JP6369330B2 - センサーチップおよびこれを用いたspfs免疫蛍光測定システム - Google Patents
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Description
被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンIと特異的に結合可能な第1の捕捉手段と、心筋トロポニンIに対する自己抗体と結合可能な第2の捕捉手段とを備えている、SPFS免疫蛍光測定用のセンサーチップである。
また、上述した目的のうち、もう一方を実現するために、本発明の一側面を反映したSPFS免疫蛍光測定システムは、上記センサーチップを有し、
心筋トロポニンIの検出と、心筋トロポニンI自己抗体の検出とを同一の検体に対して、並行して行う、SPFS免疫蛍光測定システムである。
本発明に係るセンサーチップ10は、被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンIと特異的に結合可能な第1の捕捉手段1と、心筋トロポニンI自己抗体に結合する分子である第2の捕捉手段2と、心筋トロポニンIまたはその部分断片である第3の捕捉手段とを有し、同一検体に対する心筋トロポニンIおよび心筋トロポニンI自己抗体の検出に用いることができる(図1〜図7参照)。
ここで、前記検体の溶液を流通させる流路3が形成され、該流路3に第1の捕捉手段1と第2の捕捉手段2とが固定されてもよい。
また、第1の捕捉手段1と第2の捕捉手段2とが前記流路3の流通方向に沿って直列に配置されていてもよい。
また、前記流路3において第1の捕捉手段1の下流側に第2の捕捉手段2が固定されていてもよい。
また、本発明に係るSPFS免疫蛍光測定システム100は、上記センサーチップ10を有し、同一の検体について、心筋トロポニンIの検出と、心筋トロポニンI自己抗体の検出とを並行して行うものである(図1〜図7参照)。
ここで、心筋トロポニンI自己抗体の検出は、心筋トロポニンI検出後の使用済みの検体を用いて行ってもよい。
本発明に係るセンサーチップ10は、被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンIと特異的に結合可能な第1の捕捉手段と、心筋トロポニンIに対する自己抗体と結合可能な第2の捕捉手段とを備えており、
心筋トロポニンI検出後の使用済みの被験者由来の検体を用いて、心筋トロポニンI自己抗体の検出に用いることができる。
図1に、本発明に係るSPFS免疫蛍光測定システムの一例を示す。
SPFS免疫蛍光測定システム100は、図1に示すように、センサーチップ10と、SPFS装置10Aとを有している。
センサーチップ10は、図1に示すように、後述するSPFS装置10Aに着脱可能に搭載されてSPFS免疫蛍光測定に用いられるものである。
センサーチップ10は、図1に示すように、SPFS免疫蛍光測定時の励起光を通過させるための透明支持体5と、透明支持体5の上に形成された金属膜4と、金属膜4を一部として検体の溶液等を流通させるための流路3と、金属膜4の表面に設けられて、心筋トロポニンIを検出するための第1の捕捉手段1と、心筋トロポニンI自己抗体を検出するための第2の捕捉手段2とを有し、さらに任意に第3の捕捉手段等を有する。
透明支持体5は、センサーチップ10の構造を支持するために用いられる。透明支持体5は、図1に示すように、金属膜4形成用の平面部5aと、プリズム部5b等とを有している。この平面部5aとプリズム部5bとは別体であっても一体であってもよい。
樹脂製のものとして、アクリル系、ポリカーボネート(PC),ポリメチルメタクリレート(PMMA)、シクロオレフィンポリマー(COP)などの光学樹脂製のものを用いることができる。さらにセラミックスなどの各種の無機物、天然ポリマー、二酸化ケイ素(SiO2)、二酸化チタン(TiO2)を含むものも用いることができる。
金属膜4は、全反射条件でプリズム部5bの内部に入射した励起光L1が金属膜4と平面部5aとの界面で全反射することにより生じるエバネッセント波(増強電場)を増幅するための部材である。
センサーチップ10の流路3は、被験者(ヒト、イヌ、ネコ等)から採取した血清等の検体を必要に応じて後述の前処理をした検体溶液、または洗浄液等を流通させるための流路である。
また、センサーチップ10の流路3は、センサーチップ10を左右対称(図1において)に形成する等、流路3の上流側と下流側とを反転可能な構成としてもよい。これは、図2Aに示すような直列の流路3の場合、第1捕捉手段1による検出を優先するか、第2捕捉手段2による検出を優先するかをその都度選択できるからである。
(第1の捕捉手段)
第1の捕捉手段1は、心筋トロポニンIに特異的に結合する分子である。なお、「特異的に結合する」という用語は、当業界で公知の手段によって測定したときに、特異的部位において結合する分子同士(例えば、一般的に2つのポリペプチド、1つのポリペプチドと核酸分子、または、2つの核酸分子)が他の分子よりも優先的に結合していることを表す。
第1の捕捉手段1が部分断片である場合、一般に心筋トロポニンI(cTnI)に結合可能なエピトープ(cTnIの特異的かつ保存性の高いN末端側の配列(aa 13〜36:PAPAPIRRRSSNYRAYATEPHAKK)やcTnIの保存性の高い中間部分の配列(aa 30−110)に結合可能なエピトープ)を有しているものが用いられる。
なお、左の数値範囲はアミノ酸塩基の位置を示す。右はエピトープの識別記号を示す。各エピトープはカンマで区切られている。)の1つまたは2つ以上を組み合わせて用いてもよいが、特異性を考慮する必要がある。
心筋トロポニンI抗体は、各製薬会社(フナコシ社等)から購入することができる(製品名「Anti−Troponin−I,Cardiac Human」等)。
第2の捕捉手段2は、心筋トロポニンI自己抗体に結合する分子である。第2の捕捉手段2としては、心筋トロポニンI自己抗体結合抗体、該抗体の部分断片等を用いることができる。心筋トロポニンI自己抗体結合抗体としては、Fab領域とFc領域を認識して結合する抗ヒト抗体や、後述する所定の方法で得られた抗体等が挙げられる。
第2捕捉手段2の入手方法については、第2捕捉手段2がヒト抗体のFc領域を認識して結合する抗ヒト抗体の場合、例えば、「Goat Anti−Human IgG,Fc Fragment Specific」(メルク−ミリポア社)等を購入して本発明に用いることができる。Fab領域のみの場合や、Fab領域およびFc領域の双方を認識するものも同様に購入して本発明に用いることができる。
上述した心筋トロポニンIのエピトープを1つまたは2つ以上有する心筋トロポニンIの断片は、検出感度を上げるために、より少ない数のエピトープを含むものが好ましい。
心筋トロポニンIまたはその部分断片を第3捕捉手段として、流路3に固定してもよい。第3捕捉手段は、第2捕捉手段よりも上流側に固定される。この理由は、第2捕捉手段に捕捉されても検出されない遊離の心筋トロポニンI自己抗体を第2捕捉手段の手前で極力除去するためである。なお、第3の捕捉手段は心筋トロポニンI自体であるため、第1,2捕捉手段と組み合わせて使用する2次抗体により検出されることから、スポット位置設定手段で第3のスポットに設定する必要がある。
心筋トロポニンIの部分断片の入手方法については、例えば、上述したように全長の心筋トロポニンIをプロテアーゼ処理して入手することができる。または、心筋トロポニンI(cTnI)をコードするポリヌクレオチドの塩基配列が公知であるので、配列情報をGenBankなどから取得した後、配列の一部を除去した遺伝子断片を作成し、これを発現ベクターに組み込んだ上で、タンパク質を産生させる宿主に形質転換して宿主を培養し、培養された宿主から産生された目的のタンパク質を精製することで入手することができる。
被験者から採取した血清の前処理は、必要に応じて適当なバッファー溶液に希釈することによってサンプルを前処理してもよく、濃縮してもよい。これらの前処理には、リン酸塩、トリスなどのような様々なバッファーのいずれかを場合により生理的pHで使用する多くの標準水性バッファー溶液のいずれかを使用できる。なお、サンプルとしては、血清に限定されず、血漿および全血でも構わない。
第1,第2の捕捉手段1,2や第3の捕捉手段を金属膜4に固定する方法は、特に限定されないが、下記の金属結合基を、第1,第2の捕捉手段1,2や第3の捕捉手段の抗原結合領域以外の領域に導入し、この金属結合基を介して従来公知の方法(例えば後述する方法)により、第1,2の捕捉手段や第3の捕捉手段を金属膜4に対して結合および固定させることができる。
製造したセンサーチップ10の作成後の保存に関しては、速やかに窒素雰囲気等で封入して、必要時に取り出して用いることが好ましい。窒素雰囲気での封入方法としては、水分透過率10-2g/m2・40℃90%以下の防湿性能を有する防湿フィルム中に好適に保管することができる。
SPFS装置10Aは、図1に例示するように、光源19、直線偏光板18、光路切替ミラー17、プリズムとしての透明支持体5、減光フィルター22、フィルター入換手段20、カットフィルター21、検出器23、表面プラズモン共鳴〔SPR〕検出部16、液貯留ウェル13、送液ポンプ14、アクチュエータ、制御手段、等とを有している(一部不図示)。なお、液貯留ウェル13は、SPFS装置10Aに対して着脱可能な構成としてもよい。
蛍光量を測定する際に照射される光源19は、金属膜4にプラズモン励起を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルターを通して、プリズム5に入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
直線偏光板18は、励起光であるレーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるP偏光とするものである。これにより、SPFS免疫蛍光測定時の検出感度も増加する。
光路切替ミラー17は、光源19から放射されたレーザ光L1を反射して、プリズム(透明支持体)5の入射面5cを介して入射させ、反射して出射面5dから出射した反射光を受光した表面プラズモン共鳴〔SPR〕検出部16による情報から、金属膜4に対する照射角度を調節する。
プリズム5は、図1に示すように、センサーチップ10の透明支持体5と一体であってもよいし、別体であってもよい。一体の場合には金属膜4を形成した平面部5aとそれ以外のプリズム部5bを有する。プリズム5は、必要に応じて用いられる光学フィルター、偏光フィルター及びカットフィルター等の各種フィルターを介したレーザ光L1が、金属膜4に効率よく入射されることを目的としており、別体の場合はプリズム5の屈折率がセンサーチップ10の透明支持体5と同じであることが好ましい。
全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、60度分散プリズムなどであってもよい。
減光フィルター22は、検出部23への入射光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器23を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
カットフィルター21は、外光(SPFS装置10A外の照明光)、迷光(各所での励起光の散乱成分)、プラズモンの散乱光(励起光を起源とし、センサーチップ10表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光)などの光学ノイズを除去するフィルターであって、例えば、干渉フィルター、色フィルターなどが挙げられる。
検出器23としては、超高感度の観点からは光電子増倍管(浜松ホトニクス(株)製のフォトマルチプライヤー)が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なCCDイメージセンサも好適に用いることができる。
また、表面プラズモン共鳴〔SPR〕検出部16は、すなわちSPR専用の受光センサとしてのフォトダイオード,SPRおよびSPFSの最適角度を調製するための角度可変部(サーボモータで全反射減衰〔ATR〕条件を求めるためにフォトダイオードと光源19とを同期して、45〜85°の角度変更を可能とする。分解能は0.01°以上が好ましい。),SPR検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
液貯留ウェル13は、測定対象の溶液S、希釈用緩衝液DB、抗体溶液AS、洗浄用緩衝液WB、心筋トロポニンIや心筋トロポニンI自己抗体の標準液(不図示)等を貯留するための各ウェルを有し、カートリッジ式となっている。また、各ウェル内の溶液やバッファーは、送液ポンプ14の自動ピペッティング操作により、その都度に吸い上げ等される。
送液ポンプ14としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ,循環送液には適用できないが送り精度が高く脈動が少ないシリンジポンプ,微量送液には不向きな場合があるが簡易で取り扱い性に優れるがチューブポンプなどが挙げられるが、これらに限定されることなく、目的や用途に応じて種々の手段を適宜選択して用いることができる。
アクチュエータは、検出器23や光路切替ミラー17等の各部材にそれぞれ設けられており、それらの動作の駆動を行うものである(不図示)。
SPFS装置10Aの制御手段は、表示部、入力手段、CPU、メモリ等を備え(不図示)、一般的なPC端末としての機能を有する。メモリには、スポット位置設定手段、基準値設定手段、SPFS免疫蛍光測定手段、測定値比較手段、検量線作成手段等として制御手段を動作させるプログラム等が記憶されている。
スポット位置設定手段は、ユーザーによる入力手段の入力に基づいてSPFS装置にセットされたセンサーチップ10の第1捕捉手段(心筋トロポニンI抗体等)1および第2捕捉手段(心筋トロポニンI自己抗体結合抗体等)2、任意で第3の捕捉手段の各スポット位置の設定とメモリへの記録をするものである。
なお、このスポット位置情報は、上述のSPFS免疫蛍光測定に関する設定条件の一つとして測定の際にスポットの識別に用いられる。
基準値設定手段は、入力手段を介したユーザーによるキー入力情報に基づいてSPFS免疫蛍光測定に関する基準値をメモリに記録したり、記録した基準値の変更をしたりするものである。
第1基準値は、医師が被験者(患者等)を診断する際に用いるものである。一方、第2基準値は、SPFS装置10Aの制御部の測定値比較手段が、SPFS免疫蛍光測定による心筋トロポニンI自己抗体の測定値と比較して心筋トロポニンIの測定値のデータ信頼性を判断する信頼性評価処理に用いるものである。
心筋トロポニンIが陽性であるか否かの判断に医師が用いる第1基準値は、患者検体の血清および血漿中の抗原濃度換算で0.04ng/mLである(場合によっては0.05ng/mL等の他の値が使用される)。心筋トロポニンIの測定値のカットオフ値は、0〜第1基準値である。
第2基準値については、ブランク値を超える心筋トロポニンI自己抗体の免疫蛍光が検出された時点で、心筋トロポニンIの測定の信頼性が低いことにつながることから、第2基準値としては、好ましくは、センサーチップ10のスポット2aの測定ブランクのシグナルがとりうる範囲、またはそれに近い値に設定され、例えば測定ブランクのとりうる範囲の上限値よりやや高めに設定される。また、第2基準値を超える範囲でさらに別の基準値を複数設けて、心筋トロポニンIの測定結果の信頼の程度を段階評価することとしてもよい。
SPFS免疫蛍光測定手段は、入力手段を介したユーザーによる入力により、メモリに記憶されたSPFS免疫蛍光測定に関する設定条件に基づいて、SPFS装置10Aの光源19等に各種の制御命令を出して、後述するSPFS免疫蛍光測定の一連の工程を行うものである。
測定値比較手段は、入力手段を介したユーザーによる入力に基づいて、以下に説明する蛍光測定値の信頼性評価処理を行う(図3参照)。
検量線作成手段は、以下のように検量線の作成処理を行うか、または既にある心筋トロポニンIまたは心筋トロポニンI自己抗体の検量線データを読み込んでメモリに記憶する処理を行うものである。
ユーザーがセットした液貯留ウェル13の各濃度の心筋トロポニンI標準液について、上記センサーチップ10の流路3に流通させて後述のSPFS免疫蛍光測定を行い、各濃度に対応する蛍光強度を調べて、心筋トロポニンIの検量線を作成する。なお、各ウェルの心筋トロポニンIの標準液の濃度データは、ユーザーの入力手段を介した入力により例えばリスト形式のデータとしてメモリに紐付けされて記憶されている。
心筋トロポニンI自己抗体の検量線については、例えば、市販されている被験者(患者等)等由来の血清で心筋トロポニンIと心筋トロポニンI自己抗体とが結合した複合体の濃度が既知のものについて、上記(1)の心筋トロポニンIの検量線作成の場合と同様に検量線を作成する。
以下、SPFS免疫蛍光測定手段が行うSPFS免疫蛍光測定について説明する。SPFS免疫蛍光測定は、下記の工程(a)〜(d)を含み、任意に洗浄工程(1)、(2)を含む。
工程(b):工程(a)後のセンサーチップの1次抗体に捕捉されたアナライトに対して、蛍光色素標識された2次抗体を反応させる工程
工程(c):工程(b)後のセンサーチップに対して、金属膜4を形成していないプリズム(透明支持体)5を経由してレーザ光L1を照射し、この照射により励起された2次抗体の蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程
工程(d):工程(c)で得られた測定結果から、アナライトの量を算出する工程
洗浄工程(1):上記工程(a)を経て得られたセンサーチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程
洗浄工程(2):上記工程(b)を経て得られたセンサーチップ内を、洗浄液を用いて洗浄する工程。
工程(a)は、センサーチップの金属膜4に固定化された1次抗体(心筋トロポニンI抗体または心筋トロポニンI自己抗体結合抗体等)に、アナライト溶液を接触させる工程である。
アナライト溶液は、所定の緩衝液でアナライトを希釈した溶液であり、アナライト(心筋トロポニンIや心筋トロポニンI自己抗体)を希釈するために用いる溶媒は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水〔PBS〕、トリス緩衝生理食塩水〔TBS〕、HEPES緩衝生理食塩水〔HBS〕などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
洗浄工程としては、上記工程(a)を経た後にセンサーチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程(1)と、上記工程(b)を経てた後にセンサーチップ内を洗浄液で洗浄する洗浄工程(2)がある。
洗浄工程(洗浄液による洗浄時間)は、通常0.5〜180分間、好ましくは2〜10分間である。
工程(b)は、上記工程(a)の後、好ましくは上記洗浄工程(1)を経た後に、さらに、金属膜4に固定化した各1次抗体に結合したアナライト(心筋トロポニンIまたは心筋トロポニンI自己抗体等)に対して、蛍光色素標識された2次抗体を反応させる工程である。
「蛍光色素」は、所定の励起光を照射することによって、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する物質の総称であり、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
1次抗体がポリクローナル抗体である場合、2次抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、該1次抗体がモノクローナル抗体である場合、2次抗体は、該1次抗体が認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
この溶液を送液する際の溶液の温度、流速および工程(b)の時間(送液時間)は、それぞれ上記工程(a)の場合と同様である。
工程(c)は、上記工程(b)を経た後のセンサーチップに、上記支持体の、上記金属部材を形成していないもう一方の表面から、プリズムを経由してレーザ光を照射し、励起された蛍光色素から発光された蛍光量を測定する工程である。
工程(d)は、上記工程(c)で得られた測定結果から、アナライト溶液中に含有されるアナライト量を算出する工程である。
(1)センサーチップ10は、図1に例示するように、ヒトやペット等の動物由来の検体中の心筋トロポニンIを特異的に検出可能な心筋トロポニンI抗体等の第1捕捉手段1と、心筋トロポニンI自己抗体を特異的に検出可能な抗体等の第2捕捉手段2とを有しているので、同一検体について心筋トロポニンIの検出と心筋トロポニンI自己抗体の検出を行うことができる。
[実施例1]
SPFS免疫蛍光測定システム100により、心筋トロポニンIが陽性、心筋トロポニンI自己抗体が陽性である患者由来の血清の検体について、SPFS免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、まず、図4(A)および(B)に示すように、工程(a)によりセンサーチップ10の流路3に対して、上記検体が供給される。
SPFS免疫蛍光測定システム100により、心筋トロポニンIが陽性、心筋トロポニンI自己抗体が陰性である患者由来の血清の検体について、SPFS免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、まず、図5(A)および(B)に示すように、工程(a)によりセンサーチップ10の流路3に対して、上記検体が供給される。
SPFS免疫蛍光測定システム100により、心筋トロポニンIが陰性、心筋トロポニンI自己抗体が陽性である患者由来の血清の検体について、SPFS免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、図6(A)および(B)に示すように、工程(a)により、センサーチップ10の流路3に対して、上記検体が供給される。
そして、図6(C)に示すように、工程(b)で、心筋トロポニンI自己抗体9に結合している心筋トロポニンI 8に対して、蛍光色素12で標識された2次抗体11が結合し、工程(c)および(d)で、心筋トロポニンI自己抗体結合抗体2のスポット2aの蛍光だけが観測されることとなる。
SPFS免疫蛍光測定システム100により、心筋トロポニンIが陰性、心筋トロポニンI自己抗体が陰性である患者由来の血清の検体について、SPFS免疫蛍光測定および信頼性評価処理を行った場合、図7(A)および(B)に示すように、工程(a)で、センサーチップ10の流路3に対して、上記検体が供給される。
図8(A)に従来技術に係るセンサーチップ50およびこれを搭載したSPFS免疫蛍光測定システム(一部不図示)を示す。このセンサーチップ50は、図8に示すように、センサーチップ10と比較して、心筋トロポニンI抗体1のみ有しており、心筋トロポニンI自己抗体結合抗体2を有していないものである。また、従来技術に係るSPFS免疫蛍光測定システムは、信頼性評価処理等を行う手段を有していないものである。
比較例1と同様の従来技術に係るセンサーチップ50およびSPFS免疫蛍光測定システムにより、心筋トロポニンIが陰性で心筋トロポニンI自己抗体が陽性である患者由来の血清の検体について、SPFS免疫蛍光測定を行った場合、図9に示すように、センサーチップ50の流路3に対して上記検体が供給される。
1a スポット
2 第2の捕捉手段
2a スポット
3 流路
4 金属膜
5 透明支持体(プリズム)
5a 平面部
5b プリズム部
5c 入射面
5d 出射面
6 ポンプ接続部
7 液溜
8 心筋トロポニンI
9 心筋トロポニンI自己抗体
10 センサーチップ
10A SPFS装置
11 2次抗体
12 蛍光色素
13 液貯留ウェル
14 送液ポンプ
15 流路形成体
16 表面プラズモン共鳴〔SPR〕検出部
17 光路切替ミラー
18 直線偏光板
19 光源
20 フィルター入換手段
21 カットフィルター
22 減光フィルター
23 検出器
50 センサーチップ(従来技術)
100 SPFS免疫蛍光測定システム
Claims (7)
- SPFS免疫蛍光測定用のセンサーチップであって、
被験者由来の検体中に含まれる心筋トロポニンIと特異的に結合可能な第1の捕捉手段と、心筋トロポニンI自己抗体に結合する分子である第2の捕捉手段と、心筋トロポニンIまたはその部分断片である第3の捕捉手段とを備えている、SPFS免疫蛍光測定用のセンサーチップ。 - 前記第2の捕捉手段が心筋トロポニンI自己抗体結合抗体またはその部分断片である、請求項1に記載のセンサーチップ。
- 前記検体の溶液を流通させる流路が形成され、該流路に第1の捕捉手段と第2の捕捉手段と第2の捕捉手段の上流側に第3の捕捉手段とが固定されている、請求項1または2に記載のセンサーチップ。
- 第1の捕捉手段と第2の捕捉手段とが前記流路の流通方向に沿って直列に配置されている請求項3に記載のセンサーチップ。
- 前記流路において第1の捕捉手段の下流側に第2の捕捉手段が固定されている請求項3または4に記載のセンサーチップ。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載のセンサーチップを有し、
心筋トロポニンIの検出と、心筋トロポニンI自己抗体の検出とを同一の検体に対して、並行して行う、SPFS免疫蛍光測定システム。 - 心筋トロポニンI検出後の使用済みの検体を用いて、心筋トロポニンI自己抗体の検出を行う、請求項6に記載のSPFS免疫蛍光測定システム。
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