JP5647222B2 - Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド - Google Patents

Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド Download PDF

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Description

本発明は、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に指向性を有し及び／又は（本明細書で規定のように）これと特異的に結合することができるアミノ酸配列に、並びに１つ又は複数のこのようなアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチドに関する（それぞれ本明細書中で、「本発明のアミノ酸配列」、「本発明の化合物」、「本発明の構築物」及び「本発明のポリペプチド」とも称される）。
本発明は、このようなアミノ酸配列及びポリペプチドをコードする核酸（本明細書中で「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）に、このようなアミノ酸配列及びポリペプチドを調製する方法に、このようなアミノ酸配列又はポリペプチドを発現する、又は発現することができる宿主細胞に、このようなアミノ酸配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物に、並びに特に本明細書で言及する予防目的、治療目的又は診断目的のような予防目的、治療目的又は診断目的のためのこのようなアミノ酸配列若しくはポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用にも関する。
本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
元々Ｂ細胞分化因子として同定されたタンパク質であるＩＬ−６（非特許文献１、特許文献１）と、ＩＬ−６Ｒ（非特許文献２、特許文献２）との相互作用によって、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のフォーマット形態がもたらされる。この複合体は、標的細胞上の膜タンパク質であるｇｐ１３０（非特許文献３、特許文献３）と結合し、ＩＬ−６の様々な生理作用を伝える。現在ＩＬ−６は、とりわけ免疫応答の調節、造血、急性期応答、骨代謝、血管形成、及び炎症に関与することが知られている。ＩＬ−６産生の脱調節は、幾つかの自己免疫疾患プロセス及び慢性炎症増殖性疾患プロセスの病変に関与する（非特許文献４）。結果として、過去にはＩＬ−６誘導性シグナル伝達の阻害因子に大きな注目が集まった（非特許文献５）。ＩＬ−６（非特許文献６、特許文献４）、ＩＬ−６Ｒ（特許文献５）又はｇｐ１３０（非特許文献７、特許文献６）と特異的に結合するポリペプチドがＩＬ−６の機能化に対して効率的な効果を示すことが証明された。
ＩＬ−６過剰産生及びシグナル伝達（特にいわゆるトランスシグナル伝達（trans-signalling））は、様々な疾患及び障害（例えば敗血症（非特許文献８）、及び多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病（非特許文献６）、リンパ腫、Ｂリンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺がん等の様々な形態のがん）に関与する。過剰なＩＬ−６産生又はシグナル伝達によって引き起こされる他の疾患の非限定的な例としては、骨吸収（骨粗鬆症）（非特許文献９、非特許文献１０）、悪液質（非特許文献１１）、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（非特許文献１２）、炎症性疾患及び障害（例えば関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症）（非特許文献１３）；クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）及び自己免疫インスリン依存性糖尿病（非特許文献１４）が挙げられる。他のＩＬ−６関連障害は当業者にとって明らかである。
例えば上記の参考文献から分かるように、従来技術は、ＩＬ−６関連障害の予防及び治療のためのヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−６Ｒ及びヒトｇｐ１３０タンパク質に指向性を有する抗体及び抗体断片を説明している。例は、トシリズマブ（非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８を参照されたい）、ＢＥ８（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２を参照されたい）及びCentocorのＣＮＴＯ−３２８（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５を参照されたい）である。ＩＬ−６関連障害の予防及び治療のための当該技術分野で既知の別の活性成分は、可溶性ｇｐ１３０のＦｃ融合体である（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献２８、非特許文献２９を参照されたい）。ＩＬ−６Ｒ及びそれを含むポリペプチドに指向性を有するアミノ酸配列及びナノボディは特許文献７に記載されている。
欧州特許第０２５７４０６号 欧州特許第０３２５４７４号 欧州特許第０４１１９４６号 欧州特許第０３１２９９６号 欧州特許第０４０９６０７号 欧州特許第０５７２１１８号 国際公開第０８／０２００７９号
Hirano et al.,1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5490-4 Yamasaki et al.,1988, Science, 241: 825-8 Taga et al., 1989, Cell, 58: 573-81 Ishihara andHirano, 2002, Biochim. Biophys. Acta, 1592: 281-96 Hirano et al.,1990, Immunol. Today, 11: 443-9 Klein et al.,1991, Blood, 78: 1198-204 Saito et al.,1993, J. Immunol. Methods, 163: 217-223 Starnes etal., 1999, J. Immunol., 148: 1968 Roodman etal., 1992, J. Bone Miner. Res.,7: 475-8 Jilka et al.,1992, Science, 257: 88-91 Strassman etal., 1992, J. Clin. Invest. 89: 1681-1684 Emilie et al.,1994, Int. J. Immunopharmacol. 16: 391-6 Grau et al.,1990, J. Exp. Med. 172: 1505-8 Campbell et al.,1991, J. Clin. Invest. 87: 739-742 Woo et al.,2005, Arthritis Res. Ther. 7: 1281-8 Nishimoto etal., 2005, Blood 106: 2627-32 Ito et al.,2004, Gastroenterology, 126: 989-96 Choy et al.,2002, Arthritis Rheum. 46: 3143-50 Bataille et al.,1995, Blood 86: 685-91 Emilie et al.,1994, Blood 84: 2472-9 Beck et al.,1994, N. Engl. J. Med. 330: 602-5 Wendling etal., 1993, J. Rheumatol. 20:259-62 Journal ofClinical Oncology, 2004, 22/14S: 2560 Journal ofClinical Oncology, 2004, 22/14S: 2608 Int. J. Cancer,2004, 111:592-5 Becker et al.2004, Immunity, 21: 491-501 Doganci et al.,2005, J. Clin. Invest. 115: 313-25 Nowell et al.,2003, J. Immunol. 171: 3202-9 Atreya et al.,2000, Nat. Med. 6: 583-8
本発明の具体的であるが、非限定的な目的は、他の有利な特性（例えば調製のしやすさの改善及び／又は製品コストの削減等）に加えて、従来技術のアミノ酸配列、抗体及びナノボディと比較して改善した治療特性及び／又は薬理特性を有するアミノ酸配列、ポリペプチド、並びに治療用の化合物及び組成物を提供することである。これらの改善された有利な特性は本明細書中のさらなる記載から明らかとなる。限定されるものではないが、本発明により提供されるアミノ酸配列、ポリペプチド、並びに治療用の化合物及び組成物は改善された結合及び／又は親和性、改善された結合活性（avidity：親和力）、改善された有効性及び／又は効力、増大した選択性を有し得る、及び／又はこれらはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を一部又は好ましくは完全に遮断することが可能であり、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体によるシグナル伝達を阻害する。
概して本発明の目的は、（本明細書で規定のように）１つ又は複数のＩＬ−６Ｒ関連障害の診断、予防及び／又は治療に使用することができる薬理学的に活性な作用物質及びそれを含む組成物を提供すること；並びにこのような作用物質及び組成物の投与及び／又は使用を伴うこのような疾患及び／又は障害を診断、予防及び／又は治療する方法を提供することである。
本発明は、改善された親和性及び／又は結合活性でインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）に指向性を有し及び／又は（本明細書で規定のように）これと特異的に結合することができ、及び／又は改善された有効性及び／又は効力を有し、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を（一部又は好ましくは完全に）遮断することが可能であり、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体によるシグナル伝達を阻害する、アミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列（複数可）」とも称される）に関する。より具体的には本発明は、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、若しくは
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、若しくは
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、若しくは
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを１つ又は複数含む、アミノ酸配列を提供する。
ＩＬ−６Ｒ上でのそのエピトープとの結合のために、アミノ酸配列は通常、そのアミノ酸配列内に１つ又は複数のアミノ酸残基又は１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチ（本明細書でさらに規定のような、すなわちそれぞれの「ストレッチ」は、互いに隣接しているか、又は互いに近接している（すなわちそのアミノ酸配列の一次構造又は三次構造において）２つ以上のアミノ酸残基を含む）を含有し、それを介して本発明のアミノ酸配列はＩＬ−６Ｒ上のエピトープと結合することができる。このようにしてこれらのアミノ酸残基又はアミノ酸残基ストレッチは、ＩＬ−６Ｒ上のエピトープと結合する「部位」（本明細書でさらに規定のように、本明細書では「抗原結合部位」とも称される）を形成する。
本発明はＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープと結合するのに特に適した（本明細書で規定のような）多くのアミノ酸残基ストレッチを提供する。これらのアミノ酸残基ストレッチは特に本発明のアミノ酸配列の抗原結合部位（の一部）を形成するように、本発明のアミノ酸配列に存在していても、及び／又は本発明のアミノ酸配列に組み込まれていてもよい。得られたアミノ酸配列自体が、ＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位にある、ＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位の一部を形成する、又はＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位と重複する（すなわち一次構造又は三次構造で）、又はＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位に近接している（すなわち一次構造又は三次構造で）ＩＬ−６Ｒ上の特異的エピトープと（例えばＩＬ−６と競合的に）結合する。得られたアミノ酸配列自体がＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を一部又は好ましくは完全に遮断することが可能であり、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を介したシグナル伝達を阻害する。これに関連して、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドはＩＬ−６受容体との結合に関してＩＬ−６と競合することができるようなものであるのが好ましい。本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドは、例えば実施例１１に記載のアッセイにおいて、ＩＬ−６受容体との結合に関して、市販のヒト−マウス再構成キメラモノクローナル抗ＩＬ−６Ｒ抗体であるトシリズマブ（ＭＲＡ）（Chugai/Roche）又はその抗原結合断片と競合することができるようなもの（例えば国際公開第９２／１９７５９号及び対応する欧州特許第０６２８６３９号、並びにShinkura et al., 1998, Anticancer Research 18, 1217-1222を参照されたい）；及び／又はＩＬ−６Ｒ上のトシリズマブと同じエピトープ若しくは結合部位と、又は上記結合部位に近い及び／又は上記結合部位と重複したエピトープと結合することができるようなものであるのが好ましい。
また、本発明のアミノ酸配列は、ＩＬ−６受容体との結合に関して配列番号１及び配列番号２により規定のような参照ＩｇＧ及び／又は配列番号３及び配列番号４により規定のような参照Ｆａｂと競合することができるようなもの（実施例１を参照されたい）；及び／又はＩＬ−６Ｒ上の上記参照ＩｇＧ若しくは上記参照Ｆａｂと同じエピトープ若しくは結合部位と、又は上記結合部位に近い及び／又は上記結合部位と重複したエピトープと結合することができるようなものであるのが好ましい。上記参照ＩｇＧ及び参照Ｆａｂの調製及び配列に関しては、以下の実施例１、及び配列番号１〜配列番号４を参照する。
本発明は最も広範な意味で、これらのアミノ酸残基ストレッチにより（本明細書でさらに規定のように）或る特定の親和性及び／又は効力で本発明のアミノ酸配列がＩＬ−６Ｒ上の特異的エピトープと結合していれば、これらのアミノ酸残基ストレッチが本発明のアミノ酸配列において有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことに留意すべきである。このため概して、本発明は最も広範な意味で、ＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープと結合することが可能であり、かつアミノ酸配列全体がＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープと結合することが可能な結合ドメイン及び／又は結合単位を形成するように、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を介して互いに好適に連結する本明細書に記載のような１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチ（特に２つ以上のこのようなアミノ酸残基ストレッチの好適な組合せ）を含む任意のアミノ酸配列を含む。しかしながら、本発明のアミノ酸配列にこのようなアミノ酸残基ストレッチが１つでも存在していれば、それ自体で既に、ＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープと結合することが可能な本発明のアミノ酸配列を提供するのに十分であるといえることにも留意すべきである（例えばここでもまた、国際公開第０３／０５０５３１号に記載される、いわゆる「促進断片（Expedite fragments）」を参照する）。
これらの特異的なアミノ酸残基ストレッチを１つ又は複数含むアミノ酸配列は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を一部又は完全に遮断する、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を介したシグナル伝達を阻害する能力に加えて、例えば結合及び／又は親和性の改善、結合活性の改善、有効性及び効力の改善、及び／又は選択性の増大のような特性の改善を示す。
より具体的には、これらの特異的なアミノ酸残基ストレッチを１つ又は複数含む本発明のアミノ酸配列は、好ましくは
１ｎＭ〜１ｐＭ以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１ｎＭ〜１ｐＭ以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザル（cyno）ＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、
（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができる。
本発明のアミノ酸配列とＩＬ−６Ｒとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値が本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
例えばKitamura et al. （1989, J. Cell Physiol., 140: 323）に記載のようなＴＦ−１アッセイにおいて、本発明のアミノ酸配列は、１０ｎＭ〜５０ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは１ｎＭ〜５０ｐＭ以下、例えば約７５０ｐＭ又は５００ｐＭ以下のＩＣ５０値（１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のアミノ酸配列は、５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは２５ｎＭ〜１ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１ｎＭ以下、例えば約８ｎＭ以下のＩＣ５０値（５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のアミノ酸配列は配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のアミノ酸配列はトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＩＬ−６のＥＣ５０値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような２７．２９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明のアミノ酸配列は５００ｐＭ〜５０ｐＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは２００ｐＭ〜５０ｐＭ以下、例えば１５０ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。ＩＬ−６のＥＣ９５値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような８８５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明のアミノ酸配列は１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、好ましくは７５０ｐＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは５００ｐＭ〜１００ｐＭ以下、例えば４００ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。この血漿効力アッセイでは、本発明のアミノ酸配列は配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。この血漿効力アッセイでは、本発明のアミノ酸配列はトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＣＨＯ細胞上での膜ＩＬ−６Ｒとの結合を規定するアッセイでは、本発明のアミノ酸配列は１０ｎＭ〜１００ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは２ｎＭ〜１０ｐＭ以下、例えば２ｎＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。
好ましい態様において、本発明のアミノ酸配列は、（ｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがａ）若しくはｂ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ｃ）、ｄ）、ｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応し、（ｉｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがｃ）若しくはｄ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ａ）、ｂ）、ｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応し、又は（ｉｉｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）若しくはｄ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応するように、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、若しくは
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、若しくは
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、若しくは
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを２つ以上含み得る。
さらにより好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸残基ストレッチが
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
第２のアミノ酸残基ストレッチが
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
第３のアミノ酸残基ストレッチが
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸残基ストレッチを３つ以上含む。
本発明が、本発明のアミノ酸配列（又はこれを発現するのに使用される本発明のヌクレオチド配列）の起源に関しても、また本発明のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を生成又は入手する（又は生成若しくは入手した）方法に関しても限定されないことに留意すべきである。したがって本発明のアミノ酸配列は、（任意の好適な種由来の）天然アミノ酸配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列であり得る。
具体的ではあるが非限定的な一態様では、本発明のアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを含むアミノ酸配列、又は好適な条件（例えば生理的条件）下で（すなわちフォールディングによって）免疫グロブリンフォールドを形成することができるアミノ酸配列であり得る。特にHalaby et al.（1999, J. Protein Eng. 12: 563-71）による概説を参照する。好ましくは、免疫グロブリンフォールドを形成するように適切にフォールディングする場合、アミノ酸残基ストレッチは、ＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープと結合するための抗原結合部位を適切に形成することができ、より好ましくは本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性でＩＬ−６Ｒ上でそれらのエピトープと結合することができる。
具体的であるが、非限定的な別の態様において、本発明のアミノ酸配列は免疫グロブリン配列である。具体的であるが、非限定的に、本発明のアミノ酸配列は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になるアミノ酸配列、又はＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープとさらに結合するこのようなアミノ酸配列の任意の好適な断片であり得る。
このような本発明のアミノ酸配列において、フレームワーク配列は任意の好適なフレームワーク配列であってもよく、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる開示及び従来技術に基づいて当業者にとって明らかである。
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列、又は（例えばヒト化又はラクダ化のような配列最適化によって）免疫グロブリンフレームワーク配列から誘導されているフレームワーク配列（の好適な組合せ）であるのが好ましい。例えばフレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列）から誘導されているフレームワーク配列であり得る。本発明のアミノ酸配列が重鎖可変ドメイン配列である場合、従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列（例えばこれに限定されないが、ヒト抗体由来のＶＨ配列）又はいわゆる（本明細書に規定の）「重鎖抗体」由来のいわゆる（本明細書に規定の）ＶＨＨ配列であり得る。特に好ましい一態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列（上記フレームワーク配列は任意で、部分又は完全ヒト化し得る）から誘導されているか、又は（本明細書に規定のように）ラクダ化した従来のＶＨ配列であるいずれかのフレームワーク配列である。
重鎖抗体及びその可変ドメインの概要に関しては、特に本明細書で引用される従来技術、並びに特許文献７の５９頁に言及される従来技術、及び国際出願の国際公開第０６／０４０１５３号の４１頁〜４３頁に言及される参考文献一覧を参照する（従来技術及び参考文献は参照により本明細書に援用される）。
本発明のアミノ酸配列は特に、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）若しくはナノボディ（本明細書に規定のように、ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）、他の単一可変ドメイン、又はそれらのいずれか１つの任意の好適な断片であり得る。
特に本発明のアミノ酸配列は、（本明細書で規定のような）ナノボディ（登録商標）又はその好適な断片であり得る（備考：ナノボディ（Nanobody）（登録商標）、ナノボディ（Nanobodies）（登録商標）及びナノクローン（登録商標）は、Ablynx N. V.の登録商標である）。ＩＬ−６Ｒに指向性を有するこのようなナノボディは、本明細書中で「本発明のナノボディ」とも称される。
概して、ナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を表し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を表し、１つ又は複数の特徴的な（Hallmark：ホールマーク）残基は特許文献７（表Ａ−３〜表Ａ−８）に規定されるようなものである）を有するアミノ酸配列として定義することができる。
概して、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分ヒト化ナノボディ）は特に、（例えば特許文献７の６１頁２４行目から９８頁３行目にさらに記載されるような）１つ又は複数のフレームワーク配列における１つ又は複数の「特徴的な残基」の存在を特徴とし得る。
これに関して、本発明のアミノ酸配列が、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここでＣＤＲ１が、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、若しくは
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、若しくは
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、若しくは
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される。
これらの好ましい相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）は「本発明のＣＤＲ（複数可）」とも称される。
好ましくは、本発明のアミノ酸配列が、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここでＣＤＲ１が、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、
ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される。
このようなナノボディは、任意で好適な方法で任意の好適な供給源から誘導されてもよく、例えば（すなわち好適なラクダ種由来の）天然ＶＨＨ配列、又は合成若しくは半合成のアミノ酸配列であってもよい。
特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０、又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディは、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディと比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１から選択されるアミノ酸残基ストレッチ、又は配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディは、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディと比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４、又は配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディは、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディと比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号９３〜配列番号９４から選択されるアミノ酸残基ストレッチ、又は配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディは、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディと比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号９３、又は配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディは、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列若しくはナノボディと比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様では、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも配列番号８０及び配列番号８４を含む。
さらに別の特定の態様では、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも配列番号８０及び配列番号９３を含む。
さらに別の特定の態様では、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも配列番号８４及び配列番号９３を含む。
さらに別の特定の態様では、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも配列番号８０、配列番号８４及び配列番号９３を含む。
ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の他の好ましい組合せを表Ａ−１にも示す。
本発明の好ましいアミノ酸配列は、配列番号６０〜配列番号６９；そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列；並びに配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列からなる群から選択され得る。
本発明のこのようなアミノ酸配列は好ましくは、ＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープと特異的に結合することができ、さらにより好ましくは本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性でＩＬ−６Ｒ上で特異的エピトープと結合することができるものとする。本発明のこのようなアミノ酸配列は好ましくは、本明細書に規定のような細胞ベースの効力及び血漿効力も有するものとする。
本発明により提供されるアミノ酸配列及びナノボディは、（本明細書で規定のように）本質的に単離形態であるか、又は本発明のタンパク質若しくはポリペプチド（「本発明のポリペプチド」又は「本発明のタンパク質」とも称される）（１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディを含むか、又はこれから本質的になってもよく、任意でさらに１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列若しくはナノボディ（全て任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して連結される）を含んでもよい）の一部を形成するのが好ましい。
したがって別の態様において本発明は、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディ（又はその好適な断片）を含むか、又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含む、化合物又は構築物、特にタンパク質又はポリペプチド（それぞれ本明細書で「本発明の化合物」又は「本発明のポリペプチド」とも称される）に関する。本明細書中のさらなる開示から当業者にとって明らかになるように、このようなさらなる基、残基、部分、結合単位又はアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列（及び／又はそれが存在する化合物、構築物又はポリペプチド）に対しさらなる機能性を与えても、又は与えなくてもよく、本発明のアミノ酸配列又はナノボディの特性を変えても、又は変えなくてもよい。
例えばこのようなさらなる基、残基、部分又は結合単位は、化合物、構築物又はポリペプチドが（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチドになるように、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列であり得る。好ましいが非限定的な態様において、上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は免疫グロブリン配列である。さらにより好ましくは、上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディからなる群から選択される。
代替的に、このような基、残基、部分又は結合単位は例えば化学的な基、残基、部分（それ自体が生物学的に及び／又は薬理学的に活性であっても、又は活性でなくてもよい）であり得る。例えばこれに限定されないが、このような基は、本明細書にさらに記載されるように、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドの「誘導体」を提供するように、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列又はナノボディと連結し得る。
本明細書に記載の１つ又は複数の誘導体を含むか、又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物、構築物又はポリペプチドも本発明の範囲内である。好ましくは、上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位はアミノ酸配列である。
上記の化合物、構築物又はポリペプチドにおいて、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列又はナノボディ、及び１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位は、互いに直接、及び／又は１つ又は複数の好適なリンカー又はスペーサーを介して連結してもよい。例えば１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位がアミノ酸配列である場合、リンカーは、得られる化合物、構築物又はポリペプチドが融合体（タンパク質）又は融合体（ポリペプチド）になるようにアミノ酸配列であってもよい。
本発明のアミノ酸配列又はナノボディから本発明の化合物又はポリペプチドを設計／選択、及び／又は調製する方法は、本明細書では上記本発明のアミノ酸配列又はナノボディを「フォーマットすること（formatting）」とも称され、本発明の化合物又はポリペプチドの一部を構成する本発明のアミノ酸配列又はナノボディは、「フォーマットされた（formatted）」、又は上記本発明の化合物又はポリペプチド「のフォーマット形態（inthe format of）」であるといわれる。本発明のアミノ酸配列又はナノボディをフォーマットすることができる方法の例及びこのようなフォーマットの例が、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、このようなフォーマットされたアミノ酸配列又はナノボディは、本発明のさらなる態様を形成する。
例えばこれらに限定されないが、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列又はナノボディは、全て本明細書に記載のような本発明の一価、多価、多重パラトピック又は多重特異性のポリペプチドをそれぞれ提供するために、任意で結合単位として働くことができる１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を含有し得る（すなわちＩＬ−６Ｒ上の別のエピトープに対する及び／又はＩＬ−６Ｒ以外の１つ又は複数の抗原、タンパク質又は標的に対する）このようなタンパク質又はポリペプチドにおける結合単位として使用することができる。このため本発明は、本発明のアミノ酸配列又はナノボディを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物である化合物、構築物又はポリペプチドにも関する。このため本発明は、多価構築物、例えば二価又は三価の構築物等である化合物、構築物又はポリペプチドにも関する。本発明は多重特異性構築物、例えば二重特異性又は三重特異性の構築物等である化合物、構築物又はポリペプチドにも関する。本発明は多重パラトッピック構築物、例えば二重パラトッピック又は三重パラトッピックの構築物等である化合物、構築物又はポリペプチドにも関する。
本発明の特定の一態様において、本発明の化合物、又は本発明のポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列又はナノボディと比較して増大した半減期を有し得る。このような化合物及びポリペプチドの幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかとなり、例えばその半減期が増大するように（例えばペグ化によって）化学修飾された本発明のアミノ酸配列、ナノボディ若しくはポリペプチド；血清タンパク質（例えば血清アルブミン）と結合するための少なくとも１つのさらなる結合部位を含む本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディ；又は本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディの半減期を増大させる少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）と連結する少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディを含む本発明のポリペプチドを含む。このような半減期を延長させる部分を含む本発明のポリペプチド、アミノ酸配列又はナノボディの例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかとなり、例えばこれらに限定されないが、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディが、１つ又は複数の血清タンパク質若しくはその断片（例えば（ヒト）血清アルブミン又はその好適な断片）、若しくは血清タンパク質と結合することができる１つ又は複数の結合単位（例えばドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又は血清タンパク質、例えば血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）、血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）、又はトランスフェリンと結合することができるナノボディ等、さらなる記載及び本明細書で言及される参考文献を参照する）と好適に連結するポリペプチド；本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディがＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）若しくはその好適な部分若しくは断片と連結するポリペプチド；又は１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディが、血清タンパク質と結合することができる１つ又は複数の小タンパク質若しくは小ペプチドと好適に連結するポリペプチドを含む（例えばこれに限定されないが、国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号、国際公開第０２／０７６４８９号に記載のタンパク質及びペプチド）。
概して、半減期が増大した本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列又はナノボディ自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍（例えば少なくとも５倍）、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超大きい半減期を有するのが好ましい。
好ましいが非限定的な態様において、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列又はナノボディ自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超（例えば１２時間超）、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間超増大した血清半減期を有する。
好ましいが非限定的な別の態様において、このような本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）の半減期を有し得る。
このようなタンパク質、ポリペプチド、化合物又は構築物は（本明細書で規定のように）本質的に単離形態であってもよい。
本発明の幾つかの好ましい化合物、構築物又はポリペプチドは以下のポリペプチド配列を含む：
ａ）配列番号７０〜配列番号７２、
ｂ）本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列、
ｃ）配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列。
これらの配列を有するポリペプチドは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を（一部又は完全に）遮断する、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を介したシグナル伝達を阻害する能力に加えて、例えば良好な結合特性（高い親和性及び／又は結合活性）、高い有効性及び／又は効力のような薬理学的に活性のある作用物質として使用するのに有利な特性を示す。
より具体的には、本発明のこれらのポリペプチド及び化合物は、好ましくは
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、
（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができる。
本発明のポリペプチド及び化合物とＩＬ−６Ｒとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値が本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
例えばKitamura et al. （J. Cell Physiol. 1989;140: 323）に記載のようなＴＦ−１アッセイにおいて、本発明のポリペプチド及び化合物は、１０ｎＭ〜５０ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは１ｎＭ〜５０ｐＭ以下、例えば約７５０ｐＭ又は５００ｐＭ以下のＩＣ５０値（１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のポリペプチド及び化合物は、５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは２５ｎＭ〜１ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１ｎＭ以下、例えば約８ｎＭ以下のＩＣ５０値（５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のポリペプチド及び化合物は配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のアミノ酸配列はトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＩＬ−６のＥＣ５０値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような２７．２９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明のポリペプチド及び化合物は５００ｐＭ〜５０ｐＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは２００ｐＭ〜５０ｐＭ以下、例えば１５０ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。ＩＬ−６のＥＣ９５値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような８８５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明のポリペプチド及び化合物は１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、好ましくは７５０ｐＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは５００ｐＭ〜１００ｐＭ以下、例えば４００ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。この血漿効力アッセイでは、本発明のポリペプチド及び化合物は配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。この血漿効力アッセイでは、本発明のアミノ酸配列はトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＣＨＯ細胞上での膜ＩＬ−６Ｒとの結合を規定するアッセイでは、本発明のポリペプチド及び化合物は１０ｎＭ〜１００ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは２ｎＭ〜１０ｐＭ以下、例えば２ｎＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。
別の特定の態様では、本発明のポリペプチド、化合物又は構築物は配列番号７０のアミノ酸配列から本質的になる。
別の特定の態様では、本発明のポリペプチド、化合物又は構築物は配列番号７１のアミノ酸配列から本質的になる。
本発明の化合物又はポリペプチドは概して、本発明の化合物又はポリペプチドを提供するために、任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物を１つ又は複数のさらなる基、残基、部分又は結合単位に好適に連結させる工程を少なくとも含む方法により調製することができる。本発明のポリペプチドは概して、本発明のポリペプチドをコードする核酸を用意する工程、好適に上記核酸を発現する工程、及び発現された本発明のポリペプチドを回収する工程を少なくとも含む方法によっても調製することができる。このような方法はそれ自体が既知のやり方で行うことができ、例えば本明細書にさらに記載の方法及び技法に基づいて当業者にとって明らかである。
したがって本発明は、多価の化合物、構築物又はポリペプチドの調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物の使用にも関する。多価の化合物、構築物又はポリペプチドを調製する方法は、任意で１つ又は複数のリンカーを介して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物を少なくとも１つの他の基、残基、部分又は結合単位と連結させることを含む。
概して、本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（又はこれを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）が（例えば本明細書に記載のような治療目的及び／又は診断目的で）被験体への投与を意図する場合、上記被験体で自然発生的ではないアミノ酸配列若しくはナノボディであるか、又は上記被験体で自然発生的である場合、（本明細書で規定のように）本質的に単離形態であるのが好ましい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び化合物はヒト由来のＩＬ−６Ｒに指向性を有する。しかしながら、これらは好ましくはカニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））由来のＩＬ−６Ｒとも交差反応性であるものとし、このことはこれらのアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び化合物がカニクイザル（マカク・ファシクラリス）由来のＩＬ−６Ｒ「に指向性を有し」（本明細書で規定のように）、及び／又はカニクイザル（マカク・ファシクラリス）由来のＩＬ−６Ｒと特異的に結合することが可能でもある（本明細書で規定のように）ことを意味する。このような交差反応性は、ヒトＩＬ−６Ｒに対するアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び化合物をカニクイザル疾患モデルで試験することを可能とするので、薬剤開発の観点から利点を有し得る。
本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）がヒト由来及びカニクイザル由来のＩＬ−６Ｒと「交差反応性である」ということは、本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）がヒト由来のＩＬ−６Ｒと結合する親和性と同じ又はその親和性の少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％）の（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性で、本発明の上記アミノ酸配列又はナノボディ（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）がカニクイザル由来のＩＬ−６Ｒと結合することを意味する。カニクイザルのＩＬ−６Ｒ配列及び対応するｃＤＮＡ配列に関しては、"Receptor for interleukin-6 （IL-6） from Macaca fascicularis"と題された２００８年７月１６日付けでAblynx N.V.により出願された国際公開第０９／０１０５３９号も参照し、ｃＤＮＡ配列に関しては配列番号３及び図１Ｂ、並びにアミノ酸配列に関しては配列番号４及び図３Ｂを参照されたい）。
本明細書で想定される使用に好適である限り、本発明のアミノ酸配列及びポリペプチドの部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を使用すること、及び／又はこのような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を１つ又は複数含むか、又はこれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドを使用することも本発明の範囲内である。このような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は通常、ＩＬ−６Ｒ上の特異的エピトープとの結合に機能的な抗原結合部位（の少なくとも一部）を含有し、より好ましくはＩＬ−６Ｒ上の特異的エピトープと特異的に結合することができ、さらにより好ましくは本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性でＩＬ−６Ｒ上の特異的エピトープと結合することができる。このような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は通常、本明細書に規定のような細胞ベースの効力及び血漿効力も有する。このような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体、タンパク質及び／又はポリペプチドの幾つかの非限定的な例は、本明細書のさらなる記載から明らかになる。また本発明のさらなる断片又はポリペプチドは、本明細書に記載のように１つ又は複数の（より小さい）部分又は断片を好適に組み合わせることによって（すなわち連結又は遺伝子融合によって）提供され得る。
別の態様において、本発明は、本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ又は本発明のポリペプチド（又はその好適な断片）をコードする核酸又はヌクレオチド配列にも関する。このような核酸は、本明細書中で「本発明の核酸」とも称され、例えば本明細書中でさらに記載されるように遺伝子構築物の形態であり得る。したがって本発明は遺伝子構築物の形態である核酸又はヌクレオチド配列にも関する。
本発明のヌクレオチド配列は、天然ヌクレオチド配列、又は合成若しくは半合成の配列であってもよく、例えばＰＣＲによって好適な天然鋳型から単離される配列（例えば細胞から単離されるＤＮＡ又はＲＮＡ）、ライブラリ（特に発現ライブラリ）から単離されたヌクレオチド配列、（それ自体が既知の任意の好適な技法（例えばミスマッチＰＣＲ）を使用して）天然ヌクレオチド配列に突然変異を導入することによって調製されたヌクレオチド配列、重複プライマーを使用してＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、又はそれ自体が既知のＤＮＡ合成のための技法を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。
別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ及び／又は本発明のポリペプチドを発現し（又は好適な環境下で発現することができ）、及び／又は本発明の核酸を含有する、宿主又は宿主細胞に関する。このような宿主又は宿主細胞の幾つかの好ましいが非限定的な例は本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列（又はその好適な断片）、少なくとも１つの本発明のナノボディ、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、少なくとも１つの本発明の化合物又は構築物、少なくとも１つの本発明の一価構築物、及び／又は少なくとも１つの本発明の核酸、及び任意で（すなわち組成物の目的とする用途に応じて）それ自体が既知のこのような組成物の１つ又は複数のさらなる成分を含有するか又は含む生成物又は組成物に関する。このような生成物又は組成物は例えば（本明細書に記載の）薬学的組成物、獣医学的組成物又は（本明細書にも記載の）診断用途のための生成物又は組成物であり得る。このような生成物又は組成物の幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、本明細書に記載のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物を調製する方法に関する。本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド又は本発明の一価構築物を産生する方法は、
ａ）好適な宿主細胞若しくは宿主生物において又は別の好適な発現系において、本発明の核酸若しくはヌクレオチド配列、又は本発明の遺伝子構築物を発現する工程、任意でその後
ｂ）このようにして得られた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物を単離及び／又は精製する工程
を含み得る。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物を産生する方法は、
ａ）本発明の宿主又は宿主細胞が、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物を発現及び／又は産生するような条件下で、上記宿主又は宿主細胞を培養及び／又は維持する工程、任意でその後
ｂ）このようにして得られた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物を単離及び／又は精製する工程
を含み得る。
本発明はさらに、本明細書に記載のアミノ酸配列、ポリペプチド、化合物、構築物、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の適用及び使用に、並びにＩＬ−６Ｒに関連する疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法に関する。幾つかの好ましいが非限定的な適用及び使用は本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物は概して、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との結合及び／又はその後のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との結合を調節（特に阻害及び／又は阻止）するのに、したがってＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体及び／又はｇｐ１３０によって媒介されるシグナル伝達を調節（特に阻害及び／又は阻止）するのに、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体及び／又はｇｐ１３０が関与する生物学的経路を調節するのに、及び／又はこのようなシグナル伝達若しくはこれらの経路に関連する生物学的機構、応答及び作用を調節するのに使用することができる。
一態様において、本発明は、ＩＬ−６Ｒの、ＩＬ−６Ｒ媒介性のシグナル伝達の、及び／又はＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６Ｒ媒介性のシグナル伝達が関与する生物学的経路、機構、応答及び／又は作用のアンタゴニストである、及び／又はアンタゴニストとして使用することができる、アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、構築物及び化合物を提供する。
これに関して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物は、（ａ）ＩＬ−６受容体と（本明細書に規定のように）特異的に結合するようなもの、並びに（ｂ）ＩＬ−６受容体を下方調節することができる、及び／又はＩＬ−６受容体のシグナル伝達、及び／又はＩＬ−６若しくはＩＬ−６Ｒが関与する経路（複数可）、機構（複数可）若しくはシグナル伝達を阻害、低減若しくは下方調節することができるようなものである。当業者にとって明らかなように、概してこのようなアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物を、ＩＬ−６の、ＩＬ−６受容体の、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体媒介性のシグナル伝達が関与する生物学的経路、機構又は作用のアンタゴニストとして使用することができる。任意のこのような低減又は下方調節（アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物がＩＬ−６受容体と結合しない条件下の同じパラメータと比較して、関連のパラメータで少なくとも１％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは１０％超、又は最大５０％若しくは１００％以上であり得る）は、例えば上記及び／又は実験部部分で使用され、及び／又は本明細書で言及されるアッセイの１つを使用して、それ自体が既知の任意の好適な方法で測定され得る。
より具体的に、上記の（ａ）及び（ｂ）の他に、このような拮抗的なアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び構築物は、（ｃ）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの非存在下でのＩＬ−６とその受容体との結合と比較して、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの結合が遮断、阻害又は低減されるようにＩＬ−６Ｒと結合する。
限定されるものではないが、このような拮抗的なアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び構築物はＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６相互作用部位に近いＩＬ−６Ｒ上の特異的エピトープと結合し得る。
また上記の（ａ）及び（ｂ）の他に、及び上記の（ｃ）の他に、このような拮抗的なアミノ酸配列及びポリペプチドは、（ｄ）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物の非存在下での複合体の形成及び複合体とｇｐ１３０との結合と比較して、複合体とｇｐ１３０との結合によって誘導／媒介されるシグナル伝達を調節（例えば低減）するように、ｇｐ１３０に対する複合体の結合（例えばｇｐ１３０に対する複合体の親和性）を低減する（又は逆に複合体に対するｇｐ１３０の結合（複合体に対するｇｐ１３０の親和性）を低減する）ように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の形成を阻害するか、又はこれに作用する（例えば完全に又は部分的に破壊する）ようにＩＬ−６Ｒ（すなわちそれ自体で、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体で存在する場合に）と結合し得る。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物が、治療的に関連のある量で哺乳動物（例えばヒト被験体又はカニクイザル等の炎症に好適な動物モデル）に投与する場合、上記哺乳動物において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物又は組成物を摂取していない哺乳動物と比較してＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の誘導の低減（すなわち少なくとも１％、例えば少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％以上）又は完全阻害をもたらすようなものであるのも好ましい（がこれらに限定されない）。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物が、治療的に関連のある量で哺乳動物（例えばヒト被験体又はカニクイザル等の炎症に好適な動物モデル）に投与する場合、上記哺乳動物において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物又は組成物を摂取していない哺乳動物と比較して血小板数の誘導の低減（すなわち少なくとも１％、例えば少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％以上）又は完全阻害をもたらすようなものであるのも好ましい（がこれらに限定されない）。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物が、治療的に関連のある量で哺乳動物（例えばヒト被験体又はカニクイザル等の炎症に好適な動物モデル）に投与する場合、上記哺乳動物において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物又は組成物を摂取していない哺乳動物と比較してフィブリノゲンの誘導の低減（すなわち少なくとも１％、例えば少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％以上）又は完全阻害をもたらすようなものであるのも好ましい（がこれらに限定されない）。
このように、本発明のアミノ酸配列、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物は、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６に、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的機能及び応答に関連する疾患及び障害の予防及び／又は治療のために、並びに特にＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６に、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）に、及び／又はＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（任意でさらにｇｐ１３０との複合体）が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的機能及び応答に関連し、ＩＬ−６Ｒによって又はＩＬ−６Ｒが関与する経路（複数可）によって媒介される過剰及び／又は不要なシグナル伝達を特徴とする疾患及び障害の予防及び／又は治療のために使用することができる。ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６に、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的機能及び応答に関連するこのような疾患及び障害の例は、本明細書中の開示に基づき、当業者にとって明らかであり、例えば以下の疾患及び障害を含む：敗血症（非特許文献８）及び多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病（非特許文献６）、リンパ腫、Ｂ−リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺がん等の様々な形態のがん。過剰なＩＬ−６産生又はシグナル伝達によって引き起こされる他の疾患の非限定的な例としては、骨吸収（骨粗鬆症）（Roodman et al., 1992, J. Clin. Invest. 89: 45-52、非特許文献１０）、悪液質（非特許文献１１）、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（非特許文献２０）、関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症等の炎症性疾患及び障害（非特許文献１３）、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）及び自己免疫インスリン依存性糖尿病（非特許文献１４）が挙げられる。他のＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体関連障害は当業者にとって明らかである。このような疾患及び障害は概して本明細書中で、「ＩＬ−６Ｒ関連の疾患及び障害」とも称される。
したがってこれに限定されないが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物は例えばＩＬ−６Ｒ媒介性のシグナル伝達を調節することができる活性成分（例えば上記で引用された従来技術で言及されるもの）で現在予防又は治療されている全ての疾患及び障害を予防及び／又は治療するのに使用することができる。本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物は、このような活性成分による治療が現在開発中であるか、提案されているか、又は将来提案若しくは開発予定である全ての疾患及び障害を予防及び／又は治療するのに使用することができることも予想される。また、本明細書でさらに記載されるような有利な特性から、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物は、これらの既知の活性成分が現在使用中か又は提案若しくは開発予定であるもの以外の疾患及び障害の予防及び治療に使用してもよいこと、及び／又は本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物、構築物及び組成物は、本明細書に記載の疾患及び障害を治療する新規の方法及びレジメンを提供し得ることが予想される。
したがって本発明は、本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド又は本発明の一価構築物をそれを必要とする被験体に投与することにより予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、又は本発明の（一価）構築物、又は本発明の組成物をそれを必要とする被験体に投与することを含む、方法にも関する。
本発明は、ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連する疾患及び障害のうちの少なくとも１つの予防及び／又は治療のための、及び／又は本明細書に記載の方法の１つ又は複数における使用のための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、又は本発明の（一価）構築物の使用にも関する。
本発明はさらに、ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連する疾患及び障害のうちの少なくとも１つの予防及び／又は治療における使用のための、及び／又は本明細書に記載の方法の１つ又は複数における使用のための本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、又は本発明の（一価）構築物に関する。
具体的には本発明は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて予防的用途、治療的用途及び／又は診断的用途に好適なアミノ酸配列、ナノボディ、タンパク質、ポリペプチド、化合物及び／又は構築物を提供する。
より具体的には本発明は、温血動物、具体的に哺乳動物、より具体的にヒトにおいて１つ又は複数のＩＬ−６Ｒ関連の障害（本明細書で規定されるような）の予防、治療、緩和及び／又は診断に使用することができるようなアミノ酸配列、ナノボディ、タンパク質、ポリペプチド、化合物及び／又は構築物を提供する。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び化合物の他の適用及び使用は、本明細書のさらなる開示から当業者にとって明らかになる。
実施例２に記載のようなＥＬＩＳＡによるラマ８１及びラマ８２における免疫応答分析を示す図である。 実施例２に記載のようなＦＡＣＳによるラマ８１及びラマ８２における免疫応答分析を示す図である。脚注：Ｌｌ８１ ｐｒｅ：ラマ８１由来の免疫前血清；Ｌｌ８１ ＰＢＬ１：ラマ８１から２８日目に回収した血清；Ｌｌ８２ ｐｒｅ：ラマ８２由来の免疫前血清；Ｌｌ８２ ＰＢＬ２：ラマ８２から４３日目に回収した血清。 実施例２に記載のようなＦＡＣＳによるラマ８１及びラマ８２における免疫応答分析を示す図である。脚注：Ｌｌ８１ ｐｒｅ：ラマ８１由来の免疫前血清；Ｌｌ８１ ＰＢＬ１：ラマ８１から２８日目に回収した血清；Ｌｌ８２ ｐｒｅ：ラマ８２由来の免疫前血清；Ｌｌ８２ ＰＢＬ２：ラマ８２から４３日目に回収した血清。 実施例２に記載のようなＦＡＣＳによるラマ８１及びラマ８２における免疫応答分析を示す図である。脚注：Ｌｌ８１ ｐｒｅ：ラマ８１由来の免疫前血清；Ｌｌ８１ ＰＢＬ１：ラマ８１から２８日目に回収した血清；Ｌｌ８２ ｐｒｅ：ラマ８２由来の免疫前血清；Ｌｌ８２ ＰＢＬ２：ラマ８２から４３日目に回収した血清。 ＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位に対するナノボディを同定するのに使用されるアルファスクリーンアッセイの概略図である。 抗ＩＬ−６Ｒナノボディのアミノ酸配列を示す図である。 実施例６に記載のように得られた精製ナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。 アルファスクリーンで測定されるような選択ナノボディによるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。モノクローナル抗体ＢＲ−６を対照として使用した。 アルファスクリーンで測定されるような選択ナノボディによるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。モノクローナル抗体ＢＲ−６を対照として使用した。 アルファスクリーンで測定されるような選択ナノボディによるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。参照Ｆａｂ断片（実施例１に記載）を対照として使用した。 ＦＡＣＳにより分析された抗ＩＬ−６ＲナノボディとＵ２６６細胞との結合を示す図である。 ヒト血漿の非存在（上部）及び存在（下部）下での抗ＩＬ−６ＲナノボディとＵ２６６細胞との結合を示す図である。 １ｍｇ／ｋｇ（○）、５ｍｇ／ｋｇ（△）、１０ｍｇ／ｋｇ（＋）、２５ｍｇ／ｋｇ（×）及び１００ｍｇ／ｋｇ（◇）で静脈内投与した後のカニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の個々で観察される（記号）及びモデル予測される（実線）血漿濃度−時間プロファイルを示す図である。 ナノボディとマウス及びヒトのＩＬ−６Ｒとの結合を示す図である。３つの棒グラフのそれぞれの群において、左側の棒グラフはヒトＩＬ ６Ｒを示し、中央の棒グラフはマウスＩＬ ６Ｒを示し、右側の棒グラフはブランクを示す。 精製された二重特異性ナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。 アルファスクリーンで測定されるような二重特異性ナノボディによるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。 Ｕ２６６細胞との二価ナノボディ結合のＦＡＣＳ分析を示す図である。 Ｕ２６６細胞との三価ナノボディ結合のＦＡＣＳ分析を示す図である。 ５つの最も相同なヒト生殖系列とのＩＬ６Ｒ０３配列、ＩＬ６Ｒ０４配列及びＩＬ６Ｒ１３配列のアラインメントを示す図である。さらなる説明に関しては、実施例２３を参照されたい。 ＩＬ６Ｒ０３及びＩＬ６Ｒ０４の配列を最適化した変異体のアミノ酸配列を示す図である。さらなる説明に関しては、実施例２３を参照されたい。 ＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体のアミノ酸配列を示す図である。さらなる説明に関しては、実施例２３を参照されたい。 ＩＬ６Ｒ０３の配列を最適化した変異体によるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。 ＩＬ６Ｒ０４の配列を最適化した変異体によるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。 ＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体によるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。 ＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体によるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。 野生型の抗ＩＬ−６Ｒナノボディ及び配列を最適化した抗ＩＬ−６ＲナノボディによるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害を示す図である。 配列を最適化したナノボディ対野生型ナノボディの細胞ベースの効力を示す図である。 配列を最適化したナノボディ対野生型ナノボディの細胞ベースの効力を示す図である。 配列を最適化したナノボディ対野生型ナノボディの細胞ベースの効力を示す図である。 ヒト（Ａ）及びカニクイザル（Ｂ）の血漿における配列を最適化したナノボディの血漿効力ＥＬＩＳＡを示す図である。 ＩＬ−６のＥＣ５０（左側）及びＥＣ９５（右側）での配列を最適化したナノボディの血漿効力ＥＬＩＳＡを示す図である。 実施例２９に記載のようなＩＬ−６Ｒナノボディのエピトープマッピングを示す図である：ＩＬ−６Ｒコーティングチップ（Ａ〜Ｃ）又はＩＬ−６コーティングチップ上での競合アッセイ。 親和性成熟を行ったＩＬ６Ｒ６５変異体のアミノ酸配列を示す図である。 ナノボディＩＬ６Ｒ６５（親ナノボディと称される）及びその親和性成熟を行った変異体の結合曲線を示す図である。 ヒト及びカニクイザルの血漿効力アッセイにおけるＩＬ６Ｒ６５及び５つの親和性成熟を行った変異体の評価を示す図である。 ヒトの血漿効力アッセイにおけるＩＬ６Ｒ６５及び５つの親和性成熟を行った変異体の評価を示す図である。 親和性成熟を行ったナノボディによるＴＦ−１細胞のＩＬ−６依存性の増殖の阻害を示す図である。細胞を２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６及び様々な濃度のナノボディの存在下で成長させた。増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。 Ｂｉａｃｏｒｅで測定したようにＩＬ６Ｒ６５とＩＬ−６との競合（Ａ）と比較した２つの親和性成熟を行ったナノボディとＩＬ−６との競合（Ｂ〜Ｃ）を示す図である。 Ｂｉａｃｏｒｅで測定したようにＩＬ６Ｒ６５とＩＬ−６との競合（Ａ）と比較した２つの親和性成熟を行ったナノボディとＩＬ−６との競合（Ｂ〜Ｃ）を示す図である。 Ｂｉａｃｏｒｅで測定したようにＩＬ６Ｒ６５とＩＬ−６との競合（Ａ）と比較した２つの親和性成熟を行ったナノボディとＩＬ−６との競合（Ｂ〜Ｃ）を示す図である。 ２回目の親和性成熟後のＩＬ−６Ｒ結合ナノボディの配列（コンビナトリアルライブラリＣＤＲ１／２＋ＣＤＲ３）を示す図である。 ＴＦ−１細胞のＩＬ−６依存性の増殖の阻害を示す図である。細胞を２ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６及び様々な濃度のナノボディの存在下で成長させた。増殖を３Ｈ−チミジンの取り込みにより測定した。 ヒト及びカニクイザルの血漿効力アッセイにおけるＩＬ６Ｒ６５及び２回目の親和性成熟を行った変異体の評価を示す図である。親＝ＩＬ６Ｒ６５。 ヒトの血漿効力アッセイにおけるＩＬ６Ｒ６５及び２回目の親和性成熟を行った変異体の評価を示す図である。親＝ＩＬ６Ｒ６５。 全血におけるＩＬ６Ｒ６５及びＰＭＰ２０Ａ１１とヒトＰＢＭＣとの結合を示す図である。 フォーマットされたナノボディ及び参照ＩｇＧによる膜ＩＬ−６Ｒ活性の阻害を示す図である。ＴＦ−１細胞を希釈系列のＩＬ６Ｒ３０４（■）、ＩＬ６Ｒ３０５（▲）、ＩＬ６Ｒ３０６（▼）又は参照ＩｇＧ（●）とプレインキュベートし、その後増殖を１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で誘導した。７２時間のインキュベーション後、細胞増殖を３Ｈチミジンの取り込みにより評価した。三連の測定値の平均±標準誤差を示す。 高レベルのＩＬ−６でのフォーマットされたナノボディ及び参照ＩｇＧによる膜ＩＬ−６Ｒの阻害を示す図である。ＴＦ−１細胞を希釈系列の２０Ａ１１（◆）、ＩＬ６Ｒ３０４（■）、ＩＬ６Ｒ３０５（▲）、ＩＬ６Ｒ３０６（▼）又は参照ＩｇＧ（●）とプレインキュベートし、その後増殖を５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で誘導した。７２時間のインキュベーション後、細胞増殖を３Ｈチミジンの取り込みにより評価した。三連の測定値の平均±標準誤差を示す。 ＴＦ−１細胞の増殖に対するＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の効果を示す図である。ＴＦ−１細胞を１２５００細胞／ウェルの密度で播種し、５０ｎＭのＩＬ６Ｒ３０４又はＩＬ６Ｒ３０５の存在下又は非存在下でインキュベートした。増殖を１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で誘導し、又は細胞を成長因子の非存在下でインキュベートした。７２時間のインキュベーション後、細胞増殖を３Ｈチミジンの取り込みにより評価した。それぞれのデータ点を３０回測定した。平均±標準誤差を示す。 ヒト血漿における血漿効力ＥＬＩＳＡを示す図である。参照ＩｇＧ（●）、ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１（◆）、ＩＬ６Ｒ３０４（■）、ＩＬ６Ｒ３０５（▲）、ＩＬ６Ｒ３０６（▼）又は無関連のナノボディ（×）によるヒトＩＬ−６と血漿ｓＩＬ−６Ｒとの結合の中和を示す。二連の測定値の平均±標準誤差を示す。Ａ、Ｂ：２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６との競合（ＥＣ５０）。Ｃ、Ｄ：８８５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６との競合（ＥＣ９５）。 ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１及びフォーマットされた変異体とＣＨＯ細胞との結合を示す図である。ＩＬ−６Ｒを発現するＣＨＯ細胞（Ａ）又は陰性ＣＨＯ細胞（Ｂ）をＩＬ６Ｒ２０Ａ１１（◆）、ＩＬ６Ｒ３０４（■）、ＩＬ６Ｒ３０５（▲）又はＩＬ６Ｒ３０６（▼）とインキュベートした。結合したナノボディをモノクローナル抗体ｃｌ．５．３．１及び抗マウスＰＥを用いて検出した。 全血におけるヒトＰＢＬ上でのＩＬ−６Ｒナノボディの結合を示す図である。左側：ＦＳＣ／ＳＳＣ特性に基づきリンパ球（Ｌ、黒色）、単球（Ｍ、暗灰色）及び顆粒球（Ｇ、薄灰色）をゲーティングした。中央：３つのゲーティングした集団のバックグラウンドＰＥ蛍光。右側：１μＭのＩＬ６Ｒ３０５とのインキュベーション後のＰＥ蛍光。 ＩＬ−６ＲナノボディとヒトＰＢＬとの結合を示す図である。２つのドナー由来のＥＤＴＡで処理した血液をＩＬ６Ｒ２０Ａ１１（◆）、ＩＬ６Ｒ３０４（■）、ＩＬ６Ｒ３０５（▲）又はＩＬ６Ｒ３０６（▼）とインキュベートした。結合したナノボディをモノクローナル抗体ｃｌ．５．３．１及び抗マウスＰＥを用いて検出した。Ａ：リンパ球、Ｂ：単球、Ｃ：顆粒球。 ヒト及びカニクイザルの血清アルブミン上でのフォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディの結合曲線を示す図である。 フォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディとヒト及びカニクイザルのＩＬ−６Ｒとの結合曲線を示す図である。 カニクイザル血漿における血漿効力ＥＬＩＳＡを示す図である。参照ＩｇＧ（●）、ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１（◆）、ＩＬ６Ｒ３０４（■）、ＩＬ６Ｒ３０５（▲）、ＩＬ６Ｒ３０６（▼）又は無関連のナノボディ（×）によるヒトＩＬ−６とカニクイザル血漿ｓＩＬ−６Ｒとの結合の中和を示す。 ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１と他の種由来のｓＩＬ−６Ｒとの交差反応性を示す図である。左側：ヒト（●）、カニクイザル（■）又はマウス（▲）由来の組換えｓＩＬ−６Ｒとのプレインキュベーション後のプレート上でのＩＬ６Ｒ２０Ａ１１とヒトｓＩＬ−６Ｒとの結合。右側：ヒト（●）、カニクイザル（■）、マウス（▲）又はモルモット（▼）の血漿とのプレインキュベーション後のＩＬ６Ｒ２０Ａ１１とヒトｓＩＬ−６Ｒとの結合。 競合結合ＥＬＩＳＡを示す図である。ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１（０．０５ｎＭ）を様々な濃度のＩＬ−６Ｒ（●）、ＬＩＦ−Ｒ（■）、ＣＮＴＦ−Ｒ（▲）、ＯＳＭ−Ｒ（▼）又はＩＬ−１１Ｒ／Ｆｃ（◆）とプレインキュベートした。遊離ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１をｓＩＬ−６Ｒ上で捕捉し、抗Ｈｉｓにより検出した。 ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５のｉｎ ｖｉｖｏでのＰＫ／ＰＤ分析に関する研究設計を示す図である。 個々のカニクイザルにおけるｈＩＬ−６により増大したＣＲＰレベルに対する参照ＩｇＧ、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の効果を示す図である。（Ａ）動物２７、動物２８及び動物２９は陰性対照の役割を果たし、ｈＩＬ−６のみが投与された。参照ＩｇＧ（Ｂ、黒色の（closed black）記号）、様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４（Ｃ、青色の記号）及び様々な用量のＩＬ６Ｒ３０５（Ｄ、赤色の記号）を静脈内投与した後、７日間１日１回、５μｇ／ｋｇの用量でｈＩＬ−６を皮下注射した。 個々のカニクイザルにおけるｈＩＬ−６により増大したＣＲＰレベルに対する参照ＩｇＧ、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の効果を示す図である。（Ａ）動物２７、動物２８及び動物２９は陰性対照の役割を果たし、ｈＩＬ−６のみが投与された。参照ＩｇＧ（Ｂ、黒色の（closed black）記号）、様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４（Ｃ、青色の記号）及び様々な用量のＩＬ６Ｒ３０５（Ｄ、赤色の記号）を静脈内投与した後、７日間１日１回、５μｇ／ｋｇの用量でｈＩＬ−６を皮下注射した。 ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５を用いるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＫ／ＰＤ研究で得られた全ての群に関する平均ＣＲＰレベルを示す図である。 個々のカニクイザルにおけるｈＩＬ−６により増大したフィブリノゲンレベルに対する参照ＩｇＧ、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の効果を示す図である。（Ａ）動物２７、動物２８及び動物２９は陰性対照の役割を果たし、ｈＩＬ−６のみが投与された。参照ＩｇＧ（Ｂ、黒色の記号）、様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４（Ｃ、青色の記号）及び様々な用量のＩＬ６Ｒ３０５（Ｄ、赤色の記号）を静脈内投与した後、７日間１日１回、５μｇ／ｋｇの用量でｈＩＬ−６を皮下注射した。結果を基礎レベルに正規化した。 個々のカニクイザルにおけるｈＩＬ−６により増大したフィブリノゲンレベルに対する参照ＩｇＧ、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の効果を示す図である。（Ａ）動物２７、動物２８及び動物２９は陰性対照の役割を果たし、ｈＩＬ−６のみが投与された。参照ＩｇＧ（Ｂ、黒色の記号）、様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４（Ｃ、青色の記号）及び様々な用量のＩＬ６Ｒ３０５（Ｄ、赤色の記号）を静脈内投与した後、７日間１日１回、５μｇ／ｋｇの用量でｈＩＬ−６を皮下注射した。結果を基礎レベルに正規化した。 ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５を用いるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＫ／ＰＤ研究で得られた全ての群に関する平均フィブリノゲンレベルを示す図である。 個々のカニクイザルにおけるｈＩＬ−６により増大した血小板数に対する参照ＩｇＧ、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の効果を示す図である。（Ａ）動物２７、動物２８及び動物２９は陰性対照の役割を果たし、ｈＩＬ−６のみが投与された。参照ＩｇＧ（Ａ、黒色の記号）、様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４（Ｂ、青色の記号）及び様々な用量のＩＬ６Ｒ３０５（Ｃ、赤色の記号）を静脈内投与した後、７日間１日１回、５μｇ／ｋｇの用量でｈＩＬ−６を皮下注射した。結果を基礎レベルに正規化した。 個々のカニクイザルにおけるｈＩＬ−６により増大した血小板数に対する参照ＩｇＧ、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の効果を示す図である。（Ａ）動物２７、動物２８及び動物２９は陰性対照の役割を果たし、ｈＩＬ−６のみが投与された。参照ＩｇＧ（Ａ、黒色の記号）、様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４（Ｂ、青色の記号）及び様々な用量のＩＬ６Ｒ３０５（Ｃ、赤色の記号）を静脈内投与した後、７日間１日１回、５μｇ／ｋｇの用量でｈＩＬ−６を皮下注射した。結果を基礎レベルに正規化した。 ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５を用いるｉｎ ｖｉｖｏでのＰＫ／ＰＤ研究で得られた全ての群に関する平均血小板数を示す図である。 カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の静脈内ボーラス投与（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）後の個々で観察される血漿濃度−時間プロットを示す図である。１１ｍ、１２ｍ及び１３ｆは左側の３つのグラフである。１７ｍ、１８ｆ及び１４ｍは中央のグラフであり、１５ｍ及び１６ｆは右側のグラフである。 カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０５の静脈内ボーラス投与（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）後の個々で観察される血漿濃度−時間プロットを示す図である。１９ｍ、２０ｆ及び２１ｆは左側の３つのグラフである。２５ｍ、２６ｆ及び２２ｍは中央のグラフであり、２３ｍ及び２４ｆは右側のグラフである。 カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）及びＩＬ６Ｒ２０２（２ｍｇ／ｋｇ；０．４ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇに用量を正規化した）の静脈内ボーラス投与後の観察された血漿濃度の平均値対時間プロットを示す図である。 ＩＬ６Ｒ３０４の投与前、及び静脈内投与後様々な日数での抗ＩＬ６Ｒ３０４抗体の免疫検出を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＩＬ６Ｒ３０４でコーティングした。それぞれの図の脚注は左から右への棒グラフのグループ分けに対応する。 ＩＬ６Ｒ３０４の投与前、及び静脈内投与後様々な日数での抗ＩＬ６Ｒ３０４抗体の免疫検出を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＩＬ６Ｒ３００でコーティングした。それぞれの図の脚注は左から右への棒グラフのグループ分けに対応する。 ＩＬ６Ｒ３０４の投与前、及び静脈内投与後様々な日数での抗ＩＬ６Ｒ３０４抗体の免疫検出を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＡＬＢ８でコーティングした。それぞれの図の脚注は左から右への棒グラフのグループ分けに対応する。 ＩＬ６Ｒ３０５の投与前、及び静脈内投与後様々な日数での抗ＩＬ６Ｒ３０５抗体の免疫検出を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＩＬ６Ｒ３０５でコーティングした。それぞれの図の脚注は左から右への棒グラフのグループ分けに対応する。 ＩＬ６Ｒ３０５の投与前、及び静脈内投与後様々な日数での抗ＩＬ６Ｒ３０５抗体の免疫検出を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＩＬ６Ｒ３００でコーティングした。それぞれの図の脚注は左から右への棒グラフのグループ分けに対応する。 ＩＬ６Ｒ３０５の投与前、及び静脈内投与後様々な日数での抗ＩＬ６Ｒ３０５抗体の免疫検出を示す図である。ＥＬＩＳＡプレートをＡＬＢ８でコーティングした。それぞれの図の脚注は左から右への棒グラフのグループ分けに対応する。 ＩＬ６Ｒナノボディの単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける血漿ｓＩＬ−６Ｒレベルを示す図である。Ａ：２匹の動物を５ｍｇ／ｋｇの参照ＩｇＧで処理し（■、●）、又は１匹の動物をビヒクルで処理した（▲）。Ｂ：３匹の動物を０．０４ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０４で処理した。Ｃ：３匹の動物を０．０４ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０５で処理した。 ＩＬ６Ｒナノボディの単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける総血漿ｓＩＬ−６Ｒレベルを示す図である。動物をＩＬ６Ｒ３０４（▲、■、●）、参照ＩｇＧ（▼）又はビヒクル（◇）で処理した。群ごとに平均±標準誤差を示す。 ＩＬ６Ｒナノボディの単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける総血漿ｓＩＬ−６Ｒレベルを示す図である。動物をＩＬ６Ｒ３０５（▲、■、●）、参照ＩｇＧ（▼）又はビヒクル（◇）で処理した。群ごとに平均±標準誤差を示す。 ＩＬ６Ｒナノボディの単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける総血漿ＩＬ−６レベルを示す図である。内因性のカニクイザルＩＬ−６及び注射したヒトＩＬ−６の両方の総血漿ＩＬ−６濃度をＧｙｒｏｌａｂプラットフォームで測定した。定量限界未満の試料を９．６ｐｇ／ｍＬと表す。投与したものはＩＬ６Ｒ３０４である。処理群ごとに平均±標準誤差（０．４ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇではｎ＝３、１０ｍｇ／ｋｇではｎ＝２）を示す。 ＩＬ６Ｒナノボディの単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける総血漿ＩＬ−６レベルを示す図である。内因性のカニクイザルＩＬ−６及び注射したヒトＩＬ−６の両方の総血漿ＩＬ−６濃度をＧｙｒｏｌａｂプラットフォームで測定した。定量限界未満の試料を９．６ｐｇ／ｍＬと表す。投与したものはＩＬ６Ｒ３０５である。処理群ごとに平均±標準誤差（０．４ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇではｎ＝３、１０ｍｇ／ｋｇではｎ＝２）を示す。 ＩＬ６Ｒナノボディの単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける総血漿ＩＬ−６レベルを示す図である。内因性のカニクイザルＩＬ−６及び注射したヒトＩＬ−６の両方の総血漿ＩＬ−６濃度をＧｙｒｏｌａｂプラットフォームで測定した。定量限界未満の試料を９．６ｐｇ／ｍＬと表す。投与したものは陽性対照（参照ＩｇＧ）及び陰性対照（バッファー）である。処理群ごとに平均±標準誤差を示す。 １０ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０４（■、●）、ＩＬ６Ｒ３０５（▲、▼）又は無関連のナノボディ（◇、・）の静脈内ボーラス注射後の個々の動物における内因性のカニクイザルＩＬ−６の血漿濃度を示す図である。２つの測定値の平均±標準誤差を示す。 様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４の単回静脈内投与後のカニクイザルにおける総ｓＩＬ６Ｒ血漿レベルを示す図である。群ごとにいずれかのバイオマーカーの平均血漿濃度±標準偏差を示す。所定の用量のビヒクル又はＩＬ６Ｒ３０４を時点０で投与した。脚注に関しては、図６６Ｂを参照されたい。 様々な用量のＩＬ６Ｒ３０４の単回静脈内投与後のカニクイザルにおける遊離ｓＩＬ６Ｒ血漿レベルを示す図である。群ごとにいずれかのバイオマーカーの平均血漿濃度±標準偏差を示す。所定の用量のビヒクル又はＩＬ６Ｒ３０４を時点０で投与した。 ２５ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０４の単回静脈内投与後のカニクイザルにおける総ｓＩＬ６Ｒ血漿レベル及び遊離ｓＩＬ６Ｒ血漿レベル、並びにＩＬ６Ｒ３０４濃度を示す図である。特定の用量群に関して平均±標準偏差を示す。総ｓＩＬ６Ｒ（実線、四角記号）、遊離ｓＩＬ６Ｒ（実線、丸記号）及びＩＬ６Ｒ３０４濃度（点線、デルタ型（delta））を時間（日）に対してプロットする。 １ｍｇ／ｋｇ（○）、５ｍｇ／ｋｇ（△）、１０ｍｇ／ｋｇ（＋）、２５ｍｇ／ｋｇ（×）及び１００ｍｇ／ｋｇ（◇）のＩＬ６Ｒ３０４を静脈内投与した後の個々で観察される（記号）及びモデル予測される（実線）総ｓＩＬ６Ｒ濃度−時間プロットを示す図である。 １ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０４を静脈内ボーラス注射した後のカニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の平均血漿濃度−時間プロファイルを示す図である。 中央のコンパートメントからの線形クリアランス及び非線形クリアランスを伴う開放型の３コンパートメント薬物動態モデルを示す図である。ＣＬＮＯＮ−ＩＬ６Ｒは非ＩＬ６Ｒ媒介性の線形クリアランスであり、Ｖｃは中央のコンパートメントの容量であり、Ｖｄは深部の周辺コンパートメントの容量であり、ＣＬｄは中央のコンパートメントと深部コンパートメントとの間のコンパートメント間の流れであり、Ｖｓは浅部の周辺コンパートメントの容量であり、ＣＬｓは中央のコンパートメントと浅部コンパートメントとの間のコンパートメント間の流れであり、ＣＬＩＬ６ＲはＩＬ６Ｒ媒介性の非線形クリアランスである（Ｖｍａｘは最大代謝速度であり、ＫｍはＶｍａｘの５０％に対応するＩＬ６Ｒ３０４濃度である）。
本明細書、実施例及び特許請求の範囲において：
ａ）特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば標準的なハンドブック（例えばSambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（2ndEd.）, Vols. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory Press（1989）、F.Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York（1987）、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,（1985）、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA（1981）、Roitt et al., "Immunology"（6th.Ed.）, Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK（2001）、及びJaneway et al.,"Immunobiology"（6th Ed.）, Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York（2005））、並びに本明細書で言及される一般的な背景技術を参照する。
ｂ）特に他に指示がなければ、「免疫グロブリン配列」という用語は、本明細書で重鎖抗体に言及するのに使用されるのか又は従来の４鎖抗体に言及するのに使用されるかに関係なく、完全長抗体、その個々の鎖、及びその全ての部分、ドメイン又は断片（これらに限定されないが、それぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメイン等の抗原結合ドメイン又は断片を含む）の両方を含む一般的な用語として使用される。さらに（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語で）本明細書で使用される「配列」という用語は一般的に、文脈上さらなる限定的な解釈が要求される場合を除き、関連のアミノ酸配列と、これをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列との両方を含むと理解されるべきである。また、「ヌクレオチド配列」という用語は本明細書で使用される場合、上記ヌクレオチド配列を有する核酸分子も包含し、そのため「ヌクレオチド配列」及び「核酸」という用語は同義であると見なすものとし、本明細書中では区別なく使用される。
ｃ）特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施することができ、そのように実施されている。また例えば標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景技術、並びにそれらに言及されるさらなる参考文献、並びに例えば以下の総説、Presta, 2006, Adv. Drug Deliv. Rev., 58 （5-6）: 640-56、Levin and Weiss, 2006, Mol.Biosyst., 2（1）: 49-57、Irving et al., 2001, J. Immunol. Methods, 248（1-2）: 31-45、Schmitzet al., 2000, Placenta, 21 Suppl. A, S106-12、Gonzaleset al., 2005, Tumour Biol., 26（1）, 31-43（これらは、親和性成熟等のタンパク質工学技法及び免疫グロブリン等のタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善する他の技法を記載している）を参照する。
ｄ）アミノ酸残基は、表Ａ−２に言及されるように標準的な３文字アミノ酸コード又は１文字アミノ酸コードに従って示す。
表Ａ−２：１文字アミノ酸コード及び３文字アミノ酸コード
Figure 0005647222
ｅ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一な第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出することができ、この場合、第１のヌクレオチド配列に比べた、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一ヌクレオチド（位置）での差異と考えられる。
代替的に、標準的な設定を用いて、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０等の配列アラインメント用の既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
配列同一性の程度を決定するための幾つかの他の技法、コンピュータアルゴリズム及び設定は例えば国際公開第０４／０３７９９９号、欧州特許第０９６７２８４号、欧州特許第１０８５０８９号、国際公開第００／５５３１８号、国際公開第００／７８９７２号、国際公開第９８／４９１８５号及び英国特許出願公開第２３５７７６８号に記載されている。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、他のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
ｆ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一な第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、この場合、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書で「アミノ酸同一性」とも称される）のパーセントを算出することができ、この場合、第１のアミノ酸配列に比べた、第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一アミノ酸残基（位置）での差異、すなわち本明細書に規定の「アミノ酸差異」と考えられる。
代替的に、ここでもまた標準的な設定を用いて、既知のコンピュータアルゴリズム（例えばヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を決定するのに上記で言及されるもの）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が同様の化学構造を有する別のアミノ酸残基に置き換わり、かつポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号、英国特許出願公開第３３５７６８号、国際公開第９８／４９１８５号、国際公開第００／４６３８３号及び国際公開第０１／０９３００号から当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、関連の教示に基づいて国際公開第０４／０３７９９９号及び国際公開第９８／４９１８５号、並びにそれらに言及されるさらなる参考文献から選択することができる。
このような保存的な置換は、好ましくは以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子の脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びこの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al.（1978, "Principles ofProtein Structure", Springer-Verlag）によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析、Chou and Fasman（1974, Biochemistry 13: 211及び1978, Adv. Enzymol., 47: 45-149）によって開発された構造形成可能性（structure forming potentials）の解析、並びにEisenberget al.（1984, Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144）、Kyte and Doolittle（1981, J. Molec. Biol.157: 105-132）、及びGoldman et al.（1986,Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353）によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づき得る（全て全体が参照により本明細書に援用される）。ナノボディの一次構造、二次構造、及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及された一般的な背景技術で与えられる。またこのため、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は例えばDesmyter et al.（1996, Nature StructuralBiology, 3 （9）: 803）、Spinelli et al.（1996, Natural StructuralBiology, 3: 752-757）、及びDecanniere et al.（1999, Structure, 7（4）: 361）によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてこれらの位置でＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成する幾つかのアミノ酸残基に関するさらなる情報は、上記で言及された従来技術で見出すことができる。
ｇ）アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって（本明細書に規定のように）１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であるといえる。
ｈ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、「アミノ酸差異」という用語は、第２の配列に比べて第１の配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表し、２つのアミノ酸配列は、１つ又は２つ以上のこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
ｉ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を「を含む」、又は別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列「から本質的になる」というとき、これは、後者のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に組み込まれていることを意味し得るが、より一般的に概してこれは、初めに言及されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、実際にどのように初めに言及された配列を生成又は入手したか（例えば本明細書に記載の任意の好適な方法によるものであり得る）に関係なく、その配列内にそれぞれ後者の配列と同じヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を有するヌクレオチド又はアミノ酸残基のストレッチを含むことを意味する。非限定的な例によって、本発明のアミノ酸配列がアミノ酸残基ストレッチを含むというとき、これは、上記アミノ酸残基ストレッチが、本発明のアミノ酸配列に組み込まれていることを意味し得るが、より一般的に概してこれは、本発明のアミノ酸配列が、どのように上記本発明のアミノ酸配列を生成又は入手するかに関係なく、その配列内にアミノ酸残基ストレッチを含むことを意味する。本発明のナノボディがＣＤＲ配列を含むというとき、これは、上記ＣＤＲ配列が、本発明のナノボディに組み込まれていることを意味し得るが、より一般的に概してこれは、本発明のナノボディが、どのように上記本発明のナノボディを生成又は入手したかに関係なく、その配列内に上記ＣＤＲ配列と同じアミノ酸配列を有するアミノ酸残基ストレッチを含むことを意味する。後者のアミノ酸配列は、特異的な生物学的又は構造的な機能を有する場合、初めに言及されたアミノ酸配列において本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を有するのが好ましい（言い換えれば、初めに言及されたアミノ酸配列は、後者の配列が本質的に同じ、類似の又は同等の生物学的又は構造的な機能を果たすことができるようなものであるのが好ましい）ということにも留意すべきである。例えば本発明のナノボディがそれぞれ、ＣＤＲ配列又はフレームワーク配列を含むというとき、ＣＤＲ配列及びフレームワークはそれぞれ、上記ナノボディでＣＤＲ配列又はフレームワーク配列として機能することができるのが好ましい。また、ヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むというとき、初めに言及されたヌクレオチド配列は、発現産物（例えばポリペプチド）へと発現する場合、後者のヌクレオチド配列でコードされるアミノ酸配列が上記発現産物の一部を形成するようなもの（言い換えれば後者のヌクレオチド配列が、初めに言及されたより大きなヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム内にあるようなもの）であるのが好ましい。
ｊ）核酸配列又はアミノ酸配列は、通常その供給源又は媒体に関連がある少なくとも１つの他の成分（例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分、又は巨大分子）、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物若しくは微量成分から分離されている場合、（例えばその天然の生物学的供給源及び／又はそれが得られる反応媒体又は培養媒体に比べて）「本質的な単離（形態）（で）」あると見なされる。特に、核酸配列又はアミノ酸配列は、少なくとも２倍、具体的に少なくとも１０倍、より具体的に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上精製されている場合に、「本質的に単離された」と考えられる。「本質的に単離形態である」核酸配列又はアミノ酸配列は、好適な技法、例えば好適なクロマトグラフィ技法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）を使用して決定されたものと、本質的に相同であるのが好ましい。
ｋ）本明細書で使用される「ドメイン」という用語は概して、アミノ酸配列の球状領域（例えば抗体鎖、特に重鎖抗体の球状領域）又はこのような球状領域から本質的になるポリペプチドを表す。通常、このようなドメインは、例えばシートとして、又はジスルフィド結合によって安定化されたペプチドループ（例えば３つ又は４つのペプチドループ）を含む。「結合ドメイン」という用語は（本明細書で規定されるように）抗原決定基に指向性を有するようなドメインを表す。
ｌ）「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチド）によって、及びより具体的には上記分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。「抗原決定基」及び「エピトープ」という用語は、本明細書で区別なく使用することもできる。
ｍ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質（又はその少なくとも１つの部分、断片若しくはエピトープに関して）と（特異的に）結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば本発明のナノボディ、抗体、ポリペプチド、又は概して抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片）は、上記の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質「に対する」、又は「に指向性を有する」といわれる。
ｎ）「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチド）分子が結合することができる、様々な種類の抗原又は抗原決定基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づき決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される）は、抗原結合タンパク質上の抗原決定基と抗原結合部位との間の結合力に関する評価基準であり、ＫＤ値が小さくなれば、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力が大きくなる（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者にとって明らかなように、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の測定基準である。結合活性は、抗原結合分子上での抗原決定基とその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）これらの抗原と結合する。１０４モル／Ｌより大きい任意のＫＤ値（すなわち１０４Ｍ−１（Ｌ／モル）よりも小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で所望の抗原と結合する。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法、並びに本明細書で言及される他の技法で求めることができる。
当業者にとって明らかなように、解離定数は実際又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は、当業者にとって明らかであり、例えば本明細書で言及される技法が含まれる。これに関して、１０−４モル／Ｌ又は１０−３モル／Ｌより大きい（例えば１０−２モル／Ｌの）解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかである。任意で、また当業者にとって明らかなように、（実際又は見掛けの）解離定数は、その関係性［ＫＤ＝１／ＫＡ］から（実際又は見掛けの）結合定数（ＫＡ）に基づき算出することができる。
親和性は、分子相互作用の強さ又は安定性を示す。一般的に親和性はＫＤすなわち解離定数として与えられ、その単位はモル／Ｌ（又はＭ）である。親和性は、１／ＫＤに等しい結合定数ＫＡとも表すことができ、その単位は（モル／Ｌ）−１（又はＭ−１）である。本明細書では、２つの分子（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドと、その目的標的との）間の相互作用の安定性は主に、これらの相互作用のＫＤ値で表され、ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を考慮して、ＫＤ値で分子相互作用の強さを特定することを、対応するＫＡ値を算出するのに利用することもできることは、当業者にとって明らかである。ＫＤ値は、ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）の既知の関係性から、結合の自由エネルギー（ＤＧ）と関連するので、熱力学的意味でも分子相互作用の強さを特徴付ける。
有意（例えば特異的）と見なされる、生物学的相互作用に関するＫＤは典型的に、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲内である。相互作用が強くなれば、ＫＤは低くなる。
ＫＤは、（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆのように）複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと称される）と、その結合速度（ｋｏｎと称される）との比としても表すことができる。解離速度（off-rate）ｋｏｆｆの単位はｓ−１である（ｓは秒のＳＩ単位表記である）。結合速度（on-rate）ｋｏｎの単位はＭ−１ｓ−１である。結合速度は、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し、二分子相互作用に関する拡散律速結合速度定数に近づき得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所定の分子相互作用の半減期に関連する。解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の様々な技法（例えば既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照されたい）（ここで、１つの分子がバイオセンサーチップ上に固定され、もう１つの分子が、ｋｏｎ測定値、ｋｏｆｆ測定値、及びしたがってＫＤ（又はＫＡ）値が得られるフロー条件下で固定分子上を通る）で測定することができる。例えば既知のＢＩＡＣＯＲＥの機器を使用してこれを実施することができる。
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサ上でのコーティングに関するアーチファクト（artefact：人工産物）によって、示唆した分子の固有の結合親和性に幾らか影響を与える場合、測定されたＫＤは見掛けのＫＤに対応し得ることも、当業者にとって明らかである。また、１つの分子が、もう１つの分子に対して２つ以上の認識部位を含有する場合、見掛けのＫＤが測定され得る。このような状況下で、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性により影響され得る。
親和性を評価するのに使用することができる別のアプローチは、Friguet et al.（1985, J. Immunol. Methods,77, 305-19）の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素免疫吸着アッセイ）法である。この方法によって、溶液相の結合平衡測定が確立され、プラスチック等の支持体上での１つの分子の吸着に関連すると考えられ得るアーチファクトが避けられる。
しかし、ＫＤの正確な測定はかなりの労働集約型である可能性があり、結果として２つの分子の結合力を評価するのに、見掛けのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定が一貫して（例えばアッセイ条件を一定にして）行われていれば、見掛けのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、したがって本明細書で、ＫＤ及び見掛けのＫＤは、等しい重要性又は関連性があるとして扱われるべきであることに留意すべきである。
最後に、多くの状況下で経験豊かな科学者は、幾つかの参照分子に関して結合親和性を決定することが都合がいいと判断し得ることに留意すべきである。例えば分子Ａと分子Ｂとの間の結合力を評価するために、例えば分子Ｂと結合することが知られており、かつＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）での検出を容易にするためのフルオロフォア群若しくはクロモフォア群、又は他の化学部分（例えばビオチン）、又は他のフォーマット（蛍光検出用フルオロフォア、吸光検出用クロモフォア、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用ビオチン）で好適に標識される参照分子Ｃを使用することができる。典型的に、参照分子Ｃは固定濃度に維持され、分子Ａの濃度は、分子Ｂの所定の濃度又は量に対して変化する。結果として、分子Ａの非存在下で分子Ｃについて測定されたシグナルが半分になる分子Ａの濃度に対応して、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ及び参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であれば、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）からＡ−Ｂ相互作用に対する見掛けのＫＤを得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆの場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較用の結合因子に関して一貫して（例えばｃｒｅｆを一定にして）実施されれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強さ又は安定性を評価することができ、この測定値は、本明細書を通してＫＤ又は見掛けのＫＤと同等であると判断される。
ｏ）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの半減期は概して、例えば自然機構による配列若しくは化合物の分解及び／又は配列若しくは化合物のクリアランス（clearance）若しくは捕捉（sequestration）のために、ｉｎ ｖｉｖｏでアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの血清濃度が５０％低減するのにかかる時間と定義することができる。本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は、それ自体が既知の任意の方法（例えば薬物動態解析）で求めることができる。好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば概して、好適な用量の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを温血動物（すなわち、ヒト又は別の好適な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ又は霊長類（例えばマカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス）及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット（Macaca mulatta）））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス（Papioursinus）））に好適に投与する工程と、血液サンプル又は他のサンプルを上記動物から採取する工程と、上記血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度を求める工程と、このようにして得られたデータ（のプロット）から本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度が投与時の最初のレベルに比べて５０％低減するまでの時間を算出する工程とを伴い得る。例えば以下の実験部、及び標準的なハンドブック（例えばKenneth, A et al.（Chemical Stability ofPharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists）及びPeters etal.（1996, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach））を参照する。Gibaldi M and Perron D（1982, "Pharmacokinetics",published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition）も参照する。
また当業者にとって明らかなように（例えば国際公開第０４／００３０１９号の６頁及び７頁とそこに言及されたさらなる参考文献とを参照されたい）、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β及び曲線下面積（ＡＵＣ）等のパラメータを利用して表すことができる。本明細書において、「半減期の増大」は、これらのパラメータのいずれか１つ、例えばこれらのパラメータのいずれか２つ、又は本質的に３つ全てのこれらのパラメータの増大を表す。本明細書で使用される「半減期の増大」又は「増大した半減期」は特にｔ１／２−βの増大を表し、ｔ１／２−α及び／又はＡＵＣ又はその両方は増大しても又は増大しなくてもよい。
ｐ）本発明に関して、「調節すること（"modulating" or "to modulate"）」は一般的に、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して測定するような標的又は抗原の活性の低減若しくは阻害のいずれか、又は代替的に活性の増大を意味する。特に「調節すること」は、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（通常関与する標的又は抗原によって変わる）を用いて測定するような、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける標的又は抗原の活性に比べて、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上標的又は抗原の活性を低減又は阻害すること、又は代替的に（関連又は対象の）生物学的活性を増大させることを意味し得る。
当業者にとって明らかなように、「調節すること」は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が存在しない以外は同じ条件下に比べて、そのリガンド、結合パートナー、ホモ多量体形態若しくはヘテロ多量体形態で結び付くパートナー又は基質の１つ又は複数に対する標的又は抗原の親和性、結合活性、特異性及び／又は選択性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）、及び／又は標的又は抗原が存在する媒体又は環境における１つ又は複数の条件（例えばｐＨ、イオン強度、補因子の存在）に対する標的又は抗原の感度を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）も伴い得る。当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適なアッセイを用いてさらにこれを求めてもよい。
「調節すること」は、標的又は抗原が関与する（又はその基質（複数可）、リガンド（複数可）若しくは経路（複数可）が関与する、シグナル伝達経路若しくは代謝経路及び関連の生物学的作用若しくは生理学的作用のような）１つ又は複数の生物学的な若しくは生理学的な機構、作用、応答、機能、経路又は活性に関して変化させる（すなわち標的又は抗原及び所望の生物学的作用若しくは生理学的作用に応じて、それぞれ、アゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニストとしての活性を与える）ことも意味し得る。ここでも同様に、当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適な（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイで）アッセイを使用して、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのこのような作用を求めてもよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用は、対象の生物学的活性又は生理学的活性をそれぞれ、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける生物学的活性又は生理学的活性に比べて少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上増大又は低減させるようなものであり得る。
調節することは例えば標的又は抗原のアロステリック調節、及び／又は標的又は抗原とその基質又はリガンドの１つとの結合の低減又は阻害及び／又は標的又は抗原との結合に対する基質である天然リガンドとの競合も伴い得る。調節することは、例えば標的若しくは抗原、又はそれが関与する機構若しくは経路を活性化することも伴い得る。調節することは例えば、標的若しくは抗原のフォールディング若しくは立体構造に関して、又は標的若しくは抗原がフォールディングする能力、（例えばリガンドの結合の際に）その立体構造を変更する能力、他の（サブ）ユニットと結び付く能力、又は解離する能力に関して変化させることも伴い得る。調節することは例えば標的若しくは抗原が、他の化合物を移動させる能力、又は他の化合物（例えばイオン）に対するチャネルとして働く能力を変化させることも伴い得る。
調節することは、可逆であっても又は不可逆であってもよいが、薬学的及び薬理学的目的では通常、可逆的である。
本発明に関して、「調節すること」は概して、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒが関与する生物学的経路、応答、シグナル伝達、機構又は作用に関して、それぞれアゴニスト作用又は拮抗作用を及ぼすことを意味する。特に「調節すること」は、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（例えば本明細書で言及されるもの）を用いて測定されるように、アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が存在しない以外は同じ条件下で同じアッセイでの同じパラメータに比べて、関連のパラメータが少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、少なくとも５０％等、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上変化するようなアゴニスト作用又は拮抗作用（すなわちそれぞれ、完全又は部分的なアゴニスト作用又は拮抗作用）のいずれかを意味し得る。
本発明に関して、「ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との結合を調節、阻害及び／又は阻止すること」は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物の非存在下での複合体の形成及び複合体とｇｐ１３０との結合に比べて、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の形成に作用する、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の形成を阻害及び／又は予防する（例えば完全に又は一部破壊する）ように、ｇｐ１３０に対する複合体の結合（例えばｇｐ１３０に対する複合体の親和性）を低減、阻害及び／又は阻止する（又は逆に複合体に対するｇｐ１３０の結合（例えば複合体に対するｇｐ１３０の親和性）を低減、阻害及び／又は阻止する）ように、複合体とｇｐ１３０との結合によって誘導／媒介されるシグナル伝達を調節（例えば低減、阻害及び／又は阻止）するように、ＩＬ−６Ｒ（すなわちそれ自体又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体で存在する）上の特異的エピトープと結合することを意味する。
ｑ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の「相互作用部位」という用語は、リガンド、受容体若しくは他の結合パートナーとの結合に関する部位、触媒部位、切断部位、アロステリック相互作用に関する部位、標的又は抗原の多量体化（ホモマー化又はヘテロ二量体化等）に関与する部位である、標的又は抗原上のアミノ酸残基の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン若しくはストレッチ、又は標的若しくは抗原の生物学的作用又は機構に関与する標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の他の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチを意味する。より一般的には、「相互作用部位」は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が、（本明細書中に規定のように）標的又は抗原（及び／又は標的又は抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構又は生物学的作用）を調節するように結合することができる、標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチであり得る。
ｒ）「アミノ酸残基ストレッチ」は、互いに隣接しているか、又は互いにごく近接している（すなわちそのアミノ酸配列の一次構造又は三次構造における）２つ以上のアミノ酸残基を意味する。本発明に関して、「アミノ酸残基ストレッチ」は本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物とＩＬ−６Ｒ上のその特異的エピトープとの結合に（少なくとも部分的に）関与する。
ｓ）アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物は、上記アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が第２の標的又はポリペプチドと結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、及び最大１０，０００倍以上良好な親和性（上記のように、好適にＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度及び／又はＫｏｎ速度と表す）で第１の抗原と結合する場合、第２の標的又は抗原と比べて、第１の標的又は抗原「に特異的」であるといえる。例えば第１のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物は、上記アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が第２の標的又はポリペプチドと結合するＫＤよりも少なくとも１０分の１、例えば少なくとも１００分の１、及び好ましくは少なくとも１０００分の１、例えば１０，０００分の１以下のＫＤ値で標的又は抗原と結合し得る。好ましくは、アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物が、第２の標的又は抗原に比べて第１の標的又は抗原「に特異的」である場合、そのアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物は、（本明細書中に規定のように）上記第１の標的又は抗原に指向性を有するが、上記第２の標的又は抗原に対しては指向性を有しない。
ｔ）本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）は２つの異なる種（すなわち第１の種及び第２の種）由来のＩＬ−６Ｒと「交差反応性」であるということは、本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）が、上記の本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）が第１の種由来のＩＬ−６Ｒと結合する親和性と同じ又はその少なくとも７０％（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、又はさらにより好ましくは少なくとも９５％）の（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性で第２の種由来のＩＬ−６Ｒと結合することを意味する。
ｕ）本明細書でさらに記載されるように、ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０、好ましくは１１２〜１１５の範囲内、及び最も好ましくは１１３であり得る。しかし、ナノボディの部分、断片、類似体又は誘導体（本明細書中にさらに記載される）は、本明細書に概説されるさらなる要求を満たし、また好ましくは本明細書に記載の目的に好適であれば、その長さ及び／又はサイズに特に限定されないことに留意すべきである。
ｖ）ナノボディのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans（2000, J. Immunol.Methods 240 （1-2）:185-195の論文（例えばこの論文の図２を参照されたい）においてラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるように、又は本明細書で言及されるように、Kabat et al. （"Sequence of proteins ofimmunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD,Publication No. 91）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的なナンバリングに従って数字が付けられる。このナンバリングに従って、ナノボディのＦＲ１は１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ１は３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ２は３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ２は５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ３は６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＣＤＲ３は９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディのＦＲ４は１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。［これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、カバットナンバリングで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（すなわちカバットナンバリングによる１つ又は複数の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、又は実際の配列が、カバットナンバリングにより割り当てられた数より多くのアミノ酸残基を含んでいてもよい）ことに留意すべきである。このことは、概してカバットによるナンバリングは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応していても、又は対応していなくてもよいことを意味する。しかし一般的に、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関係なく、カバットナンバリングに従うと、カバットナンバリングによる１位は、ＦＲ１の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる３６位は、ＦＲ２の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる６６位は、ＦＲ３の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる１０３位は、ＦＲ４の出発点に対応する（逆もまた同様）ことがいえる］。
ＶＨドメインのアミノ酸残基の数字を付ける代替方法（この方法は、類似の方法でラクダ科動物由来のＶＨＨドメイン及びナノボディに適用することができる）は、Chothia et al.（1989, Nature 342: 877-883）によって説明される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」である。しかし本明細書、特許請求の範囲及び図面では、特に他に指示がなければ、Riechmann and MuyldermansによってＶＨＨドメインに適用されるようなカバットによるナンバリングに従う。
ｗ）図面、配列表及び実験部／実施例は、本発明をさらに説明するためだけに与えられ、特に他にはっきりと本明細書中に指示がなければ、本発明の範囲及び／又は添付の特許請求の範囲を限定するものとしては決して解釈すべきではない。
本発明は、ＩＬ−６Ｒとの結合に特に適したアミノ酸残基ストレッチ（配列番号８０〜配列番号８２、配列番号８４〜配列番号９１及び配列番号９３〜配列番号９５）を提供する。これらのアミノ酸残基ストレッチは、特に本発明のアミノ酸配列の抗原結合部位（の一部）を形成するように本発明のアミノ酸配列に存在し得る、及び／又は組み込まれ得る。これらのアミノ酸残基ストレッチは、ＩＬ−６Ｒに対して産生され、かつＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を一部又は完全に遮断する、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を介したシグナル伝達を阻害する能力に加えて、ＩＬ−６Ｒとの結合に関する親和性、並びに有効性及び／又は効力、及び／又は選択性等の他の特性をさらに増大させるようにさらに親和性成熟を行った（実施例の項を参照されたい）重鎖抗体のＣＤＲ配列又はＶＨＨ配列として生成されている。これらのアミノ酸残基ストレッチは本明細書中で「本発明のＣＤＲ配列」（すなわちそれぞれ、「本発明のＣＤＲ１配列」、「本発明のＣＤＲ２配列」及び「本発明のＣＤＲ３配列」）とも称される。
しかしながら、本発明は最も広範な意味で、これらのアミノ酸残基ストレッチが本発明のアミノ酸配列をＩＬ−６Ｒに結合させることが可能であれば、これらのアミノ酸残基ストレッチが本発明のアミノ酸配列において有し得る特定の構造的役割又は機能に限定されないことに留意すべきである。このため概して本発明は最も広範な意味で、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を一部又は完全に遮断する、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を介したシグナル伝達を阻害する能力に加えて、或る特定の親和性、結合活性、有効性及び／又は効力でＩＬ−６Ｒと結合することが可能であり、かつアミノ酸配列全体がＩＬ−６Ｒと結合することが可能な結合ドメイン及び／又は結合単位を形成するように、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列を介して互いに好適に連結する、１つ又は複数の本明細書に記載のようなＣＤＲ配列、特に２つ以上のこのようなＣＤＲ配列の好適な組合せを含む、アミノ酸配列を提供する。しかしながら、本発明のアミノ酸配列にこのようなＣＤＲ配列が１つでも存在していれば、本発明のアミノ酸配列にＩＬ−６Ｒと結合する能力を与えるのに十分であるといえることにも留意すべきである（例えばここでもまた、国際公開第０３／０５０５３１号に記載される、いわゆる「促進断片」を参照する）。
このため具体的であるが、非限定的な一態様において、本発明のアミノ酸配列は、
ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択されるアミノ酸残基ストレッチを少なくとも１つ含み得る。
特に本発明のアミノ酸配列は、上記のようなＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基ストレッチ（又はそれらの任意の好適な組合せ）を含む抗原結合部位を少なくとも１つ含むアミノ酸配列であり得る。しかしながら好ましい態様では、本発明のアミノ酸配列は、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列及び／又は本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるアミノ酸残基ストレッチを１つ超、例えば２つ以上（more than one, such as two or more）含む。
したがって本発明は、（ｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがａ）若しくはｂ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ｃ）、ｄ）、ｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応し、（ｉｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがｃ）若しくはｄ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ａ）、ｂ）、ｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応し、又は（ｉｉｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）若しくはｄ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応するように、
ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを２つ以上含むアミノ酸配列にも関する。
特定の態様において、本発明は、第１のアミノ酸残基ストレッチが以下のＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択され、
第２のアミノ酸残基ストレッチが以下のＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択され、かつ
第３のアミノ酸残基ストレッチが以下のＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択される、アミノ酸残基ストレッチを３つ以上含むアミノ酸配列にも関する。
本明細書に記載のように、本発明は、ａ）、ｃ）及び／又はｅ）で規定のアミノ酸残基ストレッチの１つと、すなわち規定のＣＤＲ１配列の１つと（すなわち配列番号８０〜配列番号８２の１つと）、規定のＣＤＲ２配列の１つと（すなわち配列番号８４〜配列番号９１の１つと）、及び／又は規定のＣＤＲ３配列の１つと（すなわち配列番号９３〜配列番号９５の１つと）わずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを１つ又は複数含むアミノ酸配列も包含する。
「アミノ酸差異」という用語は、それぞれａ）、ｃ）又はｅ）のアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）と比較してｂ）、ｄ）又はｆ）に規定のアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表す。ｂ）、ｄ）及びｆ）のアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）はそれぞれａ）、ｃ）又はｅ）のアミノ酸残基ストレッチと比較して１つ又は最大で２つのこのようなアミノ酸差異を含有することができることを理解されたい。
「アミノ酸差異」は、本発明のアミノ酸配列の特性を改善させるか、又は本発明のアミノ酸配列の所望の特性又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、任意の１つ又は最大で２つの置換、欠失若しくは挿入、又はそれらの任意の組合せであり得る。これに関して、得られる本発明のアミノ酸配列は少なくとも、１つ又は最大で２つの置換、欠失又は挿入を有しない１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
例えば当業者の能力の範囲内で、本発明のアミノ酸配列を発現するために使用される宿主生物に応じて、このような欠失及び／又は置換を、翻訳後修飾に関する１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位）を除去するように設計してもよい。
本発明の好ましい態様では、「アミノ酸差異」はアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、本発明のアミノ酸配列の特性を改善させるか、又は本発明のアミノ酸配列の所望の特性又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、任意の１つ又は最大で２つの置換であり得る。これに関して、得られる本発明のアミノ酸配列は少なくとも、１つ又は最大で２つの置換を有しない１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチにおけるアミノ酸置換は保存的なアミノ酸置換であり得る。「保存的な」アミノ酸置換は一般的に、アミノ酸残基が同様の化学構造の別のアミノ酸残基に置き換わり、かつ得られるアミノ酸配列の機能、活性又は他の生物学的特性にほとんど又は本質的に全く影響を与えないアミノ酸置換である。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号、英国特許出願公開第３３５７７６８号、国際公開第９８／４９１８５号、国際公開第００／４６３８３号及び国際公開第０１／０９３００号から当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、関連の教示に基づいて国際公開第０４／０３７９９９号及び国際公開第９８／４９１８５号、並びにそれらに言及されるさらなる参考文献から選択することができる。
このような保存的な置換は、好ましくは以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子の脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びこの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
本発明の別の態様において、１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチにおけるアミノ酸置換はＩＬ−６Ｒとの結合に関する親和性が増大したアミノ酸配列を提供し得る。これは、ランダム突然変異誘発法又は部位特異的変異誘発法等の技法、及び／又は例えば国際公開第０９／００４０６５号、国際公開第２００９／００４０６６号、国際公開第０５／００３３４５号、国際公開第０６／０２３１４４号、欧州特許第５２７８０９号、欧州特許第３９７８３４号等に記載のそれ自体が既知の親和性成熟に関する他の技法により行うことができる。
これらに限定されないが、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の置換に関する規則（一部又は完全に従う）は以下の通りであり得る（すなわち同様の側鎖の化学的性質を有するアミノ酸による置換）：
ＫをＲに置換し、
ＲをＫに置換し、
ＡをＳ又はＴに置換し、
ＳをＡ又はＴに置換し、
ＴをＡ又はＳに置換し、
ＩをＬ又はＶに置換し、
ＬをＩ又はＶに置換し、
ＶをＩ又はＬに置換し、
ＦをＹに置換し、
ＹをＦに置換し、
ＮをＤに置換し、
ＤをＮに置換し、
ＱをＥに置換し、
ＥをＱに置換し、
ＧをＡに置換し、
ＭをＬに置換し、
Ｈ、Ｃ、Ｗ及びＰは一定に保つ。
さらには、同様にこれらに限定されないが、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の置換に関する規則（一部又は完全に従う）は代替的に、２７位〜３５位及び５０位〜５８位（カバットナンバリングシステムを使用する）の置換に関しては以下の通りであり得る、
２７位〜３５位に関しては、
２７位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＦ；Ｇ；Ｒ；Ｓ；Ｆ、Ｇ、Ｒ、Ｓのうちの２つ；Ｆ、Ｇ、Ｒ、Ｓのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
２８位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＡ；Ｉ；Ｓ；Ｔ；Ａ、Ｉ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ａ、Ｉ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
２９位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＦ；Ｇ；Ｌ；Ｓ；Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｓのうちの２つ；Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｓのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
３０位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｇ；Ｓ；Ｔ；Ｄ、Ｇ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ｄ、Ｇ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
３１位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｉ；Ｎ；Ｓ；Ｔ；Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
３２位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｎ；Ｙ；Ｄ、Ｎ、Ｙのうちの２つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
３３位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＡ；Ｇ；Ｔ；Ｖ；Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｖのうちの２つ；Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｖのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
３４位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＩ；Ｍ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
３５位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＡ；Ｇ；Ｓ；Ａ、Ｇ、Ｓのうちの２つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
元のアミノ酸配列が５２ａ位（カバットナンバリングを使用する）にアミノ酸配列を有する場合、５０位〜５８位に関しては、
５０位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＡ；Ｃ；Ｇ；Ｓ；Ｔ；Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ、Ｔのうちの４つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５１位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＩに置換し、
５２位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＮ；Ｒ；Ｓ；Ｔ；Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５２ａ位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＲ；Ｓ；Ｔ；Ｗ；Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗのうちの２つ；Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５３位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｇ；Ｎ；Ｓ；Ｔ；Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔのうちの４つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５４位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｇ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５５位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｇ；Ｓ；Ｄ、Ｇ、Ｓのうちの２つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５６位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＩ；Ｎ；Ｒ；Ｓ；Ｔ；Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの４つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５７位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＴに置換し、
５８位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｈ；Ｎ；Ｓ；Ｙ；Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｙのうちの２つ；Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｙのうちの３つ；Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｙのうちの４つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
元のアミノ酸配列が５２ａ位（カバットナンバリングを使用する）にアミノ酸配列を有しない場合、５０位〜５８位に関しては、
５０位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＡ；Ｇ；Ｒ；Ｓ；Ｔ；Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；Ａ、Ｇ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの４つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５１位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＩに置換し、
５２位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＮ；Ｓ；Ｔ；Ｎ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５３位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＮ；Ｒ；Ｓ；Ｔ；Ｙ；Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙのうちの２つ；Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙのうちの３つ；Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｙのうちの４つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５４位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｇ；Ｒ；Ｓ；Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓのうちの２つ；Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｓのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５５位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＧに置換し、
５６位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＧ；Ｎ；Ｒ；Ｓ；Ｔ；Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの２つ；Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの３つ；Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔのうちの４つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
５７位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＴに置換し、
５８位（カバットナンバリングを使用する）の元のアミノ酸残基をＤ；Ｎ；Ｔ；Ｙ；Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｙのうちの２つ；Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｙのうちの３つ；又はこれらの全て、好ましくはこれらの全てに置換し、
その後（本明細書中にさらに記載のように、それ自体が既知の任意の方法で）このようにして求めた、潜在的に有用な置換（又はその組合せ）の１つ又は複数を上記ＣＤＲ配列に導入することができ、ＩＬ−６Ｒに対する親和性、及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を（一部又は好ましくは完全に）遮断する、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を介したシグナル伝達を阻害する能力等の他の所望の特性に関して、得られたアミノ酸配列（複数可）を試験することができる。このようにして、当業者は本明細書中の開示に基づき限定的な試行錯誤によって、ＣＤＲにおける他の好適な置換（又はその好適な組合せ）を求めることができる。
本発明のアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基ストレッチ（上記アミノ酸残基ストレッチは、本明細書に記載のＣＤＲ配列の少なくとも１つの配列に対応するアミノ酸配列を有する）を含む任意のアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列は、免疫グロブリンフォールドを含んでも、又は含んでいなくてもよい。例えばこれに限定されないが、このようなアミノ酸配列は、少なくとも１つのこのようなＣＤＲ配列（上記で規定のような）を含むが、（完全）免疫グロブリンフォールドを形成するのに十分な大きさではない好適な免疫グロブリン配列の断片であり得る（例えばここでもまた、国際公開第０３／０５０５３１号に記載される、「促進断片」を参照する）。代替的に、このようなアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定されるようなＣＤＲ配列に対応する（すなわちその抗原結合部位の一部として）少なくとも１つのアミノ酸残基ストレッチを含む、好適な「タンパク質足場」であり得る。アミノ酸配列を提示するのに好適な足場が当業者にとって明らかであり、例えばこれらに限定されないが、（すなわち本明細書に既に記載の免疫グロブリン配列以外の）免疫グロブリンに基づく若しくはこれに由来する結合足場、タンパク質Ａドメイン由来のタンパク質足場（例えばアフィボディ（Affibodies）（商標））、テンダミスタット、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、設計アンキリン反復、アビマー（avimers）及びＰＤＺドメイン（Binz et al., 2005, Nat.Biotech., 23:1257）、並びにＤＮＡ又はＲＮＡに基づく結合部分（ＤＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含むが、これに限定されない）（Ulrich et al., 2006, Comb. Chem. High Throughput Screen 9（8）: 619-32）が含まれる。
また、本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定されるようなＣＤＲ配列（すなわち「本発明のＣＤＲ」）を１つ又は複数含む、任意の本発明のアミノ酸配列は、ＩＬ−６Ｒと（本明細書に規定のように）特異的に結合することができるようなもの、及びより具体的には本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６Ｒと結合することができるようなものであるのが好ましい。本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定されるようなＣＤＲ配列を１つ又は複数含む、任意の本発明のアミノ酸配列は、本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するようなものであるのが好ましい。
さらには、本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定されるＣＤＲ（すなわち「本発明のＣＤＲ」）の１つ又は複数を、ヒトの足場又は非免疫グロブリンの足場を含むがこれらに限定されない他の「足場」上に「グラフト化」することが可能であり得ることは、当業者にとって明らかであろう。このようなＣＤＲグラフト化の好適な足場及び技法は当業者にとって明らかであり、当該技術分野において既知である。例えば米国特許第７，１８０，３７０号、国際公開第０１／２７１６０号、欧州特許第０６０５５２２号、欧州特許第０４６０１６７号、米国特許第７，０５４，２９７号、Nicaise et al.（2004, Protein Science, 13: 1882-1891）、Ewert et al.（2004, Methods, 34 （2）: 184-199）、Kettleboroughet al.（1991, Protein Eng. 4（7）: 773-783）、O'Brien and Jones（2003, Methods Mol. Biol.207: 81-100）、Skerra（2000, J. Mol. Recognit. 13: 167-187）、及びSaerenset al.（2005, J. Mol. Biol. 352（3）: 597-607）、及びそれらに引用されるさらなる参考文献を参照されたい。例えばマウス又はラットのＣＤＲをヒトのフレームワーク及び足場上にグラフト化するそれ自体が既知の技法は、本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定されるＣＤＲの１つ又は複数と、１つ又は複数のヒトフレームワーク領域又は配列とを含むキメラタンパク質をもたらすのに同じように使用することができる。
このため特定の態様において、本発明は、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列及び本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるＣＤＲ配列を少なくとも１つ含むキメラアミノ酸配列も包含する。好ましくは、このようなキメラアミノ酸配列は、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列、及びまた（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；若しくは（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列及び（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含むか；又はこのようなキメラポリペプチドは、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列、及びまた（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含み得る。例えばこのようなキメラポリペプチドは、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択される１つのＣＤＲ配列と、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列からなる群から選択される１つのＣＤＲ配列と、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列からなる群から選択される１つのＣＤＲ配列とを含み得る。本発明のアミノ酸配列に好ましいとして本明細書で言及されるＣＤＲの組合せ（表Ａ−１を参照されたい）は通常これらのキメラポリペプチドにも好ましい。
上記キメラポリペプチドでは、ＣＤＲをさらなるアミノ酸配列に連結させても、及び／又はアミノ酸配列を介して互いに連結させてもよく、上記アミノ酸配列は、フレームワーク配列であるか、又はフレームワーク配列として働くか、若しくは共にＣＤＲを提示するための足場を形成するアミノ酸配列であるのが好ましい。
非限定的な一実施形態によれば、キメラアミノ酸配列は、少なくとも１つのフレームワーク配列を介して連結した（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）ＣＤＲ配列を少なくとも２つ含み、ここで好ましくは２つのＣＤＲ配列のうち少なくとも１つがＣＤＲ３配列であり、もう１つのＣＤＲ配列がＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列である。好ましいが、非限定的な一実施形態によれば、キメラアミノ酸配列は、少なくとも２つのフレームワーク配列に連結した（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ配列を少なくとも３つ含み、ここで好ましくは３つのＣＤＲ配列のうち少なくとも１つがＣＤＲ３配列であり、残りの２つのＣＤＲ配列はＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列であり、１つがＣＤＲ１配列、１つがＣＤＲ２配列であるのが好ましい。特に好ましいが、非限定的な一実施形態によれば、キメラアミノ酸配列は構造ＦＲ１’−ＣＤＲ１−ＦＲ２’−ＣＤＲ２−ＦＲ３’−ＣＤＲ３−ＦＲ４’（ここでＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定のようなものであり、ＦＲ１’、ＦＲ２’、ＦＲ３’及びＦＲ４’はフレームワーク配列である）を有する。ＦＲ１’、ＦＲ２’、ＦＲ３’及びＦＲ４’は特にそれぞれ、ヒト抗体のフレームワーク１配列、フレームワーク２配列、フレームワーク３配列及びフレームワーク４配列（例えばＶＨ３配列）及び／又はこのようなフレームワーク配列の部分若しくは断片であり得る。構造ＦＲ１’−ＣＤＲ１−ＦＲ２’−ＣＤＲ２−ＦＲ３’−ＣＤＲ３−ＦＲ４’を有するキメラポリペプチドの部分又は断片を使用することも可能である。好ましくは、このような部分又は断片は、本発明のアミノ酸配列で設定される基準を満たすようなものである。
本発明のこのようなアミノ酸配列において、フレームワーク配列は任意の好適なフレームワーク配列であり得るが、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書において言及されるさらなる開示及び従来技術に基づき、当業者に明らかである。
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列、又は（例えばヒト化又はラクダ化等の配列の最適化によって）免疫グロブリンフレームワーク配列から誘導されているフレームワーク配列（の好適な組合せ）であるのが好ましい。例えばフレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列）から誘導されているフレームワーク配列であり得る。特に好ましい一態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列（該フレームワーク配列は任意で、部分又は完全ヒト化し得る）から誘導されているか、又は（本明細書に規定のように）ラクダ化した従来のＶＨ配列であるいずれかのフレームワーク配列である。
フレームワーク配列は、本発明のアミノ酸配列が、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）であるようなものであるのが好ましい。また、好適なフレームワーク配列は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる開示及び従来技術に基づいて当業者にとって明らかである。
特に、本発明のアミノ酸配列に存在するフレームワーク配列は、本発明のアミノ酸配列がナノボディであるように、（特許文献７（表Ａ−３〜表Ａ−８）に規定の）特徴的な残基を１つ又は複数含有し得る。このようなフレームワーク配列（の好適な組合せ）の幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示から明らかになる（例えば表Ａ−１を参照されたい）。概してナノボディ（特にＶＨＨ配列及び（部分）ヒト化ＶＨＨ配列）は特に、（例えば特許文献７の６１頁２４行目から９８頁３行目にさらに記載されるような）１つ又は複数のフレームワーク配列における１つ又は複数の「特徴的な残基」の存在を特徴とし得る。
好ましい態様において、本発明のアミノ酸配列は免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能である。好ましくは、本発明のアミノ酸配列は免疫グロブリン配列であり、さらにより好ましくは本発明のアミノ酸配列は、
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
の構造を有する。
したがって本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になるアミノ酸配列であって、ここでＣＤＲ１が、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸配列にも関する。
この実施形態においてアミノ酸配列は、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列、又は（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるＣＤＲ配列を少なくとも１つ含む。好ましくはアミノ酸配列は、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列、又は（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるＣＤＲ配列を少なくとも２つ、例えば（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列及び（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；若しくは（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列及び（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列；若しくは（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列及び（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含むか、又はこのようなアミノ酸配列は、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ１配列、（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ２配列、及び（本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定の）本発明のＣＤＲ３配列からなる群から選択されるＣＤＲ配列を３つ含み得る。
このため本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になるアミノ酸配列であって、ここでＣＤＲ１が、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸配列にも関する。
本発明のアミノ酸配列に関する好ましいＣＤＲ配列の組合せを表Ａ−１に示す。
本発明のアミノ酸配列は、従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になり得るか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になり得る。本発明のアミノ酸配列は、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）若しくはナノボディから本質的になり得る。
（単一）ドメイン抗体の概説に関しては、上記で言及された従来技術、及び欧州特許第０３６８６８４号も参照する。「ｄＡｂ」という用語に関しては、例えばWard et al.（1989, Nature 341: 544-6）、Holt et al.（2003, Trends Biotechnol,21:484-490）、並びに例えば国際公開第０６／０３０２２０号、国際公開第０６／００３３８８号、及びDomantisLtd.の他の公開特許出願を参照する。哺乳動物起源ではないため、本発明に関してあまり好ましくはないが、単一ドメイン抗体又は単一可変ドメインは、或る特定種のサメ由来である可能性があることにも留意すべきである（例えばいわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えば国際公開第０５／１８６２９号を参照されたい）。
特に本発明のアミノ酸配列は、（本明細書で規定の）ナノボディ（登録商標）又はその好適な断片から本質的になるか、又はそれらであり得る（備考：ナノボディ（登録商標）、ナノボディ（登録商標）及びナノクローン（登録商標）は、Ablynx N. V.の登録商標である）。ＩＬ−６Ｒに指向性を有するこのようなナノボディは、本明細書で「本発明のナノボディ」とも称される。
ナノボディの概説に関しては、以下のさらなる記載、及び例えば特許文献７（１６頁）に記載のような本明細書で言及される従来技術を参照する。
特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０、又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１から選択されるアミノ酸残基ストレッチ、又は配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４、又は配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号９３〜配列番号９４から選択されるアミノ酸残基ストレッチ、又は配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号９３、又は配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、若しくはより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチを含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号８４；又は配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３〜配列番号９４から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３；又は配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３〜配列番号９４から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３；又は配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４；又は配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３〜配列番号９４から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４；又は配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３；又は配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０及び配列番号８４を含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０及び配列番号９３を含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８４及び配列番号９３を含む。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３〜配列番号９４から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３；又は配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号８４；又は配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３〜配列番号９４から選択されるアミノ酸残基ストレッチ；又は配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０；又は配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号８４；又は配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチ；及び少なくとも配列番号９３；又は配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチを含み、ここでは上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
さらに別の特定の態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、配列番号８０、配列番号８４及び配列番号９３を含む。
本発明のアミノ酸配列に関して本明細書で規定のＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列の好ましい組合せは表Ａ−１にも示される。
好ましい態様において、本発明のアミノ酸配列は、
ａ）配列番号６０〜配列番号６９；
ｂ）そのＣＤＲ配列の１つ、２つ又は全てにおいて配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であって、そのＣＤＲ配列の１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸配列；並びに
ｃ）配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列からなる群から選択される。
別の好ましい態様において、本発明のアミノ酸配列は、
ａ）配列番号６５〜配列番号６９；
ｂ）そのＣＤＲ配列の１つ、２つ又は全てにおいて配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であって、そのＣＤＲ配列の１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸配列；並びに
ｃ）配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列からなる群から選択される。
さらに別の好ましい態様において、本発明のアミノ酸配列は、
ａ）配列番号６６、
ｂ）そのＣＤＲ配列の１つ、２つ又は全てにおいて配列番号６６とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であって、そのＣＤＲ配列の１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６６による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸配列、並びに
ｃ）配列番号６６とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、わずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６６による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列
からなる群から選択される。
２つのアミノ酸残基ストレッチ（又は２つのＣＤＲ配列）を比較する場合、「そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」という用語は、ａ）に指定する本発明のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）と比較した、ｂ）に指定する本発明のアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）の或る位置上での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表す。２つのアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）は１つ又は最大で２つのこのようなアミノ酸差異を含有することができることが理解される。
「そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」とは、本発明のアミノ酸配列がａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３と比較してそのＣＤＲ１においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異及び／又はそのＣＤＲ２においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異及び／又はそのＣＤＲ３においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；例えば配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ１と比較してそのＣＤＲ１においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ２と比較してそのＣＤＲ２においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ３と比較してそのＣＤＲ３においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ１と比較してそのＣＤＲ１においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ２と比較してそのＣＤＲ２においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ１と比較してそのＣＤＲ１においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及び配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ３と比較してそのＣＤＲ３においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ２と比較してそのＣＤＲ２においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ３と比較してそのＣＤＲ３においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ１と比較してそのＣＤＲ１においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、ａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ２と比較してそのＣＤＲ２においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のアミノ酸配列のうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）におけるＣＤＲ３と比較してそのＣＤＲ３においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有し得ることを意味する。
「そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」は、本発明のアミノ酸配列の特性を改善させるか、又は本発明のアミノ酸配列の所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、１つ又は複数のＣＤＲにおける任意の１つ又は最大で２つの置換、欠失若しくは挿入、又はそれらの任意の組合せであり得る。これに関して、得られる本発明のアミノ酸配列は少なくとも、１つ又は最大で２つの置換、欠失又は挿入を有しない１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られるアミノ酸配列は、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られるアミノ酸配列は本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。
本発明の一態様において、「そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」はアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、本発明のアミノ酸配列の特性を改善させるか、又は本発明のアミノ酸配列の所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、１つ又は複数のＣＤＲにおける任意の１つ又は最大で２つの置換であり得る。これに関して、得られる本発明のアミノ酸配列は少なくとも、１つ又は最大で２つの置換を有しない１つ又は複数のアミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られるアミノ酸配列は、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られるアミノ酸配列は本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。
上述のように、ＣＤＲにおけるアミノ酸置換は、（本明細書に規定のように）「保存的置換」等の任意の可能な置換であっても、（本明細書に規定のように）或る特定の規則により働いても、及び／又は得られるアミノ酸配列に対する特性の改善を誘導してもよい。
本発明は、配列番号６０〜配列番号６９（の完全配列）のうちの１つとのわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列にも関する。
２つのアミノ酸配列を比較するとき、「アミノ酸差異」という用語は、第２のアミノ酸配列に比べて第１のアミノ酸配列の或る位置上での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表す。２つのアミノ酸配列は、１つ又は最大で２つのこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
「アミノ酸差異」は、本発明のアミノ酸配列の特性を改善させるか、又は本発明のアミノ酸配列の所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、アミノ酸配列における、すなわち１つ又は複数のフレームワーク領域における又は１つ又は複数のＣＤＲ、又はそれらの任意の組合せにおける任意の１つ又は最大で任意の２つの置換、欠失若しくは挿入であり得る。これに関して、得られる本発明のアミノ酸配列は少なくとも、１つ又は最大で２つの置換、欠失又は挿入を有しないアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られるアミノ酸配列は、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られるアミノ酸配列は本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。当業者は概して、好適な置換、欠失若しくは挿入、又はそれらの好適な組合せを求め、選択することができ、またこのようにして得られたアミノ酸配列の特性に対するそれらの影響を求めることができるであろう。
本発明の一態様において、「アミノ酸差異」はアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、本発明のアミノ酸配列の特性を改善させるか、又は本発明のアミノ酸配列の所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、１つ又は複数のフレームワーク領域若しくは１つ又は複数のＣＤＲ、又はそれらの任意の組合せにおける任意の１つ又は最大で２つの置換であり得る。これに関して、得られる本発明のアミノ酸配列は少なくとも、１つ又は最大で２つの置換を有しないアミノ酸配列と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られるアミノ酸配列は、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られるアミノ酸配列は本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。当業者は概して、好適な置換を求め、選択することができ、またこのようにして得られたアミノ酸配列の特性に対するその影響を求めることができるであろう。
上記のように、置換、挿入又は欠失は１つ又は複数のフレームワーク領域及び／又は１つ又は複数のＣＤＲにあり得る。上述のように、１つ又は複数のＣＤＲにおけるアミノ酸置換は、（本明細書で規定のように）「保存的置換」等の任意の置換であっても、（本明細書に規定のように）或る特定の規則により働いても、及び／又は得られるアミノ酸配列に対する特性の改善を誘導してもよい。
このような置換、挿入又は欠失が１つ又は複数のフレームワーク領域で行われる場合、置換、挿入又は欠失は、（例えば特許文献７、表Ａ−３〜表Ａ−８に規定のような）１つ又は複数の特徴的な残基で及び／又はフレームワーク残基における１つ又は複数の他の位置で行われてもよいが、（これらが本明細書に記載のような好適なヒト化置換ではない限り）特徴的な残基での置換、挿入又は欠失は概してあまり好ましくない。非限定的な例により、置換は例えば（本明細書に記載のような）保存的置換であってもよく、及び／又はアミノ酸残基を別のＶＨＨドメインにおける同じ位置で自然発生する別のアミノ酸残基に置き換えてもよいが（特許文献７、表Ａ−５〜表Ａ−８を参照されたい）、本発明は概してそれらに限定されない。
（好ましくは）１つ又は複数のフレームワーク領域において行われる置換、挿入又は欠失は、例えばヒト化置換等のフレームワーク領域の配列最適化のための置換であり得る。幾つかの好ましいが、非限定的なヒト化置換（及びそれらの好適な組合せ）は本明細書中での開示に基づき当業者にとって明らかになるであろう。ａ）に規定の本発明のアミノ酸配列のうちの１つのフレームワーク領域の配列を１つ又は複数の密接に関連したヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより、潜在的に有用なヒト化置換を確認し、その後１つ又は複数のこのようにして求められた潜在的に有用なヒト化置換（又はそれらの組合せ）を（本明細書でさらに記載のようにそれ自体が既知の任意の方法で）ａ）で規定の上記の本発明のアミノ酸配列に導入することができ、ＩＬ−６Ｒに対する親和性、安定性、発現のし易さ及びレベル、及び／又は本明細書に規定の他の所望の特性に関して、得られたヒト化アミノ酸配列を試験することができる。このようにして、当業者は本明細書中の開示に基づき限定的な試行錯誤によって、他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）を求めることができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現するのに使用される宿主生物に応じて、当業者の能力の範囲内で、このような欠失及び／又は置換を、翻訳後修飾に関する１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位）を除去するように設計してもよい。代替的には、置換又は挿入を官能基（本明細書中で説明される）が結合する１つ又は複数の部位を導入する、例えば部位特異的ペグ化（同様に本明細書中で説明される）を可能にするように設計してもよい。
特許文献７の表Ａ−５〜表Ａ−８に示すＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性に関するデータから明らかなように、フレームワーク領域内の幾つかのアミノ酸残基は他よりも保存されている。一般に、任意の置換、欠失又は挿入は好ましくは保存されにくい位置で起こるが、本発明は最も広い意味ではこれに限定されない。また、一般に、アミノ酸置換はアミノ酸欠失又はアミノ酸挿入よりも好適である。
好ましくは得られる本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは、好ましくは
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、
（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
本発明のアミノ酸配列とＩＬ−６Ｒとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値が本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
関与する特定の疾患又は障害に応じて、任意の好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／又はそれ自体が既知の動物モデル、又はそれらの任意の組合せを使用して、本発明のアミノ酸配列及びナノボディ、並びにこれを含む組成物の効力及び／又は有効性を試験することができる。好適なアッセイ及び動物モデルは当業者にとって明らかであり、例えばＩＬ−６依存性細胞株（ＴＦ−１、ＸＧ１及び７ＴＤ１を含む）を使用する増殖アッセイ及びコラーゲン誘導関節炎モデル、ＳＣＩＤマウスにおける滑膜組織の移植モデル、様々なヒトのがん（リンパ腫、骨髄腫、前立腺がん及び腎細胞癌を含む）の異種移植モデル、ＩＢＤモデル（ＴＮＢＳを含む）、霊長類モデル（例えばShinkura et al., 1998, Anticancer Research 18: 1217-1222に記載のような）、関節炎疾患の非ヒト霊長類モデル（例えばVierboom et al., 2008, Drug Discov. Today: Dis Modeldoi:10.1016/j.ddmod. 2008.06.003に記載のような）、並びに以下の実験部及び本明細書で言及される従来技術で使用されるアッセイ及び動物モデル（Peake et al., 2006 Rheumatology 45:1485-9、Wahidet al., 2000, Clin Exp. Immunol., 122:133-142、Matsunoet al., 1998, Arthritis and rheumatism 41: 2014-2021、特許文献７）が挙げられる。
例えばKitamura et al. （1989, J. Cell Physiol. 140:323）に記載のようなＴＦ−１アッセイにおいて、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは、１０ｎＭ〜５０ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは１ｎＭ〜５０ｐＭ以下、例えば約７５０ｐＭ又は５００ｐＭ以下のＩＣ５０値（１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは、５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは２５ｎＭ〜１ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１ｎＭ以下、例えば約８ｎＭ以下のＩＣ５０値（５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。このＴＦ−１アッセイでは、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディはトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＩＬ−６のＥＣ５０値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような２７．２９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは５００ｐＭ〜５０ｐＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは２００ｐＭ〜５０ｐＭ以下、例えば１５０ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。ＩＬ−６のＥＣ９５値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような８８５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、好ましくは７５０ｐＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは５００ｐＭ〜１００ｐＭ以下、例えば４００ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。この血漿効力アッセイでは、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。この血漿効力アッセイでは、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディはトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＣＨＯ細胞上での膜ＩＬ−６Ｒとの結合を規定するアッセイでは、本発明のアミノ酸配列又は本発明のナノボディは１０ｎＭ〜１００ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは２ｎＭ〜１０ｐＭ以下、例えば２ｎＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。
本明細書における開示から同様に明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のアミノ酸配列又はナノボディの部分又は断片、又は２つ以上の部分又は断片の組合せ、特に配列番号６０〜配列番号６９のアミノ酸配列の部分又は断片の使用もまた本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施形態によれば、「本発明のアミノ酸配列」又は「本発明のナノボディ」という用語は最も広い意味ではこのような部分又は断片も包含する。
概して、本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（その類似体を含む）のこのような部分又は断片は、対応する本発明の全長アミノ酸配列又はナノボディのアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、Ｃ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、１つ又は複数の連続内部アミノ酸残基、又はその任意の組合せが欠失している、及び／又は除去されたアミノ酸配列を有する。
部分又は断片は好ましくは、本明細書で規定されるような親和性（本明細書中でさらに記載されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定される、及び／又は表される）でＩＬ−６受容体上で特定のエンベロープに結合することができるようなものである。
特にアミノ酸配列、ナノボディ及び部分又は断片が好ましくは、
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するようなものであるのが好ましい。
ＩＬ−６受容体に対する部分又は断片の親和性は、それ自体が既知の方法、例えば本明細書中で説明されるアッセイを用いて求めることができる。
任意の部分又は断片は好ましくは、対応する本発明の全長アミノ酸配列又はナノボディのアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも３０個の連続アミノ酸残基、例えば少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含むものである。
また、任意の部分又は断片は好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の少なくとも１つ又は少なくともその一部（特に少なくともＣＤＲ３又は少なくともその一部）を含むものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び少なくとも１つの他のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２）又は少なくともその一部を含むものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは同様に適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び残り２つのＣＤＲの少なくとも一部を含むものである。
別の特に好ましいが非限定的な実施形態によれば、このような部分又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディの少なくともＣＤＲ３、例えばＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む（すなわち、例えば国際出願の国際公開第０３／０５０５３１号（Lasters et al.）に記載される）。
上記で既に述べたように、２つ以上のこのような部分又は断片（すなわち、同一又は別個の本発明のアミノ酸配列又はナノボディに由来する）を組み合わせる、すなわち、本発明のアミノ酸配列又はナノボディのさらなる部分又は断片（本明細書で規定される）を提供することも可能である。例えば本発明のアミノ酸配列又はナノボディの１つ又は複数の部分又は断片を、ヒトＶＨドメインの１つ又は複数の部分又は断片と組み合わせることもまた可能である。
好適な一実施形態によれば、部分又は断片は、配列番号６０〜配列番号６９のアミノ酸配列又はナノボディの１つと少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、９５％又は９９％以上の程度の配列同一性を有する。
部分及び断片、並びにそれをコードする核酸配列は、任意のそれ自体が既知の方法で準備して任意に組み合わせることができる。例えばこのような部分又は断片は、完全長の本発明のアミノ酸配列又はナノボディをコードする核酸中に終止コドンを挿入すること、及び次にこのようにして得られた核酸をそれ自体が既知の方法（例えば本明細書中で説明される）で発現させることで得ることができる。代替的には、このような部分又は断片をコードする核酸は、完全長の本発明のアミノ酸配列又はナノボディをコードする核酸を適切に制限すること、又はこのような核酸をそれ自体が既知の方法で合成することにより得ることができる。部分又は断片はまた、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いて準備してもよい。
本発明はさらに、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列若しくはナノボディ（又はその好適な断片）を含むか、又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、任意で１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位をさらに含む、化合物又は構築物に関する。好ましい態様では、上記の１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位はアミノ酸配列である。別の好ましい態様では、上記の１つ又は複数のリンカーは１つ又は複数のアミノ酸配列である。このような化合物又は構築物は「本発明のポリペプチド」とも称される。
本発明のポリペプチドは、そのアミノ末端で、そのカルボキシ末端で、又はそのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方で、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列と融合する、すなわち上記の本発明のアミノ酸配列又はナノボディと１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質がもたらされるように本発明のアミノ酸配列又はナノボディを含み得る。
１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、任意の好適及び／又は所望のアミノ酸配列であり得る。さらなるアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列又はナノボディの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、若しくはさもなければこれに影響を与えても又は与えなくてもよく、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドにさらなる官能基を付加しても又は付加しなくてもよい。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに、１つ又は複数の所望の特性又は官能性を付与する。
このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであり、一般に、従来の抗体及びその断片に基づきペプチド融合に用いられる全てのアミノ酸配列を含み得る（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）。例えばHolliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 （2005）による総説を参照する。
例えばこのようなアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列又はナノボディ自体に比べて、半減期、溶解性又は吸着を増大させる、免疫原性又は毒性を低減する、望ましくない副作用を排除又は減衰する、及び／又は他の有益な特性を本発明のポリペプチドに付与するか、及び／又は本発明のポリペプチドの望ましくない特性を低減するアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列の幾つかの非限定的な例は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えば国際公開第００／２７４３５号を参照されたい）又はハプテン分子（例えば循環抗体として認識されるハプテン（例えば国際公開第９８／２２１４１号を参照されたい））である。
さらなるアミノ酸配列はまた、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基又はエピトープ（本発明のアミノ酸配列又はナノボディが指向性を有する同様のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープ、又は異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープが挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかに指向性を有し得る第２の結合部位をもたらし得る。例えばさらなるアミノ酸配列は、血清タンパク質（例えばＩｇＧ等のヒト血清アルブミン又は別の血清タンパク質等）に指向性を有する第２の結合部位をもたらして、血清中の半減期の増大をもたらし得る。このようなアミノ酸配列は例えばナノボディ、並びに国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号及び国際公開第０２／０７６４８９号に記載の小ペプチド及び結合タンパク質、並びに国際公開第０３／００２６０９号及び国際公開第０４／００３０１９号に記載のｄＡｂを含む。Harmsen et al. （2005, Vaccine, 23 （41）: 4926-42）、並びに欧州特許第０３６８６８４号、並びにAblynx N.V.の国際公開第０８／０２８９７７号、国際公開第０８／０４３８２１号、国際公開第０８／０４３８２２号及び国際公開第０８／０６８２８０号も参照する。
本発明のアミノ酸配列又はナノボディに半減期の増大をもたらし得る好ましいアミノ酸配列は配列番号９７〜配列番号９９から選択され得る。
このようなアミノ酸配列は特に、血清アルブミン（より具体的にはヒト血清アルブミン）に及び／又はＩｇＧ（より具体的にはヒトＩｇＧ）に指向性を有し得る。例えばこのようなアミノ酸配列は、（ヒト）血清アルブミンに指向性を有するアミノ酸配列、及びＦｃＲｎへの血清アルブミンの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば国際公開第０６／０１２２７８７号を参照されたい）、及び／又は血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば同様に国際公開第０６／０１２２７８７号を参照されたい）；増大した半減期を有するか又は半減期を増大させ得るアミノ酸配列（例えば国際公開第０８／０２８９７７号を参照されたい）；哺乳動物の少なくとも１種に由来の血清アルブミンと、特に霊長類の少なくとも１種（例えばこれらに限定されるものではないが、マカク属のサル（例えば特に、カニクイザル（マカク・ファシクラリス）及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス）と交差反応性であるヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列（同様に国際公開第０８／０２８９７７号を参照する）；ｐＨ非依存的に血清アルブミンに結合し得るアミノ酸配列（例えば国際公開第０８／０４３８２１号を参照されたい）、及び／又は条件付き結合剤（conditional binders）であるアミノ酸配列（例えば国際公開第０８／０４３８２２号を参照されたい）であり得る。
別の実施形態によれば、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、従来の四本鎖抗体（特にヒト抗体）及び／又は重鎖抗体の１つ又は複数の部分、断片、又はドメインを含み得る。例えば通常はあまり好ましくないが、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは、同様に任意でリンカー配列を介して、従来の（好ましくはヒト）ＶＨドメイン若しくはＶＬドメインに、又はＶＨドメイン若しくはＶＬドメインの天然型類似体若しくは合成類似体（Ward et al.によって説明されているｄＡｂ等の他の（単一）ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）に連結され得る。
したがって本発明の化合物又は構築物では、上記の１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又はナノボディからなる群から選択され得る。
本発明の特定の一態様において、本発明のアミノ酸配列又はナノボディを少なくとも１つ含む本発明の化合物、構築物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列又はナノボディに比べて増大した半減期を有し得る。このような化合物、構築物及びポリペプチドの幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかとなり、例えば半減期が増大するように（例えばペグ化によって）化学修飾された本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを含む化合物、構築物及びポリペプチド；又は本発明のナノボディの半減期を増大させる少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）と連結する少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列又はナノボディを含む本発明のポリペプチドであり得る。このような半減期が延長した部分又はアミノ酸配列を含む本発明の化合物、構築物又はポリペプチドの例は、本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかとなり、例えばこれらに限定されないが、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列又はナノボディが、１つ又は複数の血清タンパク質若しくはその断片（例えば血清アルブミン又はその好適な断片）、又は血清タンパク質と結合することができる１つ又は複数の結合単位（例えば血清アルブミン等の血清タンパク質、ＩｇＧ等の血清免疫グロブリン又はトランスフェリンと結合することができるナノボディ又は（単一）ドメイン抗体）と好適に連結するポリペプチド；本発明のアミノ酸配列又はナノボディがＦｃ部分（例えばヒトＦｃ）又はその好適な部分若しくは断片と連結するポリペプチド；又は１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列又はナノボディが、血清タンパク質と結合することができる１つ又は複数の小タンパク質又は小ペプチドと好適に連結するポリペプチドが含まれる（例えばこれに限定されないが、国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号、国際公開第０２／０７６４８９号に記載のタンパク質及びペプチド）。
また、少なくとも１つのアミノ酸配列又はナノボディは、任意でリンカー配列を介して、１つ又は複数の（好ましくはヒト）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインと連結してもよい。例えば好適なＣＨ１ドメインと連結するアミノ酸配列又はナノボディは、例えば従来のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片に類似するが、従来のＶＨドメインの１つ、又は（Ｆ（ａｂ’）２断片の場合）両方を本発明のアミノ酸配列又はナノボディで置き換えた抗体断片／構造体を生成するように（好適な軽鎖と共に）使用することができる。また、２つのアミノ酸配列又はナノボディは、（任意でリンカーを介して）ＣＨ３ドメインと連結してｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した構築物をもたらすことができる。
本発明のポリペプチドの具体的な一態様によれば、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列又はナノボディは、１つ又は複数の定常ドメイン（例えばＦｃ部分の一部として使用する／Ｆｃ部分を形成することができる２つ又は３つの定常ドメイン）と、Ｆｃ部分と、及び／又は１つ又は複数のエフェクター機能を本発明のポリペプチドに付与し及び／又は１つ又は複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与し得る１つ又は複数の抗体部分、断片又はドメインと（任意で好適なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結し得る。例えばこの目的で、これらに限定されるものではないが、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、重鎖抗体（本明細書中に記載）及びより好ましくは従来のヒト四本鎖抗体に由来するような抗体の１つ又は複数のＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、及び／又は例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＥ、又はＩｇＡ、ＩｇＤ若しくはＩｇＭ等の別のヒトＩｇに由来するＦｃ領域（の一部）を形成してもよい。例えば国際公開第９４／０４６７８号は、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（すなわち、ナノボディ）を含む重鎖抗体を記載しており、ここでは、ラクダ科動物ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインが、ヒトＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインで置き換えられている。それによりナノボディと（ＣＨ１ドメインは含まないが）ヒトのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとをそれぞれ含む２つの重鎖からなる免疫グロブリンがもたらされるが、その免疫グロブリンは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインによって付与されるエフェクター機能を有し、如何なる軽鎖の非存在下でも機能することができる。本発明のアミノ酸配列又はナノボディと好適に連結してエフェクター機能をもたらし得る他のアミノ酸配列は当業者にとって明らかであり、所望のエフェクター機能（複数可）に基づき選択され得る。例えば国際公開第０４／０５８８２０号、国際公開第９９／４２０７７号、国際公開第０２／０５６９１０号、及び国際公開第０５／０１７１４８号、並びにHolliger and Hudsonの概説（同上）、並びに国際公開第０９／０６８６２８号）を参照する。本発明のアミノ酸配列又はナノボディとＦｃ部分との共役によっても、対応する本発明のアミノ酸配列又はナノボディに比べて半減期の増大が生じ得る。用途によっては、如何なる生物学的に重要なエフェクター機能も含まない半減期の増大を与えるＦｃ部分及び／又は定常ドメイン（すなわち、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン）の使用も好適であるか、又は一層好ましい場合がある。１つ又は複数のアミノ酸配列又はナノボディと、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した１つ又は複数の定常ドメインとを含む他の好適な構築物は当業者にとって明らかであり、例えば任意でリンカー配列を介してＣＨ３ドメインに連結する２つのアミノ酸配列又はナノボディを含み得る。一般に、半減期が増大した任意の融合タンパク質又は誘導体は好ましくは、５０ｋＤを超える分子量、すなわち腎臓吸収のカットオフ値を有する。
別の具体的であるが、非限定的な一態様において、本発明のポリペプチドを形成するために、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は、（すなわち従来の四本鎖抗体で自然発生する定常ドメインに比べて）二量体に自己会合する傾向が低減した（又は本質的にその傾向がない）天然、合成又は半合成の定常ドメイン（又はその類似体、変異体、突然変異体、部分又は断片）と（任意で好適なリンカー又はヒンジ領域を介して）連結し得る。このような単量体の（すなわち自己会合していない）Ｆｃ鎖変異体又はその断片は、当業者にとって明らかである。例えばHelm et al.（1996, J. Biol. Chem. 271: 7494）は、本発明のポリペプチド鎖で使用することができる単量体Ｆｃ鎖変異体を説明している。
また、このような単量体Ｆｃ鎖変異体は、依然として（これらが誘導されるＦｃ部分に応じて）補体又は関連のＦｃ受容体（複数可）に結合することができるようなもの、及び／又は依然としてこれらが誘導されるＦｃ部分のエフェクター機能を幾らか又は全て（又は依然として使用目的に適した低減レベルで）有するようなものであるのが好ましい。代替的に、このような本発明のポリペプチド鎖では、単量体Ｆｃ鎖を使用して、ポリペプチド鎖の半減期を増大させることができ、この場合、単量体Ｆｃ鎖はエフェクター機能を有しなくても、又は本質的に有しなくてもよい。
概して、半減期が増大した、本発明のアミノ酸配列又はナノボディ（又はこれを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）は、対応する本発明のアミノ酸配列又はナノボディ自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍（例えば少なくとも５倍）、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超大きい半減期を有するのが好ましい。例えば半減期が増大した、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、対応する本発明のアミノ酸配列又はナノボディ自体に比べて、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超（例えば１２時間超）、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間超増大した血清半減期を有する。
好ましいが非限定的な態様において、このような本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）の半減期を有し得る。
また、さらなるアミノ酸配列は、（例えば本発明のポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレフォーム、プロフォーム又はプレプロフォームをもたらすように）合成の際に宿主細胞からの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの分泌を導くシグナル配列又はリーダー配列を形成し得る。
また、さらなるアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導し、及び／又はそれらに浸透させるか若しくは侵入させ、及び／又は本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍等の腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に浸透させるか若しくはそれらに対して横断させる配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の好適な例は当業者にとって明らかであり、例えばこれらに限定されないが、上記の「Ｐｅｐｔｒａｎｓ」ベクター、Cardinale et al.によって記載される配列、並びに、例えば国際公開第９４／０２６１０号、国際公開第９５／２２６１８号、米国特許第７，００４，９４０号、国際公開第０３／０１４９６０号、国際公開第９９／０７４１４号；国際公開第０５／０１６９０号；欧州特許第１５１２６９６号；及びCattaneo A. and Biocca, S. （1997,Intracellular Antibodies：Development and Applications. Landesand Springer-Verlag）及びKontermann, （2004, Methods 34:163-170）、これらに記載のさらなる参照文献に記載されるような、いわゆる「細胞内抗体」として本発明のナノボディ及びポリペプチドを発現又は産生するのに使用することができる、それ自体が既知のアミノ酸配列及び抗体断片が挙げられる。
好ましいが非限定的な実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列又はナノボディは少なくとも、１つのさらなるアミノ酸配列又はナノボディを含み、これにより、少なくとも２つ、例えば２つ、３つ、４つ、５つ以上のアミノ酸配列又はナノボディを含む本発明のポリペプチドをもたらし、上記のアミノ酸配列又はナノボディは任意で、１つ又は複数のリンカー配列（本明細書中に規定）を介して連結され得る。少なくとも１つが本発明のアミノ酸配列又はナノボディである２つ以上のアミノ酸配列又はナノボディを含む本発明のポリペプチドは、本明細書中で本発明の「多価」ポリペプチドとも称され、このようなポリペプチド中に存在するアミノ酸配列又はナノボディは、本明細書中で「多価フォーマット」であるとも称される。例えば本発明の「二価」ポリペプチドは、任意でリンカー配列を介して連結される２つのアミノ酸配列及び／又はナノボディを含み、本発明の「三価」ポリペプチドは、任意で２つのリンカー配列を介して連結される３つのアミノ酸配列及び／又はナノボディを含む。ポリペプチド中に存在するアミノ酸配列及び／又はナノボディの少なくとも１つ、最大でポリペプチド中に存在する全てのアミノ酸配列及び／又はナノボディが、本発明のアミノ酸配列及び／又はナノボディである。
本発明の多価ポリペプチドでは、２つ以上のアミノ酸配列又はナノボディは、同じであっても異なっていてもよく、同じ抗原又は抗原決定基（例えば同じ部分（複数可）若しくはエピトープ（複数可）、又は異なる部分若しくはエピトープ）に指向性を有するものであってもよく、又は代替的に異なる抗原若しくは抗原決定基又はそれらの任意の好適な組合せに指向性を有するものであってもよい。例えば本発明の二価ポリペプチドは、（ａ）２つの同一のアミノ酸配列若しくはナノボディ、（ｂ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のアミノ酸配列若しくはナノボディ、及び第１のアミノ酸配列若しくはナノボディと異なる上記タンパク質若しくは抗原の同一抗原決定基に指向性を有する第２のアミノ酸配列若しくはナノボディ、（ｃ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のアミノ酸配列若しくはナノボディ、及び上記タンパク質若しくは抗原の別の抗原決定基に指向性を有する第２のアミノ酸配列若しくはナノボディ、又は（ｄ）第１のタンパク質若しくは抗原に指向性を有する第１のアミノ酸配列若しくはナノボディ、及び第２のタンパク質若しくは抗原（すなわち、上記第１の抗原と異なる）に指向性を有する第２のアミノ酸配列若しくはナノボディを含み得る。同様に、本発明の三価ポリペプチドは例えばこれらに限定されるものではないが、（ａ）３つの同一のアミノ酸配列若しくはナノボディ、（ｂ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のアミノ酸配列若しくはナノボディ、及び同一抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する第３のアミノ酸配列若しくはナノボディ、（ｃ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のアミノ酸配列若しくはナノボディ、及び上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のアミノ酸配列若しくはナノボディ、（ｄ）第１の抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のアミノ酸配列若しくはナノボディ、上記第１の抗原の第２の抗原決定基に指向性を有する第２のアミノ酸配列若しくはナノボディ、及び上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のアミノ酸配列若しくはナノボディ、又は（ｅ）第１の抗原に指向性を有する第１のアミノ酸配列若しくはナノボディ、上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第２のアミノ酸配列若しくはナノボディ、及び上記第１の抗原及び上記第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する第３のアミノ酸配列若しくはナノボディを含み得る。
少なくとも１つのアミノ酸配列又はナノボディが第１の抗原に指向性を有する（すなわち、ＩＬ−６受容体に対する）ものであり、少なくとも１つのアミノ酸配列又はナノボディが第２の抗原（すなわち、ＩＬ−６受容体と異なる抗原）に指向性を有するものである、少なくとも２つのアミノ酸配列及び／又はナノボディを含有する本発明のポリペプチドは、本発明の「多重特異性」ポリペプチドとも称され、このようなポリペプチド中に存在するアミノ酸配列又はナノボディは、本明細書中で「多重特異性フォーマット」であるとも称される。このため例えば本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＩＬ−６受容体）に指向性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列又はナノボディ及び第２の抗原（すなわち、ＩＬ−６受容体と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列又はナノボディを含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、ＩＬ−６受容体）に指向性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列又はナノボディ、第２の抗原（すなわち、ＩＬ−６受容体と異なる抗原）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列又はナノボディ、及び第３の抗原（すなわち、ＩＬ−６受容体及び第２の抗原の両方と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列又はナノボディを含むポリペプチドである。
したがって、その最も単純な形態において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に指向性を有する第１のアミノ酸配列又はナノボディと、第２の抗原に指向性を有する第２のアミノ酸配列又はナノボディとを含み、上記の第１及び第２のアミノ酸配列又はナノボディが任意でリンカー配列（本明細書中に規定）を介して連結され得る本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であるのに対し、その最も単純な形態の本発明の三重特異性ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に指向性を有する第１のアミノ酸配列又はナノボディと、第２の抗原に指向性を有する第２のアミノ酸配列又はナノボディと、第３の抗原に指向性を有する第３のアミノ酸配列又はナノボディとを含み、上記の第１、第２及び第３のアミノ酸配列又はナノボディが、任意で１つ又は複数、特に１つ及び複数、特に２つのリンカー配列を介して連結され得る本発明の三価ポリペプチド（本明細書中に規定）である。
特定の態様において、本発明のポリペプチドは三価の二重特異性ポリペプチドである。その最も単純な形態の本発明の三価の二重特異性ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に対する２つの同一のアミノ酸配列又はナノボディと、別の抗原に指向性を有する第３のアミノ酸配列又はナノボディとを含み、上記の第１、第２及び第３のアミノ酸配列又はナノボディが、任意で１つ又は複数、特に１つ及び複数、特に２つのリンカー配列を介して連結され得る本発明の三価ポリペプチド（本明細書中に規定）であり得る。
別の特定の態様において、本発明のポリペプチドは二重特異性ポリペプチドである。その最も単純な形態の本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に対する第１のアミノ酸配列又はナノボディと、別の抗原に指向性を有する第２のアミノ酸配列又はナノボディとを含み、上記の第１及び第２のアミノ酸配列又はナノボディが任意で、リンカー配列を介して連結され得る本発明の二価ポリペプチド（本明細書中に規定）であり得る。
好ましいが非限定的な一例において、本発明の多重特異性ポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列又はナノボディと、半減期の増大をもたらす少なくとも１つのナノボディとを含む。このようなナノボディの好ましいが非限定的な幾つかの例としては、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノゲン、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ等の免疫グロブリン、又は国際公開第０４／００３０１９号に列挙された他の血清タンパク質の１つに指向性を有するナノボディが挙げられる。
例えばマウスにおける実験のためには、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に対するナノボディを用いることができ、医薬用途のためには、ヒト血清アルブミンに対するナノボディを用いることができる。
本発明の別の実施形態は、上記少なくとも１つの（ヒト）血清タンパク質が、（ヒト）血清アルブミン、（ヒト）血清免疫グロブリン、（ヒト）チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、（ヒト）フィブリノゲン等のいずれかである、上記のポリペプチド構築物である。
したがって特定の態様において、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に対する２つの同一のアミノ酸配列又はナノボディと、（ヒト）血清アルブミンに指向性を有する第３のアミノ酸配列又はナノボディとを含み、上記の第１、第２及び第３のアミノ酸配列又はナノボディが、任意で１つ又は複数、特に１つ及び複数、特に２つのリンカー配列を介して連結され得る三価の二重特異性ポリペプチドである。
別の特定の態様において、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６受容体に対する第１のアミノ酸配列又はナノボディと、（ヒト）血清アルブミンに指向性を有する第２のアミノ酸配列又はナノボディとを含み、上記の第１及び第２のアミノ酸配列又はナノボディが任意で、リンカー配列を介して連結され得る二重特異性ポリペプチドである。
具体的であるが非限定的な本発明の態様によれば、本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列又はナノボディ以外に、少なくとも１つのヒト血清アルブミンに対するナノボディを含有する。ヒト血清アルブミンに対するこれらのナノボディは、上記で引用したAblynx N. V.による出願（例えば国際公開第０４／０６２５５１号を参照されたい）に包括的に記載されているものであってもよいが、特に好ましいが非限定的な実施形態によれば、ヒト血清アルブミンに対する上記ナノボディは、配列番号９７〜配列番号９９から選択されるアミノ酸配列から本質的になる。
ＩＬ−６Ｒに対する少なくとも１つのアミノ酸配列又はナノボディと、半減期の増大をもたらす少なくとも１つのアミノ酸配列又はナノボディとを含む、本発明のポリペプチドの幾つかの好ましいが非限定的な例は以下の通りである：
ａ）配列番号７０〜配列番号７２、
ｂ）本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列、並びに
ｃ）配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列。
本発明の三価の二重特異性ポリペプチドの幾つかの好ましいが非限定的な例は以下の通りである：
ａ）配列番号７１〜配列番号７２、
ｂ）本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号７１〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号７１〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列、並びに
ｃ）配列番号７１〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号７１〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号７１〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列。
ＩＬ−６Ｒに対するアミノ酸配列又はナノボディと、半減期の増大をもたらすアミノ酸配列又はナノボディとを含む、本発明の二重特異性ポリペプチドの幾つかの好ましいが非限定的な例は以下の通りである：
ａ）配列番号７０、
ｂ）本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号７０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号７０による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列、並びに
ｃ）配列番号７０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号７０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号７０による結合と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列。
２つのアミノ酸残基ストレッチ（又は２つのＣＤＲ配列）を比較する場合、「本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」という用語は、ａ）に指定する本発明のポリペプチドに含まれる本発明のアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）と比較した、ｂ）に指定する本発明のポリペプチドに含まれる本発明のアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）の或る位置上での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表す。２つの本発明のアミノ酸残基ストレッチ（又はＣＤＲ配列）は１つ又は最大で２つのこのようなアミノ酸差異を含有することができることが理解される。
「本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」とは、本発明のポリペプチドに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディがａ）のポリペプチドのうちの１つ（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つ）に含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３と比較してそのＣＤＲ１において（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ１において）わずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異及び／又はそのＣＤＲ２において（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ２において）わずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異及び／又はそのＣＤＲ３において（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ３において）わずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；例えばａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ１（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ１）と比較してそのＣＤＲ１（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ１）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ２（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ２）と比較してそのＣＤＲ２（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ２）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ３（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ３）と比較してそのＣＤＲ３（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ３）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ１（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ１）と比較してそのＣＤＲ１（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ１）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ２（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ２）と比較してそのＣＤＲ２（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ２）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ１（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ１）と比較してそのＣＤＲ１（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ１）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ３（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ３）と比較してそのＣＤＲ３（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ３）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ２（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ２）と比較してそのＣＤＲ２（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ２）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ３（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ３）と比較してそのＣＤＲ３（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ３）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異；又はａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ１（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ１）と比較してそのＣＤＲ１（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ１）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ２（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ２）と比較してそのＣＤＲ２（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ２）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異、及びａ）のポリペプチドのうちの１つに含まれる本発明のアミノ酸配列又はナノボディにおけるＣＤＲ３（すなわち配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つにおけるＣＤＲ３）と比較してそのＣＤＲ３（すなわちＩＬ−６Ｒ上での特異的エピトープへの本発明の化合物又はポリペプチドによる結合に関する抗原結合部位を形成するＣＤＲ３）においてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有し得ることを意味する。
「そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」は、本発明の化合物若しくはポリペプチドの特性を改善させるか、又は本発明の化合物若しくはポリペプチドの所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、１つ又は複数の本発明のＣＤＲにおける任意の１つ又は最大で任意の２つの置換、欠失若しくは挿入、又はそれらの任意の組合せであり得る。これに関して、得られる本発明の化合物又はポリペプチドは少なくとも、１つ又は最大で２つの置換、欠失又は挿入を有しない１つ又は複数の本発明のＣＤＲを含む化合物又はポリペプチドと比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られる化合物又はポリペプチドは、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られる化合物又はポリペプチドは本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。
本発明の一態様において、「そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおけるアミノ酸差異」はアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、本発明の化合物若しくはポリペプチドの特性を改善させるか、又は本発明の化合物若しくは構築物の所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、１つ又は複数の本発明のＣＤＲにおける任意の１つ又は最大で任意の２つの置換であり得る。これに関して、得られる本発明の化合物又はポリペプチドは少なくとも、１つ又は最大で２つの置換を有しない本発明のＣＤＲを１つ又は複数含む化合物又は構築物と比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られる化合物又はポリペプチドは、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られる化合物又はポリペプチドは本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。当業者は概して、本明細書中の開示に基づき、任意で例えば限られた数の可能な置換を導入すること、及びこのようにして得られた化合物又はポリペプチドの特性に対する影響を求めることを伴い得る限られた程度の日常実験後に好適な置換を求め、それを選択することができるであろう。
本発明のＣＤＲのうちの１つ又は複数におけるアミノ酸置換は、（本明細書に規定のように）「保存的置換」等の任意の可能な置換であっても、（本明細書に規定のように）或る特定の規則により働いても、及び／又は得られる化合物又はポリペプチド（本明細書でさらに規定のようなもの）に対する特性の改善を誘導してもよい。
本発明は、配列番号７０〜配列番号７２（の完全配列）のうちの１つとのわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する化合物又はポリペプチドにも関する。
２つの化合物又はポリペプチドを比較するとき、「アミノ酸差異」という用語は、第２の化合物又はポリペプチドに比べて第１の化合物又はポリペプチドの或る位置上での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表す。２つの化合物又はポリペプチドは、１つ又は最大で２つのこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
「アミノ酸差異」は、本発明の化合物又はポリペプチドの特性を改善させるか、又は本発明の化合物若しくはポリペプチドの所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損なわない、化合物又はポリペプチドにおける、すなわち１つ又は複数のフレームワーク領域における、又は１つ又は複数のＣＤＲ（本発明の（すなわち本発明のアミノ酸配列又はナノボディに存在する）ＣＤＲであっても、又は別の（すなわち配列番号９８に存在する）ＣＤＲであってもよい）における、リンカー配列、又はそれらの任意の組合せにおける任意の１つ又は最大で２つの置換、欠失若しくは挿入であり得る。これに関して、得られる本発明の化合物又はポリペプチドは少なくとも、１つ又は最大で２つの置換、欠失又は挿入を有しない化合物又はポリペプチドと比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られる化合物又はポリペプチドは、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られる化合物又はポリペプチドは本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。
本発明の一態様において、「アミノ酸差異」はアミノ酸置換である。アミノ酸置換は、本発明の化合物又はポリペプチドの特性を改善させるか、又は本発明の化合物又はポリペプチドの所望の特性を又は所望の特性のバランス若しくは組合せを少なくとも過度に損わない、フレームワーク領域における、又は１つ又は複数のＣＤＲ（本発明の（すなわち本発明のアミノ酸配列又はナノボディに存在する）ＣＤＲであっても、又は別の（すなわち配列番号９８に存在する）ＣＤＲであってもよい）における、リンカー配列、又はそれらの任意の組合せにおける任意の１つ又は最大で任意の２つの置換であり得る。これに関して、得られる本発明の化合物又はポリペプチドは少なくとも、１つ又は最大で２つの置換を有しない化合物又はポリペプチドと比較して同じ、ほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。得られる化合物又はポリペプチドは、本明細書に規定のようなものである（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合することができるようなものが好ましい。得られる化合物又はポリペプチドは本明細書で規定のように細胞ベースの効力及び血漿効力を有するのも好ましい。
上記のように、置換、挿入又は欠失は１つ又は複数のフレームワーク領域に、１つ又は複数のＣＤＲに、及び／又は１つ又は複数のリンカー配列にあり得る。ＣＤＲにおける置換、挿入又は欠失は、（本明細書で規定のように）「保存的置換」等の任意の可能な置換、挿入又は欠失であっても、（本明細書に規定のように）或る特定の規則により働いても、及び／又は得られる化合物又はポリペプチドに対する特性の改善を誘導してもよい。
このような置換、挿入又は欠失が１つ又は複数のフレームワーク領域で行われる場合、任意の可能な置換、挿入又は欠失であってもよい。このような置換、挿入又は欠失は、（例えば特許文献７、表Ａ−３〜表Ａ−８に規定のような）１つ又は複数の特徴的な残基で及び／又はフレームワーク残基における１つ又は複数の他の位置で行われてもよいが、（これらが本明細書に記載のような好適なヒト化置換ではない限り）特徴的な残基での置換、挿入又は欠失は概してあまり好ましくない。非限定的な例により、置換は（本明細書に記載のような）保存的置換であってもよく、及び／又はアミノ酸残基を別のＶＨＨドメインにおける同じ位置で自然発生する別のアミノ酸残基に置き換えてもよいが（特許文献７、表Ａ−５〜表Ａ−８を参照されたい）、本発明は概してそれらに限定されない。
（好ましくは）１つ又は複数のフレームワーク領域において行われる置換、挿入又は欠失は、例えばヒト化置換等の配列を最適化する置換であり得る。幾つかの好ましいが、非限定的なヒト化置換（及びそれらの好適な組合せ）は本明細書中での開示に基づき当業者にとって明らかになるであろう。ａ）に規定の本発明のポリペプチドのうちの１つに含まれるアミノ酸配列又はナノボディのうちの１つのフレームワーク領域の配列を１つ又は複数の密接に関連したヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより、潜在的に有用なヒト化置換を確認し、その後１つ又は複数のこのようにして求められた潜在的に有用なヒト化置換（又はそれらの組合せ）を（本明細書でさらに記載のようにそれ自体が既知の任意の方法で）ａ）に規定の本発明のポリペプチドのうちの１つに含まれる上記のアミノ酸配列又はナノボディに導入することができ、ＩＬ−６Ｒに対する親和性、安定性、発現のし易さ及びレベル、及び／又は本明細書に規定の他の所望の特性に関して、得られたヒト化ポリペプチドを試験することができる。このようにして、当業者は本明細書中の開示に基づき限定的な試行錯誤によって、他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）を求めることができる。
本発明の化合物又はポリペプチドを発現するのに使用される宿主生物に応じて、当業者の能力の範囲内で、欠失及び／又は置換を、翻訳後修飾に関する１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位）を除去するように設計してもよい。代替的には、置換又は挿入を官能基（本明細書中で説明される）が結合する１つ又は複数の部位を導入する、例えば部位特異的ペグ化（同様に本明細書中で説明される）を可能にするように設計してもよい。
特許文献７の表Ａ−５〜表Ａ−８に示すＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性に関するデータから明らかなように、フレームワーク領域内の幾つかのアミノ酸残基は他よりも強く保存されている。一般に、任意の置換、欠失又は挿入は好ましくは保存されにくい位置で起こるが、本発明は最も広い意味ではこれに限定されない。また、一般に、アミノ酸置換はアミノ酸欠失又はアミノ酸挿入よりも好適である。
好ましくは得られる本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは、好ましくは
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合するように、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するように、
（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）或る親和性でＩＬ−６Ｒと結合するものとする。
本発明の化合物又はポリペプチドとＩＬ−６Ｒとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値が本明細書中のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
関与する特定の疾患又は障害に応じて、任意の好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／又はそれ自体が既知の動物モデル、又はそれらの任意の組合せを使用して、本発明のポリペプチド及び化合物、並びにこれを含む組成物の効力及び／又は有効性を試験することができる。好適なアッセイ及び動物モデルは当業者にとって明らかであり、例えばＩＬ−６依存性細胞株（ＴＦ−１、ＸＧ１及び７ＴＤ１を含む）を使用する増殖アッセイ及びコラーゲン誘導関節炎モデル、ＳＣＩＤマウスにおける滑膜組織の移植モデル、様々なヒトのがん（リンパ腫、骨髄腫、前立腺がん及び腎細胞癌を含む）の異種移植モデル、ＩＢＤモデル（ＴＮＢＳを含む）、霊長類モデル（例えばShinkura et al., 1998, Anticancer Research 18: 1217-1222に記載のような）、関節炎疾患の非ヒト霊長類モデル（例えばVierboom et al., 2008, Drug Discov. Today: Dis Modeldoi:10.1016/j.ddmod. 2008.06.003に記載のような）、並びに以下の実験部及び本明細書で言及される従来技術で使用されるアッセイ及び動物モデル（Peake et al., 2006 Rheumatology 45: 1485-9、Wahidet al., 2000, Clin. Exp. Immunol., 122: 133-142、Matsunoet al., 1998, Arthritis and rheumatism 41: 2014-2021、特許文献７）が挙げられる。
例えばKitamura et al. （1989, J. Cell Physiol. 140:323）に記載のようなＴＦ−１アッセイにおいて、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは、１０ｎＭ〜５０ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは１ｎＭ〜５０ｐＭ以下、例えば約７５０ｐＭ又は５００ｐＭ以下のＩＣ５０値（１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは、５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは２５ｎＭ〜１ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１ｎＭ以下、例えば約８ｎＭ以下のＩＣ５０値（５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有し得る。このＴＦ−１アッセイでは、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。このＴＦ−１アッセイでは、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドはトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＩＬ−６のＥＣ５０値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような２７．２９ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは５００ｐＭ〜５０ｐＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは２００ｐＭ〜５０ｐＭ以下、例えば１５０ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。ＩＬ−６のＥＣ９５値での血漿効力アッセイでは（例えば実施例４５に記載のような８８５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６の存在下で）、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、好ましくは７５０ｐＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは５００ｐＭ〜１００ｐＭ以下、例えば４００ｐＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。この血漿効力アッセイでは、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る（実施例１を参照されたい）。この血漿効力アッセイでは、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドはトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有し得る。
ＣＨＯ細胞上での膜ＩＬ−６Ｒとの結合を規定するアッセイでは、本発明の化合物又は本発明のポリペプチドは１０ｎＭ〜１００ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは２ｎＭ〜１０ｐＭ以下、例えば２ｎＭ以下のＩＣ５０値を有し得る。
好ましい態様において、本発明の化合物又はポリペプチドは配列番号７０のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる。別の好ましい態様では、本発明の化合物又はポリペプチドは配列番号７１のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる。これらのアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を一部又は完全に遮断する、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を介したシグナル伝達を阻害する能力に加えて、例えば結合及び／又は親和性の改善、結合活性の改善、有効性及び効力の改善、及び／又は選択性の増大のような特性の改善を示す。
本発明は１つの本発明のアミノ酸配列又はナノボディを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物（「本発明の一価構築物」とも称される）にも関する。本発明の好ましい一価構築物は配列番号６０〜配列番号６９、例えば配列番号６５〜配列番号６９、例えば配列番号６６等を含むか、又はこれから本質的になる。このような一価構築物、並びに本発明のアミノ酸配列及びナノボディを、例えば本発明の多価及び／又は多重特異性の化合物又はポリペプチドのような本発明の化合物又はポリペプチドを調製するのに使用することができる。
したがって本発明は、本発明の化合物、構築物又はポリペプチドを調製するための本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物の使用にも関する。本発明はさらに、本発明の化合物、構築物又はポリペプチドを調製する方法であって、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物と１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含む、方法に関する。このような方法は１つ又は複数のリンカーを介して本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物と１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含み得る。
好ましい態様において、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は、結合単位、例えばアミノ酸配列又はナノボディである。したがって本発明は、本発明の多価及び／又は多重特異性の化合物、構築物又はポリペプチドの調製のための本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物の使用にも関する。本発明はさらに、本発明の多価及び／又は多重特異性の化合物、構築物又はポリペプチドを調製する方法であって、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物と１つ又は複数の他の結合単位、例えばアミノ酸配列又はナノボディとを連結することを含む、方法に関する。このような方法は１つ又は複数のリンカーを介して本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又は一価構築物と１つ又は複数の結合単位とを連結することを含み得る。
特定の態様において、本発明は、本発明の多価及び／又は多重特異性の化合物、構築物又はポリペプチドを調製するための配列番号６０〜配列番号６９（好ましくは配列番号６５〜配列番号６９、より好ましくは配列番号６６）のうちの１つを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物の使用にも関する。本発明はさらに、本発明の多価及び／又は多重特異性の化合物、構築物又はポリペプチドを調製する方法であって、配列番号６０〜配列番号６９（好ましくは配列番号６５〜配列番号６９、より好ましくは配列番号６６）のうちの１つを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物と１つ又は複数の他の結合単位、例えばアミノ酸配列又はナノボディとを連結することを含む、方法に関する。このような方法は配列番号６０〜配列番号６９（好ましくは配列番号６５〜配列番号６９、より好ましくは配列番号６６）のうちの１つを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物と１つ又は複数の結合単位とを１つ又は複数のリンカーを介して連結することを含み得る。
別の特定の態様において、本発明は、配列番号７０〜配列番号７２（好ましくは配列番号７０〜配列番号７１、より好ましくは配列番号７０又は配列番号７１）を含むか、又はこれから本質的になる多価及び／又は多重特異性の化合物、構築物又はポリペプチドを調製するための配列番号６０〜配列番号６９（好ましくは配列番号６５〜配列番号６９、より好ましくは配列番号６６）のうちの１つを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物の使用に関する。本発明はさらに、配列番号７０〜配列番号７２（好ましくは配列番号７０〜配列番号７１、より好ましくは配列番号７０又は配列番号７１）を含むか、又はこれから本質的になる多価及び／又は多重特異性の化合物、構築物又はポリペプチドを調製する方法であって、配列番号６０〜配列番号６９（好ましくは配列番号６５〜配列番号６９、より好ましくは配列番号６６）のうちの１つを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物と配列番号９８を含むか、又はこれから本質的になるアミノ酸配列とを１つ又は複数のリンカーを介して連結することを含む、方法に関する。
多価及び／又は多重特異性のポリペプチドに使用するのに好適なスペーサー又はリンカーは当業者にとって明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結させるのに当該技術分野で使用する任意のリンカー又はスペーサーであってもよい。好ましくは、上記リンカー又はスペーサーは、医薬用途で意図されるタンパク質又はポリペプチドを構築する上での使用に好適である。
幾つかの特に好ましいスペーサーとしては、抗体断片又は抗体ドメインを連結させるのに当該技術分野で使用されるスペーサー及びリンカーが挙げられる。これらは、上記で引用した一般的な背景技術に記載したリンカーと共に、例えばダイアボディ又はＳｃＦｖ断片を構築するのに当該技術分野で使用するリンカーを含む（しかし、この点で、ダイアボディ及びＳｃＦｖ断片では、使用するリンカー配列が、関連するＶＨドメイン及びＶＬドメインが一体となって、完全な抗原結合部位を形成することができるような長さ、柔軟性の程度、及び他の性質を有している必要があるが、それぞれのアミノ酸配列又はナノボディは単独で完全な抗原結合部位を形成するため、本発明のポリペプチドに使用するリンカーの長さ又は柔軟性に関しては特に制限がないことに留意されたい）。
例えばリンカーは、好適なアミノ酸配列、具体的には１個〜５０個、好ましくは１個〜３０個、例えば１個〜２０個又は１個〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。このようなアミノ酸配列の幾つかの好ましい例としては、国際公開第９９／４２０７７号に記載の例えば（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３又は（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３等の例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、及び天然型重鎖抗体のヒンジ領域等のヒンジ様領域、又は（国際公開第９４／０４６７８号に記載のもののような）同様の配列が挙げられる。
幾つかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（例えばＡＡＡ）、並びに表Ｂ−８で言及されるリンカーであり、その中でもＡＡＡ、ＧＳ−７及びＧＳ−９が特に好ましい。
他の好適なリンカーは一般に、有機化合物又はポリマー、特に医薬用途のタンパク質に使用するのに好適な有機化合物又はポリマーを含む。例えばポリ（エチレングリコール）部分が、抗体ドメインを連結させるのに使用されており、例えば国際公開第０４／０８１０２６号を参照されたい。
使用するリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度及び／又は他の性質（重要ではないが、通常はＳｃＦｖ断片に使用されるリンカーの場合と同様である）は、ＩＬ−６受容体又は１つ又は複数の他の抗原に対する親和性、特異性又は結合活性を含むがこれらに限定されない、最終的な本発明のポリペプチドの性質に何らかの影響を及ぼし得る点が、本発明の範囲内に包含される。当業者であれば本明細書中での開示に基づき、任意で、限定された日常実験を幾つか実施した後に、本発明の特定のポリペプチドに使用するために最適なリンカー（複数可）を決定することができるであろう。
使用するリンカー（複数可）が、本発明のポリペプチドに、１つ又は複数の他の有利な性質又は機能性を付与し、及び／又は（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物及びポリペプチドの誘導体について本明細書中に記載の）誘導体の形成及び／又は官能基の結合のための１つ又は複数の部位をもたらすことも本発明の範囲内に包含される。例えば１つ又は複数の荷電アミノ酸残基を含有するリンカーは、親水性の改善をもたらすことができるのに対し、小エピトープ又はタグを形成するか又はこれらを含有するリンカーは、検出、同定及び／又は精製の目的で使用することができる。この場合でも、当業者であれば本明細書中での開示に基づき、任意で、限定された日常実験を幾つか実施した後に、本発明の特定のポリペプチドに使用するために最適なリンカーを決定することができるであろう。
最終的に、本発明のポリペプチドに２つ以上のリンカーを使用する場合、これらのリンカーは同一であっても異なっていてもよい。この場合でも、当業者であれば本明細書中での開示に基づき、任意で、限定された日常実験を幾つか実施した後に、本発明の特定のポリペプチドに使用するのに最適なリンカーを決定することができるであろう。
通常、発現及び産生を容易にするため、本発明のポリペプチドは直鎖ポリペプチドである。しかしながら、本発明は、最も広い意味ではこれに限定されない。例えば本発明のポリペプチドが３つ以上のアミノ酸配列又はナノボディを含む場合、「星型」の構築物を得るために、各「アーム」がアミノ酸配列又はナノボディに連結する３つ以上の「アーム」を有するリンカーを使用することによってこれらを連結させることが可能である。通常あまり好ましくないが、環状の構築物を使用することも可能である。
本発明は最も広い意味では本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの誘導体も含む。このような誘導体は概して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチド及び／又は本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを形成する１つ又は複数のアミノ酸残基の修飾、特に化学的及び／又は生物学的（例えば酵素的）修飾により得ることができる。
このような修飾の例、並びにこのような形（すなわち、タンパク質骨格、又は（but）好ましくは側鎖のいずれか）で修飾することができるアミノ酸配列、ナノボディ配列、化合物又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基の例、このような修飾の導入のために使用することができる方法及び技法、並びにこのような修飾の潜在的使用及び利点は当業者に明らかである。
例えばこのような修飾は、１つ又は複数の官能基、残基又は部分、特に１つ又は複数の所望の特性又は官能性を本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドに付与する１つ又は複数の官能基、残基又は部分を本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチド中に又は上に（例えば共有結合によるか、又は他の任意の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基の例は当業者に明らかである。
例えばこのような修飾は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの半減期、溶解性及び／又は吸収性を増大する、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの免疫原性及び／又は毒性を低減する、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの任意の望ましくない副作用を排除若しくは減衰する、及び／又は本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドに他の有益な特性を付与する、及び／又は本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの不要な特性を低減する、又は上記の２つ以上の任意の組合せである１つ又は複数の官能基を（例えば共有結合によるか、又は他の任意の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基及びこれらを導入する技法の例は当業者に明らかであり、概して、上記で引用される一般的な背景技術で述べた全ての官能基及び技法、並びに医薬用タンパク質の修飾、特に抗体又は抗体断片（ＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体を含む）の修飾に関するそれ自体が既知の官能基及び技法を含み得る。これに関しては例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（1980, 16thed., Mack Publishing Co., Easton, PA）を参照する。同様に当業者に明らかなように、このような官能基は、例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドに直接（例えば共有結合的に）連結し得るか、又は任意に適切なリンカー又はスペーサーを介して連結し得る。
医薬用タンパク質の半減期を増大する、及び／又はその免疫原性を低減するために最も広く使用される技法の１つは、適切な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）すなわちｍＰＥＧ）の結合を含む。概して、任意の適切な形のペグ化、例えば当該技術分野で抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖを含むが、これらに限定されない）に対して使用されるペグ化を使用することができる。例えばChapman（2002, Nat. Biotechnol., 54:531-545）、Veronese and Harris（2003, Adv. Drug Deliv. Rev.54:453-456）、Harris and Chess（2003,Nat. Rev. Drug. Discov., 2: 214-21）及び国際公開第０４／０６０９６５号を参照する。タンパク質のペグ化に関する多様な試薬も、例えばNektar Therapeutics, USAより市販されている。
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化を使用する（例えばYang et al.（2003, Protein Engineering, 16（10）：761-770）を参照されたい）。例えばそのために、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドにおいて自然発生するシステイン残基にＰＥＧを結合してもよく、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを、ＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を適切に導入するように修飾してもよく、又はＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端と融合してもよい（全て、それ自体が当業者に既知であるタンパク質工学の技法を使用する）。
好ましくは、ＰＥＧは、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドに対して５０００を超える（例えば１００００を超える）かつ２０００００未満（例えば１０００００未満）の分子量、例えば２００００〜８００００の範囲の分子量で使用する。
別の、通常あまり好ましくない修飾は、一般的に翻訳時及び／又は翻訳後の修飾の一部として、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応じてＮ結合型又はＯ結合型のグリコシル化を含む。
さらに別の修飾は、標識した本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの用途に応じて、１つ又は複数の検出可能な標識、又は他のシグナル生成基若しくはシグナル生成部分の導入を含んでいてもよい。それらを結合、使用及び検出するのに好適な標識及び技法は当業者にとって明らかであり、例としては、蛍光標識（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタアルデヒド、及びフルオレサミン、並びに１５２Ｅｕ等の蛍光金属、又はランタニド種からの他の金属）、リン光標識、化学発光標識又は生物発光標識（例えばルミナール、イソルミナール、セロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、及びジオキセタン又はＧＦＰ、並びにその類似体）、放射性同位体（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、及び７５Ｓｅ）、金属、金属キレート又は金属カチオン（例えば９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａ等の金属カチオン）、若しくはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕ診断及びイメージングに特に適した他の金属若しくは金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅ）、並びに、発色団及び酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な標識は当業者にとって明らかであり、例としては、ＮＭＲ分光法又はＥＳＲ分光法を用いて検出することができる部分が挙げられる。
本発明のこのような標識したアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドは、例えば特異的標識の選択に応じて、（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」等のそれ自体が既知のイムノアッセイを含む）ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕのアッセイに、並びにｉｎ ｖｉｖｏ診断及びイメージングの目的で使用され得る。
当業者にとって明らかであるように、別の修飾は、例えば上記の金属又は金属カチオンの１つをキレート化するキレート基（chelating group）の導入を含んでいてもよい。例えば好適なキレート官能基としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対等の特異的結合対の一部である官能基の導入を含んでいてもよい。このような官能基は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを別のタンパク質、ポリペプチド、又は結合対の残り半分と結合する化合物に連結させるのに（すなわち、結合対の形成を介して）使用され得る。例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドは、ビオチンと結合し、アビジン又はストレプトアビジンと結合する別のタンパク質、ポリペプチド、化合物又は担体に連結し得る。例えばこのような結合した本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドは、例えば検出可能なシグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに結合する診断系のレポーターとして使用され得る。このような結合対は、例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを、医薬目的に好適な担体を含む担体に結合させるのにも使用することができる。非限定的な一例は、Cao and Suresh（2000, Journal of DrugTargetting, 8 (4):257）によって記載のリポソーム製剤である。このような結合対はまた、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドに治療的に活性のある作用物質を連結させるのに使用することができる。
他の潜在的な化学修飾及び酵素修飾は当業者にとって明らかであろう。このような修飾を、（例えば機能−活性関係性を研究するために）調査目的で導入してもよい。例えばLundblad and Bradshaw（1997, Biotechnol.Appl. Biochem., 26:143-151）を参照する。
好ましくは、この誘導体は、本明細書中に規定されるような（本明細書中にさらに記載の（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定及び／又は表される）親和性で、ＩＬ−６受容体上で特異的エピトープと結合するようなものである。
特に本発明のこのような誘導体が、
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと結合する、及び／又は
１ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合する、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合する、及び／又は
１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合する、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと結合する、及び／又は
１０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと結合するようなものであるのが好ましい。
上述のように、本発明はまた、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドから本質的になるか又はこれを含む、タンパク質又はポリペプチドに関する。「から本質的になる」とは、本発明のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列のいずれもが、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドと厳密に同じであるか、又は１個〜２０個のアミノ酸残基、例えば１個〜１０個のアミノ酸残基、及び好ましくは１個〜６個のアミノ酸残基（例えば１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基）のような限定数のアミノ酸残基をアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドのアミノ末端、カルボキシ末端、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に付加させた本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドに対応することを意味する。
上記のアミノ酸残基は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、又はさもなければこれに影響を与えることもあり又は与えない場合もあり、アミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドにさらなる機能性を付加することもあり又は付加しない場合もある。例えばこのようなアミノ酸残基は、
ａ）例えば異種宿主細胞又は異種宿主生物において発現した結果得られるＮ末端Ｍｅｔ残基を含み得る。
ｂ）合成の際に宿主細胞からのアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドの分泌を導く、シグナル配列又はリーダー配列を形成してもよい。好適な分泌リーダーペプチドは当業者にとって明らかであり、本明細書中にさらに記載される通りであり得る。通常、このようなリーダー配列は、アミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドのＮ末端に連結されるが、本発明は最も広い意味では、これに限定されるものではない。
ｃ）アミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに指向性を有し、及び／又はそれらに浸透するか若しくは侵入することを可能にし、及び／又はアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に浸透するか若しくはそれらを横断することを可能にする、配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであろう。幾つかの非限定的な例は、国際公開第０３／０２６７００号、並びにTemsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 （2001）、Temsamani and Vidal, Drug Discov.Today, 9, 1012 （004）及びRousselle,J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 （2001）に記載されている小さいペプチドベクター（「Ｐｅｐ−ｔｒａｎｓベクター」）、並びにZhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 （2003）によって記載されている膜輸送体配列である。抗体断片の細胞内標的のためのＣ末端アミノ酸配列及びＮ末端アミノ酸配列は、例えばCardinale et al., Methods, 34, 171 （2004）によって記載されている。細胞内標的化の他の好適な技法は、以下に記述されるような、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチドを含むいわゆる「細胞内抗体」の発現及び／又は使用を伴う。
ｄ）「タグ」、例えばアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくはポリペプチドの精製を、例えばその配列又は残基を対象とする親和性技法を用いて可能にするか又は容易にする、アミノ酸配列又は残基を形成し得る。その後、（例えば化学的又は酵素学的な切断によって）上記の配列又は残基を除去して、アミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチド配列をもたらし得る（この目的のために、タグは任意で、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくはポリペプチドに連結されてもよく、又は切断可能なモチーフを含有していてもよい）。このような残基の好ましいが非限定的な幾つかの例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びAAAEQKLISEEDLNGAA（配列番号１００）等のｍｙｃタグである。
ｅ）官能基化した及び／又は官能基の結合部位として機能することができる１つ又は複数のアミノ酸残基であり得る。好適なアミノ酸残基及び官能基は当業者にとって明らかであり、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物又はポリペプチド配列の誘導体について本明細書中に記述されたアミノ酸残基及び官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸は、本明細書中のさらなる説明により当業者にとって明らかであるように、それ自体が既知の方法で調製することができる。例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の調製のためのそれ自体が既知の任意の方法で調製することができる。アミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及び核酸を調製するための、好ましいが非限定的な幾つかの方法としては、本明細書中に記載の方法及び技法が挙げられる。
当業者にとって明らかであるように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドの調製に特に有用な一方法は通常、
好適な宿主細胞又は宿主生物（本明細書中では「本発明の宿主」とも称される）において、又は上記の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸（本明細書中では「本発明の核酸」とも称される）に別の適切な発現系において、発現する工程と、場合によってはその後、
このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含む。
特に、このような方法は、
本発明の宿主が少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下で、上記の本発明の宿主を培養及び／又は維持する工程と、場合によってはその後、
このようにして得られる本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程とを含み得る。
したがって本発明は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド又は一価構築物をコードする核酸又はヌクレオチド配列（「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）にも関する。本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態を取ることができ、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態をとる。例えば本発明のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ（対象となる宿主細胞又は宿主生物内の発現に特異的に適合したコドン使用頻度を有するＤＮＡ等）であってもよい。
本発明の一実施形態によれば、本発明の核酸は、本明細書中に規定したように、本質的に単離形態である。本発明の核酸は、例えばプラスミド、コスミド又はＹＡＣ等のベクターの形態をとり、ベクターに存在し、及び／又はその一部であってもよく、これもまた本質的に単離形態であってもよい。
本発明の核酸は、本明細書中に記載の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及び／又はポリペプチドに関する情報に基づき、それ自体が既知の方法で調製されるか又は得ることができ、及び／又は好適な天然資源から単離することができる。また、当業者にとって明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、例えばアミノ酸配列又はナノボディをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び例えば１つ又は複数のリンカーをコードする核酸等の幾つかのヌクレオチド配列を好適な方法で共に連結することができる。
本発明の核酸を生成するための技法は当業者にとって明らかであり、例えば自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然型配列及び／又は合成型配列（又はこれらの２つ以上の部分）の組合せ、切断された発現産物を発現させる突然変異の導入、（例えば好適な制限酵素を用いて容易に消化及び／又はライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を生成するための）１つ又は複数の制限部位の導入、及び／又は１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応による突然変異の導入が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技法及び他の技法は当業者にとって明らかであり、同様に上記のSambrook et al.及びAusubel et al.の文献等の標準的なハンドブック、及び以下の実施例を参照する。
本発明の核酸はまた、当業者にとって明らかであるように、遺伝子構築物の形態をとり、遺伝子構築物に存在し、及び／又はその一部であってもよい。このような遺伝子構築物は一般に、例えば１つ又は複数の好適な調節要素（好適なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）等）、及び本明細書中に述べられている遺伝子構築物のさらなる要素等といった、それ自体が既知の遺伝子構築物の１つ又は複数の要素に、場合によっては連結する少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書中において「本発明の遺伝子構築物」とも称される。
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、対象となる宿主細胞又は宿主生物の形質転換に好適な形態、対象となる宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに好適な形態、又は目的とする宿主生物における独立した複製、維持及び／又は遺伝に好適な形態をとり得る。例えば本発明の遺伝子構築物は、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態をとることができる。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば好適な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系）での発現を提供し得るベクターであってもよい。
好ましいが非限定的な一実施形態では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）ｂ）と作用可能に結合している少なくとも１つの本発明の核酸と、
ｂ）プロモーター、及び場合によっては好適なターミネーター等の１つ又は複数の調節要素と、場合によってはさらに
ｃ）それ自体が既知の遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、用語「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に結合した」は、当該技術分野における（本明細書中に詳述するような）通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば３’−又は５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に好適なこれら及び他の要素は当業者にとって明らかであり、例えば使用する構築物の種類、対象となる宿主細胞又は宿主生物、対象の本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法（例えば構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの）、及び／又は使用する形質転換法に応じて決定することができる。例えば抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知の調節配列、プロモーター、及びターミネーターを、本質的に類似の方法で使用してもよい。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、上記少なくとも１つの本発明の核酸、及び上記調節要素、及び場合によっては上記１つ又は複数のさらなる要素は、互いに「作用可能に連結」しており、これは通常、これらが互いに機能的な関係にあることを意味する。例えばプロモーターが、コーディング配列の転写及び／又は発現を、開始又は他の方法により制御／調節することができる場合（ここで、上記コーディング配列は、上記プロモーター「の制御下である」ものとする）、コーディング配列に「作用可能に連結」していると考えられる。一般に、２つのヌクレオチド配列が作用可能に連結している場合、これらは同一の配向を有し、通常同一リーディングフレーム内にある。通常、それらは本質的に連続しているが、これは必ず要求されるものではない。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の調節要素及びさらなる要素は、対象となる宿主細胞又は宿主生物において対象となる生物学的機能を付与することができるほどのものである。
例えばプロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、対象となる宿主細胞又は宿主生物において「作用可能」でなければならず、このことは（例えば）、上記プロモーターが、（上記で規定したように）作用可能に連結したヌクレオチド配列（例えばコーディング配列）の転写及び／又は発現を、開始、又は他の方法により制御／調節することができるものであることを意味する。
特に好ましい幾つかのプロモーターとしては、本明細書中に述べた宿主細胞における発現のためのそれ自体が既知のプロモーター、特に本明細書中に述べたもの及び／又は実施例において使用されるもののような細菌細胞における発現のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
選択マーカーは、（すなわち、適切な選択条件下で）本発明のヌクレオチド配列による形質転換が（首尾良く）起こった宿主細胞及び／又は宿主生物を、形質転換が（首尾良く）起こらなかった宿主細胞及び／又は宿主生物と区別することができるようなものでなければならない。このようなマーカーの幾つかの好ましいが非限定的な例は、抗生物質（例えばカナマイシン又はアンピシリン）に対する耐性を付与する遺伝子、温度耐性を付与する遺伝子、又は形質転換されていない細胞若しくは生物が生存する上で不可欠な、培地中の或る種の因子、化合物及び／又は（食品）成分がない状態で宿主細胞若しくは宿主生物を維持させる遺伝子である。
リーダー配列は、（対象となる宿主細胞又は宿主生物において）所望の翻訳後修飾を可能にし、及び／又は転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分又はオルガネラに配向させるような配列であるものとする。またリーダー配列は、上記細胞から発現生成物を分泌させてもよい。そのようなものとして、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物中で作用可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であってもよい。リーダー配列は、細菌細胞中での発現に必要とされない。例えば抗体及び抗体断片（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知であるリーダー配列を、本質的に類似の方法で使用することができる。
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、（宿主細胞又は宿主生物中で）遺伝子構築物（に存在する遺伝子又はヌクレオチド配列）の発現を検出できるようなものでなければならない。発現マーカーは、場合によっては、発現産物を、例えば細胞の特定の部分又はオルガネラ、及び／又は多細胞生物の特定の細胞（複数可）、組織（複数可）、器官（複数可）、又は部分（複数可）に局在化させてもよい。このようなレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドとのタンパク質融合として発現されてもよい。幾つかの好ましいが非限定的な例としては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質が挙げられる。
好適なプロモーター、ターミネーター、及びさらなる要素の幾つかの好ましいが非限定的な例としては、本明細書中に言及した宿主細胞における発現に使用することができるもの、及び具体的には本明細書中に言及されたもの、及び／又は下記の実施例で用いられているもののような細菌細胞における発現に好適であるものが挙げられる。ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、及び／又は組込み因子等の、本発明の遺伝子構築物中に存在／使用し得るプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー及びさらなる要素についての幾つかの（さらなる）非限定的な例については、上記のSambrook et al.、及びAusubel et al.の文献による概説ハンドブック、並びに国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９６／２３８１０号、国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９５／２１１９１号、国際公開第９７／１１０９４号、国際公開第９７／４２３２０号、国際公開第９８／０６７３７号、国際公開第９８／２１３５５号、米国特許第７，２０７，４１０号、米国特許第５，６９３，４９２号、及び欧州特許第１０８５０８９号に示された例を参照する。他の例は当業者にとって明らかであろう。上記で引用された一般的な背景技術に関する参考文献及び本明細書中に引用したさらなる参考文献も参照する。
本発明の遺伝子構築物は、通常例えば上記のSambrook et al.、及びAusubel et al.の文献による概説ハンドブックに記載の技法を用いて、本発明のヌクレオチド配列（複数可）を、１つ又は複数の上記さらなる要素と適切に連結させることにより得ることができる。
多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体が既知の好適な（発現）ベクターに挿入することによって得られる。好適な発現ベクターの幾つかの好ましいが非限定的な例は、以下の実施例において使用されるもの、及び本明細書中に言及されたものである。
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞又は宿主生物を形質転換させるため、すなわち本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現及び／又は産生させるために使用することができる。好適な宿主又は宿主細胞は当業者にとって明らかであり、例えば任意の好適な真菌、原核、又は真核の細胞若しくは細胞株又は任意の好適な真菌、原核、又は真核生物、例えば：
細菌株（大腸菌の株、ミラビリス変形菌等のプロテウス属の株、蛍光菌等のシュードモナス属の株等のグラム陰性株；及び枯草菌又はブレビス菌等のバチルス属の株、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトミセス属の株、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）等のブドウ球菌の株、及び乳酸連鎖球菌等のラクトコッカス属の株等のグラム陽性株が挙げられるがこれらに限定されない）、
真菌細胞（トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）等のトリコデルマ属、アカパンカビ等のニューロスポラ属、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）等のソルダリア属、アスペルギルス・ニガー（Aspergillusniger）又はショウユコウジカビ等のアスペルギルス属、又は他の糸状菌由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない）、
酵母細胞（出芽酵母等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又はピキア・メタノリカ（Pichiamethanolica）等のピキア属、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンセヌラ属、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）等のクルイベロミセス属、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）等のアークスラ属、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowialipolytica）等のヤロウィア属由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない）、
アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞又は細胞株、
昆虫に由来する細胞又は細胞株、例えばシロイチモンジヨトウＳＦ９及びＳｆ２１細胞を含むがこれらに限定されない鱗翅目に由来する細胞／細胞株、又はシュナイダー細胞及びＫｃ細胞等のショウジョウバエに由来する細胞／細胞株、
植物又は植物細胞、例えばタバコ植物、及び／又は
哺乳類細胞又は細胞株、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞（例えばＢＨＫ−２１細胞）、並びにＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えばＣＯＳ−７細胞）、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞等のヒト細胞又は細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、ヒトに由来する細胞又は細胞株、哺乳動物に由来する細胞又は細胞株、並びに
抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるがこれらに限定されない）の発現及び産生に関してそれ自体が既知の他の全ての宿主又は宿主細胞であってもよく、これらは当業者に明らかであろう。上記で引用した一般的な背景技術に関する文献、及び例えば国際公開第９４／２９４５７号、国際公開第９６／３４１０３号、国際公開第９９／４２０７７号、Frenken et al.（1998, Res. Immunol. 149（6）: 589-99）、Riechmannand Muyldermans （1999, J. Immunol. Methods, 231（1-2）: 25-38）、van derLinden （2000, J. Biotechnol. 80（3）: 261-70）、Joostenet al.（2003, Microb. Cell Fact. 2（1）: 1）、Joosten et al.（2005, Appl. Microbiol. Biotechnol. 66（4）: 384-92）及び本明細書中に引用したさらなる文献を参照する。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、例えば予防目的及び／又は治療目的（遺伝子治療等）のために、多細胞生物の１つ又は複数の細胞、組織又は器官に導入し、発現させることもできる。このために、本発明のヌクレオチド配列を、例えばこのように（例えばリポソームを用いて）、又は好適な（例えばアデノウイルス等のレトロウイルス、アデノ随伴ウイルス等のパルボウイルスに由来する）遺伝子治療用ベクターに挿入後、任意の好適な方法を用いて細胞又は組織に導入することができる。当業者にとって明らかであるように、このような遺伝子治療は、本発明の核酸又は本発明の核酸をコードする好適な遺伝子治療用ベクターを、患者又は患者の特定の細胞又は特定の組織若しくは器官に投与することにより患者の体内において、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｓｉｔｕで行うことができ、又は好適な（多くの場合、外植リンパ球、骨髄吸引物又は組織生検試料等の、治療対象となる患者の身体より採取された）細胞は、本発明のヌクレオチド配列を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで処理した後、患者の体内に好適に（再）導入することができる。これらは全て、例えばCulver, K. W.（1994, "Gene Therapy",p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y）、Giordano（1996, Nature F Medicine 2: 534-539）、Schaper（1996, Circ. Res. 79: 911-919）、Anderson（1992, Science 256: 808-813）、Verma（1994, Nature 389: 239）、Isner（1996, Lancet 348: 370-374）、Muhlhauser（1995, Circ. Res. 77: 1077-1086）、Onodera（1998, Blood 91: 30-36）、Verma（1998, Gene Ther. 5: 692-699）、Nabel（1997, Ann. N.Y. Acad. Sci., 811: 289-292）、Verzeletti（1998, Hum. Gene Ther. 9: 2243-51）、Wang（1996, Nature Medicine 2: 714-716）、国際公開第９４／２９４６９号、国際公開第９７／００９５７号、米国特許第５，５８０，８５９号、又はSchaper（1996, Current Opinion inBiotechnology 7: 635-640）に記載の当業者に既知の遺伝子治療用ベクター、技法、及び送達システムを用いて行うことができる。例えばＳｃＦｖ断片（Afanasieva et al.（2003, Gene Ther., 10: 1850-1859））及びダイアボディ（Blanco et al., 2003, J. Immunol., 171: 1070-1077）のｉｎ ｓｉｔｕ発現は当該技術分野に記述されている。
細胞中でのアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの発現のために、これらは、例えば国際公開第９４／０２６１０号、国際公開第９５／２２６１８号、米国特許第７，００４，９４０号、国際公開第０３／０１４９６０号、Cattaneo A. and Biocca S. （1997,Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes andSpringer-Verlag）、及びKontermann（2004,Methods 34: 163-170）に記載の、いわゆる「細胞内抗体」として発現させることもできる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、例えばウサギ、ウシ、ヤギ又はヒツジの母乳等のトランスジェニック哺乳動物の母乳中（トランス遺伝子を哺乳動物に導入する一般的な技法については、例えば米国特許第６，７４１，９５７号、米国特許第６，３０４，４８９号、及び米国特許第６，８４９，９９２号を参照されたい）、植物、又は葉、花、果実、種、根、塊茎を含むがこれらに限定されない植物の一部中（例えばタバコ、トウモロコシ、大豆、又はアルファルファ）、又は、例えばカイコガの蛹中で産生することもできる。
さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、細胞を含まない発現系で発現及び／又は産生してもよく、このような系の好適な例は当業者にとって明らかであろう。幾つかの好ましいが非限定的な例としては、小麦麦芽系、ウサギ網状赤血球溶解物、又はZubayの方法による大腸菌を用いた系での発現が挙げられる。
上記のように、ナノボディを使用する利点の１つは、それに基づくポリペプチドを、好適な細菌系における発現によって調製することができる点であり、及び好適な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、調節要素等は、例えば上述した参考文献によって当業者にとって明らかであろう。しかしながら、本発明は、最も広い意味では細菌系における発現に限定されないことに留意されたい。
好ましくは、本発明では、本発明のポリペプチドを医薬用途に適した形態で提供する細菌発現系等の（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現系を使用するが、このような発現系も当業者にとって明らかであろう。当業者にとって明らかであるように、医薬用途に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法を用いて調製することもできる。
工業規模の製造において、ナノボディ又はナノボディを含有するタンパク質治療剤の（工業的）製造のために好ましい異種宿主としては、大規模の発現／産生／培養、特に大規模の医薬用途での発現／産生／培養に適した大腸菌、ピキア・パストリス、出芽酵母の株が挙げられる。このような株の好適な例は当業者とって明らかであろう。このような株及び産生／発現系は、Biovitrum（Uppsala, Sweden）等の企業から入手可能である。
代替的に、哺乳動物細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模の発現／産生／培養、特に大規模の医薬用途での発現／産生／培養のために用いることができる。このような発現／産生系も、上記企業の幾つかから入手可能である。
特定の発現系の選択は、或る特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化の必要条件に一部依存している。グリコシル化が望ましいか又は必要とされるナノボディを含有する組換えタンパク質の産生には、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物の発現用宿主の使用が必要である。これに関連して、得られるグリコシル化パターン（すなわち、結合する残基の種類、数及び位置）が、発現に用いられる細胞又は細胞株に依存することは、当業者にとって明らかであろう。好ましくは、ヒト（すなわち、本質的にヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を与える）細胞若しくは細胞株、又は、本質的に及び／又は機能的にヒトのグリコシル化と同一であるか、又は少なくともヒトのグリコシル化を模倣したグリコシル化パターンを与えることができる別の哺乳動物の細胞株が用いられる。一般に、大腸菌等の原核生物の宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を有しておらず、酵母等の下等真核細胞を使用すると、通常、ヒトのグリコシル化と異なるグリコシル化パターンがもたらされる。それにもかかわらず、上記宿主細胞及び発現系の全てを、得ようとする所望のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに応じて、本発明に用いることができることを理解されたい。
したがって、本発明の非限定的な一実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化されている。本発明の別の非限定的な実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化されていない。
本発明の好ましいが非限定的な一実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細菌細胞、具体的には大規模の医薬品製造に適した細菌細胞、例えば上記の株の細胞で産生する。
本発明の別の好ましいが非限定的な実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、酵母細胞、具体的には大規模の医薬品製造に適した酵母細胞、例えば上記の種の細胞で産生する。
本発明のさらに別の好ましいが非限定的な実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、哺乳動物細胞で、具体的にはヒト細胞又はヒト細胞株の細胞で、さらに具体的には大規模の医薬品製造に適したヒト細胞又はヒト細胞株、例えば上記の細胞株の細胞で産生する。
宿主細胞中での発現が、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの製造に用いられる場合、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、細胞内（例えば細胞質中、ペリプラズム中、又は封入体中）で産生し、次いで宿主細胞から単離し、場合によってはさらに精製してもよく、又は細胞外（例えば宿主細胞を培養する培地中）で産生し、次いで培地から単離し、場合によってはさらに精製してもよい。真核宿主細胞を使用する場合、得られるアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド及びタンパク質のさらなる単離及び下流工程での処理が大幅に容易になるため、通常、細胞外で産生されることが好ましい。通常、上記で言及された大腸菌の株等の細菌細胞は、毒素及び血液毒等の数種のタンパク質を除き、タンパク質を細胞外に分泌せず、大腸菌において分泌物を産生することは、内膜を通してペリプラズム空間へタンパク質を移行させることを意味する。ペリプラズムでの産生は、細胞質での産生に対して幾つかの利点がある。例えば分泌産物のＮ末端のアミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後の天然遺伝子産物と同一であってもよい。また、ペリプラズム中では、細胞質中よりもプロテアーゼ活性がはるかに低いと思われる。さらに、ペリプラズム中では、混入するタンパク質が少ないため、タンパク質の精製がより容易である。別の利点は、ペリプラズムが細胞質よりも酸化的な環境をもたらすため、正しい位置にジスルフィド結合が形成される可能性があるという点である。大腸菌中で過剰発現されたタンパク質は、封入体と呼ばれる不溶性の凝集物中に見られることが多い。これらの封入体は、細胞質中にも又はペリプラズム中にも存在させることができ、これらの封入体からの生物学的に活性のあるタンパク質の回収は、変性／リフォールディングプロセスを必要とする。治療用タンパク質を含む多くの組換えタンパク質は封入体から回収される。代替的には、当業者に明らかであるように、所望のタンパク質、特に本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを分泌するように遺伝的に修飾された細菌の組換え株を用いることができる。
したがって、本発明の非限定的な一実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞内で産生され、宿主細胞から、特に細菌細胞又は細菌細胞中の封入体から単離したアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。本発明の非限定的な別の実施形態によれば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、細胞外で産生され、宿主細胞を培養する培地から単離されたアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドである。
これらの宿主細胞と共に用いる好ましいが非限定的な幾つかのプロモーターとしては、
大腸菌における発現のための、ｌａｃプロモーター（及びｌａｃＵＶ５プロモーター等のこれらの誘導体）、アラビノースプロモーター、λファージの左側（ＰＬ）及び右側（ＰＲ）プロモーター、ｔｒｐオペロンのプロモーター、ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）、Ｔ７−プロモーター（より具体的にはＴ７−ファージ遺伝子１０のプロモーター）、及び他のＴ−ファージプロモーター、Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター、外来制御オペレーター配列の１つ又は複数を含む上記プロモーターの組換え変異体；
出芽酵母における発現のための、ＡＤＨ１（アルコール脱水素酵素１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（チトクロームｃ ｉｓｏ−１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）の構成的プロモーター；ＧＡＬ１，１０，７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコール脱水素酵素２）、ＰＨＯ５（酸ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）の制御的プロモーター、ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）の外来プロモーター；
ピキア・パストリスにおける発現のための、ＡＯＸ１プロモーター（アルコール酸化酵素Ｉ）；
哺乳動物細胞における発現のための、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、プロモーターがＴｅｔリプレッサーによって制御可能なように２個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター変異体、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＲＳＶ ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター、ヒト、チンパンジー、マウス、又はラット由来の伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＨＩＶ−１の長末端反復配列プロモーター、βアクチンプロモーターが挙げられる。
これらの宿主細胞と共に用いる好ましいが非限定的な幾つかのベクターとしては、
哺乳動物細胞における発現のためのベクター：ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）、並びにアデノウイルスに基づくもの等のウイルスに基づく発現系；
細菌細胞における発現のためのベクター：ｐＥＴベクター（Novagen）及びｐＱＥベクター（Qiagen）；
酵母又は別の真菌細胞における発現のためのベクター：ｐＹＥＳ２（Invitrogen）及びピキア発現ベクター（Invitrogen）；
昆虫細胞における発現のためのベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター；
植物又は植物細胞における発現のためのベクター：例えばカリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス、アグロバクテリウムの好適な株に基づくベクター、又はＴｉ−プラスミドベースのベクターが挙げられる。
これらの宿主細胞と共に用いる好ましいが非限定的な幾つかの分泌配列としては、
大腸菌等の細菌細胞における使用のため、ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢ等；ＴＡＴシグナルペプチド、ヘモリシンＣ−末端分泌シグナル；
酵母における使用のため、α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）等；
哺乳動物細胞における使用のため、標的タンパク質が真核細胞起源である場合には、固有シグナル、マウスＩｇκ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド等が挙げられる。
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するのに好適な技法は、当業者にとって明らかであり、対象となる宿主細胞／宿主生物及び使用する遺伝子構築物に依存することもある。同様に、上記ハンドブック及び特許出願を参照する。
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物によってうまく形質転換された宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択する工程を実行することができる。この工程は、例えば本発明の遺伝子構築物に存在する選択可能なマーカーに基づいて選択する工程、又は、例えば特異的抗体を使用する本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程であってもよい。
形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態を取ることができる）又は宿主生物（安定な突然変異細胞系又は株の形態を取ることができる）は、本発明のさらなる態様をなす。
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、（宿主生物の場合には、その少なくとも１つの細胞、部分、組織又は器官において）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを発現し、又は（少なくとも）（例えば好適な条件下で）発現することができるようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代及び／又は子孫を含んでおり、それらは、例えば細胞分裂又は有性若しくは無性生殖により得られるものであってよい。
本発明のアミノ酸配列を発現させ／その発現を得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物は一般に、（所望の）本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドが発現／産生されるような条件下で保持、維持及び／又は培養される。好適な条件は当業者にとって明らかであり、通常、使用する宿主細胞／宿主生物、及び（関連する）本発明のヌクレオチド配列の発現を制御する制御因子に依存する。この場合にも、本発明の遺伝子構築物に関する上記の段落に言及したハンドブック及び特許出願を参照する。
概して、好適な条件には、好適な培地の使用、好適な食餌及び／又は好適な栄養源の存在、好適な温度の使用、及び場合によっては好適な誘導因子又は化合物の存在（例えば本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターにより制御下にある場合）が含まれ、これらは全て当業者が選択することができる。この場合にも、このような条件下で、本発明のアミノ酸配列は、連続的、一時的、又は適切に誘導された場合にのみ発現することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、（まず）未成熟型（上記）で産生され、次いで、使用する宿主細胞／宿主生物に応じて翻訳後修飾されてもよいことも、当業者にとって明らかであろう。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、この場合にも、使用する宿主細胞／宿主生物に応じてグリコシル化されてもよい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドは、次いで、宿主細胞／宿主生物から、及び／又は上記宿主細胞若しくは宿主生物を培養した培地から、（分取）クロマトグラフィ法、及び／又は電気泳動法、分別沈殿法、アフィニティー法（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドに融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を用いる）、及び／又は分取免疫法（すなわち単離対象のアミノ酸配列に対する抗体を用いる）等の、それ自体が既知のタンパク質の単離技法及び／又は精製技法を用いて単離することができる。
概して、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤及び／又はアジュバントとを含み、場合によっては１つ又は複数のさらなる薬理学的に活性のあるポリペプチド及び／又は化合物を含む薬学的調製物又は薬学的組成物として製剤化することができる。非限定的な例により、このような製剤は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋内若しくは皮下注射、又は静脈内点滴等による）のため、局所投与のため、吸入、経皮パッチ、インプラント、坐剤等による投与のために適した形態を取ることができる。このような好適な投与形態は、投与の方法、及びその調製物で用いるための方法及び担体に応じて、固体、半固体又は液体であってよく、当業者にとって明らかであり、本明細書でさらに記述する。
したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、少なくとも１つの本発明のナノボディ又は少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの好適な（すなわち医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤と、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質とを含有する薬学的組成物に関する。特定の態様では、本発明は配列番号７０と、少なくとも１つの好適な（すなわち医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤と、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質とを含有する薬学的組成物に関する。別の特定の態様では、本発明は配列番号７１と、少なくとも１つの好適な（すなわち医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤と、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質とを含有する薬学的組成物に関する。
概して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、それ自体が既知の任意の好適な方法により製剤化及び投与することができ、これらについては、例えば上記で引用した一般的な背景技術（特に、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０４１８６５号及び国際公開第０４／０４１８６７号）、及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., MackPublishing Company, USA （1990）、又はRemington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition,Lippincott Williams and Wilkins （2005）等の文献の標準的なハンドブックを参照する。
例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、従来の抗体及び抗体断片（ＳｃＦｖ及びダイアボディを含む）及び他の薬学的に活性のあるタンパク質のための、それ自体が既知の任意の方法で製剤化及び投与することができる。このような製剤及びそれを調製する方法は当業者にとって明らかであり、例えば非経口（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋内、管腔内、動脈内又は髄腔内投与）又は局所（経皮又は皮内）投与に好適な調製物が挙げられる。
非経口投与のための調製物は、例えば点滴又は注射に好適な滅菌液剤、懸濁剤、分散剤又は乳化剤であってもよい。このような調製物に好適な担体又は希釈剤としては、例えばこれらに限定するものではないが、滅菌水及び緩衝水溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液等の溶液、水性油、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール等のグリコール、又は鉱物油、動物油、及び植物油、例えば落花生油、大豆油、並びに好適なこれらの混合物が挙げられる。通常、水溶液剤又は懸濁剤が好ましい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、遺伝子治療の送達方法を使用して投与することもできる。例えば米国特許第５，３９９，３４６号（その全体が参照により援用される）を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドをコードする遺伝子によりトランスフェクトされた初代細胞を、特定の器官、組織、移植片、腫瘍又は細胞を標的とするための組織特異的プロモーターによりさらにトランスフェクトすることができ、細胞内に局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列によりさらにトランスフェクトすることもできる。
このように、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、不活性希釈剤又は吸収可能な食用の担体等の薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、例えば経口的に全身投与することができる。それらを、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤として打錠してもよく、又は患者の食事中の食品に直接加えてもよい。経口治療用の投与のために、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドを含有していなければならない。組成物及び調製物中のそれらの割合は、当然ながら変えることができ、便宜上所定の単位投薬形態の重量の約２％〜約６０％であり得る。このような治療上有用な組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドの量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、トラガカントガム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン等の結着剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテーム等の甘味料を含有していてもよく、又はペパーミント、冬緑油、チェリー香料等の香料を加えてもよい。単位投薬形態がカプセル剤である場合、上記のような種類の物質以外に、植物油又はポリエチレングリコール等の液体担体を含有していてもよい。種々の他の物質が、コーティングとして、又は固体の単位投薬形態の物理的形態を他の方法により変化させるために存在していてもよい。例えば錠剤、丸剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラック又は砂糖等でコーティングされていてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチド、甘味料としてのスクロース又はフルクトース、保存料としてのメチルパラベン又はプロピルパラベン、色素、及びチェリー又はオレンジ香料等の香料を含有していてもよい。当然ながら、任意の単位投薬形態の調製に使用される全ての物質は、薬学的に許容され、使用する量において実質的に無毒でなければならない。さらに、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、徐放調製物及び装置中に封入されていてもよい。
経口投与のための調製物及び製剤にはまた、本発明の構築物が胃内環境に耐性を有しかつ腸内に入ることを可能にする腸溶コーティングが付与される。より包括的には、経口投与のための調製物及び製剤は、消化管のいずれかの所望部分に送達するのに好適に製剤化され得る。また、好適な坐剤を消化管への送達に使用してもよい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドはまた、点滴又は注射によって静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの溶液、又はそれらの塩は、水中で調製することがき、任意で無毒性界面活性剤と混合することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存料を含有している。
注射又は点滴に好適な薬剤投薬形態としては、滅菌注射又は滅菌点滴可能な溶液又は分散液の即時調製に適合し、場合によってはリポソームに封入された活性成分を含む、滅菌の水溶液若しくは分散液又は滅菌粉末が挙げられ得る。全ての場合において、最終的な投薬形態は、滅菌されており、流体であり、製造及び保存条件下で安定でなければならない。液体の担体又はビヒクルは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体の分散媒であってもよい。例えばリポソームの形成により、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤により微生物の作用を妨害することができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖類、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。組成物において、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収をもたらすことができる。
滅菌注射可能な溶液は、所望の量の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを、上記に列挙した種々の他の成分を含む適切な溶媒中に組み込んだ後、必要に応じて、滅菌濾過することにより調製される。滅菌注射可能な溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥法及び凍結乾燥法であり、活性成分の粉末、及び予め滅菌濾過された溶液中に存在する任意のさらなる望ましい成分が得られる。
局所投与のためには、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドが液体の場合には、純粋な形態で適用することができる。しかし、一般に、それらは、固体であっても液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と共に、組成物又は製剤として皮膚に投与されることが望ましい。
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉砕された固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、ヒドロキシアルキル若しくはグリコール又は水−アルコール／グリコール混合物が挙げられ、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドは、場合によっては非毒性の界面活性剤の作用により、有効な濃度で溶解又は分散することができる。所定用途のための性質を最適化するために、芳香剤及びさらなる抗菌剤等のアジュバントを加えてもよい。得られる液体組成物は、絆創膏及び他の包帯に薬剤を含浸させるのに用いられる吸収パッドによって適用することができ、又はポンプ型若しくはエアロゾルスプレーを使用して患部の上に噴霧することができる。
使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏及び石鹸等を形成するために、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース又は修飾無機物質等の増粘剤を液体担体と共に使用することができる。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドを皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科用組成物の例は当該技術分野で既知であり、例えばJacquet et al.（米国特許第４，６０８，３９２号）、Geria（米国特許第４，９９２，４７８号）、Smith et al.（米国特許第４，５５９，１５７号）及びWortzman（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの有用な投与量は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、及び動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における有効投与量をヒトに外挿するための方法は当該技術分野で既知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
概して、ローション等の液体組成物中の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの濃度は、約０．１重量％〜２５重量％、好ましくは、約０．５重量％〜１０重量％である。ゲル又は粉末等の半固形又は固形組成物中の濃度は、約０．１重量％〜５重量％、好ましくは約０．５重量％〜２．５重量％である。
治療における使用に必要な本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの量は、選択される特定のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドだけでなく、投与経路、治療する症状の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変動し、最終的には担当する医師又は臨床医の判断に委ねられる。また、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ及びポリペプチドの投与量は、標的となる細胞、腫瘍、組織、移植片又は器官によっても変動する。
望ましい用量は便宜上、単回用量で、又は例えば１日２回、３回、４回以上の部分用量として、適切な間隔での分割用量で示され得る。部分用量自体を、例えば吸入器からの複数回の吸入又は複数滴の点眼投与のように個別で、大まかな間隔の数多くの投与にさらに分割してもよい。投与計画には、長期間の１日処置が含まれ得る。「長期間」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、又は数年の期間を意味する。この投与量範囲における必要な改変は、本明細書中で教示される日常実験のみを使用して当業者によって決定され得る。Remington's Pharmaceutical Sciences （Martin,E. W., ed. 4）, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。投与量は、何らかの合併症が発症した場合には、個々の医師が調整することもできる。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−６Ｒに関連する疾患及び／又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験体に薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
本発明の内容において、「予防及び／又は治療」という用語とは、疾患を予防及び／又は治療することを含むだけでなく、概して、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅延又は退行させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状の発症を予防又は遅延させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状を低減及び／又は軽減すること、疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重症度及び／又は期間を低減すること、及び／又は疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重症度のさらなる増大を予防すること、疾患によって生じるあらゆる生理学的損傷を予防、低減又は退行させること、及び概して治療対象の患者に有益なあらゆる薬理作用も含む。
治療対象の被験体とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療対象の被験体は、特に本明細書中に言及される疾患及び障害を患っているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
本発明は、ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、その生物活性若しくは薬理活性に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達に関連がある少なくとも１つの疾患及び／又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験体に薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。特に、本発明は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、その生物活性若しくは薬理活性、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患及び／又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験体に薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、ポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。特に、上記の薬学的に活性のある量とは、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、その生物活性若しくは薬理活性、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する生物学的経路又はシグナル伝達を調節するのに十分な量である。
本発明は、本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ又は本発明のポリペプチドを患者に投与することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患及び／又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験体に薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法にも関する。
より具体的には、本発明は、本明細書中に列挙される疾患及び障害からなる群から選択される少なくとも１つの疾患及び／又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験体に薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
特に本発明は、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。様々な形態のがんは、多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂリンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺がんからなる群から選択され得る。炎症性疾患は、関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息及び自己免疫インスリン依存性糖尿病からなる群から選択され得る。
別の特定の態様において、本発明は、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の配列番号７０、及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。別の特定の態様では、本発明は、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の配列番号７１、及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。様々な形態のがんは、多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂリンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺がんからなる群から選択され得る。炎症性疾患は、関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息及び自己免疫インスリン依存性糖尿病からなる群から選択され得る。
別の態様では、本発明は、免疫療法、特に受動免疫療法に関する方法であって、本明細書中に記載の疾患及び障害を患っているか又はそれらの危険性のある被験体に、薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、本発明の化合物、本発明の構築物及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
上記の方法において、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び／又は構築物、及び／又はこれを含む組成物は、使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて任意の好適な方法で投与することができる。したがって、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び／又は構築物、及び／又はこれを含む組成物は、例えばこの場合にも使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて経口的、腹腔内（例えば静脈内、皮下、筋内、又は消化管を回避した任意の他の投与経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所的に、坐剤を用いて、吸入によって投与することができる。臨床医は、予防又は治療すべき疾患及び／又は障害、及び臨床医に既知の他の因子に応じて、好適な投与経路、及びこのような投与に使用される好適な薬学的製剤又は薬学的組成物を選択することができるであろう。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び／又は構築物及び／又はこれを含む組成物は、予防又は治療対象の疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療に好適な治療計画に従って投与される。臨床医は一般的に、予防又は治療対象の疾患又は障害、治療対象の疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用される本発明の特定のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物、特定の投与経路、及び使用される薬学的製剤又は薬学的組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、並びに臨床医に既知の同様の因子に応じて、好適な治療計画を決定することができるであろう。
概して、治療計画には、１つ又は複数の薬学的に活性のある量又は用量における１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び／又は構築物、又はこれを含む１つ又は複数の組成物の投与が含まれるであろう。投与される具体的な量（複数可）又は用量はこの場合でも上記の因子に基づき臨床医によって決定することができる。
概して、本明細書中に言及された疾患及び障害の予防及び／又は治療に関して、また治療対象の特定の疾患又は障害、使用される本発明の特定のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び構築物の効力、特定の投与経路、及び使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び構築物は概して、１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．０１μｇ／ｋｇ（体重）／日、好ましくは、０．１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．１μｇ／ｋｇ（体重）／日、例えば約１μｇ／ｋｇ（体重）／日、１０μｇ／ｋｇ（体重）／日、１００μｇ／ｋｇ（体重）／日又は１０００μｇ／ｋｇ（体重）／日の量で、連続して（例えば点滴によって）、日々の単回用量として、又は１日の中の複数回の分割用量として投与されるであろう。臨床医は一般的に、本明細書中で言及される因子に応じて好適な日用量を決定することができるであろう。特定の場合には、例えば上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づきこれらの量から外れるように臨床医が選択することもあることが明らかであろう。一般的に、親和性／結合活性、有効性、体内分布、半減期及び当業者に既知の同様の因子の差異は考慮するものの、本質的に同様の経路を介して投与される、同様の標的に対する比較可能な従来の抗体又は抗体断片に関して通常投与される量から、投与量に関する指針を幾らか得ることができる。
通常上記の方法では、本発明の単一のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物を使用するであろう。しかしながら、２つ以上の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び／又は構築物を組み合わせて使用することも本発明の範囲内である。
本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び構築物は、１つ又は複数のさらなる薬学的に活性のある化合物又は成分と組み合わせて、すなわち複合治療計画（相乗効果をもたらすことも又はもたらさないこともある）として使用することもできる。この場合でも、臨床医は、上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づき、このようなさらなる化合物又は成分、並びに好適な複合治療計画を選択することができるであろう。
特に、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物及び構築物は、本明細書中に記載の疾患及び障害の予防及び／又は治療に用いられるか又は用いることができる他の薬学的に活性のある化合物又は成分と組み合わせて使用してもよく、その結果、相乗効果が得られることも又は得られないこともある。このような化合物及び成分、並びにそれらを投与するための経路、方法及び薬学的製剤又は薬学的組成物は臨床医にとって明らかであろう。
２つ以上の物質又は成分を複合治療計画の一環として使用する場合、それらは、同様の投与経路を介して又は種々の投与経路を介して、本質的に同じ時点で又は種々の時点で（例えば本質的に同時に、連続して、又は交互に）投与することができる。物質又は成分を、同様の投与経路を介して同時に投与しようとする場合、当業者にとって明らかであるような、種々の薬学的製剤又は薬学的組成物、又は併せた薬学的製剤又は薬学的組成物の一部として投与してもよい。
また、２つ以上の活性物質又は活性成分を複合治療計画の一環として使用しようとする場合、化合物又は成分を単独で使用する場合に用いられるものと同様の量で、また同様の計画に従って、物質又は成分の各々を投与してもよく、このような併用によって、相乗効果がもたらされることも又はもたらされないこともある。しかしながら、２つ以上の活性物質又は活性成分の併用によって相乗効果がもたらされる場合には、所望の治療作用を達成しつつも、投与される物質又は成分の１つ、複数又は全ての量を低減することができる可能性がある。これは、例えば所望の薬学的効果又は治療効果を依然として得ながら、一般的な量で使用される場合の物質又は成分の１つ又は複数の使用に関連するあらゆる望ましくない副作用を回避、制限又は低減するのに有用であり得る。
本発明に従って使用される治療計画の有効性は、臨床医にとって明らかであるように、関与する疾患及び／又は障害についてそれ自体が既知の任意の方法で決定及び／又は追跡され得る。臨床医はまた、必要に応じて及びケースバイケースで、特定の治療計画を変更又は改変し、それにより、所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限又は低減し、及び／又は一方で所望の治療効果を達成することと、他方で望ましくない副作用を回避、制限又は低減することとの適切な均衡を達成することができる。
概して、所望の治療効果が達成されるまで、及び／又は所望の治療効果が維持されている限り、治療計画は続けられる。また、これは臨床医が決定することができるものである。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−６Ｒ関連障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は（一価）構築物の使用に関する。
本発明は、ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも１つを予防及び／又は治療するための、及び／又は本明細書に記載される１つ又は複数の方法において使用するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は（一価）構築物の使用にも関する。
本発明は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、その生物学的若しくは薬理学的な活性、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節することにより予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物の使用にも関する。
本発明は、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物を患者に投与することにより予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物の使用にも関する。
より具体的には、本発明は、ＩＬ−６Ｒ関連障害を予防及び／又は治療するため、特に敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患を予防及び治療するための薬学的組成物の調製における本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物の使用であって、上記方法が薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、使用にも関する。様々な形態のがんは、多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂリンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺がんからなる群から選択され得る。炎症性疾患は、関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息及び自己免疫インスリン依存性糖尿病からなる群から選択され得る。
本発明はさらに、少なくとも１つのＩＬ−６Ｒ関連疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療に使用するための本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくは構築物、ポリペプチド、一価構築物、又はこれを含む薬学的組成物に関する。
本発明はさらに、ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、その生物学的若しくは薬理学的な活性に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達に関連する少なくとも１つの疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療に使用するための本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくは構築物、ポリペプチド、一価構築物、又はこれを含む薬学的組成物に関する。
本発明はさらに、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、その生物学的若しくは薬理学的な活性、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達を調節することにより予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療に使用するための本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくは構築物、ポリペプチド、一価構築物、又はこれを含む薬学的組成物に関する。
本発明はさらに、本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ又は本発明のポリペプチドを患者に投与することにより予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療に使用するための本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくは構築物、ポリペプチド、一価構築物、又はこれを含む薬学的組成物に関する。
本発明はさらに、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患の予防及び／又は治療に使用するための本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくは構築物、ポリペプチド、一価構築物、又はこれを含む薬学的組成物であって、上記方法が薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれを含む薬学的組成物を投与することを含む、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、化合物若しくは構築物、ポリペプチド、一価構築物、又はこれを含む薬学的組成物に関する。様々な形態のがんは、多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂリンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺がんからなる群から選択され得る。炎症性疾患は、関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息及び自己免疫インスリン依存性糖尿病からなる群から選択され得る。
治療対象の被験体とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療対象の被験体は、特に本明細書中に言及される疾患及び障害を患っているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
同様にこのような薬学的組成物において、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、ナノボディ、ポリペプチド、化合物又は構築物を１つ又は複数の他の活性成分、例えば本明細書で言及されるものと好適に組み合せることもできる。
本発明は以下の実施例でさらに説明されるが、さらなる限定とは決して解釈されないものとする。本願全体で引用された全ての引例（参考文献、交付済み特許、公開特許出願、及び同時係属特許出願を含む）の内容全体が参照により特に上記で言及された教示に関して明示的に援用される。
態様
態様１． ＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列であって、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、若しくは
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、若しくは
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、若しくは
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを１つ又は複数含む、アミノ酸配列。
態様２． （ｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがａ）若しくはｂ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ｃ）、ｄ）、ｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応し、（ｉｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがｃ）若しくはｄ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ａ）、ｂ）、ｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応し、又は（ｉｉｉ）第１のアミノ酸残基ストレッチがｅ）若しくはｆ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応する場合、第２のアミノ酸残基ストレッチは、ａ）、ｂ）、ｃ）若しくはｄ）によるアミノ酸配列のうちの１つに対応するように、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、若しくは
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、若しくは
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ、及び／又は
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、若しくは
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを２つ以上含む、態様１に記載のアミノ酸配列。
態様３． 第１のアミノ酸残基ストレッチが
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、
第２のアミノ酸残基ストレッチが
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
第３のアミノ酸残基ストレッチが
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、アミノ酸残基ストレッチを３つ以上含む、態様１又は２に記載のアミノ酸配列。
態様４． 免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能である、態様１〜３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様５． 免疫グロブリン配列である、態様１〜４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様６． ４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここでＣＤＲ１が、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、態様１〜５のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様７． ４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になり、ここでＣＤＲ１が、
ａ）配列番号８０〜配列番号８２、又は
ｂ）配列番号８０〜配列番号８２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
ＣＤＲ２が、
ｃ）配列番号８４〜配列番号９１、又は
ｄ）配列番号８４〜配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｅ）配列番号９３〜配列番号９５、又は
ｆ）配列番号９３〜配列番号９５のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
からなる群から選択される、態様６に記載のアミノ酸配列。
態様８． 少なくとも、
ａ）配列番号８０、又は
ｂ）配列番号８０とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
を含む、態様１〜７のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様９．少なくとも、
ａ）配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１、又は
ｂ）配列番号８４、配列番号８９若しくは配列番号９１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを含む、態様１〜８のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１０． 少なくとも、
ａ）配列番号８４、又は
ｂ）配列番号８４とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
を含む、態様１〜９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１１． 少なくとも、
ａ）配列番号９３〜配列番号９４、又は
ｂ）配列番号９３〜配列番号９４のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、１つ又は２つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを含む、態様１〜１０のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１２． 少なくとも、
ａ）配列番号９３、又は
ｂ）配列番号９３とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸残基ストレッチであって、上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列は、２つ又は１つのアミノ酸差異を有しない上記アミノ酸残基ストレッチを含むアミノ酸配列と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、アミノ酸残基ストレッチ
を含む、態様１〜１１のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１３．
ａ）配列番号８０及び配列番号８４、
ｂ）配列番号８０及び配列番号９３、又は
ｃ）配列番号８４及び配列番号９３
から選択されるアミノ酸残基ストレッチを少なくとも２つ含む、態様１〜１２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１４． 配列番号８０、配列番号８４及び配列番号９３を含む、態様１〜１３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１５． 従来の４鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になるか、又は重鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、態様１〜１４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１６． ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列）又はナノボディから本質的になる、態様１〜１５のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１７．
ａ）配列番号６０〜配列番号６９、
ｂ）そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列、
ｃ）配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６０〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列
からなる群から選択される、態様１〜１６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様１８．
ａ）配列番号６５〜配列番号６９、
ｂ）そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列、
ｃ）配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列
からなる群から選択される、態様１７に記載のアミノ酸配列。
態様１９．
ａ）配列番号６６、
ｂ）そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号６６とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、そのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６６による結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列、
ｃ）配列番号６６とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有する配列であって、配列番号６６とわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号６６による結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、配列
からなる群から選択される、態様１８に記載のアミノ酸配列。
態様２０． １ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様１〜１９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２１． １ｎＭ〜１ｐＭ以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様１〜２０のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２２． １０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様１〜２１のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２３． １０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様１〜２２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２４． １０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様１〜２３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２５． １０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様１〜２４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２６． ＴＦ−１アッセイにおいて１０ｎＭ〜５０ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは１ｎＭ〜５０ｐＭ以下、例えば約７５０ｐＭ又は５００ｐＭ以下のＩＣ５０値（１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有する、態様１〜２５のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２７． ＴＦ−１アッセイにおいて５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは２５ｎＭ〜１ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１ｎＭ以下、例えば約８ｎＭ以下のＩＣ５０（５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有する、態様１〜２６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２８． ＴＦ−１アッセイにおいて配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様１〜２７のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様２９． ＴＦ−１アッセイにおいてトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様１〜２８のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様３０． ＩＬ−６のＥＣ５０値での血漿効力アッセイにおいて５００ｐＭ〜５０ｐＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは２００ｐＭ〜５０ｐＭ以下、例えば１５０ｐＭ以下のＩＣ５０値を有する、態様１〜２９のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様３１． ＩＬ−６のＥＣ９５値での血漿効力アッセイにおいて１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、好ましくは７５０ｐＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは５００ｐＭ〜１００ｐＭ以下、例えば４００ｐＭ以下のＩＣ５０値を有する、態様１〜３０のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様３２． 態様３０又は３１の血漿効力アッセイにおいて配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様１〜３１のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様３３． 態様３０又は３１の血漿効力アッセイにおいてトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様１〜３２のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様３４． ＣＨＯ細胞上での膜ＩＬ−６Ｒとの結合に関して１０ｎＭ〜１００ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは２ｎＭ〜１０ｐＭ以下、例えば２ｎＭ以下のＩＣ５０値を有する、態様１〜３３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列。
態様３５． 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
態様３６． 上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列又はナノボディからなる群から選択される、態様３５に記載の化合物又は構築物。
態様３７． 多価構築物、例えば二価又は三価の構築物である、態様３５又は３６に記載の化合物又は構築物。
態様３８． 多重特異性構築物、例えば二重特異性又は三重特異性の構築物である、態様３５〜３７のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様３９． 態様１〜３４のいずれか一つに記載の対応するアミノ酸配列自体と比較して増大した半減期を有する、態様３５〜３８のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様４０． 上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、態様１〜２０のいずれか一つに記載の対応するアミノ酸配列と比較して増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する、態様３９に記載の化合物又は構築物。
態様４１． 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質と結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質と結合することができる小タンパク質又は小ペプチドからなる群から選択される、態様３９に記載の化合物又は構築物。
態様４２． 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ヒト血清アルブミン又はその断片からなる群から選択される、態様３９に記載の化合物又は構築物。
態様４３． 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができる結合単位からなる群から選択される、態様３９に記載の化合物又は構築物。
態様４４． 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸配列、又は血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）若しくは血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるナノボディからなる群から選択される、態様３９に記載の化合物又は構築物。
態様４５． 増大した半減期を有する化合物又は構築物を提供する上記１つ又は複数の他の結合単位が、配列番号９７〜配列番号９９から選択される、態様３９に記載の化合物又は構築物。
態様４６． 以下のポリペプチド配列：
ａ）配列番号７０〜配列番号７２、
ｂ）本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列、
ｃ）配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列
から選択される、態様３５〜４５のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様４７． 以下のポリペプチド配列：
ａ）配列番号７０〜配列番号７１、
ｂ）本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいて配列番号７０〜配列番号７１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、本発明のそのＣＤＲの１つ、２つ又は全てにおいてわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列は、配列番号７０〜配列番号７１のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列、
ｃ）配列番号７０〜配列番号７１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するポリペプチド配列であって、配列番号７０〜配列番号７１のうちの１つとわずか２つ、好ましくはわずか１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列は、配列番号７０〜配列番号７１のうちの１つによる結合と比較してほぼ同じ、又はより高い親和性（上記親和性は表面プラズモン共鳴により測定されるようなものである）でＩＬ−６Ｒと結合するものとする、ポリペプチド配列
から選択される、態様３５〜４６のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様４８． 配列番号７０のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる、態様３５〜４７のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様４９． 配列番号７１のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる、態様３５〜４７のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５０． １ｎＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ（モル／Ｌ）以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様３５〜４９のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５１． １ｎＭ〜１ｐＭ以下、好ましくは５００ｐＭ〜１ｐＭ以下、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭ以下、又はさらにより好ましくは約５０ｐＭ〜１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）でカニクイザルＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様３５〜５０のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５２． １０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でｈＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様３５〜５１のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５３． １０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約１０６Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様３５〜５２のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５４． １０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でｈＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様３５〜５３のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５５． １０−３ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−５ｓ−１〜１０−６ｓ−１、例えば約１０−５ｓ−１以下のｋｏｆｆ速度でカニクイザルＩＬ−６Ｒと特異的に結合する、態様３５〜５４のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５６． ＴＦ−１アッセイにおいて１０ｎＭ〜５０ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは１ｎＭ〜５０ｐＭ以下、例えば約７５０ｐＭ又は５００ｐＭ以下のＩＣ５０値（１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有する、態様３５〜５５のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５７． ＴＦ−１アッセイにおいて５０ｎＭ〜１ｎＭ、好ましくは２５ｎＭ〜１ｎＭ、より好ましくは１０ｎＭ〜１ｎＭ以下、例えば約８ｎＭ以下のＩＣ５０（５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６で）を有する、態様３５〜５６のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５８． ＴＦ−１アッセイにおいて配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様３５〜５７のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様５９． ＴＦ−１アッセイにおいてトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様３５〜５８のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様６０． ＩＬ−６のＥＣ５０値での血漿効力アッセイにおいて５００ｐＭ〜５０ｐＭ、好ましくは２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、より好ましくは２００ｐＭ〜５０ｐＭ以下、例えば１５０ｐＭ以下のＩＣ５０値を有する、態様３５〜５９のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様６１． ＩＬ−６のＥＣ９５値での血漿効力アッセイにおいて１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、好ましくは７５０ｐＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは５００ｐＭ〜１００ｐＭ以下、例えば４００ｐＭ以下のＩＣ５０値を有する、態様３５〜６０のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様６２． 態様６０又は６１の血漿効力アッセイにおいて配列番号１及び配列番号２に規定のような参照ＩｇＧ又は配列番号３及び配列番号４に規定のような参照Ｆａｂに関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様３５〜６１のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様６３． 態様６０又は６１の血漿効力アッセイにおいてトシリズマブ（ＭＲＡ）に関して得られたＩＣ５０値と比較して少なくとも同じ、好ましくはより良好な、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、さらにより好ましくは５倍、７倍又は７倍超良好なＩＣ５０値を有する、態様３５〜６２のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様６４． ＣＨＯ細胞上での膜ＩＬ−６Ｒとの結合に関して１０ｎＭ〜１００ｐＭ、好ましくは５ｎＭ〜１００ｐＭ、より好ましくは２ｎＭ〜１０ｐＭ以下、例えば２ｎＭ以下のＩＣ５０値を有する、態様３５〜６３のいずれか一つに記載の化合物又は構築物。
態様６５． １つの態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的になる一価構築物。
態様６６． 態様３７〜６４のいずれか一つに記載の多価の化合物又は構築物の調製における態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列又は態様６５に記載の一価構築物の使用。
態様６７． 態様３７〜６４のいずれか一つに記載の多価の化合物又は構築物を調製する方法であって、態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列又は態様６５に記載の一価構築物と、１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含む、方法。
態様６８． １つ又は複数のリンカーを介して、態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列又は態様６５に記載の一価構築物と、他の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含む、態様６７に記載の、態様３７〜６４のいずれか一つに記載の多価の化合物又は構築物を調製する方法。
態様６９． 態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物をコードする核酸又はヌクレオチド配列。
態様７０． 遺伝子構築物の形態である、態様６９に記載の核酸又はヌクレオチド配列。
態様７１． 態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物を発現し、又は好適な環境下で発現することができ；及び／又は態様６９に記載の核酸若しくはヌクレオチド配列又は態様７０に記載の遺伝子構築物を含む、宿主又は宿主細胞。
態様７２． 態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物を産生する方法であって、
ａ）好適な宿主細胞若しくは宿主生物において又は別の好適な発現系において、態様６９に記載の核酸若しくはヌクレオチド配列又は態様７０に記載の遺伝子構築物を発現する工程、任意でその後に
ｂ）このようにして得られた、態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物を単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。
態様７３． 態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物を産生する方法であって、
ａ）態様７１に記載の宿主又は宿主細胞が、少なくとも１つの態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物を発現及び／又は産生するような条件下で、上記宿主又は宿主細胞を培養及び／又は維持する工程、任意でその後に
ｂ）このようにして得られた、態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、これをコードする核酸若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるような態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物を単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。
態様７４． 少なくとも１つの態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、態様６５に記載の一価構築物、又は態様６９若しくは７０に記載の核酸若しくはヌクレオチド配列を含む、組成物。
態様７５． 薬学的組成物である、態様７４に記載の組成物。
態様７６． 少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、かつ任意で１つ又は複数のさらなる薬学的に活性のあるポリペプチド及び／又は化合物を含む薬学的組成物である、態様７４に記載の組成物。
態様７７． ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも１つを予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の少なくとも１つの態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、態様６５に記載の一価構築物、又は態様７５若しくは７６に記載の組成物をこれを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様７８． ＩＬ−６Ｒに及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある上記の疾患及び障害が、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患からなる群から選択される、態様７７に記載の方法。
態様７９． 上記様々な形態のがんが、多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病、リンパ腫、Ｂリンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺がんからなる群から選択される、態様７８に記載の方法。
態様８０． 上記炎症性疾患が、関節リウマチ、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息、アレルギー性喘息及び自己免疫インスリン依存性糖尿病からなる群から選択される、態様７８に記載の方法。
態様８１． 態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物をこれを必要とする被験体に投与することにより予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の少なくとも１つの態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、態様６５に記載の一価構築物、又は態様７５若しくは７６に記載の組成物をこれを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様８２． ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも１つを予防及び／又は治療するための、及び／又は１つ又は複数の態様７７〜８１に記載の方法における使用のための薬学的組成物の調製における態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物の使用。
態様８３． ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも１つの予防及び／又は治療における使用のための、及び／又は１つ又は複数の態様７７〜８１に記載の方法における使用のための態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物。
態様８４． 態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物、又は態様６５に記載の一価構築物の誘導体。
態様８５． ＩＬ−６Ｒと特異的に結合することができる、態様８４に記載の誘導体。
態様８６． 態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列自体、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物自体、又は態様６５に記載の一価構築物自体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍（例えば少なくとも５倍）、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超大きい血清半減期を有する、態様８４又は８５に記載の誘導体。
態様８７． 対応する態様１〜３４のいずれか一つに記載のアミノ酸配列自体、態様３５〜６４のいずれか一つに記載の化合物若しくは構築物自体、又は態様６５に記載の一価構築物自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超（例えば１２時間超）、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間超増大した血清半減期を有する、態様８４〜８６のいずれか一つに記載の誘導体。
態様８８． 少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上；例えば少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、若しくは少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）のヒトにおける血清半減期を有する、態様８４〜８７のいずれか一つに記載の誘導体。
態様８９． ペグ化誘導体である、態様８４〜８８のいずれか一つに記載の誘導体。
態様９０． 態様８４〜８９のいずれか一つに記載の誘導体を少なくとも１つ含む組成物。
Ｉ．ＩＬ−６Ｒと結合するナノボディの単離
実施例１：材料
ＩＬ−６Ｒと結合するナノボディの単離に用いられる材料を表Ｃ−１に示す。
欧州特許第０６２８６３９号に記載の２つの代表的な抗ヒトＩＬ−６Ｒ免疫グロブリン（Ｆａｂ断片及び完全長ＩｇＧ）を産生し、参照化合物として使用した。Ｆａｂ断片及び完全長ＩｇＧは「ＲＶＬａ」と呼ばれるＬ鎖（欧州特許第０６２８６３９号、表２、バージョン（ａ）を参照されたい）及び「ＲＶＨｆ」と呼ばれるＨ鎖（欧州特許第０６２８６３９号、表３、バージョン（ｆ）を参照されたい）に基づき構築されていた。欧州特許第０６２８６３９号（例えば００７４段落を参照されたい）に従って、これらの特定のＬ鎖及びＨ鎖を含む再形成されたヒト抗体がヒトＩＬ−６Ｒに対するマウスモノクローナル抗体であるＰＭ１と同じレベルでヒトＩＬ−６Ｒと結合する能力を示したため（これについても欧州特許第０６２８６３９号、００９段落及びそこで引用されたさらなる引例を参照されたい）、参照化合物を構築するために上記Ｌ鎖及び上記Ｈ鎖が選択された。
全長の参照ＩｇＧは配列番号１（重鎖）及び配列番号２（軽鎖）のアミノ酸配列からなっていた。Ｆａｂ断片は配列番号３（ヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域に融合した重鎖領域ＶＬｂ及びＶＨｆ）及び配列番号４（ヒトＣκに融合した再形成されたヒトＰＭ−１可変軽鎖）のアミノ酸配列からなっていた。
コーディングＤＮＡ断片を、一部重複したオリゴヌクレオチドを用いたアセンブリＰＣＲにより産生した。ＰＣＲ産物を単一の２シストロン性の（bi-cistronic）ベクターにクローニングしたが、それにより大腸菌のペリプラズムにおいて機能的なジスルフィド結合したＦａｂ断片を発現させることが可能となる。全長のＩｇＧを、軽鎖及び重鎖に関する遺伝子を含有する２つの発現ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で産生した。重鎖をコードする遺伝子は、ＶＨｆをヒトＩｇＧ１の定常領域と融合することにより作出した。軽鎖は欧州特許第０６２８６３９号に記載のようなものであった。
実施例２：免疫付与
２頭のラマ（８１及び８２）を表Ｃ−２に記載の免疫付与スケジュールに従って、ヒトＩＬ−６Ｒ（Peprotech）で免疫付与した。
免疫付与スケジュールの終了後、各動物における免疫応答をＥＬＩＳＡにより分析した。そのために、ビオチン化ＩＬ−６Ｒ（２μｇ／ｍｌ）をニュートラアビジンコーティングマイクロタイタープレートに捕捉させた。０日目、２８日目、３９日目及び４３日目に回収した血清試料の段階希釈物（開始希釈率：１／５００）を添加し、結合したラマＩｇＧをＨＲＰで標識したヤギ抗ラマＩｇＧの添加により検出した。ＴＭＢを基質として使用した。結果を図１に示す。
免疫応答はＦＡＣＳによっても分析した：０日目、２８日目及び４３日目に回収した血清試料の段階希釈物（開始希釈率：１／１００）を、Ｕ２６６細胞（ヒト骨髄腫）とインキュベートした。結合したラマＩｇＧをＦＩＴＣで標識したヤギ抗ラマＩｇＧにより検出した。結果を図２に示す。
これらのデータをまとめると、両方の動物がＩＬ−６Ｒに対して良好な免疫応答を生じたこと、及びラマＩｇＧの少なくとも一部がＵ２６６細胞の表面上でＩＬ−６Ｒを認識することが示される。
実施例３：ライブラリ構築
ＰＢＬ及びリンパ節から抽出したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用して、ナノボディをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片をＬａｃＺプロモーター、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子、マルチクローニング部位及びｇｅｎ３リーダー配列を含有するｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターにクローニングした。ナノボディコード配列とインフレームで、ベクターはＣ末端ｃ−ｍｙｃタグ及び（Ｈｉｓ）６タグをコードしていた。ファージは標準的プロトコルに従って調製し、滅菌濾過の後、さらなる使用のために４℃で保管した。構築されたライブラリの特徴を表Ｃ−３に示す。
実施例４：選別（Selections：セレクション）
表Ｃ−４に要約されるような様々な条件を用いて、上記ライブラリにより選別を実行した。
全条件について選別を１回だけ行なった。各々の選別のアウトプットを濃縮係数（対照と比べた溶出液中に存在するファージの数）、多様性（ＨｉｎｆＩプロファイリング）及びＩＬ−６Ｒ陽性クローンの割合（ＥＬＩＳＡ）について分析した。これらのパラメータに基づき、さらなる分析のために最良の選別を選択した。そのために、各々の選別からのアウトプットを、ＬａｃＺプロモーター、アンピシリン又はカルベニシリンに対する耐性遺伝子、マルチクローニング部位及びｇｅｎ３リーダー配列を含有するｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターにプールとして再クローニングした。ナノボディコード配列とインフレームで、ベクターはＣ末端ｃ−ｍｙｃタグ及び（Ｈｉｓ）６タグをコードしていた。コロニーを採取して９６ディープウェルプレート（１ｍｌ容）で培養し、ＩＰＴＧを添加することによりナノボディ発現を誘導した。ペリプラズム抽出液を、標準的プロトコルに従って調製した。
実施例５：スクリーニング
ペリプラズム抽出液はまず、ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ相互作用を阻害する能力について分析した。そのために、図３に概略的に示される２つの独立したアルファスクリーンアッセイを設定した。アッセイ１では、ペリプラズム抽出液を可溶性ＩＬ−６受容体（１ｎＭ）、ビオチン化ＩＬ−６（３ｎＭ）、ストレプトアビジンコーティングドナービーズ及びモノクローナル抗体ＢＮ−１２コーティングアクセプタービーズ（２０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。このアッセイで陽性のナノボディはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用、又はＩＬ−６Ｒ−モノクローナル抗体ＢＮ−１２相互作用のいずれかを阻害することができた。これら２つの可能性を区別するために、第２のアッセイを設定した（アッセイ２）。このアッセイでは、ペリプラズム抽出液をｂｉｏ−ＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）、ストレプトアビジンコーティングドナービーズ及びモノクローナル抗体ＢＮ−１２コーティングアクセプタービーズ（１０μｇ／ｍｌ）とインキュベートした。アッセイ１では陽性であるがアッセイ２では陰性のナノボディは、ＩＬ−６−ＩＬ−６Ｒ阻害因子であると考えられた。
両アッセイではペリプラズム抽出液を、最終濃度の４０ｎＭにほぼ一致する２５倍に希釈した。スクリーニング試行（effort）の統計的概要を以下の表Ｃ−５に示す。最も強い阻害を示すナノボディをＢｉａｃｏｒｅ及びＤＮＡシークエンシングでの解離速度に関する分析のために選択した。図４は細胞ベースのアッセイにおけるさらなる分析のために選択された阻害ナノボディのタンパク質配列を示す。表Ｃ−６はこれらの阻害ナノボディのｋｏｆｆ値を示す。
実施例６：ナノボディの発現及び精製
選択されたナノボディを大腸菌において、ｃ−ｍｙｃ、（Ｈｉｓ）６タグ付けタンパク質として５０ｍｌ又は２５０ｍｌの培養物量で発現させた。発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、３７℃で４時間継続させた。細胞培養物の遠沈（spinning）後、ペリプラズム抽出液を沈殿物を凍結融解することにより調製した。これらの抽出液を出発物質として固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）に使用した。ナノボディを１５０ｍＭのイミダゾールでカラムから溶出させ、続いてＰＢＳに対して透析した。全収率及び細胞培養物１リットル当たりの収率を表Ｃ−７に挙げる。精製ナノボディ（ＰＭＰ２８Ｅ１１を除く）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図５に示す。
実施例７：タンパク質ベースの競合アッセイ
１４個の精製ナノボディを、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。精製タンパク質の段階希釈物（濃度範囲：５００ｎＭ〜１０ｐＭ）をＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて、３ｎＭのｂｉｏ−ＩＬ−６及びＢＮ−１２コーティングアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベート後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーで読み取った。ＢＲ−６及び実施例１に記載のＦａｂ断片は参照として含まれていた。結果を図６に示す。
用量応答曲線を１４個のナノボディ全てについて観察したが、ＩＣ５０値は４８ｐＭ〜１．７ｎＭの範囲であった（表Ｃ−８）。このアッセイで最も強力なナノボディはＰＭＰ３２Ｃ９及びＰＭＰ３５Ｈ４であった。ＰＭＰ３３Ａ３に関しては、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の部分的な（約５０％の）阻害しか達成できなかった。
実施例８：得られたナノボディの親和性決定
個々のナノボディ及び実施例１に記載の参照Ｆａｂ断片の親和定数（Ｋｄ）をＢｉａｃｏｒｅ ３０００機器による表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により求めた。簡潔に述べると、ＩＬ−６Ｒを８００ＲＵ〜１０００ＲＵの密度でＣＭ５センサーチップにアミンカップリングさせた。ナノボディを１ｎＭ〜５０ｎＭの５つの種々の濃度で注入した。流速は全ての実験で４５μｌ／分であった。結合期及び解離期はそれぞれ３分及び１０分であった。チップをグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を用いて再生させた。種々の濃度のナノボディでの結合曲線を、動態パラメータｋｏｎ、ｋｏｆｆ及びＫｄを算出するのに使用した（表Ｃ−９）。
実施例９：ＸＧ１アッセイにおけるナノボディの細胞ベースの効力
全ての精製ナノボディをＸＧ１アッセイで試験した。ＸＧ１はＩＬ−６依存性のヒト骨髄腫細胞株である。最大半減増殖は約２０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６で達成される。アッセイは原則的にZhang et al.（1994, Blood 83: 3654-3663）により記載のように行った。実施例１に記載のような参照Ｆａｂ断片は参照として含まれていた。ＩＣ５０値は表Ｃ−１０に挙げられるように９０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲であった。ナノボディの小さいサブセットをこのアッセイにおいて１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡの存在下でも試験した。
実施例１０：ＴＦ１アッセイにおけるナノボディの細胞ベースの効力
ナノボディを細胞表面上でのＩＬ−６ＲとのＩＬ−６の結合の遮断によるＴＦ−１細胞（ＥＣＡＣＣ番号９３０２２３０７；1989, J. Cell Physiol., 140: 323; 1993, Exp. Cell Res., 208: 35）のＩＬ−６依存性の増殖を阻害する能力に関しても試験した。このため、ナノボディの段階希釈物を固定量のＴＦ−１細胞と３７℃で２時間プレインキュベートした。続いてＩＬ−６を最終濃度が２ｎｇ／ｍｌになるまで添加した。ＩＬ−６依存性の細胞増殖を７２時間継続させ、トリチウムで標識されたチミジンの取り込みにより測定した。ＩＣ５０値を表Ｃ−１１に挙げている。
実施例１１：ＩＬ−６Ｒとの結合に関する参照Ｆａｂとの競合
１４個のナノボディ全てを、アルファスクリーンをベースにしたアッセイにおいて実施例１に記載のような参照ＦａｂとＩＬ−６Ｒとの結合を阻害する能力に関して分析した。このアッセイでは、１００ｎＭの精製ナノボディを０．４ｎＭのビオチン化ＩＬ−６とインキュベートした。参照Ｆａｂコーティングアクセプタービーズ及びストレプトアビジンコーティングドナービーズを添加し、参照Ｆａｂ／ＩＬ−６Ｒ複合体の濃度を測定した。ナノボディの存在下で得られた値をナノボディを加えなかった対照と比較し、％で表される２つの値の間の比を表Ｃ−１２に挙げている。ＩＬ６Ｒ０３を除く全てのナノボディは、ＩＬ−６Ｒと参照Ｆａｂとの結合の阻害を全く又は一部だけしか示さず、これによりそれらのエピトープが参照Ｆａｂのエピトープと全く又は一部だけしか重複しないことが示唆される。
実施例１２：ナノボディとＵ２６６細胞との結合
ナノボディとＵ２６６細胞上で発現する膜結合ＩＬ−６Ｒとの結合をＦＡＣＳで分析した。この分析は選別されたクローン由来の精製ナノボディ（ＩＬ６Ｒ０４、ＩＬ６Ｒ０９、ＩＬ６Ｒ１１、ＩＬ６Ｒ１３及びＩＬ６Ｒ１４）に対して行った。結果を図７に示す。全てのナノボディが細胞表面で発現するヒトＩＬ−６Ｒと結合することが可能であった。
実施例１３：ナノボディと血漿由来のヒトＩＬ−６Ｒとの結合
可溶性のＩＬ−６Ｒが８０ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト血漿に存在する。ナノボディＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３が血漿由来のＩＬ−６Ｒと結合することが可能であるかを決定するために、Ｕ２６６細胞に結合するナノボディに対するヒト血漿の影響を評価した。ヒト血漿はＵ２６６細胞との結合を阻害したが、これは３つのナノボディ全てが血漿由来のヒトＩＬ−６Ｒと結合することが可能であることを示している（図８を参照されたい）。
実施例１４：ナノボディとマウスＩＬ−６Ｒとの交差反応性
ナノボディとマウスＩＬ−６Ｒとの交差反応性をＥＬＩＳＡで分析した。このため、５００ｎＭのナノボディを１μｇ／ｍｌのマウス及びヒトのＩＬ−６Ｒでコーティングしたマイクロタイタープレートに適用した。一次抗体及び二次抗体としてそれぞれ抗ｍｙｃ及び抗マウスＨＲＰを用いて検出を行った。光学密度を図１０に示す。マウスＩＬ−６Ｒとの結合は試験したナノボディのいずれでも観察されなかった。
実施例１５：ＩＬ−６Ｒと結合するナノボディの単離に関する要約
組換えＩＬ−６Ｒによる２匹のラマの免疫付与によりＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの相互作用を遮断することができた１４個の特有のナノボディのパネルが得られた。このパネルを詳細に分析し、全ての実験データに基づき、ナノボディＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３をさらなる開発のために選別した。最も重要なナノボディ特性を表Ｃ−１３に要約する。
ＩＩ．抗ＩＬ−６Ｒナノボディのフォーマッティング
実施例１６：多価構築物の調製
先の段落に記載の抗ＩＬ−６ＲナノボディはＣ末端の抗ＳＡナノボディ（ＡＬＢ１）、９アミノ酸のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー及びＮ末端の抗ＩＬ−６Ｒナノボディからなる二重特異性構築物としても発現された。さらに、Ｃ末端及びＮ末端の抗ＩＬ−６Ｒナノボディ、中央の抗ＳＡナノボディ（ＡＬＢ１）（全て９アミノ酸のＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーを介して連結した）からなる４個の三価の二重特異性ナノボディを構築した。これらのナノボディ番号を表Ｃ−１４に挙げている。
実施例１７：二重特異性抗ＩＬ−６Ｒナノボディの発現
二重特異性ナノボディ構築物は大腸菌においてｃ−ｍｙｃ、（Ｈｉｓ）６タグ付けタンパク質として発現し、続いて固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により培養培地から精製した。全収率及び細胞培養物１リットル当たりの収率を表Ｃ−１５に挙げている。精製ナノボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１１に示す。
実施例１８：タンパク質ベースの競合アッセイ
精製した二重特異性ナノボディを、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関してアルファスクリーンで試験した。精製タンパク質の段階希釈物（濃度範囲：２５０ｎＭ〜５ｐＭ）をＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて、３ｎＭのｂｉｏ−ＩＬ−６及びＢＮ−１２コーティングアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後に、ストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベート後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーで読み取った。ＢＲ−６及び実施例１に記載のＦａｂ断片は参照として含まれていた。結果を図１２に示す。
用量応答曲線を全てのナノボディについて観察したが、ＩＣ５０値は１２３ｐＭ〜１．６７ｎＭの範囲であった（表Ｃ−１６）。
実施例１９：ＸＧ１アッセイにおけるナノボディの細胞ベースの効力
二重特異性ナノボディをＸＧ１増殖アッセイで試験した。ＩＣ５０値は６０ｐＭ〜６５ｎＭの範囲であった。ナノボディをこのアッセイにおいて１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンの存在下でも分析した。二重特異性ナノボディに関しては、ＩＣ５０値は１９０ｐＭ〜９０ｎＭの範囲である。実施例１に記載のような参照ＩｇＧは参照として含まれていた。ＩＣ５０値を表Ｃ−１７に挙げている。
フォーマットされたナノボディをＸＧ１アッセイにおいてアルブミンの存在下で試験した場合、効力の喪失が観察された。フォーマットされたナノボディＩＬ６Ｒ２４、ＩＬ６Ｒ４４及びＩＬ６Ｒ４９の効力は血清アルブミンの存在下での参照ＩｇＧよりも優れているか、又は参照ＩｇＧと同じ範囲であった。
実施例２０：ＩＬ−６Ｒに対する親和性の決定
二重特異性ナノボディとＩＬ−６Ｒとの結合を表面プラズモン共鳴により分析した。動態パラメータを求め、表Ｃ−１８に挙げている。ＩＬ−６Ｒに対する親和性の顕著な喪失は二価フォーマットのナノボディ（ＩＬ６Ｒ２３、ＩＬ６Ｒ２４、ＩＬ６Ｒ３３）では観察されなかった。
実施例２１：血清アルブミンに対する親和性の決定
フォーマットされたナノボディと血清アルブミンとの結合を表面プラズモン共鳴により分析した。親和定数（Ｋｄ）を求め、表Ｃ−１９に挙げている。アルブミンと結合するナノボディＡｌｂ−１（配列番号９７）は比較用に含まれていた。親和性は同じ抗血清アルブミン構成要素を含有するこれまでにフォーマットされたナノボディの範囲内であったが、概ねより低い親和性が観察された。このことは特にマウス血清アルブミンの親和性の場合で顕著であった。
実施例２２：フォーマットされたナノボディとＵ２６６細胞との結合
選択されたクローン由来のフォーマットされたナノボディ（ＩＬ６Ｒ２３、ＩＬ６Ｒ２４、ＩＬ６Ｒ２９、ＩＬ６Ｒ３３、ＩＬ６Ｒ４４及びＩＬ６Ｒ５３）とＵ２６６細胞との結合をＦＡＣＳにより分析した。結果を図１３及び図１４に示す。二価ナノボディＩＬ６Ｒ２３、ＩＬ６Ｒ２４、ＩＬ６Ｒ２９及びＩＬ６Ｒ３３は一価構成要素と比較して結合の低減を示すが、同様の結合は三価ナノボディＩＬ６Ｒ４４及びＩＬ６Ｒ５３で観察された。
ＩＩＩ．抗ＩＬ−６Ｒナノボディの配列最適化
実施例２３：配列最適化戦略
ナノボディＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３のタンパク質配列を各々、最大の相同性を共有する５つの最も近縁なヒト生殖系列とアラインメントした（図１５）。ヒト生殖系列のコンセンサス配列と比べたフレームワーク領域のアミノ酸差異を色分けする。薄灰色で強調したアミノ酸差異はヒトの対応物（counterpart）に変換するために選択したが、暗灰色で強調したアミノ酸はそのままにした（untouched）。初めに配列を最適化した４つの変異体のパネルを３つのナノボディそれぞれで作製した（段階１）。これらの変異体を多くのパラメータに関して分析し、得られた結果を、第２のセットのナノボディを設計するのに使用した（段階２）。配列を最適化した全ての変異体のタンパク質配列を図１６に示す。
実施例２４：配列最適化段階１
配列最適化プロセスの段階１では、以下の１２個の変異体を作製し、分析した：
ＩＬ６Ｒ０３：ＩＬ６Ｒ６１、ＩＬ６Ｒ６２、ＩＬ６Ｒ６３及びＩＬ６Ｒ６４
ＩＬ６Ｒ０４：ＩＬ６Ｒ７１、ＩＬ６Ｒ７２、ＩＬ６Ｒ７３及びＩＬ６Ｒ７４
ＩＬ６Ｒ１３：ＩＬ６Ｒ８１、ＩＬ６Ｒ８２、ＩＬ６Ｒ８３及びＩＬ６Ｒ８４
これらの様々な変異体のアミノ酸配列を図１６に示す。
ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ競合アッセイにおける配列を最適化したナノボディの評価
ＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化したクローンをアルファスクリーンにおいてＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関して試験した。精製ナノボディの段階希釈物をＩＬ−６Ｒ（０．３ｎＭ）に添加し、１５分間インキュベートした。続いて３ｎＭのｂｉｏ−ＩＬ−６及びＢＮ−１２コーティングアクセプタービーズを添加し、この混合物を１時間インキュベートした。最後にストレプトアビジンドナービーズを添加し、１時間のインキュベーション後、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダーで読み取った。親クローンは参照として含まれていた。結果を図１７、図１８及び図１９に示す。
ＩＬ６Ｒ０３の配列を最適化した変異体（ＩＬ６Ｒ６１、ＩＬ６Ｒ６２及びＩＬ６Ｒ６４）は全て、ＩＬ６Ｒ０３のＩＣ５０値の２倍以内のＩＣ５０値を有するが、ＩＬ６Ｒ６３は約４倍低いＩＣ５０値を示している。
ＩＬ６Ｒ０４の配列を最適化した変異体に関して、ＩＬ６Ｒ０４と配列を最適化した４つの変異体との間でＩＣ５０値の有意差は観察されなかった。
ＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体に関して、ＩＬ６Ｒ８１及びＩＬ６Ｒ８３のＩＣ５０値はＩＬ６Ｒ１３のものとほぼ同一であったが、フレームワーク２においてＲＡＴ→ＫＧＬ突然変異を保有する２つの変異体（ＩＬ６Ｒ８２及びＩＬ６Ｒ８４）の効力は低下した。
親和性決定
ＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体をＢｉａｃｏｒｅでもＩＬ−６Ｒとの結合に関して分析した。動態パラメータを表Ｃ−２０に挙げている。
ＩＬ６Ｒ０３の配列を最適化した変異体に関して、ＩＬ６Ｒ６１、ＩＬ６Ｒ６２及びＩＬ６Ｒ６３のＫｄ値は全てＩＬ６Ｒ０３のＫｄ値の２倍以内であった。ＩＬ６Ｒ６４のＫｄは求めなかった。
ＩＬ６Ｒ０４の配列を最適化した変異体に関して、ＩＬ６Ｒ０４と配列を最適化した４つの変異体との間でＫｄ値の有意差は観察されなかった。
ＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体に関して、ＩＬ６Ｒ８１及びＩＬ６Ｒ８３のＫｄ値はＩＬ６Ｒ１３のＫｄ値と非常に類似しているが、フレームワーク２においてＲＡＴ→ＫＧＬ突然変異を保有する２つの変異体（ＩＬ６Ｒ８２及びＩＬ６Ｒ８４）の親和性は大きな低下を示した。
全体として、これらの観察結果はアルファスクリーンをベースにした競合アッセイで得られた結果に完全に一致する。
実施例２５：配列最適化段階２
段階１の親和性及び効力データに基づき、以下のセットの変異体を作製することを決めた。
ＩＬ６Ｒ０３に関しては、変異体ＩＬ６Ｒ６１、ＩＬ６Ｒ６２、ＩＬ６Ｒ６３及びＩＬ６Ｒ６４に存在する全ての突然変異を組み合わせて、ＩＬＲ６５を得た。
ＩＬ６Ｒ０４に関しては、変異体ＩＬ６Ｒ７１、ＩＬ６Ｒ７２、ＩＬ６Ｒ７３及びＩＬ６Ｒ７４に存在する全ての突然変異を組み合わせて、ＩＬＲ７５を得た。
ＩＬ６Ｒ１３に関しては、ＦＲ２においてＲＡＴ配列で異なる突然変異（の組合せ）を保有する６つの新規の変異体セット（ＩＬ６Ｒ８５〜ＩＬ６Ｒ９０）を作製した。この配列を最適化した変異体は親和性及び効力のどちらでもＩＬ６Ｒ１３とは区別することはできなかったため、これらの突然変異はＩＬ６Ｒ８３バックグラウンドに導入された。
配列を最適化したＩＬ６Ｒ１３変異体の解離速度分析
配列を最適化した変異体ＩＬ６Ｒ８５〜ＩＬ６Ｒ９０をＢｉａｃｏｒｅでペリプラズム抽出液として分析した。解離曲線をｋｏｆｆ値を算出するのに用いた（表Ｃ−２１）。ナノボディＩＬ６Ｒ８７〜ＩＬ６Ｒ８９の解離速度はＩＬ６Ｒ１３のものと同様であったが、ナノボディＩＬ６Ｒ８５、ＩＬ６Ｒ８６及びＩＬ６Ｒ９０は１０倍高い解離速度を有していた。
ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ競合アッセイにおける配列を最適化したナノボディの評価
配列を最適化した変異体ＩＬ６Ｒ８５〜ＩＬ６Ｒ９０をアルファスクリーンにおいてＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用を遮断する能力に関してペリプラズム抽出液として試験した。結果を図２０に示す。
ナノボディＩＬ６Ｒ８７、ＩＬ６Ｒ８８及びＩＬ６Ｒ８９はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の遮断においてＩＬ６Ｒ１３変異体ＩＬ６Ｒ８５、ＩＬ６Ｒ８６及びＩＬ６Ｒ９０よりも強力であった。これらの結果はＢｉａｃｏｒｅでの観察結果と完全に一致する。配列を最適化したＩＬ６Ｒ１３変異体のアミノ酸配列の比較により、突然変異Ｔ４５Ｌが解離速度及び効力の低減に関与することが明らかとなった。そのためＴ４５Ｌ突然変異を有しない最も有望なヒト変異体、すなわちＩＬ６Ｒ８８をさらなる特性評価のために選択した。
この変異体を発現させ、精製し、精製クローンＩＬ６Ｒ６５及びＩＬ６Ｒ７５と併せてＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ相互作用の阻害に関して分析した。配列を最適化した様々なクローン（ＩＬ６Ｒ６５、ＩＬ６Ｒ７５及びＩＬ６Ｒ８８）と対応する配列を最適化していないバージョン（それぞれ、ＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３）との間の有意差は観察されなかった（図２１）。
親和性決定
ＩＬ６Ｒ６５、ＩＬ６Ｒ７５及びＩＬ６Ｒ８８の配列を最適化したクローンのヒトＩＬ−６Ｒに関する親和定数（Ｋｄ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器で表面プラズモン共鳴により求めた。簡潔に述べると、ヒトＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに８００ＲＵ〜１０００ＲＵの密度でアミンカップリングを行った。残存する反応基を不活化した。ナノボディ結合を０．５ｎＭ〜５０ｎＭの範囲の様々な濃度で評価した。各々の試料を４５μｌ／分の流速で４分間注入して、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させた。ＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体の動態パラメータを表Ｃ−２２に示す。
親ナノボディと配列を最適化したナノボディとの間では親和定数に大きな差異は観察されなかった。
細胞ベースの効力アッセイ
配列を最適化したナノボディをＸＧ−１アッセイで分析した。結果を図２２に示す。ＩＣ５０値を表Ｃ−２３に要約する。配列最適化は、細胞ベースのアッセイにおいてＩＬ−６誘導性の増殖を中和する効力に対して有意な効果を有していなかった。
ＩＶ．配列を最適化したナノボディのさらなる特性評価
実施例２６：カニクイザルＩＬ−６Ｒに対する親和性決定
ＩＬ６Ｒ０３−ＩＬ６Ｒ６５、ＩＬ６Ｒ０４−ＩＬ６Ｒ７５及びＩＬ６Ｒ１３−ＩＬ−６Ｒ８８のカニクイザルＩＬ−６Ｒに対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器でＳＰＲにより求めた。簡潔に述べると、カニクイザルＩＬ−６ＲをＣＭ５センサーチップに７６０ＲＵの密度でアミンカップリングを行った。残存する反応基を不活化した。ナノボディ結合を１．２５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の様々な濃度で評価した。各々の試料を４５μｌ／分の流速で４分間注入して、チップに結合した抗原に結合させた。次に、ナノボディを含まない結合バッファーを同じ流速でチップに送り、結合したナノボディを解離させた。動態パラメータを表Ｃ−２４に要約する。
ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ７５の親和定数の間にはかなりの差異があったが、この実験からカニクイザルＩＬ−６Ｒに対する両方の分子の親和性はヒトに対するものよりもずっと低いことが明らかであった。これに対して、カニクイザルＩＬ−６Ｒに対するＩＬ６Ｒ０３及びＩＬ６Ｒ６５の親和定数はヒトＩＬ−６Ｒに対するものと同じ範囲内であった。顕著には、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０複合体の結晶構造（Boulanger et al.）はＩＬ−６Ｒ上のＩＬ−６結合部位がヒトとカニクイザルとの間で完全に保存されることを明らかにしており、このことはＩＬ６Ｒ０４が異なるエピトープと結合していることを示唆している。
実施例２７：ヒト及びカニクイザルの血漿を用いる血漿効力アッセイにおける配列を最適化したナノボディの試験
カニクイザルＩＬ−６ＲとのＩＬ６Ｒ６５及びＩＬ６Ｒ７５の交差反応性を評価するために、ｓＩＬ−６Ｒの供給源としてヒト又はカニクイザルの血漿のいずれかを用いて血漿効力ＥＬＩＳＡを行った。このアッセイでは、希釈系列のナノボディを血漿及びヒトＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）とプレインキュベートした。続いて、血漿ｓＩＬ−６ＲをＢＮ−１２コーティングプレート上で捕捉し、ビオチン化ポリクローナル抗体及びストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて結合したＩＬ−６を検出した。
図２３Ａで観察することができるように、ＩＬ６Ｒ２０１及びＩＬ６Ｒ６５の両方がＩＬ−６とヒトｓＩＬ−６Ｒとの結合を完全に遮断することができたが、ＩＬ６Ｒ６５はＩＬ６Ｒ２０１よりも、並びに実施例１に記載の参照ＩｇＧ及び参照Ｆａｂよりも効力が低いと思われた。図２３Ｂで観察することができるように、ＩＬ６Ｒ６５は、実施例１に記載の参照Ｆａｂと同程度の効力でＩＬ−６とカニクイザルｓＩＬ−６Ｒとの結合を完全に遮断することができた。
実施例２８：高いＩＬ−６濃度での血漿効力アッセイにおける配列を最適化したナノボディの試験
ヒト血漿における血漿効力アッセイを、ナノボディが高濃度のＩＬ−６を遮断する能力を試験するのにも使用した。ＩＬ６Ｒ０４、ＩＬ６Ｒ６５及び実施例１に記載の参照ＦａｂをＩＬ−６のＥＣ５０（５０ｎｇ／ｍＬ）で及びＩＬ−６のＥＣ９５（８８５ｎｇ／ｍＬ）で試験した。結果を図２４に示す。明らかに、ＩＬ６Ｒ０４はＩＬ−６のＥＣ５０で最も強力な化合物であると思われた。ＥＣ９５では、参照Ｆａｂ及びＩＬ６Ｒ６５はより高濃度ではあるものの依然として血漿ｓＩＬ−６Ｒを完全に遮断することができ、このことはこれら２つの分子がＩＬ−６結合部位と重複するエピトープと結合することを示している。参照ＦａｂのＩＣ５０は０．５５ｎＭから８．４７ｎＭへと増大し、ＩＬ６Ｒ６５のＩＣ５０は２．６１ｎＭから６６．２５ｎＭへと増大した。
実施例２９：Ｂｉａｃｏｒｅ競合研究
ＩＬ−６及びＩＬ６Ｒ６５がＩＬ−６Ｒと同時に結合することができるかを調べるためにＢｉａｃｏｒｅ実験を行った。参照Ｆａｂ（図２５Ａ）、ＩＬ６Ｒ２０１／７５（図２５Ｂ）又はＩＬ６Ｒ６５（図２５Ｃ）をＩＬ−６Ｒ上で捕捉し、その後ＩＬ−６を複合体に結合させた。参照Ｆａｂ及びＩＬ６Ｒ６５では、ＩＬ−６の結合をほとんど観察することはできなかった。ＩＬ−６をＩＬ−６Ｒ上で捕捉し、ナノボディを注入した場合、３つのナノボディ全てが複合体と結合することができたようであった。しかしながら、参照Ｆａｂ及びＩＬ−６Ｒ６５の場合、このことはおそらくＩＬ−６Ｒに対してＩＬ−６の親和性がより低いことによりＩＬ−６が取って代わられたためであった。
最後に、ＩＬ−６Ｒをナノボディの存在下又は非存在下でＩＬ−６コーティングチップに結合させた（図２５Ｄ）。このことにより、先の結果が確認された、すなわち参照Ｆａｂ又はＩＬ６Ｒ６５の存在下ではＩＬ−６Ｒを捕捉することができなかった。
結論として、Ｂｉａｃｏｒｅエピトープマッピング実験は、参照Ｆａｂ及びＩＬ６Ｒ６５の両方がＩＬ−６と同じエピトープを標的とすることを示した。ＩＬ６Ｒ６５及び参照ＦａｂはＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの結合を完全に遮断することができたが、ＩＬ６Ｒ２０１は、このナノボディが受容体と結合している場合、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの結合を妨げることができなかった。
Ｖ．ＩＬ６Ｒ６５の親和性成熟
実施例３０：親和性成熟のための多様化戦略
ナノボディＩＬ６Ｒ６５のＣＤＲ領域を２つの以下の戦略を用いてランダム化した：
１．各ＣＤＲ残基を類似の側鎖化学構造を有する残基のセットに置き換えた。
Ｋ⇔Ｒ
Ａ⇔Ｓ⇔Ｔ
Ｉ⇔Ｌ⇔Ｖ
Ｆ⇔Ｙ
Ｎ⇔Ｄ
Ｑ⇔Ｅ
Ｇ→Ａ
Ｍ→Ｌ
Ｈ、Ｃ、Ｗ、Ｐは一定に保つ。
２．各ＣＤＲ残基をその位置で自然発生するアミノ酸のパネルに置き換えた。１つの位置当たりの多様性を制限するために、各位置で最も高い頻度で発生するアミノ酸だけを導入した。このアプローチはＣＤＲ１及びＣＤＲ２のランダム化だけに使用した。
上記の２つの戦略を用いてＣＤＲ１及びＣＤＲ２の同時ランダム化を行い、戦略１に従って別々にＣＤＲ３をランダム化し、合計で３つのライブラリを得た。縮重オリゴ（oligos）を用いたＰＣＲ重複伸長により３つ全てのライブラリを自家（in-house）作製した。各々のライブラリの理論的多様性はおよそ１×１０ｅ６であった。ナノボディ変異体をコードする断片をファージ提示ベクターにクローニングした。３つ全てのライブラリの実際のサイズはおよそ１×１０ｅ８であった（理論的多様性の範囲の１００倍）。溶液中における種々の濃度のビオチン化ＩＬ−６Ｒ（０ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ及び１００ｐＭ）を用いて１回の選別を行った。これらの条件下でＣＤＲ３ライブラリに関して濃縮は観察されなかったが、ＣＤＲ１／ＣＤＲ２ライブラリの両方では用量依存的な濃縮が観察された。ＣＤＲ１／ＣＤＲ２ライブラリのアウトプットをＥＬＩＳＡにおいてペリプラズム抽出液として分析し、続いてシグナルが最も高いクローンをＢｉａｃｏｒｅで試験した。ＥＬＩＳＡにおける上位３０個のクローンは２．１×１０ｅ−３ｓ−１〜２．６×１０ｅ−４ｓ−１の解離速度を示した。解離速度が最も緩やかな５つのナノボディをシークエンシングし、発現させ、精製した（図２６）。
実施例３１：ナノボディの発現及び精製
親和性成熟を行ったナノボディを大腸菌において、ｃ−ｍｙｃ、（Ｈｉｓ）６タグ付けタンパク質として２５０ｍｌの培養物量で発現させた。発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、３７℃で４時間継続させた。細胞培養物の遠沈後、ペリプラズム抽出液を沈殿物を凍結融解することにより調製した。これらの抽出液を出発物質として固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）に使用した。ナノボディを１５０ｍＭのイミダゾールでカラムから溶出させ、続いてＨｉｐｒｅｐ２６／１０カラムで脱塩した。
実施例３２：Ｂｉａｃｏｒｅでの親和性成熟を行った変異体の親和性決定
ナノボディＩＬ６Ｒ６５（配列を最適化した）及び５つの親和性成熟を行った変異体をＢｉａｃｏｒｅで分析した。種々の濃度の精製ナノボディの結合曲線を記録し、親和定数を算出するのに用いた。これらの５つのクローンに関するＫｄ値は０．３４ｎＭ〜０．９５ｎＭであったが、これは最良の変異体でのＩＬ６Ｒ６５（親ナノボディ）と比べて１３倍の改善に相当する（図２７）。
実施例３３：血漿効力アッセイにおける親和性成熟を行った変異体の評価
５つ全ての親和性成熟を行ったナノボディ及び配列を最適化したナノボディを血漿効力アッセイでも試験した。このアッセイでは、様々な濃度のナノボディをヒト又はカニクイザルのいずれかに由来する血漿を含有する可溶性のＩＬ−６Ｒ及び固定濃度のヒトＩＬ−６（２．４ｎＭ又は４２ｎＭ）と混合した。１時間のインキュベーション後、混合物を抗ＩＬ−６Ｒモノクローナル抗体ＢＮ−１２（Diaclone）でコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに移した。結合したＩＬ−６の量を続くビオチン化抗ＩＬ−６ポリクローナル抗体（R&D Systems）及びストレプトアビジン−ＨＲＰの添加により求めた。ＴＭＢは基質として用いた。基質変換は４５０ｎｍで測定した（図２８）。
実施例３４：ＴＦ−１アッセイにおける親和性成熟を行った変異体の評価
親和性成熟を行ったナノボディを、細胞表面上のＩＬ−６ＲとのＩＬ−６結合の遮断によるＴＦ−１細胞（ＥＣＡＣＣ番号９３０２２３０７；1989, J. Cell Physiol. 140: 323; 1993, Exp. Cell Res. 208: 35）のＩＬ−６依存性の増殖を阻害する能力に関しても試験した。このため、ナノボディの段階希釈物を固定量のＴＦ−１細胞と３７℃で２時間プレインキュベートした。続いてＩＬ−６を２ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。ＩＬ−６依存性の細胞増殖を７２時間継続させ、トリチウムで標識したチミジンの取り込みにより測定した（図２９）。
親和性成熟を行ったナノボディのＩＣ５０値はＩＬ６Ｒ６５のものよりも最大で１７倍良好であったが、全ての変異体は依然として参照ＩｇＧより効力が低かった。
実施例３５：Ｂｉａｃｏｒｅ競合研究
ＩＬ−６がＩＬ６Ｒ６５及びその親和性成熟を行った変異体のうちの２つ（７Ｄ６及び７Ｃ４）と同時にＩＬ−６Ｒと結合することができるかを調べるために、Ｂｉａｃｏｒｅ実験を行った。これらの実験では、ＩＬ−６ＲをＢＮ−１２コーティングチップ上で捕捉し、ナノボディＩＬ６Ｒ６５（図３０Ａ）、７Ｄ６（図３０Ｂ）又は７Ｃ４（図３０Ｃ）を用いて飽和状態にした。次に、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒ−ナノボディ複合体との結合を１００ｎＭの濃度でサイトカインを注入することにより評価した。さらに、３つのナノボディとＩＬ−６と複合体形成したＩＬ−６Ｒとの結合も求めた。
ＩＬ６Ｒ６５に関する結果（図３０Ａ）はこれまでに観察された結果と同等のものであり、ＩＬ６Ｒ６５及びＩＬ−６がＩＬ−６Ｒ上で同じエピトープを認識することを確認する。予想通り、ＩＬ６Ｒ６５の親和性成熟を行った変異体及びＩＬ−６もＩＬ−６Ｒ上で同じエピトープを認識した（図３０Ｂ、図３０Ｃ）。
実施例３６：さらなる親和性成熟
次に、ＣＤＲ１／ＣＤＲ２及びＣＤＲ３における有益な突然変異の様々な組合せを含有する４７個のナノボディのパネルを作製した。これらの突然変異をＣＤＲランダム化ライブラリから単離された全てのナノボディクローンのタンパク質配列及び解離速度の徹底分析により同定した。これらの第２世代のクローンの解離速度は４．２Ｅ−０４ｓ−１〜４．５Ｅ−０５ｓ−１の範囲であった。最も緩やかな解離速度を示す５つのクローンをさらなる分析のために選択した（２０Ｆ６、２０Ａ１１、２０Ｅ１０、２１Ａ１０、２１Ｄ１１）。配列を図３１に挙げている。
実施例３７：２回親和性成熟を行った変異体のナノボディの発現及び精製
親和性成熟を行ったナノボディを大腸菌において、ｃ−ｍｙｃ、（Ｈｉｓ）６タグ付けタンパク質として２５０ｍｌの培養物量で発現させた。発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘導し、３７℃で４時間継続させた。細胞培養物の遠沈後、ペリプラズム抽出液を沈殿物を凍結融解することにより調製した。これらの抽出液を出発物質として固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）に使用した。ナノボディを１５０ｍＭのイミダゾールでカラムから溶出させ、続いてＨｉｐｒｅｐ２６／１０カラムで脱塩した。
実施例３８：融解温度の決定
ナノボディの温度安定性を熱転移アッセイで分析した。Ｔｍ値は全ての親和性成熟を行ったナノボディで同程度であり、ＩＬ６Ｒ６５と比較してわずかに高かった。Ｔｍ値は表Ｃ−２５に挙げられている。
実施例３９：Ｂｉａｃｏｒｅでの２回親和性成熟を行った変異体の親和性決定
ナノボディＩＬ６Ｒ６５（配列を最適化した）及び５つの親和性成熟を行った変異体に関する動態パラメータをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００で求めた。結合速度（ｋａ）を２つの異なる濃度の精製ナノボディ及びモノクローナル抗体ＢＮ−１２を介してチップ上で捕捉された固定濃度のＩＬ−６Ｒでの結合曲線から求めた。解離速度をチップと共有結合したＩＬ−６Ｒを用いて単一のナノボディ濃度で求めた。ｋａ、ｋｄ及びＫｄに関する値を表Ｃ−２６に挙げている。
実施例４０：ＴＦ−１アッセイにおける２回親和性成熟を行った変異体の評価
２回親和性成熟を行った変異体の生物学的活性をＴＦ１アッセイで評価し、データを図３２に提示する。２回親和性成熟を行ったクローンは１回親和性成熟を行ったクローン７Ｃ４よりも５倍〜８倍高い効力を有しており、実施例１に記載のベンチマーク（benchmark）参照ＩｇＧよりも２．５倍〜４倍強力であった。最良のクローンはＩＣ５０が０．４ｎＭである（ベンチマークと比較して４倍強力な）２０Ａ１１であった。
実施例４１：血漿効力アッセイにおける２回親和性成熟を行った変異体の評価
可溶性ＩＬ−６Ｒの阻害を血漿効力アッセイにおいて高い及び低いＩＬ−６濃度で分析した。２回親和性成熟を行った変異体は血漿効力アッセイにおいて参照ＩｇＧと少なくとも同じくらい強力であり（０．１ｎＭ〜０．２ｎＭ）、これはこのアッセイの感度限界であった。高いＩＬ−６濃度（ＥＣ９５）では、親和性突然変異体は依然としてＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの結合を遮断することができ、参照ＩｇＧより３倍〜４倍強力であると考えられた。このアッセイで１回親和性成熟を行った変異体と２回親和性成熟を行った変異体との間で差異は観察することができなかった。予想通り、試験したクローンは全てカニクイザル交差反応性であった（図３３）。
実施例４２：全血におけるヒトＰＢＭＣとの結合
精製ナノボディＩＬ６Ｒ６５及びＰＭＰ２０Ａ１１をヒトＰＢＭＣとの結合に関してＦＡＣＳで試験した。ビオチン化抗Ｈｉｓモノクローナル抗体及びＰＥ標識したストレプトアビジンを用いて細胞結合を検出した（図３４）。ＩＬ６Ｒ６５及び親和性成熟を行った変異体ＰＭＰ２０Ａ１１の両方が好中球、単球及びリンパ球の亜集団と結合することができた。これはＩＬ−６Ｒの発現プロファイルに一致する。
ＶＩ．親和性成熟を行ったナノボディのフォーマッティング
実施例４３：多価構築物の調製
ＰＭＰ２０Ａ１１をアルブミンと結合するナノボディＡＬＢ８を有する二価及び三価のナノボディとしてフォーマットした。様々なナノボディの概要を表Ｃ−２７に提示する。
実施例４４：ＴＦ−１アッセイにおける膜ＩＬ−６Ｒの中和
第１の実験において、モデル系としてＴＦ−１細胞株を用いて、フォーマットされたナノボディがＩＬ−６Ｒによるシグナル伝達を阻害するかを検証した。ナノボディ２０Ａ１１、ＩＬ６Ｒ３０４、ＩＬ６Ｒ３０５及びＩＬ６Ｒ３０６は膜ＩＬ−６Ｒにより媒介されるＴＦ−１細胞のＩＬ−６誘導性の増殖を用量依存的にかつ完全に遮断する（図３５、表Ｃ−２８）。
これらの結果は、フォーマットされたナノボディが全て膜ＩＬ−６Ｒ活性の阻害に関して実施例１に記載のような参照ＩｇＧと比較してより強力であることを実証している。その一価等価物ＩＬ６Ｒ３０４と比較して、ＩＬ６Ｒ３０５は約７倍強力にＩＬ−６媒介性の応答を阻害し、それによりＩＬ６Ｒ３０５と膜ＩＬ−６Ｒとの強い（avid）相互作用が実証される。ＩＬ６Ｒ３０６はＩＬ６Ｒ３０５よりも効力が低く、ＩＬ６Ｒ３０４よりも２倍良好な効力しか示さない。このことはＩＬ６Ｒ３０６のフォーマットがあまり有益ではないことを実証しており、さらにＩＬ６Ｒ３０６の強い結合が考えにくいことを示している。
次に、フォーマットされたナノボディが依然として病理学的な濃度のＩＬ−６でＩＬ−６Ｒによるシグナル伝達を完全に阻害できたかを検証した。実際、２０Ａ１１、ＩＬ６Ｒ３０４、ＩＬ６Ｒ３０５及びＩＬ６Ｒ３０６は、５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６により誘導されるＴＦ−１細胞の増殖を用量依存的にかつ完全に遮断した（図３６、表Ｃ−２９）。予想通り、ＩＣ５０は１００ＩＵ／ｍＬで行われた実験と比較して変わらなかった。先の結果と一致して、ＩＬ６Ｒ３０５は膜ＩＬ−６Ｒを介したＩＬ−６誘導性のシグナル伝達の遮断において最も効力が高かった。
ナノボディがＩＬ−６Ｒと相互作用する場合、ナノボディとこの受容体との結合が細胞増殖をもたらす細胞活性化を誘導する可能性があるかを検証した。ＴＦ−１細胞を１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６の存在下又は非存在下で過剰量のナノボディとインキュベートした（図３７）。予想通り、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の両方がＩＬ−６媒介性の増殖を完全に阻止した。実際に、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５がバックグラウンド（成長因子の非存在下で測定された３Ｈ−チミジン取り込み）と同じレベルまでＩＬ−６増殖を阻害し、これによりＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５がＩＬ−６の効果を完全に遮断することが実証された。
ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５は成長因子の非存在下ではＴＦ−１細胞の増殖を誘導せず、これによりこれらの化合物がＴＦ−１細胞に対するアゴニスト効果を有しないことが示唆された。
実施例４５：ＥＬＩＳＡにおけるフォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディによるｓＩＬ−６Ｒの中和
構成要素ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１及びそのフォーマットされた変異体がヒトＩＬ−６と血漿ｓＩＬ−６Ｒとの結合を阻止する能力を血漿効力ＥＬＩＳＡで分析した。血漿ｓＩＬ−６Ｒの濃度は変化し得るので、ナノボディの効力を比較するために異なるアッセイ全体にわたり同じ血漿を使用する必要があった。また初めに、滴定したＩＬ−６（titration of IL-6）を血漿中でインキュベートし、ナノボディと共に使用するＩＬ−６の濃度を求めた。ヒト血漿におけるＩＬ−６のＥＣ５０値及びＥＣ９５値をそれぞれ２７．２９ｎｇ／ｍＬ及び８８５ｎｇ／ｍＬと求めた。続いてこれらの濃度を通常濃度及び高濃度のＩＬ−６でのナノボディの効力を試験するのに用いた。
ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１及びフォーマットされた変異体を実施例１に記載のような参照ＩｇＧと比較した。様々なナノボディで得られたＩＣ５０値を表Ｃ−３０に要約する。ＩＬ−６のＥＣ５０では（図３８Ａ、図３８Ｂ）、一価及び二価のＩＬ−６Ｒナノボディの両方が参照ＩｇＧと同じ範囲内であった。ＩＬ６Ｒ３０４は１つだけしか結合部位を有していないが、参照ＩｇＧと同程度のＩＣ５０を有していた（０．２２９ｎＭ対０．２５８ｎＭ）。ＩＬ６Ｒ３０５はＩＬ６Ｒ３０４の２倍の効力を有するようであったが（０．１３７ｎＭのＩＣ５０）、このことはそれが２つの結合部位を有していることと一致している。しかしながら、ＩＬ６Ｒ３０６はＩＬ６Ｒ３０４及び参照ＩｇＧよりも効力が低いようであり、０．４１２ｎＭのＩＣ５０を有していた。
最も考えられることとしては、感度がアッセイ限界に達したということであった。実際、血漿ｓＩＬ−６Ｒの濃度は約３０ｎｇ／ｍＬ又は０．６ｎＭであった。そのため、０．３ｎＭのｓＩＬ−６Ｒしかナノボディにより遮断する必要がなく（５０％血漿）、このことは得ることのできる最小ＩＣ５０が０．１５ｎＭであることを意味している。これは得られたＩＣ５０値に相当する。しかしながら、ＩＬ−６濃度が８８５ｎｇ／ｍＬまで増大したなら、ナノボディがＩＬ−６と競合することがより困難となり、より大きな効力の差異を検出することができるだろう。実際、高いＩＬ−６濃度では、ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５は参照ＩｇＧよりも明らかに効力が高かったが、ＩＬ６Ｒ３０６はそうではなかった（図３８Ｃ、図３８Ｄ）。高濃度及び低い濃度のＩＬ−６でのＩＣ５０の比率を表Ｃ−３０に示す。明らかなことに、参照ＩｇＧ及びＩＬ６Ｒ３０６は他のナノボディよりもＩＬ−６の増大による影響が大きかった。このことはＴＦ−１アッセイでも観察された（実施例４４を参照されたい）。
実施例４６：フォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディと膜ＩＬ−６Ｒとの結合
ＩＬ−６のシグナル伝達を遮断するために、可溶性ＩＬ−６Ｒ及び膜ＩＬ−６Ｒの両方をナノボディにより中和する必要がある。そのため、様々なフォーマットされたナノボディとＩＬ−６Ｒを発現する細胞との結合をフローサイトメトリにより分析した。
ＩＬ−６Ｒを発現するＣＨＯ細胞との結合
ヒトＩＬ−６Ｒを発現する安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、抗ＩＬ−６Ｒナノボディと膜ＩＬ−６Ｒとの結合を分析するのに使用した（図３９Ａ）。ＩＬ−６Ｒ陰性ＣＨＯ細胞を陰性対照として使用した（図３９Ｂ）。４つ全てのナノボディがＩＬ−６Ｒを発現する細胞との結合の飽和を示したが、ＩＬ−６Ｒ陰性細胞では高いナノボディ濃度でも非常に低いシグナルしか検出されなかった。
中央値のＰＥ蛍光をＧｒａｐｈＰａｄにエクスポートし、４ＰＬ曲線を適合させ、ＥＣ５０値を求めた。これらを表Ｃ−３１に要約する。ＴＦ−１アッセイとは対照的に、ＩＬ６Ｒ３０５はこの設定では結合活性効果から利益を受けることはないと考えられた：ＩＬ６Ｒ３０５はＩＬ６Ｒ３０４よりもわずか２倍効力が高いだけであった（０．８９８４ｎＭ対１．９３９ｎＭ）。ＴＦ−１及び血漿ＥＬＩＳＡの場合とも同様に、ＩＬ６Ｒ３０６はＩＬ−６Ｒ陽性細胞にあまり結合しなかった。
末梢血白血球との結合
ヒトＰＢＬを、生理的条件下でのナノボディと膜ＩＬ−６Ｒとの結合を実証するのに使用した。このマトリクスはＨＳＡ（約５０ｍｇ／ｍＬ）、ｓＩＬ−６Ｒ（約３０ｎｇ／ｍＬ）、膜ＩＬ−６Ｒを発現する細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、単球、顆粒球）及びＩＬ−６Ｒ陰性細胞（ほとんどが循環性Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含有しているため、ｉｎ ｖｉｖｏ状況と関連性が高い。ナノボディを２つのドナー由来のＥＤＴＡで処理した血液中でインキュベートし、結合したナノボディをフローサイトメトリにより検出した。リンパ球、単球及び顆粒球をＦＳＣ／ＳＳＣ特性に基づきゲーティングし（図４０）、結合したナノボディをＰＥチャネルで検出した。
図４０（右側）で観察することができるように、顆粒球及び単球をナノボディにより均一に染色した。これに対して、リンパ球は一部だけ染色した。これはＰＥヒストグラムにおいて２重のピークとして見ることができる。様々な濃度のナノボディとインキュベートした後の３つのゲーティングされた集団の平均蛍光を図４１に示し、得られたＥＣ５０値を表Ｃ−３２に要約する。
実施例４７：ヒト及びカニクイザルの血清アルブミンに対するフォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディの親和性
ヒト及びカニクイザルの血清アルブミンに対する二重特異性、二価及び三価のナノボディＩＬ６Ｒ３０４、ＩＬ６Ｒ３０５及びＩＬ６Ｒ３０６の動態分析をＢｉａｃｏｒｅ ３０００機器でＳＰＲにより行った。結果を図４２に示し、表Ｃ−３３に要約した。ナノボディＩＬ６Ｒ３０４、ＩＬ６Ｒ３０５及びＩＬ６Ｒ３０６はヒト及びカニクイザルのＳＡに対して同程度の動態速度定数及び親和性（１７ｎＭ〜２３ｎＭ）を示した。ＳＡに対するフォーマットされたＩＬ−６Ｒナノボディの親和性は、結合速度の２．５倍の低減及び解離速度の２．５倍の増大により一価抗ＳＡナノボディＡＬＢ１１と比較して６．５倍低かった。
実施例４８：ヒト及びカニクイザルのＩＬ−６Ｒに対する親和性
ヒト及びカニクイザルのＩＬ−６Ｒに対する動態分析をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器でＳＰＲにより行った。チップに直接固定化した場合のＩＬ−６Ｒの立体構造変化の示唆により、結合速度をＢＮ−１２により捕捉されたＩＬ−６Ｒで測定した。ナノボディ−ＩＬ−６Ｒ相互作用より解離速度が低いために捕捉ツールの可用性が喪失するので、解離速度を直接固定化したＩＬ−６Ｒで測定した。結果を表Ｃ−３４及び図４３に示す。
２０Ａ１１（ＩＬ６Ｒ３００；配列番号６６）の結合速度は抗ＳＡ構成要素によるフォーマッティング（ＩＬ６Ｒ３０４）により２倍未満低減した。ヒトＩＬ−６Ｒに対するＩＬ６Ｒ３０４に関する解離速度はＢｉａｃｏｒｅ機器の検出限界以下であった。カニクイザルＩＬ−６Ｒでの解離速度はヒトＩＬ−６Ｒでのものより２倍以上高かったが、依然として検出限界付近であった。ＩＬ６Ｒ３０４で算出された親和性はヒトＩＬ−６Ｒで１４ｐＭ以下、及びカニクイザルＩＬ−６Ｒで２５ｐＭであった。
実施例４９：ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１の種交差反応性
ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１及びそのフォーマットされた変異体とカニクイザルｓＩＬ−６Ｒとの交差反応性をカニクイザル血漿を用いた血漿効力ＥＬＩＳＡで分析した。また、競合ＥＬＩＳＡを用いて、ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１とカニクイザル及びマウスのｓＩＬ−６Ｒとの交差反応性を求めた。
血漿効力ＥＬＩＳＡ
初めに、滴定したＩＬ−６をカニクイザル血漿中でインキュベートし、ＩＬ−６のＥＣ５０値を５０．１１ｎｇ／ｍＬと求めた。続いてこの濃度のＩＬ−６をナノボディとカニクイザル血漿ｓＩＬ−６Ｒとの交差反応性を試験するのに使用した。図４４で観察することができるように、ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１及びフォーマットされた変異体は明らかにカニクイザルｓＩＬ−６Ｒと交差反応性であった。同じ傾向（ranking）をヒト血漿でも見ることができ、ヒト血漿対カニクイザル血漿のＩＣ５０値の比率は全ての化合物で同様であった（表Ｃ−３５）。
競合ＥＬＩＳＡ
血漿効力ＥＬＩＳＡはＢＮ−１２がこの特定の種由来の血漿ｓＩＬ−６Ｒを捕捉することができ、かつＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒとの結合を検出することができる場合にしか使用することができない。そのため、より包括的な（generic）競合ＥＬＩＳＡを開発した。このアッセイはＩＬ６Ｒ２０Ａ１１とニュートラアビジンで捕捉されたＩＬ−６Ｒ−ｂｉｏとの結合に基づいていた。簡単に言うと、０．４ｎＭのＩＬ６Ｒ２０Ａ１１を内因性のｓＩＬ−６Ｒを含有する様々な種由来の滴定系列の血漿とプレインキュベートし、その後遊離ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１をニュートラアビジンコーティングプレート上で固定化されたビオチン化ヒトｓＩＬ−６Ｒで捕捉し、抗ＶＨＨモノクローナル抗体：ＦＩＴＣ及び抗ＦＩＴＣ−ＨＲＰにより検出した。０．４ｎＭのＩＬ６Ｒ２０Ａ１１濃度は最大シグナルの５０％をもたらす濃度に相当する（０．３５±０．０２１ｎＭのＥＣ５０；ｎ＝４）。
図４５で観察することができるように、ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１は明らかにカニクイザルｓＩＬ−６Ｒと交差反応性であり、このことがＢｉａｃｏｒｅによる結果を確認している。これに対して、マウスｓＩＬ−６Ｒとの結合は観察することができなかった。ヒト及びカニクイザルの血漿はＩＬ６Ｒ２０Ａ１１と組換えｓＩＬ−６Ｒとの結合とも競合したが、マウス血漿は競合しなかった。実際、高濃度のマウス血漿でシグナルの増大が観察されたが、これはおそらくはこのアッセイでのマウス免疫グロブリンの検出によるものであった。
実施例５０：ＩＬ−６Ｒに対するＩＬ６Ｒ２０Ａ１１の特異性
ＩＬ−６ＲはＩ型サイトカイン受容体ファミリーに属する。これらの受容体のサイトカイン結合領域は保存されているので、ＩＬ−６Ｒに対するＩＬ６Ｒ２０Ａ１１の特異性をＩＬ−６Ｒに関連する受容体との結合を分析することにより分析した。ＩＬ６Ｒ２０Ａ１１とＬＩＦ−Ｒ、ＣＮＴＦ−Ｒ、ＯＳＭ−Ｒ及びＩＬ−１１Ｒ／Ｆｃとの結合を競合結合ＥＬＩＳＡで分析した。図４６で観察することができるように、陽性対照ｓＩＬ−６ＲはＩＬ６Ｒ２０Ａ１１とプレートとの結合を阻害した。ｓＩＬ−６Ｒに対するＩＣ５０（０．０３ｎＭ）は用いられたＩＬ６Ｒ２０Ａ１１の量に基づき予測されたＩＣ５０に一致していた（０．０２５ｎＭ対０．０５ｎＭ）。ＩＬ−６Ｒ関連タンパク質は、１００倍モル過剰（５ｎＭ）であってもＩＬ６Ｒ２０Ａ１１とｓＩＬ−６Ｒとの結合に競合しないと考えられた。同様の設定で、ＣＬＦ−１／ＣＬＣ、ＩＬ１２−ｐ４０、ＩＬ−２７Ｂ及びｇｐ１３０／Ｆｃも、１００ｎＭと高濃度であっても０．０５ｎＭのＩＬ６Ｒ２０Ａ１１と相互作用しないことが示された（結果は示さない）。
ＶＩＩ．ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５のｉｎ ｖｉｖｏでのＰＫ／ＰＤ分析
この研究の目的は単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおける配列を最適化した親和性成熟を行った２つの抗インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）ナノボディ、すなわちＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の血漿薬物動態（ＰＫ）、薬効（pharmacodynamics）（ＰＤ）及び免疫原性を分析することであった。ナノボディの投与後に、ナノボディ投与の２４時間後から始めて７日間毎日組換えヒト（ｈ）ＩＬ−６を皮下注射した。このｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究の最終的な目的はこれらの抗ＩＬ−６ＲナノボディがｈＩＬ−６誘導性のパラメータを阻害する能力を評価し、互いに及び実施例１のベンチマーク参照とそれらの有効性を比較することであった。
非ヒト霊長類及びヒトでは、組換えｈＩＬ−６は急性期タンパク質の合成を誘導すると報告されている。急性期タンパク質は、その血漿濃度が主に肝細胞による産生の変化により炎症に応答して少なくとも２５％増減する或る種類の血漿タンパク質、例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＡ、ハプトグロビン、フィブリノゲン、アルブミン及びトランスフェリンと規定される。サイトカイン産生パターン及び急性期応答は様々な炎症条件で異なる。そのため、急性期変化は炎症の存在及び強度を反映し、それらを診断に関連のあるものにする。急性期タンパク質の産生の主な刺激因子は炎症関連サイトカインであり、これは炎症プロセス中に産生される：ＩＬ−６、ＩＬ−１β、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターフェロン−γ（ＩＮＦ−γ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）及び可能性としてはＩＬ−８。
実施例５１：研究設計
この研究では、２〜３匹の動物の６つの群（群６〜群１１、表Ｃ−３６）にＩＬ６Ｒ３０４又はＩＬ６Ｒ３０５の単回静脈内注射を行った。両方のナノボディで、３つの異なる用量、すなわち０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇを試験した。さらに、群１２の動物（ｎ＝３）はビヒクルを投与され、陰性対照の役割を果たすが、群１３の動物（ｎ＝３）には５ｍｇ／ｋｇの参照ＩｇＧを注射した（表Ｃ−３６）。
ＴＤ１、すなわち試験項目投与の２４時間後から始めて、全ての動物にｈＩＬ−６（５μｇ／ｋｇ；図４７）を１日１回７日間注射した。
血液試料を所定の時点でのｈＩＬ−６の注射の前後で橈側皮静脈又は大伏在静脈を介して回収した（図４７を参照されたい）。ＰＫ分析のためにさらに血液試料をＴＤ０で採取した（表Ｃ−３７を参照されたい）。
実施例５２：ｈＩＬ−６誘導性の急性期応答（第２相）に対するナノボディの効果
ｈＩＬ−６の７日間連続した毎日の注射により急性期応答の誘導に対するナノボディ及び陽性参照ＩｇＧの効果を分析した。読み取り項目（Read-outs）はＣＲＰレベル、フィブリノゲンレベル及び血小板数であった。
陰性対照群（群１２）では、ＣＲＰレベルは１回目のｈＩＬ−６の注射直後に上昇し、２日目で既に最大レベルに達した。達成された最大レベルは０．２ｍｇ／ｍＬ〜０．８ｍｇ／ｍＬであり、このプラトーは最後のｈＩＬ−６注射日の翌日である８日目まで維持された（図４８Ａ）。
これらの変化は５ｍｇ／ｋｇの参照ＩｇＧによる前処理により完全に阻害された（図４８Ｂ）。また同程度の用量（２ｍｇ／ｋｇ）又は５倍用量（１０ｍｇ／ｋｇ）のナノボディＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５による単回の前処理により、実験の全経過中にＣＲＰ誘導のほぼ完全な阻害がもたらされた（図４８Ｃ及び図４８Ｄ）。ＩＬ６Ｒ３０４の最高用量群における番号１８の動物だけが幾らかの誘導を示し、最大血清ＣＲＰレベルが０．１ｍｇ／ｍＬ付近に達した。最低用量群（０．４ｍｇ／ｋｇ）では、両方のナノボディが７日間完全な阻害をもたらした。ＣＲＰレベルは８日目でのみ陰性対照群と同程度のレベルまで増大した（図４８）。全ての群の平均ＣＲＰレベルは図４９に見ることができる。
フィブリノゲンレベルは陰性対照群において基礎レベルの５倍の平均最大値までゆっくりと増大した（図５０Ａ）。この最大値には６日目で到達し、さらに２日間維持された。１４日目では、フィブリノゲンレベルは基礎レベルに戻った。参照ＩｇＧはフィブリノゲンの誘導を完全に阻害することができた（図５０Ｂ）。両方のナノボディはフィブリノゲン誘導の用量依存的な阻害を示した（図５０Ｃ及び図５０Ｄ）。最高用量群では、阻害はＩＬ６Ｒ３０４で前処理した両方の動物で、及びＩＬ６Ｒ３０５で前処理した２匹の動物のうちの１匹でほぼ完全であった。番号２５の動物（１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０５）と両方のナノボディの中程度の用量群及び最低用量群の全ての動物とのフィブリノゲンレベルの増大はほんのわずかであった。しかしながらこれらの動物では、フィブリノゲンレベルは基礎レベルの２〜３倍を決して超えなかった。全ての群の平均フィブリノゲンレベルを図５１に見ることができる。
陰性対照群における全ての動物で、血小板数は５日目からゆっくりと増大した。最大レベルには８日目〜１４日目に到達し、基礎レベルの１６０％〜１９０％であった。血小板数に対するｈＩＬ−６の効果は５ｍｇ／ｋｇの参照ＩｇＧ又は２ｍｇ／ｋｇ以上のナノボディによる単回の前処理により完全に遮断された。血小板数の誘導はナノボディの最低用量群のでのみ観察され、８日目には全ての動物で開始された。ＩＬ６Ｒ３０４では最大誘導は基礎レベルのおよそ１２０％〜１５０％であったが、ＩＬ６Ｒ３０５では最大の血小板数は基礎レベルの１６０％〜１８０％であった（図５２及び図５３）。
結論として、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５は３つ全ての急性期応答パラメータの同様の用量依存的かつ完全な阻害を示した。
実施例５３：カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４又はＩＬ６Ｒ３０５（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与後の血漿濃度
血漿薬物動態（ＰＫ）分析、ＥＬＩＳＡ試料分析のための血液試料をＩＬ６Ｒ３０４又はＩＬ６Ｒ３０５の投与前、及び以下の投与後の時点で採取した：５分及び３０分、３時間及び８時間、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、１４日目、２１日目及び２９日目。
ＩＬ６Ｒ３０４（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）及びＩＬ６Ｒ３０５（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）のカニクイザルへの静脈内投与後の個々で観察された血漿濃度−時間プロットをそれぞれ図５４及び図５５に示す。
実施例５４：カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）の非コンパートメント薬物動態分析
カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）及びＩＬ６Ｒ３０５（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）の非コンパートメントＰＫ分析により得られた基礎ＰＫパラメータの概要を表Ｃ−３８、表Ｃ−３９、表Ｃ−４０、表Ｃ−４１、表Ｃ−４２及び表Ｃ−４３に示す。本明細書で論じられているＰＫパラメータはＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１（Pharsight Corp）を用いた非コンパートメント分析（ＮＣＡ）により得られる。幾つかの動物に関する最終的なパラメータは２つのデータ点のみで算出した（デフォルト設定でＲ２は１である）。
カニクイザルで静脈内投与された両方のナノボディでは、血漿濃度は三段階で低下しているように思われた。投与後最初の２日間で、最初の体内動態（disposition）相があり、その後より緩やかな優位相が続いた。より低い濃度での段階的低下により、短い半減期を特徴とする終末相が生じた。
抗薬物抗体がほとんどのカニクイザルの血漿試料で検出されたので、より低い濃度での最終半減期の変化は免疫媒介性のクリアランス機構と結び付いている可能性がある。しかしながら、これはＰＫプロファイルの検査で起こりそうもないことである：免疫原性が検出されない時点において最低用量で最も短い半減期が観察されている。さらに、より高い用量で検出可能な力価が存在するにもかかわらず、依然として半減期がより長くなる傾向がある（例えば１０ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０４（静脈内））。
ＰＫプロファイル観察結果に基づき、両方のナノボディが少なくとも２つの機構を介して循環血液から除去されることが予測される。このような状況において、線形不飽和クリアランス機構は化合物の非特異的な分解を表す。第２の飽和クリアランス機構は標的により媒介される（例えば膜結合ＩＬ−６Ｒとの薬物結合の内在化、及び続くクリアランス）。より高いナノボディ濃度で、第２のクリアランス機構は線形不飽和クリアランスと比較して飽和しており、かつ無視できる程度のものであることが予測される：線形クリアランスが優位である（優位な半減期をもたらす）。しかしながらより低い濃度では、代謝の速度は所与のナノボディ濃度でより高く、それにより最終傾き（terminal slope）が変化する。
標的により媒介されるクリアランスのために、クリアランス及び半減期のようなＮＣＡ分析で得られるＰＫパラメータは用量依存的及び時間依存的であると考えられる。総クリアランスは最低用量で最も高い：より高い用量でのＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５での１０．４ｍＬ／日／ｋｇ〜９．００ｍＬ／日／ｋｇ及び５．９３ｍＬ／日／ｋｇ〜７．７６ｍＬ／日／ｋｇと比較した０．４ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後のＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５での２４．８ｍＬ／日／ｋｇ及び３５ｍＬ／日／ｋｇ。それに対応して、用量を正規化した曝露は最低用量でより低くなる（用量＝ＣＬ×ＡＵＣ）。
ＩＬ６Ｒ３０４の優位半減期は１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ及び０．４ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後に６．６１日から５．００日及び１．７３日まで低減した。ＩＬ６Ｒ３０５の優位半減期は１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ及び０．４ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後に７．３７日から４．２９日及び１．６４日まで低減した。より早い時点ではより多くのデータ点が利用可能であるために、終末相は最低用量で最も十分に特徴付けられた：０．４ｍｇ／ｋｇのＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の静脈内投与後に、それぞれ０．５３０日及び０．４７０日の短い最終半減期が観察された。
これらのＰＫ所見に基づくと、ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５の薬物動態特性は同様のものであると考えられる。
サル１４ｍ及びサル１５ｆ（２ｍｇ／ｋｇ（静脈内））では試験２９日目で、低いＩＬ６Ｒ３０４濃度レベルが依然として検出可能であった。他のサルのＰＫプロファイルに基づき、これらの観察結果は予期せぬものであった。これは、非常に低い濃度でのみ現れる、第２のタイプの飽和型の標的結合を示している可能性がある。しかしながら、これらの観察結果はＰＫ ＥＬＩＳＡ試料分析の人為的な結果（artifact）である可能性もある。
ＮＣＡ分析を介して算出した報告された分布体積は両方のナノボディでのおよそ４０ｍＬ／ｋｇの血漿体積の１倍〜２倍の範囲と低いものであり、これにより血管空間外での分布の制限が示唆される。しかしながら、真のＶｓｓはＮＣＡと結び付いた方法論的誤差のために過小評価され得る（例えば周辺空間でのナノボディ分布及び続く分解は分布期間ではなく、総全身クリアランスに起因する）。Ｖｓｓは様々な用量レベルでほぼ一定であると思われる。
ＰＫプロファイルに対する標的結合の可能性のある効果を示すために、図５６ではＩＬ６Ｒ３０４（０．４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ（静脈内））及びＩＬ６Ｒ２０２（２ｍｇ／ｋｇ（静脈内）、配列番号７３）の平均ＰＫプロファイルを比較している。例示目的で、ＩＬ６Ｒ２０２（２ｍｇ／ｋｇ（静脈内））のＰＫプロファイルを０．４ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量にも正規化した。ＩＬ６Ｒ３０４はカニクイザルではＩＬ−６Ｒと結合することが示されたが、ＩＬ６Ｒ２０２ではカニクイザルでは標的結合が喪失した（国際公開第０９／０１０５３９号）。これに対応して、線形クリアランスが優位な高濃度では、両方のナノボディのプロファイル（及び対応する半減期）は同様なものである。より低い濃度では、ＩＬ６Ｒ３０４ではおそらく標的媒介性のクリアランスにより傾きの段階的変化が観察されるが、ＩＬ６Ｒ２０２では最終傾きは変化しない。しかしながら、より低い濃度のＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５は、特に高いＩＬ−６Ｒレベルが存在する場合、ＰＫ ＥＬＩＳＡでのＩＬ−６Ｒ干渉により幾らか過小評価される可能性もある。
実施例５５：抗ＩＬ６Ｒ３０４抗体及び抗ＩＬ６Ｒ３０５抗体の検出
ＩＬ６Ｒ３０４又はＩＬ６Ｒ３０５の投与前及び投与後様々な日数で採取された一連の血漿試料を、ナノボディ又はその１つ又は複数の構成要素と結合することが可能であるサル抗体（ＩｇＧアイソタイプ）の存在に関してスクリーニングした。ＩＬ６Ｒ３０４を投与した動物由来の試料を、ＩＬ６Ｒ３０４（図５７）、ＩＬ６Ｒ３００（図５８）又はＡＬＢ８（図５９）のいずれかでコーティングしたプレート上で分析した。ＩＬ６Ｒ３０５を投与した動物由来の試料を、ＩＬ６Ｒ３０５（図６０）、ＩＬ６Ｒ３００（図６１）又はＡＬＢ８（図６２）のいずれかでコーティングしたプレート上で分析した。
完全なナノボディ（ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５）に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）発生（appearance）の概要を表Ｃ−４４に示す。ＩＬ６Ｒ３００及びＡｌｂ８に対してはより低い応答しか又は全く応答が見られなかった。結論として、ＩＬ６Ｒ３０４の静脈内注射後、ＡＤＡは全てのサルで検出可能であった（投与前の値が高いためにＡＤＡを決定することができなかった１６番の動物を除く）。０．４ｍｇ／ｋｇで投与したサルでの投与の１週間後、並びに２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで投与したサルでの投与の２週間後、抗体が発生した。最も高いＡＤＡ力価は番号１１及び番号１３の動物で得られた（両方とも０．４ｍｇ／ｋｇの用量）。ＩＬ６Ｒ３０５の静脈内注射後、ＡＤＡは全てのサルで検出可能であった（ＡＤＡが検出されなかった２３番の動物を除く）。０．４ｍｇ／ｋｇでの投与したサルでの投与の１週間後、並びに２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇでの投与したサルで投与の２週間後、抗体が発生した。最も高いＡＤＡ力価は番号２２及び番号２４の動物（両方とも２ｍｇ／ｋｇの用量）並びに番号２５及び番号２６の動物（両方とも１０ｍｇ／ｋｇの用量）で得られた。
実施例５６：ｓＩＬ−６Ｒレベルに対するナノボディの効果
公的に利用可能なデータ（Nishimoto etal., 2008, Blood 112（10）:3959-64）に基づき予想されるように、参照ＩｇＧによる処理により血漿ｓＩＬ−６Ｒの増大がもたらされるが、ビヒクルによる処理では増大しなかった（図６３Ａ）。同様に、低用量のＩＬ６Ｒ３０４は３匹のサル全てでｓＩＬ−６Ｒレベルの迅速な増大を誘導した（図６３Ｂ）。ＩＬ６Ｒ３０５で処理した動物では、血漿ｓＩＬ−６Ｒも増大したが、他の処理群ほど顕著ではなかった（図６３Ｃ）。
ＶＩＩＩ．ＩＬ６Ｒ３０４の有効性
実施例５７：有効性研究におけるｓＩＬ−６Ｒレベルに対するナノボディの効果
血漿における総ｓＩＬ−６Ｒレベル（遊離型、ナノボディ結合型及びＩＬ−６結合型）をＥＬＩＳＡで測定した。公開データ（Nishimoto et al., 2008, Blood 112（10）: 3959-64）に基づき予想されるように、参照ＩｇＧによる処理により血漿ｓＩＬ−６Ｒの増大がもたらされたが、ビヒクルによる処理では増大しなかった（図６４Ａ）。同様に、ナノボディで処理した動物全てがｓＩＬ−６Ｒレベルの迅速な増大を示した。これは遊離ｓＩＬ−６Ｒと比較した参照ＩｇＧ−ｓＩＬ−６Ｒ複合体又はナノボディ−ｓＩＬ−６Ｒ複合体のより緩やかなクリアランスにより説明することができる。
最大ｓＩＬ−６Ｒレベル及び効果持続期間は明らかに用量依存的であった。また、ナノボディの効果は参照ＩｇＧのものよりも顕著であると考えられる（図６４において２ｍｇ／ｋｇの用量のナノボディと参照ＩｇＧとを比較されたい）。これはおそらく抗体免疫複合体のより迅速なＦｃ媒介性の除去により説明することができる。しかしながら驚くべきことに、ｓＩＬ−６Ｒ及び効果持続期間の増大はＩＬ６Ｒ３０５（図６４Ｂ）と比較してＩＬ６Ｒ３０４（図６４Ａ）でより顕著であった。
実施例５８：有効性研究におけるＩＬ−６レベルに対するナノボディの効果
血漿における総ＩＬ−６レベル（遊離型、ｓＩＬ−６Ｒ結合型）をＧｙｒｏｌａｂプラットフォームにより測定した。このアッセイでは、ビオチン化ラット抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体をＩＬ−６を捕捉するのに使用し、Ａｌｅｘａで標識したマウス抗ヒトＩＬ−６モノクローナル抗体を検出するのに使用した。このアッセイは、内因性カニクイザルＩＬ−６及び１日目〜８日目に毎日注射した組換えヒトＩＬ−６の両方を測定する。このため、１日目までに測定することができるＩＬ−６（＝内因性のカニクイザルＩＬ−６のみ）と２日目〜２９日目のＩＬ−６（＝投与されたヒトＩＬ−６＋内因性のカニクイザルＩＬ−６）とを区別する必要がある。
図６５で観察することができるように、ＩＬ６Ｒ３０４、ＩＬ６Ｒ３０５、参照ＩｇＧ及びわずかにプラシーボの投与により、投与後８時間でピークに達したＩＬ−６の一時的な増大がもたらされた。しかしながら、この増大はナノボディで処理した群で顕著に高かった。無関連のナノボディの投与によっても一時的にＩＬ−６応答がもたらされた（図６５Ｄ）ため、ＩＬ−６に対する効果はＩＬ−６Ｒを標的とするナノボディに特異的なものではないと考えられた。ＩＬ−６の初期増大はおそらく動物の取扱いによるストレス、及び可能性としてはナノボディ調製物中の微量のエンドトキシンによるＩＬ−６産生のさらなる増大により説明することができる。
ＩＬ−６処理期間中、毎日ＩＬ−６を注射する前に毎回血液をサンプリングした。ナノボディ又は参照ＩｇＧではなくＩＬ−６を投与したプラシーボ群では、ほとんどＩＬ−６が検出されなかった（図６５Ｃ）。このことは皮下注射後のヒトＩＬ−６の短い半減期と一致している（Tsigos, et al., 1997, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 4167-70）。しかしながら、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの参照ＩｇＧ、ＩＬ６Ｒ３０４又はＩＬ６Ｒ３０５で処理した全ての動物で、２日目〜８日目でＩＬ−６を検出した。このことはＩＬ−６の受容体媒介性のクリアランスの遮断、それによるその半減期の長期化により説明することができる（Nishimoto et al., 2008, Blood 112（10）: 3959-64）。したがって、循環するＩＬ−６はＩＬ−６Ｒの中和に関する薬力学的バイオマーカーの機能を果たし得る。
ＩＸ．ＩＬ６Ｒ３０４の薬効
実施例５９：カニクイザルにおける単回投与後の薬力学的効果
ｓＩＬ６Ｒ血漿濃度の変化を、健常な（すなわち非刺激）カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の単回静脈内投与後でも測定した。この単回投与ＰＫ／ＰＤ研究では、用量は１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であった。血液サンプリングを薬力学的分析、免疫原性分析及び薬効分析のために行った。ＥＬＩＳＡベースのアッセイを総ｓＩＬ６Ｒレベルを測定するのに使用し、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）プラットフォームを用いたリガンド結合アッセイを遊離ｓＩＬ６Ｒレベルを測定するのに使用した。総ｓＩＬ６Ｒアッセイのために、非中和抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体をｓＩＬ６Ｒ（遊離型＋複合体）を捕捉するのに、ストレプトアビジン−ＨＲＰと組み合せたビオチン化ポリクローナル抗ＩＬ６Ｒツールを検出のために使用した。遊離ｓＩＬ６Ｒアッセイのために、ビオチン化２０Ａ１１構成要素を遊離ｓＩＬ６Ｒを捕捉するのに、Ａｌｅｘａで標識した非中和抗ＩＬ６Ｒモノクローナル抗体を検出のために使用した。
単回投与ＰＫ／ＰＤ研究の結果により、（ｉ）最大の総ｓＩＬ６Ｒ濃度（図６６Ａ）、（ｉｉ）（総ｓＩＬ６Ｒの増大の持続期間（図６６Ａ）及び（ｉｉｉ）遊離ｓＩＬ６Ｒの抑制の持続期間（図６６Ｂ）に対するＩＬ６Ｒ３０４の用量依存的な効果が確認された。概して、総ｓＩＬ６Ｒ濃度及び遊離ｓＩＬ６Ｒ濃度は所定の時間後ベースラインレベルまで戻った（用量依存的に；最も長い上昇及び抑制が最大用量で見られる）。１ｍｇ／ｋｇと低用量のＩＬ６Ｒ３０４の投与後の遊離ｓＩＬ６Ｒの濃度はおよそ８日間減少し、それからビヒクルで処理した動物のものを超える濃度まで増大した。
総ｓＩＬ６Ｒレベルと、遊離ｓＩＬ６Ｒレベル（ＰＤ）と、ＩＬ６Ｒ３０４濃度との間で良好な逆相関が観察され、これによりｓＩＬ６Ｒを活性薬物の存在に関するバイオマーカーとして使用することができることが確認された。図６７は３つのパラメータ間の相互作用（interplay）を明らかにする１つの例を示す（中程度の用量群でベースラインレベルへの回復を実証することができるので、この群を選択した）：ＩＬ６Ｒ３０４の投与により総ｓＩＬ６Ｒ濃度の増大がもたらされ、安定化された薬物−ｓＩＬ６Ｒ複合体が形成された。ＩＬ６Ｒ３０４血漿濃度が低減すると、同時に複合体形成した受容体から構成されるほとんどの総ｓＩＬ６Ｒと同様、総ｓＩＬ６Ｒの濃度も低減した。このことは循環血液からＩＬ６Ｒ３０４が排除される際に基礎レベルへと回復する低い遊離ｓＩＬ６Ｒ濃度により確認される。低い遊離ｓＩＬ６Ｒ濃度により、測定された総ｓＩＬ６Ｒが実際に不活性であり、ＩＬ６Ｒ３０４と複合体形成していることが確認される（図６７）。
実施例６０：ＰＫ／ＰＤモデリングによる薬力学的効果の説明
総ｓＩＬ６Ｒレベルに対するＩＬ６Ｒ３０４投与の影響はＩＬ６Ｒ３０４と受容体との直接結合により説明することができ、複合体はＩＬ６Ｒ３０４の半減期延長部分（すなわちアルブミン結合）を介して循環血液中に留まる。総ｓＩＬ６Ｒ濃度の測定可能な変化は時間遅延動態に従うので、間接的な応答モデルは、ＰＫ／ＰＤ関係性を最も良く説明しており、ｓＩＬ６Ｒ−ＩＬ６Ｒ３０４複合体レベルの集積に対する静脈内投与したＩＬ６Ｒ３０４の効果を説明するのに使用された。このモデルは、ＩＬ６Ｒ３０４と結合する場合のｓＩＬ６Ｒの排除の阻害に起因する薬物応答を説明している。この間接的な応答モデルでは、総ｓＩＬ６Ｒ−ＩＬ６Ｒ３０４複合体の変化速度（応答Ｒ）は、
Figure 0005647222
 （Ｋｉｎ、ゼロ次合成速度；Ｒ、総ｓＩＬ６Ｒ；Ｉｍａｘ、最大阻害；Ｃ、ＩＬ６Ｒ３０４血漿濃度；ｎ、用量応答形状因子；及びＫｏｕｔ、ｓＩＬ６Ｒの一次排除速度定数）により説明される。
単回投与ＰＫ／ＰＤ研究による利用可能な静脈内の総ｓＩＬ６Ｒデータを全て、間接的な応答ＰＫ／ＰＤモデルの入力関数として実施例６１に記載のような薬物動態関数を用いたモデル（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１、Pharsight Corporation, Mountain View California, USA）に同時に適合させた。
図６８は１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後のカニクイザルにおける個々の観察された及びモデル予測された総ｓＩＬ６Ｒ濃度−時間データを示す。カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の推定薬力学的パラメータを表Ｃ−４５に挙げている。全てのパラメータを５０％未満のＣＶ％値により示されるように十分な精度で推定した。
単回投与ＰＫ／ＰＤ研究による静脈内投与後のデータを全て、ｓＩＬ６Ｒ、ＩＬ６Ｒ３０４、及びｓＩＬ６Ｒ−ＩＬ６Ｒ３０４の複合体の挙動を説明する間接的な応答モデルに同時に適合させた。
ｓＩＬ６Ｒの平均半減期はおよそ５．８時間（＝ｌｎ２／Ｋｏｕｔ（Ｋｏｕｔ＝Ｋｉｎ／Ｒ０））であると推定され、推定産生速度は２．４９ｎｇ／ｍＬ／時間であった。ＩＬ６Ｒ３０４は一次経路によりｓＩＬ６Ｒの排除をほぼ完全に阻害することができた（Ｉｍａｘ＝９７％）。そのため排除速度はカニクイザル血清アルブミンのものと相関関係にある新たな最大減少したｋｏｕｔまで変化した。続いて総ｓＩＬ６Ｒの新たな基礎レベルが確立された。推定ＩＣ５０が１２５ｎｇ／ｍＬすなわち４．４８ｎＭであるので、ＩＬ６Ｒ３０４はカニクイザルにおける複合体形成していないｓＩＬ６Ｒの排除の強力な阻害因子であることが示された。
Ｘ．ＩＬ６Ｒ３０４の薬物動態
実施例６１：カニクイザルにおける薬物動態
この項は１つの交差反応種（カニクイザル）における静脈内投与したＩＬ６Ｒ３０４の薬物動態挙動を特性決定するデータを要約する。
健常な（非誘導性）カニクイザルでは、正規の（qualified）ＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光免疫測定（dissociation enhanced lanthanide fluoro-immunoassay））法を用いてＩＬ６Ｒ３０４の濃度を測定した。活性のあるＩＬ６Ｒ３０４の総濃度をＩＬ６Ｒ依存アッセイにより測定した。
単回投与ＰＫ／ＰＤ研究では、ＩＬ６Ｒ３０４を健常な雄カニクイザルに０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇの単回静脈内ボーラスとして投与した。ＰＫ、ＡＤＡ（抗薬物抗体）及びＰＤの分析目的で血液試料を投与前及び投与後の選択された時点で全ての動物から回収した。ＰＫ、ＰＤ及びＡＤＡのために試料を分析した（実施例６２も参照されたい）。
有効な電気化学発光（ＥＣＬ）架橋スクリーニング及び立体構造アッセイを抗ＩＬ６Ｒ３０４抗体を検出するのに使用した。簡単に言うと、ＩＬ６Ｒ３０４をＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ２４００を用いて同種のアッセイフォーマットで抗薬物抗体（ＡＤＡ）を捕捉及び検出するのに使用した。
ＰＫ分析のために、ＩＬ６Ｒ３０４をストレプトアビジンコーティングプレート上でビオチン化抗ナノボディツール（３Ｅ８ｂｉｖ−ｂｉｏ）により捕捉した。標的ＩＬ６Ｒとの複合体形成工程後、ＩＬ６Ｒに対するユーロピウムで標識したモノクローナル抗体を増強溶液中で蛍光シグナルを発生させるのに使用した。
ＩＬ６Ｒ３０４の平均血漿濃度−時間プロファイルを図６９に示す。１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇの単回静脈内ボーラス投与後のＩＬ６Ｒ３０４の重要な薬物動態パラメータの要約を表Ｃ−４６に示す。
静脈内投与後の薬物動態プロファイルは三段階の低下を示した。投与後最初の２日間で、分布相が観察され、その後より緩やかな優位相及びより迅速な終末相が続いた。分布相は迅速な分布（浅部コンパートメント）及び緩やかな分布（深部コンパートメント）にさらに分けることができる。排除相に基づき、ＩＬ６Ｒ３０４は２つの機構、すなわち線形不飽和型クリアランス機構（非特異的な排除すなわちＣＬＮＯＮ−ＩＬ６Ｒ）及び非線形飽和型クリアランス機構（標的媒介性の又は特異的な排除すなわちＣＬＩＬ６Ｒ）により除去されると推測される。非線形飽和型クリアランス機構は膜結合ＩＬ６Ｒに結合したＩＬ６Ｒ３０４の内在化、及び続くＩＬ６Ｒ３０４−ｍＩＬ６Ｒ複合体のクリアランスの結果であり得る。
ＩＬ６Ｒ３０４のクリアランスは飽和型経路と不飽和型経路との組合せであるので、カニクイザルにおける血漿中の動態は用量依存的でかつ所与の用量レベルで時間依存的でもある半減期を伴う非線形的な挙動を示した。
ＣＬＩＬ６Ｒが飽和状態である場合、ＣＬ全体は主にＣＬＮＯＮ−ＩＬ６Ｒにより求められ、カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の報告された半減期は５．８日〜８．９日の範囲であり、カニクイザル血清アルブミンで報告されたものと同程度であった（Nguyen et al., 2006, Protein Eng. Des. Sel. 19: 291）。このことはＩＬ６Ｒ３０４のアルブミン結合部分とカニクイザルアルブミンとの期待された及び確認された交差反応性に一致していた。
単回投与後の平均曝露は、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの間及び１０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの間では用量に比例する場合に比べ幾らか大きく増大し、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間では用量に比例して増大した。１００ｍｇ／ｋｇの用量群には１匹の動物しか含まれていなかったため、この用量群の結果は注意して扱わなければならない。全体として、１つの用量群当たりのサルの数には限りがあるため、用量比例評価は予備的なものだった。
ＩＬ６Ｒ３０４とｓＩＬ６Ｒとの結合により、ｓＩＬ６ＲとｓＩＬ６Ｒ−ＩＬ６Ｒ３０４複合体とで構成されるｓＩＬ６Ｒの測定される総濃度が増大したが、この増大はｓＩＬ６Ｒ単独と比較して複合体のクリアランスがより緩やかであることによると考えられる。
利用可能な免疫原性、ＰＫ及びＰＤデータに基づき、新たに出現するＡＤＡが最高用量群由来の２匹の動物（動物１５及び動物１７）においてＩＬ６Ｒ３０４のＰＫ／ＰＤプロファイルに影響を与えると思われると結論付けた。両方の動物が測定可能なＡＤＡの出現と同時に起こり、薬力学的効果の低減を伴うＩＬ６Ｒ３０４血漿レベルの予期せぬ低減を示した。そのため、これらの動物はＰＫ／ＰＤ分析では検討に入れなかった。他の動物で新たに出現するＡＤＡはＰＫ／ＰＤプロファイルに対して明らかな効果を有しないと思われたので、これらのデータはこの分析に含められた。
１ｍｇ／ｋｇの用量群における１匹の動物（動物３）では、標的媒介性のクリアランスは観察されなかったが、このことはこの低用量では予測されるものだった。５ｍｇ／ｋｇの用量群における１匹の動物（動物６）では、用量がより高く、かつこの経路の飽和が予測されるにもかかわらず、標的媒介性のクリアランスが依然として観察された。動物間の内因性ＩＬ６Ｒ濃度の変動性が高い可能性があるので、標的媒介性のクリアランスは個体間の高い変動性の影響を受ける可能性がある。さらに、ＩＬ６Ｒ３０４濃度が推定ＫＭ値（ここでは０．７１８μｇ／ｍＬ）に近い場合、ＩＬ６Ｒ３０４濃度の小さい変化により非線形クリアランスが大きく変化する。両方の組合せにより、最終半減期値の高い変動性に反映される、より低い用量群での標的又は非標的媒介性のクリアランスの兆候を測定することができる。生物学的変動性により適用した方法の精度の有意な評価が排除されるため、動物３及び動物６のＰＫパラメータは記述統計から排除した（表Ｃ−４６）。
プラシーボ群由来の動物はＩＬ６Ｒ３０４に全身的に曝露させなかった。ＩＬ６Ｒ３０４で処理した動物の投与前試料は全て定量下限（ＬＬＯＱ）未満であった。活性処理群由来の動物は用量レベルの増大に伴いＩＬ６Ｒ３０４の血漿濃度の増大を示した。最大の平均総曝露（ＡＵＣｉｎｆ）は最高用量群（１００ｍｇ／ｋｇ）で観察され、５４０６１２μｇ・時間／ｍＬであった。
平均の用量で正規化したＡＵＣｉｎｆ値は５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間の用量範囲にわたり用量に比例して増大し、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの間及び１０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの間で用量に比例する場合に比べ幾らか大きく増大した（それぞれ１．３倍及び１．４倍）。最高用量群には１匹の動物しか含まれていなかったため、２５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間での用量に比例する場合に比べ大きな増大は注意して扱わなければならない。全体として、１つの用量群当たりのサルの数には限りがあるため、用量比例評価は予備的なものだった。
特に、非コンパートメント分析のデータは、試験されたより高い用量レベルと比較した際１ｍｇ／ｋｇの用量レベルで半減期の差異を示した。このことは非飽和型の機構が主であるより高い用量と比較して飽和型の標的媒介性のクリアランス機構の寄与がより高いことに起因する。
排除相に基づくと、ＩＬ６Ｒ３０４は２つの機構、すなわち線形クリアランス機構及び非線形クリアランス機構により除去されると推測される。線形クリアランス機構はＩＬ６Ｒ３０４の非飽和型の非ＩＬ６Ｒ媒介性の除去に関連すると考えられ、ＩＬ６Ｒ３０４の緩やかなかつ非特異的なタンパク質分解に対応する。非線形のＩＬ６Ｒ媒介性クリアランスプロセスは、おそらくはＩＬ６Ｒ３０４と膜結合ＩＬ６Ｒとの結合、並びに続く内在化及びクリアランスを示す飽和型のクリアランス機構である。
カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の非線形薬物動態挙動を、中央のコンパートメントからの線形クリアランス及び非線形クリアランスを伴う開放型の（open）３コンパートメント薬物動態モデルにデータを適合させることにより把握した。構造モデルを図７０に示す。
単回投与ＰＫ／ＰＤ研究による利用可能な個々の静脈内の血漿濃度データを全て、反復的再重み付け（re-weighting）（１／ｙ×ｙ）（式中、ｙは予測血漿濃度である）を用いたモデル（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．１（Pharsight Corporation, Mountain View California, USA））に同時に適合させた。図７１は１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後のカニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の個々で観察された及びモデル予測した血漿濃度−時間プロットを示す。ＩＬ６Ｒ３０４の推定薬物動態パラメータを表Ｃ−４７に挙げている。
単回投与ＰＫ／ＰＤ研究によるデータを全て、中央のコンパートメントからの線形クリアランス（ＣＬＮＯＮ−ＩＬ６Ｒ）及び非線形クリアランス（ＣＬＩＬ６Ｒ）を伴う開放型の３コンパートメントモデルに同時に適合させた。低いＩＬ６Ｒ３０４濃度（Ｃ＜＜＜Ｋｍ）では、ＩＬ６Ｒ媒介性のクリアランス（ＣＬＩＬ６Ｒ）の寄与が優位であり、Ｖｍａｘ／Ｋｍに等しい。高いＩＬ６Ｒ３０４濃度（Ｃ＞＞＞Ｋｍ）では、ＩＬ６Ｒ媒介性のクリアランス経路は飽和状態になり、最大質量代謝回転（maximum mass turnover）（すなわちＶｍａｘ）で進行する。結果として、総クリアランス（ＣＬ）は線形の非ＩＬ６Ｒ媒介性経路（ＣＬＮＯＮ−ＩＬ６Ｒ）が優位となる。
クリアランスにおける非線形のＩＬ６Ｒ媒介性の構成要素はカニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の半減期の時間依存性及び用量依存性の両方を説明する。
表Ａ−１：ＣＤＲ配列の好ましい組合せ
Figure 0005647222
表Ｂ−１：参照化合物を構成するアミノ酸配列
Figure 0005647222
表Ｂ−２：抗ＩＬ−６Ｒナノボディのタンパク質配列
Figure 0005647222
表Ｂ−３：多価抗ＩＬ−６Ｒナノボディのタンパク質配列
Figure 0005647222
Figure 0005647222
表Ｂ−４：配列を最適化したナノボディのタンパク質配列
Figure 0005647222
表Ｂ−５：親和性成熟を行ったナノボディのタンパク質配列
Figure 0005647222
表Ｂ−６：フォーマットされた親和性成熟を行った／配列を最適化したナノボディのタンパク質配列
Figure 0005647222
表Ｂ−７：アルブミンと結合するナノボディの好ましいが、非限定的な例
Figure 0005647222
表Ｂ−８：リンカーの配列リスト
Figure 0005647222
表Ｃ−１：ＩＬ−６Ｒと結合するナノボディの単離に使用した材料
Figure 0005647222
表Ｃ−２：免疫付与スケジュール
Figure 0005647222
表Ｃ−３：免疫付与ラマから得られたナノボディライブラリの特徴
Figure 0005647222
表Ｃ−４：ナノボディの選択に用いられる条件
Figure 0005647222
表Ｃ−５：スクリーニング統計
Figure 0005647222
表Ｃ−６：阻害ナノボディのｋｏｆｆ値
Figure 0005647222
表Ｃ−７：ナノボディ細胞培養物の収率
Figure 0005647222
表Ｃ−８：選択されたナノボディのＩＣ５０値
Figure 0005647222
表Ｃ−９：選択された１４個の阻害抗ＩＬ−６Ｒナノボディサブセットに関する動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−１０：ＸＧ−１細胞増殖のナノボディ阻害に関するＩＣ５０値
Figure 0005647222
表Ｃ−１１：ＴＦ１細胞増殖のナノボディ阻害に関するＩＣ５０値
Figure 0005647222
表Ｃ−１２：アルファスクリーンアッセイで決定されるようなＩＬ−６Ｒとの結合に関する参照Ｆａｂとの競合
Figure 0005647222
表Ｃ−１３：ナノボディ特性の概要
Figure 0005647222
表Ｃ−１４：フォーマットされたナノボディの番号付け（Nomenclature）（番号）
Figure 0005647222
表Ｃ−１５：二重特異性の抗ＩＬ−６Ｒナノボディの発現収率
Figure 0005647222
表Ｃ−１６：アルファスクリーン競合アッセイにおける二価ナノボディのＩＣ５０値
Figure 0005647222
表Ｃ−１７：ＸＧ−１増殖アッセイにおけるフォーマットされたナノボディのＩＣ５０値
Figure 0005647222
表Ｃ−１８：ＩＬ−６Ｒ結合の動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−１９：様々な種由来の血清アルブミンとの結合に関するフォーマットされたナノボディのＫｄ値
Figure 0005647222
表Ｃ−２０：ＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体の動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−２１：ＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体のｋｏｆｆ値
Figure 0005647222
表Ｃ−２２：ＩＬ６Ｒ０３、ＩＬ６Ｒ０４及びＩＬ６Ｒ１３の配列を最適化した変異体の動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−２３：ＸＧ−１アッセイにおける配列を最適化したナノボディ及び野生型ナノボディのＩＣ５０値
Figure 0005647222
表Ｃ−２４：カニクイザルＩＬ−６Ｒとのナノボディ結合の動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−２５：ＩＬＲ６５及び親和性成熟を行ったＩＬ−６ＲナノボディのＴｍ値
Figure 0005647222
表Ｃ−２６：ＩＬ６Ｒ６５及び親和性成熟を行った変異体の親和性に関する動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−２７：親和性成熟を行った抗ＩＬ６Ｒナノボディのフォーマット
Figure 0005647222
表Ｃ−２８：１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６でのＴＦ−１増殖アッセイにおけるフォーマットされたナノボディ対参照の効力
Figure 0005647222
表Ｃ−２９：５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−６でのＴＦ−１増殖アッセイにおけるフォーマットされたナノボディの効力
Figure 0005647222
表Ｃ−３０：ヒト血漿におけるｓＩＬ−６ＲとのＩＬ−６結合の中和に関するフォーマットされたナノボディのＩＣ５０値（ｎＭ）
Figure 0005647222
表Ｃ−３１：フォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディとＣＨＯ ４Ｄ５（４ＰＬ）との結合に関するＥＣ５０値（ｎＭ）
Figure 0005647222
表Ｃ−３２：フォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディと２つのドナー由来のＰＢＬとの結合に関するＥＣ５０値（ｎＭ）
Figure 0005647222
表Ｃ−３３：フォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディとヒト及びカニクイザルの血清アルブミンとの結合に関する動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−３４：フォーマットされた親和性成熟を行ったナノボディとヒト及びカニクイザルのＩＬ−６Ｒとの結合に関する動態パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−３５：カニクイザル及びヒトの血漿におけるｈＩＬ−６と血漿ｓＩＬ−６Ｒとの結合の中和に関するＩＣ５０値（ｎＭ）の比較
Figure 0005647222
表Ｃ−３６：ＩＬ６Ｒ３０４及びＩＬ６Ｒ３０５のｉｎ ｖｉｖｏでのＰＫ／ＰＤ分析のための投与群
Figure 0005647222
表Ｃ−３７：ＰＫ分析のためのサンプリング時間
Figure 0005647222
表Ｃ−３８：カニクイザルにおける０．４ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内ボーラス投与後のＩＬ６Ｒ３０４の基礎ＰＫパラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−３９：カニクイザルにおける２ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内ボーラス投与後のＩＬ６Ｒ３０４の基礎ＰＫパラメータ。幾つかの動物に関する最終パラメータを２つのデータ点のみで算出した（デフォルト設定でＲ２は１である）。
Figure 0005647222
表Ｃ−４０：カニクイザルにおける１０ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内ボーラス投与後のＩＬ６Ｒ３０４の基礎ＰＫパラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−４１：カニクイザルにおける０．４ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内ボーラス投与後のＩＬ６Ｒ３０５の基礎ＰＫパラメータ。幾つかの動物に関する最終パラメータを２つのデータ点のみで算出した（デフォルト設定でＲ２は１である）。
Figure 0005647222
表Ｃ−４２：カニクイザルにおける２ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内ボーラス投与後のＩＬ６Ｒ３０５の基礎ＰＫパラメータ。幾つかの動物に関する最終パラメータを２つのデータ点のみで算出した（デフォルト設定でＲ２は１である）。
Figure 0005647222
表Ｃ−４３：カニクイザルにおける１０ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内ボーラス投与後のＩＬ６Ｒ３０５の基礎ＰＫパラメータ。幾つかの動物に関する最終パラメータを２つのデータ点のみで算出した（デフォルト設定でＲ２は１である）。
Figure 0005647222
表Ｃ−４４：完全なナノボディに対する抗ＩＬ６Ｒ３０４抗体及び抗ＩＬ６Ｒ３０５抗体の発生の概要
Figure 0005647222
表Ｃ−４５：カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の薬力学的パラメータ
Figure 0005647222
表Ｃ−４６：１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇでの単回静脈内ボーラス投与後のカニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の平均（±標準偏差）の重要なＰＫパラメータの概要
Figure 0005647222
表Ｃ−４７：カニクイザルにおけるＩＬ６Ｒ３０４の薬物動態パラメータ
Figure 0005647222

Claims (12)

  1. 配列番号６５〜配列番号６９のうちの１つからなるポリペプチド
    からなる群から選択される、ＩＬ−６Ｒに指向性を有するポリペプチド。
  2. 化合物又は構築物であって、１つ又は複数の請求項１に記載のポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結した、１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
  3. 前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位は半減期が増大した化合物又は構築物を提供し、かつ前記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、血清免疫グロブリン又はＩｇＧと結合することができる、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適なポリペプチド、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適なポリペプチド、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適なポリペプチド、又はナノボディからなる群から選択される、請求項２に記載の化合物又は構築物。
  4. 配列番号７０〜配列番号７２のうちの１つからなるポリペプチド
    から選択される、請求項２又は３に記載の化合物又は構築物。
  5. 配列番号７０のアミノ酸配列又は配列番号７１のアミノ酸配列を有するか、又はこれから本質的になる、請求項２〜４のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
  6. 請求項１に記載のうちの１つのポリペプチドを含むか、又はこれから本質的になる一価構築物。
  7. 請求項２〜５のいずれか一項に記載の多価の化合物又は構築物を調製する方法であって、請求項１に記載のポリペプチド又は請求項６に記載の一価構築物と、１つ又は複数の基、残基、部分又は結合単位とを連結することを含む、方法。
  8. 請求項１に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項６に記載の一価構築物をコードする核酸又はヌクレオチドであって、前記核酸が任意で遺伝子構築物の形態である、核酸又はヌクレオチド。
  9. 請求項１に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項６に記載の一価構築物を好適な環境下で発現することができる非ヒト宿主又は宿主細胞、及び／又は請求項８に記載の核酸若しくはヌクレオチド又は遺伝子構築物を含む、非ヒト宿主又は宿主細胞。
  10. 請求項１に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項６に記載の一価構築物を産生する方法であって、
    ａ）好適な宿主細胞若しくは非ヒト宿主生物において又は別の好適な発現系において、請求項８に記載の核酸若しくはヌクレオチド又は遺伝子構築物を発現する工程、又は
    請求項９に記載の非ヒト宿主又は宿主細胞が、少なくとも１つの請求項１に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項６に記載の一価構築物を発現及び／又は産生するような条件下で、前記宿主又は宿主細胞を培養及び／又は維持する工程、任意でその後に
    ｂ）ａ）の工程で得られた、請求項１に記載のポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸若しくはヌクレオチドの発現により得ることができる請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項６に記載の一価構築物を単離及び／又は精製する工程
    を少なくとも含む、方法。
  11. 少なくとも請求項１に記載の１つのポリペプチド、請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、請求項６に記載の一価構築物、又は請求項８に記載の核酸若しくはヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
  12. 請求項１に記載の１つのポリペプチド、請求項２〜５のいずれか一項に記載の化合物若しくは構築物、又は請求項６に記載の一価構築物、又は請求項１１に記載の組成物を有効成分とする、敗血症、様々な形態のがん、骨吸収、骨粗鬆症、悪液質、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫及び炎症性疾患からなる群から選択される、ＩＬ−６に、ＩＬ−６Ｒに、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関連がある疾患及び障害、並びに／又は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ及び／若しくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路及び／又は生物学的機能及び応答に関連がある疾患及び障害のうちの少なくとも１つを予防及び／又は治療するための薬剤。
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