JP7069007B2 - 取り込み／排出を改変した微生物宿主におけるヒトミルクオリゴ糖の生産 - Google Patents
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Description
人乳は乳幼児の成長に最良の食品であると考えられている。人乳は脂質、タンパク質、ビタミン、ミネラル、微量元素、及びラクトースと約１５０種類の構造的に多様なオリゴ糖（ヒトミルクオリゴ糖、ＨＭＯ）を含む複合糖質混合物から構成される。
ＨＭＯは乳幼児の胃腸内細菌叢の発達に有益な影響を与え、栄養添加物としての使用が推奨されるため、主として化学的又はバイオテクノロジーアプローチによりＨＭＯを生産する試みが広く注目されている。これらのプレバイオティックな特性以外にも、ＨＭＯの他の多くのプラスの効果がこれまでに確認されており、その利用分野は拡大している。
しかし、多くの科学研究は実現する見込みの殆どない単一の純化合物を求めている。特にこのような例としては複雑な遊離型の中性及び酸性オリゴ糖が挙げられ、競争力のある大規模生産方法は未だに存在しない（例えばラクト－Ｎ－テトラオース（Ｇａｌ（β１－３）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（Ｇａｌ（β１－４）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（Ｆｕｃ（α１－２）Ｇａｌ（β１－３）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＩ（Ｆｕｃ（α１－２）Ｇａｌ（β１－４）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）（ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースａ（ＬＳＴ－ａ；Ｎｅｕ５Ａｃ（α２－３）Ｇａｌ（β１－３）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ））。化学的方法ではこれらの分子を数トン規模で生産するには非効率的であるため、これらの化合物を生産するように微生物の代謝経路を改変する方法が最も有望なアプローチである。
主に代謝改変大腸菌株を使用して２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース又は３’－シアリルラクトース等の単純な構造のＨＭＯを生産する数種の発酵アプローチが既に開発されている。
しかし、細菌細胞からのオリゴ糖排出を促進し、それによって（ｉ）生産性を高めると共に、（ｉｉ）培養ブロスから所望のオリゴ糖を回収できるようにしなければ、大規模な量は得られない。生産される糖が大きくなるほど、排出の問題を解決する必要性は増すと思われる。また、現在利用可能な発酵法では、生産されるオリゴ糖が複雑になると、産生細胞からオリゴ糖前駆体が排出されてしまい、発酵培地に産物と前駆体のオリゴ糖が混在してしまうという問題が生じる。膜を通して単糖又は二糖を転移させることが分かっているトランスポータータンパク質には複数のものがあるが、もっと大きいオリゴ糖（例えば三糖以上のオリゴ糖）の輸送については殆ど分かっていない。
例えば、頻用される発酵モデル生物である大腸菌のゲノムは、５００種類を超える異なるトランスポータータンパク質をコードする（Ｂｕｓｃｈ ａｎｄ Ｓａｉｅｒ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２；３７（５）：２８７－３３７）。これらの膜輸送タンパク質の分類は種々多様であり、転移メカニズム、タンパク質構造又は発生起源によりサブグループに分けられる。
定説によると、エネルギー駆動型能動輸送体は、基質の濃度又は電気化学勾配に逆らって基質移動を行うが、基質がチャネルを流れる動力学と方向は主にこのような勾配に従う。転移に使用されるエネルギー源に応じて、夫々ＡＴＰ等の代謝エネルギー又は電気化学ポテンシャルを利用する一次性能動輸送体と二次性能動輸送体とに、ポンプを原則的に分類することができる（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７ Ｏｃｔ；１５（１０）：４４８－５５；Ｆｏｒｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｆｅｂ；１８０７（２）：１６７－８８）。エネルギー生成、糖質取り込み及びタンパク質と抗細菌物質との流出を可能にする数種類の膜タンパク質については詳細な情報が得られているが、力学的プロセス又は天然基質もしくは推定基質に関する情報についてのこれまでに得られた鋭い洞察は、注釈を付された細菌トランスポーターのごく一部についてのものに過ぎない。
大腸菌ラクトースパーミアーゼＬａｃＹは恐らく最も詳細に特性解析されている溶質トランスポーターであり（Ｇｕａｎ ａｎｄ Ｋａｂａｃｋ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２００６；３５：６７－９１）、ユニポート、シンポート又はアンチポートにより糖類、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオン等を輸送する二次性能動輸送体のクラスに属する巨大で著しく多様なメジャーファシリテーター（ｍａｊｏｒ ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）スーパーファミリー（ＭＦＳ）のメンバーである（Ｓａｉｅｒ ｅｉ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｎｏｖ；１（２）：２５７－７９）。少数の例外を除き、ＭＦＳトランスポーターには細胞膜を貫通するヘリックス６本からなるサブドメインを２つもつという共通の構造特徴がある。関連するＨ＋共役型ＭＦＳシンポーター間に機能的に相同のアミノ酸位置が存在することからも、ラクトースパーミアーゼにも同様の動力学的メカニズムが確認されるものと思われる（Ｍａｄｅｊ ａｎｄ Ｋａｂａｃｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｄｅｃ １０；１１０（５０）：Ｅ４８３１－８）。
数十年前から、細菌への糖質の取り込みについては膨大な情報が得られている。しかし、糖質、特に非表面会合分子の排出については、極僅かな情報しか得られていない。糖類は実際に有利な炭素及びエネルギー源であり、一旦細胞に取り込んだら競争的環境に放出すべきでないため、この点は意外ではない。
しかし、糖エクスポーターの天然の機能には浸透圧又は糖リン酸ストレスの軽減が含まれている可能性が高く、このような機能は柔軟な範囲の基質に対応すると思われる。興味深いことに、ＭＦＳトランスポーター群に属するいわゆる糖排出（ｓｕｇａｒ ｅｆｆｌｕｘ）トランスポーターファミリー（ＳＥＴ）のメンバーについて、ＩＰＴＧ、ＴＭＧ及びラクトース等の種々のガラクトシドの排出が示されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ａｕｇ １３；２７４（３３）：２２９７７－８４；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；３１（６）：１８４５－５１）。
大腸菌輸送タンパク質ＳｅｔＡはヒトミルクオリゴ糖である３－フコシルラクトースを転移させ、その結果、ｓｅｔＡを過剰発現する組換え型大腸菌株の発酵中における３－フコシルラクトースの生産が改善されるとも記載されている（出願人の国際特許出願第ＷＯ２０１０／１４２３０５号参照）。また、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）に由来する糖排出トランスポーターを発現させることにより、改変型大腸菌産生株からヒトミルクオリゴ糖２’－フコシルラクトースの排出が可能になることも示されている。
この他に、力学的及びエネルギー的観点から、膜を通って両方向に溶質を移動させる能力があるのはイオン－勾配駆動型輸送システムのみである。このような例としては、大腸菌でラクトースの代謝を可能にする細菌ｌａｃオペロンの一部であるガラクトシド／Ｈ＋シンポーターである上記ＬａｃＹが挙げられる。このパーミアーゼは主としてラクトースを細胞に取り込むが、その基質を逆方向に転移させることも可能である。
最大のトランスポーター群であるメジャーファシリテータースーパーファミリー以外に、細菌は溶質を排出するための別のメカニズムも持っており、このようなメカニズムは多剤排出ポンプのクラスにまとめられていることが多い。ＭＦＳと同様に、低分子多剤耐性（ｓｍａｌｌ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）スーパーファミリー（ＳＭＲ）、多剤・毒性化合物排出（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ａｎｄ ｔｏｘｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）スーパーファミリー（ＭＡＴＥ）及び耐性・根粒形成・細胞分裂（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ－ｃｅｌｌ ｄｉｖｉｓｉｏｎ）スーパーファミリー（ＲＮＤ）の活性は電気化学勾配に依存する。５番目の分類はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）結合カセットスーパーファミリー（ＡＢＣ）であり、細胞から分子を駆動するためのエネルギー源としてＡＴＰを使用する。ＭＦＳと同様に、ＳＭＲ、ＭＡＴＥ、ＲＮＤ及びＡＢＣのメンバーは構造的に多様な分子を輸送する。更に、これまでに同定されているそれらの基質の大半は天然に存在しないため、それらの基質優先性は殆ど推測できない。
Ｂｕｓｃｈ ａｎｄ Ｓａｉｅｒ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２；３７（５）：２８７－３３７
Ｄａｖｉｄｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７ Ｏｃｔ；１５（１０）：４４８－５５
Ｆｏｒｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２０１１ Ｆｅｂ；１８０７（２）：１６７－８８
Ｇｕａｎ ａｎｄ Ｋａｂａｃｋ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２００６；３５：６７－９１
Ｓａｉｅｒ ｅｉ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９ Ｎｏｖ；１（２）：２５７－７９
Ｍａｄｅｊ ａｎｄ Ｋａｂａｃｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｄｅｃ １０；１１０（５０）：Ｅ４８３１－８
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９ Ａｕｇ １３；２７４（３３）：２２９７７－８４
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９ Ｍａｒ；３１（６）：１８４５－５１
ヒトミルクオリゴ糖の化学的合成法は知られているが、これらの方法は非常にコストがかかり、満足な量を得られない。他方、遺伝子改変微生物を使用した発酵法には、大きいオリゴ糖（四糖、五糖、六糖）の排出が費用効果のある生産方法の確立の大きな妨げになるという欠点が残っている。従って、大規模なヒトオリゴ糖の改善された生産方法が、依然として必要とされている。
本発明によると、上記及び他の目的は添付の特許請求の範囲に記載するような方法及び微生物宿主細胞により解決される。
本発明の方法及び宿主細胞によると、所望のオリゴ糖、好ましくは非改変宿主細胞で生産されないオリゴ糖、更に好ましくはヒトミルクオリゴ糖に属するオリゴ糖を培地から取得可能な大量の量で生産することが可能である。従って、オリゴ糖は言わば培地中から遊離状態で取得可能であり、表面タンパク質又は膜タンパク質又は宿主細胞の表面の他のタンパク質と結合していない。
本発明によると、遺伝子的に改変された微生物宿主細胞による所望のオリゴ糖の生産方法が提供され、前記方法は、ａ）少なくとも１種の組換え型グリコシルトランスフェラーゼを含んでおり、少なくとも１種の内在性糖排出タンパク質の発現又は活性が遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して（ｉ）増加又は（ｉｉ）低下もしくは不活性化され、夫々遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して（ｉ）培地へのオリゴ糖の排出が低下もしくは停止するか、又は（ｉｉ）所望のオリゴ糖の輸送が増加するように、前記糖排出タンパク質の発現又は活性が改変された遺伝子的に改変された微生物宿主細胞を準備する工程と、ｂ）前記所望のオリゴ糖の生産に許容される条件下で前記宿主細胞を培地で培養し、前記所望のオリゴ糖を前記培地中に輸送させる工程を含む。前記方法は更にｃ）前記培地から前記所望のオリゴ糖を取得する工程を含むことができる。
本発明の方法において、前記所望のオリゴ糖は、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ；ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）をコア三糖として含むヒトミルクオリゴ糖であることが好ましい。なお、「コア三糖」を有するオリゴ糖とは、所望のオリゴ糖の還元末端に相当する特定の三糖を含むことを意味し、場合により、主要部分に相当する前記特定の三糖と共に別の糖部分も含む。
従って、本発明の方法及び宿主細胞の１実施形態において、前記所望のオリゴ糖は、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキソースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩＩ、ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃ、ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース、ジシアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオースから構成される群から選択される。
オリゴ糖排出の制限という上記欠点に対処するために、上記発明の以下のような方法により、この課題はさらに解決される：前記宿主細胞が、前記培地への所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする少なくとも１種の同種もしくは異種核酸配列を含み、前記同種もしくは異種核酸配列の発現が、過剰発現となるかもしくは前記核酸配列の過剰発現を可能にするプロモーターの制御下におかれるように、前記宿主細胞が改変されている；及び／又は、前記宿主細胞が、前記所望のオリゴ糖の前駆体を前記宿主細胞の外側に排出するエクスポータータンパク質をコードする少なくとも１種の内在性核酸配列の、欠失、破壊、機能低下もしくは不活性化を含んでいる；及び／又は、前記宿主細胞が、前記宿主細胞への所望のオリゴ糖の前駆体の取り込みに介在するタンパク質をコードする少なくとも１種の同種もしくは異種核酸配列を含み、好ましくは前記核酸配列が過剰発現されており、好ましくは前記前駆体が三糖以上である。
グルコース、スクロース、グリセリン又はその組み合わせの存在下でこれらの基質を炭素源及びエネルギー源として使用すると共に、ラクトース又は三糖以上のオリゴ糖（例えばＬＮＴ－ＩＩ）の存在下で、本願に記載するような特徴を含む遺伝子的に改変された微生物宿主細胞を、培養する。
この方法及び宿主細胞の好ましい１実施形態において、所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質は二次性能動輸送体のクラスに属しており、より好ましくは少なくとも３つの部分を含むオリゴ糖の排出を行う。
好ましい実施形態によると、所望のオリゴ糖を排出させるために、細胞内オリゴ糖生合成に関与する遺伝子以外に適切なエクスポーターを発現させる。
本発明の方法及び宿主細胞の１態様によると、所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも１種の核酸配列は内在性核酸又は組換え型核酸である。
本発明の方法及び宿主細胞の好ましい１実施形態において、所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記核酸配列は、細菌、古細菌、植物、酵母又は動物に由来し、好ましくは所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも１種の核酸配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するｙｅｂＱ及びｙｊｈＢ、マンヘミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）に由来するｐｒｏＰ並びにセデセア・ネテリ（Ｃｅｄｅｃｅａ ｎｅｔｅｒｉ）に由来するｓｅｔＡから構成される群から選択される遺伝子又はその機能的フラグメントである。
好ましくは、前記オリゴ糖エクスポーターは大腸菌のＳｅｔＡ、ＳｅｔＢ、ＳｅｔＣ、ＹｄｅＡ、Ｃｍｒ、ＹｎｆＭ、ＭｄｔＤ、ＹｆｃＪ、ＹｈｈＳ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ及びＹｄｅＡ、マンヘミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）に由来するＰｒｏＰ、並びにセデセア・ネテリ（Ｃｅｄｅｃｅａ ｎｅｔｅｒｉ）に由来するＳｅｔＡの少なくとも１種から選択されるタンパク質又はその変異体もしくはホモログである。
更に別の好ましい実施形態において、前記組換え型グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼの少なくとも１種から選択され、好ましくはβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β－１，６－ガラクトシルトランスフェラーゼ、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ又はα－１，３－フコシルトランスフェラーゼの少なくとも１種から選択される。
本発明の方法及び宿主細胞の好ましい１実施形態は、宿主細胞又はその供給に関し、前記宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼとして（ｉ）β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと、（ｉｉ）β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼとを含む。なお、前記β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、Ｎ－アセチルグルコサミンをラクトースに連結してラクト－Ｎ－トリオースＩＩを生成する活性をもち、前記β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ又は前記β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼは、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩをガラクトシル化して夫々ラクト－Ｎ－テトラオース又はラクト－Ｎ－ネオテトラオースを生成する活性をもつことが、好ましい。本発明により開発されたシステムは、別のグリコシルトランスフェラーゼの発現により更に複雑なオリゴ糖にも容易に応用可能である。
本発明の微生物細胞及び方法によると、所望のオリゴ糖、特にＬＮＴ－ＩＩをコア構造として含むオリゴ糖を大量に発酵させ、培養ブロスから回収することが可能である。
好ましい１実施形態において、前記β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）のＩｇｔＡ又はパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）のＰｍｎａｇＴのクラス又はその変異体に属する。
前記グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びフコシルトランスフェラーゼから選択されることが好ましい。
更に別の好ましい実施形態において、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼを生成する前記ラクト－Ｎ－テトラオースは、ＷｂｄＯ又はその機能的変異体である。本発明の１態様によると、前記β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）に由来するβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｗｂｄＯ、アクセッション番号ＡＹ７３０５９４）であり、大腸菌Ｏ５５：Ｈ７に由来するｗｂｇＯ又はルチエラ・ニトロフェルム（Ｌｕｔｉｅｌｌａ ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ）に由来するｆｕｒＡから構成される群から選択される遺伝子又はその機能的フラグメントによりコードされることが好ましい。
本発明は更に、内在性β－ガラクトシダーゼ遺伝子が不活性化又は欠失しており、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子が存在する、上記のような遺伝子的に改変された微生物宿主細胞、好ましくは細菌宿主細胞に関する。
従って、本発明の方法及び宿主細胞の好ましい１実施形態では、該当する場合には、内在性β－ガラクトシダーゼ遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ遺伝子を不活性化又は欠失させた遺伝子的に改変された宿主細胞が提供され、前記遺伝子的に改変された宿主細胞は、機能的ラクトースパーミアーゼタンパク質、好ましくはＬａｃＹをコードする核酸配列を含む。
好ましい１実施形態において、前記遺伝子的に改変された宿主細胞は、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン産生能と、ＵＤＰ－ガラクトース、ＧＤＰ－フコース又はＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸産生能が、遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して上昇している。
本発明の方法及び宿主細胞のこの実施形態の改良例において、前記ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン及びＵＤＰ－ガラクトース産生能の上昇は、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、ＵＤＰ－ガラクトース－４－エピメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの活性を含むタンパク質をコードする１種以上の遺伝子の過剰発現を含む。
例えばＬＮＴの合成には、ＵＤＰ－ガラクトースとＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンが必要である。ＵＤＰ－ガラクトースは、発酵培地を介してＨＭＯ産生細菌宿主細胞にガラクトースを供給することにより得ることができる。その後、ガラクトースは細胞に取り込まれ、リン酸化されてガラクトース－１－リン酸となった後、ＵＤＰ－ガラクトースに変換される。これらの酵素活性をコードする遺伝子は、文献から周知である（Ｇｒｏｓｓｉｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ２００３ １８５（３）８７０－８７８）。ＵＤＰ－ガラクトースの供給は細胞自身の代謝により得ることもでき、代謝はＵＤＰ－ガラクトース－４’－エピメラーゼ又はＵＤＰ－ガラクトース－４’－エピメラーゼとグルコース－１－リン酸－１－ウリジリルトランスフェラーゼとの組み合わせの過剰発現等で更に遺伝子改変することにより、改善することができる。ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンは、細菌宿主細胞自身のＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン代謝により得ることもできる。オリゴ糖を含むＮ－アセチルグルコサミンの合成用のＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンの供給は、産生細胞内のＮ－アセチルグルコサミン異化の不活性化により改善することができる。
本発明の１態様によると、グルコース、スクロース、グリセロール又はその組み合わせの存在下で且つＮ－アセチルグルコサミン又はガラクトース又はその組み合わせの不添加下又は非存在下において、前記遺伝子的に改変された宿主細胞を培養する。
本発明の方法及び宿主細胞の好ましい１実施形態において、前記所望のオリゴ糖は、発現された異種グリコシルトランスフェラーゼであるβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼとβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとの作用により、宿主細胞中で単一炭素源からの全発酵により生産されるラクト－Ｎ－トリオースＩＩである。
既に記載したように、本発明はまた、所望のオリゴ糖の生産用の遺伝子的に改変された宿主細胞にも関し、前記オリゴ糖は、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ；ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）をコア三糖として含み、前記宿主細胞は、少なくとも１種の組換え型グリコシルトランスフェラーゼを含み、前記グリコシルトランスフェラーゼは、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼから選択されることが好ましく、少なくとも１種の内在性糖輸送タンパク質の発現又は活性が、前記所望のオリゴ糖の前駆体の排出について機能的に不活性化されるように、前記内在性糖輸送タンパク質の発現又は活性が、改変されている。
好ましい１実施形態は、（ｉ）発現された異種β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと、（ｉｉ）発現された異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ又は発現された異種β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼとをグリコシルトランスフェラーゼとして含む上記のような宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、更に宿主細胞を培養する培地への前記オリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする少なくとも１種の同種又は異種核酸配列を含むことが好ましく、所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質は二次性能動輸送体のクラスに属し、前記宿主細胞は、前記同種又は異種核酸配列の発現が過剰発現となるように、又は前記核酸配列の過剰発現を可能にするプロモーターの制御下におかれるように、改変されている。前記宿主細胞の好ましい実施形態において、前記所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも１種の核酸配列は、内在性核酸配列又は組換え型核酸配列である。
本発明の方法について既に概説したように、本発明の宿主細胞において、所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記核酸配列は、細菌、古細菌、植物、酵母又は動物に由来することが好ましい。
本発明の別の態様によると、上記のような宿主細胞は更に、前記所望のオリゴ糖の前駆体を宿主細胞の外側に排出するエクスポータータンパク質をコードする少なくとも１種の内在性核酸配列の欠失、破壊、機能低下もしくは不活性化；及び／又は前記宿主細胞への所望のオリゴ糖の前駆体の取り込みを可能にするタンパク質をコードする少なくとも１種の同種もしくは異種核酸配列を含み、好ましくは前記核酸配列が過剰発現しており、好ましくは前記前駆体が三糖以上である。
前記宿主細胞への所望のオリゴ糖の前駆体の取り込みを可能にするタンパク質をコードする少なくとも１種の同種又は異種核酸配列が過剰発現されると、所望のオリゴ糖の前駆体（例えばＬＮＴ－ＩＩ）を培地に供給することが可能になり、これは宿主細胞に取り込まれる。
本発明の１態様によると、宿主細胞において、所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも１種の核酸配列は、大腸菌に由来するｙｅｂＱ及びｙｊｈＢ、マンヘミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）に由来するｐｒｏＰ並びにセデセア・ネテリ（Ｃｅｄｅｃｅａ ｎｅｔｅｒｉ）に由来するｓｅｔＡから構成される群から選択される遺伝子又はその機能的フラグメントである。
更に別の好ましい実施形態によると、前記所望のオリゴ糖は、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩであり、前記宿主細胞を培養する培地への前記所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質は、大腸菌に由来するＹｊｈＢ、マンヘミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）に由来するＰｒｏＰ及びセデセア・ネテリ（Ｃｅｄｅｃｅａ ｎｅｔｅｒｉ）に由来するＳｅｔＡ又はその機能的フラグメントである。
好ましい１実施形態によると、本発明の微生物宿主は、所望のオリゴ糖の前駆体を排出するタンパク質を発現しないように更に改変されている。
前記宿主細胞の好ましい１実施形態において、前記所望のオリゴ糖は、ラクト－Ｎ－テトラオースであり、前記前駆体は、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩであり、前記宿主細胞は、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩを前記宿主細胞の外側に排出することが可能なエクスポータータンパク質をコードする少なくとも１種の核酸配列が欠失、破壊又は不活性化されている。
なお、ラクト－Ｎ－テトラオースの排出を可能にする前記タンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に由来するＹｅｂＱ、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のＳｐｏＶＢ、エルウィニア・ピリフォリア（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｙｒｉｌｆｏｌｉａ）のＹａｂＭ、大腸菌ＭＧ１６５５のＢｃｒ、大腸菌ＭＧ１６５５のＹｄｅＡ、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＰｒｏＰ２、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）のＳｅｔＡ、大腸菌ＭＧ１６５５のＦｕｃＰ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｂｍｂ９３９３のＭｄｅＡ、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）のＩｍｒＡ、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＴ－１のＳｅｔＡ及びボーベリア・バシアーナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）Ｄ１－５のＳｅｔＡから選択されることが好ましい。
前記オリゴ糖エクスポーターは、大腸菌のＳｅｔＡ、ＳｅｔＢ、ＳｅｔＣ、ＹｄｅＡ、Ｃｍｒ、ＹｎｆＭ、ＭｄｔＤ、ＹｆｃＪ、ＹｈｈＳ、ＥｍｒＤ、ＹｄｈＣ、ＹｂｄＡ、ＹｄｅＥ、ＭｈｐＴ、ＹｅｂＱ、ＹｊｈＢ、Ｂｃｒ及びＹｄｅＡ、マンヘミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）に由来するＰｒｏＰ並びにセデセア・ネテリ（Ｃｅｄｅｃｅａ ｎｅｔｅｒｉ）に由来するＳｅｔＡの少なくとも１種から選択されるタンパク質又はその変異体もしくはホモログであることが好ましい。
本願において、「核酸」なる用語は、１本鎖又は２本鎖のデオキシリボヌクレオチド高分子又はリボヌクレオチド高分子を意味するとともに、所望の核酸とハイブリダイズし且つ所定のポリペプチドをコードする公知のアナログ又は天然もしくは合成ヌクレオチドを包含する。
微生物宿主細胞に関して本願で使用する「組換え」又は「遺伝子的に改変」なる用語は、微生物宿主細胞が異種核酸を複製すること、又は異種核酸（即ち、「前記細胞に対して外来性の」配列）によりコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを意味する。組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態に存在しない遺伝子を含むことができる。組換え細胞は、細胞の天然形態に存在する遺伝子を含むこともでき、その場合、遺伝子は改変され、人為的手段により細胞に導入される。この用語は、細胞に内在性の核酸を細胞から除去せずに改変された細胞も包含し、このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的突然変異及び関連技術により得られるものが挙げられる。従って、「組換えポリペプチド」とは、組換え細胞により産生されたものである。本願で使用する「異種配列」又は「異種核酸」とは、特定の宿主細胞に対して外来性の起源に由来するもの（例えば別の種に由来するもの）、又は同一起源に由来する場合にはその本来の形態から改変されたものである。従って、プロモーターに機能的に連結された異種核酸は、プロモーターが由来する起源とは別の起源に由来し、同一起源に由来する場合には、その本来の形態から改変されている。異種配列は、例えばトランスフェクション、形質転換、コンジュゲーション又は形質導入により微生物宿主細胞のゲノムに安定的に導入することができ、こうして遺伝子的に改変された宿主細胞となる。配列を導入しようとする宿主細胞に応じた技術を適用することができる。種々の技術が当業者に公知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に開示されている。
従って、本願において「微生物宿主細胞」とは外来ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランスフェクションされているか又は形質転換もしくはトランスフェクションすることが可能な微生物、好ましくは細菌細胞とみなされる。
従って、本発明で使用される核酸配列は、例えば宿主微生物細胞に安定的に形質転換／トランスフェクション又は他の方法で導入されるベクターに含むことができる。
本願で使用する「機能的に連結された」なる用語は、核酸発現調節配列（例えばプロモーター、シグナル配列又は一連の転写因子結合部位）と第２の核酸配列との機能的連結を意味し、前記発現調節配列は第２の配列に対応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を与える。従って、「プロモーター」なる用語は、通常ではＤＮＡポリマー内で遺伝子の「手前」に配置され、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供する、ＤＮＡ配列を意味する。「レギュレーター」ＤＮＡ配列もまた、通常では所定のＤＮＡポリマー内で遺伝子の「上流」（即ち手前）に配置され、転写開始頻度（又は速度）を決定するタンパク質と結合する。機能的ＤＮＡポリマーにおいて選択された遺伝子（又は遺伝子群）の手前に配置されるこれらの配列は「プロモーター／レギュレーター」又は「調節」ＤＮＡ配列と総称され、共働して遺伝子の転写（及びその結果としての発現）が生じるか否かを決定する。ＤＮＡポリマー内で遺伝子の「後方」に配置され、ｍＲＮＡへの転写の終結シグナルを提供するＤＮＡ配列を転写「ターミネーター」配列と呼ぶ。
本発明のポリペプチドを生産するには、非常に多様な発現システムを使用することができる。このようなベクターとしては、特に染色体、エピソーム及びウイルス由来ベクターが挙げられ、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルスに由来するベクターと、その組み合わせに由来するベクター（例えばコスミドやファージミド等のプラスミド及びバクテリオファージ遺伝子成分に由来するもの）が挙げられる。発現システム構築物は、発現を制御及び誘発する調節領域を含むことができる。一般に、この点では、ポリヌクレオチドを維持、増殖又は発現させ、ポリペプチドを宿主で合成するのに適したあらゆるシステム又はベクターを、発現に使用することができる。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前出に記載されているもの等の種々の周知及び慣用技術のいずれかにより、適切なＤＮＡ配列を、発現システムに挿入することができる。
選択された宿主生物の形質転換に使用される遺伝子材料の単離、合成、精製及び増幅用の「組換えＤＮＡ」技術については、多数の特許及び非特許文献に記載されている。従って、選択された外来（即ち外来性又は「異種」）ＤＮＡ配列を導入した「ハイブリッド」ウイルス又は環状プラスミドＤＮＡで宿主生物を形質転換することは、常識である。当分野で公知の方法は、先ず環状ウイルス又はプラスミドＤＮＡを酵素により切断して線状ＤＮＡ鎖を形成することにより、形質転換用ベクターを作製する。同一／類似の酵素を利用することにより、通常は所望のタンパク質産物をコードする配列を含む選択された外来ＤＮＡ鎖を、線状形態で作製する。復元プロセスを実施することが可能な連結酵素の存在下で、線状ウイルス又はプラスミドＤＮＡを外来ＤＮＡと共にインキュベートし、この選択された外来ＤＮＡセグメントをウイルス又は環状ＤＮＡプラスミドに「スプライス」した「ハイブリッド」ベクターを形成する。
本願で使用する「培養する」なる用語は、所望のオリゴ糖の生産に許容され且つ適切な条件下で細菌細胞を培地で増殖させることを意味する。当業者は、自身の技術的及び専門的背景を踏まえて本発明の開示を通読後に、数種の適切な細菌宿主細胞とその培地及び条件に容易に想到するであろう。
本願で使用する「回収する」又は「取得する」なる用語は本発明の宿主細胞により産生されたオリゴ糖を宿主細胞培養液から単離、回収、精製、採取又は他の方法で分離することを意味する。
本発明による「微生物」宿主細胞とは、一般に理解されている通り、一般に大量培養に適しており、所望のオリゴ糖を生産するために本発明に従って遺伝子的に改変することが可能な細菌、真菌及び古細菌を含むあらゆる微生物を意味する。好ましい微生物は細菌（例えば大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））と酵母サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）であり、これらの微生物は実験室環境で簡単且つ廉価に増殖させることができ、細菌と酵母は多年来詳細に調査されているという利点がある。
一般に、本発明の全文を通して「グリコシルトランスフェラーゼ活性」又は「グリコシルトランスフェラーゼ」なる用語は、二糖、オリゴ糖及び多糖の生合成に関与する酵素を意味及び包含し、これらは活性化されたヌクレオチド単糖／糖（「グリコシル供与体」）からグリコシル受容体分子への単糖部分の転移を触媒する。
一般に、本発明の全文を通して「エクスポーター」又は「エクスポータータンパク質」又は「所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質」なる用語は、本願では同義に使用され、単独又はマルチタンパク複合体の一部として細菌細胞の細胞内環境から前記細胞のペリプラズム又は培養上清へとオリゴ糖を転移させ、オリゴ糖が前記細胞の細胞膜及び／又は細胞壁を通過できるようにする１種以上のポリペプチドを意味する。
本発明の範囲内では、野生型グリコシルトランスフェラーゼ活性又はオリゴ糖排出を示すタンパク質によりコードされるポリペプチドに対して好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、２００アミノ酸、５００アミノ酸、１０００アミノ酸又はそれ以上の領域にわたって約６０％を上回るアミノ酸配列一致度、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上のアミノ酸配列一致度を有する、核酸／ポリヌクレオチド及びポリペプチド多形変異体、対立遺伝子、突然変異体及び種間ホモログもまた、これらの用語に含まれる。
本願で使用する用語「変異体」なる用語は、夫々参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドと異なるが、本質的な性質を維持するポリヌクレオチド又はポリペプチドを意味する。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、ヌクレオチド配列が別の参照ポリヌクレオチドと相違する。変異体のヌクレオチド配列の変異は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更するものでもよいし、変更しないものでもよい。ヌクレオチド変異の結果、以下に記載するように、参照配列によりコードされるポリペプチドにアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び切断を生じることができる。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が別の参照ポリペプチドと相違する。一般に、変異は、参照ポリペプチドと変異体の配列が全体的に非常によく似ており、多くの領域では一致するように制限される。変異体と参照ポリペプチドは、任意の組み合わせの１箇所以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が相違し得る。置換又は挿入されるアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされるものでもよいし、されないものでもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように天然に存在するものでもよいし、天然に存在することが分かっていない変異体でもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術、直接合成、及び当業者に公知の他の組換え法により作製することができる。
従って、本願に開示する遺伝子／タンパク質のいずれかの「機能的フラグメント」とは、夫々のフラグメントが由来する遺伝子又はタンパク質の活性と同一であるか又は若干弱い活性を維持する遺伝子／タンパク質の配列変異体を意味するものである。
なお、「～をコードする核酸配列」なる用語は、一般に、非改変ＲＮＡ又はＤＮＡでも改変ＲＮＡ又はＤＮＡでもよい任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、一般に所定のポリペプチド又はタンパク質をコードする遺伝子を表す。
この文脈で、「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合又は改変ペプチド結合により相互に結合した２個以上のアミノ酸を含む、任意のペプチド又はタンパク質を意味する。「ポリペプチド」とは、短鎖（一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーと呼ばれる）と長鎖（一般「タンパク質」と呼ばれる）の両方を意味する。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子によりコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、プロセッシングや他の翻訳後修飾等の天然プロセスだけでなく、化学的修飾技術により修飾されたものも含む。なお、ポリペプチドによっては、このポリペプチドの活性を本質的に変えずに数箇所の部位で同一程度又は異なる程度で同一種の修飾が存在している場合がある。更に、ポリペプチドによっては、多数の型の修飾を含む場合もある。修飾は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシル末端を含むポリペプチドのあらゆる場所に存在することができる。
更に、「前駆体」なる用語には、本発明のオリゴ糖の生合成経路に関与する化合物、又は宿主細胞で産生され、天然に存在する化合物が含まれる。
本願において「三糖以上の前駆体」とは、３個以上の単糖残基を含む糖部分とみなされる。
「所望のオリゴ糖」なる用語は、少なくとも３つの部分から構成される糖ポリマーを意味し、即ち、三糖類、四糖類、五糖類等を含み、好ましくはラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキソースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩＩ、ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃ、ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース、ジシアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオースの少なくとも１種から選択されるオリゴ糖である。
本願では、当該分野で一般に理解されている通り、「同種」なる用語は、特定の１種以上の産物をコードする核酸配列であって、前記核酸配列を挿入する種と同一種に由来するものを意味する。従って、「異種」なる用語は、特定の１種以上の産物をコードする核酸配列であって、前記核酸配列を挿入する種以外の種に由来するものを意味する。
本願及び一般に当該分野において「内在性」なる用語は、目的の酵素をコードする核酸が細菌宿主細胞に由来し且つ前記宿主細胞に導入されたものではないことを意味し、これに対して「組換え」核酸は、前記宿主細胞に導入されたものであり且つ前記宿主細胞に由来しない。
本願及び一般に当該分野において「過剰発現された」又は「過剰発現する」又は「前記核酸配列の過剰発現を可能にするプロモーター配列の制御下」なる用語は、通常値を上回る量、即ち多量の遺伝子が発現し、この核酸配列がコードしているタンパクの量が増加することを意味する。
所定の実施形態では、発現レベルが例えば温度、ｐＨ、嫌気性又は好気性条件、光、転写因子及び薬品等の環境又は発生因子により変化し得る場合に、遺伝子の発現を誘導するプロモーターである誘導性プロモーターの制御下に核酸配列を置く。このようなプロモーターを本願では「誘導性」プロモーターと言い、本発明で使用されるタンパク質の発現のタイミングを制御できる。大腸菌及び他の微生物宿主細胞について、誘導性プロモーターは当業者に公知である。
その他の利点は以下の説明と図面から明らかである。
当然のことながら、上記特徴及び以下に説明する特徴は、本発明の文脈から逸脱しない限り、指定する夫々の組み合わせだけでなく、他の組み合わせで使用することもできるし、単独で使用することもできる。
以下、実施例と添付図面により本発明をより詳細に説明する。
図１は、ラクトースを取り込み、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴＩＩ）とラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）を合成する本発明の代表的宿主細胞１０の模式図を示す。ラクトースは、宿主細胞を培養する培地からトランスポーター１を介して細胞に取り込まれる。酵素Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＮａｃＧｌｃＴは、Ｎ－アセチルグルコサミンを受容体基質ラクトースに連結し、ＬＮＴ－ＩＩを生成する。ＬＮＴ－ＩＩは、エクスポータータンパク質２０を介して細胞から排出される。ＬＮＴ－ＩＩは、ＬＮＴ又はＬＮｎＴの前駆体であるため、ＬＮＴ－ＩＩを排出するエクスポーターは、このオリゴ糖の前駆体を排出するエクスポータータンパク質に相当する。更に図１から明らかなように、前記細胞は、ＬＮＴ－ＩＩのガラクトシル化によりＬＮＴを細胞内に生成させることが可能なβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をもつタンパク質を含み、前記細胞は、及びそれに加えて／又はその代わりに、ＬＮＴ－ＩＩのガラクトシル化によりラクト－Ｎ－ネオテトラオースＬＮｎｔを細胞内に生成させることが可能なβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を含むことができる。その後、ＬＮＴ又は場合によりＬＮｎｔは、オリゴ糖エクスポーターにより細胞から細胞を培養する培地中に排出される。
エクスポーターは、膜結合型であり、その発現を過剰発現にすることができ、ＬＮＴ－ＩＩエクスポーターが過剰発現される場合には、ＬＮＴ－ＩＩ排出の増加とＬＮＴ排出の低下をもたらし、ＬＮＴ－ＩＩを排出するエクスポータータンパク質が欠失又は他の方法で不活性化される場合には、ＬＮＴ排出が改善される。ＬＮＴ－ＩＩエクスポーターは、内在性エクスポータータンパク質であることが好ましく、ＬＮＴエクスポータータンパク質は異種エクスポータータンパク質であることが好ましい。
実施例１
大腸菌ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ産生株の開発
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－２）産生株を構築した。特定遺伝子の夫々突然変異誘発及び欠失と、異種遺伝子のゲノム取り込みにより、代謝改変を行った。Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｕｔａｇａｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６７４２－６７４６（２００１）に記載されているようなミスマッチオリゴヌクレオチドを使用して、突然変異誘発により遺伝子ｌａｃＺ及びａｒａＡを不活性化させた。
大腸菌ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ産生株の開発
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用して、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－２）産生株を構築した。特定遺伝子の夫々突然変異誘発及び欠失と、異種遺伝子のゲノム取り込みにより、代謝改変を行った。Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｍｕｔａｇａｅｎｅｓｉｓ，ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６７４２－６７４６（２００１）に記載されているようなミスマッチオリゴヌクレオチドを使用して、突然変異誘発により遺伝子ｌａｃＺ及びａｒａＡを不活性化させた。
ＤａｔｓｅｎｋｏとＷａｒｎｅｒの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：６６４０－６６４５（２０００））に従って、ゲノム欠失を行った。Ｎ－アセチルグルコサミンの細胞内分解を防ぐために、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸デアセチラーゼ（ｎａｇＡ）とグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ（ｎａｇＢ）とをコードする遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムから欠失させた。更に、遺伝子ｗｚｘＣ－ｗｃａＪをも欠失させた。ＷｃａＪは、コラン酸合成の第１段階を触媒するＵＤＰ－グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース－１－リン酸トランスフェラーゼをコードする（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６，１７８：４８８５－４８９３）。更に、夫々Ｌ－フコースイソメラーゼ及びＬ－フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｅＩ及びｆｕｃＫをも欠失させた。
転移により、異種遺伝子のゲノム組み込みを行った。ＥＺ－Ｔｎ５（ＴＭ）トランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，米国）を使用して線状ＤＮＡフラグメントを組み込み、あるいはマリナートランスポザーゼの超活性Ｃ９突然変異体Ｈｉｍａｒ１（Ｌａｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９，ＵＳＡ ９６：１１４２８－１１４３３）を転移に利用した。ＥＺ－Ｔｎ５トランスポゾンを作製するために、プライマー１１１９及び１１２０（使用した全プライマーを下表３に示す）を使用してＦＲＴ部位を両端にもつ抗生物質耐性マーカーと共に目的の遺伝子を増幅し、ＥＺ－Ｔｎ５トランスポザーゼの１９ｂｐ Ｍｏｓａｉｃ Ｅｎｄ認識部位を両端にもつＰＣＲ産物を得た。Ｈｉｍａｒ１を使用した組み込みでは、同様にＦＲＴ部位を両端にもつ抗生物質耐性マーカーと共に目的のトランスポザーゼ発現構築物（オペロン）をｐＥｃｏｍａｒベクターにクローニングした。ｐＥｃｏｍａｒベクターはアラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢの制御下でマリナートランスポザーゼの超活性Ｃ９突然変異体Ｈｉｍａｒ１をコードする。ＥＺ－Ｔｎ５トランスポザーゼを使用することにより、発現フラグメント＜Ｐｔｅｔ－ｌａｃＹ－ＦＲＴ－ａａｄＡ－ＦＲＴ＞（配列番号１）を組み込んだ。大腸菌Ｋ１２ＴＧ１に由来するラクトースインポーターＬａｃＹ（アクセッション番号ＡＢＮ７２５８３）の遺伝子の組み込みに成功した後、プラスミドｐＣＰ２０上でコードされるＦＬＰリコンビナーゼにより、ストレプトマイシン耐性クローンから耐性遺伝子を除去した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｒｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００，ＵＳＡ ９７：６６４０－６６４５）。髄膜炎菌ＭＣ５８に由来するＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子ＩｇｔＡ（アクセッション番号ＮＰ＿２７４９２３）を大腸菌で発現できるようにコドン最適化させ、遺伝子合成により作製した。同様に遺伝子合成により得た大腸菌Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５に由来するガラクトース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｇａｌＴ（アクセッション番号ＮＰ＿４１５２７９）と共に、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ－ＩｇｔＡ－ｇａｌＴを使用してＩｇｔＡを転移により挿入した（配列番号２）。ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミンのデノボ合成を亢進させるために、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ（ｇｌｍＳ）、大腸菌Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５に由来するホスホグルコサミンムターゼ（ｇｌｍＭ）、及び大腸菌Ｋ－１２亜株ＭＧ１６５５に由来するＮ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｇｌｍＵ）（夫々アクセッション番号ＮＰ＿４１８１８５、ＮＰ＿４１７６４３、ＮＰ＿４１８１８６）をコードする遺伝子をコドン最適化させ、遺伝子合成により得た。オペロンｇｌｍＵＭを、構成的テトラサイクリンプロモーターＰｔｅｔの制御下にクローニングし、ｇｌｍＳは構成的ＰＴ５プロモーターの制御下にクローニングした。マリナー様エレメントＨｉｍａｒ１トランスポザーゼにより、特異的に認識される末端逆向き反復配列を両端にもつトランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ－ｇｌｍＵＭ－ＰＴ５－ｇｌｍＳ－ＦＲＴ－ｄｈｆｒ－ＦＲＴ＞（配列番号３）をｐＥｃｏｍａｒ－ｇｌｍＵＭ－ｇｌｍＳから挿入すると、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ産生株となることが分かった。更に、ＥＺ－Ｔｎ５トランスポザーゼを使用することにより、発現フラグメント＜Ｐｔｅｔ－ｌａｃＹ（６ＨＩＳ）－ＦＲＴ－ａａｄＡ－ＦＲＴ＞（配列番号４）を組み込んだ。
プライマー６０５及び６０６を使用してｇａｌオペロン（ｇａｌＥＴＫＭ）を大腸菌Ｋ１２ＴＧ１から増幅し（配列番号６）、ｒｅｄリコンビナーゼヘルパープラスミドｐＫＤ４６を使用することによって促進した相同組換えにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のｇａｌＭ ｙｂｈＪ遺伝子座に挿入した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｗａｒｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００，ＵＳＡ ９７：６６４０－６６４５）。異種遺伝子と遺伝子クラスターの配列を付表１として提出する。
実施例２
種々のβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７０７のバッチ培養
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株ＨＮ０６に由来するβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＰｍｎａｇＴ（アクセッション番号ＰＭＣＮ０６＿００２２）の遺伝子のコドン最適化及び合成を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）に委託した。配列及びライゲーション非依存性クローニングにより、プラスミドｐＥＴ－ＤＵＥＴ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）への遺伝子のクローニングを行った。クローニングに使用した全プライマーを下表３に示す。
種々のβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７０７のバッチ培養
Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株ＨＮ０６に由来するβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＰｍｎａｇＴ（アクセッション番号ＰＭＣＮ０６＿００２２）の遺伝子のコドン最適化及び合成を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）に委託した。配列及びライゲーション非依存性クローニングにより、プラスミドｐＥＴ－ＤＵＥＴ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）への遺伝子のクローニングを行った。クローニングに使用した全プライマーを下表３に示す。
β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするプラスミドｐＥＴ－ＰｍｎａｇＴを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７０７（下表２）に導入し、グルコース２％（ｗｔ／ｖｏｌ）とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加した無機塩培地（Ｓａｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，７２：３３－４７）で３０℃にて増殖させた。培養液のＯＤ６６０ｎｍが０．１になったら、０．３ｍＭＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導した。４時間インキュベーション後に、１．５ｍＭラクトースを添加した。振盪フラスコで３０℃にて更に２４時間インキュベーション後に、細胞を回収した。薄層クロマトグラフィーによりＬＮＴ－２が検出された。従って、ガラスビーズを使用して細胞を規定容量中で機械的に破砕した。その後、試料をＴＬＣ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）にアプライした。移動相はアセトン：ブタノール：酢酸：水（３５：３５：７：２３）から構成した。
ＴＬＣ分析の結果を図２に示す。遺伝子ＰｍｎａｇＴが過剰発現されたときに、三糖標準ＬＮＴ－ＩＩと同一の泳動速度を示す化合物の形成を確認することができた。ＬＮＴ－ＩＩ産生株７２４を対照（１９）とした。ラクトース（１）とＬＮＴ－ＩＩ（２）の標準を示す。試料中のＬＮＴ－ＩＩ産物形成を星印で示す。
実施例３
同種糖排出トランスポーターを過剰発現する大腸菌ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ産生株の作製
大腸菌で産生されたオリゴ糖の排出は、発酵工程中の制限因子となることが分かっている。一方、２’－フコシルラクトースやＬＮＴ－２等の三糖類は、ある程度まで培養上清中に転移するため、活動中の糖排出トランスポーターをコードしている可能性が高い。ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ；ＧｌｕＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）の流出を改善するために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株１３２６（下表２）を糖排出トランスポーター（ＳＥＴ）のライブラリーのスクリーニングに使用した。大腸菌に由来する推定ＳＥＴタンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡから増幅し、配列及びライゲーション非依存性クローニングによりベクターｐＩＮＴに組み込んだ。遺伝子ｙｊｈＢを代表例として使用し、プライマー２５６７、２５６８、２５２６及び２４４３を使用してプラスミドｐＩＮＴ－ｙｊｈＢを作製した。クローニングに使用したプライマー配列を下表３に示す。
同種糖排出トランスポーターを過剰発現する大腸菌ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ産生株の作製
大腸菌で産生されたオリゴ糖の排出は、発酵工程中の制限因子となることが分かっている。一方、２’－フコシルラクトースやＬＮＴ－２等の三糖類は、ある程度まで培養上清中に転移するため、活動中の糖排出トランスポーターをコードしている可能性が高い。ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ；ＧｌｕＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ）の流出を改善するために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株１３２６（下表２）を糖排出トランスポーター（ＳＥＴ）のライブラリーのスクリーニングに使用した。大腸菌に由来する推定ＳＥＴタンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡから増幅し、配列及びライゲーション非依存性クローニングによりベクターｐＩＮＴに組み込んだ。遺伝子ｙｊｈＢを代表例として使用し、プライマー２５６７、２５６８、２５２６及び２４４３を使用してプラスミドｐＩＮＴ－ｙｊｈＢを作製した。クローニングに使用したプライマー配列を下表３に示す。
２０種類の異なる大腸菌トランスポーターをコードするプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）１３２６に導入し、グルコース２％（ｗｔ／ｖｏｌ）、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びゼオシン４０μｇ／ｍｌを添加した無機塩培地（Ｓａｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，７２：３３－４７）で３０℃にて増殖させた。培養液のＯＤ６６０ｎｍが０．１になったら、アンヒドロテトラサイクリン２００ｎｇ／ｍｌを添加して遺伝子の遺伝子発現を誘導した。４時間インキュベーション後に、２．５ｍＭラクトースを添加した。振盪フラスコで３０℃にて更に２４時間及び４８時間インキュベーション後に、上清中のＬＮＴ－ＩＩ濃度をＬＣ－ＭＳにより測定した。
ＬＣ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳ検出システムを使用して、特徴的なフラグメントイオン検出により質量分析を行った。前駆イオンを選択し、四重極１で分析し、ＣＩＤガスとして窒素を使用してコリジョンセル内で断片化させ、四重極３でフラグメントイオンの選択を行う。
ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ（Ｇａｌ（β１－３）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ））、ＬＮＴ－ＩＩ及びマルトトリオース（定量の内部標準）をＥＳＩ正イオン化モードで分析した。ＬＮＴは、ｍ／ｚ７０８．３［Ｍ＋Ｈ＋］のイオンを形成し、ＬＮＴ－ＩＩはｍ／ｚ５４６．１［Ｍ＋Ｈ＋］のイオンを形成し、マルトトリオースはｍ／ｚ５２２．０［Ｍ＋ＮＨ４
＋］のイオンを形成する。この糖質［ｍ／ｚ５０４．０］は、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）と付加イオンを形成するため、＋１８の質量シフトを生じる。このため、マルトトリオースには、ｍ／ｚ５２２．０の前駆イオンを選択した。前駆イオンを更にコリジョンセル内で特徴的フラグメントイオンｍ／ｚ４８７．１、ｍ／ｚ３２５．０及びｍ／ｚ１６３．２に断片化させた。ＬＮＴの分子イオン（ｍ／ｚ７０８．３）をｍ／ｚ５４６．３、ｍ／ｚ５２８．３、ｍ／ｚ３６６．２及びｍ／ｚ２０４．０に断片化させた。ＬＮＴ－ＩＩ（ｍ／ｚ５４６．１）をｍ／ｚ２０４．２、１８６．０、１３８．０及び１２６．０に断片化させた（方法の説明参照）。
Ｌｕｎａ ＮＨ２ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，ドイツ）でＬＮＴとＬＮＴ－ＩＩのクロマトグラフィー分離を行った。イオン化の間にＬＮＴの部分的断片化によりＬＮＴ－ＩＩシグナルが発生し、個々の糖質の定量結果に影響を与えるため、この操作が必要であった。
培養上清中にＬＮＴ－２の量の増加が認められたのは、遺伝子ｙｊｈＢを発現する株のみであった（下表１参照）。
実施例４
種々のβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４のバッチ発酵
β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子として、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ ＮＪ８７００に由来するＩｅｘ１（アクセッション番号ＹＰ＿００３００８６４７）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株ＨＮ０６に由来するＰｍｇａｌＴ７（アクセッション番号ＰＭＣＮ０６＿００２１）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ ＤＳＭ１４６７５に由来するＭｓｇａｌＴ８（アクセッション番号ＭＹＳＴＩ＿０４３４６）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ３３３９４に由来するＫｄｇａｌＴ１０（アクセッション番号ＨＭＰＲＥＦ９０９８＿２４０７）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｍ１４０４に由来するｇａｔＤ（アクセッション番号ＧＱ４４４３３１）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｉｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ９３４３に由来するＢｆｇａｌＴ２（アクセッション番号ＢＦ９３４３＿０５８５）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａに由来するＩｓｇＤ（アクセッション番号ＡＡＡ２４９８１）及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに由来するＨｐｇａｌＴ（アクセッション番号ＡＢ０３５９７１）のコドン最適化及び合成を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）に委託した。配列及びライゲーション非依存性クローニングにより遺伝子のクローニングを行った（Ｌｉ ａｎｄ Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７ Ｍａｒ；４（３）：２５１－６．）。従って、アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にｍａｌＥ遺伝子を導入したプラスミドｐＩＮＴを使用し、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子とｍａｌＥとのＮ末端融合体を作製した。Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ ＪＧ１０－０８に由来する遺伝子ｗａａＸ（アクセッション番号ＥＣＡ０１５４）をコードするβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼを単独でプラスミドｐＡＣＹＣ－Ｄｕｅｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）にクローニングした。クローニングに使用した全プライマーを下表３に示す。
種々のβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４のバッチ発酵
β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子として、Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ ＮＪ８７００に由来するＩｅｘ１（アクセッション番号ＹＰ＿００３００８６４７）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ株ＨＮ０６に由来するＰｍｇａｌＴ７（アクセッション番号ＰＭＣＮ０６＿００２１）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ ＤＳＭ１４６７５に由来するＭｓｇａｌＴ８（アクセッション番号ＭＹＳＴＩ＿０４３４６）、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＡＴＣＣ ３３３９４に由来するＫｄｇａｌＴ１０（アクセッション番号ＨＭＰＲＥＦ９０９８＿２４０７）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｍ１４０４に由来するｇａｔＤ（アクセッション番号ＧＱ４４４３３１）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｉｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＮＣＴＣ９３４３に由来するＢｆｇａｌＴ２（アクセッション番号ＢＦ９３４３＿０５８５）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａに由来するＩｓｇＤ（アクセッション番号ＡＡＡ２４９８１）及びＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに由来するＨｐｇａｌＴ（アクセッション番号ＡＢ０３５９７１）のコドン最適化及び合成を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）に委託した。配列及びライゲーション非依存性クローニングにより遺伝子のクローニングを行った（Ｌｉ ａｎｄ Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７ Ｍａｒ；４（３）：２５１－６．）。従って、アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下にｍａｌＥ遺伝子を導入したプラスミドｐＩＮＴを使用し、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子とｍａｌＥとのＮ末端融合体を作製した。Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ ＪＧ１０－０８に由来する遺伝子ｗａａＸ（アクセッション番号ＥＣＡ０１５４）をコードするβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼを単独でプラスミドｐＡＣＹＣ－Ｄｕｅｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）にクローニングした。クローニングに使用した全プライマーを下表３に示す。
プラスミドｐＣＤＦ－ｇａｌＥと、ｍａｌＥ及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの融合遺伝子をコードするプラスミドとを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４（下表２）に導入し、グルコース２％（ｗｔ／ｖｏｌ）、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びゼオシン４０μｇ／ｍｌを添加した無機塩培地（Ｓａｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，７２：３３－４７）で３０℃にて増殖させた。培養液のＯＤ６６０ｎｍが０．１になったら、０．３ｍＭＩＰＴＧ及び２００ｎｇ／ｍｌアンヒドロテトラサイクリンを添加して、ｇａｌＥ遺伝子及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子発現を誘導した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）５３４（下表２）にプラスミドｐＥＴ－ＩｇｔＡ、ｐＣＯＬＡ－ｇｌｍＵＭ－ｇｌｍＳ、ｐＣＤＦ－ｇａｌＴ－ｇａｌＥ及びｐＡＣＹＣ－ｗａａＸを導入し、グルコース２％（ｗｔ／ｖｏｌ）、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン３０μｇ／ｍｌを添加した無機塩培地で３０℃にて増殖させた。培養液のＯＤ６６０ｎｍが０．１になったら、０．３ｍＭＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導した。遺伝子発現の誘導から４時間後に、２ｍＭラクトースを添加した。振盪フラスコで３０℃にて更に４８時間インキュベーション後に細胞を回収し、機械的に破砕した。ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ（Ｇａｌ（β１－４）ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｃ））が薄層クロマトグラフィーにより検出された。従って、ガラスビーズを使用して細胞を機械的に破砕した。その後、試料をＴＬＣ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）にアプライした。移動相はアセトン：ブタノール：酢酸：水（３５：３５：７：２３）から構成した。
ＴＬＣ分析の結果を図３～５に示す。図３はβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＢｆｇａｌＴ２（１）、ＰｍｇａｌＴ７（３）、ＭｓｇａｌＴ８（６）、ｇａｔＤ（７）、Ｉｅｘ１（９）、ＩｇｔＢ（１１）又はＩｓｇＤ（１３）を過剰発現するラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）産生大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養抽出液のＴＬＣ分析を示す。ラクトース（１５）、ＬＮＴ－ＩＩ（１６）及びＬＮｎＴ（１７）の標準を示す。試料中のＬＮｎＴ産物形成を星印で示す。
図４は、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＫｄｇａｌＴ１０（１）、ｃｐｓｌ１４Ｊ（７）、ｃｐｓｌａＪ（８、９）、ＨｐｇａｌＴ（１２）を過剰発現するラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）産生大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養抽出液のＴＬＣ分析を示す。ラクトース（３、１５）、ＬＮＴ－ＩＩ（４、１６）及びＬＮｎＴ（５、１７）の標準を示す。試料中のＬＮｎＴ産物形成を星印で示す。
図５は、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｗａａＸ（５）を過剰発現するラクト－Ｎ－テトラオース産生大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養抽出液のＴＬＣ分析を示す。ラクトース（１）、ＬＮＴ－ＩＩ及びＬＮｎＴ（２）の標準を示す。本図も試料中のＬＮｎＴ産物形成を星印で示す。
以下の遺伝子Ｉｅｘ１、ＰｍｇａｌＴ７、ＭｓｇａｌＴ８、ＢｆｇａｌＴ２、ｇａｔＤ、ＩｓｇＤ、ＫｄｇａｌＴ１０、ＨｐｇａｌＴ、ｗａｘが過剰発現されたときに、四糖標準ＬＮｎＴと同一の泳動速度を示す化合物の形成を確認することができた。
ＬＮｎＴを産生することが文献（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２ Ｆｅｂ；１３１（２）：１８３－９１；Ｋｏｌｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６ Ｊｕｌ；１７８（１３）：３７３６－４１）から分かっているβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼｃｐｓｌａＪ及びｃｐｓｌ１４Ｊも活性スクリーニングに加え、陽性対照とした。上記発現システムを使用した処、ＣｐｓｌａＪ及びＣｐｓｌ１４ＪによるＬＮｎＴの形成を確認することができた（図３）。試験した３０種類の遺伝子のうち、合計１１種類がＬＮＴ－ＩＩとＵＤＰ－ガラクトースからＬＮｎＴを産生することが確認された。
実施例５
種々のβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）５３４のバッチ培養
大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５αのゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、プライマー１１６３及び１１６２を使用してｇａｌＥを増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、同一酵素で切断しておいたベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）の第２のマルチクローニングサイトにライゲーションした。ＧａｌＥはＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターから発現される。大腸菌Ｋ１２遺伝子ｇａｌＴをゲノムＤＮＡから増幅し、プライマー９９１～９９４を使用して配列及びライゲーション非依存性クローニングによりプラスミドｐＣＤＦ－ｇａｌＥに組み込み、プラスミドｐＣＤＦ－ｇａｌＴ－ｇａｌＥを作製した。
種々のβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをスクリーニングする大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）５３４のバッチ培養
大腸菌Ｋ１２ ＤＨ５αのゲノムＤＮＡを鋳型として使用し、プライマー１１６３及び１１６２を使用してｇａｌＥを増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、同一酵素で切断しておいたベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）の第２のマルチクローニングサイトにライゲーションした。ＧａｌＥはＩＰＴＧ誘導性Ｔ７プロモーターから発現される。大腸菌Ｋ１２遺伝子ｇａｌＴをゲノムＤＮＡから増幅し、プライマー９９１～９９４を使用して配列及びライゲーション非依存性クローニングによりプラスミドｐＣＤＦ－ｇａｌＥに組み込み、プラスミドｐＣＤＦ－ｇａｌＴ－ｇａｌＥを作製した。
ＩｇｔＡのコドン最適化遺伝子を鋳型として使用し、プライマー６８８及び６８９を使用して増幅を行った。ＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＡａｔＩＩで消化し、同一酵素で切断しておいたベクターｐＥＴＤｕｅｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）のマルチクローニングサイトにライゲーションし、プラスミドｐＥＴ－ＩｇｔＡを作製した。
プライマー８４８～８５１を使用して配列及びライゲーション非依存性クローニングによりｇｌｍＵＭのコドン最適化遺伝子構築物をプラスミドｐＣＯＬＡ－Ｄｕｅｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）にクローニングした。プライマー８５２及び８５３を使用してｇｌｍＳのコドン最適化形態を増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ及びＡａｔＩＩで消化し、同一酵素で切断しておいたベクターｐＣＯＬＡ－ｇｌｍＵＭの第２のマルチクローニングサイトにライゲーションし、プラスミドｐＣＯＬＡ－ｇｌｍＵＭ－ｇｌｍＳを作製した。
β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの遺伝子として、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ．ｓａｌａｍａｅ ｓｅｒｏｖａｒ Ｇｒｅｅｎｓｉｄｅに由来するｗｂｄＯ（アクセッション番号ＡＹ７３０５９４）と、Ｌｕｔｉｅｌｌａ ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ ２００２に由来するｆｕｒＡ（ＦｕｒａＤＲＡＦＴ＿０４１９）もＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）にコドン最適化と合成を委託した。配列及びライゲーション非依存性クローニングによりプラスミドｐＡＣＹＣ－Ｄｕｅｔ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）に遺伝子をクローニングした。クローニングに使用した全プライマーを下表３に示す。
プラスミドｐＥＴ－ＩｇｔＡ、ｐＣＯＬＡ－ｇｌｍＵＭ－ｇｌｍＳ、ｐＣＤＦ－ｇａｌＴ－ｇａｌＥ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするプラスミドｐＡＣＹＣ－ｆｕｒＡ又はｐＡＣＹＣ－ｗｂｄＯを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）５３４に導入し、グルコース２％（ｗ／ｖ）、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ及びカナマイシン３０μｇ／ｍｌを添加した無機塩培地（Ｓａｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，７２：３３－４７）で３０℃にて増殖させた。培養液のＯＤ６６０ｎｍが０．１になったら、０．３ｍＭＩＰＴＧを添加して遺伝子発現を誘導した。４時間インキュベーション後に２ｍＭラクトースを添加した。振盪フラスコで３０℃にて更に４８時間インキュベーション後に細胞を回収した。薄層クロマトグラフィーによりＬＮＴが検出された。従って、ガラスビーズを使用して細胞を機械的に破砕した。その後、試料をＴＬＣ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）にアプライした。移動相はアセトン：ブタノール：酢酸：水（３５：３５：７：２３）から構成した。
ＴＬＣ分析の結果を図６に示し、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｗｂｄＯ又はｆｕｒＡを過剰発現するラクト－Ｎ－テトラオース産生大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養抽出液のＴＬＣ分析を示す。試料中のＬＮＴ産物形成は顕著である。試験した１２種類の推定β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼのうちで、遺伝子ｗｂｄＯ及びｆｕｒＡが過剰発現されたときに、四糖標準ＬＮＴと同一の泳動速度を示す化合物の形成を確認することができた。
実施例６
改良型プラスミドフリー大腸菌ラクト－Ｎ－テトラオース産生株の開発
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４株を使用し、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）産生株を構築した。ｐＥｃｏｍａｒ－ｗｂｄＯ－ｇａｌＥから挿入したマリナー様エレメントＨｉｍａｒ１トランスポザーゼにより特異的に認識される末端逆向き反復配列を両端にもつトランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ－ｗｂｄＯ－ＰＴ５－ｇａｌＥ－ＦＲＴ－ｃａｔ－ＦＲＴ＞（配列番号５）のゲノム組み込みにより代謝改変を行った。得られた１３５３株を更に代謝改変させ、細胞内ＬＮＴ－ＩＩプールの増加を示し、ＬＮＴの産生を増加させるようにした。従って、メジャーファシリテータースーパーファミリートランスポーターｙｊｈＢ（アクセッション番号ＹＰ＿００３００１８２４）を大腸菌株のゲノムから欠失させ、１４３１株を作製した（下表２）。
改良型プラスミドフリー大腸菌ラクト－Ｎ－テトラオース産生株の開発
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）７２４株を使用し、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）産生株を構築した。ｐＥｃｏｍａｒ－ｗｂｄＯ－ｇａｌＥから挿入したマリナー様エレメントＨｉｍａｒ１トランスポザーゼにより特異的に認識される末端逆向き反復配列を両端にもつトランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ－ｗｂｄＯ－ＰＴ５－ｇａｌＥ－ＦＲＴ－ｃａｔ－ＦＲＴ＞（配列番号５）のゲノム組み込みにより代謝改変を行った。得られた１３５３株を更に代謝改変させ、細胞内ＬＮＴ－ＩＩプールの増加を示し、ＬＮＴの産生を増加させるようにした。従って、メジャーファシリテータースーパーファミリートランスポーターｙｊｈＢ（アクセッション番号ＹＰ＿００３００１８２４）を大腸菌株のゲノムから欠失させ、１４３１株を作製した（下表２）。
２％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコースを単一炭素及びエネルギー源として添加した無機塩培地（Ｓａｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，７２：３３－４７）で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株１３５３及び１４３１のバッチ培養を３０℃にて４８時間行った。培養液のＯＤ６６０ｎｍが０．５になったら、２．５ｍＭラクトースを添加した。培養上清中のＬＮＴ－ＩＩとＬＮＴの存在を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出した。
屈折率検出器（ＲＩＤ－１０Ａ）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｄｕｉｓｂｕｒｇ，ドイツ）とＲｅｐｒｏＳｉｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ，５μｍ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＧｍｂＨ，ドイツ）をＨＰＬＣシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｄｕｉｓｂｕｒｇ，ドイツ）に接続してＨＰＬＣによる分析を行った。アセトニトリル：Ｈ２Ｏ（６８／３２（ｖ／ｖ））を溶離液として３５℃で流速１．４ｍｌ／ｍｉｎにてアイソクラティック溶離を行った。試料４０μｌをカラムにアプライした。試料を濾過し（０．２２μｍ細孔寸法）、イオン交換マトリックス（Ｓｔｒａｔａ ＡＢＷ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，ドイツ）で固相抽出により清澄化処理した。
ＨＰＬＣ分析の結果を図７に示し、ラクト－Ｎ－テトラオース産生大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養上清のＨＰＬＣ分析を示す。（Ａ）グルコースとラクトースの存在下で増殖させた２４時間インキュベーション後の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）１３５３（黒グラフ）及び１４３１（ピンクグラフ）の上清。（Ｂ）グルコースとラクトースの存在下で増殖させた４８時間インキュベーション後の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）１３５３（青色グラフ）及び１４３１（茶色グラフ）の上清。ＨＰＬＣ分析から明らかなように、ＬＮＴ産生株からｙｊｈＢを欠失させた結果、培養上清中のＬＮＴの蓄積が増加した。
実施例７
糖排出トランスポーターを過剰発現する大腸菌ラクト－Ｎ－テトラオース産生株の作製
産生株では培地へのラクト－Ｎ－テトラオースの排出が少量しかないので、糖排出トランスポーターライブラリーのスクリーニングを行った。実施例３に準じて推定ＳＥＴタンパク質を大腸菌ゲノムＤＮＡから増幅させるか、又はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）にコドン最適化及び合成を委託した。増幅後、配列及びライゲーション非依存性クローニングにより、遺伝子をベクターｐＩＮＴに組み込んだ。大腸菌遺伝子のクローニング用のプライマーは実施例３に準じた。標準化ヌクレオチドオーバーハングを使用して合成遺伝子を合成し、同様にプライマー２５２７、２４４４、２５２６及び２４４３を使用して発現ベクターに組込んだ。クローニングに使用したプライマー配列を下表３に示す。
糖排出トランスポーターを過剰発現する大腸菌ラクト－Ｎ－テトラオース産生株の作製
産生株では培地へのラクト－Ｎ－テトラオースの排出が少量しかないので、糖排出トランスポーターライブラリーのスクリーニングを行った。実施例３に準じて推定ＳＥＴタンパク質を大腸菌ゲノムＤＮＡから増幅させるか、又はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，米国）にコドン最適化及び合成を委託した。増幅後、配列及びライゲーション非依存性クローニングにより、遺伝子をベクターｐＩＮＴに組み込んだ。大腸菌遺伝子のクローニング用のプライマーは実施例３に準じた。標準化ヌクレオチドオーバーハングを使用して合成遺伝子を合成し、同様にプライマー２５２７、２４４４、２５２６及び２４４３を使用して発現ベクターに組込んだ。クローニングに使用したプライマー配列を下表３に示す。
６６種類の異なるトランスポーターをコードするプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）１３５３（下表２）に導入し、グルコース３％（ｗ／ｖ）、ＮＨ４ＣＩ２ ５ｇ／ｌ、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びカナマイシン１５μｇ／ｍｌを添加した無機塩培地（Ｓａｍａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，７２：３３－４７）で３０℃にて増殖させた。合計容量２００μｌを加えた９６ウェルプレートで、前培養を行った。３０℃で連続振盪下にて２４時間インキュベーションした後に、アンヒドロテトラサイクリン２００ｎｇ／ｍｌとラクトース１０ｍＭを更に添加した合計容量４００μｌの無機塩培地を加えた９６ウェルディープウェルプレートにウェル当たり５０μｌを移した。２４～４８時間インキュベーションを持続後に上清中のＬＮＴ濃度をＬＣ－ＭＳにより測定した。実施例３に記載したように質量分析を行った。
図８は、糖排出トランスポーターを過剰発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の上清中のラクト－Ｎ－テトラオースの濃度を対照株１３５３と比較した相対濃度を示す。１３５３株のＬＮＴ濃度を、１００％に設定した。図８に示すように、６６種類の遺伝子のうちの１１種類で過剰発現が生じた結果、ＬＮＴ産生が倍加した。これらのうちで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムでコードされるタンパク質もＬＮＴ排出を強化することが分かった（ＴＰ３７、ｙｅｂＱ、アクセッション番号ＮＣ＿０１２９７１）。ＹｅｂＱは、多剤排出に関与すると推定される推定ＭＦＳトランスポーターであり、１３５３株の発酵中にＬＮＴの観測基底流出をもたらす主要なトランスポータータンパク質であると思われる。
更に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのｓｐｏＶＢ（ＴＰ１，アクセッション番号ＡＦＪ６０１５４）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｙｒｉｌｆｏｌｉａｅのｙａｂＭ（ＴＰ２，アクセッション番号ＣＡＹ７３１３８）、大腸菌ＭＧ１６５５のｂｃｒ（ＴＰ１８，アクセッション番号ＡＡＣ７５２４３）、大腸菌ＭＧ１６５５のｙｄｅＡ（ＴＰ２０，アクセッション番号ＡＡＣ７４６０１）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｐｒｏＰ２（ＴＰ５４，アクセッション番号ＥＧＣ７２１０７）、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍのｓｅｔＡ（ＴＰ５５，アクセッション番号ＺＰ＿０３８２９９０９）、大腸菌ＭＧ１６５５のｆｕｃＰ（ＴＰ５９，アクセッション番号ＡＩＺ９０１６２）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｂｍｂ９３９３のｍｄｅＡ（ＴＰ６１，アクセッション番号ＳＡＢＢ＿０１２６１）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓのＩｍｒＡ（ＴＰ６２，アクセッション番号Ｌ１１６５３２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＭＴ－１のｓｅｔＡ（ＴＰ７２，アクセッション番号ＢＡＰ７８８４９）及びＢｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ Ｄ１－５のｓｅｔＡ（ＴＰ７３，アクセッション番号ＫＧＱ１３３９８）の各遺伝子により、コードされるエクスポーターが大腸菌産生株１３５３で過剰発現されるときにＬＮＴ産生が増加した。
実施例８
異種糖排出トランスポーターの過剰発現による大腸菌ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ産生株の作製
実施例６に記載したＬＮＴエクスポータースクリーニングでは、興味深いことに、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅに由来するＴＰ１１（ｐｒｏＰ，アクセッション番号ＡＡＵ３７７８５）及びＣｅｄｅｃｅａ ｎｅｔｅｒｉ Ｍ００６に由来するＴＰ７０（ｓｅｔＡ，アクセッション番号ＷＰ＿０３９２９０２５３）の２種類のタンパク質の過剰発現の結果、ＬＮＴ－ＩＩの産生が著しく増加し、従って、ＬＮＴ産生が低下することが判明した（データは示さず）。この結果を、実施例３に記載したような実験構成で確認した。糖排出トランスポーターＹｊｈＢの過剰発現を陽性対照とした。ＴＰ１１とＴＰ７０の過剰発現の結果、ＬＮＴ－ＩＩ産生は約４倍となり、若干ではあるが、ＹｊｈＢよりも増加した。図９は糖排出トランスポーターＴＰ１１（２）、ＹｊｈＢ（３）又はＴＰ７０（４）を過剰発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の上清中のラクト－Ｎ－トリオースＩＩの濃度を示すグラフである。空の対照プラスミドを導入した１３２６株を対照（１）とした。こうして、ＬＮＴ－ＩＩを排出の標的とし、その過剰発現がＬＮＴ－ＩＩ産生株を作製するのに有用であると思われる３種類の糖排出トランスポーターが同定された。
異種糖排出トランスポーターの過剰発現による大腸菌ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ産生株の作製
実施例６に記載したＬＮＴエクスポータースクリーニングでは、興味深いことに、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ ＭＢＥＬ５５Ｅに由来するＴＰ１１（ｐｒｏＰ，アクセッション番号ＡＡＵ３７７８５）及びＣｅｄｅｃｅａ ｎｅｔｅｒｉ Ｍ００６に由来するＴＰ７０（ｓｅｔＡ，アクセッション番号ＷＰ＿０３９２９０２５３）の２種類のタンパク質の過剰発現の結果、ＬＮＴ－ＩＩの産生が著しく増加し、従って、ＬＮＴ産生が低下することが判明した（データは示さず）。この結果を、実施例３に記載したような実験構成で確認した。糖排出トランスポーターＹｊｈＢの過剰発現を陽性対照とした。ＴＰ１１とＴＰ７０の過剰発現の結果、ＬＮＴ－ＩＩ産生は約４倍となり、若干ではあるが、ＹｊｈＢよりも増加した。図９は糖排出トランスポーターＴＰ１１（２）、ＹｊｈＢ（３）又はＴＰ７０（４）を過剰発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の上清中のラクト－Ｎ－トリオースＩＩの濃度を示すグラフである。空の対照プラスミドを導入した１３２６株を対照（１）とした。こうして、ＬＮＴ－ＩＩを排出の標的とし、その過剰発現がＬＮＴ－ＩＩ産生株を作製するのに有用であると思われる３種類の糖排出トランスポーターが同定された。
Claims (20)
- 遺伝子的に改変された微生物宿主細胞による所望のオリゴ糖の生産方法であって、前記所望のオリゴ糖が、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ；ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）をコア三糖として含むヒトミルクオリゴ糖であり、
－遺伝子的に改変された微生物宿主細胞を準備する工程と、
－前記遺伝子的に改変された微生物宿主細胞は、少なくとも２種の組換え型グリコシルトランスフェラーゼを含み、前記グリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含み、
－前記遺伝子的に改変された微生物宿主細胞は、少なくとも１種の内在性糖排出タンパク質の発現又は活性が、遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して低下もしくは不活性化され、遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して培地への前記所望のオリゴ糖の前駆体の排出が低下もしくは停止するように、前記糖排出タンパク質の発現又は活性が改変されており、前記前駆体は、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩであり、
－前記所望のオリゴ糖の生産に許容される条件下で、前記宿主細胞を培地で培養し、前記所望のオリゴ糖を前記培地中に輸送させる工程と、
－前記培地から前記所望のオリゴ糖を取得する工程と
を含む、方法。 - 前記オリゴ糖が、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキソースＩ、ラクト－Ｎ－ジフコシルヘキサオースＩＩ、ラクト－Ｎ－シアリルペンタオースＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃ、ジシアリルラクト－Ｎ－テトラオース、ジシアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオースから構成される群から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、
－前記培地への所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする少なくとも１種の同種もしくは異種核酸配列をさらに含み、前記同種もしくは異種核酸配列の発現が過剰発現となるように、前記宿主細胞が改変されており；及び／又は
－前記所望のオリゴ糖の前駆体を前記宿主細胞の外側に排出するエクスポータータンパク質をコードする少なくとも１種の内在性核酸配列の欠失、破壊、機能低下もしくは不活性をさらに含み；及び／又は
－前記宿主細胞への所望のオリゴ糖の前駆体の取り込みに介在するタンパク質をコードする少なくとも１種の同種もしくは異種配列の過剰発現をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。 - 所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質が、二次性能動輸送体のクラスに属する、請求項３に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質が、少なくとも３部分、好ましくはラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ；ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）をコア三糖として含むオリゴ糖の排出を行う、請求項３又は４に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも１種の核酸配列が、内在性核酸又は組換え型核酸である、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記核酸配列が、細菌、古細菌、植物、酵母又は動物に由来する請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所望のオリゴ糖がラクト－Ｎ－テトラオースであり、前記前駆体がラクト－Ｎ－トリオースＩＩであり、前記宿主細胞はラクト－Ｎ－トリオースＩＩを前記宿主細胞の外側に排出することが可能なエクスポータータンパク質をコードする少なくとも１種の核酸配列を欠失、破壊又は不活性化されており、好ましくはラクト－Ｎ－テトラオースの排出を可能にする前記タンパク質が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に由来するＹｅｂＱ、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のＳｐｏＶＢ、エルウィニア・ピリフォリア（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｙｒｉｌｆｏｌｉａ）のＹａｂＭ、大腸菌ＭＧ１６５５のＢｃｒ、大腸菌ＭＧ１６５５のＹｄｅＡ、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＰｒｏＰ２、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）のＳｅｔＡ、大腸菌ＭＧ１６５５のＦｕｃＰ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｂｍｂ９３９３のＭｄｅＡ、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）のＩｍｒＡ、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＴ－１のＳｅｔＡ及びボーベリア・バシアーナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）Ｄ１－５のＳｅｔＡから選択される、請求項３～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組換え型グリコシルトランスフェラーゼが、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）のＬｇｔＡ又はパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）のＰｍｎａｇＴのクラス又はその変異体に属する、請求項９に記載の方法。
- 前記β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼが、ラクト－Ｎ－テトラオースを生成するβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼであり、ＷｂｄＯ又はその機能的変異体である、請求項１０に記載の方法。
- 前記遺伝子的に改変された宿主細胞において、内在性β－ガラクトシダーゼ遺伝子及びグルコサミン－６－リン酸デアミナーゼ遺伝子が、不活性化又は欠失しており、前記遺伝子的に改変された宿主細胞が、機能的ラクトースパーミアーゼタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子的に改変された宿主細胞は、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン産生能と、ＵＤＰ－ガラクトース又はＧＤＰ－フコース又はＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸産生能が遺伝子的に改変されていない宿主細胞に比較して増加しており、好ましくは、前記ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン産生能とＵＤＰ－ガラクトース産生能の増加が、Ｌ－グルタミン：Ｄ－フルクトース－６－リン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン－１－リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ホスホグルコサミンムターゼ、ＵＤＰ－ガラクトース－４－エピメラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの活性を含むタンパク質をコードする１種以上の遺伝子の過剰発現を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- グルコース、スクロース、グリセロール又はその組み合わせの存在下で、且つＮ－アセチルグルコサミンもしくはガラクトース、又はその組み合わせの不添加下又は非存在下に、前記遺伝子的に改変された宿主細胞を培養する、請求項１２又は１３に記載の方法。
- 所望のオリゴ糖の生産のための遺伝子的に改変された微生物宿主細胞であって、前記オリゴ糖が、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ；ＧｌｃＮＡｃ（β１－３）Ｇａｌ（β１－４）Ｇｌｕｃ）をコア三糖として含み、前記宿主細胞が、
－少なくとも２種の組換え型グリコシルトランスフェラーゼを含み、前記グリコシルトランスフェラーゼが、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含み、
－少なくとも１種の内在性糖輸送タンパク質の発現又は活性が、前記所望のオリゴ糖の前駆体の排出に関して機能的に不活性化されるように前記内在性糖輸送タンパク質の発現又は活性が改変されており、前記前駆体が、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩである、
前記微生物宿主細胞。 - グリコシルトランスフェラーゼとして、（ｉ）発現された異種β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼと、（ｉｉ）発現された異種β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼを含む、請求項１５に記載の微生物宿主細胞。
- －前記宿主細胞を培養する培地への前記オリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする少なくとも１種の同種もしくは異種核酸配列をさらに含み、前記所望のオリゴ糖の排出を可能にする前記タンパク質は、二次性能動輸送体のクラスに属し、所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記同種もしくは異種核酸配列は、過剰発現されているか、もしくは前記核酸配列の過剰発現を可能にするプロモーター配列の制御下にあり；及び／又は
－前記所望のオリゴ糖の前駆体を前記宿主細胞の外側に排出するエクスポータータンパク質をコードする少なくとも１種の内在性核酸配列の欠失、破壊、機能低下もしくは不活性化をさらに含み；及び／又は
－前記宿主細胞への所望のオリゴ糖の前駆体の取り込みに介在するタンパク質をコードする少なくとも１種の同種又は異種核酸配列の過剰発現をさらに含む、
請求項１５又は１６に記載の微生物宿主細胞。 - 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記核酸配列が、細菌、古細菌、植物、酵母又は動物に由来する、請求項１７に記載の微生物宿主細胞。
- 所望のオリゴ糖の排出を可能にするタンパク質をコードする前記少なくとも１種の核酸配列が、内在性又は組換え型核酸配列である、請求項１７又は１８に記載の微生物宿主細胞。
- 前記所望のオリゴ糖がラクト－Ｎ－テトラオースであり、前記前駆体がラクト－Ｎ－トリオースＩＩであり、前記宿主細胞はラクト－Ｎ－トリオースＩＩを前記宿主細胞の外側に排出することが可能なエクスポータータンパク質をコードする少なくとも１種の核酸配列を欠失、破壊又は不活性化されており、好ましくはラクト－Ｎ－テトラオースの排出を可能にする前記タンパク質が大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に由来するＹｅｂＱ、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のＳｐｏＶＢ、エルウィニア・ピリフォリア（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｙｒｉｌｆｏｌｉａ）のＹａｂＭ、大腸菌ＭＧ１６５５のＢｃｒ、大腸菌ＭＧ１６５５のＹｄｅＡ、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のＰｒｏＰ２、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）のＳｅｔＡ、大腸菌ＭＧ１６５５のＦｕｃＰ、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｂｍｂ９３９３のＭｄｅＡ、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）のＩｍｒＡ、シュードモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＭＴ－１のＳｅｔＡ及びボーベリア・バシアーナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）Ｄ１－５のＳｅｔＡから選択される、請求項１８又は１９に記載の微生物宿主細胞。
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