JP6443060B2 - Microbe culture sheet - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本発明は、微生物培養シートに関し、好ましくは微生物を検出するために用いられる微生物培養シートに関する。 The present invention relates to a microorganism culture sheet, and preferably relates to a microorganism culture sheet used for detecting microorganisms.
試料中の微生物の存在を確認し、又は微生物数を測定する方法としては、寒天平板混釈法がある。この寒天平板混釈法では、あらかじめ滅菌したシャーレ中に形成した寒天培地を使用するので、寒天培地を高圧蒸気滅菌するためのオートクレーブや、微生物検査を無菌的に行うための検査室が必要となる。また、微生物のサンプリング、試料液の調製、分注、培地との混釈などの操作が要求される。そこで、このような一連の操作を必要とせず、簡便に微生物検査を行うことができる乾燥培地を備える微生物培養シートが開発されている。 As a method for confirming the presence of microorganisms in a sample or measuring the number of microorganisms, there is an agar plate mixing method. In this agar plate mixing method, an agar medium formed in a pre-sterilized petri dish is used, so an autoclave for autoclaving the agar medium and an inspection room for performing microbiological examination aseptically are required. . In addition, operations such as sampling of microorganisms, preparation of sample solution, dispensing, and pour with a culture medium are required. Therefore, a microorganism culture sheet having a dry medium that can easily perform a microorganism test without requiring such a series of operations has been developed.
例えば、特許文献１には、基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートが記載されている。前記培養シートは、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである。 For example, Patent Literature 1 describes a microorganism culture sheet having a base sheet, a culture layer formed on the base sheet, and a cover sheet that covers the culture layer. The culture sheet is formed by patterning a medium solution containing polyvinylpyrrolidone and at least one selected from the group consisting of a gelling agent, a nutritional component, a coloring indicator, a selection agent, and a substrate.
また、特許文献２でも、同様に、基材シートと、前記基材シートの上面に設けられた培養層と、前記培養層を覆うことができるカバーフィルムと、を備える微生物培養シートが開示されている。 Similarly, Patent Document 2 discloses a microorganism culture sheet comprising a base sheet, a culture layer provided on the top surface of the base sheet, and a cover film that can cover the culture layer. Yes.
特許文献１及び２に開示される微生物培養シートでは、作業の操作性及び安全性に優れ、作業効率を向上することができる。また、ポリビニルピロリドンを培地液の必須成分としているので、所定形状の培養層を安価かつ簡便にパターン形成することができる。 The microorganism culture sheets disclosed in Patent Documents 1 and 2 are excellent in work operability and safety, and work efficiency can be improved. In addition, since polyvinylpyrrolidone is an essential component of the medium solution, a culture layer having a predetermined shape can be formed in a cheap and simple pattern.
しかし、ポリビニルピロリドンを培養層に用いる場合、培養層に反りが生じる場合がある。培養層に反りが生じると、微生物培養シートにも反りが生じることになり、作業の操作性や安全性の低下に繋がる。そこで、そのような反りの発生を防ぐため、培養層に可塑剤としてのグリセリンが添加される。特許文献２の実施例でもグリセリンが添加されている。 However, when polyvinylpyrrolidone is used for the culture layer, the culture layer may be warped. If the culture layer is warped, the microorganism culture sheet is also warped, which leads to a decrease in work operability and safety. Therefore, in order to prevent the occurrence of such warpage, glycerin as a plasticizer is added to the culture layer. In the example of Patent Document 2, glycerin is also added.
ここで、従来から大腸菌群を検出するために、大腸菌群が有するβ−ガラクトシダーゼ活性を利用した発色反応試験が行われている。つまり、培養層上で増殖した大腸菌群は、β−ガラクトシダーゼによって培養層中に含まれるβ−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質（以下、β−ガラクトシダーゼ基質とも称す）を分解し、色原体化合物を遊離させ、これによってコロニーが発色する。しかしながら、上述の通り、ポリビニルピロリドンを用いた培養層では、培養層に反りが生じ易くなるため、培養層中に可塑剤としてグリセリンを添加することでその反りの発生を防いでいた。しかし、本発明者らは、意
外にも、ポリビニルピロリドン及びグリセリン等を含む培養層を用いた場合、本来β−ガラクトシダーゼ活性を有する大腸菌群の中でもβ−ガラクトシダーゼ基質による発色反応が確認できない菌が存在することを発見した。また、このような現象は、α−グルコシダーゼ活性を利用した発色反応試験でも起こることがわかった。具体的には、α−グルコシダーゼ活性を利用した発色反応試験は、例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus
）の検出等に利用することができるが、ポリビニルピロリドン及びグリセリン等を含む培養層を用いた場合、通常では発色反応が得られるはずの黄色ブドウ球菌においてもα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質（以下、α−グルコシダーゼ基質とも称す）による発色反応が確認できない菌が存在することを発見した。目的の発色反応が得られない菌が存在すると、例えば、微生物の生菌数を測定するための試験において正確な情報を得ることができない場合や、目的微生物を検出又は同定するための試験においても正確な結果を得ることができない場合がある。
Here, conventionally, in order to detect coliforms, a color reaction test using β-galactosidase activity of the coliforms has been performed. That is, the coliform group grown on the culture layer decomposes a chromogenic enzyme substrate (hereinafter also referred to as β-galactosidase substrate) that is decomposed by β-galactosidase contained in the culture layer by β-galactosidase, thereby producing a chromogenic compound. Is released, and the colony develops color. However, as described above, in the culture layer using polyvinyl pyrrolidone, the culture layer is likely to warp. Therefore, the addition of glycerin as a plasticizer in the culture layer prevented the warpage from occurring. However, the present inventors surprisingly, when using a culture layer containing polyvinylpyrrolidone, glycerin, etc., among the Escherichia coli group originally having β-galactosidase activity, there is a bacterium that cannot confirm the color reaction by β-galactosidase substrate. I found it to be. Moreover, it has been found that such a phenomenon also occurs in a color development reaction test using α-glucosidase activity. Specifically, a color reaction test using α-glucosidase activity is performed by, for example, Staphylococcus aureus.
), But when a culture layer containing polyvinylpyrrolidone and glycerin is used, a chromogenic enzyme substrate that is degraded by α-glucosidase in Staphylococcus aureus, which should normally produce a chromogenic reaction. It has been discovered that there are bacteria that cannot confirm the color development reaction (hereinafter also referred to as α-glucosidase substrate). If there are bacteria that cannot achieve the desired color reaction, for example, when accurate information cannot be obtained in a test for measuring the number of living microorganisms, or in a test for detecting or identifying a target microorganism. In some cases, accurate results cannot be obtained.
そこで、本発明の目的は、培養層にポリビニルピロリドンを含む場合であっても、反りの発生が抑えられ、かつ発色酵素基質による発色反応が広範囲の微生物で得られる微生物培養シートを提供することである。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a microorganism culture sheet that suppresses the occurrence of warping even when polyvinyl pyrrolidone is contained in the culture layer, and that allows a color development reaction with a chromogenic enzyme substrate to be obtained with a wide range of microorganisms. is there.
本発明者らは、意外にも、可塑剤として、グリセリンの代わりにポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールを用いることにより、β−ガラクトシダーゼ基質及びα−グルコシダーゼ基質による発色反応を得られることを見出し、本発明に至った。
本発明は以下のように表される。
The present inventors have surprisingly found that by using polyethylene glycol or 1,3-butylene glycol instead of glycerin as a plasticizer, it is possible to obtain a color developing reaction with a β-galactosidase substrate and an α-glucosidase substrate. The present invention has been reached.
The present invention is expressed as follows.
（１）基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、
前記培養層が、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有し、
前記発色酵素基質が、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質であり、
前記可塑剤が、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つである微生物培養シート。
（２）前記可塑剤がポリエチレングリコールである、（１）に記載の微生物培養シート。
（３）ポリエチレングリコールの平均分子量が１００以上１０００以下である、（２）に記載の微生物培養シート。
（４）前記可塑剤が１，３−ブチレングリコールである、（１）に記載の微生物培養シート。
（５）大腸菌群を検出するために用いられ、前記発色酵素基質がβ−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質である、（１）乃至（４）のいずれかに記載の微生物培養シート。
（６）黄色ブドウ球菌を検出するために用いられ、前記発色酵素基質がα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質である、（１）乃至（４）のいずれかに記載の微生物培養シート。
（７）前記基材シート及び前記カバーシートの少なくとも一方が、透明プラスチックシートからなる、（１）乃至（６）のいずれかに記載の微生物培養シート。
(1) A microorganism culture sheet having a base sheet, a culture layer formed on the base sheet, and a cover sheet covering the culture layer,
The culture layer contains polyvinylpyrrolidone, a gelling agent, a nutrient component, a selective agent, a chromogenic enzyme substrate and a plasticizer,
The chromogenic enzyme substrate is a chromogenic enzyme substrate that is degraded by β-galactosidase or a chromogenic enzyme substrate that is degraded by α-glucosidase,
The microorganism culture sheet, wherein the plasticizer is at least one selected from polyethylene glycol and 1,3-butylene glycol.
(2) The microorganism culture sheet according to (1), wherein the plasticizer is polyethylene glycol.
(3) The microorganism culture sheet according to (2), wherein the polyethylene glycol has an average molecular weight of 100 or more and 1000 or less.
(4) The microorganism culture sheet according to (1), wherein the plasticizer is 1,3-butylene glycol.
(5) The microorganism culture sheet according to any one of (1) to (4), which is used to detect Escherichia coli, and the chromogenic enzyme substrate is a chromogenic enzyme substrate that is degraded by β-galactosidase.
(6) The microorganism culture sheet according to any one of (1) to (4), which is used to detect Staphylococcus aureus and the chromogenic enzyme substrate is a chromogenic enzyme substrate that is degraded by α-glucosidase.
(7) The microorganism culture sheet according to any one of (1) to (6), wherein at least one of the base sheet and the cover sheet is made of a transparent plastic sheet.
（８）少なくとも１種の細菌を含む試料中の大腸菌群を検出するための方法であって、
（１）乃至（７）のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。
（９）少なくとも１種の細菌を含む試料中の黄色ブドウ球菌を検出するための方法であって、
（１）乃至（７）のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。
(8) A method for detecting coliforms in a sample containing at least one bacterium,
Inoculating the culture layer of the microorganism culture sheet according to any one of (1) to (7) with at least a part of the sample;
Culturing bacteria inoculated on the culture layer;
Including methods.
(9) A method for detecting Staphylococcus aureus in a sample containing at least one kind of bacteria,
Inoculating the culture layer of the microorganism culture sheet according to any one of (1) to (7) with at least a part of the sample;
Culturing bacteria inoculated on the culture layer;
Including methods.
本発明の構成により、培養層にポリビニルピロリドンを含む場合であっても、反りの発生が抑えられ、かつ発色酵素基質による発色反応が広範囲の微生物で得られる微生物培養シートを提供することができる。 According to the configuration of the present invention, even when the culture layer contains polyvinyl pyrrolidone, it is possible to provide a microorganism culture sheet in which the occurrence of warpage is suppressed and a color development reaction with a chromogenic enzyme substrate can be obtained with a wide range of microorganisms.
本発明は、基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートを対象とする。また、本発明の微生物培養シートにおいて、前記培養層は、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有する。また、前記発色酵素基質が、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質である。また、前記可塑剤が、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つである。 The present invention is directed to a microorganism culture sheet having a base sheet, a culture layer formed on the base sheet, and a cover sheet that covers the culture layer. In the microorganism culture sheet of the present invention, the culture layer contains polyvinylpyrrolidone, a gelling agent, a nutrient component, a selective agent, a chromogenic enzyme substrate, and a plasticizer. Further, the chromogenic enzyme substrate is a chromogenic enzyme substrate that is degraded by β-galactosidase or a chromogenic enzyme substrate that is degraded by α-glucosidase. The plasticizer is at least one selected from polyethylene glycol and 1,3-butylene glycol.
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. In addition, this invention is not limited to the following embodiment.
［微生物培養シート］
以下、微生物培養シートの各構成要素について説明する。
（１）培養層
本発明の微生物培養シートにおいて、基材シートの上に設ける培養層は、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有する。培養層は、これらの成分を分散又は溶解させる溶媒を含む培地液から形成することができる。
[Microbe culture sheet]
Hereinafter, each component of the microorganism culture sheet will be described.
(1) Culture layer In the microorganism culture sheet of the present invention, the culture layer provided on the base sheet contains polyvinylpyrrolidone, a gelling agent, a nutrient component, a selective agent, a chromogenic enzyme substrate, and a plasticizer. The culture layer can be formed from a medium solution containing a solvent for dispersing or dissolving these components.
（ｉ）ポリビニルピロリドン
ポリビニルピロリドンは、培地液の粘度調整剤としての役割を有する。ポリビニルピロリドンによれば、濃度を調整することで容易に培地液の粘度調整することができるので、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を均一に分散させることができる。また、培養層を必要な部分に形成することが可能となり、高価な材料の無駄が生じない。また、培地液を所定のパターンに配置した後に溶媒を除去すると、ポリビニルピロリドンの優れた皮膜性のため、ゲル化剤や栄養成分を取り込んで培養層を成膜することができる。また、基材シートとも良好な密着性を有するので、接着剤を使用しなくても培養層を形成することができる。そのため、接着剤成分による微生物の発育の影響を低減することができる。
(I) Polyvinyl pyrrolidone Polyvinyl pyrrolidone has a role as a viscosity modifier of a culture solution. According to polyvinylpyrrolidone, the viscosity of the medium solution can be easily adjusted by adjusting the concentration, so that the gelling agent, nutrient component, selective agent, chromogenic enzyme substrate and plasticizer can be uniformly dispersed. Moreover, it becomes possible to form a culture layer in a required part, and a waste of expensive material does not arise. Further, when the solvent is removed after the medium solution is arranged in a predetermined pattern, the culture layer can be formed by taking in the gelling agent and nutrient components because of the excellent film property of polyvinylpyrrolidone. Moreover, since it has favorable adhesiveness with the base material sheet, the culture layer can be formed without using an adhesive. Therefore, the influence of the growth of microorganisms due to the adhesive component can be reduced.
（ｉｉ）ゲル化剤
ゲル化剤を含有する培地液を用いて形成される培養層は、被検液を接種すると増粘若しくはゲル化するため、微生物の育成に良好な粘度を付与することができる。また、増粘後にはカバーシートに密着し得るため、培養時の培養層の乾燥を抑制することができる。
(Ii) Gelling agent Since a culture layer formed using a medium solution containing a gelling agent thickens or gels when inoculated with a test solution, it can give a good viscosity to the growth of microorganisms. it can. Moreover, since it can contact | adhere to a cover sheet after thickening, drying of the culture layer at the time of culture | cultivation can be suppressed.
ゲル化剤としては、特に制限されるものではなく、公知のゲル化剤を用いることができる。ゲル化剤としては、高分子多糖類が好ましく、カラギーナン、グアーガム、キタンサンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ローカストビーンガム、アルギン酸及びアルギン酸塩等を挙げることができる。これらの高分子多糖類は、被検液中に含まれる水によって増粘又はゲル化するため、微生物の発育が良好となる。また、高分子多糖類は、透明性が高いため、コロニーの視認性に優れる。さらに、高分子多糖類は、増粘してカバーシートに密着し易くなるため、培養時の乾燥を抑制することができる。高分子多糖類の中でも、グアーガムが特に好ましい。グアーガムは、低濃度で極めて高い粘度を呈するため、少量で微生物の発育に適した環境を作ることができるからである。なお、グアーガムは、一年生の豆科植物であるグアーの種子の胚乳部より製造される。 The gelling agent is not particularly limited, and a known gelling agent can be used. The gelling agent is preferably a high molecular polysaccharide, and examples thereof include carrageenan, guar gum, chitansan gum, hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, locust bean gum, alginic acid, and alginic acid salt. Since these high molecular polysaccharides are thickened or gelled by water contained in the test solution, the growth of microorganisms is improved. Moreover, since the high molecular polysaccharide is highly transparent, the visibility of colonies is excellent. Furthermore, since the polymer polysaccharide is thickened and easily adheres to the cover sheet, drying during culture can be suppressed. Of the high molecular polysaccharides, guar gum is particularly preferable. This is because guar gum exhibits an extremely high viscosity at a low concentration, so that an environment suitable for the growth of microorganisms can be created with a small amount. Guar gum is produced from the endosperm portion of guar seeds, which are annual legumes.
ゲル化剤の含有量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して１００質量部以上６
００質量部以下であることが好ましい。
The content of the gelling agent is 100 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of polyvinylpyrrolidone.
It is preferable that it is 00 mass parts or less.
（ｉｉｉ）栄養成分
栄養成分としては、特に制限されるものではなく、公知の栄養成分を用いることができる。栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、又はペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等、あるいはこれらにリン酸二カリウム及び／又は塩化ナトリウムを加えた混合物が好ましく用いられる。大腸菌群検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム等が好ましく用いられる。黄色ブドウ球菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・卵黄混合物、又はペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が好ましく用いられる。ビブリオ検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁等が好ましく用いられる。腸球菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム等が好ましく用いられる。真菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、又はポテトエキス・ブドウ糖混合物等が好ましく用いられる。これらの中から発育させようとする微生物に応じて一種又はそれ以上の栄養成分を選択して用いることができる。なお、培養層中で栄養成分が不足している場合は、被検液に不足分の栄養成分を加えてもよい。
(Iii) Nutritional component The nutritional component is not particularly limited, and a known nutritional component can be used. As a nutrient component, for example, in the case of a microorganism culture sheet for inspection of general viable bacteria, the nutrient component includes a yeast extract / pepton / glucose mixture, a meat extract / peptone mixture, or a peptone / soybean peptone / glucose mixture, or the like. A mixture of dipotassium phosphate and / or sodium chloride is preferably used. In the case of a microorganism culture sheet for coliform group inspection, sodium desoxycholate, peptone, ammonium iron citrate, sodium chloride, dipotassium phosphate, lactose, peptone, lactose, dipotassium phosphate, etc. are preferably used as nutrient components. . In the case of a microbial culture sheet for S. aureus testing, nutritional components include meat extract, peptone, sodium chloride, mannitol, egg yolk mixture, or peptone, meat extract, yeast extract, sodium pyruvate, glycine, lithium chloride, A telluric acid egg yolk mixture or the like is preferably used. In the case of a microorganism culture sheet for vibrio testing, yeast extract, peptone, sucrose, sodium thiosulfate, sodium citrate, sodium cholate, ferric citrate, sodium chloride, beef bile, etc. are preferably used as nutrient components . In the case of a microorganism culture sheet for enterococci examination, bovine brain extract, heart extract, peptone, glucose, dipotassium phosphate, sodium nitride and the like are preferably used as nutrient components. In the case of a microorganism culture sheet for fungal examination, a peptone / glucose mixture, a yeast extract / glucose mixture, a potato extract / glucose mixture, or the like is preferably used as a nutrient component. One or more nutrient components can be selected and used according to the microorganism to be developed from these. In addition, when a nutrient component is insufficient in the culture layer, an insufficient nutrient component may be added to the test solution.
（ｉｖ）選択剤
培養層は、検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤を含有する。このような選択剤としては、例えば、抗生物質、合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、又はストレプトマイシン等を挙げることができる。合成抗菌剤としては、例えば、サルファ剤、ナリジクス酸、又はオラキンドックス等を挙げることができる。また、色素としては、例えば、静菌又は殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等を挙げることができる。また、界面活性剤としては、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩等を挙げることができる。また、無機塩としては、例えば、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、又は高濃度の塩化ナトリウム等を挙げることができる。これら以外にも、例えば、タウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、又はデオキシコール酸塩等を挙げることができる。
(Iv) Selection agent A culture layer contains the selection agent which suppresses growth of microorganisms other than the detection objective. As such a selective agent, for example, antibiotics such as antibiotics and synthetic antibacterial agents, dyes, surfactants, inorganic salts and the like are used. Examples of antibiotics include methicillin, ceftamethazole, cefixime, ceftazidime, cefsulosin, bacitracin, polymyxin B, rifampicin, novobiocin, colistin, lincomycin, chloramphenicol, tetracycline, or streptomycin. Examples of synthetic antibacterial agents include sulfa drugs, nalidixic acid, olaquindox, and the like. Examples of the pigment include crystal violet, brilliant green, malachite green, and methylene blue that have bacteriostatic or bactericidal action. Examples of the surfactant include Tergitol 7, dodecyl sulfate, lauryl sulfate, and the like. Examples of the inorganic salt include selenite, tellurite, sulfite, sodium nitride, lithium chloride, oxalate, and high-concentration sodium chloride. In addition to these, for example, taurocholate, glycine, bile powder, bile salt, or deoxycholate can be used.
大腸菌群検査用の微生物培養シートの場合、選択剤としては、胆汁酸塩、デオキシコール等の胆汁由来物質、タージトール７、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、クリスタルバイオレット等の色素類、又は、セフェキシム若しくはノボビオシン等の抗生物質等が好ましく用いられる。黄色ブドウ球菌検査用の微生物培養シートの場合、選択剤としては、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、コリスチン、ビブリオ菌増殖阻害化合物Ｏ／１２９、アズトレオナム、アンフォテリシン、コリマイシン、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、及びデフェロキサミンから選ばれる少なくとも１種が好ましく用いられる。 In the case of a microorganism culture sheet for coliform group inspection, as a selective agent, bile salts, bile-derived substances such as deoxychol, surfactants such as tarditol 7 and sodium lauryl sulfate (SDS), pigments such as crystal violet, Alternatively, an antibiotic such as cephexime or novobiocin is preferably used. In the case of a microorganism culture sheet for S. aureus examination, as selective agents, lithium chloride (LiCl), sodium azide (NaN 3 ), colistin, Vibrio bacteria growth inhibitory compound O / 129, aztreonam, amphotericin, colimycin, sodium chloride (NaCl) and at least one selected from deferoxamine are preferably used.
（ｖ）発色酵素基質
本発明の微生物培養シートにおいて、発色酵素基質としては、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質（β−ガラクトシダーゼ基質）又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質（α−グルコシダーゼ基質）を用いる。発色酵素基質は、天然基質であってもよく、合成基質であってもよい。発色は、吸収、蛍光又は発光の変化のような光学的性質の変異によるものであることが望ましい。β−ガラクトシダーゼ基質は、β−ガラクトシダーゼ活性により加水分解され、発色を呈する任意の化合物を用いることができる。
(V) Chromogenic enzyme substrate In the microorganism culture sheet of the present invention, as the chromogenic enzyme substrate, a chromogenic enzyme substrate (β-galactosidase substrate) that is degraded by β-galactosidase or a chromogenic enzyme substrate that is degraded by α-glucosidase (α- Glucosidase substrate). The chromogenic enzyme substrate may be a natural substrate or a synthetic substrate. The color development is desirably due to a variation in optical properties such as changes in absorption, fluorescence or emission. As the β-galactosidase substrate, any compound that is hydrolyzed by β-galactosidase activity and exhibits color development can be used.
α−グルコシダーゼ基質は、α−グルコシダーゼ活性により加水分解され、発色を呈する任意の化合物を用いることができる。 As the α-glucosidase substrate, any compound that is hydrolyzed by α-glucosidase activity and develops color can be used.
発色酵素基質は、例えば、インドキシル誘導体に基く酵素基質、ウンベリフェロン誘導体に基く酵素基質、フラボン誘導体に基く酵素基質、アリザリン誘導体に基く酵素基質、ナフトールベンゼイン誘導体に基く酵素基質、ニトロフェノール誘導体に基く酵素基質、ナフトール誘導体に基く酵素基質、カテコール誘導体に基く酵素基質、ヒドロキシキノリン誘導体に基く酵素基質、クマリン誘導体に基く酵素基質、レゾルフィン誘導体に基く酵素基質、フェノキサジン誘導体に基く酵素基質、ナフトール誘導体に基く酵素基質、ナフチルアミン誘導体に基く酵素基質を挙げることができる。これらの中でも、インドキシル誘導体に基く酵素基質、又はウンベリフェロン誘導体に基く酵素基質が好ましい。 Examples of chromogenic enzyme substrates include enzyme substrates based on indoxyl derivatives, enzyme substrates based on umbelliferone derivatives, enzyme substrates based on flavone derivatives, enzyme substrates based on alizarin derivatives, enzyme substrates based on naphthol benzein derivatives, nitrophenol derivatives Enzyme substrate based on naphthol derivative, enzyme substrate based on catechol derivative, enzyme substrate based on hydroxyquinoline derivative, enzyme substrate based on coumarin derivative, enzyme substrate based on resorufin derivative, enzyme substrate based on phenoxazine derivative, naphthol Examples include enzyme substrates based on derivatives and enzyme substrates based on naphthylamine derivatives. Among these, enzyme substrates based on indoxyl derivatives or enzyme substrates based on umbelliferone derivatives are preferred.
β−ガラクトシダーゼ基質としては、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及びオルトニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。これらのうち、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）が特に好ましい。 Examples of the β-galactosidase substrate include 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, 6-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside and orthonitrophenyl-β-D-galactopyrano Cid etc. are mentioned. Of these, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) is particularly preferred.
α−グルコシダーゼ基質としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−α−グルコピラノシドトリハイドレート、ｎ−ヘプチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド等が挙げられる。これらのうち、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドが特に好ましい。 Examples of the α-glucosidase substrate include 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside, 5-bromo-6-chloro-3- Indolyl-α-D-glucopyranoside, 5-bromo-6-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside, 6-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside, 5-bromo-3-indolyl-α- D-glucopyranoside, o-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, phenyl-α-D-glucopyranoside, 3-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, 3-indoxyl- α-glucopyranoside trihydrate, n-heptyl-α-D-glucopyranoside, 5- Romo-4-chloro-3-indoxyl-2-acetamido-2-deoxy-.alpha.-D-glucopyranoside, and the like. Of these, 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside is particularly preferred.
発色酵素基質の培地液中の含有量は、例えば、０．０１〜２．０ｇ／ｌである。発色酵素基質の培地液中の含有量は、発色のコントラストの観点から、０．０２〜０．２ｇ／ｌであることが好ましい。 The content of the chromogenic enzyme substrate in the medium solution is, for example, 0.01 to 2.0 g / l. The content of the chromogenic enzyme substrate in the medium solution is preferably 0.02 to 0.2 g / l from the viewpoint of color contrast.
発色酵素基質は、広いｐＨ範囲で用いることができ、例えば、ｐＨ５．５〜１０、好ましくはｐＨ６．５〜１０で用いることができる。 The chromogenic enzyme substrate can be used in a wide pH range, for example, pH 5.5 to 10, preferably pH 6.5 to 10.
（ｖｉ）可塑剤
本発明の微生物培養シートにおいて、可塑剤として、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つを用いる。
(Vi) Plasticizer In the microorganism culture sheet of the present invention, at least one selected from polyethylene glycol and 1,3-butylene glycol is used as the plasticizer.
ポリエチレングリコールの平均分子量は、１００以上であることが好ましく、１５０以上であることがより好ましく、２００以上であることがさらに好ましく、３００以上であることが特に好ましい。また、ポリエチレングリコールの平均分子量は、１００００以下であることが好ましく、５０００以下であることがより好ましく、２０００以下であることがさらに好ましく、１０００以下であることが特に好ましく、８００以下であることがより特に好ましい。 The average molecular weight of polyethylene glycol is preferably 100 or more, more preferably 150 or more, further preferably 200 or more, and particularly preferably 300 or more. The average molecular weight of polyethylene glycol is preferably 10,000 or less, more preferably 5000 or less, further preferably 2000 or less, particularly preferably 1000 or less, and preferably 800 or less. More particularly preferred.
ポリエチレングリコールの培養層中の含有量は、例えば、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、３０質量部以上９０質量部以下である。ポリエチレングリコールの培養層中の含有量は、反りを抑制する観点から、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、４０質量部以上８０質量部以下であることが好ましい。 The content of polyethylene glycol in the culture layer is, for example, from 30 parts by weight to 90 parts by weight with respect to 100 parts by weight of polyvinylpyrrolidone. The content of polyethylene glycol in the culture layer is preferably 40 parts by mass or more and 80 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of polyvinylpyrrolidone from the viewpoint of suppressing warpage.
１，３−ブチレングリコールの培養層中の含有量は、例えば、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、３０質量部以上９０質量部以下である。１，３−ブチレングリコールの培養層中の含有量は、反りを抑制する観点から、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、４０質量部以上８０質量部以下であることが好ましい。 The content of 1,3-butylene glycol in the culture layer is, for example, 30 parts by mass or more and 90 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of polyvinylpyrrolidone. The content of 1,3-butylene glycol in the culture layer is preferably 40 parts by mass or more and 80 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of polyvinylpyrrolidone from the viewpoint of suppressing warpage.
（ｖｉｉ）その他
培養層は、β−ガラクトシダーゼ発現誘導物質を含んでもよい。β−ガラクトシダーゼ発現誘導物質としては、例えば、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧとも称す）又はメチル−β−Ｄ−チオガラクトシドなどが挙げられる。ＩＰＴＧについては、０．０５〜０．１ｍＭ（１．２〜２．４ｍｇ／１００ｍｌ）の濃度で大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの合成を強力に誘導することが知られている。
(Vii) Others The culture layer may contain a β-galactosidase expression inducer. Examples of the β-galactosidase expression inducer include isopropyl-1-thio-β-D-galactoside (hereinafter also referred to as IPTG) and methyl-β-D-thiogalactoside. It is known that IPTG strongly induces the synthesis of β-galactosidase of E. coli at a concentration of 0.05 to 0.1 mM (1.2 to 2.4 mg / 100 ml).
培養層は、発色指示薬を含んでもよい。発色指示薬は、培養過程で発育する微生物の代謝により産出される特異物質との反応、ｐＨ変化の認識等によって発色してコロニーを着色することができ、コロニー数の計数を極めて容易にする効果を有する。発色指示薬としては、例えば、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（以下ＴＴＣと表示）、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ベラトリルテトラゾリウムブルー等のテトラゾリム塩、ニュートラルレッド混合物、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、又はチモールブルー混合物等のｐＨ指示薬がある。 The culture layer may contain a color development indicator. The coloring indicator can color colonies by reacting with specific substances produced by metabolism of microorganisms that grow during the culture process, recognizing pH changes, etc., and has the effect of making counting the number of colonies extremely easy. Have. Examples of the color development indicator include triphenyltetrazolium chloride (hereinafter referred to as TTC), tetrazolim salts such as p-tolyltetrazolium red, tetrazolium violet, veratryl tetrazolium blue, neutral red mixture, phenol red, bromthymol blue, or thymol blue. There are pH indicators such as mixtures.
培養層は、１層で構成されてもよく、２層以上で構成されてもよい。例えば、ポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）を含有する培地液で第１培養層を形成し、その上にポリビニルピロリドン溶液（ｉ）にゲル化剤（ｉｉ）、栄養成分（ｉｉｉ）、選択剤（ｉｖ）及び発色酵素基質（ｖ）を含有する培地液で第２培養層を形成し、本発明で使用する培養層としてもよい。 The culture layer may be composed of one layer or may be composed of two or more layers. For example, a first culture layer is formed with a medium solution containing a gelling agent (ii) in a polyvinylpyrrolidone solution (i), and a gelling agent (ii) and a nutrient component (iii) are added to the polyvinylpyrrolidone solution (i) thereon. ), A selective culture agent (iv), and a culture medium containing a chromogenic enzyme substrate (v), the second culture layer may be formed to be a culture layer used in the present invention.
また、培地液中に含まれる成分によっては混合により反応を起こす場合があり、これらを別の層に含有させることで混合反応を防ぐことができる。したがって、例えば栄養成分に混合反応を起こす成分ＡとＢとが含有される場合には、Ａ成分を除去した第１培養層と、Ｂ成分を除去した第２培養層との２層を積層して培養層としてもよい。 Moreover, depending on the components contained in the medium solution, a reaction may occur by mixing, and the mixing reaction can be prevented by containing these in another layer. Therefore, for example, when components A and B that cause a mixed reaction in the nutrient component are contained, two layers of a first culture layer from which the A component has been removed and a second culture layer from which the B component has been removed are laminated. It may be a culture layer.
（ｖｉｉｉ）培養層の形成
培養層は、基材シートの上に培地液を所定のパターンに塗布して乾燥することにより形成することができる。培養層をパターン形成することにより、被検液の滴下後に速やかにカバーシートを被覆することで、被検液が自然に一定範囲に拡がるため、優れた操作性を提供することができる。本発明において、「パターン形成」とは、基材シートの上に、培地液を予め決められた形状に印刷、塗布、塗工、又は噴霧等によって配置することをいう。培地液を基材上に配置する方法は、特に制限されるものではない。したがって、パター
ン形成には、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェット等による塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコート等の塗工、スプレー方式等の噴霧等の方法を使用することができる。
(Viii) Formation of culture layer The culture layer can be formed by applying a medium solution in a predetermined pattern on a base sheet and drying it. By forming the culture layer in a pattern, the test liquid is naturally spread to a certain range by covering the cover sheet immediately after the test liquid is dropped, and thus excellent operability can be provided. In the present invention, “pattern formation” means that a medium solution is arranged on a base material sheet in a predetermined shape by printing, coating, coating, spraying or the like. The method for disposing the medium solution on the substrate is not particularly limited. Therefore, for pattern formation, screen printing, gravure printing, letterpress printing, transfer printing, flexographic printing, other printing, application by dispenser or inkjet, bar coating to be coated using a bar, knife coating, die coating, etc. Methods such as spraying such as coating and spraying can be used.
培地液中に含まれる成分は、粉末で添加してもよいし、また、これらを溶媒に溶解した後、例えば、前記ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に混合し、培地液としてもよい。なお、発色指示薬の種類によっては滅菌処理時に着色が目立つものもあり、培養層に含有させず、被検液に発色指示薬を含んだものを使用して発色させてもよい。 The components contained in the medium solution may be added as a powder, or after dissolving these in a solvent, the medium solution may be mixed with the alcohol solution of polyvinyl pyrrolidone, for example. Depending on the type of coloring indicator, coloring may be conspicuous at the time of sterilization. Coloring may be performed using a sample solution containing a coloring indicator instead of being contained in the culture layer.
（２）微生物培養シートの構成
微生物培養シートの好適な態様の一例を図１（ａ）、（ｂ）に示す。図１（ａ）は平面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ’断面図である。
(2) Structure of microorganism culture sheet An example of a suitable aspect of the microorganism culture sheet is shown in FIGS. 1 (a) and 1 (b). 1A is a plan view, and FIG. 1B is a cross-sectional view taken along the line AA ′ in FIG.
図１は、方形の基材シート１０の略中央に培養層３０が形成され、かつ前記培養層３０を被覆するように、方形のカバーシート４０が設けられている態様を示す。基材シート１０に培養層３０がパターン形成されている。図２（ａ）の断面図に示すように、基材シート１０は、基材シート１１と、基材シート１３との２層からなる多層シートであってもよく、更に、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図２（ｂ）に示すように、培養層３０が２層以上の多層で構成されていてもよい。
FIG. 1 shows a mode in which a
パターン形成により調製された培養層３０の形状は、図１に示す円形に限定されるものではなく、正方形、長方形、その他の多角形、不定形であってもよい。
The shape of the
微生物培養シートは、図３（ａ）の展開図に示すように、基材シート１０とカバーシート４０との双方に、培養層３０と、バインダー成分及び栄養成分等のその他の成分を含有する特定成分層３０’と、がそれぞれ形成されていてもよい。例えば、培養層３０と、前記特定成分層３０’との双方にゲル化剤が含まれている場合には、基材シート１０の上の培養層３０と、カバーシート４０に設けられた特定成分層３０’とが対向して配設されるため、例えば、基材シート１０の上の培養層３０に被検液を接種した後に、カバーシート４０で培養層３０を被覆すると、前記被検液が培養層３０と特定成分層３０’とに吸水され、培養層３０と特定成分層３０’との双方で微生物を観察することができる。また、指示薬によっては、培養層３０に含有させると滅菌処理時に着色が目立つものもあり、その場合には、前記指示薬を特定成分層３０’に含有させることで、滅菌処理時の着色を防止することができる。なお、図３（ｂ）は、横断面図である。
As shown in the development view of FIG. 3A, the microorganism culture sheet contains a
また、微生物培養シートは、図４（ａ）の平面図及び図４（ｂ）のＡ−Ａ’線断面図に示すように、基材シート１０の略中央に培養層３０が形成され、前記培養層の外周に円形の枠層２０が形成されたものであってもよい。枠層２０によれば、培養層３０に接種した被検液の吸水範囲をより確実に限定することができる。なお、枠層２０の形状は円形に限定されるものではなく、方形、楕円形、多角形、不定形等いずれであってもよいが、培養層３０に接種した被検液の吸水範囲が所定の面積を確保しうるように枠層が形成されていることが好ましい。また、この態様において、図５の断面図に示すように、更にカバーシート４０に、基材シート１０の上の培養層３０と対向するように特定成分層３０’が形成されていてもよい。
Moreover, as shown in the plan view of FIG. 4A and the AA ′ line cross-sectional view of FIG. 4B, the microorganism culture sheet has a
更に、図６に示すように、前記枠層２０と対向するように、カバーシート４０に粘着層５０が形成されていてもよい。枠層２０と粘着層５０とが密着することで、培養層３０の乾燥や汚染をより効果的に防止することができる。
Furthermore, as shown in FIG. 6, an
微生物培養シートでは、図７（ａ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層２０が基材シート１０の表面に形成されている場合であっても、基材シート１０は、基材シート１１と、基材シート１３との２層からなる多層シートの態様であってもよいし、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図７（ｂ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層２０が基材シート１０の表面に形成されている場合であっても、培養層３０は２層以上の多層で構成されていてもよい。
In the microorganism culture sheet, as shown in the cross-sectional view of FIG. 7 (a), even when the
また、培養層３０は、基材シート１０の上に複数存在してもよい。複数の培養層３０と、それらの外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層２０と、前記培養層３０を被覆するカバーシート４０とが基材シート１０の端部で固設された態様を図８（ａ）、（ｂ）に示す。図８（ａ）は平面図であり、図８（ｂ）は、図８（ａ）のＡ−Ａ’断面図である。図８（ｂ）では、カバーシート４０は、培養層３０を被覆し、かつ枠層２０の上部に密着することができるように、２つの角部（Ｃ１，Ｃ２）が形成される態様となっている。なお、図８とは相違するが、前記基材シート１０上に形成された培養層３０と対向するように、カバーシート４０に特定成分層３０’が形成されていてもよい。
A plurality of culture layers 30 may exist on the
（３）基材シート
本発明の微生物培養シートでは、基材シートの上に培地液をパターン形成するため、基材シートは、耐溶媒性、印刷適性を有する必要がある。また、微生物培養シートとして、耐水性も要求され、培養層を形成する際の乾燥処理に耐える耐熱性を有することも要求される。基材シートは、単層でもよく、２層以上の積層シートであってもよい。
(3) Substrate sheet In the microorganism culture sheet of the present invention, since the medium solution is patterned on the substrate sheet, the substrate sheet needs to have solvent resistance and printability. Moreover, as a microorganism culture sheet, water resistance is also required, and it is also required to have heat resistance that can withstand a drying treatment when forming a culture layer. The base sheet may be a single layer or a laminated sheet having two or more layers.
（４）カバーシート
本発明の微生物培養シートでは、カバーシートは、基材シートに固設されていることが好ましい。カバーシートは、培養中の落下菌等による汚染を防止すると共に、培養層の水分蒸発を防止する作用を有する。カバーシートは、防水性、水蒸気不透過性を有すると同時に、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察及び計数できるように、透明であることが好ましい。カバーシートとしては、例えば、前記基材シートで挙げたようなポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のプラスチックシートを使用することができる。微生物培養シートでは、前記基材シートとカバーフィルムとが透明であれば、微生物培養シートの背面からの投射光で観察することもでき、また、側面からの入射光で観察することもできる。すなわち、カバーシート側からも基材シート側からもコロニーを観察及び計数することができるので、観察方法及び計測方法の選択の幅が広がることとなる。なお、カバーシートの開け閉め等の作業性を考慮すると、ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルムが特に好ましい。
(4) Cover sheet In the microorganism culture sheet of the present invention, the cover sheet is preferably fixed to the base sheet. The cover sheet has the effect of preventing contamination by falling bacteria during culture and preventing moisture evaporation of the culture layer. It is preferable that the cover sheet is waterproof and water vapor impermeable, and at the same time transparent so that colonies can be observed and counted through the cover sheet after culturing the microorganisms. As the cover sheet, for example, a polyolefin sheet such as polyethylene and polypropylene as exemplified in the base sheet, a plastic sheet such as polyester, polyamide, polystyrene, polycarbonate, and polyvinyl chloride can be used. In the microorganism culture sheet, if the substrate sheet and the cover film are transparent, they can be observed with the projection light from the back surface of the microorganism culture sheet, and can also be observed with the incident light from the side surface. That is, since colonies can be observed and counted from both the cover sheet side and the base sheet side, the range of selection of the observation method and the measurement method is widened. In view of workability such as opening and closing of the cover sheet, a polyester film and a polyolefin film are particularly preferable.
（５）枠層
本発明の微生物培養シートでは、前記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されていることが好ましい。枠層が形成されていると、被検液を培養層に接種し、カバーシートを被覆した場合に、被検液が枠層まで速やかに拡散されるため、培養層による被検液の吸水を待たずにカバーシートを被覆することができ、接種操作を短時間で行うことができる。また、枠層によって被検液の遺漏をより確実に防げ、接種時の作業効率を向上することできる。培養層にゲル化剤が含まれる場合には、被検液が枠層の内側にある培養層に吸水され、ゲル化剤が増粘し、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。また、培養層にゲル化剤が含まれない場合であっても、ポリビニルピロリドンが溶解し増粘するため、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。培養層とカバーシートとの密着性が優れると、カバーシートにコロニー形成のための層等を形成する必要がなく、コロニーの優れた視認性を確保することができる。
(5) Frame layer In the microorganism culture sheet of the present invention, it is preferable that a frame layer made of a hydrophobic resin is formed on the outer periphery of the culture layer. When the frame layer is formed, when the test solution is inoculated into the culture layer and covered with a cover sheet, the test solution is quickly diffused to the frame layer. The cover sheet can be covered without waiting, and the inoculation operation can be performed in a short time. In addition, leakage of the test liquid can be prevented more reliably by the frame layer, and the work efficiency at the time of inoculation can be improved. When the culture layer contains a gelling agent, the test solution is absorbed by the culture layer inside the frame layer, the gelling agent thickens, and the adhesion between the culture layer and the cover sheet causes the culture layer to Drying can be prevented. Moreover, even when the gelling agent is not contained in the culture layer, since the polyvinyl pyrrolidone dissolves and thickens, it is possible to prevent the culture layer from drying due to the adhesion between the culture layer and the cover sheet. When the adhesion between the culture layer and the cover sheet is excellent, it is not necessary to form a layer for colony formation on the cover sheet, and excellent visibility of the colonies can be ensured.
（６）粘着層
本発明の微生物培養シートでは、基材シートやカバーシートに粘着層を形成することができる。このような粘着層は、培養層を被覆したカバーシートを固定し、培養層の水分蒸発や汚染を防止する目的で配設され、基材シートを密封できればいかなる種類の粘着剤を用いてもよい。作業性を考えると基材シートとカバーシートとが再接着できる程度に、弱い粘着力を有する粘着剤が好ましい。例えば、ゴム系粘着剤やアクリル系粘着剤が好ましく、特に再剥離タイプ及び微粘着タイプのアクリル系粘着剤が好ましく用いられる。具体的には、ブチルアクリレートや２−エチルヘキシルアクリレート等のアルキルアクリレート（好ましくはアルキルの炭素数が２〜１２）１００質量部に対し、カルボキシル基や水酸基、アミノ基等の官能基を含有するモノマーを２〜１５質量部共重合させたポリマーに、粘着付与剤としてロジン、キシレン樹脂、フェノール樹脂等を加え、メラミン類、イソシアネート類、エポキシ等で架橋したもの等を使用することができる。また、粘着層はどのような形状でもよいが、基材シートとカバーシートとの接着部分に隙間がなく接着できるように配設されることが好ましい。
(6) Adhesive layer In the microorganism culture sheet of this invention, an adhesive layer can be formed in a base material sheet or a cover sheet. Such an adhesive layer is disposed for the purpose of fixing the cover sheet covering the culture layer and preventing moisture evaporation and contamination of the culture layer, and any kind of adhesive may be used as long as the base sheet can be sealed. . In consideration of workability, a pressure-sensitive adhesive having a weak adhesive strength is preferable to the extent that the base sheet and the cover sheet can be re-bonded. For example, a rubber adhesive and an acrylic adhesive are preferable, and a re-peeling type and a slightly adhesive type acrylic adhesive are particularly preferably used. Specifically, a monomer containing a functional group such as a carboxyl group, a hydroxyl group, or an amino group with respect to 100 parts by mass of an alkyl acrylate such as butyl acrylate or 2-ethylhexyl acrylate (preferably an alkyl having 2 to 12 carbon atoms). A rosin, xylene resin, phenol resin, or the like as a tackifier may be added to a copolymer obtained by copolymerization with 2 to 15 parts by mass and crosslinked with melamines, isocyanates, epoxies, or the like. The pressure-sensitive adhesive layer may have any shape, but it is preferable that the adhesive layer is disposed so that the adhesive portion between the base sheet and the cover sheet can be bonded without a gap.
（７）格子印刷層
本発明の微生物培養シートには、格子印刷層が積層されていてもよい。格子印刷は、着色剤、樹脂、溶剤等の選択範囲が広い点でグラビア印刷等が好ましい。枡目の大きさは１ｃｍ角程度が適当である。
(7) Lattice Print Layer A lattice print layer may be laminated on the microorganism culture sheet of the present invention. For the grid printing, gravure printing or the like is preferable because it has a wide selection range of colorant, resin, solvent and the like. The size of the mesh is about 1 cm square.
（８）微生物培養キット
本発明では、前記微生物培養シートと、特定成分を含む被検液とを組み合わせて、微生物培養キットとすることができる。
被検液に、培養層に添加することが望ましい成分（例えば、発色指示薬）を添加して培養することができる。特に、滅菌処理その他の工程で変質、変色、分解等を受けやすい成分を含む場合に、有効である。
(8) Microorganism culture kit In the present invention, a microorganism culture kit can be obtained by combining the microorganism culture sheet and a test solution containing a specific component.
A component (for example, a color indicator) that is desirably added to the culture layer can be added to the test solution and cultured. It is particularly effective when it contains components that are susceptible to alteration, discoloration, decomposition, etc. during sterilization and other processes.
（９）製造方法
（ｉ）培養層の形成
本発明の微生物培養シートにおける培養層は、上述のように、基材シートの上に培地液を所定のパターンに配置して乾燥することにより形成することができる。また、パターン形成の方法も、培地液を基材シートの予定した形状に塗布できるものであれば、特に制限はなく、印刷、塗布、塗工、噴霧等の任意の方法を用いることができる。好ましくは、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有させた培地液を調製し、該培地液を基材シートの上にパターン形成した後、前記培地液に含まれるアルコールを除去して培養層を形成する。
(9) Production method (i) Formation of culture layer As described above, the culture layer in the microorganism culture sheet of the present invention is formed by placing a medium solution in a predetermined pattern on a substrate sheet and drying it. be able to. Also, the pattern formation method is not particularly limited as long as the medium solution can be applied to the predetermined shape of the base material sheet, and any method such as printing, application, coating, spraying and the like can be used. Preferably, after preparing a medium solution containing a gelling agent, a nutrient component, a selective agent, a chromogenic enzyme substrate and a plasticizer in an alcohol solution of polyvinylpyrrolidone, and patterning the medium solution on a base sheet The alcohol contained in the medium solution is removed to form a culture layer.
微生物培養シートの製造方法では、基材シートと培養層との密着性、パターン形成の容易さ等の理由から、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液を使用することが好ましい。アルコールとしては、炭素数１〜５のアルコールを好適に使用することができる。例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、及びブタノールから選ばれる少なくとも１種を使用することができる。これらの中でも、メタノール、エタノール、又はイソプロピルアルコールが好ましい。従来は、栄養成分を溶解するために水やトルエン等の高沸点溶媒が使用されていたが、溶媒除去のために高温で加熱する必要があり、培養層に含まれる成分や基材の熱分解を招くおそれがあった。また、溶媒除去に過剰の熱エネルギーを使用する必要があり、コスト上昇の一因となり、また、溶媒除去時間も長くなるため生産効率低下の一因ともなっていた。本実施形態では、ポリビニルピロリドンを使用し、その溶媒として、低沸点である前記アルコールを使用することで、培地液に含まれる成分や基材の熱変性を回避し、並びに生産効率を向上することができる。なお、前記趣旨を損
なわない範囲で、アルコールにクロロホルム等の副溶媒を混合した溶媒を使用することもできる。
In the method for producing a microorganism culture sheet, it is preferable to use an alcohol solution of polyvinyl pyrrolidone for reasons such as adhesion between the base sheet and the culture layer and ease of pattern formation. As alcohol, a C1-C5 alcohol can be used conveniently. For example, at least one selected from methanol, ethanol, isopropyl alcohol, and butanol can be used. Among these, methanol, ethanol, or isopropyl alcohol is preferable. Conventionally, high-boiling solvents such as water and toluene have been used to dissolve nutrients, but it is necessary to heat at a high temperature to remove the solvent, and pyrolysis of the components and substrate contained in the culture layer There was a risk of inviting. In addition, it is necessary to use excessive heat energy for solvent removal, which contributes to an increase in cost, and also causes a decrease in production efficiency because the solvent removal time becomes longer. In this embodiment, polyvinyl pyrrolidone is used, and the alcohol having a low boiling point is used as a solvent thereof, thereby avoiding thermal denaturation of components and base materials contained in the medium solution and improving production efficiency. Can do. It should be noted that a solvent in which an alcohol and a secondary solvent such as chloroform are mixed can also be used within a range not impairing the above-mentioned purpose.
ポリビニルピロリドンを培地液の必須の成分とした理由は、前記したように濃度を調整することでゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤等を均一に分散させることができ、しかも、容易に粘度を調整することができるためである。これにより、培地液を容易にパターン形成できる。なお、ポリビニルピロリドンは、優れた成膜性と基材シートに対する密着性とを有するため、接着剤を使用することなく基材シートに培養層を形成することができ、接着剤による微生物の発育阻害を回避することができる。 The reason why polyvinylpyrrolidone is an essential component of the medium solution is that the gelling agent, nutrient component, selective agent, chromogenic enzyme substrate and plasticizer can be uniformly dispersed by adjusting the concentration as described above. Moreover, the viscosity can be easily adjusted. Thereby, pattern formation of a culture solution can be performed easily. Polyvinylpyrrolidone has excellent film-forming properties and adhesion to the substrate sheet, so that a culture layer can be formed on the substrate sheet without using an adhesive. Can be avoided.
ポリビニルピロリドンに対するアルコールの量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、１００質量部以上１００００質量部以下であることが好ましく、３００質量部以上２０００質量部以下であることがより好ましく、９００質量部以上１４００質量部以下であることが特に好ましい。 The amount of alcohol relative to polyvinylpyrrolidone is preferably 100 parts by mass or more and 10000 parts by mass or less, more preferably 300 parts by mass or more and 2000 parts by mass or less, and more preferably 900 parts by mass or more with respect to 100 parts by mass of polyvinylpyrrolidone. The amount is particularly preferably 1400 parts by mass or less.
培地液を構成するゲル化剤はパターン形成が可能であれば、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に溶解している必要はない。したがって、微生物培養シートの製造方法では、ゲル化剤を粉末で添加することができる。粉末で添加する場合のゲル化剤の平均粒子径は５〜５００μｍ、より好ましくは１０〜２００μｍである。平均粒子径が前記範囲にあれば、分散性に優れる。５００μｍを超えると分散性が低下し、パターン形成適性が損なわれる場合がある。ただし、これらを溶媒に溶解し、前記ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に混合して培地液としてもよい。 The gelling agent constituting the medium solution need not be dissolved in an alcohol solution of polyvinylpyrrolidone as long as pattern formation is possible. Therefore, in the method for producing a microorganism culture sheet, the gelling agent can be added as a powder. When added as a powder, the gelling agent has an average particle size of 5 to 500 μm, more preferably 10 to 200 μm. When the average particle diameter is in the above range, the dispersibility is excellent. If it exceeds 500 μm, the dispersibility may be lowered, and the pattern formation suitability may be impaired. However, these may be dissolved in a solvent and mixed with the polyvinylpyrrolidone alcohol solution to form a medium solution.
培地液におけるゲル化剤の含有量は、ポリビニルピロリドン１００質量部に対して、１００質量部以上６００質量部以下であることが好ましく、２５０質量部以上４００質量部以下であることがより好ましい。ゲル化剤の含有量が前記範囲であれば、被検液滴下の際の水分によって、増粘又はゲル化し、菌の育成に良好な粘度とすることができる。 The content of the gelling agent in the culture medium is preferably 100 parts by mass or more and 600 parts by mass or less, and more preferably 250 parts by mass or more and 400 parts by mass or less with respect to 100 parts by mass of polyvinylpyrrolidone. If the content of the gelling agent is in the above range, it can be thickened or gelled by the water under the test droplet, and can have a good viscosity for growing bacteria.
なお、ポリビニルピロリドンの皮膜は硬くもろい場合があるため、本発明では可塑剤としてポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールを添加する。本発明において、本発明の効果を阻害しない限り、エーテルエステル誘導体系可塑剤、プロピレングリコールやグリコール誘導体系可塑剤、グリコールエーテル誘導体系可塑剤、ポリヒドロキシカルボン酸誘導体系可塑剤、又はフタル酸誘導体系可塑剤等の他の可塑剤を添加してもよい。グリセリンやグリセリン誘導体系可塑剤は含まないことが望ましい。 In addition, since the polyvinyl pyrrolidone film may be hard and brittle, in the present invention, polyethylene glycol or 1,3-butylene glycol is added as a plasticizer. In the present invention, an ether ester derivative plasticizer, a propylene glycol or glycol derivative plasticizer, a glycol ether derivative plasticizer, a polyhydroxycarboxylic acid derivative plasticizer, or a phthalic acid derivative system unless the effect of the present invention is inhibited. You may add other plasticizers, such as a plasticizer. It is desirable not to contain glycerin or a glycerin derivative plasticizer.
微生物培養シートの製造方法では、前記培地液を使用してパターン形成するが、特に、前記培地液を使用し、ディスペンサーによる塗布等で好適に培養層を形成することができる。 In the method for producing a microorganism culture sheet, the medium solution is used to form a pattern. In particular, the medium solution can be used to suitably form a culture layer by coating with a dispenser or the like.
前記したように培養層は、２層以上の多層であってもよい。なお、本発明では、培養層が第１培養層と第２培養層とからなる２層である場合に、異なる方法でパターン形成を行ってもよい。例えば、第１培養層をディスペンサーで塗布してパターン形成し、第２培養層のパターン形成に関しては、噴霧等その他の方法を用いてもよい。 As described above, the culture layer may be a multilayer of two or more layers. In the present invention, when the culture layer is a two-layer composed of the first culture layer and the second culture layer, pattern formation may be performed by different methods. For example, the first culture layer may be applied with a dispenser to form a pattern, and other methods such as spraying may be used for pattern formation of the second culture layer.
本実施形態では、培地液を基材シート上にパターン形成した後に、培地液に含まれるアルコールを除去する。ポリビニルピロリドンにゲル化剤等を配合した培養層を使用することで、寒天培地と同様に微生物コロニーを観察及び計数することができ、かつ極めて優れた視認性を得ることができる。なお、ゲル化剤は、水溶性であるため水溶液として調製された後に基材に塗工されることが一般的である。しかし、ゲル化剤は水の除去に高温かつ長時間の加熱処理を行う必要があり、水溶液の調製時に、高い粘度のために気泡等が混入
する場合があった。本実施形態によれば、ゲル化剤等の粉末をポリビニルピロリドンのアルコール溶液に分散させるため、気泡の混入を回避することができ、水を使用していないため、乾燥を低温かつ短時間で行うことができる。また、ゲル化剤等は、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に分散しているだけで溶解していないため、培地液の粘度の上昇を防止することができ、これによって円滑なパターン形成を行うことができる。しかも、得られた培養層では、前記成分がポリビニルピロリドンで被覆されているので、被検液を接種するとポリビニルピロリドンが直ちに溶解し、前記成分が溶解又は吸水する。そのため、被検液の接種後、すぐにカバーシートで被覆することができる。また、ポリビニルピロリドンが溶解したり、ゲル化剤が含まれたりする場合には、それが増粘してカバーシートに密着するため、乾燥を防止しうると共に、極めて優れた視認性を確保することができる。
In the present embodiment, after the medium solution is patterned on the base sheet, alcohol contained in the medium solution is removed. By using a culture layer in which a gelling agent or the like is blended with polyvinylpyrrolidone, microbial colonies can be observed and counted in the same manner as the agar medium, and extremely excellent visibility can be obtained. In addition, since a gelatinizer is water-soluble, it is common to apply to a base material, after preparing as aqueous solution. However, the gelling agent needs to be subjected to heat treatment for a long time at a high temperature in order to remove water, and bubbles and the like may be mixed due to high viscosity when preparing an aqueous solution. According to this embodiment, since powders such as gelling agents are dispersed in an alcohol solution of polyvinyl pyrrolidone, air bubbles can be avoided and water is not used, so drying is performed at a low temperature and in a short time. be able to. Further, since the gelling agent or the like is only dispersed in the polyvinylpyrrolidone alcohol solution but not dissolved, it is possible to prevent an increase in the viscosity of the medium solution, thereby enabling smooth pattern formation. . Moreover, in the obtained culture layer, since the above components are coated with polyvinyl pyrrolidone, when the test solution is inoculated, polyvinyl pyrrolidone dissolves immediately and the above components dissolve or absorb water. Therefore, it can be covered with a cover sheet immediately after inoculation with the test solution. Also, when polyvinylpyrrolidone dissolves or contains a gelling agent, it thickens and adheres closely to the cover sheet, thus preventing drying and ensuring extremely excellent visibility. Can do.
微生物培養シートにおいて、特定成分層は、例えば塗布方法は、全面塗布であっても、パターン形成であってもよい。パターン形成の場合には、培養層の形成と同様に、印刷、塗布、塗工、噴霧等であってもよい。 In the microorganism culture sheet, the specific component layer may be applied, for example, on the entire surface or pattern formation. In the case of pattern formation, printing, application, coating, spraying, and the like may be performed in the same manner as the formation of the culture layer.
培養層の乾燥は、培地液に含まれる前記アルコールを除去できればよく、温度、圧力等、従来公知の方法に準じて乾燥することができる。 The culture layer only needs to be able to remove the alcohol contained in the medium solution, and can be dried according to conventionally known methods such as temperature and pressure.
基材シートの上に形成する培養層の厚さは、乾燥後において５０〜１０００μｍであることが好ましく、２００〜６００μｍであることがより好ましい。また、塗布量は、乾燥後において５〜４００ｇ／ｍ２であることが好ましく、１００〜３００ｇ／ｍ２であることがより好ましい。前記範囲で、菌の発育に最適な粘度の培養層とすることができる。 The thickness of the culture layer formed on the base sheet is preferably 50 to 1000 μm, more preferably 200 to 600 μm after drying. Moreover, it is preferable that it is 5-400 g / m < 2 > after drying, and, as for an application quantity, it is more preferable that it is 100-300 g / m < 2 >. Within the above range, the culture layer can have a viscosity that is optimal for the growth of bacteria.
（ｉｉ）枠層の形成
本発明の微生物培養シートは、基材シートの表面、かつ培養層の外周に枠層を形成してもよい。枠層は、疎水性樹脂を用いて形成することができる。なお、枠層の製造方法は特に問わない。あらかじめ枠層が形成された基材シートを使用することもできる。
(Ii) Formation of frame layer The microorganism culture sheet of the present invention may form a frame layer on the surface of the base material sheet and on the outer periphery of the culture layer. The frame layer can be formed using a hydrophobic resin. In addition, the manufacturing method in particular of a frame layer is not ask | required. A base sheet in which a frame layer is formed in advance can also be used.
枠層が形成された基材シートとしては、少なくとも疎水性樹脂を表面に有する基材シートであって、その疎水性樹脂の部分がエンボス加工されることにより、枠の形状に凸部が形成されたものが挙げられる。そして、前記凸部の内側に培養層を形成すれば、微生物培養シートを製造することができる。また、培養層を形成する箇所を凹状にエンボス加工し、凹部の外周に形成される凸部を枠層とすることもできる。 The base sheet on which the frame layer is formed is a base sheet having at least a hydrophobic resin on the surface, and a convex portion is formed in the shape of the frame by embossing the hydrophobic resin portion. Can be mentioned. And if a culture layer is formed inside the said convex part, a microorganisms culture sheet can be manufactured. Moreover, the location which forms a culture layer can be embossed in concave shape, and the convex part formed in the outer periphery of a recessed part can also be used as a frame layer.
（ｉｉｉ）カバーシートの固設
本発明の微生物培養シートは、培養層に被検液を接種した後にカバーシートで培養層を被覆し、これを培養するため、カバーシートの一部が基材シートに固設されていることが好ましい。ただし、直接スタンプや拭き取り試験等の場合、カバーシートが無いことで作業効率が向上する場合には、カバーシートを取り除いて使用してもよい。
(Iii) Fixing of the cover sheet The microorganism culture sheet of the present invention covers the culture layer with the cover sheet after inoculating the test solution on the culture layer and cultures it, so that a part of the cover sheet is a base sheet. It is preferable that it is fixed to. However, in the case of a direct stamp, a wiping test, or the like, if the work efficiency is improved by the absence of the cover sheet, the cover sheet may be removed and used.
カバーシートと基材シートとが同一部材で構成される場合には、別個に作成したカバーシートを基材シートにヒートシールやラミネート接着、その他によって固設してもよいが、カバーシートと基材シートとを同質の材料を使用し、図９（ａ）の展開図、図９（ｂ）の断面図に示すように基材シート１０とカバーシート４０とを連設したまま基材シート１０に枠層２０と培養層３０とを形成し、カバーシート４０を折り曲げて微生物培養シートを形成してもよい。図９（ｃ）にその断面図を示す。この方法によれば、カバーシートに特定成分層３０’や粘着層５０を形成する場合でも、基材シート１０とカバーシート４０が連設されているため、基材シート１０の上の培養層３０と対向する位置に正確かつ簡便に特定成分層３０’を形成することができる。
When the cover sheet and the base sheet are composed of the same member, the cover sheet prepared separately may be fixed to the base sheet by heat sealing, laminating, or the like. The same material is used for the sheet, and the
また、図１０及び図１１の横断面図に示すように、カバーシート４０と基材シート１０とを異なる部材で構成し、カバーシート４０と、培養層３０を形成した基材シート１０とを、両面接着テープ６０等で張り合わせてもよい。
Moreover, as shown in the cross-sectional views of FIGS. 10 and 11, the
図１２及び図１３に、カバーシート４０に格子印刷が形成され、カバーシート４０と培養層３０を形成した基材シート１０とが端部で接着された微生物培養シートの外観斜視図を示す。図１３では、培養層３０の周囲に枠層２０が形成されている。
12 and 13 are external perspective views of the microorganism culture sheet in which grid printing is formed on the
微生物培養シートは、ガンマ線照射やエチレンオキサイドガス滅菌等の滅菌を施し、微生物培養シートの製品とすることができる。微生物培養シートは、含まれる微生物栄養成分の種類や、使用する基材シート、カバーシートの通気性その他に応じて各種の微生物の培養を行うことできる。 The microorganism culture sheet can be sterilized by gamma ray irradiation or ethylene oxide gas sterilization to obtain a product of the microorganism culture sheet. The microorganism culture sheet can cultivate various microorganisms according to the type of microbial nutrients contained, the base sheet used, the air permeability of the cover sheet, and the like.
また、本発明の微生物培養シートを用いて、試料中に含まれる大腸菌群を効果的に検出することができる。すなわち、本発明の微生物培養シートは、β−ガラクトシダーゼ活性による発色反応において、大腸菌群に対して優れた検出性能を有するため、大腸菌群の検出用ツールとして有用である。また、同様に、本発明の微生物培養シートを用いて、試料中に含まれる黄色ブドウ球菌を効果的に検出することができる。すなわち、本発明の微生物培養シートは、α−グルコシダーゼ活性による発色反応において、黄色ブドウ球菌に対して優れた検出性能を有するため、黄色ブドウ球菌の検出用ツールとして有用である。 Moreover, coliform bacteria contained in a sample can be effectively detected using the microorganism culture sheet of the present invention. That is, the microorganism culture sheet of the present invention has an excellent detection performance for coliforms in a color development reaction by β-galactosidase activity, and thus is useful as a tool for detecting coliforms. Similarly, Staphylococcus aureus contained in a sample can be effectively detected using the microorganism culture sheet of the present invention. That is, since the microorganism culture sheet of the present invention has an excellent detection performance for Staphylococcus aureus in the color development reaction by α-glucosidase activity, it is useful as a tool for detecting Staphylococcus aureus.
そこで、本発明の一形態は、少なくとも１種の細菌を含む試料中の大腸菌群を検出するための方法であって、本発明の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも１部を接種する工程と、前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、を含む方法である。 Therefore, one aspect of the present invention is a method for detecting coliform bacteria in a sample containing at least one kind of bacteria, wherein at least a part of the sample is added to the culture layer of the microorganism culture sheet of the present invention. The method includes a step of inoculating and a step of culturing bacteria inoculated on the culture layer.
また、本発明の一形態は、少なくとも１種の細菌を含む試料中の黄色ブドウ球菌を検出するための方法であって、本発明の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも１部を接種する工程と、前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、を含む方法である。 One embodiment of the present invention is a method for detecting Staphylococcus aureus in a sample containing at least one kind of bacteria, wherein the culture layer of the microorganism culture sheet of the present invention includes at least a part of the sample. And a step of culturing bacteria inoculated on the culture layer.
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, these Examples do not restrict | limit this invention at all.
（実施例１）
メタノール２７６ｇにポリビニルピロリドン２４ｇを溶解し、ポリビニルピロリドンのメタノール溶液を調製した。このポリビニルピロリドンのメタノール溶液に、ゲル化剤としてのグアーガム粉末７５．８ｇ、栄養成分としてのトリプトン９．３ｇ、酵母エキス０．９ｇ、ピルビン酸ナトリウム０．３５ｇ、Ｌ−トリプトファン０．３５ｇ、塩化ナトリウム１．７ｇ、リン酸二水素ナトリウム０．１８ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．９５ｇ、硝酸カリウム０．１８ｇ、選択剤としてのラウリル硫酸ナトリウム０．０４ｇ、発色酵素基質としてのＸ−ｇａｌ０．０４ｇ、可塑剤としてのポリエチレングリコール１０ｇ、β−ガラクトシダーゼ発現誘導物質としてのＩＰＴＧ０．０４ｇを添加して培地液を調製した。なお、使用した材料の入手先は以下の通りである。
Example 1
24 g of polyvinyl pyrrolidone was dissolved in 276 g of methanol to prepare a methanol solution of polyvinyl pyrrolidone. In this methanol solution of polyvinyl pyrrolidone, 75.8 g of guar gum powder as a gelling agent, 9.3 g of tryptone as a nutritional component, 0.9 g of yeast extract, 0.35 g of sodium pyruvate, 0.35 g of L-tryptophan, sodium chloride 1.7 g, sodium dihydrogen phosphate 0.18 g, disodium hydrogen phosphate 0.95 g, potassium nitrate 0.18 g, sodium lauryl sulfate 0.04 g as a selective agent, X-gal 0.04 g as a chromogenic enzyme substrate, plasticity A medium solution was prepared by adding 10 g of polyethylene glycol as an agent and 0.04 g of IPTG as a β-galactosidase expression inducer. In addition, the acquisition place of the used material is as follows.
・ポリビニルピロリドン（日本触媒社製、商品名「ポリビニルピロリドン Ｋ−９０」）・グアーガム粉末（三晶社製、商品名「ネオビスコ Ｇ」、２００メッシュタイプ）
・トリプトン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品
名「ＢＡＣＴ ＴＲＹＰＴＯＮＥ」）
・酵母エキス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社製、商品名「ＹＥＡＳＴ ＥＸＴＲＡＣＴ」）
・ピルビン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
・Ｌ−トリプトファン（和光純薬工業社製）
・塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）
・リン酸二水素ナトリウム（和光純薬工業社製）
・リン酸水素二ナトリウム（和光純薬工業社製）
・硝酸カリウム（和光純薬工業社製）
・ラウリル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）
・Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社製）
・ポリエチレングリコール（和光純薬工業社製、ポリエチレングリコール６００、和光一級）
・ＩＰＴＧ（和光純薬工業社製）
・ Polyvinylpyrrolidone (made by Nippon Shokubai Co., Ltd., trade name “Polyvinylpyrrolidone K-90”) ・ Guar gum powder (made by Sanki Co., Ltd., trade name “Neovisco G”, 200 mesh type)
・ Tryptone (Becton, Dickinson and Company, trade name “BACT TRYPTONE”)
-Yeast extract (Becton, Dickinson and Company, trade name “YEAST EXTRACT”)
・ Sodium pyruvate (Wako Pure Chemical Industries)
・ L-tryptophan (Wako Pure Chemical Industries)
・ Sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries)
・ Sodium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ Disodium hydrogen phosphate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ Potassium nitrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
・ Sodium lauryl sulfate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside, manufactured by BIOSYTHH)
・ Polyethylene glycol (Wako Pure Chemical Industries, polyethylene glycol 600, Wako first grade)
・ IPTG (Wako Pure Chemical Industries)
次に、この培地液をポリエチレンテレフタラートフィルム（帝人デュポン社製、商品名「テイジンテトロンフィルム」）の上に所定のパターンに配置した後、５０℃で１５分間乾燥させ、培養層を形成した。乾燥後の培養層の厚さは、約２５０μｍであった。次いで、ディスペンサーを用いて、ＵＶ硬化インク（十条ケミカル社製、商品名「レイキュアーＧＡ ４１００−２」）を幅１．０ｍｍ、高さ７５０μｍ、直径５２ｍｍの円状に塗布した。続いて、水銀ランプを用いて積算光量２５０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射し、ＵＶ硬化インクを硬化させ、培養層の周りに疎水性樹脂を用いて枠層を形成した。 Next, this medium solution was placed in a predetermined pattern on a polyethylene terephthalate film (trade name “Teijin Tetron Film” manufactured by Teijin DuPont), and then dried at 50 ° C. for 15 minutes to form a culture layer. The thickness of the culture layer after drying was about 250 μm. Next, using a dispenser, UV curable ink (manufactured by Jujo Chemical Co., Ltd., trade name “Recure GA 4100-2”) was applied in a circular shape having a width of 1.0 mm, a height of 750 μm, and a diameter of 52 mm. Subsequently, an ultraviolet ray having an accumulated light amount of 250 mJ / cm 2 was irradiated using a mercury lamp to cure the UV curable ink, and a frame layer was formed using a hydrophobic resin around the culture layer.
そして、カバーシート（東セロ社製、ＯＰＰフィルム、型番「ＯＰ Ｕ−１（片面コロナ放電処理）」、厚み：４０μｍ）を、前記ポリエチレンテレフタラートフィルムの上に積層し、端部を接着した後、γ線で滅菌して、微生物培養シート（１）を作製した。 And, after laminating a cover sheet (manufactured by Tosero Co., Ltd., OPP film, model number “OP U-1 (single-sided corona discharge treatment)”, thickness: 40 μm) on the polyethylene terephthalate film and bonding the ends, Sterilized with gamma rays to prepare a microorganism culture sheet (1).
（実施例２）
ポリエチレングリコール１０ｇの代わりに、１，３−ブチレングリコール（和光純薬工業社製）１０ｇを用いて培地液を調製したこと以外は、実施例１と同様にして微生物培養シート（２）を作製した。
(Example 2)
A microorganism culture sheet (2) was prepared in the same manner as in Example 1 except that 10 g of 1,3-butylene glycol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used instead of 10 g of polyethylene glycol. .
（比較例１）
ポリエチレングリコール１０ｇの代わりに、グリセリン（阪本薬品工業社製）１０ｇを用いて培地液を調製したこと以外は、実施例１と同様にして、微生物培養シート（３）を作製した。
(Comparative Example 1)
A microorganism culture sheet (3) was produced in the same manner as in Example 1, except that 10 g of glycerin (manufactured by Sakamoto Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) was used instead of 10 g of polyethylene glycol.
「評価」
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）又はＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）（両方とも大腸菌群に含まれる）を液体培地（ＴＲＹＰＴＩＣ ＳＯＹ ＢＲＯＴＨ）にて３７℃で２４時間振盪培養した。そして、得られた被検液のそれぞれを菌数が１０２／ｍｌとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、ＴＴＣを添加して、２つの培養試験用被検液をそれぞれ調製した。これらの培養試験用被検液を、微生物培養シート（１）〜（３）の培養層の上に１ｍｌずつそれぞれ接種し、それらの上にカバーシートを乗せて、被検液を培養層全体に広げた。その後、約１分間静置してゲルを形成させ、６つの培養試験用サンプルを得た。得られた培養試験用サンプルを３７℃で４８時間培養した。そして、培養後に発生したコロニーについて発色の有無を確認した。培養後の培養試験用サンプルの写真を図１４〜１６にそれぞれ示す。なお、図１４は実施例１で作製した微生物培養シート（１）を用いた培養試験用サンプルを示し
、図１４（Ａ）はＥ．ｃｏｌｉの被検液を接種した培養試験用サンプル、図１４（Ｂ）はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの被検液を接種した培養試験用サンプルを示す。図１５は実施例２で作製した微生物培養シート（２）を用いた培養試験用サンプルを示し、図１５（Ａ）はＥ．ｃｏｌｉの被検液を接種した培養試験用サンプル、図１５（Ｂ）はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの被検液を接種した培養試験用サンプルを示す。図１６は比較例１で作製した微生物培養シート（３）を用いた培養試験用サンプルを示し、図１６（Ａ）はＥ．ｃｏｌｉの被検液を接種した培養試験用サンプル、図１６（Ｂ）はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの被検液を接種した培養試験用サンプルを示す。
"Evaluation"
Escherichia coli (ATCC 25922) or Klebsiella
pneumoniae (ATCC13883) (both included in the coliform group) was cultured with shaking in a liquid medium (TRYPTIC SOY BROTH) at 37 ° C. for 24 hours. Then, each of the obtained test solutions was diluted with sterile physiological saline so that the number of bacteria was 10 2 / ml, and TTC was added to prepare two test solutions for culture test. 1 ml of each of these test liquids for culture test is inoculated on the culture layers of the microorganism culture sheets (1) to (3), and a cover sheet is placed on each of the culture layers. Spread out. Then, it left still for about 1 minute, the gel was formed, and six samples for culture tests were obtained. The obtained sample for culture test was cultured at 37 ° C. for 48 hours. And the presence or absence of color development was confirmed about the colony which generate | occur | produced after culture | cultivation. Photographs of culture test samples after culture are shown in FIGS. 14 shows a sample for culture test using the microorganism culture sheet (1) prepared in Example 1, and FIG. A culture test sample inoculated with a test solution of E. coli, FIG. The sample for culture | cultivation tests which inoculated the test liquid of pneumoniae is shown. FIG. 15 shows a culture test sample using the microorganism culture sheet (2) prepared in Example 2, and FIG. A sample for a culture test inoculated with a test solution of E. coli, FIG. The sample for culture | cultivation tests which inoculated the test liquid of pneumoniae is shown. FIG. 16 shows a sample for culture test using the microorganism culture sheet (3) prepared in Comparative Example 1, and FIG. A sample for culture test inoculated with a test solution of E. coli, FIG. The sample for culture | cultivation tests which inoculated the test liquid of pneumoniae is shown.
可塑剤としてポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールが含まれている微生物培養シート（１）又は（２）（実施例１及び２）では、図１４又は１５に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）の両方でＸ−Ｇａｌによる発色が確認された。しかし、可塑剤としてグリセリンが含まれている微生物培養シート（３）（比較例１）では、図１６に示されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）では発色が確認されるものの、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＡＴＣＣ１３８８３）では発色が確認されなかった。比較例１の結果より、グリセリンを用いると、大腸菌群の中でもβ−ガラクトシダーゼ基質による発色反応を確認できない菌がいることがわかる。そして、意外にも、グリセリンの代わりにポリエチレングリコール又は１，３−ブチレングリコールを可塑剤として用いることにより、グリセリンを用いた場合では発色が確認できない菌であっても、β−ガラクトシダーゼ基質による発色反応を確認できることがわかる。 In the microorganism culture sheet (1) or (2) (Examples 1 and 2) containing polyethylene glycol or 1,3-butylene glycol as a plasticizer, as shown in FIG. coli (ATCC 25922) and K.I. In both pneumoniae (ATCC 13883), color development by X-Gal was confirmed. However, in the microorganism culture sheet (3) (Comparative Example 1) containing glycerin as a plasticizer, as shown in FIG. Although color development is confirmed in E. coli (ATCC 25922), K. No color development was confirmed with pneumoniae (ATCC 13883). From the results of Comparative Example 1, it can be seen that when glycerin is used, there are bacteria in the E. coli group that cannot confirm the coloring reaction by the β-galactosidase substrate. Surprisingly, by using polyethylene glycol or 1,3-butylene glycol as a plasticizer instead of glycerin, even when the glycerin is used, color development reaction with β-galactosidase substrate is not possible even when the color is confirmed. You can see that.
以下の試験例では、α−グルコシダーゼ活性又はホスファターゼ活性を利用した発色反応試験において、グリセリンを含む培養層を用いた場合に発色反応が得られない菌がいるかどうか、また、グリセリンの代わりにポリエチレングリコールを用いた場合に発色反応が得られるかどうかについて、寒天培地にて簡易的に調べた。 In the following test examples, in the color reaction test using α-glucosidase activity or phosphatase activity, there is a bacterium that does not produce a color reaction when using a culture layer containing glycerin, and polyethylene glycol instead of glycerin. Whether or not a color development reaction was obtained when using was examined in a simple manner on an agar medium.
（参考例１）
トリプトンを４．０ｇ／ｌ、ポリエチレングリコールを１８．７ｇ／ｌ、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを０．１ｇ／ｌ、及び寒天を１５．０ｇ／ｌ含む培地液を調製した。この培地液をオートクレーブで滅菌した後、シャーレに広げて固め、寒天培地（１）を作製した。
(Reference Example 1)
A medium solution containing tryptone 4.0 g / l, polyethylene glycol 18.7 g / l, 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside 0.1 g / l, and agar 15.0 g / l was prepared. . This medium solution was sterilized by an autoclave and then spread and hardened in a petri dish to prepare an agar medium (1).
（参考例２）
ポリエチレングリコールを寒天培地液に添加しなかったこと以外は、参考例１と同様にして、寒天培地（２）を作製した。
(Reference Example 2)
An agar medium (2) was prepared in the same manner as in Reference Example 1 except that polyethylene glycol was not added to the agar medium solution.
（参考例３）
４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド０．１ｇ／ｌの代わりに、ホスファターゼの発色酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ホスフェイトを０．１ｇ／ｌの濃度で寒天培地液に添加し、かつポリエチレングリコール１８．７ｇ／ｌの代わりにグリセリンを１８．７ｇ／ｌの濃度で寒天培地液に添加したこと以外は、参考例１と同様にして、寒天培地（３）を作製した。
(Reference Example 3)
Instead of 0.1 g / l 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-phosphate, a chromogenic enzyme substrate for phosphatase, at a concentration of 0.1 g / l In the same manner as in Reference Example 1 except that glycerin was added to the agar medium at a concentration of 18.7 g / l instead of polyethylene glycol 18.7 g / l. 3) was produced.
（比較例２）
ポリエチレングリコール１８．７ｇ／ｌの代わりにグリセリンを１８．７ｇ／ｌの濃度で寒天培地液に添加したこと以外は、参考例１と同様にして、寒天培地（４）を作製した。
(Comparative Example 2)
An agar medium (4) was prepared in the same manner as in Reference Example 1, except that glycerin was added to the agar medium solution at a concentration of 18.7 g / l instead of polyethylene glycol 18.7 g / l.
「評価」
α−グルコシダーゼ活性を有する菌として、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９２３）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２５９０４）、及びＳ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ１３２７６）を使用した。これらの３種の菌を液体培地（ＴＲＹＰＴＩＣ ＳＯＹ ＢＲＯＴＨ）にて３７℃で２４時間振盪培養した。そして、得られた被検液を菌数が１０２／ｍｌとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、３つの培養試験用被検液をそれぞれ調製した。この培養試験用被検液を、寒天培地（１）〜（４）の上に０．１ｍｌずつそれぞれ接種し、コンラージ棒を用いて塗抹後、培養試験用サンプルを得た。得られた培養試験用サンプルを３５℃で４８時間培養した。表１に発色反応の結果を示す。なお、表１において、○はα−グルコシダーゼ基質又はホスファターゼ基質による発色反応が確認されたことを示す。×はα−グルコシダーゼ基質による発色反応が確認されなかったことを示す。
"Evaluation"
As a bacterium having α-glucosidase activity, aureus (ATCC 25923), S.A. aureus (ATCC 25904), and S. aureus. aureus (ATCC 13276) was used. These three types of bacteria were cultured with shaking in a liquid medium (TRYPTIC SOY BROTH) at 37 ° C. for 24 hours. Then, the obtained test solution was diluted with sterilized physiological saline so that the number of bacteria was 10 2 / ml, and three test solutions for culture test were prepared. Each 0.1 ml of this test liquid for culture test was inoculated on each agar medium (1) to (4) and smeared using a conage bar to obtain a sample for culture test. The obtained sample for culture test was cultured at 35 ° C. for 48 hours. Table 1 shows the results of the color development reaction. In Table 1, o indicates that a color development reaction with an α-glucosidase substrate or a phosphatase substrate was confirmed. X indicates that the color development reaction by the α-glucosidase substrate was not confirmed.
比較例２では、可塑剤としてグリセリンを含む場合、α−グルコシダーゼ基質による発色反応は確認されなかった。また、可塑剤を添加しなかった参考例２では、α−グルコシダーゼ基質による発色反応が確認された。これにより、通常ではα−グルコシダーゼ基質による発色反応により検出できる菌において、グリセリンの存在により、発色反応が確認できなくなる菌が存在することがわかる。また、可塑剤としてポリエチレングリコールを用いた参考例１では、試験したすべての菌についてα−グルコシダーゼ基質による発色反応を確認できた。なお、参考例３より、可塑剤としてグリセリンを用いた場合であっても、ホスファターゼ基質による発色反応は確認された。 In Comparative Example 2, when glycerin was included as a plasticizer, a color reaction by the α-glucosidase substrate was not confirmed. Further, in Reference Example 2 in which no plasticizer was added, a coloring reaction with an α-glucosidase substrate was confirmed. As a result, it can be seen that in bacteria that can usually be detected by a color reaction with an α-glucosidase substrate, there are bacteria in which the color reaction cannot be confirmed due to the presence of glycerin. Moreover, in Reference Example 1 using polyethylene glycol as the plasticizer, it was possible to confirm the color development reaction with the α-glucosidase substrate for all the tested bacteria. In addition, from Reference Example 3, even when glycerin was used as the plasticizer, a color reaction by the phosphatase substrate was confirmed.
本発明の微生物培養シートは、例えば、菌の検出や菌数検査等に用いることができる。 The microorganism culture sheet of the present invention can be used for, for example, detection of bacteria or inspection of the number of bacteria.
１０ 基材シート
２０ 枠層
３０ 培養層
３０’ 特定成分層
４０ カバーシート
５０ 粘着層
６０ 両面接着テープ
DESCRIPTION OF
Claims (9)
前記培養層が、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、栄養成分、選択剤、発色酵素基質及び可塑剤を含有し、
前記発色酵素基質が、β−ガラクトシダーゼにより分解される発色酵素基質又はα−グルコシダーゼにより分解される発色酵素基質であり、
前記可塑剤が、ポリエチレングリコール及び１，３−ブチレングリコールから選択される少なくとも１つである微生物培養シート。 A microorganism culture sheet having a base sheet, a culture layer formed on the base sheet, and a cover sheet covering the culture layer,
The culture layer contains polyvinylpyrrolidone, a gelling agent, a nutrient component, a selective agent, a chromogenic enzyme substrate and a plasticizer,
The chromogenic enzyme substrate is a chromogenic enzyme substrate that is degraded by β-galactosidase or a chromogenic enzyme substrate that is degraded by α-glucosidase,
The microorganism culture sheet, wherein the plasticizer is at least one selected from polyethylene glycol and 1,3-butylene glycol.
請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。 A method for detecting coliforms in a sample comprising at least one bacterium, comprising:
Inoculating the culture layer of the microorganism culture sheet according to any one of claims 1 to 7 with at least a part of the sample;
Culturing bacteria inoculated on the culture layer;
Including methods.
請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された細菌を培養する工程と、
を含む方法。
A method for detecting S. aureus in a sample comprising at least one bacterium, comprising:
Inoculating the culture layer of the microorganism culture sheet according to any one of claims 1 to 7 with at least a part of the sample;
Culturing bacteria inoculated on the culture layer;
Including methods.
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