JP7297232B2 - Method for saccharification of lignocellulosic biomass - Google Patents

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Description

本発明は、親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤、酵素安定化剤の製造方法、酵素の安定化方法、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法、及び酵素安定化剤の製造装置に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to an enzyme stabilizer containing a hydrophilic lignin derivative, a method for producing an enzyme stabilizer, a method for stabilizing an enzyme, a method for saccharifying lignocellulosic biomass, and an apparatus for producing an enzyme stabilizer.

近年、地球温暖化対策や、廃棄物の有効活用の観点から、植物資源を原料とするバイオマスの利用が注目されている。一般に、バイオマスからエタノール等の化合物を製造するための原料としては、サトウキビ等の糖質やトウモロコシ等のデンプン質が多く用いられている。しかしながら、これらの原料はもともと食料又は飼料として用いられており、長期的に工業用利用資源として活用することは、食料又は飼料用途との競合を引き起こし、原料価格の高騰を招く危険性がある。 BACKGROUND ART In recent years, the use of biomass made from plant resources has attracted attention from the viewpoint of global warming countermeasures and the effective use of waste. Generally, carbohydrates such as sugar cane and starches such as corn are often used as raw materials for producing compounds such as ethanol from biomass. However, these raw materials are originally used as food or feed, and there is a risk that their long-term use as industrial resources will cause competition with food or feed use, leading to a rise in raw material prices.

従って、非食用バイオマスをエネルギー資源として活用する技術開発が進められている。非食用バイオマスとしては、地球上に最も多く存在するセルロースがあげられるが、その大部分は芳香族ポリマーのリグニンやヘミセルロースとの複合体であるリグノセルロースとして存在する。 Therefore, technology development for utilizing non-edible biomass as an energy resource is underway. Cellulose is the most abundant non-edible biomass on earth, and most of it exists as lignocellulose, which is a complex with aromatic polymers such as lignin and hemicellulose.

このリグノセルロース系バイオマスを利用する場合、濃硫酸でバイオマス中のセルロースを単糖に分解した後に発酵させる手法が古くから検討されてきた。しかし、この手法は濃硫酸を取り扱うための装置の耐酸性や硫酸の効率的な回収技術の確立や管理が難しく、普及は進んでいない。 When using this lignocellulosic biomass, a method of decomposing cellulose in the biomass into monosaccharides with concentrated sulfuric acid and then fermenting the monosaccharides has long been studied. However, this method has not been widely used because it is difficult to establish and manage an acid-resistant device for handling concentrated sulfuric acid and an efficient recovery technique for sulfuric acid.

一方、硫酸などの酸を使わず、セルラーゼなどの酵素を使ってバイオマスの多糖成分を単糖化(糖化)し、酵母等によりエタノール発酵する方法(酵素糖化・発酵法)が検討されている。しかしながら、この手法を木材等のリグノセルロース系バイオマスに応用する場合、酵素糖化処理の前に何らかの処理(前処理)が必要とされている。 On the other hand, a method (enzymatic saccharification/fermentation method) that uses enzymes such as cellulase to monosaccharify (saccharify) biomass polysaccharide components without using acids such as sulfuric acid and then performs ethanol fermentation with yeast is being studied. However, when this method is applied to lignocellulosic biomass such as wood, some kind of treatment (pretreatment) is required before the enzymatic saccharification treatment.

酵素糖化の前処理は、バイオマス中のセルロース等に酵素が効果的に作用できる状態にする工程であり、物理的又は化学的な処理が行われる。物理的処理としてはボールミル等で摩砕する手法等がある。化学的な処理としては紙パルプ化の化学工程のように、化学薬剤でリグニンを除去してセルロースを得る手法等がある。例えば、特許文献1においては、アルカリ蒸解やクラフト蒸解などによりバイオマスを前処理し、バイオマス中のリグニンの大部分を取り除いた後、酵素糖化・発酵で効率的にバイオエタノールが製造可能であることが開示されている。 The pretreatment for enzymatic saccharification is a step of making cellulose or the like in biomass into a state in which enzymes can effectively act, and physical or chemical treatment is performed. As a physical treatment, there is a method of grinding with a ball mill or the like. As chemical treatment, there is a method of obtaining cellulose by removing lignin with a chemical agent, such as the chemical process of paper pulping. For example, in Patent Document 1, bioethanol can be efficiently produced by enzymatic saccharification/fermentation after pretreatment of biomass by alkali digestion or kraft digestion to remove most of the lignin in the biomass. disclosed.

一方、リグニンはバイオマスの3大主成分の一つであり、地上で2番目に蓄積されている有機化合物である。化学パルプ化工程やバイオエタノール前処理工程で分離され、紙パルプ生産やバイオエタノール生産で副産されるが、熱源以外の有効な利用法に乏しく、その有効利用法が模索されている。非特許文献1には、疎水性のリグニン誘導体が機能性原料となり得ることが開示されており、研究が進められている。 On the other hand, lignin is one of the three main components of biomass and the second most accumulated organic compound on earth. It is separated in the chemical pulping process and bioethanol pretreatment process, and is a by-product in paper pulp production and bioethanol production, but there are few effective ways to use it other than as a heat source, and effective ways to use it are being sought. Non-Patent Document 1 discloses that a hydrophobic lignin derivative can be a functional raw material, and research is underway.

特許文献2には、リグニンと親水性化合物との反応により生成されるリグニン誘導体を含む酵素安定化剤により、糖化酵素の活性を向上させ、また、糖化酵素の基質への非特異的吸着を防止することにより、リグノセルロース系バイオマスの糖化を効率的に行うことができることが開示されている。
特許文献3には、リグニンと親水性化合物との反応によりリグニン誘導体を製造する方法について開示されている。
In Patent Document 2, an enzyme stabilizer containing a lignin derivative produced by the reaction of lignin and a hydrophilic compound improves the activity of the saccharifying enzyme and prevents non-specific adsorption of the saccharifying enzyme to the substrate. It is disclosed that saccharification of lignocellulosic biomass can be efficiently performed by doing so.
Patent Document 3 discloses a method for producing a lignin derivative by reacting lignin with a hydrophilic compound.

特開2008-92910号公報Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2008-92910 国際公開第2011/111664号WO2011/111664 特開2017-197517号公報JP 2017-197517 A

Applied Clay Science, Volumes 132-133, November 2016, Pages 425-429Applied Clay Science, Volumes 132-133, November 2016, Pages 425-429

しかしながら、特許文献2には、リグニンと親水性化合物との反応により生成されるリグニン誘導体の利用方法について開示されているが、リグニンの利用は、リグニン誘導体に限られ、リグニン誘導体をさらに親水性分の液分画と疎水性分の固形分画に分離精製し各々のリグニン誘導体の有効利用については開示されていない。 However, although Patent Document 2 discloses a method of using a lignin derivative produced by the reaction of lignin and a hydrophilic compound, the use of lignin is limited to lignin derivatives, and the lignin derivative is further used as a hydrophilic component. There is no disclosure regarding the effective utilization of each of the lignin derivatives separated and purified into a liquid fraction and a hydrophobic solid fraction.

特許文献3には、リグニンと親水性化合物の反応によりリグニン誘導体を製造する方法について開示されているが、目的生成物は反応物に酸を混合して沈殿させて取得できる固体分画であり、分離された液体分画の利用については開示されていない。 Patent Document 3 discloses a method for producing a lignin derivative by reacting lignin with a hydrophilic compound, but the target product is a solid fraction that can be obtained by mixing an acid with the reactant and precipitating it, The use of a separated liquid fraction is not disclosed.

また、特許文献2、3には、反応させる親水性化合物の分子量や製造するリグニン誘導体の酵素安定化性能に対するリグニン誘導体の分子量の影響については開示されていない。 Further, Patent Documents 2 and 3 do not disclose the influence of the molecular weight of the hydrophilic compound to be reacted or the molecular weight of the lignin derivative on the enzyme stabilization performance of the lignin derivative to be produced.

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、リグノセルロース系バイオマスから得られるリグニン誘導体から、親水性リグニン誘導体を含む液分画と疎水性リグニン誘導体を含む固形分画を分離し、親水性リグニン誘導体を含む液分画を糖化酵素安定化剤として用い、疎水性リグニン誘導体を含む固形分画を機能性原料の製造に利用することにより、セルロース系バイオマスを用いるプロセス全体の収益性を向上させることを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative and a solid fraction containing a hydrophobic lignin derivative are separated from a lignin derivative obtained from lignocellulosic biomass. Improve the profitability of the entire process using cellulosic biomass by using the liquid fraction containing the hydrophobic lignin derivative as a saccharifying enzyme stabilizer and using the solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative for the production of functional raw materials. It is intended to

本発明者らは、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を反応させて得られたリグニン誘導体に、第二の酸を添加した後に固液分離をして液分画を得ることにより得られる親水性リグニン誘導体が、糖化酵素を安定化することにより、セルロース系バイオマスの糖化酵素による糖化を効率的に行うことができること、及び、上記固液分離をして得られた固形分画に含まれる疎水性リグニン誘導体から機能性原料を製造することができ、セルロース系バイオマスを用いるプロセス全体の収益性を向上させることができることを見出し、本発明を完成した。 The present inventors added a second acid to a lignin derivative obtained by reacting a first acid with a lignocellulosic biomass and a polyalkylene glycol, followed by solid-liquid separation to obtain a liquid fraction. The hydrophilic lignin derivative obtained by stabilizes the saccharifying enzyme, so that the saccharification of cellulosic biomass by the saccharifying enzyme can be performed efficiently, and the solid fraction obtained by the solid-liquid separation The inventors have found that a functional raw material can be produced from the hydrophobic lignin derivative contained in , and the profitability of the entire process using cellulosic biomass can be improved, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は以下の[1]~[19]に関する。
[1]リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させ、得られるリグニン誘導体に、第二の酸を添加後、固液分離をして液分画を得ることにより得られる親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤。
[2]親水性リグニン誘導体が、リグニンのコニフェリルアルコール骨格のα位の炭素にポリアルキレングリコール基を有し、前記ポリアルキレングリコールの末端が水酸基である[1]の酵素安定化剤。
[3]前記リグノセルロース系バイオマスが木粉である[1]又は[2]の酵素安定化剤。
[4]前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである[1]~[3]のいずれか1つの酵素安定化剤。
[5]前記ポリエチレングリコールの平均分子量が200~600である[4]の酵素安定化剤。
[6]前記親水性リグニン誘導体の平均分子量が1000~3200である[1]~[5]のいずれか1つの酵素安定化剤。
[7]前記第一の酸又は第二の酸が硫酸である[1]~[6]のいずれか1つの酵素安定化剤。
[8]リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させ、得られるリグニン誘導体に、第二の酸を添加後、固液分離をして液分画を得ることを特徴とする親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤の製造方法。
[9]以下の工程を含む親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤の製造方法。
(1)リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させる工程、
(2)工程(1)で得られた反応液にアルカリを添加して中和する工程、
(3)工程(2)で得られたアルカリ中和液から固形分を除く工程、
(4)工程(3)で得られた液分画に第二の酸を添加する工程、及び、
(5)工程(4)で沈殿した沈殿物に対し固液分離を行い、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得る工程
[10]親水性リグニン誘導体が、リグニンのコニフェリルアルコール骨格のα位の炭素にポリアルキレングリコール基を有し、前記ポリアルキレングリコールの末端が水酸基である[8]又は[9]の酵素安定化剤の製造方法。
[11]前記リグノセルロース系バイオマスが木粉である[8]~[10]のいずれか1つの酵素安定化剤の製造方法。
[12]前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである[8]~[11]のいずれか1つの酵素安定化剤の製造方法。
[13]前記ポリエチレングリコールの平均分子量が200~600である[12]の酵素安定化剤の製造方法。
[14]前記親水性リグニン誘導体の平均分子量が1000~3200である[8]~[13]のいずれか1つの酵素安定化剤の製造方法。
[15]前記第一の酸又は第二の酸が硫酸である[8]~[13]のいずれか1つの酵素安定化剤の製造方法。
[16]基質と酵素の反応系に、[1]~[7]のいずれか1つの酵素安定化剤、又は[8]~[15]のいずれか1つの製造方法により得られる酵素安定化剤を添加することを特徴とする酵素の安定化方法。
[17]リグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化方法において、[1]~[7]のいずれか1つの酵素安定化剤、又は[8]~[15]のいずれか1つの製造方法により得られる酵素安定化剤を添加することを含む、リグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
[18]前記酵素安定化剤中の親水性リグニン誘導体を、酵素糖化されるリグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対し0.1~1.0質量%となるように添加する、[17]の糖化方法。
[19]アルカリ供給手段を有し、リグノセルロース系バイオマスとポリエチレングリコールとに第一の酸を反応させる第一の反応槽と、
濾過装置と、
前記濾過装置を用いて固液分離して得られた液分画と第二の酸とを反応させる第二の反応槽と、
固液分離装置と、
を備えることを特徴とする酵素安定化剤の製造装置。
That is, the present invention relates to the following [1] to [19].
[1] By adding a first acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol and reacting them, adding a second acid to the resulting lignin derivative, and then performing solid-liquid separation to obtain a liquid fraction. An enzyme stabilizer comprising the resulting hydrophilic lignin derivative.
[2] The enzyme stabilizer of [1], wherein the hydrophilic lignin derivative has a polyalkylene glycol group at the α-position carbon of the coniferyl alcohol skeleton of lignin, and the terminal of the polyalkylene glycol is a hydroxyl group.
[3] The enzyme stabilizer of [1] or [2], wherein the lignocellulosic biomass is wood flour.
[4] The enzyme stabilizer according to any one of [1] to [3], wherein the polyalkylene glycol is polyethylene glycol.
[5] The enzyme stabilizer of [4], wherein the polyethylene glycol has an average molecular weight of 200-600.
[6] The enzyme stabilizer according to any one of [1] to [5], wherein the hydrophilic lignin derivative has an average molecular weight of 1,000 to 3,200.
[7] The enzyme stabilizer according to any one of [1] to [6], wherein the first acid or second acid is sulfuric acid.
[8] Adding a first acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol for reaction, adding a second acid to the resulting lignin derivative, and then performing solid-liquid separation to obtain a liquid fraction. A method for producing an enzyme stabilizer comprising a hydrophilic lignin derivative characterized by:
[9] A method for producing an enzyme stabilizer containing a hydrophilic lignin derivative, comprising the following steps.
(1) adding a first acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol to react them;
(2) adding alkali to the reaction solution obtained in step (1) to neutralize;
(3) removing solids from the neutralized alkaline solution obtained in step (2);
(4) adding a second acid to the liquid fraction obtained in step (3); and
(5) Perform solid-liquid separation on the precipitate precipitated in step (4) to obtain a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative [10] A hydrophilic lignin derivative is at the α-position of the coniferyl alcohol skeleton of lignin having a polyalkylene glycol group at the carbon of [8] or [9], wherein the end of the polyalkylene glycol is a hydroxyl group.
[11] The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of [8] to [10], wherein the lignocellulosic biomass is wood flour.
[12] The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of [8] to [11], wherein the polyalkylene glycol is polyethylene glycol.
[13] The method for producing an enzyme stabilizer according to [12], wherein the polyethylene glycol has an average molecular weight of 200-600.
[14] The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of [8] to [13], wherein the hydrophilic lignin derivative has an average molecular weight of 1000 to 3200.
[15] The method for producing an enzyme stabilizer according to any one of [8] to [13], wherein the first acid or second acid is sulfuric acid.
[16] The enzyme stabilizer according to any one of [1] to [7], or the enzyme stabilizer obtained by the production method of any one of [8] to [15], in the reaction system of the substrate and the enzyme. A method for stabilizing an enzyme, characterized by adding
[17] In the enzymatic saccharification method of lignocellulosic biomass, the enzyme stabilizer of any one of [1] to [7] or the enzyme obtained by the production method of any one of [8] to [15] A method of saccharification of lignocellulosic biomass comprising adding a stabilizer.
[18] The saccharification of [17], wherein the hydrophilic lignin derivative in the enzyme stabilizer is added so as to be 0.1 to 1.0% by mass relative to the dry weight of the lignocellulosic biomass to be enzymatically saccharified. Method.
[19] A first reaction tank having an alkali supply means, for reacting the lignocellulosic biomass and polyethylene glycol with the first acid;
a filtering device;
a second reaction tank for reacting a liquid fraction obtained by solid-liquid separation using the filtration device with a second acid;
a solid-liquid separator;
An apparatus for producing an enzyme stabilizer, comprising:

本発明によれば、リグノセルロース系バイオマスから、酵素安定化剤として有用な親水性リグニン誘導体を含む液分画と同時に、機能性原料として有用な疎水性リグニン誘導体を含む固形分画を得ることできることにより、リグノセルロース系バイオマスを用いるプロセス全体における収益性を向上させることができる。 According to the present invention, a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative useful as an enzyme stabilizer and a solid fraction containing a hydrophobic lignin derivative useful as a functional raw material can be obtained from lignocellulosic biomass. can improve the profitability of the overall process using lignocellulosic biomass.

本発明の実施形態に係る酵素安定化剤の製造方法及び該酵素安定化剤の製造装置を模式的に示す概略構成図である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS Fig. 1 is a schematic configuration diagram schematically showing a method for producing an enzyme stabilizer and an apparatus for producing the enzyme stabilizer according to an embodiment of the present invention; 実施例1で得られた液分画と固形分画を用いた糖化反応の結果を示す図である。1 is a diagram showing the results of saccharification reactions using the liquid fraction and solid fraction obtained in Example 1. FIG. ポリエチレングリコールとして、ポリエチレングリコール(PEG)200、PEG400、及びPEG600を用いた場合のリグニン誘導体の添加率とC6糖化率との関係を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the addition rate of lignin derivatives and the C6 saccharification rate when polyethylene glycol (PEG) 200, PEG 400, and PEG 600 are used as polyethylene glycol. ポリエチレングリコールとして、ポリエチレングリコール(PEG)200、PEG600、及びPEG1000を用いた場合の、反応させるPEG分子量と糖収量比との関係を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the PEG molecular weight to be reacted and the sugar yield ratio when polyethylene glycol (PEG) 200, PEG600, and PEG1000 are used as polyethylene glycol. ポリエチレングリコールとして、ポリエチレングリコール(PEG)400を用いて調製した実施例2のリグニン誘導体、及び比較例1にて調製したリグニン誘導体の添加率とC6糖化率との関係を示す図である。It is a figure which shows the relationship between the addition rate of the lignin derivative of Example 2 prepared using polyethylene glycol (PEG) 400 as polyethylene glycol, and the lignin derivative prepared in Comparative Example 1, and C6 saccharification rate.

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。なお、本明細書及び請求の範囲において、各種用語の意味を以下のとおり定義する。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. In addition, in this specification and claims, the meanings of various terms are defined as follows.

(1)酵素の安定化
本明細書中で使用される場合、「酵素の安定化」とは、基質と酵素との反応において、酵素安定化剤を存在させることにより、酵素の失活を防ぎ、酵素活性を高い値に維持することを意味する。具体的には、例えば、後述する試験例1の酵素糖化反応条件下で、残存酵素活性が、酵素安定化剤を使用していない場合と比較して、10%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50%以上高いことをいう。なお、酵素活性測定法は、本明細書記載の方法、市販品であればカタログ記載の方法、文献等に記載の方法などの中から当業者が適宜採用することができる。
(1) Enzyme stabilization As used herein, "enzyme stabilization" refers to the presence of an enzyme stabilizer in the reaction between a substrate and an enzyme to prevent deactivation of the enzyme. , means that the enzyme activity is maintained at a high value. Specifically, for example, under the enzymatic saccharification reaction conditions of Test Example 1 described later, the residual enzyme activity is 10% or more, preferably 20% or more, compared to the case where the enzyme stabilizer is not used, More preferably, it means 50% or higher. Enzyme activity measurement methods can be appropriately selected by those skilled in the art from among the methods described in this specification, methods described in catalogs for commercially available products, methods described in literature, and the like.

(2)酵素
本明細書中で使用される場合、「酵素」とは、化学反応を触媒するタンパク質を中心とした高分子化合物をいい、特に、糖化酵素をいう。糖化酵素としては、セルロースを分解するセルラーゼ、ヘミセルロースを分解するヘミセルラーゼ、グルコキシダーゼ(βグルコキシダーゼ)、デンプンを分解するアミラーゼ等が挙げられ、好ましくはセルラーゼである。
(2) Enzyme As used herein, the term “enzyme” refers to a high-molecular compound mainly composed of protein that catalyzes chemical reactions, and particularly refers to saccharifying enzymes. Saccharifying enzymes include cellulases that degrade cellulose, hemicellulase that decomposes hemicellulose, glucoxidase (β-glucoxidase), amylase that decomposes starch, and the like, preferably cellulase.

(3)親水性リグニン誘導体
本明細書中で使用される場合、「親水性リグニン誘導体」とは、前記親水性リグニン誘導体を構成するコニフェリルアルコール骨格のα位の炭素のいずれかにポリアルキレングリコール基を有し、リグノセルロース系バイオマスと、末端に水酸基を有するポリアルキレングリコールとに硫酸を添加して得られるリグニン誘導体のうち、硫酸によりpHを2~3にした時に沈殿しないリグニン誘導体をいう。親水性リグニン誘導体としては、分子量1000~3200のものが好ましい。これは分子量1000以下では親水性が不十分となる傾向があり、一方3200以上では分子量が大きいため酵素安定化剤としての機能が低下する傾向があるためである。
(3) Hydrophilic lignin derivative As used herein, the term "hydrophilic lignin derivative" refers to a polyalkylene glycol at any of the α-position carbons of the coniferyl alcohol skeleton that constitutes the hydrophilic lignin derivative. Among lignin derivatives obtained by adding sulfuric acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol having a terminal hydroxyl group, it refers to a lignin derivative that does not precipitate when the pH is adjusted to 2 to 3 with sulfuric acid. As the hydrophilic lignin derivative, those having a molecular weight of 1,000 to 3,200 are preferred. This is because if the molecular weight is less than 1000, the hydrophilicity tends to be insufficient, while if the molecular weight is greater than 3200, the function as an enzyme stabilizer tends to decrease due to the high molecular weight.

(4)疎水性リグニン誘導体
本明細書中で使用される場合、「疎水性リグニン誘導体」とは、前記疎水性リグニン誘導体を構成するコニフェリルアルコール骨格のα位の炭素のいずれかにポリアルキレングリコール基を有し、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに硫酸を添加して得られるリグニン誘導体のうち、硫酸によりpHを2~3にした時に沈殿するリグニン誘導体をいう。疎水性リグニン誘導体としては、分子量4000~20000のものが好ましい。
(4) Hydrophobic Lignin Derivative As used herein, the term “hydrophobic lignin derivative” refers to a polyalkylene glycol at any of the α-position carbons of the coniferyl alcohol skeleton that constitutes the hydrophobic lignin derivative. Among lignin derivatives obtained by adding sulfuric acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol, it refers to a lignin derivative that precipitates when the pH is adjusted to 2 to 3 with sulfuric acid. Hydrophobic lignin derivatives having a molecular weight of 4,000 to 20,000 are preferred.

[実施形態1:酵素安定化剤及び該酵素安定化剤の製造方法]
本実施形態に係る酵素安定化剤は、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させ、得られるリグニン誘導体に、第二の酸を添加後、固液分離をして液分画を得ることにより得られる親水性リグニン誘導体を含む酵素安定化剤である。ここで、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させ、得られるリグニン誘導体に、第二の酸を添加後、固液分離をして得られる親水性リグニン誘導体を含む液分画は、基質と酵素との反応において、酵素活性を安定化することができることが、後述する実施例で実証されている。従って、本実施形態に係る酵素安定化剤は、酵素の失活を防ぎ、酵素活性を安定化することができる。
[Embodiment 1: Enzyme stabilizer and method for producing the enzyme stabilizer]
The enzyme stabilizer according to the present embodiment is obtained by adding a first acid to lignocellulose biomass and polyalkylene glycol to react, adding a second acid to the obtained lignin derivative, and then performing solid-liquid separation. It is an enzyme stabilizer containing a hydrophilic lignin derivative obtained by obtaining a liquid fraction with Here, a hydrophilic lignin derivative obtained by adding a second acid to the lignin derivative obtained by adding a first acid to lignocellulose-based biomass and polyalkylene glycol to react with each other and performing solid-liquid separation is obtained. It has been demonstrated in the examples described later that the liquid fraction containing the enzyme can stabilize the enzyme activity in the reaction between the substrate and the enzyme. Therefore, the enzyme stabilizer according to this embodiment can prevent enzyme deactivation and stabilize enzyme activity.

(リグノセルロース系バイオマス)
本発明において、リグノセルロース系バイオマスは、木本植物、草本植物、それらの加工物およびそれらの廃棄物からなる群より選ばれる少なくとも1種であればその種類は問わないが、細かく粉砕した方が好ましい。
(lignocellulosic biomass)
In the present invention, the lignocellulosic biomass is of any type as long as it is at least one selected from the group consisting of woody plants, herbaceous plants, processed products thereof, and waste products thereof. preferable.

本発明における木本植物とは、スギ、ヒノキ、カラマツ、マツ、米マツ、米スギ、米ツガ、ポプラ、シラカバ、ヤナギ、ユーカリ、クヌギ、コナラ、カシ、シイ、ブナ、アカシア、タケ、ササ、アブラヤシ、サゴヤシなどを例示することができるが、性状の安定性の観点からスギが好ましい。また、樹皮、枝条、果房、果実殻なども使用することができる。また、これらを使った合板、繊維板、集成材のような加工材も使用することができる。また、建築物に使用後、解体された部材も使用することができる。また、紙などリグノセルロース系バイオマスの加工物や古紙も使用することができる。 Woody plants in the present invention include cedar, cypress, larch, pine, rice pine, rice cedar, rice hemlock, poplar, white birch, willow, eucalyptus, sawtooth oak, konara oak, oak, seaweed, beech, acacia, bamboo, bamboo, Oil palm, sago palm and the like can be exemplified, but cedar is preferable from the viewpoint of stability of properties. In addition, bark, branches, fruit clusters, fruit shells, etc. can also be used. In addition, processed materials such as plywood, fiberboard and laminated lumber using these materials can also be used. In addition, members dismantled after being used in buildings can also be used. In addition, processed products of lignocellulose biomass such as paper and used paper can also be used.

本発明における草本植物とは、イネ、ムギ、サトウキビ、ヨシ、ススキ、トウモロコシ
などを挙げることができる。
Examples of herbaceous plants in the present invention include rice, wheat, sugar cane, reeds, pampas grass, and corn.

(ポリアルキレングリコール)
本発明において、ポリアルキレングリコールとしては、アルキレングリコールが重合したものであれば、特に制限はないが、末端に水酸基を有するものが好ましい。例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられるが、ポリエチレングリコールが好ましい。ポリアルキレングリコールの分子量は本発明の酵素安定化剤の製造に用いることができれば特に制限はないが、ポリエチレングリコールの場合は、200~1000が好ましく、400~600がより好ましい。
(polyalkylene glycol)
In the present invention, the polyalkylene glycol is not particularly limited as long as it is polymerized alkylene glycol, but preferably has a terminal hydroxyl group. Examples thereof include polyethylene glycol, polypropylene glycol, etc., and polyethylene glycol is preferred. The molecular weight of the polyalkylene glycol is not particularly limited as long as it can be used for the production of the enzyme stabilizer of the present invention.

これらポリアルキレングリコールは、市販のものを用いてもよいし、当該分野で公知の方法により調製したものを用いてもよい。 These polyalkylene glycols may be commercially available or may be prepared by methods known in the art.

(リグニン誘導体)
リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールとに第一の酸を添加して反応させることにより、リグノセルロース系バイオマス中のリグニンからリグニン誘導体を液分画中に得ることができる。このようにして得られるリグニン誘導体を含む液分画は、親水性リグニン誘導体と疎水性リグニン誘導体を含む。図1に本発明に係るリグニン誘導体を含む液分画の製造方法の概略を示す。
以下、図1を参照しながら、当該リグニン誘導体を含む液分画の製造方法を具体的に説明する。
(lignin derivative)
A lignin derivative can be obtained in a liquid fraction from lignin in the lignocellulosic biomass by adding a first acid to the lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol and reacting them. The liquid fraction containing the lignin derivative thus obtained contains the hydrophilic lignin derivative and the hydrophobic lignin derivative. FIG. 1 shows an outline of a method for producing a liquid fraction containing a lignin derivative according to the present invention.
Hereinafter, a method for producing a liquid fraction containing the lignin derivative will be specifically described with reference to FIG.

本発明に係るリグニン誘導体を含む液分画は以下の工程により製造することができる。
(1)リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールとに第一の酸を添加して反応させる工程(図中11)、
(2)工程(1)で得られた反応液にアルカリを添加して中和する工程(図中12)、
(3)工程(2)で得られたアルカリ中和液から固形分画を除く工程(図中13)、
A liquid fraction containing the lignin derivative according to the present invention can be produced by the following steps.
(1) a step of adding a first acid to lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol to react (11 in the figure);
(2) a step of adding an alkali to the reaction solution obtained in step (1) to neutralize it (12 in the figure);
(3) a step of removing the solid fraction from the neutralized alkaline solution obtained in step (2) (13 in the figure);

上記工程(1)において、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールとを反応する際に用いられる第一の酸としては、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールからリグニン誘導体を生成させることができれば特に制限はなく、塩酸、硫酸等が用いられ、硫酸が好ましく用いられる。添加量は、通常、ポリアルキレングリコールに対して、0.1~3.0重量部である。 In the above step (1), the first acid used when reacting the lignocellulose biomass and the polyalkylene glycol is not particularly limited as long as it can produce a lignin derivative from the lignocellulose biomass and the polyalkylene glycol. Hydrochloric acid, sulfuric acid, or the like is used, and sulfuric acid is preferably used. The amount added is usually 0.1 to 3.0 parts by weight based on the polyalkylene glycol.

リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールとの反応において、リグノセルロース系バイオマスに対して反応させるポリアルキレングリコールの量は、使用されるリグノセルロース系バイオマス中のリグニン及びポリアルキレングリコールの種類、並びに目的とする酵素安定化剤の性能に依存して決定することができる。例えば、加えるポリアルキレングリコールの量は、使用するリグノセルロース系バイオマス中に存在するリグニン中の水酸基の量、及び加えるポリアルキレングリコール中の水酸基の量に基づき算出される。ポリアルキレングリコールは、リグニンのα位の炭素原子に結合している水酸基と反応する。ポリアルキレングリコールの量は、通常、リグノセルロース系バイオマス10乾燥重量部に対しポリアルキレングリコール5~100重量部、好ましくは、10~60重量部、より好ましくは、20~50重量部である。 In the reaction between lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol, the amount of polyalkylene glycol to be reacted with lignocellulosic biomass depends on the type of lignin and polyalkylene glycol in the lignocellulosic biomass used and the desired amount. It can be determined depending on the performance of the enzyme stabilizer. For example, the amount of polyalkylene glycol to be added is calculated based on the amount of hydroxyl groups in lignin present in the lignocellulosic biomass to be used and the amount of hydroxyl groups in the polyalkylene glycol to be added. Polyalkylene glycol reacts with the hydroxyl groups attached to the α carbon atoms of lignin. The amount of polyalkylene glycol is usually 5 to 100 parts by weight, preferably 10 to 60 parts by weight, more preferably 20 to 50 parts by weight based on 10 parts by dry weight of lignocellulosic biomass.

反応温度は、特に制限はないが、通常、100℃~200℃、好ましくは120℃~160℃である。 Although the reaction temperature is not particularly limited, it is usually 100°C to 200°C, preferably 120°C to 160°C.

反応時間は、特に制限はないが、通常、30分間~180分間、好ましくは60分間~120分間である。 Although the reaction time is not particularly limited, it is usually 30 to 180 minutes, preferably 60 to 120 minutes.

上記工程(2)において、添加するアルカリとしては、工程(1)で得られた反応液を中和できるものであれば、特に制限はないが、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化リチウム等が挙げられる。
アルカリ添加後の反応液のpHは、pH6以上12以下であること好ましく、pH6以上10以下であることがより好ましい。
上記工程(3)において、アルカリ中和液から固形分を除く方法としては、アルカリ中和液から固形分を除くことができれば特に制限はないが、例えば、遠心分離、スクリュープレス、フィルタープレス、透過膜等が挙げられる。上記工程(3)で固形分を除いて得られた液分画に、親水性および疎水性リグニン誘導体が含まれ、親水性リグニン誘導体は本発明の酵素安定化剤として用いることができる。
In the above step (2), the alkali to be added is not particularly limited as long as it can neutralize the reaction solution obtained in step (1). Calcium, magnesium hydroxide, lithium hydroxide and the like can be mentioned.
The pH of the reaction solution after addition of the alkali is preferably 6 or more and 12 or less, more preferably 6 or more and 10 or less.
In the above step (3), the method for removing the solid content from the neutralized alkaline solution is not particularly limited as long as the solid content can be removed from the neutralized alkaline solution. membranes and the like. The liquid fraction obtained by removing the solid content in step (3) contains hydrophilic and hydrophobic lignin derivatives, and the hydrophilic lignin derivative can be used as the enzyme stabilizer of the present invention.

(親水性リグニン誘導体)
リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させることにより得られる上記リグニン誘導体を含む液分画に、第二の酸を添加後、固液分離をして、固形物を分離し、親水性リグニン誘導体を含む液分画得ることができる。以下、図1を参照しながら、該親水性リグニン誘導体を含む液分画の製造方法を具体的に説明する。
(Hydrophilic lignin derivative)
After adding a second acid to the liquid fraction containing the lignin derivative obtained by adding the first acid to the lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol and reacting them, solid-liquid separation is performed to obtain a solid can be separated to obtain a liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative. Hereinafter, a method for producing a liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative will be specifically described with reference to FIG.

本発明に係る親水性リグニン誘導体を含む液分画は以下の工程により製造することができる。
(4)上記の工程(3)で得られた液分画に第二の酸を添加する工程(図中14)、
(5)上記工程(4)で沈殿した固形物に対し固液分離を行い、リグニン誘導体を含む液分画を得る工程(図中15)。
A liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative according to the present invention can be produced by the following steps.
(4) a step of adding a second acid to the liquid fraction obtained in step (3) above (14 in the figure);
(5) A step of performing solid-liquid separation on the solid precipitated in step (4) to obtain a liquid fraction containing a lignin derivative (15 in the figure).

リグニン誘導体を含む液分画に添加する第二の酸としては、液分画を酸性にすることができれば特に制限はないが、pHを1~4とすることができる酸が好ましく、とくに硫酸が好ましい。添加量は、通常、液分画に対して、0.01~3.0重量部である。
液分画に第二の酸を加えて酸性にすることにより、未反応のリグニン及び疎水性リグニン誘導体が沈殿し、固液分離をして、固形物を分離することにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画が得られる。なお、前記液分画には、親水性リグニン誘導体の他に未反応のポリアルキレングリコールが含まれるため、前記液分画の未反応のポリアルキレングリコールは工程(1)に再利用することが可能である。
固液分離の方法としては、第二の酸を添加して生成する固形物を分離できる方法であれば、特に制限はないが、遠心分離が好ましい。遠心分離は、通常、2000g~20000g、好ましくは、5000g~15000gである。
The second acid added to the liquid fraction containing the lignin derivative is not particularly limited as long as it can acidify the liquid fraction, but an acid capable of adjusting the pH to 1 to 4 is preferable, and sulfuric acid is particularly preferred. preferable. The amount added is usually 0.01 to 3.0 parts by weight based on the liquid fraction.
By adding a second acid to the liquid fraction to make it acidic, unreacted lignin and hydrophobic lignin derivatives are precipitated, solid-liquid separation is performed, and the solids are separated to obtain hydrophilic lignin derivatives. A liquid fraction containing Since the liquid fraction contains unreacted polyalkylene glycol in addition to the hydrophilic lignin derivative, the unreacted polyalkylene glycol in the liquid fraction can be reused in step (1). is.
The method for solid-liquid separation is not particularly limited as long as it is a method capable of separating the solids produced by adding the second acid, but centrifugation is preferred. Centrifugation is usually from 2000g to 20000g, preferably from 5000g to 15000g.

反応により得られた親水性リグニン誘導体を含む上記液分画は、そのまま酵素安定化剤として使用することができるが、必要に応じて、脱塩及び未反応のポリアルキレングリコールの除去のために、限外濾過やイオン交換樹脂、合成吸着剤、活性炭等に付してもよい。 The liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative obtained by the reaction can be used as it is as an enzyme stabilizer. It may be subjected to ultrafiltration, ion exchange resin, synthetic adsorbent, activated carbon, or the like.

反応により得られた親水性リグニン誘導体を含む液分画は、必要に応じて、凍結乾燥機等の従来使用されている乾燥方法により完全に乾燥させてもよい。 If necessary, the liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative obtained by the reaction may be completely dried by a conventionally used drying method such as a freeze dryer.

(酵素安定化剤)
本発明の親水性リグニン誘導体を含む液分画を酵素安定化剤として使用する場合は、水溶液の形態で使用してもよいし、または、乾燥させたものを粉体化して使用してもよい。
(enzyme stabilizer)
When the liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative of the present invention is used as an enzyme stabilizer, it may be used in the form of an aqueous solution, or it may be dried and powdered. .

本発明の酵素安定化剤には、その性能を阻害しない範囲で、任意の添加剤を添加してもよい。そのような添加剤としては、例えば、pH調整剤、酸化防止剤、水溶性若しくは水不溶性担体、分散剤、水溶性の金属の無機または有機酸塩等が挙げられる。 Any additive may be added to the enzyme stabilizer of the present invention as long as it does not impair its performance. Examples of such additives include pH adjusters, antioxidants, water-soluble or water-insoluble carriers, dispersants, water-soluble inorganic or organic acid salts of metals, and the like.

前記pH調整剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等が挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 Examples of the pH adjuster include citric acid, sodium citrate, potassium citrate, and the like. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.

前記酸化防止剤としては、例えば、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 Examples of the antioxidant include butylhydroxytoluene, distyrenated cresol, sodium sulfite and sodium hydrogensulfite. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.

前記水溶性又は水不溶性担体としては、例えば、水、アルコール類(エタノール、イソプロピルアルコール等)、ジオール(例えば、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,6-ヘキサンジオール)、他のポリオール(例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等)、エーテル類(例えば、ジプロピレングリコールモノメチルエーテル等)、ケトン類(例えば、シクロヘキサノン等)、エステル類(例えば、コハク酸ジメチル、アジピン酸ジメチル等)、含窒素類(例えば、N-メチル-2-ピロリドン、N,N-ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等)等の水溶性担体;脂肪族や芳香族の炭化水素系溶剤(例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、キシレン、トルエン、ドデシルベンゼン、ミネラルスピリット、芳香族系ナフサ等)、油脂類(例えば、ヤシ油、大豆油、ナタネ油、ヒマシ油、アマニ油等)等の水不溶性担体等が挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 Examples of the water-soluble or water-insoluble carrier include water, alcohols (ethanol, isopropyl alcohol, etc.), diols (eg, ethylene glycol, 1,2-propanediol, 1,6-hexanediol), other polyols ( polyethylene glycol, polypropylene glycol, etc.), ethers (e.g., dipropylene glycol monomethyl ether, etc.), ketones (e.g., cyclohexanone, etc.), esters (e.g., dimethyl succinate, dimethyl adipate, etc.), nitrogen-containing compounds Water-soluble carriers such as (e.g., N-methyl-2-pyrrolidone, N,N-dimethylformamide, acetonitrile, etc.); aliphatic and aromatic hydrocarbon solvents (e.g., pentane, hexane, heptane, xylene, toluene, water-insoluble carriers such as dodecylbenzene, mineral spirits, aromatic naphtha, etc.), oils and fats (eg, coconut oil, soybean oil, rapeseed oil, castor oil, linseed oil, etc.). These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.

前記分散剤としては、例えば、アクリレートホモポリマー、アクリレートコポリマー又はそれらの混合物等が挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 Examples of the dispersant include acrylate homopolymers, acrylate copolymers, mixtures thereof, and the like. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.

前記水溶性の金属の無機又は有機酸塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、モノ、ジ、トリエタノールアミン塩等のアルカノールアミン塩等が挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 Examples of the inorganic or organic acid salts of water-soluble metals include alkali metal salts such as sodium and potassium, alkaline earth metal salts such as magnesium, and alkanolamine salts such as mono-, di-, and triethanolamine salts. be done. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.

[実施形態2:酵素の安定化方法]
本実施形態に係る酵素の安定化方法は、基質と酵素との反応系に、前記酵素安定化剤を添加することを特徴とする酵素の安定化方法である。ここで、リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールとの反応により生成される親水性リグニン誘導体を含む液分画は、基質と酵素との反応において、酵素活性を安定化することができることが、後述する実施例で実証されている。したがって、本実施形態に係る酵素の安定化方法は、前記親水性リグニン誘導体を含む液分画を使用するので、酵素活性を安定化することができる。
[Embodiment 2: Enzyme stabilization method]
The method for stabilizing an enzyme according to the present embodiment is a method for stabilizing an enzyme, which comprises adding the enzyme stabilizer to a reaction system between a substrate and an enzyme. Here, it will be described later that the liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative produced by the reaction between the lignocellulosic biomass and the polyalkylene glycol can stabilize the enzymatic activity in the reaction between the substrate and the enzyme. Examples demonstrate this. Therefore, the enzyme stabilization method according to the present embodiment uses the liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative, so that the enzyme activity can be stabilized.

本実施形態に係る酵素の安定化方法に使用される親水性リグニン誘導体は、基本的には、実施形態1において具体的に説明された酵素安定化剤に使用される親水性リグニン誘導体と同様の構成及び作用効果を有する。よって、実施形態1と同様の内容については、適宜説明を省略する。 The hydrophilic lignin derivative used in the enzyme stabilization method according to the present embodiment is basically the same as the hydrophilic lignin derivative used for the enzyme stabilizer specifically described in Embodiment 1. It has a configuration and operational effects. Therefore, descriptions of the same contents as in the first embodiment will be omitted as appropriate.

酵素反応の酵素としては、糖化酵素が好ましく、特にセルラーゼが好ましい。酵素反応
の基質としては、セルロースが好ましく、特に木材等を由来とするリグノセルロースが好
ましい。
As the enzyme for the enzymatic reaction, a saccharifying enzyme is preferred, and cellulase is particularly preferred. As the substrate for the enzymatic reaction, cellulose is preferred, and lignocellulose derived from wood or the like is particularly preferred.

本実施形態に係る酵素の安定化方法に使用される酵素安定化剤の添加量は、任意であるが、例えば、リグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対して、酵素安定化剤に含まれる親水性リグニン誘導体の重量が、好ましくは0.1~3.0質量%、より好ましくは0.2~1.0質量%、特に好ましくは0.3~0.7質量%となる量である。このような好ましい添加量であると、酵素の失活をより防ぐことができ、酵素活性をより安定化することができる。
反応液に添加する親水性リグニン誘導体の濃度は、以下の式により算出することができる。
The amount of the enzyme stabilizer used in the method for stabilizing enzymes according to the present embodiment is arbitrary. The weight of the lignin derivative is preferably 0.1 to 3.0% by mass, more preferably 0.2 to 1.0% by mass, and particularly preferably 0.3 to 0.7% by mass. With such a preferable addition amount, deactivation of the enzyme can be further prevented, and the enzyme activity can be further stabilized.
The concentration of the hydrophilic lignin derivative added to the reaction solution can be calculated by the following formula.

Figure 0007297232000001
Figure 0007297232000001

[実施形態3:酵素糖化方法]
本実施形態に係る酵素糖化方法は、リグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化方法において、実施形態1に係る酵素安定化剤を添加することを含むリグノセルロース系バイオマスの糖化方法である。本実施形態に使用する酵素安定化剤は、上記のとおり、酵素の失活を防ぎ、酵素活性を安定化することができる。したがって、前記酵素安定化剤を使用する糖化方法によれば、使用した酵素を再利用すること、又は酵素使用量を減じることが可能である。
[Embodiment 3: Enzymatic saccharification method]
The enzymatic saccharification method according to the present embodiment is a method for saccharifying lignocellulosic biomass by adding the enzyme stabilizer according to Embodiment 1 to the enzymatic saccharification method for lignocellulosic biomass. As described above, the enzyme stabilizer used in this embodiment can prevent enzyme deactivation and stabilize enzyme activity. Therefore, according to the saccharification method using the enzyme stabilizer, it is possible to reuse the used enzyme or reduce the amount of enzyme used.

本明細書中で使用される場合、「リグノセルロース系バイオマスの酵素による糖化方法」とは、リグノセルロース系バイオマスを酵素により糖化する方法であればいずれでもよいが、例えば、特開2008-92910号公報に記載される糖化方法(エタノールの製造方法)であってよい。特開2008-92910号公報の内容は本明細書中に参照として援用される。 As used herein, the “enzymatic saccharification method for lignocellulosic biomass” may be any method as long as it enzymatically saccharifies lignocellulosic biomass. A saccharification method (method for producing ethanol) described in a publication may be used. The contents of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-92910 are incorporated herein by reference.

本実施形態に係る酵素糖化方法は、
(a)リグノセルロース系バイオマスに酸又はアルカリを混合させ、水熱処理(前処理)を行う工程、
(b)前処理を行ったリグノセルロース系バイオマスに酵素、本発明の酵素安定化剤及び水を添加し、バイオマス内のセルロース及びヘミセルロースをそれぞれグルコース及びキシロースの単糖に加水分解(糖化)し糖液を得る工程、及び
(c)得られた糖液に、酵母を添加し発酵させ、エタノールを生産する工程を含む。
The enzymatic saccharification method according to this embodiment includes:
(a) a step of mixing acid or alkali with lignocellulosic biomass and performing hydrothermal treatment (pretreatment);
(b) An enzyme, an enzyme stabilizer of the present invention, and water are added to the pretreated lignocellulosic biomass, and cellulose and hemicellulose in the biomass are hydrolyzed (saccharified) into monosaccharides of glucose and xylose, respectively. and (c) a step of adding yeast to the obtained sugar solution and fermenting it to produce ethanol.

本発明の酵素糖化方法において、糖化効率は、C6糖化率を算出することにより調べることができる。ここでC6糖化率とは、前処理済バイオマス中のセルロース(グルコース換算)から糖化を経て生成するグルコース量の比率を示す。本来、前処理と糖化を経てキシロース(C5糖)も生成するが、キシロースは、希硫酸を使った前処理で生成する割合が高いため、酵素糖化効率はC6糖化率で調べるのがよい。 In the enzymatic saccharification method of the present invention, the saccharification efficiency can be examined by calculating the C6 saccharification rate. Here, the C6 saccharification rate indicates the ratio of the amount of glucose produced through saccharification from cellulose (in terms of glucose) in the pretreated biomass. Originally, xylose (C5 sugar) is also produced through pretreatment and saccharification, but since a high proportion of xylose is produced by pretreatment with dilute sulfuric acid, the enzymatic saccharification efficiency should be examined by the C6 saccharification rate.

本実施形態に係る糖化方法に使用される酵素安定化剤は、実施形態1において具体的に
説明された酵素安定化剤と同様の構成及び作用効果を有する。よって、実施形態1と同様
の内容については、適宜説明を省略する。
The enzyme stabilizer used in the saccharification method according to this embodiment has the same configuration and effects as the enzyme stabilizer specifically described in the first embodiment. Therefore, descriptions of the same contents as in the first embodiment will be omitted as appropriate.

本実施形態に係る糖化方法に使用される酵素安定化剤の添加量は、任意であるが、例えば、酵素安定化剤に含まれる親水性リグニン誘導体の重量が酵素糖化されるリグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対し、好ましくは0.1~3.0質量%、より好ましくは0.2~1.0質量%、特に好ましくは0.3~0.70質量%である。このような好ましい添加量により、酵素のバイオマス成分への吸着をより抑制することができ、酵素の活性をより向上させることができる。 The amount of the enzyme stabilizer used in the saccharification method according to the present embodiment is arbitrary. It is preferably 0.1 to 3.0% by mass, more preferably 0.2 to 1.0% by mass, and particularly preferably 0.3 to 0.70% by mass based on the dry weight. With such a preferable addition amount, the adsorption of the enzyme to the biomass component can be further suppressed, and the activity of the enzyme can be further improved.

親水性リグニン誘導体の重量は、前記酵素の安定化方法の項で記載した方法により算出することができる。 The weight of the hydrophilic lignin derivative can be calculated by the method described in the section of the enzyme stabilization method.

本発明において用いる糖化酵素としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ又はβグルコキ
シダーゼ活性を有する任意の酵素を用いることができる。これら糖化酵素産生菌の例としては、好気性のトリコデルマ属、アスペルギルス属、フミコラ属、イルペックス属、アクレモニウム属などが挙げられる。
Any enzyme having cellulase, hemicellulase or β-glucoxidase activity can be used as the saccharifying enzyme used in the present invention. Examples of these saccharifying enzyme-producing bacteria include aerobic Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Irpex, and Acremonium.

糖化反応に使用する糖化酵素の添加量は、原料基質となるリグノセルロース系バイオマスのセルロース1gに対して5~50ユニットのセルラーゼ活性を含むように調整する。 The amount of the saccharifying enzyme used in the saccharification reaction is adjusted so that 5 to 50 units of cellulase activity are included with respect to 1 g of cellulose of the lignocellulosic biomass serving as the raw material substrate.

本発明の糖化方法により得られる糖化液は、エタノール発酵、乳酸発酵、アミン酸発酵、ブタノール発酵、イソブタノール発酵等の原料として用いることができる。以下に、エタノール発酵に用いる場合について説明する。 The saccharified liquid obtained by the saccharification method of the present invention can be used as a raw material for ethanol fermentation, lactic acid fermentation, amino acid fermentation, butanol fermentation, isobutanol fermentation, and the like. Below, the case where it uses for ethanol fermentation is demonstrated.

エタノール発酵においては、上記で得られた糖化液を発酵させる。糖化反応に最適な温度と発酵に最適な温度は異なるため、糖化反応は、糖化反応に適した温度で実施し、40~60℃が好ましい。反応液のpHも、糖化反応に適した条件で実施し、4~7が好ましい。糖化反応の終了後、糖化反応液を取り出し、発酵槽へ供給する。発酵槽のエタノール発酵菌は、固定化してもしなくても良いが、固定化した方が好ましい。発酵条件は、エタノール発酵に適した条件で実施する。pHは、4~8、温度は、20~40℃が好ましい。エタノール発酵中に生産したエタノールを分離回収することもできる。 In ethanol fermentation, the saccharified liquid obtained above is fermented. Since the optimum temperature for the saccharification reaction differs from the optimum temperature for fermentation, the saccharification reaction is carried out at a temperature suitable for the saccharification reaction, preferably 40 to 60°C. The pH of the reaction solution is also suitable for the saccharification reaction, preferably 4-7. After completion of the saccharification reaction, the saccharification reaction solution is taken out and supplied to the fermenter. The ethanol-fermenting bacteria in the fermenter may or may not be immobilized, but are preferably immobilized. Fermentation conditions are carried out under conditions suitable for ethanol fermentation. The pH is preferably 4-8, and the temperature is preferably 20-40°C. Ethanol produced during ethanol fermentation can also be separated and recovered.

得られた糖化液にエタノール発酵菌を投入することにより糖化液を発酵させ、エタノールを製造することができる。このようなエタノール発酵菌としては、例えば、サッカロマイセス属、ザイモモナス属、ピキア属などが挙げられる。また、遺伝子組み換えされたものもアルコール発酵が可能で有れば使用できる。これらのエタノール発酵菌は、エタノール発酵前に液体培地で前培養し、菌体量を増加させておく方が望ましい。エタノール発酵菌の投入量は多いほど発酵効率がよく、好ましくは、糖化反応により生成する糖を同時に完全にエタノールへ変換できる菌体量を確保する。 By adding ethanol-fermenting bacteria to the obtained saccharified liquid, the saccharified liquid can be fermented to produce ethanol. Examples of such ethanol-fermenting bacteria include Saccharomyces, Zymomonas, and Pichia. Genetically modified ones can also be used if alcoholic fermentation is possible. These ethanol-fermenting bacteria are desirably pre-cultured in a liquid medium before ethanol fermentation to increase the amount of bacteria. The greater the amount of ethanol-fermenting bacteria input, the better the fermentation efficiency.

糖化反応とエタノール発酵は、上記糖化酵素とともにエタノール発酵菌を添加することにより、同時に行うこともできる。同時糖化発酵においては、同一の反応器で糖化反応と発酵を行う方式でも糖化反応と発酵を別々の反応器で行う方式でも良い。 The saccharification reaction and ethanol fermentation can also be performed simultaneously by adding an ethanol-fermenting bacterium together with the saccharifying enzyme. In the simultaneous saccharification and fermentation, a method of performing saccharification reaction and fermentation in the same reactor or a method of performing saccharification reaction and fermentation in separate reactors may be used.

同一の反応器で糖化反応と発酵を行う場合には、反応液のpHと温度は、糖化反応と発酵、どちらも作用できる条件で行う。条件としては、エタノール発酵菌の発酵条件を優先し、pHは、4~7、温度は、20~40℃が好ましい。また、同時糖化発酵を嫌気的条件で行うことで、好気性菌である糖化酵素産生菌の増殖を抑制することができ、糖化酵素産生菌の増殖に伴う糖の消費を抑制することができる。また、同時糖化発酵は撹拌した方が、糖化反応が進行し易いため、エタノール生産性が良くなる。また、生成したエタノールを分離回収しながら同時糖化発酵を行うこともできる。この方式は、一つの反応器で全ての糖化反応とエタノール発酵を行えるので製造工程の簡便化が図れる。 When the saccharification reaction and the fermentation are performed in the same reactor, the pH and temperature of the reaction solution are set so that both the saccharification reaction and the fermentation can work. As conditions, priority is given to fermentation conditions for ethanol-fermenting bacteria, preferably pH of 4 to 7 and temperature of 20 to 40°C. In addition, by performing simultaneous saccharification and fermentation under anaerobic conditions, it is possible to suppress the growth of saccharifying enzyme-producing bacteria, which are aerobic bacteria, and to suppress the consumption of sugar accompanying the growth of saccharifying enzyme-producing bacteria. In addition, stirring the simultaneous saccharification and fermentation facilitates the progress of the saccharification reaction, resulting in improved ethanol productivity. Simultaneous saccharification and fermentation can also be performed while separating and recovering the produced ethanol. This method can simplify the manufacturing process because all saccharification reactions and ethanol fermentation can be performed in one reactor.

糖化反応と発酵を別々の反応器で同時に行う方式では、糖化反応は、糖化反応に適した温度で実施し、好ましくは、40~60℃で実施する。反応液のpHは、発酵条件と同一とし、4~6が好ましい。糖化反応液は連続的に取り出し、発酵槽へ供給する。発酵槽のエタノール発酵菌は、固定化してもしなくても良いが、固定化した方が好ましい。発酵条件は、pHは、4~7、温度は、20~40℃が好ましい。エタノール発酵液は再び糖化反応槽へ戻し、糖化反応と発酵を同時に行う。その際、生成したエタノールを分離回収することもできる。 In the method in which the saccharification reaction and fermentation are simultaneously performed in separate reactors, the saccharification reaction is performed at a temperature suitable for the saccharification reaction, preferably at 40-60°C. The pH of the reaction solution is the same as the fermentation conditions, preferably 4-6. The saccharification reaction liquid is continuously taken out and supplied to the fermenter. The ethanol-fermenting bacteria in the fermenter may or may not be immobilized, but are preferably immobilized. Fermentation conditions are preferably pH 4 to 7 and temperature 20 to 40°C. The ethanol fermentation liquid is returned to the saccharification reaction tank again, and saccharification reaction and fermentation are performed simultaneously. At that time, the produced ethanol can also be separated and recovered.

糖化反応の経過に伴って反応器内のリグノセルロース系バイオマスは分解され、減少するため、必要に応じてリグノセルロース系バイオマスを反応器内に無菌的に投入し反応を継続させる方が望ましい。 As the saccharification reaction progresses, the lignocellulosic biomass in the reactor is decomposed and reduced, so it is desirable to aseptically charge the lignocellulosic biomass into the reactor as needed to continue the reaction.

また、発酵において、反応器内にエタノールが蓄積し、エタノール濃度が上昇すると発酵が抑制されるので、発酵液からエタノールを分離回収しながら発酵させても良い。その場合、浸透気化膜を使っても良く、エバポレーション装置を使っても良い。その際、発酵微生物が失活しない50℃以下で運転することが好ましい。ただし、エタノールを回収後の発酵液を反応器に戻さない場合には、この限りではなく、エタノール回収に適した温度で実施できる。また、エタノール回収後の液中には発酵微生物が残存しているので反応器へ無菌的に戻し、再利用する方が望ましい。
酵素や発酵微生物は必要に応じて無菌的に追加しても良い。
In fermentation, ethanol accumulates in the reactor, and fermentation is suppressed when the ethanol concentration rises. Therefore, fermentation may be performed while separating and recovering ethanol from the fermentation broth. In that case, a pervaporation membrane may be used, or an evaporation device may be used. At that time, it is preferable to operate at 50° C. or less at which the fermenting microorganisms are not deactivated. However, if the fermentation broth after recovering ethanol is not returned to the reactor, this is not the case, and the temperature suitable for recovering ethanol can be used. In addition, since fermenting microorganisms remain in the liquid after ethanol recovery, it is preferable to aseptically return the liquid to the reactor for reuse.
Enzymes and fermenting microorganisms may be added aseptically as needed.

また、反応器内には不溶性の残さが蓄積し、撹拌効率を抑制するので遠心分離機などを使って除去しても良い。残さ中にセルロースが大量に残っている場合には、原料であるリグノセルロース系バイオマスと混合しても良く、糖化酵素産生菌培養液を追加し、分解してもよい。
回収したエタノールは、蒸留装置で蒸留することができる。
In addition, insoluble residue accumulates in the reactor and suppresses stirring efficiency, so it may be removed using a centrifugal separator or the like. When a large amount of cellulose remains in the residue, it may be mixed with the raw material lignocellulose biomass, or may be decomposed by adding a saccharifying enzyme-producing bacteria culture solution.
The recovered ethanol can be distilled with a distillation apparatus.

(疎水性リグニン誘導体)
リグノセルロース系バイオマスとポリアルキレングリコールに第一の酸を添加して反応させることにより得られる上記リグニン誘導体を含む液分画に、さらに第二の酸を添加後、固液分離をして、疎水性リグニン誘導体を含む固形分画を得ることができる。以下、図1を参照しながら、当疎水性リグニン誘導体を含む固形分画の製造方法を具体的に説明する。
(Hydrophobic lignin derivative)
After adding a second acid to the liquid fraction containing the lignin derivative obtained by adding the first acid to the lignocellulosic biomass and polyalkylene glycol and reacting them, solid-liquid separation is performed to obtain a hydrophobic A solid fraction containing the organic lignin derivative can be obtained. Hereinafter, a method for producing a solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative will be specifically described with reference to FIG.

本発明に係る疎水性リグニン誘導体を含む固形分画は以下の工程により製造することができる。
(4)上記の工程(3)で得られた液分画に第二の酸を添加する工程(図中14)、
(6)上記工程(4)で沈殿した沈殿物に対し固液分離を行い、リグニン誘導体を含む固形分画を得る工程(図中15)。
A solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative according to the present invention can be produced by the following steps.
(4) a step of adding a second acid to the liquid fraction obtained in step (3) above (14 in the figure);
(6) A step of performing solid-liquid separation on the precipitate precipitated in step (4) to obtain a solid fraction containing the lignin derivative (15 in the figure).

リグニン誘導体を含む液分画に添加する第二の酸としては、液分画を酸性にすることができれば特に制限はないが、pHを1~4とすることができる酸が好ましく、とくに硫酸が好ましい。添加量は、添加量は、通常、液分画に対して、0.1~3.0重量部である。
液分画に第二の酸を加えて酸性にすることにより、疎水性リグニン誘導体が沈殿し、固液分離により、疎水性リグニン誘導体を含む固形分画が得られる。なお、固液分離により得られた固形分画には、前記疎水性リグニン誘導体の他に未反応のリグニンを含む。
固液分離の方法としては、第二の酸を添加して生成する沈殿物を分離できる方法であれば、特に制限はないが、遠心分離が好ましい。遠心分離は、通常、2000g~20000g、好ましくは、5000g~15000gである。
The second acid added to the liquid fraction containing the lignin derivative is not particularly limited as long as it can acidify the liquid fraction, but an acid capable of adjusting the pH to 1 to 4 is preferable, and sulfuric acid is particularly preferred. preferable. The amount to be added is usually 0.1 to 3.0 parts by weight based on the liquid fraction.
Hydrophobic lignin derivatives are precipitated by adding a second acid to the liquid fraction to acidify it, and a solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative is obtained by solid-liquid separation. The solid fraction obtained by solid-liquid separation contains unreacted lignin in addition to the hydrophobic lignin derivative.
The solid-liquid separation method is not particularly limited as long as it is a method capable of separating the precipitate formed by adding the second acid, but centrifugation is preferred. Centrifugation is usually from 2000g to 20000g, preferably from 5000g to 15000g.

反応により得られた疎水性リグニン誘導体を含む固形分画は、必要に応じて、凍結乾燥機等の従来使用されている乾燥方法により完全に乾燥させてもよい。
固形分画中の疎水性リグニン誘導体の濃度は、以下の式により算出することができる。
If necessary, the solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative obtained by the reaction may be completely dried by a conventionally used drying method such as a freeze dryer.
The concentration of the hydrophobic lignin derivative in the solid fraction can be calculated by the following formula.

Figure 0007297232000002
Figure 0007297232000002

前記固形分画に含まれる疎水性リグニン誘導体は、耐熱フィルム、セメント分散剤、熱硬化性樹脂等の機能性原料として用いることができる。 The hydrophobic lignin derivative contained in the solid fraction can be used as a functional raw material for heat-resistant films, cement dispersants, thermosetting resins, and the like.

[実施形態4:酵素安定化剤の製造装置]
図1は、本発明の第1実施形態に係る酵素安定化剤の製造装置を模式的に示す概略構成図である。以下、図1を参照しながら、本実施形態の酵素安定化剤の製造装置の各構成について説明する。
本発明の第1実施形態に係る酵素安定化剤の製造装置100は、第一の反応槽1と、濾過装置2と、第二の反応層3と、固液分離装置4と、を備える。第一の反応槽1は、アルカリ供給手段1aを有し、リグノセルロース系バイオマスとポリエチレングリコールとに第一の酸を反応させる。前記第二の反応槽3は、第二の酸供給手段3aを有する。
[Embodiment 4: Apparatus for producing enzyme stabilizer]
FIG. 1 is a schematic configuration diagram schematically showing an apparatus for producing an enzyme stabilizer according to a first embodiment of the present invention. Hereinafter, each configuration of the apparatus for producing an enzyme stabilizer according to this embodiment will be described with reference to FIG.
An enzyme stabilizer manufacturing apparatus 100 according to the first embodiment of the present invention includes a first reaction tank 1 , a filtration device 2 , a second reaction layer 3 , and a solid-liquid separation device 4 . The first reaction tank 1 has an alkali supply means 1a, and reacts the lignocellulosic biomass and polyethylene glycol with the first acid. The second reaction tank 3 has a second acid supply means 3a.

本実施形態の酵素安定化剤の製造装置によれば、高収率で、酵素活性を安定化できる酵素安定化剤を得ることができる。さらに、本実施形態の酵素安定化剤の製造装置は、酵素安定化剤として利用可能な親水性リグニン誘導体と、機能性原料に適した疎水性リグニン誘導体を同時に得ることができるため、リグノセルロース系バイオマスを利用した工業生産プロセス全体での収益性を向上させることが可能となる。 According to the apparatus for producing an enzyme stabilizer of the present embodiment, an enzyme stabilizer capable of stabilizing enzyme activity can be obtained at a high yield. Furthermore, the apparatus for producing an enzyme stabilizer of the present embodiment can simultaneously obtain a hydrophilic lignin derivative that can be used as an enzyme stabilizer and a hydrophobic lignin derivative that is suitable as a functional raw material. It is possible to improve the profitability of the entire industrial production process using biomass.

[反応槽]
反応槽1は、リグノセルロース系バイオマスとポリエチレングリコールとに第一の酸を反応させて、リグニン誘導体を得るための槽である。リグノセルロース系バイオマス、ポリエチレングリコール及び第一の酸については、上述の酵素安定化剤にて記載されたものと同じものが挙げられる。
加えるポリアルキレングリコールの量は、特に制限はなく、通常、リグノセルロース系バイオマス10乾燥重量部に対して、5~100重量部、好ましくは10~60重量部、より好ましくは20~50重量部である。
加える第一の酸の量は、例えば、ポリアルキレングリコール100重量部に対して、0.1~0.3重量部である。
[Reaction tank]
The reaction tank 1 is a tank for obtaining a lignin derivative by reacting the lignocellulosic biomass and polyethylene glycol with the first acid. The lignocellulosic biomass, polyethylene glycol, and first acid are the same as those described for the enzyme stabilizer above.
The amount of polyalkylene glycol to be added is not particularly limited, and is usually 5 to 100 parts by weight, preferably 10 to 60 parts by weight, more preferably 20 to 50 parts by weight with respect to 10 parts by dry weight of lignocellulose biomass. be.
The amount of the first acid to be added is, for example, 0.1 to 0.3 parts by weight with respect to 100 parts by weight of polyalkylene glycol.

また、反応槽1は、耐酸性であるものであればよく、特別な限定はない。
反応槽1は撹拌翼等の撹拌機構を有していてもよい。
また、撹拌槽における反応液の温度は、特に制限はなく、通常、100℃~200℃、好ましくは120℃~160℃である。
反応槽1内の温度を上記範囲内に保つために、撹拌槽1は温度調整装置又は温度計1bを備えていてもよい。
また、反応槽1は、アルカリ供給手段1aを有する。さらに、図1に示すようにリグノセルロース系バイオマス供給手段1c、ポリアルキレングリコール供給手段1d、第一の酸供給手段1e等を有してもよい。
また、反応槽1は、pH計を有してもよい。pH計は、アルカリ供給後の反応液のpHを測定し、アルカリ供給量を適宜調整するために、用いればよい。
Moreover, the reaction tank 1 is not particularly limited as long as it is acid-resistant.
The reaction tank 1 may have a stirring mechanism such as a stirring blade.
Moreover, the temperature of the reaction solution in the stirring tank is not particularly limited, and is usually 100°C to 200°C, preferably 120°C to 160°C.
In order to keep the temperature in the reaction vessel 1 within the above range, the stirring vessel 1 may be equipped with a temperature control device or a thermometer 1b.
Moreover, the reaction vessel 1 has an alkali supply means 1a. Furthermore, as shown in FIG. 1, a lignocellulose-based biomass supply means 1c, a polyalkylene glycol supply means 1d, a first acid supply means 1e, and the like may be provided.
Moreover, the reaction tank 1 may have a pH meter. A pH meter may be used to measure the pH of the reaction solution after alkali supply and to appropriately adjust the amount of alkali supply.

(アルカリ供給手段)
アルカリ供給手段1aは反応槽1に配設されており、アルカリを反応槽1に供給するためのものである。アルカリを供給することで、前記反応槽1内において、リグニン誘導体の生成反応が終了した後に、反応液を中和することができる。アルカリとしては、上述の酵素安定化剤の製造方法において例示されたものと同様である。
アルカリ供給後の反応液のpHは、pH6以上12以下であること好ましく、pH6以上10以下であることがより好ましい。
アルカリ供給手段1aはアルカリの供給量を調整するためのポンプ、弁等を有していてもよい。
(Alkali supply means)
The alkali supply means 1a is arranged in the reaction tank 1 and is for supplying the alkali to the reaction tank 1. As shown in FIG. By supplying the alkali, the reaction liquid can be neutralized after the production reaction of the lignin derivative is completed in the reaction vessel 1 . The alkali is the same as those exemplified in the method for producing the enzyme stabilizer described above.
The pH of the reaction solution after supplying the alkali is preferably 6 or more and 12 or less, more preferably 6 or more and 10 or less.
The alkali supply means 1a may have a pump, a valve, etc. for adjusting the amount of alkali to be supplied.

[濾過装置]
濾過装置2は、反応液から固形分画を取り除くためのものである。
濾過装置2としては、アルカリ中和液から固形分画を除くことができれば、特に制限はないが、例えば、遠心分離、スクリュープレス、フィルタープレス等が挙げられる。
[Filtration device]
The filtering device 2 is for removing a solid fraction from the reaction solution.
The filtering device 2 is not particularly limited as long as the solid fraction can be removed from the neutralized alkaline solution, and examples thereof include centrifugal separation, screw press, and filter press.

[固液分離装置]
第二の反応槽3は、濾過装置2で得られた液分画と第二の酸とを反応させるためのものである。
加える第二の酸の量は、例えば、液分画100重量部に対して、0.01~3.0重量部である。
また、第二の反応槽3は、耐酸性であるものであればよく、特別な限定はない。
第二の反応槽3は撹拌翼等の撹拌機構を有していてもよい。
固液分離装置4は、第二の反応槽3で得られた反応液を、固液分離して、固形物を除くことにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得るためのものである。
固液分離装置4は、酸を添加して生成する固形物を分離できる装置であれば、特に制限はないが、例えば、遠心分離機等が挙げられる。
[Solid-liquid separator]
The second reaction tank 3 is for reacting the liquid fraction obtained by the filtering device 2 with the second acid.
The amount of the second acid to be added is, for example, 0.01 to 3.0 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the liquid fraction.
Moreover, the second reaction tank 3 is not particularly limited as long as it is acid-resistant.
The second reaction vessel 3 may have a stirring mechanism such as a stirring blade.
The solid-liquid separation device 4 is for solid-liquid separation of the reaction liquid obtained in the second reaction tank 3 to remove solids, thereby obtaining a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative. .
The solid-liquid separator 4 is not particularly limited as long as it can separate solid matter generated by adding acid, and examples thereof include a centrifugal separator.

図1に示す酵素安定化剤の製造装置100を用いた酵素安定化剤の製造方法について、以下に説明する。
まず、反応槽1に、リグノセルロース系バイオマス供給手段1c、ポリアルキレングリコール供給手段1d及び第一の酸供給手段1eにより、リグノセルロース系バイオマス、ポリアルキレングリコール及び第一の酸を添加する。各材料の種類、添加量、反応温度及び反応時間は、上述の酵素安定化剤の製造方法に記載されたとおりである。上記材料を反応させて、リグニン誘導体を生成させる。
次いで、反応後のリグニン誘導体を含む反応液に、アルカリ供給手段1aからアルカリを添加して、反応液を中和する。アルカリの種類、添加量は、上述の酵素安定化剤の製造方法に記載されたとおりである。次いで、中和された反応液は、ポンプ5aにより送液量を調整しながら配管5を介して、濾過装置2に送られる。濾過装置2において、送られた反応液から固形分画を取り除き、液分画を得る。固形分は配管6aを介して排出される。
一方、得られた液分画は、配管6bを介して、第二の反応槽3に送られ、第二の酸が添加される。反応液は配管7を介して固液分離装置4に送られ、ここで、未反応のリグニン及び疎水性リグニン誘導体を含む固形物が固形分画として分離される。
一方、得られた液分画には、親水性リグニン誘導体の他に未反応のポリアルキレングリコールが含まれる。そのため、液分画に含まれる未反応のポリアルキレングリコールは図示しない配管により、ポリアルキレングリコール供給手段1dに送られ、再利用することができる。
A method for producing an enzyme stabilizer using the apparatus 100 for producing an enzyme stabilizer shown in FIG. 1 will be described below.
First, lignocellulose-based biomass, polyalkylene glycol, and a first acid are added to the reaction tank 1 by the lignocellulose-based biomass supply means 1c, the polyalkylene glycol supply means 1d, and the first acid supply means 1e. The kind, addition amount, reaction temperature and reaction time of each material are as described in the method for producing the enzyme stabilizer described above. The above materials are reacted to produce a lignin derivative.
Next, an alkali is added from the alkali supply means 1a to the reaction liquid containing the lignin derivative after the reaction to neutralize the reaction liquid. The type and amount of alkali to be added are as described in the method for producing the enzyme stabilizer described above. Next, the neutralized reaction liquid is sent to the filtration device 2 through the pipe 5 while adjusting the amount of liquid to be sent by the pump 5a. In the filtering device 2, a solid fraction is removed from the sent reaction liquid to obtain a liquid fraction. The solid content is discharged through pipe 6a.
On the other hand, the obtained liquid fraction is sent to the second reaction tank 3 via the pipe 6b, and the second acid is added. The reaction liquid is sent to the solid-liquid separation device 4 through the pipe 7, where solids containing unreacted lignin and hydrophobic lignin derivatives are separated as a solid fraction.
On the other hand, the obtained liquid fraction contains unreacted polyalkylene glycol in addition to the hydrophilic lignin derivative. Therefore, the unreacted polyalkylene glycol contained in the liquid fraction can be sent to the polyalkylene glycol supply means 1d through a pipe (not shown) and reused.

本発明において、リグノセルロース系バイオマスから、酵素安定化剤として有用な親水性リグニン誘導体と、機能性原料として有用な疎水性リグニン誘導体を同時に得ることができるので、リグノセルロース系バイオマスを利用した工業生産プロセス全体での収益性を向上させることが可能となる。 In the present invention, a hydrophilic lignin derivative useful as an enzyme stabilizer and a hydrophobic lignin derivative useful as a functional raw material can be simultaneously obtained from lignocellulose biomass. It is possible to improve the profitability of the entire process.

以下、本発明の実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実
施例に限定されるものではない。
EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

[実施例1:親水性リグニン誘導体及び疎水性リグニン誘導体の調製]
風乾したスギの木粉250gに、ポリエチレングリコール200(PEG200、ライオン社製)1250gと95%硫酸4gを加え、140℃に加熱し、90分間撹拌して反応させた。反応終了後、2N水酸化ナトリウム水溶液150mlを加えて中和し、リグニン誘導体を抽出した。得られた反応液を濾過膜(ADVANTEC社製)にかけ、固形分を除去した。
得られた濾液に3N硫酸をpH2になるまで加えた。硫酸により沈殿する沈殿物を13000gで15分間遠心分離することにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得た。
遠心分離により得られた沈殿物は、水3Lで洗浄し、凍結乾燥し、疎水性リグニン誘導体を含む固形分画を得た。
[Example 1: Preparation of hydrophilic lignin derivative and hydrophobic lignin derivative]
To 250 g of air-dried cedar wood powder, 1250 g of polyethylene glycol 200 (PEG200, manufactured by Lion Corporation) and 4 g of 95% sulfuric acid were added, heated to 140° C., and stirred for 90 minutes to react. After completion of the reaction, 150 ml of 2N aqueous sodium hydroxide solution was added for neutralization, and the lignin derivative was extracted. The resulting reaction solution was applied to a filtration membrane (manufactured by ADVANTEC) to remove solids.
3N sulfuric acid was added to the resulting filtrate until the pH reached 2. A liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative was obtained by centrifuging the sediment precipitated by sulfuric acid at 13000 g for 15 minutes.
The precipitate obtained by centrifugation was washed with 3 L of water and freeze-dried to obtain a solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative.

[実施例2:親水性リグニン誘導体及び疎水性リグニン誘導体の調製]
実施例1において、PEG200の代わりに、PEG400(ライオン社製)又はPEG600(ライオン社製)を用いる以外は、実施例1と同様にして、親水性リグニン誘導体を含む液分画をそれぞれ得た。
[Example 2: Preparation of hydrophilic lignin derivative and hydrophobic lignin derivative]
Liquid fractions containing hydrophilic lignin derivatives were obtained in the same manner as in Example 1, except that PEG400 (manufactured by Lion Corporation) or PEG600 (manufactured by Lion Corporation) was used instead of PEG200.

[実施例3:親水性リグニン誘導体及び疎水性リグニン誘導体の調製]
実施例1において、PEG200の代わりにPEG1000(WAKO製)を用いる以外は、実施例1と同様にして、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得た。
[Example 3: Preparation of hydrophilic lignin derivative and hydrophobic lignin derivative]
A liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative was obtained in the same manner as in Example 1, except that PEG1000 (manufactured by WAKO) was used instead of PEG200.

[比較例1:特許文献2によるリグニン誘導体の調製]
風乾した杉チップをアルカリ蒸解処理し、アルカリ処理リグニンを得た。得られたアルカリ処理リグニン10gを100mlの1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、ラウリルアルコール-ポリエチレンオキサイドーグリシジルエーテルを40g加えた。得られた溶液を70℃に加熱し、3時間撹拌反応させた。反応後、得られた溶液に酢酸を加えてpH4に調整し、分子量1000以下を排除する限外ろ過膜にて濾過を行った。濾過後、残渣を収集し、リグニン誘導体を得た。
[Comparative Example 1: Preparation of lignin derivative according to Patent Document 2]
Air-dried cedar chips were digested with alkali to obtain alkali-treated lignin. 10 g of the resulting alkali-treated lignin was dissolved in 100 ml of 1N sodium hydroxide aqueous solution, and 40 g of lauryl alcohol-polyethylene oxide-glycidyl ether was added. The resulting solution was heated to 70° C. and reacted with stirring for 3 hours. After the reaction, acetic acid was added to the obtained solution to adjust the pH to 4, and the solution was filtered with an ultrafiltration membrane that excludes particles with a molecular weight of 1,000 or less. After filtration, the residue was collected to obtain the lignin derivative.

ここで、実施例1~3のリグニン誘導体の製造方法と比較例のリグニン誘導体の製造方法を比較する。原料において、実施例1~3の製造方法ではリグノセルロース系バイオマスを用いるのに対して、比較例1の製造方法ではバイオマスをアルカリ処理したリグニンを用いる点で異なる。また、リグニン誘導体の合成での触媒と溶媒種類において、実施例1~3では触媒として硫酸を用い、溶媒としてポリアルキレングリコールを用いるのに対し、比較例1では触媒は用いず、溶媒として強アルカリ溶液を用いる点で異なる。さらに、合成温度において、実施例1~3では100~200℃であるのに対し、比較例1では70℃である点で異なる。誘導体分離方法においても、実施例1~3では酸で沈殿させた後に遠心分離を実施し、液分画として親水性リグニン誘導体を得、固形分画としての疎水性リグニン誘導体を得るのに対し、比較例1では限外濾過膜により固形分画としてリグニン誘導体を得る点で異なる。 Here, the method for producing the lignin derivatives of Examples 1 to 3 and the method for producing the lignin derivative of the comparative example are compared. As a raw material, the production methods of Examples 1 to 3 use lignocellulose biomass, whereas the production method of Comparative Example 1 uses lignin obtained by treating biomass with alkali. In addition, regarding the types of catalyst and solvent in the synthesis of the lignin derivative, in Examples 1 to 3, sulfuric acid was used as the catalyst and polyalkylene glycol was used as the solvent. The difference is that a solution is used. Further, the synthesis temperature is 100 to 200° C. in Examples 1 to 3, whereas it is 70° C. in Comparative Example 1. In the derivative separation method, in Examples 1 to 3, centrifugation was performed after precipitation with acid, to obtain a hydrophilic lignin derivative as a liquid fraction and a hydrophobic lignin derivative as a solid fraction. Comparative Example 1 is different in that a lignin derivative is obtained as a solid fraction by an ultrafiltration membrane.

得られたリグニン誘導体を含む液分画を酵素安定化剤として用いて、以下の試験を行った。 Using the obtained liquid fraction containing the lignin derivative as an enzyme stabilizer, the following tests were carried out.

[試験例1:酵素活性維持効果確認試験(1)]
バガス20gを希硫酸で前処理したバガス前処理物の乾燥重量10gと、水で希釈した糖化酵素液2gに、実施例1で調製した親水性リグニン誘導体を含む液分画又は疎水性リグニン誘導体を含む固形分画を、それぞれリグニン誘導体量として、バガス乾燥重量当り0.1~2.2重量%となるように加え、さらに水を加えて100mlとした。これを50℃で48時間反応させ、糖化反応を行った。反応後のC6糖化率を測定し、リグニン誘導体添加率と、C6糖化率の関係を調べた。その結果を図2に示す。ここで、添加率0重量%とは、実施例で調製した液分画又は固形分画を添加しないものをいう。図2から明らかなように、実施例1で調製した親水性リグニン誘導体を含む液分画を0.25重量%添加することにより、C6糖化率が約5%上昇した。それに対し、疎水性リグニン誘導体を含む固形分画を添加した場合は、1~2重量%添加することによりC6糖化率が約5%上昇した。これにより、親水性リグニン誘導体を含む液分画は、基質と酵素との反応性を高め、酵素の活性を向上させることが確認できた。
[Test Example 1: Enzyme Activity Maintenance Effect Confirmation Test (1)]
The liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative prepared in Example 1 or the hydrophobic lignin derivative was added to 10 g of the dry weight of the pretreated bagasse obtained by pretreating 20 g of bagasse with dilute sulfuric acid and 2 g of the saccharifying enzyme solution diluted with water. The solid fraction contained was added so that the amount of lignin derivative was 0.1 to 2.2% by weight based on the dry weight of bagasse, and water was added to bring the total volume to 100 ml. This was reacted at 50° C. for 48 hours to carry out a saccharification reaction. The C6 saccharification rate after the reaction was measured, and the relationship between the lignin derivative addition rate and the C6 saccharification rate was investigated. The results are shown in FIG. Here, the addition rate of 0% by weight means that the liquid fraction or solid fraction prepared in Examples is not added. As is clear from FIG. 2, the addition of 0.25% by weight of the liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative prepared in Example 1 increased the C6 saccharification rate by about 5%. In contrast, when the solid fraction containing the hydrophobic lignin derivative was added, the C6 saccharification rate increased by about 5% by adding 1 to 2% by weight. As a result, it was confirmed that the liquid fraction containing the hydrophilic lignin derivative increased the reactivity between the substrate and the enzyme and improved the activity of the enzyme.

[試験例2:ポリエチレングリコールの効果確認試験(1)]
試験例1において、実施例1で調製した親水性リグニン誘導体の代わりに、実施例2で調製した親水性リグニンを用いる以外は試験例1と同様にして、糖化試験を実施した。、親水性リグニン誘導体の添加率とC6糖化率との関係を図3に示す。
[Test Example 2: Polyethylene glycol effect confirmation test (1)]
In Test Example 1, a saccharification test was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the hydrophilic lignin prepared in Example 2 was used instead of the hydrophilic lignin derivative prepared in Example 1. 3 shows the relationship between the addition rate of the hydrophilic lignin derivative and the C6 saccharification rate.

図3から明らかなように、PEG200を用いて調製した実施例1の親水性リグニン誘導体の場合は、0.25重量%の添加で、C6糖化率が約5%上昇した。それに対し、PEG400又はPEG600を用いて調製した実施例2の親水性リグニン誘導体の場合では、0.25重量%のリグニン誘導体の添加により、C6糖化率が約10%上昇した。この結果から、PEG200よりもPEG400、PEG600を用いて調製した親水性リグニン誘導体を用いた場合の方が、糖化効率がよいことが判明した。 As is clear from FIG. 3, in the case of the hydrophilic lignin derivative of Example 1 prepared using PEG200, the addition of 0.25% by weight increased the C6 saccharification rate by about 5%. In contrast, in the case of the hydrophilic lignin derivative of Example 2 prepared using PEG400 or PEG600, the addition of 0.25% by weight of the lignin derivative increased the C6 saccharification rate by about 10%. From this result, it was found that the saccharification efficiency was higher when using the hydrophilic lignin derivatives prepared using PEG400 and PEG600 than when using PEG200.

[試験例3:ポリエチレングリコールの効果確認試験(2)]
試験例1において、実施例1で調製した親水性リグニン誘導体の代わりに、実施例3で調製した親水性リグニン誘導体を用いる以外は、試験例1と同様にして、糖化試験を実施した。親水性リグニン誘導体の添加率は、バガス前処理物乾燥重量当たり0.5重量%となるように加えた。実施例1及び2で用いたPEGの分子量(200、600)及び実施例3で用いたPEGの分子量(1000)と糖収量比の関係を図4に示す。なお、糖収量比とは、リグニン誘導体を添加しない場合の糖化終了時のグルコース量と、リグニン誘導体を添加した場合の糖化終了時のグルコース量の比であり、糖収量比100%以上はリグニン誘導体添加により糖化率が上昇したことを示す。この結果、用いるPEG分子量が大きくなるほど糖化率が上昇するが、PEG600以上では糖化率が大きく上昇しないことが確認された。さらに、それぞれPEG200、PEG600、PEG1000を用いた親水性リグニン誘導体の平均分子量は、各々1530、2250、3060であった。以上のことから、親水性リグニン誘導体分子量は1000~3200程度が好ましく、より好ましくは1500~2300程度であると推測される。
[Test Example 3: Polyethylene glycol effect confirmation test (2)]
A saccharification test was carried out in the same manner as in Test Example 1 except that the hydrophilic lignin derivative prepared in Example 3 was used in Test Example 1 instead of the hydrophilic lignin derivative prepared in Example 1. The addition rate of the hydrophilic lignin derivative was added so as to be 0.5% by weight based on the dry weight of the pretreated bagasse. FIG. 4 shows the relationship between the molecular weight (200, 600) of PEG used in Examples 1 and 2 and the molecular weight (1000) of PEG used in Example 3 and the sugar yield ratio. The sugar yield ratio is the ratio of the amount of glucose at the end of saccharification when no lignin derivative is added to the amount of glucose at the end of saccharification when a lignin derivative is added. It shows that the addition increased the saccharification rate. As a result, it was confirmed that the higher the molecular weight of PEG used, the higher the saccharification rate. Furthermore, the average molecular weights of the hydrophilic lignin derivatives using PEG200, PEG600 and PEG1000 were 1530, 2250 and 3060, respectively. From the above, it is estimated that the hydrophilic lignin derivative has a molecular weight of preferably about 1,000 to 3,200, more preferably about 1,500 to 2,300.

[試験例4:酵素活性維持効果確認試験(3)]
試験例1において、実施例1で調製した親水性リグニン誘導体の代わりに、PEG400を用いて調製した実施例2の親水性リグニン誘導体および比較例1にて調製したリグニン誘導体を用いる以外は、試験例1と同様にして、糖化試験を実施した。結果を図5に示す。
[Test Example 4: Enzyme activity maintenance effect confirmation test (3)]
In Test Example 1, instead of the hydrophilic lignin derivative prepared in Example 1, the hydrophilic lignin derivative of Example 2 prepared using PEG400 and the lignin derivative prepared in Comparative Example 1 were used. A saccharification test was performed in the same manner as in 1. The results are shown in FIG.

図5から、実施例2で調製した親水性リグニン誘導体の方が、比較例1で調製したリグニン誘導体よりもC6糖化率が高くなる傾向となった。この結果より、比較例1で調製したリグニン誘導体よりも実施例2で調製したリグニン誘導体の方が、酵素の活性向上効果が高いことが確認された。 From FIG. 5 , the hydrophilic lignin derivative prepared in Example 2 tended to have a higher C6 saccharification rate than the lignin derivative prepared in Comparative Example 1. From this result, it was confirmed that the lignin derivative prepared in Example 2 had a higher effect of improving enzyme activity than the lignin derivative prepared in Comparative Example 1.

本発明によれば、リグノセルロース系バイオマスから、親水性リグニン誘導体を含む液分画と疎水性リグニン誘導体を含む固形分画とを得ることができる。親水性リグニン誘導体を含む液分画は酵素安定化剤として有用であり、疎水性リグニン誘導体を含む固形分画は、機能性原料の製造原料として有用である。 According to the present invention, a liquid fraction containing hydrophilic lignin derivatives and a solid fraction containing hydrophobic lignin derivatives can be obtained from lignocellulosic biomass. A liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative is useful as an enzyme stabilizer, and a solid fraction containing a hydrophobic lignin derivative is useful as a raw material for producing a functional raw material.

1…第一の反応槽、1a…アルカリ供給手段、1b…温度計、1c…リグノセルロース系バイオマス供給手段、1d…ポリアルキレングリコール供給手段、2…濾過装置、3…第二の反応槽、4…固液分離装置、5,6a,6b,7…配管、5a…ポンプ、100…酵素安定化剤の製造装置 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1... First reaction tank 1a... Alkaline supply means 1b... Thermometer 1c... Lignocellulosic biomass supply means 1d... Polyalkylene glycol supply means 2... Filtration device 3... Second reaction tank 4 ... solid-liquid separator, 5, 6a, 6b, 7 ... piping, 5a ... pump, 100 ... enzyme stabilizer manufacturing apparatus

Claims (2)

以下の工程を含むリグノセルロース系バイオマスの糖化方法。
(1)木本植物、草本植物、それらの加工物およびそれらの廃棄物からなる群より選ばれる少なくとも1種であるリグノセルロース系バイオマスと、平均分子量が400~600であるポリエチレングリコールに第一の酸を添加して反応させる工程、
(2)工程(1)で得られた反応液にアルカリを添加して中和する工程、
(3)工程(2)で得られたアルカリ中和液から固形分を除く工程、
(4)工程(3)で得られた液分画に第二の酸を添加する工程、
(5)工程(4)で沈殿した沈殿物に対し固液分離を行い、親水性リグニン誘導体を含む液分画を得る工程、及び、
(6)前記工程(5)で得られた液分画をリグノセルロース系バイオマスに添加する工程
A method for saccharification of lignocellulosic biomass comprising the following steps .
(1) Lignocellulosic biomass, which is at least one selected from the group consisting of woody plants, herbaceous plants, processed products thereof, and waste products thereof, and polyethylene glycol having an average molecular weight of 400 to 600. adding an acid to react,
(2) adding alkali to the reaction solution obtained in step (1) to neutralize;
(3) removing solids from the neutralized alkaline solution obtained in step (2);
(4) adding a second acid to the liquid fraction obtained in step (3);
(5) performing solid-liquid separation on the precipitate precipitated in step (4) to obtain a liquid fraction containing a hydrophilic lignin derivative;
(6) Step of adding the liquid fraction obtained in step (5) to lignocellulosic biomass
前記工程(6)において、前記工程(5)で得られた液分画を、前記工程(5)で得られた液分画中の親水性リグニン誘導体、酵素糖化される前記リグノセルロース系バイオマスの乾燥重量に対し0.1~1.0質量%となるように添加する、請求項に記載の糖化方法。 In the step (6), the liquid fraction obtained in the step (5) is subjected to enzymatic saccharification of the hydrophilic lignin derivative in the liquid fraction obtained in the step (5). The saccharification method according to claim 1 , wherein the dry weight is added so as to be 0.1 to 1.0% by mass.
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