JP6610728B2 - センサーチップおよびこれを用いたｓｐｆｓ免疫蛍光測定システム - Google Patents

Description

本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法〔ＳＰＦＳ；Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ〕を用いて、同一検体について、心筋トロポニンＩと心筋トロポニンＩ自己抗体を測定可能なセンサーチップ、およびこれを用いたＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムに関する。

従来、心筋トロポニンＩは、ＡＣＳ（急性冠症候群）において、ＡＭＩ（急性心筋梗塞）かそれとも他の心疾患（狭心症など）であるかの判別をする際に有用なバイオマーカーであり、臨床の場でも活用されている。

トロポニンＩ（ＴｎＩ）は心筋、骨格筋でそのアミノ酸配列が異なり、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は高い心筋特異性を有しているため、アミノ酸配列の相違に基づいてｃＴｎＩを特異的に測定することは、心筋梗塞の診断等に有用である。トロポニンＩはここ数年、初期の心筋梗塞診断における高感度測定の有用性が数多く示されている。

しかし、一方で、ここ数年で心筋トロポニンＩ自己抗体の存在が、心筋トロポニンＩの測定結果に影響を与えていることが報告されており、先に述べた高感度にトロポニンＩを測定する場合には、その影響が特に深刻となる。心筋トロポニンＩ自己抗体が心筋トロポニンＩ抗原と結合し、抗原の定量に用いる心筋トロポニンＩ抗体と心筋トロポニンＩ抗原の反応を阻害することで、偽陰性となってしまうケースが生じるのである。

偽陰性となってしまうことから、検体中の心筋トロポニンＩ自己抗体の血中濃度をイムノアッセイにより測定し、所定の基準より高レベルの場合には心筋トロポニンＩの測定値の信頼性を欠くものと判断して、対象とする被験者が免疫療法等の候補であるか否かといった項目等の追加診断項目のカスケードを設ける心筋トロポニンの自己抗体アッセイ系が知られている（例えば、特許文献１参照）。

ここで、心筋トロポニンＩ自己抗体は、ウイルス、細菌もしくは毒素のような病原体の分子擬態、遺伝的異常、組織損傷または突発性疾患によって産生される。「心筋トロポニンＩ自己抗体」とは、自己の免疫細胞から産生され、自己の心筋トロポニンＩタンパク質に反応する抗体をいう。

ところで、特許文献１においては、心筋トロポニンＩと心筋トロポニンＩ自己抗体の測定が別々の方法で実施されており、検体自体も同一のロットではないことから、アッセイの迅速性、正確性および被験者（患者等）からのサンプル採取量の少量化（低侵襲性）の面で十分ではない。また、心筋トロポニンＩのカットオフ値における測定値の信頼性が求められている。

特表２０１０−５０８５１５号公報

本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであって、心筋トロポニンＩの検出をより迅速、かつ正確に、そして高感度に行い、被験者（患者等）からサンプル採取量の少量化（低侵襲性）の達成が可能なセンサーチップおよびこれを用いたＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムの提供をすることを課題とする。

上述した目的のうち、少なくとも一方を実現するために、本発明の一側面を反映したセンサーチップは、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定用のセンサーチップであって、
被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンＩと特異的に結合可能な第１の捕捉手段と、心筋トロポニンＩに対する自己抗体と結合可能な第２の捕捉手段とを備えている、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定用のセンサーチップである。
また、上述した目的のうち、もう一方を実現するために、本発明の一側面を反映したＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムは、上記センサーチップを有し、
心筋トロポニンＩの検出と、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出とを同一の検体に対して、並行して行う、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムである。

本発明によれば、心筋トロポニンＩの検出をより迅速かつ正確に、そして高感度に行い、被験者（患者等）からのサンプル採取量の少量化（低侵襲性）の達成が可能なセンサーチップおよびこれを用いたＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムの提供をすることができる。

図１は、本発明に係るセンサーチップを搭載したＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムを示す模式図である。 図２Ａは、図１のセンサーチップの上面図である。 図２Ｂは、別の本発明に係るセンサーチップの上面図である。 図３は、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムによる信頼性評価処理のフローチャートを示す図である。 図４は、心筋トロポニンＩが陽性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性の検体を図１のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムで免疫蛍光測定をしている状態を示す図である。 図５は、心筋トロポニンＩが陽性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陰性の検体を図１のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムで免疫蛍光測定をしている状態を示す図である。 図６は、心筋トロポニンＩが陰性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性の検体を図１のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムで免疫蛍光測定をしている状態を示す図である。 図７は、心筋トロポニンＩが陰性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陰性の検体を図１のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムで免疫蛍光測定をしている状態を示す図である。 図８は、心筋トロポニンＩが陽性で、心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性の検体を従来のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムで免疫蛍光測定をしている状態を示す図である。 図９は、心筋トロポニンＩが陰性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性の検体を従来のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムで免疫蛍光測定をしている状態を示す図である。

以下、本発明に係るセンサーチップ１０およびこれを用いたＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００について、図１〜図７を参照しながら説明する。
本発明に係るセンサーチップ１０は、被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンＩと特異的に結合可能な第１の捕捉手段１と、心筋トロポニンＩ自己抗体に結合する分子である第２の捕捉手段２と、心筋トロポニンＩまたはその部分断片である第３の捕捉手段とを有し、同一検体に対する心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＩ自己抗体の検出に用いることができる（図１〜図７参照）。
ここで、前記検体の溶液を流通させる流路３が形成され、該流路３に第１の捕捉手段１と第２の捕捉手段２とが固定されてもよい。
また、第１の捕捉手段１と第２の捕捉手段２とが前記流路３の流通方向に沿って直列に配置されていてもよい。
また、前記流路３において第１の捕捉手段１の下流側に第２の捕捉手段２が固定されていてもよい。
また、本発明に係るＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００は、上記センサーチップ１０を有し、同一の検体について、心筋トロポニンＩの検出と、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出とを並行して行うものである（図１〜図７参照）。
ここで、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出は、心筋トロポニンＩ検出後の使用済みの検体を用いて行ってもよい。
本発明に係るセンサーチップ１０は、被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンＩと特異的に結合可能な第１の捕捉手段と、心筋トロポニンＩに対する自己抗体と結合可能な第２の捕捉手段とを備えており、
心筋トロポニンＩ検出後の使用済みの被験者由来の検体を用いて、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出に用いることができる。

＜ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム＞
図１に、本発明に係るＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムの一例を示す。
ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００は、図１に示すように、センサーチップ１０と、ＳＰＦＳ装置１０Ａとを有している。

＜センサーチップ＞
センサーチップ１０は、図１に示すように、後述するＳＰＦＳ装置１０Ａに着脱可能に搭載されてＳＰＦＳ免疫蛍光測定に用いられるものである。
センサーチップ１０は、図１に示すように、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定時の励起光を通過させるための透明支持体５と、透明支持体５の上に形成された金属膜４と、金属膜４を一部として検体の溶液等を流通させるための流路３と、金属膜４の表面に設けられて、心筋トロポニンＩを検出するための第１の捕捉手段１と、心筋トロポニンＩ自己抗体を検出するための第２の捕捉手段２とを有し、さらに任意に第３の捕捉手段等を有する。

なお、符号６は、センサーチップ１０に検体の溶液等を送液する際に、ＳＰＦＳ装置１０Ａの送液ポンプ１４（後述）の先端部を接続させるためのポンプ接続部を示す。また、符号７は、センサーチップ１０を流通した後の検体の溶液等を一時的に貯留等するための着脱可能な液溜を示している。符号１５は、流路天板や流路基板等の流路形成体を示す。

（透明支持体）
透明支持体５は、センサーチップ１０の構造を支持するために用いられる。透明支持体５は、図１に示すように、金属膜４形成用の平面部５ａと、プリズム部５ｂ等とを有している。この平面部５ａとプリズム部５ｂとは別体であっても一体であってもよい。

透明支持体５の材質としては、ガラス製または樹脂製のものを用いることができる。
樹脂製のものとして、アクリル系、ポリカーボネート（ＰＣ），ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などの光学樹脂製のものを用いることができる。さらにセラミックスなどの各種の無機物、天然ポリマー、二酸化ケイ素（ＳｉＯ₂）、二酸化チタン（ＴｉＯ₂）を含むものも用いることができる。

透明支持体５の屈折率〔ｎ_d〕は、好ましくは１．４０〜２．２０である。また、透明支持体５の平面部５ａが別体の場合には、平面部５ａの厚さは、好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍである。

透明支持体５の表面は、金属膜４を形成する前に、酸および／またはプラズマにより洗浄することが好ましい。酸による洗浄処理としては、０．０００１〜１Ｎの塩酸中に、１〜３時間、透明支持体５を浸漬することが好ましい。プラズマによる洗浄処理としては、例えば、プラズマドライクリーナー（ヤマト科学（株）製の「ＰＤＣ200」）中に、０．１〜３０分間、透明支持体５を浸漬させる方法が挙げられる。

透明支持体５の平面部５ａの大きさ（縦×横）は、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定に悪影響を与えない限り、特に限定されない。透明支持体５の平面部５ａの法線方向に沿ったプリズム部５ｂの断面の形状として、図示した逆台形形状に限らず、三角形状、半円形状、楕円形状に形成することもできる。

透明支持体５のプリズム部５ｂは、後述するＳＰＦＳ装置の光源１９からの励起光Ｌ１をプリズム部５ｂの内部に入射させる入射面５ｃと、透明支持体５の平面部５ａ上の金属膜４の裏面で反射した前記励起光をプリズム部５ｂの外部に出射する出射面５ｄとを有する（図１参照）。

（金属膜）
金属膜４は、全反射条件でプリズム部５ｂの内部に入射した励起光Ｌ１が金属膜４と平面部５ａとの界面で全反射することにより生じるエバネッセント波（増強電場）を増幅するための部材である。

透明支持体５の表面に形成される金属膜４としては、金，銀，アルミニウム，銅および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属は、その合金（アロイ）の形態であってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。

透明支持体５の上に金属膜４を形成する方法としては、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。金属膜４の形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法により金属膜４を形成することが好ましい。

金属膜４の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ，銀：５〜５００ｎｍ，アルミニウム：５〜５００ｎｍ，銅：５〜５００ｎｍ，白金：５〜５００ｎｍ，およびそれらの合金：５〜５００ｎｍが好ましい。

電場増強効果の観点から、金属膜４の厚さとして、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍおよびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましい。

金属膜４の厚さが上記範囲内であれば、表面プラズモンを好適に発生させることができる。なお、金属膜４の大きさ（縦×横）は、平面部５ａと同様に、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定に悪影響を与えない限り、特に限定されない。

＜流路＞
センサーチップ１０の流路３は、被験者（ヒト、イヌ、ネコ等）から採取した血清等の検体を必要に応じて後述の前処理をした検体溶液、または洗浄液等を流通させるための流路である。

流路３は、図２Ａに示すように、第１，２の捕捉手段１，２を直列に設けた分岐しない流路３とすることができるが、図２Ｂに示すように、ポンプ接続部６より下流の位置で分岐させて、分岐流路に第１，２の捕捉手段１，２をそれぞれ設けた並列の流路３でもあってもよい。

ただし、被験者からの採取するサンプル量がより少なくなる（より低侵襲性となる）点で、図２Ａの分岐させない直列の流路３が好ましい。
また、センサーチップ１０の流路３は、センサーチップ１０を左右対称（図１において）に形成する等、流路３の上流側と下流側とを反転可能な構成としてもよい。これは、図２Ａに示すような直列の流路３の場合、第１捕捉手段１による検出を優先するか、第２捕捉手段２による検出を優先するかをその都度選択できるからである。

センサーチップ１０の流路３の構成としては、流路３の流通方向Ｍ（図１参照）を一方方向に固定して、下流側から排出される使用済みの検体溶液を再度上流側に循環させる流路構成であってもよい。

このようにすることで、使用済みの検体溶液をさらに第１，２の各捕捉手段１，２と反応させることができ、第１，２捕捉手段１，２と検体との間で抗原抗体反応を十分に行うことができ、心筋トロポニンＩや心筋トロポニンＩの自己抗体の検出精度を向上させることができる。この循環については後述のＳＰＦＳ装置１０Ａの制御手段で自動制御して行ってもよい。

センサーチップ１０の流路３の長さは、被験者（患者等）の低侵襲性を高めるために極力短くして測定に必要な検体量を低減することが望ましいが、第１，２捕捉手段１，２と心筋トロポニンＩや心筋トロポニンＩの自己抗体との結合反応が十分確保される長さにする必要がある。

センサーチップ１０の流路３の横幅は、図２Ａに示すように、分岐しない直列の流路３とする場合、第１，第２の捕捉手段１，２のスポット１ａ，２ａと流路３との隙間を極力なくすように設定することが好ましい。

この理由は、各スポットにおける反応が十分に行われるだけでなく、例えば、図２Ａに示すように、上流側において心筋トロポニンＩが第１捕捉手段１とスポット１ａで結合する分、下流側における第２捕捉手段２と心筋トロポニンＩ自己抗体との結合に悪影響を与えないからである。

また、センサーチップ１０の流路３に対して、後述する固定方法で第１，第２の捕捉手段１，２を固定した後、ブロッキング剤等の非特異的結合を最小にする材料で流路３の表面処理をすることにより、検体中に含まれる夾雑物質の第１，第２の捕捉手段１，２に対する非特異的結合を極力抑制するようにしてもよい。

表面処理として、例えば、金属膜４や、金属膜４とともに流路３を形成している流路形成体１５等の部材（図１参照）に対して、プラズマ処理（酸素プラズマ処理など）やコロナ放電処理、または、親水性ポリマーやタンパク質、脂質等でコーティングする処理することができるが、これらに限定されない。

ブロッキング剤としては、例えば、カゼイン、スキムミルク、アルブミン（ＢＳＡ等）、ポリエチレングリコール等の親水性高分子、リン脂質などの他に、エチレンジアミンやアセトニトリルなどの低分子化合物が挙げられ、一種単独で用いても二種以上併用してもよい。これらは、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ、リン酸緩衝液等の溶媒で希釈して用いることができる。

センサーチップ１０の流路３の形状は、角筒（管）状であっても丸筒（管）状であってもよいが、アナライト（心筋トロポニンＩや心筋トロポニンＩ自己抗体）と１次抗体を結合させて蛍光測定する反応部・測定部（スポット１ａ，２ａが存在する幅広の流路部分）については光を通過させる関係から角筒状であることが好ましく、それ以外の薬液等の送液のみに利用される流路部分は丸筒状であることが好ましい。

センサーチップ１０の外壁を構成する流路形成体１５（図１参照）の材料としては、メチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどからなり、流路３の面する部分はシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いることが好ましい。

スポット１ａ，２ａ周辺の反応部・測定部にあたる流路３の部分は、検体中のアナライト（心筋トロポニンＩや心筋トロポニンＩ自己抗体）との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、流路３の断面において（図１参照）、縦と横がそれぞれ１００ｎｍ〜１ｍｍ程度であることが好ましい。

センサーチップ１０に流路３を形成する方法としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、センサーチップ１０の金属膜４が形成されている表面側に、流路高さ０．５ｍｍを有するポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートをセンサーチップ１０の金属薄膜４が形成されている部位を囲むようにして圧着し、次に、該ポリジメチルシロキサン〔ＰＤＭＳ〕製シートとセンサーチップ１０とをビス等の閉め具により固定する方法が好ましい（一部不図示）。

工業的に製造される大規模ロット（工場レベル）では、センサーチップ１０に流路３を形成する方法としては、センサーチップ１０に流路基板と流路天板の流路形成体１５に相当する部材をプラスチックの一体成形により形成する方法等が挙げられる。図１では、流路天板や流路基板等の流路形成体１５を用いて流路３を形成しているがこれを用いず流路３を形成してもよい。

＜捕捉手段＞
（第１の捕捉手段）
第１の捕捉手段１は、心筋トロポニンＩに特異的に結合する分子である。なお、「特異的に結合する」という用語は、当業界で公知の手段によって測定したときに、特異的部位において結合する分子同士（例えば、一般的に２つのポリペプチド、１つのポリペプチドと核酸分子、または、２つの核酸分子）が他の分子よりも優先的に結合していることを表す。

第１の捕捉手段１として機能する生体分子としては、心筋トロポニンＩ抗体や、心筋トロポニンＩ抗体の部分断片を挙げることができる。
第１の捕捉手段１が部分断片である場合、一般に心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）に結合可能なエピトープ（ｃＴｎＩの特異的かつ保存性の高いN末端側の配列（ａａ １３〜３６：ＰＡＰＡＰＩＲＲＲＳＳＮＹＲＡＹＡＴＥＰＨＡＫＫ）やｃＴｎＩの保存性の高い中間部分の配列（ａａ ３０−１１０）に結合可能なエピトープ）を有しているものが用いられる。

また、文献（Ｔｎｊａ Ｓａｖｕｋｏｓｋｉ, ｅｔ ａｌ. Ｔｒｏｐｏｎｉｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｒｅｎｔ Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ Ａｓｓａｙ Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５８：６ １０４０−１０４８（２０１２））のＦｉｇ．２にあるエピトープ（ａａ ２０−３９ Ｐａｂ，ａａ ８７−９１ Ｍａｂ，ａａ ２４−４０ Ｍａｂ，ａａ ４１−４９ Ｍａｂ，ａａ ２７−３９ Ｐａｂ，ａａ ８０−１１０ Ｍａｂ，ａａ ４１−４９ １９Ｃ７，ａａ ８６−１１０ Ｍａｂ，ａａ ４１−４９ １９Ｃ７，ａａ ８６−９０ ８Ｅ１０，ａａ ２３−２９ ４Ｃ２，ａａ ２６−３５ ２２８，ａａ ８３−９３ ５６０，ａａ １８−２８ Ｍ１８，ａａ ２６−３５ ２２８，ａａ １９０−１９６ ＭＦ４，ａａ １６９−１７８ ２６，ａａ １３７−１４８ ８Ｉ７，ａａ １９０−１９５ ９７０７；
なお、左の数値範囲はアミノ酸塩基の位置を示す。右はエピトープの識別記号を示す。各エピトープはカンマで区切られている。）の１つまたは２つ以上を組み合わせて用いてもよいが、特異性を考慮する必要がある。

第１捕捉手段との組み合わせで用いる２次抗体としては、第１捕捉手段のエピトープと異なるエピトープを有し、このエピトープを介して第１捕捉手段に捕捉された心筋トロポニンＩを特異的に認識して結合する抗体である。

サンドイッチＥＬＩＳＡにより、上記２つの特異的なエピトープ（ａａ １３〜３６，ａａ ４１〜４９）を用いて心筋トロポニンＩを検出する場合、心筋トロポニンＩを検出するための第１捕捉手段１のエピトープは、上記２つのエピトープのうち、何れか一方を認識するものとする必要がある。また、サンドイッチする２次抗体のエピトープは、他方のエピトープを認識する必要がある。

また、第１の捕捉手段１が全長の心筋トロポニンＩ結合抗体の場合、心筋トロポニンＩ結合抗体の野生型のアミノ酸配列でもよく、または、野生型ポリペプチドの対応領域のアミノ酸配列の変異体でもよい。

また、第１の捕捉手段１は、上述のアミノ酸配列に加えて、異種蛋白質に由来の配列を含む他のアミノ酸配列を含み得る。従って、第１の捕捉手段１には、心筋トロポニンＩ抗体の生体分子のアミノ酸配列が一端または両端で１つ以上の異種タンパク質由来の（１つ以上の）アミノ酸配列に融合した融合ポリペプチドが包含される。

融合する追加のアミノ酸配列の例としては、蛋白質の生成を容易にするシグナル配列、および免疫学検出またはアフィニティー精製のために使用できるエピトープタグ等をも含まれる。

（第１捕捉手段と２次抗体の入手方法）
心筋トロポニンＩ抗体は、各製薬会社（フナコシ社等）から購入することができる（製品名「Ａｎｔｉ−Ｔｒｏｐｏｎｉｎ−Ｉ，Ｃａｒｄｉａｃ Ｈｕｍａｎ」等）。

また、心筋トロポニンＩ抗体は、公知の手法によって作製することもできる。例えば、定法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９７５年，第２５６巻，ｐ４９５−４９７）に基づいて、ゲル濾過や購入等により入手した心筋トロポニンＩにより齧歯動物を免疫することにより、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の形で心筋トロポニンＩ抗体を取得することができる。

心筋トロポニンＩ抗体の部分断片は、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ抗体フラグメントは、完全型抗体をプロテアーゼ酵素により処理して、場合により還元して得ることができる。

また、抗体を産生するハイブリドーマから、そのｃＤＮＡを単離し、遺伝子改変によって作製された発現ベクターを用いて、抗体またはその抗体の断片あるいは抗体の断片と別のタンパク質との融合タンパク質として産生することができる。この場合は、上述したようにアフィニティー精製用のエピトープタグを有していることが好ましい。

第１捕捉手段との組み合わせで用いる２次抗体の入手方法としては、例えば第１捕捉手段１と心筋トロポニンＩとの結合に用いないエピトープを含む心筋トロポニンＩの部分断片を抗体産生動物に免疫する方法や、上記のようにハイブリドーマを用いる方法により入手することができる。

（第２の捕捉手段）
第２の捕捉手段２は、心筋トロポニンＩ自己抗体に結合する分子である。第２の捕捉手段２としては、心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体、該抗体の部分断片等を用いることができる。心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体としては、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を認識して結合する抗ヒト抗体や、後述する所定の方法で得られた抗体等が挙げられる。

心筋トロポニンＩ自己抗体は、心拍数や心収縮に関係が深いL型カルシウム電流を増加させ，心筋障害の持続に関連するとの報告があり（医学のあゆみ ２００８年２２６巻１号ｐ．１６−２１等）、拡張型心筋症の発症因子でもある（再表２００４／０９１４７６）。そのため、心筋トロポニンＩの検出結果の信頼性の判断だけでなく、上記した観点からも測定・検出する意義は高い。

心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体の部分断片は、心筋トロポニンＩ自己抗体に結合可能なエピトープを有し、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト型抗体またはその短縮型（例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ）抗体などのいずれの形体であってもよい。

第２捕捉手段との組み合わせで用いる２次抗体としては、第２捕捉手段に捕捉された心筋トロポニンＩ自己抗体に結合した心筋トロポニンＩを認識して結合する抗体である。好適には、トロポニンＩ自己抗体がトロポニンＩとの結合時に認識するエピトープと異なるエピトープを有し、このエピトープを介して心筋トロポニンＩを認識して結合する抗体である。２次抗体が第２捕捉手段２に結合している心筋トロポニンＩ自己抗体と競合しないようにするためである。

（第２捕捉手段の入手方法）
第２捕捉手段２の入手方法については、第２捕捉手段２がヒト抗体のＦｃ領域を認識して結合する抗ヒト抗体の場合、例えば、「Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆｃ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ」（メルク−ミリポア社）等を購入して本発明に用いることができる。Ｆａｂ領域のみの場合や、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域の双方を認識するものも同様に購入して本発明に用いることができる。

通常、試料中の心筋トロポニンＩ自己抗体が心筋トロポニンＩのいずれのエピトープを認識して結合しているかは不明であり、２次抗体が結合する（心筋トロポニンＩ自己抗体と競合しない）エピトープも不明であることから、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出感度を高めるために、心筋トロポニンＩの各エピトープを極力網羅的に認識できるポリクローナル抗体、またはそのようなモノクローナル抗体の組み合わせを２次抗体として用いることが望ましい。

この２次抗体の調製方法としては、心筋トロポニンＩの全エピトープを極力網羅するように、心筋トロポニンＩのエピトープを１つまたは２つ以上有する心筋トロポニンＩの断片を用いて、上述するような公知の方法により抗体産生動物に複数回接種して、該動物から分離精製することで調製することができる。また上述したようなハイブリドーマを用いて調製する方法であってもよい。
上述した心筋トロポニンＩのエピトープを１つまたは２つ以上有する心筋トロポニンＩの断片は、検出感度を上げるために、より少ない数のエピトープを含むものが好ましい。

（第３の捕捉手段）
心筋トロポニンＩまたはその部分断片を第３捕捉手段として、流路３に固定してもよい。第３捕捉手段は、第２捕捉手段よりも上流側に固定される。この理由は、第２捕捉手段に捕捉されても検出されない遊離の心筋トロポニンＩ自己抗体を第２捕捉手段の手前で極力除去するためである。なお、第３の捕捉手段は心筋トロポニンＩ自体であるため、第１，２捕捉手段と組み合わせて使用する２次抗体により検出されることから、スポット位置設定手段で第３のスポットに設定する必要がある。

（第３捕捉手段の入手方法）
心筋トロポニンＩの部分断片の入手方法については、例えば、上述したように全長の心筋トロポニンＩをプロテアーゼ処理して入手することができる。または、心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）をコードするポリヌクレオチドの塩基配列が公知であるので、配列情報をＧｅｎＢａｎｋなどから取得した後、配列の一部を除去した遺伝子断片を作成し、これを発現ベクターに組み込んだ上で、タンパク質を産生させる宿主に形質転換して宿主を培養し、培養された宿主から産生された目的のタンパク質を精製することで入手することができる。

（血清の前処理）
被験者から採取した血清の前処理は、必要に応じて適当なバッファー溶液に希釈することによってサンプルを前処理してもよく、濃縮してもよい。これらの前処理には、リン酸塩、トリスなどのような様々なバッファーのいずれかを場合により生理的ｐＨで使用する多くの標準水性バッファー溶液のいずれかを使用できる。なお、サンプルとしては、血清に限定されず、血漿および全血でも構わない。

（金属膜へ捕捉手段を固定する方法）
第１，第２の捕捉手段１，２や第３の捕捉手段を金属膜４に固定する方法は、特に限定されないが、下記の金属結合基を、第１，第２の捕捉手段１，２や第３の捕捉手段の抗原結合領域以外の領域に導入し、この金属結合基を介して従来公知の方法（例えば後述する方法）により、第1，２の捕捉手段や第３の捕捉手段を金属膜４に対して結合および固定させることができる。

前記金属結合基としては、チオール基（−ＳＨ）、テルル基（−ＴｅＨ）、セレノール基（−ＳｅＨ）、対称又は非対称ジセレニド基（−ＳｅＳｅ−）、対称又は非対称ジスルフィド基（−ＳＳ−）、チオイソシアニド基（−ＳＣＮ）、イソニトリル基（−ＮＣ）、３価リン酸基（−ＰＯ₄ ^2-）、スルフィド基（−ＳＲＺ）、ジスルフィド基（−ＳＳＲＺ）、セレニド基（−ＳｅＲＺ）、ジセレニド基（−ＳｅＳｅＲＹ）、キサンテート基（−ＯＣＳＳ−）、ニトロ基（−ＮＯ₂）、チオカルバメート基（−ＳＣＨ）、ホスフィン基（−ＰＲ₂）、チオ酸基又はジチオ酸基（−ＣＯＳＨ、−ＣＳＳＨ）、カルボキシル基（−ＣООＨ）、シラン基（−ＳＨ₃）等を挙げることができる。

第１，第２の捕捉手段１，２を金属膜４に固定する方法の具体例として、まず、透明基板上の金属膜４の表面に対して、第１，２捕捉手段１，２を溶解した、１０−カルボキシ−１−デカンチオール（（株）同仁化学研究所製）あるいは１０−アミノ−１−デカンチオールを含むエタノール溶液を滴下し、スポットが乾燥しない条件にて常温で所定時間（例えば２４時間）インキュベートし、インキュベートした後に各スポットをエアガンで乾燥して、固定を完了する方法が挙げられる。

なお、上記では第１，第２の捕捉手段１，２や第３の捕捉手段を金属膜４に直接固定する方法を説明したが、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を介して第１、第２の捕捉手段１，２や第３の捕捉手段を金属膜４に固定したり、更にＳＡＭ上にカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）等の親水性高分子層を設け、その親水性高分子層に第１、第２の捕捉手段１，２や第３の捕捉手段を固定したり、従来公知の固定方法を利用することができる。

なお、センサーチップ１０の流路３における第１，２の捕捉手段１，２の固定位置については、心筋トロポニンＩの検出を行うこと（急性心筋梗塞か他の心疾患であるかの判別）の方が、心筋トロポニンＩの自己抗体の検出を行うことよりも重要と考えられるため、心筋トロポニンＩの自己抗体の固定位置よりも上流側に固定することが好ましい。

（センサーチップ保管方法）
製造したセンサーチップ１０の作成後の保存に関しては、速やかに窒素雰囲気等で封入して、必要時に取り出して用いることが好ましい。窒素雰囲気での封入方法としては、水分透過率１０^-2ｇ／ｍ²・４０℃９０％以下の防湿性能を有する防湿フィルム中に好適に保管することができる。

＜ＳＰＦＳ装置＞
ＳＰＦＳ装置１０Ａは、図１に例示するように、光源１９、直線偏光板１８、光路切替ミラー１７、プリズムとしての透明支持体５、減光フィルター２２、フィルター入換手段２０、カットフィルター２１、検出器２３、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部１６、液貯留ウェル１３、送液ポンプ１４、アクチュエータ、制御手段、等とを有している（一部不図示）。なお、液貯留ウェル１３は、ＳＰＦＳ装置１０Ａに対して着脱可能な構成としてもよい。

（光源）
蛍光量を測定する際に照射される光源１９は、金属膜４にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルターを通して、プリズム５に入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。

レーザ光の照射により、全反射減衰条件〔ＡＴＲ〕において、金属膜４の表面に表面プラズモンが発生する。表面プラズモンの電場増強効果により、照射したフォトン量の数十〜数百倍に増えたフォトンにより蛍光色素１２（図４等参照）を励起する。なお、該電場増強効果によるフォトン増加量は、プリズム５の屈折率、金属部材の金属種およびその膜厚に依存するが、通常、金属膜４が金膜の場合では約１０〜２０倍の増加量となる。

蛍光色素１２は、光吸収により分子内の電子が励起され、短時間のうちに第一電子励起状態に移動し、この状態（準位）から基底状態に戻る際、そのエネルギー差に相当する波長の蛍光を発する。

レーザ光Ｌ１としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０．００１〜１，０００ｍＷのＬＤ；波長２３０〜８００ｎｍ（金属膜４に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。

（直線偏光板）
直線偏光板１８は、励起光であるレーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするものである。これにより、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定時の検出感度も増加する。

（光路切替ミラー）
光路切替ミラー１７は、光源１９から放射されたレーザ光Ｌ１を反射して、プリズム（透明支持体）５の入射面５ｃを介して入射させ、反射して出射面５ｄから出射した反射光を受光した表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部１６による情報から、金属膜４に対する照射角度を調節する。

（プリズム）
プリズム５は、図１に示すように、センサーチップ１０の透明支持体５と一体であってもよいし、別体であってもよい。一体の場合には金属膜４を形成した平面部５ａとそれ以外のプリズム部５ｂを有する。プリズム５は、必要に応じて用いられる光学フィルター、偏光フィルター及びカットフィルター等の各種フィルターを介したレーザ光Ｌ１が、金属膜４に効率よく入射されることを目的としており、別体の場合はプリズム５の屈折率がセンサーチップ１０の透明支持体５と同じであることが好ましい。
全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。

（減光フィルター）
減光フィルター２２は、検出部２３への入射光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器２３を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。

（カットフィルター）
カットフィルター２１は、外光（ＳＰＦＳ装置１０Ａ外の照明光）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサーチップ１０表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）などの光学ノイズを除去するフィルターであって、例えば、干渉フィルター、色フィルターなどが挙げられる。

（検出器）
検出器２３としては、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサも好適に用いることができる。

（表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部）
また、表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部１６は、すなわちＳＰＲ専用の受光センサとしてのフォトダイオード，ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰〔ＡＴＲ〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源１９とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。），ＳＰＲ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。

（液貯留ウェル）
液貯留ウェル１３は、測定対象の溶液Ｓ、希釈用緩衝液ＤＢ、抗体溶液ＡＳ、洗浄用緩衝液ＷＢ、心筋トロポニンＩや心筋トロポニンＩ自己抗体の標準液（不図示）等を貯留するための各ウェルを有し、カートリッジ式となっている。また、各ウェル内の溶液やバッファーは、送液ポンプ１４の自動ピペッティング操作により、その都度に吸い上げ等される。

（送液ポンプ）
送液ポンプ１４としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ，循環送液には適用できないが送り精度が高く脈動が少ないシリンジポンプ，微量送液には不向きな場合があるが簡易で取り扱い性に優れるがチューブポンプなどが挙げられるが、これらに限定されることなく、目的や用途に応じて種々の手段を適宜選択して用いることができる。

（アクチュエータ）
アクチュエータは、検出器２３や光路切替ミラー１７等の各部材にそれぞれ設けられており、それらの動作の駆動を行うものである（不図示）。

（制御手段）
ＳＰＦＳ装置１０Ａの制御手段は、表示部、入力手段、ＣＰＵ、メモリ等を備え（不図示）、一般的なＰＣ端末としての機能を有する。メモリには、スポット位置設定手段、基準値設定手段、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定手段、測定値比較手段、検量線作成手段等として制御手段を動作させるプログラム等が記憶されている。

制御手段は、入力手段を介したユーザーによる入力に基づいて、スポット位置設定処理、基準値設定処理、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定処理および信頼性評価処理等を行う。この制御手段は、インターネット等の回線を通じて例えば病院の端末と接続され、ＭＭＬ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｒｋｕｐ Ｌａｎｇｕａｇｅ）等のデータ形式で他の端末と情報交換可能に構成されていてもよい。

（スポット位置設定手段）
スポット位置設定手段は、ユーザーによる入力手段の入力に基づいてＳＰＦＳ装置にセットされたセンサーチップ１０の第１捕捉手段（心筋トロポニンＩ抗体等）１および第２捕捉手段（心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体等）２、任意で第３の捕捉手段の各スポット位置の設定とメモリへの記録をするものである。

スポット位置設定手段は、例えば、ユーザーによる入力手段を介した入力により、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定の際に流路３の上流側から蛍光が確認されるスポットの順番に、第１捕捉手段１のスポット１ａ、（任意で第３捕捉手段のスポット）、第２捕捉手段２のスポット２ａと認識するように設定をして、その設定情報をスポット位置情報としてメモリに記憶する等の動作を行う。また、検出器２３により取得された検出画像のいずれの側が流路３の上流側であることの情報があらかじめメモリに記録等されて、情報として得られるようになっている。
なお、このスポット位置情報は、上述のＳＰＦＳ免疫蛍光測定に関する設定条件の一つとして測定の際にスポットの識別に用いられる。

（基準値設定手段）
基準値設定手段は、入力手段を介したユーザーによるキー入力情報に基づいてＳＰＦＳ免疫蛍光測定に関する基準値をメモリに記録したり、記録した基準値の変更をしたりするものである。

この基準値には、心筋トロポニンＩの測定値に対する基準値（第１基準値）と、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値に対する基準値（第２基準値）が含まれる。
第１基準値は、医師が被験者（患者等）を診断する際に用いるものである。一方、第２基準値は、ＳＰＦＳ装置１０Ａの制御部の測定値比較手段が、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定による心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値と比較して心筋トロポニンＩの測定値のデータ信頼性を判断する信頼性評価処理に用いるものである。

（第１基準値）
心筋トロポニンＩが陽性であるか否かの判断に医師が用いる第１基準値は、患者検体の血清および血漿中の抗原濃度換算で０．０４ｎｇ／ｍＬである（場合によっては０．０５ｎｇ／ｍＬ等の他の値が使用される）。心筋トロポニンＩの測定値のカットオフ値は、０〜第１基準値である。

（第２基準値）
第２基準値については、ブランク値を超える心筋トロポニンＩ自己抗体の免疫蛍光が検出された時点で、心筋トロポニンＩの測定の信頼性が低いことにつながることから、第２基準値としては、好ましくは、センサーチップ１０のスポット２ａの測定ブランクのシグナルがとりうる範囲、またはそれに近い値に設定され、例えば測定ブランクのとりうる範囲の上限値よりやや高めに設定される。また、第２基準値を超える範囲でさらに別の基準値を複数設けて、心筋トロポニンＩの測定結果の信頼の程度を段階評価することとしてもよい。

（ＳＰＦＳ免疫蛍光測定手段）
ＳＰＦＳ免疫蛍光測定手段は、入力手段を介したユーザーによる入力により、メモリに記憶されたＳＰＦＳ免疫蛍光測定に関する設定条件に基づいて、ＳＰＦＳ装置１０Ａの光源１９等に各種の制御命令を出して、後述するＳＰＦＳ免疫蛍光測定の一連の工程を行うものである。

（測定値比較手段）
測定値比較手段は、入力手段を介したユーザーによる入力に基づいて、以下に説明する蛍光測定値の信頼性評価処理を行う（図３参照）。

まず、ステップＳ１では、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定手段により心筋トロポニンＩの測定値の有無について判断する。なお、心筋トロポニンＩの測定値の値が０でもデータとして存在することになる。測定値が存在しＹＥＳであればステップＳ２に進み、存在しなければステップＳ６に移動してエラー表示した後、信頼性評価処理を終了する。なお、信頼性評価処理における「測定値」とはサンプル中に含まれる測定対象の含有量を、測定対象の免疫蛍光測定シグナルから各検量線をもとにして換算した値である。

ステップＳ２では、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値および第２基準値の有無について判断する。双方の情報が存在しＹＥＳであればステップＳ３に進み、いずれか一方でも存在しなければステップＳ６に移動してエラー表示後、信頼性評価処理を終了する。

ステップＳ３では、ステップＳ２の心筋トロポニンＩの自己抗体の測定値と第２基準値とを比較し、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値が第２基準値より高くＹＥＳの場合は、ステップＳ４に移動する。心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値が第２基準値以下でＮＯの場合は、ステップＳ５に移動する。

ステップＳ４では、例えば、表示部に心筋トロポニンＩの測定結果の信頼性が低いことを表示し、被験者情報（患者の氏名等）と関連付けされた心筋トロポニンＩの測定値の情報に対して、信頼性が低いことの情報を関連づけてメモリに記録し、信頼性評価処理を終了する。

ここで、メモリに記録する際に、比較に用いた第２基準値、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値、偽陰性により追加検査の必要性があること等の情報を、一緒に関連付けて記録をするようにしてもよい。また、上記記録と同時に病院等の他の端末（例えば医師が使用する端末）にこれらのデータを送信して他の端末とデータを共有してもよい。

ステップＳ５では、例えば、表示部に心筋トロポニンＩの測定結果の信頼性が高いことを表示し、心筋トロポニンＩの測定値に対して、信頼性が高いことの情報を関連付けてメモリに記録し、信頼性評価処理を終了する。

ここで、メモリに記録する際に、ステップＳ４と同様に、比較に用いた第２基準値、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値、追加検査が不要であること等の情報を、一緒に関連付けて上記記録をするようにしてもよい。また、上記記録と同時に病院等の他の端末（例えば医師が使用する端末）にこれらのデータを送信して他の端末とデータを共有してもよい。

（検量線作成手段）
検量線作成手段は、以下のように検量線の作成処理を行うか、または既にある心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＩ自己抗体の検量線データを読み込んでメモリに記憶する処理を行うものである。

（１）心筋トロポニンＩの検量線の作成
ユーザーがセットした液貯留ウェル１３の各濃度の心筋トロポニンＩ標準液について、上記センサーチップ１０の流路３に流通させて後述のＳＰＦＳ免疫蛍光測定を行い、各濃度に対応する蛍光強度を調べて、心筋トロポニンＩの検量線を作成する。なお、各ウェルの心筋トロポニンＩの標準液の濃度データは、ユーザーの入力手段を介した入力により例えばリスト形式のデータとしてメモリに紐付けされて記憶されている。

（２）心筋トロポニンＩと心筋トロポニンＩ自己抗体の複合体の検量線の作成
心筋トロポニンＩ自己抗体の検量線については、例えば、市販されている被験者（患者等）等由来の血清で心筋トロポニンＩと心筋トロポニンＩ自己抗体とが結合した複合体の濃度が既知のものについて、上記（１）の心筋トロポニンＩの検量線作成の場合と同様に検量線を作成する。

〈ＳＰＦＳ免疫蛍光測定〉
以下、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定手段が行うＳＰＦＳ免疫蛍光測定について説明する。ＳＰＦＳ免疫蛍光測定は、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み、任意に洗浄工程（１）、（２）を含む。

工程（ａ）：センサーチップ（センサーチップ１０等）に、アナライト溶液（検体の溶液や標準液等）を接触させる工程
工程（ｂ）：工程（ａ）後のセンサーチップの１次抗体に捕捉されたアナライトに対して、蛍光色素標識された２次抗体を反応させる工程
工程（ｃ）：工程（ｂ）後のセンサーチップに対して、金属膜４を形成していないプリズム（透明支持体）５を経由してレーザ光Ｌ１を照射し、この照射により励起された２次抗体の蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程
工程（ｄ）：工程（ｃ）で得られた測定結果から、アナライトの量を算出する工程
洗浄工程（１）：上記工程（ａ）を経て得られたセンサーチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
洗浄工程（２）：上記工程（ｂ）を経て得られたセンサーチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程。

［工程（ａ）］
工程（ａ）は、センサーチップの金属膜４に固定化された１次抗体（心筋トロポニンＩ抗体または心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体等）に、アナライト溶液を接触させる工程である。

（アナライト溶液の接触）
アナライト溶液は、所定の緩衝液でアナライトを希釈した溶液であり、アナライト（心筋トロポニンＩや心筋トロポニンＩ自己抗体）を希釈するために用いる溶媒は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔ＰＢＳ〕、トリス緩衝生理食塩水〔ＴＢＳ〕、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水〔ＨＢＳ〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。

１次抗体に多くのアナライトを捕捉させるために、送液されたアナライト溶液を流路３に対して、上述したように往復させたり、流路３の流通方向を反転させる等して循環させることが好ましい。その際のアナライト溶液の温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃で１〜６０分間、好ましくは２５℃で５〜１５分間である。

アナライト溶液を流路３に送液する場合、該アナライト溶液中に含有されてもよいアナライト（心筋トロポニンＩおよび心筋トロポニンＩ自己抗体）の初期濃度（送液前の濃度）は、１００μｇ／ｍＬ〜０．００１ｐｇ／ｍＬが好ましい。

流路３に送液するアナライト溶液の総量は、通常０．００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．１〜１ｍＬである。また、流路３に送液するアナライト溶液の流速は、通常１〜５，００００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５，０００〜１，００００μＬ／ｍｉｎである。

［洗浄工程］
洗浄工程としては、上記工程（ａ）を経た後にセンサーチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（１）と、上記工程（ｂ）を経てた後にセンサーチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程（２）がある。

洗浄工程（１）および（２）に使用される洗浄液としては、例えば、工程（ａ）および（ｂ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を好ましくは０．００００１〜１質量％含有するよう溶解させたもの、または塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの塩を１０〜５００ｍＭ含有させたものが望ましい。あるいは、低ｐＨの緩衝液、例えば、１０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ ＨＣｌでｐＨが１．５〜４．０のものを洗浄液として用いてもよい。

洗浄工程における洗浄液の温度および流速は、上記工程（ａ）におけるアナライト溶液の送液時の温度および流速と同じであることが好ましい。
洗浄工程（洗浄液による洗浄時間）は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは２〜１０分間である。

［工程（ｂ）］
工程（ｂ）は、上記工程（ａ）の後、好ましくは上記洗浄工程（１）を経た後に、さらに、金属膜４に固定化した各１次抗体に結合したアナライト（心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＩ自己抗体等）に対して、蛍光色素標識された２次抗体を反応させる工程である。

（蛍光色素）
「蛍光色素」は、所定の励起光を照射することによって、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。

使用可能な蛍光色素は、金属部材による吸光に起因して完全に消光しない限りにおいて、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計〔ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ〕よりむしろフィルターを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。

このような蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６，４０６，２９７号、同第６，２２１，６０４号、同第５，９９４，０６３号、同第５，８０８，０４４号、同第５，８８０，２８７号、同第５，５５６，９５９号および同第５，１３５，７１７号に記載の蛍光色素を用いることもできる。

これらファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。

また、蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も用いることができる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ³⁺が挙げられる。

金属膜４に含まれる金属による吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。例えば、金属部材として金を用いる場合には、金部材による吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。

したがって、この場合には、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７等近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが特に望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、金属部材として銀を用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を使用することが望ましい。これら蛍光色素は１種単独でも、２種以上併用してもよい。

（蛍光色素で標識された２次抗体）
１次抗体がポリクローナル抗体である場合、２次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該１次抗体がモノクローナル抗体である場合、２次抗体は、該１次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。

蛍光色素標識された２次抗体の作製方法としては、例えば、まず蛍光色素にカルボキシル基を付与し、該カルボキシル基を、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕（例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩〔ＥＤＣ〕など）とＮ−ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕とにより活性エステル化し、次いで活性エステル化したカルボキシル基と２次抗体が有するアミノ基とを水溶性カルボジイミドを用いて脱水反応させ固定化させる方法；イソチオシアネートおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；スルホニルハライドおよびアミノ基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ヨードアセトアミドおよびチオール基をそれぞれ有する２次抗体および蛍光色素を反応させ固定化する方法；ビオチン化された蛍光色素とストレプトアビジン化された２次抗体（あるいは、ストレプトアビジン化された蛍光色素とビオチン化された２次抗体）とを反応させ固定化する方法などが挙げられる。

このように作製された蛍光色素標識された２次抗体を含む溶液をセンサーチップに送液して反応させる際、送液される当該溶液の濃度は、０．００１〜１０，０００μｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜１０μｇ／ｍＬがより好ましい。
この溶液を送液する際の溶液の温度、流速および工程（ｂ）の時間（送液時間）は、それぞれ上記工程（ａ）の場合と同様である。

［工程（ｃ）］
工程（ｃ）は、上記工程（ｂ）を経た後のセンサーチップに、上記支持体の、上記金属部材を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。

センサーチップ１０には、少なくとも第１捕捉手段１と第２捕捉手段２の２種以上のスポットが固定され、各スポットからの蛍光を測定する必要があることから、工程（ｃ）の蛍光量を測定する際には、ＳＰＦＳ装置１０Ａの制御手段の命令に基づいて、アクチュエータが光路切替ミラー１７の位置・角度や検出器２３の位置を調節し、各捕捉手段のスポット別に同一の条件でレーザ光Ｌ１を照射して、各スポットから発する蛍光量の測定を行う。

［工程（ｄ）］
工程（ｄ）は、上記工程（ｃ）で得られた測定結果から、アナライト溶液中に含有されるアナライト量を算出する工程である。

より具体的には、工程（ｄ）は、上述した検量線に基づいて被測定検体中のアナライト（心筋トロポニンＩまたは心筋トロポニンＩ自己抗体）量を測定シグナルおよび検量線のデータから算出して、これらデータをＳＰＦＳ装置１０Ａの制御手段のメモリに測定値として記憶等する工程である。

以下、本発明に係るセンサーチップ１０およびＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００による作用・効果について、図１〜図９を参照しながら説明する。
（１）センサーチップ１０は、図１に例示するように、ヒトやペット等の動物由来の検体中の心筋トロポニンＩを特異的に検出可能な心筋トロポニンＩ抗体等の第１捕捉手段１と、心筋トロポニンＩ自己抗体を特異的に検出可能な抗体等の第２捕捉手段２とを有しているので、同一検体について心筋トロポニンＩの検出と心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を行うことができる。

また、同一検体について心筋トロポニンＩの検出と心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を行うことで、被験者（患者等）からのサンプル採取量を少量化することができ、検体のロットが異なることによる測定誤差もなくなる。このため、被験者（患者等）の低侵襲性と心筋トロポニンＩの測定値の信頼性を向上させることができ、また、心筋トロポニンＩの測定値の信頼性の向上から、例えば心筋トロポニンＩの測定値がカットオフ値付近である場合においても、より迅速かつ正確なＡＭＩ検出のためのデータ提供に資することができる。

（２）検体の溶液を流通させる流路３が形成され、流路３に第１の捕捉手段１と第２の捕捉手段２とが固定されていれば、流路３に対して本来であれば１回の検出分の検体の溶液を流通させるのみで、同一検体に対する心筋トロポニンＩの検出と心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を行うことができる。

（３）第１の捕捉手段１と第２の捕捉手段２が流路３の流通方向Ｍに沿って直列に配置されていれば（図２Ａ参照）、心筋トロポニンＩの検出と心筋トロポニンＩ自己抗体の検出の優先順位を設定して検出することができる。

（４）例えば、心筋トロポニンＩを検出する第１の捕捉手段１を流路３のシリンジポンプとの接続部に近い側である上流側に設置し、流路３の下流側に心筋トロポニンＩ自己抗体の検出をする第２捕捉手段２を設置して、心筋トロポニンＩの検出を優先させ、よりインタクトな状態の検体について心筋トロポニンＩの検出を行うことで検出精度を高めることができる。

逆に、心筋トロポニンＩがカットオフ値付近であることがわかっているような検体の場合に、心筋トロポニンＩ自己抗体を捕捉する第２の捕捉手段２を第１捕捉手段１より上流側に設置して、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を優先させ、よりインタクトな状態の検体について心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を行う点で、その検出精度を高めることができる。

また、直列の流路は並列のものと比較して、流路面積をよりも小さくすることができ、被験者から採取する検体の量を低減することができるので、並列の流路より被験者（患者等）に対する低侵襲性を向上させることができる。

（５）センサーチップ１０を有し、心筋トロポニンＩの検出と、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出とを同一の検体に対して、並行して行うＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００であれば、同一の検出系で心筋トロポニンＩの検出、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を行うことができ、検出装置や検出時期が異なることによる測定誤差を極力減らすことができる。この結果、心筋トロポニンＩの測定値の信頼性をさらに向上させることができ、より迅速かつ正確で高感度なＡＭＩ検出のためのデータ提供に資することができる。

（６）また、心筋トロポニンＩの検出後の使用済みの検体を用いて、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を行うことで、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出からすれば検出上の夾雑物にあたる心筋トロポニンＩを極力含まない使用済みの検体について検出を行うことができることから、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出の検出精度をより高めることができる。

以下、各種検体について行ったＳＰＦＳ免疫蛍光測定の実施例および比較例について、図４〜図９を参照しながら説明する。
［実施例１］
ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００により、心筋トロポニンＩが陽性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性である患者由来の血清の検体について、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、まず、図４（Ａ）および（Ｂ）に示すように、工程（ａ）によりセンサーチップ１０の流路３に対して、上記検体が供給される。

抗原である心筋トロポニンＩ ８の一部は、心筋トロポニンＩ自己抗体９と既に結合した状態で流路３に供給されるので、図４（Ｂ）に示すように、第１捕捉手段である心筋トロポニンＩ抗体１に結合するものと、第２捕捉手段である心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体２に結合するものとに分かれる。

そして、図４（Ｃ）に示すように、工程（ｂ）で、それぞれの心筋トロポニンＩ ８に対して蛍光色素１２で標識された２次抗体１１が結合して、工程（ｃ）および（ｄ）で心筋トロポニンＩ ８と心筋トロポニンＩ自己抗体９の双方のスポット１ａ,２ａ（図２Ａ参照）の蛍光が観測されることとなる。

そして、この測定データについて行われる信頼性評価処理では、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値が第２基準値を上回るので、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出により、上記検体の心筋トロポニンＩの測定結果の信頼性が低いことがＳＰＦＳ装置１０Ａの表示部に表示等される。

［実施例２］
ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００により、心筋トロポニンＩが陽性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陰性である患者由来の血清の検体について、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、まず、図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、工程（ａ）によりセンサーチップ１０の流路３に対して、上記検体が供給される。

ここで、検体には心筋トロポニンＩ自己抗体９が存在しないので、抗原である心筋トロポニンＩ ８は、図５（Ｂ）に示すように、心筋トロポニンＩ抗体１にのみ結合する。そして、図５（Ｃ）に示すように、工程（ｂ）で、心筋トロポニンＩ抗体１に結合している心筋トロポニンＩ ８に対して蛍光色素１２で標識された２次抗体１１が結合して、工程（ｃ）および（ｄ）で心筋トロポニンＩ抗体１のスポット１ａの蛍光だけが観測されることとなる。

そして、この測定データについて行われる信頼性評価処理では、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値が第２基準値を下回るので、心筋トロポニンＩ自己抗体の不検出により、上記検体の心筋トロポニンＩの測定結果の信頼性が高いことがＳＰＦＳ装置１０Ａの表示部に表示等される。

［実施例３］
ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００により、心筋トロポニンＩが陰性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性である患者由来の血清の検体について、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、図６（Ａ）および（Ｂ）に示すように、工程（ａ）により、センサーチップ１０の流路３に対して、上記検体が供給される。

抗原である心筋トロポニンＩ ８は、心筋トロポニンＩ自己抗体９と既に結合された状態であり、その状態で流路３に供給される。このうち、心筋トロポニンＩ抗体１が認識するエピトープが心筋トロポニンＩ自己抗体９により覆い隠されているものは、図６（Ｂ）に示すように、心筋トロポニンＩ抗体１とは結合しない。一方、心筋トロポニンＩ抗体１が認識するエピトープが心筋トロポニンＩ自己抗体９により覆い隠されていないものは、心筋トロポニンＩ抗体１と結合する。なお、後者の量は、心筋トロポニンＩが陰性であるため、全体に占める割合は低く、図６への図示を省略している。

そして、前者の心筋トロポニンＩ自己抗体９の部分が心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体２と結合することとなる。
そして、図６（Ｃ）に示すように、工程（ｂ）で、心筋トロポニンＩ自己抗体９に結合している心筋トロポニンＩ ８に対して、蛍光色素１２で標識された２次抗体１１が結合し、工程（ｃ）および（ｄ）で、心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体２のスポット２ａの蛍光だけが観測されることとなる。

そして、この測定データについて行われる信頼性評価処理では、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値が第２基準値を上回るので、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出により、上記検体の心筋トロポニンＩの測定結果の信頼性が低いことがＳＰＦＳ装置１０Ａの表示部に表示等される。

［実施例４］
ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム１００により、心筋トロポニンＩが陰性、心筋トロポニンＩ自己抗体が陰性である患者由来の血清の検体について、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、図７（Ａ）および（Ｂ）に示すように、工程（ａ）で、センサーチップ１０の流路３に対して、上記検体が供給される。

抗原である心筋トロポニンＩ ８と心筋トロポニンＩ自己抗体９が、検体中に存在しないか、陰性となる程に極少量であるので、図７（Ｂ）および図７（Ｃ）に示すように、工程（ｂ）〜（ｄ）を経ても、いずれの結合もなくスポット１ａ，２ａの蛍光が観測されないこととなる。

そして、この測定データについて行われる信頼性評価処理では、心筋トロポニンＩ自己抗体の測定値が第２基準値を下回るので、心筋トロポニンＩ自己抗体の不検出により、上記検体の心筋トロポニンＩの測定結果の信頼性が高いことがＳＰＦＳ装置１０Ａの表示部に表示等される。

［比較例１］
図８（Ａ）に従来技術に係るセンサーチップ５０およびこれを搭載したＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム（一部不図示）を示す。このセンサーチップ５０は、図８に示すように、センサーチップ１０と比較して、心筋トロポニンＩ抗体１のみ有しており、心筋トロポニンＩ自己抗体結合抗体２を有していないものである。また、従来技術に係るＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムは、信頼性評価処理等を行う手段を有していないものである。

従来のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムにより、心筋トロポニンＩが陽性で心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性である患者由来の血清の検体について、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定を行った場合、図８（Ａ）および（Ｂ）に示すように、センサーチップ５０の流路３に対して上記検体が供給されるが、心筋トロポニンＩ自己抗体９と結合した一部の心筋トロポニンＩ ８は検出されることはなく、また、心筋トロポニンＩの測定結果のデータの信頼性が確かであることは判別できない。

［比較例２］
比較例１と同様の従来技術に係るセンサーチップ５０およびＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムにより、心筋トロポニンＩが陰性で心筋トロポニンＩ自己抗体が陽性である患者由来の血清の検体について、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定を行った場合、図９に示すように、センサーチップ５０の流路３に対して上記検体が供給される。

このうち、心筋トロポニンＩ抗体１が認識するエピトープが心筋トロポニンＩ自己抗体９により覆い隠されている心筋トロポニンＩ ８は、心筋トロポニンＩ抗体１に結合しない。一方、心筋トロポニンＩ抗体１が認識するエピトープが心筋トロポニンＩ自己抗体９により覆い隠されていない心筋トロポニンＩは、心筋トロポニンＩ抗体１と結合する。しかし、後者の量は、心筋トロポニンＩが陰性となる第１基準値以下であるので、図９への図示を省略している。

そして、実施例１〜４のように心筋トロポニンＩ自己抗体の検出系が従来技術のＳＰＦＳ免疫蛍光測定システムには存在しないことから、心筋トロポニンＩ自己抗体９が検出されることはなく、心筋トロポニンＩの測定結果のデータの信頼性が確かであることは判別できない。

以上、本発明に係る実施の形態および実施例を、図面を参照しながら説明してきたが、本発明はこれら実施の形態および実施例に限定されず、その要旨を逸脱しない限り、設計変更等は許容される。

例えば、第１の捕捉手段１は、心筋トロポニンＩを検出するものであるが、心筋トロポニンＴ等の他の標的物質を検出ものであってもよい。

１ 第１の捕捉手段
１ａ スポット
２ 第２の捕捉手段
２ａ スポット
３ 流路
４ 金属膜
５ 透明支持体（プリズム）
５ａ 平面部
５ｂ プリズム部
５ｃ 入射面
５ｄ 出射面
６ ポンプ接続部
７ 液溜
８ 心筋トロポニンＩ
９ 心筋トロポニンＩ自己抗体
１０ センサーチップ
１０Ａ ＳＰＦＳ装置
１１ ２次抗体
１２ 蛍光色素
１３ 液貯留ウェル
１４ 送液ポンプ
１５ 流路形成体
１６ 表面プラズモン共鳴〔ＳＰＲ〕検出部
１７ 光路切替ミラー
１８ 直線偏光板
１９ 光源
２０ フィルター入換手段
２１ カットフィルター
２２ 減光フィルター
２３ 検出器
５０ センサーチップ（従来技術）
１００ ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム

Claims (3)

1. ＳＰＦＳ免疫蛍光測定用のセンサーチップであって、
   被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンＩと特異的に結合可能な第１の捕捉手段と、心筋トロポニンＩに対する自己抗体と結合可能な第２の捕捉手段とを備えており、
   心筋トロポニンＩ検出後の使用済みの被験者由来の検体を用いて、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出を行い、
   前記検体の溶液を流通させる流路が形成され、該流路に第１の捕捉手段と第２の捕捉手段とが固定され、
   前記第１の捕捉手段と前記第２の捕捉手段とが前記流路の流通方向に沿って直列に配置され、
   前記流路において第１の捕捉手段の下流側に第２の捕捉手段が固定されている、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定用のセンサーチップ。
2. 前記流路において流通方向を一方方向に固定して、下流側から排出される前記使用済みの検体溶液を再度上流側に循環させる、請求項１に記載のセンサーチップ。
3. 請求項１または２に記載のセンサーチップを有し、
   心筋トロポニンＩの検出と、心筋トロポニンＩ自己抗体の検出とを同一の検体に対して、並行して行う、ＳＰＦＳ免疫蛍光測定システム。
   
   

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