で調製した実施品３１～３７のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１０に示す通り、ＡｒｇＲＳ及びＧｌｕＲＳにおいてＡＴＰ濃度の増加と共にピロリン酸の増加が認められた。また、ｔＲＮＡ又は/及び各基質アミノ酸の全てが一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。(Measurement of pyrophosphate by molybdenum blue method: step (II) of the method of the present invention)
Pyrophosphate of Examples 31 to 37 prepared in Examples 20 and 21 was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 10, pyrophosphate increased with an increase in ATP concentration in ArgRS and GluRS. In addition, more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate produced when tRNA and/or all of the substrate amino acids were used (not reused) in the enzymatic reaction only once.
（各種二価イオン濃度によるピロリン酸産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２．５ｍＭ ＡＴＰ、１８．７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２．５ｍＭ ＡＴＰ、３１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２．５ｍＭ ＡＴＰ、６２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、又は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２．５ｍＭ ＡＴＰ、９３．７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）３８、３９、４０、及び４１を調製した。(Pyrophosphate production amount by various divalent ion concentrations: step (I) of the method of the present invention)
Reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 18.75 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mix, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0) , 12.5 mM ATP, 31.25 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mixture, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 62.5 mM Reaction solutions containing MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mix or 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 93.75 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine , 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mixture (150 μL) was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 38, 39, 40, and 41 were prepared.
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、３７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、１８７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、又は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）４２、４３、４４、及び４５を調製した。Reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM ATP, 37.5 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mix, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM Reaction solution containing ATP, 125 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamate, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM ATP, 187.5 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamate, Reaction solutions containing 5.0 μM GluRS and 600 μM tRNA mixture, or 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM ATP, 250 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture. 150 μL of the reaction solution containing was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and working products (products of the present invention) 42, 43, 44, and 45 were prepared.
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例２３、２４で調製した実施品３８～４５のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１１に示す通り、ＡｒｇＲＳ及びＧｌｕＲＳ共に、ＡＴＰ：二価イオン比率が、１：１.５～１：１０において、各基質アミノ酸の全てが一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。(Measurement of pyrophosphate by molybdenum blue method: step (II) of the method of the present invention)
The pyrophosphate of Examples 38-45 prepared in Examples 23 and 24 was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 11, for both ArgRS and GluRS, at ATP: divalent ion ratios of 1:1.5 to 1:10, all of each substrate amino acid was used in a single enzymatic reaction (repeated). more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate produced in the case of non-utilization.
（各反応温度によるピロリン酸産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２.５ｍＭ ＭｎＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び２.５μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液を１５０μＬ調製し、２０、又は３０、又は４０、又は５０℃で６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。その結果、図１２に示す通り、２０～５０℃の広い範囲において、良好なピロリン酸の産生が認められた。また、ｔＲＮＡ又は/各基質アミノ酸の全てが一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。(Pyrophosphate production amount at each reaction temperature: step (I) of the method of the present invention)
150 μL of a reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 12.5 mM MnCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 2.5 μM tRNA was prepared, and 20 or 30, or 40 or 50° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. As a result, as shown in FIG. 12, good pyrophosphate production was observed over a wide range of 20 to 50.degree. In addition, more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate produced when all of the tRNA and/or each substrate amino acid were used (not reused) in the enzymatic reaction only once.
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０、又は４０、又は５０℃で６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。その結果、図１２に示す通り、３０～５０℃の広い範囲において、良好なピロリン酸の産生が認められた。また、各基質アミノ酸の全てが一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。150 μL of reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM ATP, 250 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture was prepared and incubated at 30, 40, or 50°C. Treated for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. As a result, as shown in FIG. 12, good pyrophosphate production was observed over a wide range of 30 to 50.degree. In addition, more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate produced when all of the substrate amino acids were used in the enzymatic reaction only once (not reused).
（各ｐＨによるピロリン酸産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ ＭＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、又は、２００ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、５０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。その結果、図１３に示す通り、ｐＨ７～８において、各基質アミノ酸の全てが一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。(Pyrophosphate production amount at each pH: step (I) of the method of the present invention)
Reaction solution containing 200 mM MES-KOH (pH 6.0), 12.5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mix, 200 mM HEPES-KOH (pH 7.0), 12 Reaction solution containing 5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 , 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mixture, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 , 20 μM L- Reaction solutions containing Arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mix or 200 mM CHES-KOH (pH 9.0), 12.5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 , 20 μM L-Arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM 150 μL of reaction solution containing the tRNA mixture was prepared and treated at 50° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. As a result, as shown in FIG. 13, at pH 7 to 8, more pyrophosphate than the theoretical value of the amount of pyrophosphate produced when all of the substrate amino acids were used (not reused) in the enzymatic reaction only once. was produced.
２００ｍＭ ＭＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液、又は、２００ｍＭ ＣＨＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ９．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、４０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。その結果、図１３に示す通り、ｐＨ７～９において、各基質アミノ酸の全てが一回きり酵素反応に使用された（再利用されない）場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。Reaction solution containing 200 mM MES-KOH (pH 6.0), 25 mM ATP, 250 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mix, 200 mM HEPES-KOH (pH 7.0), 25 mM ATP, Reaction solution containing 250 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamate, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture, 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM ATP, 250 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamate, 5.0 μM GluRS , and a reaction solution containing 600 μM tRNA mixture, or a reaction solution containing 200 mM CHES-KOH (pH 9.0), 25 mM ATP, 250 mM MgCl 2 , 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture. 150 μL was prepared and treated at 40° C. for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. As a result, as shown in FIG. 13, at pH 7 to 9, pyrophosphate more than the theoretical value of the amount of pyrophosphate produced when all of the substrate amino acids were used (not reused) in the enzymatic reaction only once. was produced.
（ｔＲＮＡを用いたモリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるアルギニンの検量線）
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２.５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０、１０、２０、又は３０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び１０μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液１５０μＬを調製し、５０℃、６０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１４に示すように、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～３０μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９６)が認められ、Ｌ-アルギニンの定量が可能であることが示された。(Standard curve of arginine in pyrophosphate measurement by molybdenum blue method using tRNA)
Prepare 150 μL of reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 12.5 mM MnCl 2 , 0, 10, 20, or 30 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 10 μM tRNA, The mixture was reacted at 50°C for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and pyrophosphate in the supernatant was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 14, more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate that would be produced if all the added amino acids were used in the reaction. Moreover, a correlation (R=0.96) was observed between the amino acid concentration and the amount of pyrophosphate in the amino acid concentration range of 0 to 30 μM, indicating that L-arginine can be quantified.
（ｔＲＮＡを用いたモリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるグルタミンの検量線）
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ ＡＴＰ、３０ｍＭ ＭgＣｌ２、０、５、１０、２０、又は３０μＭ Ｌ-グルタミン、２μＭ ＧｌｎＲＳ、及び１６μＭ ｔＲＮＡを含む反応溶液１５０μＬを調製し、４０℃、６０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１４に示すように、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～３０μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が認められ、Ｌ-グルタミンの定量が可能であることが示された。(Standard curve of glutamine in pyrophosphate measurement by molybdenum blue method using tRNA)
150 μL of a reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 3 mM ATP, 30 mM MgCl 2 , 0, 5, 10, 20, or 30 μM L-glutamine, 2 μM GlnRS, and 16 μM tRNA was prepared, heated at 40° C., 60° C. reacted for a minute. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and pyrophosphate in the supernatant was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 14, more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate that would be produced if all the added amino acids were used in the reaction. Moreover, a correlation (R=0.99) was observed between the amino acid concentration and the amount of pyrophosphate in the amino acid concentration range of 0 to 30 μM, indicating that L-glutamine can be quantified.
（ｔＲＮＡ混合品を用いたモリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるアルギニンの検量線）
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１２.５ｍＭ ＡＴＰ、１２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０、５、１０、又は２０μＭ Ｌ-アルギニン、２．５μＭ ＡｒｇＲＳ、及び４００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液１５０μＬを調製し、５０℃、６０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１４に示すように、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～２０μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が認められ、Ｌ-アルギニンの定量が可能であることが示された。(Arginine calibration curve in pyrophosphate measurement by molybdenum blue method using tRNA mixture)
Prepare 150 μL reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 12.5 mM ATP, 125 mM MgCl 2 , 0, 5, 10, or 20 μM L-arginine, 2.5 μM ArgRS, and 400 μM tRNA mixture; The mixture was reacted at 50°C for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and pyrophosphate in the supernatant was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 14, more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate that would be produced if all the added amino acids were used in the reaction. Moreover, a correlation (R=0.99) was observed between the amino acid concentration and the amount of pyrophosphate in the amino acid concentration range of 0 to 20 μM, indicating that L-arginine can be quantified.
（ｔＲＮＡ混合品を用いたモリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるグルタミン酸の検量線）
２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ ＡＴＰ、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０、５、１０、又は２０μＭ Ｌ-グルタミン酸、５．０μＭ ＧｌｕＲＳ、及び６００μＭ ｔＲＮＡ混合品を含む反応溶液１５０μＬを調製し、４０℃、６０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例７に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１４に示すように、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０～２０μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が認められ、Ｌ-グルタミン酸の定量が可能であることが示された。(Standard curve of glutamic acid in pyrophosphate measurement by molybdenum blue method using tRNA mixture)
Prepare 150 μL of reaction solution containing 200 mM HEPES-KOH (pH 8.0), 25 mM ATP, 250 mM MgCl 2 , 0, 5, 10, or 20 μM L-glutamic acid, 5.0 μM GluRS, and 600 μM tRNA mixture, at 40° C. , reacted for 60 minutes. After the reaction, 30 μL of trichloroacetic acid was added to a final concentration of 4% to terminate the reaction. After stopping the reaction, the precipitate was removed by centrifugation, and pyrophosphate in the supernatant was measured by the molybdenum blue method described in Example 7. As a result, as shown in FIG. 14, more pyrophosphate was produced than the theoretical amount of pyrophosphate that would be produced if all the added amino acids were used in the reaction. Moreover, a correlation (R=0.99) was observed between the amino acid concentration and the amount of pyrophosphate in the amino acid concentration range of 0 to 20 μM, indicating that L-glutamic acid can be quantified.
以上の結果から、本発明方法におけるＡＡＲＳ反応では、ＡＡＲＳ、ｔＲＮＡ及びアミノ酸を繰り返し反応に使用することで、産生されるピロリン酸を増幅できることが示された。実施例４～１１に示されるように、ＡｒｇＲＳ、ＧｌｕＲＳ及びＧｌｎＲＳのいずれにおいても当該反応で産生されるピロリン酸を反応液中のｔＲＮＡ及び/又はアミノ酸のモル数より多く産生させることができた。実施例１２～１７に示されるように、ｔＲＮＡ濃度によってピロリン酸の産生量は変化することが分かった。また、ｔＲＮＡが無添加の場合、ＡｒｇＲＳ、ＧｌｕＲＳ及びＧｌｎＲＳのいずれにおいてもピロリン酸の増加が認められなかったことから、これらのＡＡＲＳ反応には、ｔＲＮＡが必須であることが分かった。比較例１及び比較例２に示されるように、従来のＡＡＲＳ反応では、産生されるピロリン酸量が、反応液中のｔＲＮＡ及び/又はアミノ酸の分子数以下であったが、本発明の方法では、反応液中のｔＲＮＡ及び/又はアミノ酸の分子数以上のピロリン酸が産生されることが分かった。実施例２０～２５に示されるように、ＡＴＰ濃度やマグネシウム濃度によって、ピロリン酸の産生量が変化することが分かった。また、実施例２６～２９に示されるように、酵素反応温度及びｐＨによって、ピロリン酸の産生量は変化し、３０～５０℃、ｐＨ７～９で好適にピロリン酸が産生することが分かった。さらに、実施例３０～３３に示されるように、アミノ酸濃度に依存して直線的にピロリン酸が増加する、即ちアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係があることが分かり、本発明のＡＡＲＳ反応により産生したピロリン酸について、簡便な方法であるモリブデンブルー法による各種アミノ酸の定量が可能であることが確認された。 From the above results, it was shown that the AARS reaction in the method of the present invention can amplify the pyrophosphate produced by repeatedly using AARS, tRNA and amino acids in the reaction. As shown in Examples 4 to 11, all of ArgRS, GluRS and GlnRS were able to produce more pyrophosphate in the reaction than the number of moles of tRNA and/or amino acids in the reaction solution. As shown in Examples 12 to 17, it was found that the amount of pyrophosphate produced varies depending on the tRNA concentration. In addition, when no tRNA was added, no increase in pyrophosphate was observed in any of ArgRS, GluRS and GlnRS, indicating that tRNA is essential for these AARS reactions. As shown in Comparative Examples 1 and 2, in the conventional AARS reaction, the amount of pyrophosphate produced was less than the number of tRNA and/or amino acid molecules in the reaction solution. , it was found that more pyrophosphate was produced than the number of tRNA and/or amino acid molecules in the reaction solution. As shown in Examples 20 to 25, it was found that the amount of pyrophosphate produced varies depending on the ATP concentration and magnesium concentration. In addition, as shown in Examples 26-29, it was found that the amount of pyrophosphate produced varies depending on the enzyme reaction temperature and pH, and pyrophosphate is produced favorably at 30-50°C and pH 7-9. Furthermore, as shown in Examples 30 to 33, it was found that pyrophosphate increased linearly depending on the amino acid concentration, that is, there was a correlation between the amino acid concentration and the amount of pyrophosphate. It was confirmed that it was possible to quantify various amino acids from the produced pyrophosphate using the molybdenum blue method, which is a simple method.
従来のｔＲＮＡの会合を必要とするＡＡＲＳを用いたアミノ酸定量法では、微量な反応産物を検出する必要があり、放射線ラベルをした測定対象アミノ酸や高感度分析が必要不可欠であった。これに対して、本発明に係るアミノ酸定量方法によれば、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、反応液中に含まれるｔＲＮＡ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生させることができる。その結果、従来技術のような放射線ラベルをした測定対象アミノ酸は不必要である。また、従来技術に比べてより簡便な手段でこれら反応産生物を測定する場合であっても、従来技術の多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析のアミノ酸定量法のアミノ酸定量範囲と同等の範囲での定量が可能であり、このような高感度分析は不必要である。従って、本発明によって、ＡＡＲＳを用いてアミノ酸を特異的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供することが可能となった。 In the conventional amino acid quantification method using AARS, which requires association of tRNA, it is necessary to detect trace amounts of reaction products, and radiolabeled target amino acids and highly sensitive analysis are essential. In contrast, according to the method for quantifying amino acids according to the present invention, it is possible to produce reaction products such as pyrophosphate, which are the objects to be measured, to a larger number of moles than tRNA and/or amino acids contained in the reaction solution. can. As a result, radiolabeled amino acids to be measured as in the prior art are unnecessary. In addition, even if these reaction products are measured by a simpler means than the conventional technology, the amino acid quantification range of the amino acid quantification method of high-sensitivity analysis by fluorescence method using multi-step enzymatic reaction of the conventional technology can be quantified in a range equivalent to , and such high-sensitivity analysis is unnecessary. Therefore, according to the present invention, it has become possible to provide a method for quantifying amino acids specifically, easily, and with high sensitivity using AARS, and a kit for amino acid quantification.
Claims (6)
（工程Ｉ－１）試料中のアミノ酸（ＡＡ）に対応するアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）及び転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を反応させて、ＡＡＲＳとｔＲＮＡから成る複合体（ＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
（工程Ｉ－２）二価陽イオンの存在下、該ＡＡ、該ＡＡに対応するＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体から成る複合体（アミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体）を形成させる反応（反応２）を含む工程；
（工程Ｉ－３）反応２及び／又は反応４で形成されたアミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体（該複合体から生成され得るＡＡＲＳ及びアミノアシルｔＲＮＡも含む）にアミノ酸再生試薬を作用させて、ＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を遊離させる反応（反応３）を含む工程；
（工程Ｉ－４）反応３で遊離されたＡＡ、並びに、ＡＡＲＳ、ＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体及びｔＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一種以上の化合物を反応１及び／又は反応２において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ－ＡＡＲＳ－ｔＲＮＡ複合体反応を形成させる反応（反応４）を含む工程；及び、
（工程Ｉ－５）工程Ｉ－３及び工程Ｉ－４を繰り返す工程、並びに、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）、
を含む、試料中のアミノ酸定量方法であって、
前記工程（Ｉ）で用いるアミノ酸再生試薬が、ヌクレオチド及びアルカリ性化合物であることを特徴とするアミノ酸定量方法。 Step (I) comprising the following steps:
(Step I-1) Aminoacyl-tRNA synthetase (AARS) corresponding to an amino acid (AA) in a sample and transfer RNA (tRNA) are reacted to form a complex consisting of AARS and tRNA (AARS-tRNA complex). A step comprising a reaction (Reaction 1) to cause;
(Step I-2) reacting the AA, the AARS-tRNA complex corresponding to the AA, and adenosine triphosphate (ATP) in the presence of a divalent cation to form aminoacyl adenylic acid (aminoacyl AMP); a step comprising a reaction (reaction 2) to form a complex consisting of an AARS-tRNA complex (aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex);
(Step I-3) The aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex formed in Reaction 2 and/or Reaction 4 (including AARS and aminoacyl-tRNA that can be produced from the complex) is allowed to act with an amino acid renaturing reagent to obtain AA. , and a step comprising a reaction (reaction 3) for releasing at least one compound selected from the group consisting of AARS, AARS-tRNA complexes and tRNA;
(Step I-4) Reusing the AA released in Reaction 3 and at least one compound selected from the group consisting of AARS, AARS-tRNA complex and tRNA in Reaction 1 and/or Reaction 2 forming an aminoacyl AMP-AARS-tRNA complex reaction (reaction 4); and
(Step I-5) repeating steps I-3 and I-4, measuring the amount of the reaction product produced in step (I), and determining the amount of amino acid based on the measured amount of the reaction product; step (II) comprising determining
A method for quantifying amino acids in a sample comprising
A method for quantifying amino acids , wherein the amino acid regeneration reagent used in the step (I) is a nucleotide and an alkaline compound .
An amino acid quantification kit for performing the amino acid quantification method according to any one of claims 1 to 5 , comprising ATP, an amino acid regeneration reagent, and AARS and tRNA corresponding to the amino acid. Kit for.
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