JP5710253B2

JP5710253B2 - 速効型インスリンアナログ

Info

Publication number: JP5710253B2
Application number: JP2010520562A
Authority: JP
Inventors: ヘレ，ビルクオルセン，; トマス，ボールムケルセン，; ペルバルシュミット，; ティングレンドーフ，; スヴェンドハヴェルンド，
Original assignee: ノボ・ノルデイスク・エー／エス
Priority date: 2007-08-13
Filing date: 2008-08-12
Publication date: 2015-04-30
Anticipated expiration: 2028-08-12
Also published as: CN101778862A; CN101778862B; EP2178909B1; EP2178909A1; WO2009021955A1; US20110021423A1; JP2010535841A; ES2558930T3; US8575096B2

Description

本発明は、速効型インスリンアナログ及び速効型インスリンアナログを含有してなる製薬的組成物及び持効型インスリンアナログとの混合物で速効型インスリンアナログを含有してなる製薬的組成物に関する。

インスリンは膵臓のβ細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンであって、２つのポリペプチド鎖、Ａ及びＢから成り、このＡ鎖とＢ鎖は２つの鎖間ジスルフィド架橋によって連結される。さらに、Ａ鎖は１つの鎖内ジスルフィド架橋を特徴とする。
ホルモンは、立体配置：プレペプチドＢ−ＡｒｇＡｒｇ−Ｃ−ＬｙｓＡｒｇ−Ａ(Ｃは３１アミノ酸の連結ペプチドである)で、２４アミノ酸のプレペプチドの後に８６アミノ酸を含有するプロインスリンからなるプロインスリンの単鎖前駆物質(プレプロインスリン)として合成される。Ａｒｇ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ａｒｇは、２鎖のインスリン分子を形成するためのＡ鎖及びＢ鎖の連結ペプチドの切断のための切断部位である。インスリンは正常な代謝調節を維持するために必須である。
ホルモンは、まず二量体に希釈し、次に単量体に希釈することによって分離する一定の六量体として、分泌される。活性なホルモンはインスリン単量体である。インスリン六量体及び／又はインスリン二量体の不安定化によって、欧州特許第２１４８２６号に開示される、速効型インスリン様Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリンが生じる。

現在、１型糖尿病及び２型糖尿病両方の糖尿病の治療は、いわゆる強化インスリン療法の程度を上げることに関する。この投薬計画によると、患者は、基礎的インスリン需要を賄うために持効型インスリンを１日に１又は２回注射し、食事に関連したインスリン需要を賄うために速効型インスリンの急速注射により補うことを含む毎日複数回のインスリン注射により治療される。
糖尿病患者は、速効型インスリンの複数回注射を伴う遅延型インスリンを含む毎日複数回の注射により治療されるので、速効型及び持効型のインスリンを１回の注射と組み合わせることは複数の注射を省くことになるであろう。国際公開２００３／０９４９５１は、速効型インスリンアナログインスリンアスパルト(Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン)およびインスリンデテミル(Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-テトラデカノイル) ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン)の混合物を開示する。しかしながら、速効型インスリンアナログと持効型インスリンアナログとの混合物は混合能が限られており、速効型インスリンの速効性が低下し、持効型インスリンの持効性が低下するかもしれない。
本発明の目的は、可溶性の持効型インスリンアナログとの混合能に関して公知の速効型インスリンよりも優れた特性を有する改良速効型インスリンを提供することである。

第一の態様では、本発明は、持効型インスリンアナログとの可溶性の混合物(予め混合してあるもの又は自身で混合するもの)を形成しうる速効型インスリンアナログに関する。速効性はヒトインスリンのＢ鎖のＣ末端における置換／欠失を単量体化することにより達成され、持効型インスリンアナログとの混合性はヒトインスリンの位置Ｂ１０におけるＺｎ結合ＨｉｓのＧｌｎアミノ酸残基との置換により達成される。
一実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２２−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに場合によって位置Ｂ２２−Ｂ３０の一又は複数のアミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。

更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに場合によって位置Ｂ２５−Ｂ３０の一又は複数のアミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。
更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに場合によって位置Ｂ２５、Ｂ２６及びＢ３０の一又は複数の天然アミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。

更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに場合によって位置Ｂ２６及びＢ３０の天然アミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。
更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに位置Ｂ２５及びＢ３０の天然アミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。

更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに位置Ｂ２５の天然アミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。
更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに位置Ｂ２６の天然アミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。
更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基が、インスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されている、速効型インスリンアナログであって、Ｂ鎖の位置１０におけるＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎと置換しており、さらに位置Ｂ３０の天然アミノ酸残基が欠失している速効型インスリンアナログに関する。

一実施態様では、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における３以下のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と置換されている。置換は同じでも異なっていてもよい。
更なる実施態様では、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における１−２のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と置換されており、更なる実施態様では、位置Ｂ２２−Ｂ３０における唯一つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と置換されている。
一実施態様では、位置Ｂ２２のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２３のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２４のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２５のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２６のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２７のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２８のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２９のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ３０のアミノ酸は他のアミノ酸残基と置換される。

更なる実施態様では、位置Ｂ２２および位置Ｂ２８のアミノ酸は、同じでも異なっていてもよい他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２２および位置Ｂ２７のアミノ酸は、同じでも異なっていてもよい他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２５および位置Ｂ２７のアミノ酸は、同じでも異なっていてもよい他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２５および位置Ｂ２８のアミノ酸は、同じでも異なっていてもよい他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２６および位置Ｂ２７のアミノ酸は、同じでも異なっていてもよい他のアミノ酸残基と置換される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２６および位置Ｂ２８のアミノ酸は、同じでも異なっていてもよい他のアミノ酸残基と置換される。
前述の各々の実施態様では、天然のアミノ酸残基は、Ｇｌｕ又はＡｓｐアミノ酸残基によって置換されてもよい。

位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における一又は複数のアミノ酸残基を置換することに加えて、これら一又は複数のアミノ酸残基は欠失されていてもよい。したがって、Ｂ鎖の領域における変更は、一又は複数の置換と一又は複数の欠失の組合せであってもよい。
一実施態様では、１のアミノ酸残基は欠失される。他の実施態様では、２のアミノ酸残基は欠失される。
本発明の一実施態様では、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における１のアミノ酸残基は欠失されており、２のアミノ酸残基は同じでも異なっていてもよい他のアミノ酸残基と置換されている。
本発明の他の実施態様では、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における１のアミノ酸残基は欠失されており、１のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基と置換されている。
本発明の更なる実施態様では、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における２のアミノ酸残基は欠失されており、１のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基と置換されている。

一実施態様では、位置Ｂ３０のアミノ酸は欠失される。
他の実施態様では、位置Ｂ２９のアミノ酸残基は欠失される。
他の実施態様では、位置Ｂ２８のアミノ酸残基は欠失される。
他の実施態様では、位置Ｂ２７のアミノ酸残基は欠失される。
他の実施態様では、位置Ｂ２６のアミノ酸残基は欠失される。
他の実施態様では、位置Ｂ２５のアミノ酸残基は欠失される。
他の実施態様では、位置Ｂ２６およびＢ３０のアミノ酸残基は欠失されている。
他の実施態様では、位置Ｂ２５およびＢ３０のアミノ酸残基は欠失されている。
他の実施態様では、位置Ｂ２７およびＢ３０のアミノ酸残基は欠失されている。

一実施態様では、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０のアミノ酸置換は、Ｇｌｕおよび／またはＡｓｐから選択される。
更なる実施態様では、位置Ｂ２２のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２３のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２４のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２５のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２６のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２７のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２８のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２９のアミノ酸はＧｌｕである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２２のアミノ酸はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２３のアミノ酸はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２４のアミノ酸はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２５のアミノ酸はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２６のアミノ酸はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２７のアミノ酸はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２８のアミノ酸はＡｓｐである。
更なる実施態様では、位置Ｂ２９のアミノ酸はＡｓｐである。
位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０のアミノ酸残基の置換のための他の適切なアミノ酸残基は、ＨｉｓおよびＰｒｏである。また、Ｂ３０アミノ酸残基はＬｙｓに置換されてもよい。

一実施態様では、位置Ｂ２６および位置３０のアミノ酸は欠失されており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に置換されている。
他の実施態様では、位置Ｂ２６および位置３０のアミノ酸は欠失されており、位置Ｂ２７のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に置換されている。
他の実施態様では、位置Ｂ２５および位置３０のアミノ酸は欠失されており、位置Ｂ２８のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に置換されている。
他の実施態様では、位置Ｂ２５および位置３０のアミノ酸は欠失されており、位置Ｂ２７のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に置換されている。
他の態様では、本発明は、糖尿病の治療のための本発明に係るインスリンアナログの使用に関連がある。
更なる態様では、本発明は、本発明の速効型インスリンアナログと、場合によって安定化、保存又は等張性に適する一又は複数の薬剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含有してなる製薬的組成物に関する。製剤の亜鉛含量は、インスリン六量体当たり０〜およそ４亜鉛原子であってよい。

ゆえに、一実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基がインスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されており、Ｂ鎖の位置１０のＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎに置換されており、さらに場合によって、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における一又は複数のアミノ酸残基が欠失されている速効型インスリンアナログを、安定化、保存又は等張性に好適な一又は複数の薬剤などの好適なアジュバント及び添加剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールと共に含有してなる薬学的製剤に関する。
また、本発明は、本発明に係る速効型インスリンアナログと持効型インスリンアナログないしは誘導体との混合物である可溶性組成物であって、注入部位からのこの速効型インスリンアナログと持効型インスリンアナログないしは誘導体それぞれのインビボ消失率が別々の組成物で注入された場合と同じか又は実質的に同じである可溶性組成物を提供する。
ゆえに、他の態様では、本発明は、本発明に係る速効型ヒトインスリンアナログを、持効型ヒトインスリンアナログないしは誘導体との混合物で、安定化、保存又は等張性に適する一又は複数の薬剤などの好適なアジュバント及び添加剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールと共に含有してなる可溶性の薬学的製剤に関する。
亜鉛含量が、インスリン六量体につき０からおよそ４の亜鉛原子であってもよい。薬学的調製物のｐＨは、およそ３からおよそ８．５、およそ３からおよそ５、またはおよそ６．５からおよそ７．５であってもよい。

一実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基がインスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されており、Ｂ鎖の位置１０のＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎに置換されており、さらに場合によって、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における一又は複数のアミノ酸残基が欠失されている速効型インスリンアナログを、持効型ヒトインスリンアナログないしは誘導体との混合物で、安定化、保存又は等張性に好適な一又は複数の薬剤などの好適なアジュバント及び添加剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールと共に含有してなる薬学的製剤に関する。
本発明の一実施態様では、持効型ヒトインスリン誘導体は、ヒトインスリンのアシル化された誘導体である。アシル化されたインスリン誘導体は、親油性基が位置Ｂ２９又はＢ１のリジン残基に付着されていてもよい。アシル化されたインスリンの図示は、欧州特許第７９２２９０号に開示される。商品は、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-テトラデカノイル)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)を活性成分として含有してなるＬｅｖｅｍｉｒ(登録商標)である。

ゆえに、更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基がインスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されており、Ｂ鎖の位置１０のＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎに置換されており、さらに場合によって、位置Ｂ２２−Ｂ３０における一又は複数のアミノ酸残基が欠失されている速効型インスリンアナログを、持効型アシル化ヒトインスリン誘導体との混合物で、安定化、保存又は等張性に好適な一又は複数の薬剤などの好適なアジュバント及び添加剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールと共に含有してなる薬学的製剤に関する。
持効型インスリンの他の例は、米国特許第５６５６７２２号にて開示されるような、Ｂ鎖のＣ末端に付着されるＡｒｇなどの陽性荷電アミノ酸を含むものである。商品は、Ａ２１Ｇｌｙ、Ｂ３１Ａｒｇ、Ｂ３２Ａｒｇヒトインスリン(インスリングラルギン)を含有してなるＬａｎｔｕｓ(登録商標)である。

ゆえに、更なる実施態様では、本発明は、ヒトＢ鎖の位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における少なくとも一の天然アミノ酸残基がインスリンの単量体形態の形成を促す作用を有する他のアミノ酸残基と置換されており、Ｂ鎖の位置１０のＨｉｓアミノ酸残基がＧｌｎに置換されており、さらに場合によって、位置Ｂ２２−Ｂ３０又はＢ２５−Ｂ３０における一又は複数のアミノ酸残基が欠失されている速効型インスリンアナログを、ヒトインスリンと比較して１又は２つの更なる陽性電荷を有する持効型インスリンアナログとの混合物で、安定化、保存又は等張性に好適な一又は複数の薬剤などの好適なアジュバント及び添加剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールと共に含有してなる薬学的製剤に関する。

一実施態様では、本発明は、本発明に係る速効型インスリンアナログを、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-テトラデカノイル)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)との混合物で含有してなる製薬的組成物に関する。
他の実施態様では、本発明は、本発明に係る速効型インスリンアナログを、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-(Ｎ-リトコリル-γ-グルタミル)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンとの混合物で含有してなる製薬的組成物に関する。
更なる実施態様では、本発明は、本発明に係る速効型インスリンアナログを、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンとの混合物で含有してなる製薬的組成物に関する。

更なる実施態様では、本発明は、本発明に係る速効型インスリンアナログを、Ａ２１Ｇｌｙ、Ｂ３１Ａｒｇ、Ｂ３２Ａｒｇヒトインスリン(インスリングラルギン)との混合物で含有してなる製薬的組成物に関する。
更なる態様では、本発明は、特に糖尿病の治療のための哺乳動物の血中グルコースレベルの低減のための薬学的調製物の調製のための、場合によって持効型ヒトインスリンアナログないしは誘導体との混合物での本発明に係る速効型インスリンアナログの使用に関する。
更なる実施態様では、本発明は、治療を必要とする患者に、場合によって持効型ヒトインスリンアナログないしは誘導体との混合物での本発明に係る速効型インスリンアナログの治療上活性な用量を投与することによる、哺乳動物の血中グルコースレベルの低減方法に関する。

インスリンアスパルト(Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン)及びインスリングラルギン(Ａ２１Ｌｙｓ、Ｂ３１Ａｒｇ、Ｂ３２Ａｒｇヒトインスリン)の平衡溶解度を示す。パネルＡ：純水中の各調製物の溶解性。パネルＢ：０．３ｍＭＺｎ^２＋、１６ｍＭｍ-クレゾール、１６ｍＭフェノールおよび１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭインスリンアスパルトおよび０．３ｍＭインスリングラルギンの混合調製物の溶解性。パネルＣ：１２０ｍＭＮａＣｌ、１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭインスリングラルギンと０．３ｍＭインスリンアスパルトとの混合調製物の溶解性。各パネルにおいて、インスリンアスパルトの溶解性は灰色の印にて表され、インスリングラルギンの溶解性は黒色の印にて表され、個々の測定点を繋ぐ線は見やすくするためのものである。Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン及びインスリングラルギンの平衡溶解度を示す。パネルＡ：純水中の各調製物の溶解性。パネルＢ：０．３ｍＭＺｎ^２＋、１６ｍＭｍ-クレゾール、１６ｍＭフェノールおよび１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０インスリンおよび０．３ｍＭインスリングラルギンの混合調製物の溶解性。パネルＣ：１２０ｍＭＮａＣｌ、１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０インスリンおよび０．３ｍＭインスリングラルギンの混合調製物の溶解性。各パネルにおいて、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０の溶解性は灰色の印にて表され、インスリングラルギンの溶解性は黒色の印にて表され、個々の測定点を繋ぐ線は見やすくするためのものである。Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン及びインスリングラルギンの平衡溶解度を示す。パネルＡ：純水中の各調製物の溶解性。パネルＢ：０．３ｍＭＺｎ^２＋、１６ｍＭｍ-クレゾール、１６ｍＭフェノールおよび１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０インスリンおよび０．３ｍＭインスリングラルギンの混合調製物の溶解性。パネルＣ：１２０ｍＭＮａＣｌ、１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０インスリンおよび０．３ｍＭインスリングラルギンの混合調製物の溶解性。各パネルにおいて、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０の溶解性は灰色の印にて表され、インスリングラルギンの溶解性は黒色の印にて表され、個々の測定点を繋ぐ線は見やすくするためのものである。Ａ２１Ｇ,Ｂ１０Ｑ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン及びインスリングラルギンの平衡溶解度を示す。パネルＡ：純水中の各調製物の溶解性。パネルＢ：０．３ｍＭＺｎ^２＋、１６ｍＭｍ-クレゾール、１６ｍＭフェノールおよび１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭＡ２１Ｇ,Ｂ１０Ｑ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０インスリンおよび０．３ｍＭインスリングラルギンの混合調製物の溶解性。パネルＣ：１２０ｍＭＮａＣｌ、１．６％グリセロールを含む０．３ｍＭＡ２１Ｇ,Ｂ１０Ｑ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０インスリンおよび０．３ｍＭインスリングラルギンの混合調製物の溶解性。各パネルにおいて、Ａ２１Ｇ,Ｂ１０Ｑ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０の溶解性は灰色の印にて表され、インスリングラルギンの溶解性は黒色の印にて表され、個々の測定点を繋ぐ線は見やすくするためのものである。０．６ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０、１９ｍＭフェノール、１９ｍＭｍ-クレゾール、１．６％グリセロール、ｐＨ＝３．２(合計９０ｎｍｏｌのインスリンアナログ)およびＬａｎｔｕｓ(登録商標)(インスリングラルギン)(合計２１０ｎｍｏｌのインスリングラルギン)の別々の注入(データを黒色で示す)、又は使用前に３０:７０(モル基準)に混合した前記２つのインスリンの調製物(合計３００ｎｍｏｌの２つのインスリンアナログ)の単回注入(データを灰色で示す)による皮下投与後のブタにおけるグルコース利用の比較を示す。グルコース注入速度(ＧＩＲ)は平均±ＳＥとして表される。皮下貯蔵物(ブタモデル)からのインスリン調製物の消失を示す。曲線は、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンの３つの異なる製剤ａ)、ｂ)およびｃ)の消失とＮｏｖｏＲａｐｉｄ(登録商標)製剤のインスリンアスパルトの消失を表す。Ｔ５０％は以下の通りである。ａ) ０．９±０．２、ｂ) １．３±０．２、及びｃ) １．１±０．３、ｄ) ０．９±０．３。ａ)は、０．６ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、１９ｍＭフェノール、１９ｍＭｍ-クレゾールおよび１．６％グリセロール、ｐＨ３．２３を含む調製物である。ｂ)は、ａ)とＬａｎｔｕｓ(登録商標)との３：７混合物、ｐＨ＝３．７４である。ｃ)は、０．１８ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンおよび１．６８ｍＭインスリンデテミルおよび０．８４ｍＭＺｎ、１９ｍＭフェノール、１９ｍＭｍ-クレゾール、１．６％グリセロールおよび１０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．３９を含む混合物である。

発明の説明
本発明に係るインスリンは、二量体および六量体の形成に影響を及ぼすインスリン分子内の特定の位置で修飾され、本発明に係るインスリンアナログは、持効型インスリンアナログとの可溶性混合製剤(予め混合したもの又は自身で混合するもの)を形成しうることに特徴を有する。速効性は、Ｂ鎖Ｃ末端内の置換／欠失を単量体化することにより達成され、持効型インスリンアナログとの混合性は、位置Ｂ１０のＺｎ-結合Ｈｉｓの置換により達成される。
単量体を得るためにヒトインスリンのＢ鎖のＣ末端の一又は複数のアミノ酸残基を置換した、速効型インスリンアナログは、例えば欧州特許第２１４８２６号から周知である。
結果として生じるインスリン分子が所望の特性を有する限り、つまり、鈍化することなく、速効性があり、可溶性の混合物を形成するために持効型インスリンアナログないしは誘導体と混合可能であり、可溶性である限り、Ｂ鎖及びＡ鎖は共に本発明に係る変異にさらに更なる変異を含んでもよい。このような更なる変異は、物理的ないしは化学的な安定性又は変更インスリン分子の両方に対して安定化作用を有しうる。

一実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２６Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；及びＢ１０Ｑ,Ｂ２５Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンからなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０,Ａ２１Ｇヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２７Ｅ,ｄｅｓＢ３０,Ａ２１Ｇヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２６Ｅ,ｄｅｓＢ３０,Ａ２１Ｇヒトインスリン；及び、Ｂ１０Ｑ,Ｂ２５Ｅ,ｄｅｓＢ３０,Ａ２１Ｇヒトインスリンからなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；及び、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンからなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０,Ａ２１Ｇヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０,Ａ２１Ｇヒトインスリン；及び、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０,Ａ２１Ｇヒトインスリンからなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,Ｂ２８Ｅヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２７Ｅヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２６Ｅヒトインスリン；及び、Ｂ１０Ｑ,Ｂ２５Ｅヒトインスリンからなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,Ｂ２８Ｅ,Ａ２１Ｇヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２７Ｅ,Ａ２１Ｇヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,Ｂ２６Ｅ,Ａ２１Ｇヒトインスリン；及び、Ｂ１０Ｑ,Ｂ２５Ｅ,Ａ２１Ｇヒトインスリンからなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２８Ｅヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅヒトインスリン；及び、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅヒトインスリンからなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明に係るインスリンアナログは、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２７,Ｂ２８Ｅ,Ａ２１Ｇヒトインスリン；Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,Ａ２１Ｇヒトインスリン；及び、Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,Ａ２１Ｇヒトインスリンからなる群から選択される。

本発明に係る速効型インスリンアナログは、鈍化の影響を受けずに持効型インスリンアナログないしは誘導体と混合することができる。鈍化(blunting)とは、速効型及び持効型のインスリンそれぞれの活性特性が混合物中で変化し、速効型インスリンの速効性が低減し、持効型インスリンの持効性が早くなることを意味する。
ゆえに、本明細書中で用いる「鈍化がない」という用語は、一つの製剤に調製した場合に速効型インスリン及び持効型インスリンが、別々の製剤として投与した場合の作用の特徴と同一か又は実質的に同一である作用の特徴を有することを意味する。

「実質的に同一の」という表現は、作用の特徴が、別々の製剤として投与した場合の個々のインスリンの作用の特徴に対して少なくとも７０−９５％の同一性があることを意味するであろう。
一実施態様では、個々のインスリンの作用の特徴が、別々の製剤として投与した場合の作用の特徴に対して少なくとも７５％の同一性がある。
他の実施態様では、個々のインスリンの作用の特徴が、別々の製剤として投与した場合の作用の特徴に対して少なくとも８５％の同一性がある。
他の実施態様では、個々のインスリンの作用の特徴が、別々の製剤として投与した場合の作用の特徴に対して少なくとも９５％の同一性がある。

「混合性」なる用語は、鈍化が起こらないか又は実質的に起こらない速効型と持効型のインスリンの混合物を特徴付けるために用いられる。
「速効型」インスリンとは、通常又は標準のヒトインスリンよりも作用の発現が早いインスリンを意味し、「持効型インスリン」とは、通常又は標準のヒトインスリンよりも作用の持続が長いインスリンを意味する。
ある種の持効型インスリンはアシル化したインスリン誘導体である。ヒトインスリンは、Ａ鎖及びＢ鎖のＮ末端基と、位置Ｂ２９のリジン残基のε-アミノ基という３つの主なアミノ基を有する。リジン残基位置Ｂ２９のεアミノ基に連結した親油性置換基を含む可溶性インスリン誘導体は、例えば国際公開９５／０７９３１および国際公開２００５／１２３４において開示される。

アシル基は親油性基であり、典型的にはおよそ６〜およそ３２、より典型的には６〜２４、８〜２０、１２〜２０、１２〜１６、１０〜１６、１０〜２０、１４〜１８又は１４〜１６の炭素原子を含む脂肪酸部分であってもよい。脂肪酸の例は、カプリン酸、ラウリン酸、テトラデカン酸(ミリスチン酸)、ペンタデカン酸、パルミチン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、ドデカン酸、トリデカン酸およびテトラデカン酸である。また、アシル基はジカルボキシル脂肪酸から得られてもよいし、リトコール酸であってもよい。
アシル基は、対象の遊離したアミノ基に直接付着されてもよい。しかしながらまた、アシル基は、インスリン分子内の遊離アミノ基と対象のアシル基を連結するリンカーによって、アミド結合を介して付着されてもよい。
アシル化されたインスリンは、ヒトインスリンと比較して１又は２の更なる陰性正味電荷を有してもよい。脂肪酸の遊離カルボン酸基によって、又は、少なくとも一の遊離カルボン酸又は中性ｐＨで負に荷電している基を含む一又は複数のアミノ酸残基を含みうるリンカー基によって、さらに負に荷電しうる。

アシル化インスリンアナログの非限定的な例は、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-テトラデカノイル)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-ヘキサデカノイル)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-テトラデカノイル)ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-ヘキサデカノイル)ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-(Ｎ-ヘキサデカノイル-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-(Ｎ-リトコールイル-γ-Ｇｌｕ))ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-(ω-カルボキシヘプタデカノイル))ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｌｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-(ω-カルボキシヘプタデカノイル))ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１３ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１５ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１６ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１７ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１８ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｎ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１３ＣＯ)-γ-Ａｓｐ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、及びＮ^εＢ２９-(Ｎ^α-(ＨＯＯＣ(ＣＨ_２)_１４ＣＯ)-γ-Ａｓｐ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンである。

他の種の持効型インスリンアナログは、インスリングラルギンのような、荷電基、例えばＣ末端基Ｂ３０に付着されたＡｒｇを有するインスリンアナログを開示する欧州特許第３６８１８７号において開示される。
２つの成分の混合性は、本発明に係る速効型インスリンアナログの、持効型アシル化インスリンＬｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-テトラデカノイル)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)および持効型インスリンアナログインスリングラルギンとの混合物によって示されている。
速効型インスリンは、例えば欧州特許第１２４６８４５号に開示されるような周知の技術によって、速効型インスリンの単鎖インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列を適切な宿主細胞内で発現させることによって製造される。インスリン前駆体は、欧州特許第１６３５２９号および欧州特許第２１４８２６号にて開示されるように、酵素的および化学的なインビトロ方法によって所望のインスリン分子に変換される前駆体分子として、形質移入された宿主細胞において発現される。前駆体分子は、欧州特許第１２４６８４５号に開示されるように、後に切断されるＮ末端伸展と共に発現されてもよい。本発明において適切な種類のＮ末端伸展の例は、米国特許第５３９５９２２号および欧州特許第７６５３９５号において開示される。
本発明に係る速効型インスリンと混合される持効型アシル化インスリンを調製するためのインスリン前駆体生産物は、上記の方法と類似の方法によって製造されうる。インスリン前駆体は、例えば欧州特許第２１４８２６号、欧州特許第３７５４３７号および欧州特許第３８３４７２号において記載されるように、所望の位置でアシル化されうる。

本明細書中で用いる「インスリン」とは、Ｃｙｓ^Ａ７とＣｙｓ^Ｂ７との間、及びＣｙｓ^Ａ２０とＣｙｓ^Ｂ１９との間にジスルフィド架橋を、そしてＣｙｓ^Ａ６とＣｙｓ^Ａ１１との間に内部ジスルフィド架橋を有するヒトインスリンの二本鎖構造を有するヒトインスリン、ブタインスリンおよびウシインスリンを意味する。
Ｂ鎖は、３０のアミノ酸残基を有するヒトインスリンＢ鎖を指し、Ａ鎖は、２１のアミノ酸残基を有するヒトインスリンＡ鎖を指す。本発明に係るインスリンアナログ内のＢ鎖及びＡ鎖の両方は、結果として生じるインスリン分子が所望の性質を有する限り、本発明に係る変異にさらに付加的な変異を含んでもよい。
更なる変異の数は、典型的に３より多くなく、より典型的に２又は１であろう。
ゆえに、Ｂ１のアミノ酸残基は、Ａｓｐ又はＧｌｙのような他のアミノ酸残基に置換されてもよく、又は欠失していてもよい。また、位置Ｂ３のＡｓｎは、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐに変異してもよい。また、Ｂ鎖はＮ末端伸展を含んでもよく、Ｂ１は欠失していてもよい。
Ａ鎖において、位置Ａ２１のＡｓｎは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌに、特に、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒに、そして好ましくはＧｌｙに変異してもよい。また、Ａ１８はＧｌｎに変異してもよい。最後に、Ａ鎖は、Ａ２２およびＡ２３などのＣ末端伸展を含んでもよい。位置Ａ２２およびＡ２２のアミノ酸残基は、酸性のｐＨ範囲で良好な溶解性を与えるリジン残基であってもよく、アミド分解に対してさらに分子を安定させる。

「ｄｅｓＢ３０又はＢ(１−２９)」とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠いている天然のインスリンＢ鎖又はそのアナログを意味し、「Ａ(１−２１)」は、天然のインスリンＡ鎖又はそのアナログないしは誘導体を意味する。
「インスリンアナログ」とは、一又は複数のアミノ酸の置換、付加又は欠失及びこれらの組合せによる天然の分子からの逸脱を有する分子を意味する。
「インスリン誘導体」とは、一又は複数の主鎖アミノ酸残基に付着される化学基を有するインスリン分子を意味する。

本発明に係るアナログの位置の番号付けは、ヒトのインスリン分子に基づく。ゆえに、「Ｂ２７」はヒトインスリンのＢ鎖の位置２７のアミノ酸残基(Ｎ末端から計数した)を意味し、「Ａ１」はヒトインスリンのＡ鎖の位置１のアミノ酸残基(Ｎ末端端から計数した)をそれぞれ意味する。一又は複数の天然のアミノ酸残基が欠失された場合であっても、この番号付けシステムは維持される。ゆえに、「Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２５,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン」と称されるインスリンアナログは、Ｂ鎖にＣ末端配列Ｔｈｒ-Ａｓｐ-Ｌｙｓを有する。
アミノ酸残基は、３文字アミノ酸コード又は１文字アミノコードで示される。明確に示されない限り、本明細書において言及するアミノ酸はＬ-アミノ酸である。さらに、特に明記しない限り、ペプチドのアミノ酸配列の左右の端はそれぞれＮ-およびＣ末端である。
本明細書において用いられる「単量体インスリン」なる用語は、ヒトインスリンよりも自己会合(二量体および六量体に)する傾向が低いヒトインスリンアナログを指す。

製薬的組成物
本発明の速効型インスリンを場合によって持効型インスリンアナログないしは誘導体と混合して含有する組成物は、インスリンに対して感受性がある状態の治療において使用され得る。したがって、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病、ならびに例えば重篤なけがをした人及び主要な手術を経験した人においてしばしば見られる高血糖の治療において使用され得る。任意の患者に適する用量レベルは、用いる特定のインスリンアナログないしは誘導体の効力、患者の年齢、体重、身体活性、及び食事、他の薬剤との可能な組み合わせ、ならびに治療されるべき状態の重症度を含む種々の因子に依存するであろう。本発明のインスリンアナログないしは混合物の一日量は、既知のインスリン組成物に対してと同様に当業者により個々の患者に対して決定されることが推奨される。
通常、本発明の製薬的組成物は皮下に投与される。しかしながらまた、組成物は、インスリンポンプに用いられてもよいし、肺の(pulmunal)投与のために調製されてもよい。

製薬的組成物は、通常のアジュバント及び添加剤を含有するであろうし、好ましくは水溶液として調製される。水溶媒質は、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグリセロールによって等張性にされる。さらに、水溶媒質は、亜鉛イオン、バッファ及び防腐剤を含有してもよい。組成物のｐＨ値は所望の値に調整され、対象のインスリンの等電点(ｐＩ)に応じて、およそ３〜およそ８．５、好ましくはおよそ３〜およそ５又はおよそ６．５〜およそ７．５であってもよい。
速効型インスリンアナログと持効型インスリンは、およそ１０／９０％、およそ３０／７０％、又はおよそ５０／５０％の比率で混合されうる。一実施態様では、持効型インスリンと速効型インスリンとのモル比は２／１より大きい。

本発明に係る製薬的調製物に用いられるバッファは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はこれらの混合物から選択されてもよい。
薬学的に許容可能な防腐剤は当分野で周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。
等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖質又は糖アルコール、アミノ酸又はアルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)からなる群から選択されてよい。製薬的組成物での等張剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995を参照されたい。等張剤は、一般的に１ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。更なる実施態様では、等張剤は、１ｍｇ／ｍｌから７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍ、または２５ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

本発明は以下の実施例にさらに詳細に記載されており、これらの実施例は特許請求の範囲としてあげられる本発明の権利範囲を限定するものではない。添付の図は、明細書及び本発明の説明の不可欠な部分として認識されるものである。本明細書中に示した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、その全体ならびに各参考文献が個々にかつ具体的に出典明記によって援用されることが示され、その全体がここに示されているのと同じ範囲で、本明細書の一部として援用される(法律により許容される最大限の範囲)。
項目及び副項目は、便宜上のためのみに使用され、本発明を限定するように解釈されるべきでない。
本明細書中における例又は例示的な言葉（「例えば」及び「〜のような」）の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図しており、示さない限り本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の記載は、権利請求されていないあらゆる要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
特許書類の引用及び援用は、ここでは便宜的にのみなされ、そのような特許書類の妥当性、特許性、及び／又は実施可能性の見解を示すものではない。

一般的な手順
すべての発現プラスミドは、Ｃ-ＰＯＴの種類のものであり、欧州特許第１７１１４２号に記載のものと類似しており、出芽酵母(S. cerevisiae)中での安定性及びプラスミド選別の目的で分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(ＰＯＴ)を含有することを特徴とする。また、プラスミドは、出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーターを含有する。これらの配列は、リーダーとインスリン生成物の融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片の配列を除くすべての配列が、プラスミドｐＫＦＮ１００３(国際公開第９０／１０００７５号に記載)の対応配列と類似している。異なる融合タンパク質を発現させるために、ｐＫＦＮ１００３のＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片は、単に対象のリーダー-インスリン融合をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片によって置換する。このようなＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片は、標準的な技術に従って合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲと用いて合成してもよい。

酵母形質転換体は、宿主株として出芽酵母株ＭＴ６６３ (ＭＡＴａ／ＭＡＴα ｐｅｐ４-３／ｐｅｐ４-３ＨＩＳ４/ｈｉｓ４ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：ＬＥＵ２Ｃｉｒ^＋)を形質転換して調製した。酵母株ＭＴ６６３は、国際公開第９２／１１３７８号の出願に関連して、寄託番号ＤＳＭ６２７８としてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託された。

ＭＴ６６３はＹＰＧａＬ(１%バクト酵母抽出物、２%バクトペプトン、２%ガラクトース、１%ラクトース)にて０．６のＯＤ６００ｎｍまで生育した。１００ｍｌの培養物は、遠心分離にて回収し、１０ｍｌの水にて洗浄し、再び遠心分離して、１．２Ｍソルビトール、２５ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌジチオトレイトールを含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁した。懸濁液を３０℃で１５分インキュベートして、遠心分離し、細胞を１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡ、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、及び２ｍｇＮｏｖｏｚｙｍ(登録商標)２３４を含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁した。懸濁液を３０℃で３０分間インキュベートし、細胞を遠心分離にて回収し、１０ｍｌの１．２Ｍソルビトール及び１０ｍｌのＣＡＳ(１．２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭトリスＨＣｌ(トリス＝トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン) ｐＨ＝７．５)にて洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁した。形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ-懸濁細胞を、およそ０．１ｍｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温に１５分間放置した。１ｍｌの(２０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ＝７．５)を加えて、混合物を室温にさらに３０分間放置した。混合物を遠心分離し、ペレットを０．１ｍｌのＳＯＳ(１.２Ｍソルビトール、３３% ｖ/ｖＹＰＤ、６.７ｍＭＣａＣｌ_２)に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。その後、懸濁物を遠心分離して、ペレットを０．５ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁した。その後、６ｍｌのトップアガー(１．２Ｍソルビトールと２．５％アガーを含有する、Sherman等 (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor LaboratoryのＳＣ培地)を５２℃で加え、同じ寒天凝固のソルビトール含有培地を含むプレートの上に懸濁物を注いだ。
発現プラスミドにて形質転換された出芽酵母(S. cerevisiae)株ＭＴ６６３はＹＰＤ中、３０℃で７２時間生育される。発現され分泌されたインスリン前駆体は従来の方法によって単離され、上記のように従来のインビトロ酵素変換により本発明に係る所望のインスリンアナログに変換される。

実施例１
インスリン製剤の平衡溶解度
Ｚｎ^２＋、フェノール及びグリセロールを市販の製品に近い濃度で含むか又は１２０ｍＭＮａＣｌを含む、速効型インスリンアナログの保存溶液又は速効型インスリンアナログと持効型インスリン(インスリングラルギン)との混合物の保存溶液を調製し、ｐＨ溶解性質のアルカリエンドポイントに相当する所望の値にｐＨを調整した。これらの貯蔵溶液から試料を取り出し、ｐＨ３−８の範囲の所望の値にｐＨを調整し、０．３ｍｌの試料を２３℃で少なくとも４日間インキュベートした。各試料の遠心分離(２３℃で２０分間、２００００ｇ)の後、ｐＨを測定し、ＸＴｅｒｒａＲＰ８Ｇｕａｒｄカラム(Waters)、５０×２０ｍｍ、５ミクロン粒径にて、３５℃で２ｍｌ／分で溶出させた、又はＧｅｍｉｎｉ３ｕＣ１８１１０Ａカラム(Phenomenex)、５０×２．０ｍｍ、３ミクロン粒径にて、３５℃で０．８ｍｌ／分で溶出させた、逆相ＨＰＬＣ分析によって上清中のインスリン含量の定量により溶解性を決定した。インスリンは、リン酸緩衝液ｐＨ＝７．２にて、およそ７％(ｗ／ｗ)アセトニトリルから始め、その後およそ６５％(ｗ／ｗ)の濃度にアセトニトリルを段階的に増加させて、溶出する。

純水中又はインスリングラルギンとの混合製剤中の、本発明の様々なインスリンアナログ(対照としてインスリンアスパルト)のｐＨに対する平衡溶解度を、図１−４に示す。各図において、パネルＡは、インスリングラルギンと比較したときの各インスリンアナログのｐＨに対する水中の非混合製剤中の溶解度を表す。パネルＢおよびＣは、薬学的製剤に近い調製物(パネルＢ：０．３ｍＭインスリングラルギンおよび０．３ｍＭＺｎ^２＋、１６ｍＭｍ-クレゾール、１６ｍＭフェノール及び１．６％グリセロールと混合した０．３ｍＭインスリンアナログ)、又は１２０ｍＭＮａＣｌ、１．６％グリセロール(パネルＣ：１．６％グリセロール、１２０ｍＭＮａＣｌを含む０．３ｍＭインスリンアナログおよび０．３ｍＭインスリングラルギン)のいずれかにおける混合製剤中の各インスリンの溶解度であり、１２０ｍＭＮａＣｌは皮下組織に存在するイオン強度に相当する。
表１では、これらの溶解性は、混合時の中性ｐＨでの個々のインスリンアナログの溶解性が別々の調製物中での溶解性と比較して損なわれていない場合、「Ｌａｎｔｕｓ(登録商標)混合性」との見出しの欄に「＋」として表す。インスリングラルギンが中性ｐＨで沈殿する場合の他の用語では、本発明のインスリンアナログは完全に可溶性であるが、我々は２つのアナログが混合可能であるとみなし、これを表１では「＋」と表す。

実施例２
Ｂ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン及びインスリングラルギンの調製物のグルコース利用
本発明のインスリン調製物の皮下注射後のグルコース利用効果は、Kurtzhals & Ribel, Diabetes 44, 1381-1385, (1995)にて記載されるように、ブタクランプモデルを用いて特徴を表した。
図５は、０．６ｍＭＢ１０Ｑ,ｄｅｓＢ２６,Ｂ２８Ｅ,ｄｅｓＢ３０、１９ｍＭフェノール、１９ｍＭｍ-クレゾール、１．６％グリセロール、ｐＨ＝３．２(合計９０ｎｍｏｌのインスリンアナログ)およびインスリングラルギン(合計２１０ｎｍｏｌのインスリングラルギン)の別々の注入、又は使用前に３０:７０(モル基準)に混合した前記２つのインスリンの調製物(合計３００ｎｍｏｌの２つのインスリンアナログ)の単回注入のいずれかを皮下投与した後のブタにおけるグルコース利用を比較する。別々に投与した後と比較したときの混合調製物の投与後のグルコース利用は、実験的不確実性の範囲内で差異がない。

実施例３
異なる製剤における多くの本発明のインスリンアナログのＰＫ性質は、ブタへの皮下注入後の皮下貯蔵物からの消失率によって特徴付けた。Ｔ_５０％は、外的γ−計測器にて測定されるとき、Ａ１４Ｔｙｒ(^１２５Ｉ)インスリンの５０％が注入部位から消失した時の時間である(Ribel et al., The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. In: M. Serrano-Rtios and P.J. Lefebre (Eds): Diabetes (1985) Proceedings of the 12th congress of the International Diabetes Federation, Madrid, Spain, 1985 (Excerpta Medica, Amsterdam (1986), 891-896)。多くの本発明のインスリンアナログのＴ_５０％値を表１に表し、消失曲線の例を図６に示す。ＮｏｖｏＲａｐｉｄ(登録商標)製剤のインスリンアスパルト(Ｂ２８Ｄヒトインスリン)を対照として、すべての実験に含めた。
試験結果を表１に示す。
(１)は、生化学的方法アッセイ(II)を指す。
(２)は、生化学方法アッセイ(III)を指す。
(３)は、生化学方法アッセイ(IV)を指す。
(４)は、実施例３に記載のように測定される、０．６ｍＭインスリンアナログ、１９ｍＭフェノール、１９ｍＭｍ-クレゾール、１．６％グリセロール、３．０と４．０の間のｐＨの製剤を指す。
(５)は、実施例３に記載のように測定される、０．１８ｍＭインスリンアナログ、１．６８ｍＭインスリンデテミル、０．８４ｍＭＺｎ、１９ｍＭフェノール、１９ｍＭｍ-クレゾール、１．６％グリセロール、１０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４以下、又は０．３ｍＭインスリンアナログ、１．２ｍＭインスリンデテミル、０．８４ｍＭＺｎ、１９ｍＭフェノール、１９ｍＭｍ-クレゾール、１．６％グリセロール、１０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．４以下の製剤を指す。
(６)は、列挙するモル比のＬａｎｔｕｓ(登録商標)と(４)の製剤との混合物を指す。実施例３に記載のように測定される。
(７)は、実施例１に記載のように測定される、個々のインスリン種の溶解性を指す。
(８)は、サイズ排除クロマトグラフィ(生化学方法アッセイ(I))にて測定される混合能を指す。単量体及び六量体としてそれぞれ溶出する材料についての測定された分布と、モル比から算出される理論上の分布を括弧内に示す。このシステムにおけるインスリンデテミルは部分的単量体及び部分的六量体として溶出される。
(９)は、ＮＵＶ−ＣＤ方法(生化学方法アッセイ(VI))。

表１

薬理学的方法
アッセイ(I)
サイズ排除クロマトグラフィ(ＳＥＣ)は基本的にHavelund等 2004 Pharmaceutical research, 21, 1498-1504に記載のように行った。クロマトグラフィシステムは、３７℃のトリス緩衝等張生理食塩水(ＮａＣｌ１４０ｍＭ、トリス／ＨＣｌ１０ｍＭ、ＮａＮ_３０．０１%、ｐＨ７．５)、１％のカラム容量を注入し、カラム容量当たり９０分の流速を用いて溶出したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲＰＣ６／３０カラム(GE healthcare)と２７６ｎｍのＵＶ検出であった。参照物質は、安定インスリン単量体インスリンＸ２(ＡｓｐＢ９、ＧｌｕＢ２７ヒトインスリン、亜鉛フリー)、安定六量体インスリン：Ｃｏ(III)インスリン、アルブミン(ＨＳＡ)及び共有結合性アルブミン(溶液中で形成)とした。

アッセイ(II)
インスリンレセプター結合
ヒトインスリンレセプターのインスリンアナログの親和性は、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕獲アッセイにて測定することができる。ＳＰＡ−ＰＶＴ抗体-結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号ＰＲＮＱ００１７)を２５ｍｌの結合バッファ(１００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７.８；１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭＭｇＳＯ_４、０.０２５% Ｔｗｅｅｎ-２０)と混合する。単一ＰａｃｋａｒｄＯｐｔｉｐｌａｔｅ(Packard番号６００５１９０)用の試薬混合物は、２．４μｌの１：５０００に希釈した精製した組み換えヒトインスリンレセプター-エクソン１１、１００μｌの試薬混合物当たり５０００ｃｐｍに相当するＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-ヒトインスリンのある量の貯蔵溶液、１２μｌの１：１０００に希釈したＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ-ビーズ及び総量を１２ｍｌにする結合バッファからなる。次いで、総量１００μｌを加え、希釈物を適当な試料から作製する。１００μｌの試薬混合物を希釈物に加え、試料をゆっくりと撹拌しながら１６時間インキュベートする。次いで、この相を１分間遠心分離して分離し、プレートをＴｏｐｃｏｕｎｔｅｒにて計数する。結合データは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ２.０１(GraphPad Software, San Diego, CA)に非線形回帰アルゴリズムを用いてフィッティングする。

アッセイ(III)
インスリンアナログの生物学的能力、ラットフリー脂肪細胞アッセイ
ラットを屠殺し、精巣上体脂肪パットを取り出し、分解バッファにおく。勢いよく振とうしながら３７℃で１時間分解を行う。組織細片を取り除くために細胞懸濁液を濾過し、脂肪細胞を２回洗浄し、インキュベーションバッファに再懸濁する。０．１ｍｌの細胞懸濁液は、１０μｌのグルコース溶液および１０μｌのインスリン又は他の化合物と共に、ゆっくりと振とうしながら３７℃で２時間インキュベートする。１５０μｌのシンチレーターを加えてインキュベートを止め、計数する。
内部標準および未知試料のＥＣ５０を比較することによって能力の算出を行う。曲線のフィッティングは、一定の最低及び最大の応答を予想する４パラメータロジスティックモデルである。

アッセイ(IV)
ヒトインスリン様増殖因子-１レセプター(ｈＩＧＦ-１Ｒ)に対するインスリンアナログの結合
ヒトインスリン様増殖因子-１レセプター(ｈＩＧＦ-１Ｒ)に対するインスリンアナログの親和性は、ＳＰＡ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体キャプチャアッセイにて測定することができる。抗マウスＰＶＴＳＰＡビーズ(５００ｍｇ、GE Life Sciences # RPNQ0017)は、２５ｍｌの結合用バッファ(１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ_４、０．０２５％ツイーン-２０、ｐＨ＝７．８)と混合する。単一９６ウェルマイクロタイタープレート(Optiplate-96 Perkin-Elmer # 6005190)のための混合試薬は、４０μｌの精製された組み換えｈＩＧＦ-１Ｒ(Novo Nordisk A/S)、１２μｌの抗ｈＩＧＦ-１Ｒモノクローナル抗体(クローン２４−３１)の１：１６希釈物、３ｍｌのＳＰＡビーズ懸濁物及び全量１２ｍｌになるまでの結合バッファからなる。次いで、２５μｌのＩＧＦ-１の一連の希釈物に、インスリン又はインスリンアナログ、１００μｌの混合試薬および１００００ｃｐｍに相当する[１２５Ｉ]Ａ１４Ｔｙｒ-ヒトＩＧＦ-１の２５μｌの希釈物を加える。試料は、穏やかに撹拌しながら室温で１６時間インキュベートする。次いで、プレートを１０００ｒｐｍにて１分間遠心し、ＰａｃｋａｒｄＴｏｐＣｏｕｎｔＮＸＴにて計数する。結合データは、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０３(GraphPad Software, San Diego, CA)の４-パラメータ非線形回帰アルゴリズム(Ｓ字形用量-反応)を用いてフィットさせる。

アッセイ(V)
インスリンアナログの持効型アナログとの混合能、ＮＭＲベースの方法
ＮＭＲスペクトルのタンパク質及びペプチドからのシグナルは、局所の化学環境に非常に影響される。その結果、我々は、インスリンの混合能のためのプローブにＮＭＲシグナルを用いることができる。^１５Ｎ標識されたｄｅｓＢ３０インスリンについて、^１Ｈ−^１５ＮＨＳＱＣＮＭＲスペクトルのＮＨ基からのシグナルの位置は公知である。^１５Ｎ標識ｄｅｓＢ３０インスリンを非標識のアナログと混合した場合の^１Ｈ−^１５ＮＮＭＲスペクトルの変化をモニターすることができる。ｄｅｓＢ３０インスリンの^１Ｈ−^１５ＮＨＳＱＣＮＭＲスペクトルおよびあるアナログと混合したｄｅｓＢ３０のスペクトルを比較する。アナログが混合物中に存在する場合に^１５ＮｄｅｓＢ３０の^１Ｈ−^１５ＮＨＳＱＣスペクトルに新規なピークが現れた場合、^１５ＮｄｅｓＢ３０インスリンのＮＨ基の局所の環境における変化を示す。また、これは、二量体／六量体の混合が形成されたことが、２つの成分が混合可能でないことを意味することを示す。
^１Ｈ−^１５ＮＨＳＱＣＮＭＲスペクトルは、コールドプローブを備えたＶａｒｉａｎＩｎｏｖａ６００ＮＭＲ分光光度計にて記録した。すべてのデータは３７℃の温度で再記録した。インスリン(^１５ＮｄｅｓＢ３０および選択されたアナログ)は別々に水に溶解し、混合し、最終溶媒系は、３０ｍＭフェノール-ｄ、１０ｍＭＮａＣｌ、１４ｍｇ／ｍｌプロピレングリコール-ｄ及び８ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１ｍＭＺｎ、９０％Ｈ_２Ｏ／１０％Ｄ_２Ｏである。
インスリン濃度は、０．２ｍＭ ^１５ＮｄｅｓＢ３０及び０．０５ｍＭの選択されたインスリンアナログであった。比較のために、^１５ＮｄｅｓＢ３０のＮＭＲスペクトルを同一の溶媒条件下で記録した。
このアッセイにおいて本発明に係るインスリンアナログを試験した場合、大部分のアナログがｄｅｓＢ３０インスリンと混合可能であることが明らかとなったことから、これらはまた、Ｂ２９内の付加したアシル基を除いて分子のこの領域内にｄｅｓＢ３０インスリンと同じアミノ酸組成を有するインスリンデテミルとも混合可能であろうことが示される。

アッセイ(VI)
単量体／二量体平衡の評価、ＮＵＶ−ＣＤベースの方法
インスリンアナログの単量体化、ＮＵＶ−ＣＤ
３５０−２５０ｎｍのＮＵＶ−ＣＤ(近ＵＶ円二色性)スペクトルはチロシン発色団の環境を反映し、凝集に非常に敏感であり、ゆえに、単量体と二量体／高次凝集との平衡のレポーターとして有用であり、数値は単量体種では低く(低濃度)、二量体種では高い(参考までに、ヒトインスリンは最も濃度が高い)。
ＮＵＶＣＤスペクトルは、(＋)-１０-カンフルスルホン酸にて較正したＪａｓｃｏＪ-７１５分光旋光計を使用して２０℃で記録した。ＣＤは、近ＵＶ範囲(２５０−３５０ｎｍ)のタンパク質のモル濃度に正規化したΔε(Ｍ−１ｃｍ−１)として表され、濃度に対する２７６ｎｍのシグナルは単量体化のレポーターとして用いる。
表１では、「単量体−＞１ｍＭ(ＮＵＶ−ＣＤ)」との見出しを付けた欄の「＋」は、試験したインスリンアナログが主に単量体形態であったことを示す。

Claims

以下の（１）ないし（１３）の変異から選択される一組のアミノ酸変異を含む、天然インスリンの速効型インスリンアナログ：
（１）Ｂ１０Ｑ、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（２）Ｂ１０Ｑ、ｄｅｓＢ２７、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（３）Ｂ１０Ｑ、Ｂ２２Ｅ、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（４）Ｂ１０Ｑ、ｄｅｓＢ２６、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（５）Ｂ１０Ｑ、Ｂ２６Ｅ、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（６）Ｂ１０Ｑ、ｄｅｓＢ２５、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（７）Ｂ１０Ｑ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（８）Ａ２１Ｇ、ｄｅｓＢ１、Ｂ３Ｔ、Ｂ１０Ｑ、Ｂ２８Ｄ、Ｂ２９Ｐ、及びＢ３０Ｋ；
（９）Ａ２１Ｇ、Ｂ１０Ｑ、ｄｅｓＢ２７、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（１０）Ａ２１Ｇ、Ｂ１０Ｑ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（１１）Ａ２１Ｇ、ｄｅｓＢ１、Ｂ３Ｑ、Ｂ１０Ｑ、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；
（１２）Ａ２１Ｇ、ｄｅｓＢ１、Ｂ３Ｑ、Ｂ１０Ｑ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０；及び
（１３）Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｔ、Ｂ１０Ｑ、ｄｅｓＢ２７、Ｂ２８Ｅ、及びｄｅｓＢ３０。
糖尿病の治療の使用のための、請求項１に記載の速効型インスリンアナログ。
請求項１に記載の速効型インスリンアナログを持効型インスリンアナログないしは誘導体との混合物で含有する薬学的製剤。
持効型インスリンがアシル化されたインスリン誘導体である、請求項３に記載の薬学的製剤。
持効型アシル化インスリンがＬｙｓ^Ｂ２９(Ｎ^ε-テトラデカノイル)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン(インスリンデテミル)である、請求項４に記載の薬学的製剤。
持効型インスリンがＡ２１Ｇｌｙ,Ｂ３１Ａｒｇ,Ｂ３２Ａｒｇヒトインスリン(インスリングラルギン)である、請求項４に記載の薬学的製剤。