JP5291129B2 - 細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、慢性炎症の治療に適した、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ（ｋｒａｎｋｈｅｉｔｓｐｈａｓｅｎ）特異的な薬剤の製造方法に関する。

慢性炎症は、高い社会経済的影響を伴う大きな医療的問題となってきている。これには、特に以下の疾患群：
・自己免疫疾患およびリウマチ性（ｒｈｅｕｍａｔｉｓｃｈｅｎ Ｆｏｒｍｅｎｋｒｅｉｓｅｓ）の疾患（とりわけ皮膚、肺、腎臓、血管系、神経系、結合組織、運動器官、内分泌系における症状発現）
・アレルギー性急性反応および喘息
・慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）
・動脈硬化症
・乾癬および接触皮膚炎
・臓器移植、骨髄移植後の慢性拒絶反応、
が包含される。

これらの疾患の多くは、ここ１０年工業国だけでなく一部全世界的に有病率が増加している。その間に、ヨーロッパ、北米、日本およびオーストラリアでは、人口の２０％以上がアレルギー性疾患および喘息を患っている。慢性閉塞性肺疾患は、現在５番目に頻繁な死因であり、ＷＨＯは２０２０年には３番目に頻繁な死因になると予測している。心筋梗塞、卒中、末梢動脈閉塞症を続発症として伴う動脈硬化は、世界中で罹患率統計や死亡率統計の上位を占めている。一般的に、乾癬および接触皮膚炎は、神経皮膚炎と共に最も頻繁な皮膚における慢性炎症疾患である。

現在のところ、環境要因と遺伝的素因との間の相互作用がまだ十分に理解されていないため、免疫系の継続的な調節異常に至ってしまう。この場合において、この種々の疾患には以下のような共通の原則が認められる：
（Ａ）通常は人間にとって無害な抗原に対する過剰な免疫応答が起こる。この抗原は、環境的要素（例えば花粉、動物の毛、食物、ダニ、化学物質（例えば防腐剤、染料、洗剤）のようなアレルゲン）である場合もある。そして患者はアレルギー性反応を示すようになる。例えば能動および受動喫煙の場合に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を発病することがある。一方、免疫系が自己組織の成分に対しても反応する場合があり、自己組織の成分を非自己として認識し、それに対して炎症反応を起こす。この場合に、自己免疫疾患が発病する。いずれの場合においても、無害で非毒性の抗原が非自己または危険なものとして誤って認識され、不適当な炎症反応が引き起こされる。

（Ｂ）これらの疾患は、開始、進行、すなわち炎症反応の進行、およびこれに伴う臓器機能性の欠損を有する破壊および改変（いわゆるリモデリング）を含むフェーズに沿って進行する。

（Ｃ）これらの疾患は、患者に特異的にサブ表現型（ｓｕｂ−ｐｈａｅｎｏｔｙｐｉｓｃｈｅ）の特徴の現れ方を示す。

（Ｄ）開始、維持（Ａｕｆｒｅｃｈｔｅｒｈａｌｔｕｎｇ）、および破壊および改変過程には、先天性免疫および獲得免疫の成分が継続的に関与している。先天性免疫（重要な成分：多様なポピュレーションを伴う抗原提示細胞および補体系）の影響下、
適応免疫系（重要な成分：Ｔリンパ球とＢリンパ球）の細胞の活性化および分化が起こる。その後、Ｔ細胞が、高度に特化したエフェクター細胞に分化することで中心的機能を引き継ぐ。このとき、Ｔ細胞は、特に
以下の機能：抗体産生、免疫系のエフェクター細胞（例えば、好中球顆粒球、好塩基球顆粒球、好酸球顆粒球）の機能性制御、先天性免疫系の機能へのフィードバック、例えば上皮細胞、内皮細胞、結合組織、骨および軟骨、特に神経細胞のような非造血性細胞の機能性への影響、
を含む一定のエフェクター機構を活性化および獲得する。この際、免疫系と神経系の間に特別な相互作用が生じ、この相互作用から慢性炎症における神経−免疫相互作用のコンセプトが展開された。

慢性炎症を伴う疾患の病状の複雑さと多様性から、該疾患の治療に最適な薬剤は、以下の要件を満たしていなければならない：
（１）これらの疾患では、患者に特異的な（サブ）−表現型が現れる。従って、薬剤は高い患者または症例特異性を示すものでなくてはならない。

（２）これらの疾患は、ステージ（Ｓｔａｄｉｅｎ）およびフェーズに沿って進行する。従って、薬剤はステージまたはフェーズ特異性を有するものでなくてはならない。

（３）これらの疾患は、種々の特化した細胞によって制御されている。従って、薬剤は細胞特異的な作用を起こすものでなければならない。

（４）これらの疾患は、種々の臓器および部位（Ｋｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔｅｎ）で起こる。従って、薬剤は部位または臓器特異性を有するものでなくてはならない。

（５）薬剤は、長期治療に適したものでなければならない。薬剤に対する免疫系の反応が抑制される必要がある。

（６）薬剤の副作用プロファイルは、疾患の重篤度、予後および経過との医学的および倫理的関係において許容される程度のものでなければならない。

現在、慢性炎症に対する使用可能な確立された治療はいずれも、この基準を適切に満たしていない。免疫グロブリンＡによる治療は、特許文献１から、そしてホスホリパーゼＡ_２（ＰＬＡ_２）および／または補酵素Ａ非依存性アシル基転移酵素（ＣｏＡ−ＩＴ）の阻害は、特許文献２により公知である。該疾患に対して現在確立されている治療コンセプトの中心は、非特異的な抗炎症治療および免疫抑制である。よって、使用されるイブプロフェン、アセチルサリチル酸およびパラセタモールのような非特異的な抗炎症作用物質の多くは、効果が十分でないかまたは高い割合で不要な副作用を示す。それに対して、ステロイドは確かに高い作用効果を有するが、高血圧症、糖尿病および骨粗鬆症のような重大な副作用が伴う。例えば、シクロスポリンおよびタクロリムスのような新世代の免疫抑制剤は、肝毒性および腎毒性を示す。

これらの状況に対処するため、免疫学的および細胞生物学的な調節異常に特異的に作用する新しい様々な分子の探索および臨床試験が行われた。これらの例として、サイトカイン、サイトカイン受容体および抗サイトカインなどを挙げることができる。これらの新しい治療方法で問題となるのは、細胞および臓器に対する特異性の低さ、これらの分子に対する不要な免疫反応の発生、および種々の表現型における有効性の低さである。

最近、新しいクラスの触媒分子、いわゆる「ＤＮＡｚｙｍｅ」（非特許文献１）を、その発現が疾患の原因である遺伝子の不活化のために治療剤として使用する試みがなされている。ＤＮＡｚｙｍｅは、原則的には、ＲＮＡの相補的な領域に結合することができ、切断を通してこれらを不活化する一本鎖分子である。ただし、ＤＮＡｚｙｍｅを治療剤として特異的に使用するためには、前提として疾患原因遺伝子およびそのｍＲＮＡが正確にわかっていなければならない。しかし、これは現時点では数少ない疾患であてはまるのみである。

特許文献３に記載されているＤＮＡｚｙｍｅは、ＲｅｌＡ（ｐ６５）ｍＲＮＡと結合し、それにより転写因子ＮＦ−κＢに対しても適応し、そして特許文献４には、ＥＧＲ−１ ｍＲＮＡに結合するＤＮＡｚｙｍｅが開示されている。特許文献５には、核酸変異を見つける診断方法に使用可能な１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅが開示されている。現在公知のアンチセンス分子およびＤＮＡｚｙｍｅは、患者における慢性炎症の治療用薬剤の製造のために使用できるものではない。

独国特許出願（ＤＥ−Ｔ２）公開第６９５１１２４５号明細書 独国特許出願（ＤＥ−Ｔ２）公開第６９５１８６６７号明細書 国際公開（ＷＯ−Ａ１）第０１／１１０２３号パンフレット 国際公開第００／４２１７３号パンフレット 国際公開第９９／５０４５２号パンフレット

Ｓａｎｔｏｒｏ， １９９７

本発明の課題は、その発現が慢性炎症反応および自己免疫疾患の発症に関与している転写因子およびシグナル伝達経路における因子のリボ核酸分子を機能的に不活化させ、慢性炎症反応および自己免疫疾患の治療に適しており、本技術分野における従来の欠点を有していない、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤を提供することにある。

本発明のさらなる課題は、その発現が慢性炎症反応および自己免疫疾患の発症に関与している転写因子およびシグナル伝達経路における因子のリボ核酸分子を同定し、標的細胞内においてこれらを機能的に不活化する、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤の製造方法を提供することにある。

前記課題は、本発明請求項１に記載の方法、および請求項１０〜１５に記載の特異的ＤＮＡｚｙｍｅを使用する請求項１６〜１８に記載の薬剤によって解決される。

本発明の有利な点は、特異的なＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはｓｉＲＮＡを用いて、分化および／または慢性炎症反応および自己免疫疾患の発症に関与するサイトカインの発現をつかさどる転写因子およびシグナル伝達経路における因子のリボ核酸分子を、機能的に不活化することにある。このストラテジーは、従来の方法や遺伝子療法に対して、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異性および選択性が高いこと、分子の安定性が高いことおよび抗原性が無視できることを特徴とする。慢性炎症疾患を患っている患者の平均的な（ｍａｓｓｇｅｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔｅ）長期治療に最適な条件が得られた。

図１は、ＣＤ４^＋細胞のＴＨ１細胞またはＴＨ２細胞への分化におけるシグナル伝達の模式図を示す。 図２は、１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅの触媒ドメインのヌクレオチド配列およびワトソン−クリック対合を用いた標的ＲＮＡとの結合を示す。 図３ａは、段階ｂ）後における特異的なリボ核酸分子のプール、特にＧＡＴＡ−３に対するＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０およびそれらのヌクレオチド配列を示す。 図３ｂは、段階ｂ）後における特異的なリボ核酸分子のプール、特にＧＡＴＡ−３に対するＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０およびそれらのヌクレオチド配列を示す。ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０およびそれらのヌクレオチド配列を示す。 図４ａは、ヒトＧＡＴＡ−３遺伝子のヌクレオチド配列（アライメント）を示す。 図４ｂは、ヒトＧＡＴＡ−３遺伝子のヌクレオチド配列（アライメント）を示す。 図４ｃは、ヒトＧＡＴＡ−３遺伝子のヌクレオチド配列（アライメント）を示す。 図４におけるヒトＧＡＴＡ−３遺伝子のヌクレオチド配列３を示す。間に更なるＤＮＡｚｙｍｅ切断部位がある各ヌクレオチドペアＧＴおよびＡＴを灰色のバックで示す。 図５は、段階ｂ）後における、特異的リボ核酸分子による標的ｍＲＮＡ（ここではＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡ）の切断を示すゲル電気泳動を示す。 図６は、細胞内における特異的なリボ核酸分子の反応を伴う免疫ブロットを示す。 図７ａは、段階ｂ）後の特異的リボ核酸分子のプール、特にＴ−ｂｅｔに対するＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ １〜ｔｄ ７０、およびそれらのヌクレオチド配列を示す。 図７ｂは、段階ｂ）後の特異的リボ核酸分子のプール、特にＴ−ｂｅｔに対するＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ １〜ｔｄ ７０、およびそれらのヌクレオチド配列を示す。 図８ａは、ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列（アライメント）を示す。 図８ｂは、ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列（アライメント）を示す。 図８におけるヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列１を示す。間にさらなるＤＮＡｚｙｍｅ切断部位を有する各ヌクレオチドペアＧＴおよびＡＴをグレーのバックで示す。 図９は、段階ｂ）後における、特異的リボ核酸分子による標的ｍＲＮＡ（ここではＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ）の切断を示すゲル電気泳動を示す。 図１０は、ＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ５４（Ａ）、ｔｄ６９（Ｂ）およびｔｄ７０（Ｃ）で処理された細胞由来のＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡ量の、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒによる定量を示す。 図１１は、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞内におけるＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡの半定量化グラフを示す。

本発明のさらなる詳細および利点を、以下の図および記載によって説明する。

図１：ＣＤ４^＋細胞のＴＨ１細胞またはＴＨ２細胞への分化におけるシグナル伝達の模式図（Ｈｏ ｌ． Ｃ． ｕｎｄ Ｇｌｉｍｃｈｅｒ Ｌ． Ｈ．， Ｃｅｌｌ ２００２ ； １０９ ： Ｓ１０９−Ｓ１２０を改変）。

図２：１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅの触媒ドメインのヌクレオチド配列およびワトソン−クリック対合を用いた標的ＲＮＡとの結合（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＵまたはＣ、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＵまたはＧ）。矢印は標的ＲＮＡにおける切断部位を示す。

図３：段階ｂ）後における特異的なリボ核酸分子のプール、特にＧＡＴＡ−３に対するＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０およびそれらのヌクレオチド配列（Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チミン）。大文字で記載されているヌクレオチドは、右側のおよび左側の基質結合ドメインを表し、小文字で記載されるヌクレオチドは、１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅの中心の触媒ドメインを表している。

図４：ヒトＧＡＴＡ−３遺伝子のヌクレオチド配列（アライメント）
配列１：ヒトＧＡＴＡ−３、データバンクＮｏ．：ＸＭ＿０４３１２４
配列２：ヒトＧＡＴＡ−３、データバンクＮｏ．：Ｘ５８０７２
配列３：ヒトＧＡＴＡ−３（プラスミドｐＣＲ２．１より配列決定）
塩基が多様な場合を灰色のバックで、ＧＡＴＡ−３のクローニング用プライマー位置を下線で示した。ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ４０の位置は、太字のアルファベット、灰色のバックおよび下線で強調されている（Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チミン）。

図４Ａ：図４のヒトＧＡＴＡ−３遺伝子のヌクレオチド配列３。その間に更なるＤＮＡｚｙｍｅ切断部位がある各ヌクレオチドペアＧＴおよびＡＴが示されている（灰色のバック）。

図５：段階ｂ）後における、特異的リボ核酸分子、ここでは非修飾ＤＮＡｚｙｍｅ［ｈｇｄ１１（レーン２）、ｈｇｄ１３（レーン４）、ｈｇｄ１７（レーン６）、ｈｇｄ４０（レーン８）］および修飾ＤＮＡｚｙｍｅ［ｈｇｄ１１−Ｍ（レーン３）、ｈｇｄ１３−Ｍ（レーン５）、ｈｇｄ１７−Ｍ（レーン７）、ｈｇｄ４０−Ｍ（レーン９）］による標的ｍＲＮＡ（ここではＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡ）の切断を示すゲル電気泳動。Ｍは修飾ＤＮＡｚｙｍｅを表す。非修飾ＤＮＡｚｙｍｅ（０．２５μＭ）または修飾ＤＮＡｚｙｍｅ（０．２５μＭ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡ（０．０２５μＭ）と一緒に、容量１０μｌの以下：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２の反応混合物中で、３７℃において１時間インキュベートする。引き続いて、生成物をゲル電気泳動で分離する。レーン１は、ＤＮＡｚｙｍｅを加えていないｍＲＮＡをコントロールとして含む。一緒に使用した分子量スタンダード（図示せず）は、１０００ｂｐ、２０００ｂｐおよび３０００ｂｐのバンドの大きさを示す。矢印は、基質（ここではＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡ）のバンドＳ、および切断生成物Ｐ１およびＰ２を示す。

図６：細胞内における特異的なリボ核酸分子の反応を伴う免疫ブロット。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞は、特異的なリボ核酸分子を用いたリポフェクション（ここではＤＮＡｚｙｍｅ［ｈｇｄ １１−Ｍ（レーン４）、ｈｇｄ １３−Ｍ（レーン５）、ｈｇｄ １７−Ｍ（レーン６）、ｈｇｄ ４０−Ｍ（レーン７）］）により形質転換される。コントロールとして、未処理細胞（レーン１）、トランスフェクション試薬のみで処理された細胞（レーン２）およびＤＮＡｚｙｍｅ（ｈｇｄ １１−Ｍ）のみ、すなわちトランスフェクション試薬なしで処理された細胞（レーン３）を用いる。４８時間のインキュベーション後、可溶化したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＧＡＴＡ−３（Ａ）を特異的抗体による免疫ブロットで検出する（レーン４はｈｇｄ １１−Ｍを用いた細胞、レーン５はｈｇｄ １３−Ｍを用いた細胞、レーン６はｈｇｄ １７−Ｍを用いた細胞、レーン７はｈｇｄ ４０−Ｍを用いた細胞。）。各レーンあたりのタンパク質量が同一であることを確認するために、同一のブロット膜上でβ−アクチン（Ｂ）による免疫染色を行った。一緒に使用した分子量スタンダード（図示せず）は、６３．８ｋＤａ、４９．５ｋＤａおよび３７．４ｋＤａのバンドの大きさを示した。

図７：段階ｂ）後の特異的リボ核酸分子のプール、特にＴ−ｂｅｔに対するＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ １〜ｔｄ ７０、およびそれらのヌクレオチド配列（Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チミン）。

図８：ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列（アライメント）
配列１：ヒトＴ−ｂｅｔ、データバンクＮｏ．：ＮＭ＿０１３３５１
配列２：ヒトＴ−ｂｅｔ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫより配列決定）
塩基が多様な場合を灰色のバックで、Ｔ−ｂｅｔのクローニング用プライマー位置を下線で示した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにおける半定量化用プライマー位置を囲み線で示す。ＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ５４およびｔｄ６９の位置は、灰色のバックおよび下線で、またｔｄ７０は、更に太字のアルファベットで強調されている（Ａ＝アデニン、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｔ＝チミン）。

図８Ａ：図８におけるヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列１。その間にさらなるＤＮＡｚｙｍｅ切断部位を有する各ヌクレオチドペアＧＴおよびＡＴをグレーのバックで示す。

図９：段階ｂ）後における、特異的リボ核酸分子、ここでは修飾ＤＮＡｚｙｍｅ［（ｔｄ５４ｍ（レーン３）、ｔｄ６９ｍ（レーン４）およびｔｄ７０ｍ（レーン５）］による標的ｍＲＮＡ（ここではＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ）の切断を示すゲル電気泳動。修飾ＤＮＡｚｙｍｅ（０．２５μＭ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ（０．０２５μＭ）と一緒に、体積１０μｌの以下：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２の反応混合物中で、３７℃において３０分間インキュベートする。引き続いて、生成物をゲル電気泳動で分離する。レーンＭは、分子量スタンダード３０００塩基および２０００塩基、レーン２は、コントロールとしてＤＮＡｚｙｍを加えていないｍＲＮＡ。矢印Ａは、基質（ここではＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡ）のバンド、矢印Ｂは、大きい方の切断生成物を示している。２つ目の切断生成物は、小さく、この図内には確認されない。

図１０：ＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ５４（Ａ）、ｔｄ６９（Ｂ）およびｔｄ７０（Ｃ）で処理された細胞由来のＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡ量の、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒによる定量。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞は、２４時間間隔で２回、Ｔ−ｂｅｔ特異的なＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ５４（Ａ）、ｔｄ６９（Ｂ）およびｔｄ７０（Ｃ）により、またはコントロールとしてナンセンスＤＮＡｚｙｍｅ（図示せず）によって形質転換される。続いて、ＲＮＡを精製し、逆転写を行い、得られたＤＮＡをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒにおいて使用する。内部標準として、ＧＡＰＤＨ（点線の曲線）を用いた。Ｔ−ｂｅｔ特異的なＤＮＡｚｙｍｅあるいはナンセンスＤＮＡｚｙｍｅによって処理された細胞をそれぞれ４回測定する。実線の曲線は、Ｔ−ｂｅｔ特異的なＤＮＡｚｙｍｅで処理された細胞内のＴ−ｂｅｔの量、点線は、ナンセンスＤＮＡｚｙｍｅによって処理された細胞内のＴ−ｂｅｔの量を示す。

図１１：Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞内におけるＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡの半定量化グラフ。

Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を、Ｔ−ｂｅｔ特異的なＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ５４、ｔｄ６９およびｔｄ７０によって２回形質転換し、４８時間後にＲＮＡを単離する。逆転写後、ｍＲＮＡ量をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒで定量する。コントロールとしてナンセンスＤＮＡｚｙｍｅを使用する。Ｔ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡの半定量化は、説明書［Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２（２００１）． Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／０４３０３８５９．ｐｄｆ）］の方法に従った。

ナンセンスＤＮＡｚｙｍｅを用いたコントロール実験のＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡの量を１００％とした。

図１は、ＣＤ４^＋細胞のＴＨ１細胞またはＴＨ２細胞への分化におけるシグナル伝達の関係をＨｏ Ｉ．Ｃ．およびＧｌｉｍｃｈｅｒ Ｌ．Ｈ．（Ｃｅｌｌ ２００２； １０９： Ｓ１０９−Ｓ１２０）が示した模式図を改変したものである。対応するペプチドＭＨＣ複合体を介したＴ細胞レセプターによる刺激は、クローン拡大およびＣＤ４^＋Ｔ−リンパ球のＴ−ヘルパー（ＴＨ）１細胞またはＴＨ２細胞へのプログラムされた分化を誘導する。これら２つのサブタイプへの分類は、これらのサイトカインプロファイルに基づいて行われる。ＴＨ１細胞は、インターフェロン−γ（ＩＮＦγ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）および腫瘍壊死因子β（Ｔｕｍｏｒ−Ｎｅｋｒｏｓｅ−Ｆａｋｔｏｒ−β）を生成するのに対し、ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を分泌する。細菌感染およびウイルス感染は、ＴＨ１細胞が主体の免疫応答を誘導する。一方ＴＨ２細胞は、寄生虫に対するＩｇＥの生産を制御する。この際、ＴＨ１細胞とＴＨ２細胞は、バランスが保たれている。これらのバランスが崩れると疾患を引き起こし、すなわち過剰なＴＨ１細胞応答は自己免疫疾患に関連し、それに対して強いＴＨ２細胞応答はアレルギー性疾患の原因となる。

ＴＨ１サイトカインが、例えば自己免疫性ぶどう膜炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎、１型糖尿病またはクローン病のような自己免疫疾患の病因に関与し、一方、ＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＩＬ−９）が、例えば気管好酸球増多症、粘液過分泌および気管過敏性のような慢性炎症性気道疾患の発症に関与していることは知られている。これらの疾患の要因は、抗原特異的ＴＨ細胞における特有なサイトカイン生成の間の病態生理学的な変化である。よって、気管上皮内でＴＨ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＩＬ−９が構成的に過剰発現する遺伝子導入マウスは、典型的なアレルギー性炎症反応を示す。一方、肺や気管内におけるＴＨ２細胞サブポピュレーションは、動物モデルにおけるＴＨ２細胞内で、気管支喘息に特有な症状を引き起こす。

驚くべきことに、慢性炎症および／または自己免疫疾患の細胞および／または組織特異的な治療に、分化、および／または慢性炎症反応および自己免疫疾患の発症に関与しているサイトカインの発現をつかさどる、例えばＴＨ１細胞特異的な転写因子Ｔ−ｂｅｔおよびＴＨ２細胞特異的転写因子ＧＡＴＡ−３のような転写因子およびシグナル伝達経路における因子が適していることが判明した。

ＴＨ１細胞特異的な転写因子Ｔ−ｂｅｔは、主に、ナイーブＣＤ^＋Ｔ細胞からＴＨ１細胞への分化に携わっている。該因子の発現は、Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）のシグナル伝達経路およびＩＮＦγ受容体／ＳＴＡＴ１を介して制御される。Ｔ−ｂｅｔは、内因性ＩＮＦγ遺伝子をトランス活性化し、ＩＮＦγ産出を誘導する。更に、該因子は、ＩＬ−１２Ｒβ２鎖のタンパク質発現の上方調節を誘導し、個々のＩＮＦγ対立遺伝子のクロマチンリモデリングを導く。Ｔ−ｂｅｔのｉｎ ｖｉｖｏでの機能は、ノックアウトマウス（Ｔ−ｂｅｔ^−／−）で確認された。Ｔ−ｂｅｔ欠失マウスは、通常のリンパ球の発達を示すにもかかわらず、抗ＣＤ３／ＣＤ２８やＰＭＡ／イオノマイシンで刺激してもこのマウスのＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＩＮＦγを産出しない。要するに、Ｔ−ｂｅｔ欠失マウスは、大形リューシュマニア（Ｌ． ｍａｊｏｒ）感染に免疫応答を示さず、ＴＨ２サイトカインが高い状態にある。

炎症性腸疾患における粘膜Ｔ細胞内のＴ−ｂｅｔの機能は公知である。動物モデルにおける研究で、再構成ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）マウスにおいて、ＣＤ４^＋ＣＤ２６Ｌ^＋Ｔ細胞へのＴ−ｂｅｔのレトロウイルスによる形質導入後、大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ）の悪化が見られるのに対し、Ｔ−ｂｅｔ欠損Ｔ細胞の導入からは大腸炎は誘導されない。

転写因子Ｔ−ｂｅｔは、ＴＨ１細胞の発達を特異的に誘導し、この細胞内でのＩＮＦγ産出を制御する。Ｔ−ｂｅｔを阻害すると、ＴＨ１細胞とＴＨ２細胞の間の平衡が、ＴＨ２細胞側に移動する。

ＴＨ２細胞に特異的な転写因子ＧＡＴＡ−３は、主に、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からＴＨ２細胞への分化に携わっている。

ここでＴＨ２細胞分化は、主に、２通りのシグナル伝達経路、すなわちＴ細胞受容体（ＴｃＲ）の経路およびＩＬ−４受容体の経路を介して制御される。ＴｃＲから送られるシグナルは、ＴＨ２細胞特異的転写因子ｃ−ＭａｆおよびＧＡＴＡ−３だけでなく、転写因子ＮＦＡＴおよびＡＰ−１をも活性化する。ＩＬ−４受容体の活性化により、ＳＴＡＴ６がＩＬ−４受容体の細胞質ドメインに結合し、Ｊａｋ１キナーゼおよびＪａｋ３キナーゼによりリン酸化される。そこでのリン酸化は、核内へのＳＴＡＴ６の二量体化および移行を導き、ＳＴＡＴ６はＧＡＴＡ−３およびその他の遺伝子の転写を活性化する。

ＧＡＴＡ−３は、ジンクフィンガー転写因子の１つであり、「Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ−Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ−Ａｎａｌｙｓｉｓ」（ＲＤＡ）およびＩＬ−５の転写制御の研究によると、ＴＨ１細胞ではなく、成熟ＴＨ２細胞内でのみ発現する。

ＴＨ１細胞またはＴＨ２細胞への分化に関与し、慢性炎症反応および自己免疫疾患の発症と関与を示し、そしてその標的細胞における発現がコントロール細胞での発現と比較して差異を有して、本発明に同様に適しているその他の転写因子も、慢性炎症性疾患治療用の特異的なＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはｓｉＲＮＡの設計に使用することができる：
・ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａおよびＳＴＡＴ１（シグナル伝達物質および転写アクチベーター）
・ｃ−Ｒｅｌ
・ＣＲＥＢ２（ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２：ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質２）
・ＡＴＦ−２、ＡＴＦ−２
・Ｈｌｘ
・ＩＲＦ−１（インターフェロン制御因子−１）
・ｃ−Ｍａｆ
・ＮＦＡＴ（Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ：活性化Ｔ細胞核因子）
・ＮＩＰ４５（ＮＦ−ＡＴ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４５：ＮＦ−ＡＴ相互作用タンパク質４５）
・ＡＰ１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ １：アクチベータータンパク質１）
・Ｍｅｌ−１８
・ＳＫＡＴ−２（ＳＣＡＮ ｂｏｘ， ＫＲＡＢ ｄｏｍａｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｔｈ２ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ：ＳＣＡＮボックス、Ｔｈ２表現型関連ＫＲＡＢドメイン）
・ＣＴＬＡ−４（Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ４：細胞障害性Ｔリンパ球抗原４）。

サイトカインの分化および／または発現に関与し、慢性炎症反応および自己免疫疾患の発症と関与を示し、そしてその標的細胞における発現がコントロール細胞での発現と比較して差異を有して、本発明に同様に適しているその他のシグナル伝達経路における因子も、慢性炎症性疾患治療用の特異的なＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはｓｉＲＮＡの設計に使用することができる：
・Ｓｒｃキナーゼ
・Ｔｅｃキナーゼ
Ｒｌｋ（ヒトではＴｘｋ）
Ｉｔｋ
Ｔｅｃ
・ＲＩＢＰ（Ｒｌｋ／Ｉｔｋ結合タンパク質）
・ＰＬＣγ（ホスホリパーゼＣγ１）
・ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）
ＥＲＫ
ＪＮＫ
Ｐ３８
・ＭＫＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）
ＭＫＫ１
ＭＫＫ２
ＭＫＫ３
ＭＫＫ４
ＭＫＫ６
ＭＫＫ７
・Ｒａｃ２
・ＧＡＤＤ４５（増殖停止およびＤＮＡ損傷遺伝子４５（Ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｇｅｎｅ ４５））
ＧＡＤＤ４５β
ＧＡＤＤ４５γ
・ＳＯＣＳ（サイトカインシグナルのサプレッサー）
ＣＩＳ（サイトカイン誘導性ＳＨ２タンパク質）
ＳＯＣＳ１
ＳＯＣＳ２
ＳＯＣＳ３
・ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）
ＪＡＫ１
ＪＡＫ３
・ＮＩＰ４５（ＮＦ−ＡＴ相互作用タンパク質） 。

本発明は、慢性炎症の治療に適した、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤を提供する。

該薬剤は、好ましくは、慢性炎症反応および自己免疫疾患の基礎となっている免疫学的および細胞生物学的な調節異常の複雑なカスケードに介入する箇所（Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓｐｕｎｋｔｅｎ）で作用する。例えば、ＴＨ２細胞特異的な転写因子ＧＡＴＡ−３またはＴＨ１細胞特異的な転写因子Ｔ−ｂｅｔのような、関連する転写因子の分化制御に介入する箇所が特に好ましい。達成される治療効果は、特異的なＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡ分子の機能的不活化によるものである。このストラテジーは、従来の方法に対してだけでなく、遺伝子療法的アプローチと比較しても多くの利点：高い特異性および選択性、高い分子安定性および無視できる抗原性を有する。すなわち、慢性炎症疾患を患っている患者の平均的な長期治療に最適な前提条件が得られたのである。

本発明は、以下の段階：
ａ）その標的細胞における発現が、コントロール細胞での発現と比較して差異を有するリボ核酸分子の同定
ｂ）段階ａ）のリボ核酸分子と結合し、それを機能的に不活化する特異的なリボ核酸分子の設計
ｃ）段階ｂ）の特異的なリボ核酸分子の標的細胞への導入
ｄ）段階ｂ）の特異的なリボ核酸分子および／または段階ｃ）の標的細胞の薬剤への製剤化、
を含む、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤の製造方法を提供する。

本発明における「細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な」という語句は、本発明の方法によって製造された薬剤が、本質的にある特定の種類の細胞（標的細胞）、および／または特定の組織または臓器、および／または疾患の特定のフェーズにおいてのみ効力を発揮し、その他の細胞（コントロール細胞）、組織または臓器には、無視できるほどの影響しか与えないという意味で使用されている。該薬剤が、標的細胞の少なくとも２／３に有効であることが好ましい。また、標的細胞の少なくとも８０％で有効であることがより好ましく、少なくとも９８％で有効であることが特に好ましい。更に、該薬剤が有効であるのが多くとも１０％のコントロール細胞であることが好ましく、多くとも５％のコントロール細胞であることがより好ましく、１％未満であることが特に好ましい。

本発明における「その標的細胞内における発現が、コントロール細胞内での発現と比較して差異を有するリボ核酸分子の同定」という語句には、以下の段階が含まれる。

ｉ）標的細胞は、疾患の発症を導くか、それに寄与するかまたはこれを悪化させるか、疾患を維持する過程を支持するか、それに寄与するかまたはこれを増強するか、または疾患の後遺症（Ｓｐａｅｔｆｏｌｇｅｎ）を導くか、それに寄与するかまたはそれを増強する組織および臓器内の細胞である。前記の細胞としては、例えば特定の転写因子を有し、特異的なホルモン、サイトカインおよび増殖因子を分泌する細胞、または典型的な表面受容体を有する細胞が挙げられる。

ｉｉ）該標的細胞は、例えば特異的な抗体の結合に基づく技術によって単離することができる。ここでは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製（Ｍａｃｓ−Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｄｙｎａｌ社製（ＤｙｎａＢｅａｄｓ）またはＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製（ｉＭＡＧ）のマグネットビーズを使用する。あるいは、これは例えばＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製（ＭＯＦＬＯ）またはＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製（ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ）のセルソーターで蛍光標識抗体を用いた細胞の精製により行われる。更に、標的細胞の純度は、少なくとも８０％であることが好ましく、少なくとも９５％であることがより好ましく、少なくとも９９％であることが特に好ましい。

ｉｉｉ）ＲＮＡの単離方法は、例えば「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （２００１）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」および「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９８）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」に記載されている。また、当業者であれば、市販のキット（シリカ・テクノロジー）、例えばＱｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙ ＫｉｔをＲＮＡ単離に使用することができる。更に好ましくは、市販のキット、例えばＱｉａｇｅｎ社製（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社製（ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）またはＭｉｌｔｅｎｙｉ社製（ｍＲＮＡｄｉｒｅｃｔ）を使用して、標的細胞から直接ｍＲＮＡを精製する。

ｉｖ）差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｅｌｌ）な異なるｍＲＮＡ、すなわち、その標的細胞における発現がコントロール細胞に対して増加しているｍＲＮＡの同定は、例えば市販の遺伝子チップ（例えば、ＭＷＧ、ＣＬＯＮ−ＴＥＣＨ社）またはフィルターハイブリダイゼーション法（例えばＵｎｉｇｅｎｅ社）を用いて、製造者の指示に従って実施される。あるいは、差次的なｍＲＮＡは、事前にｍＲＮＡからＲＴ反応により生成されるｃＤＮＡのサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションによっても調製される。当業者に公知の方法としては、例えばＳＳＨ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）またはＲＤＡ法が挙げられる。同様に、チップ技術およびサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションの組み合わせもまた好ましい応用形態である。差次的に発現する遺伝子の同定は、市販のプログラム、例えばＩｎｆｏｒＭａｘ社のＶｅｃｔｏｒ Ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍを使用して、チップ技術を用いることにより行うことができる。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションを用いた場合、差次的に発現している遺伝子を単離した後に、クローニングおよびそれに続く配列決定（例えば「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （２００１）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」および「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９８）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」参照）のような慣用の、当業者に公知の方法に基づいて、例えばＧｅｎｅ−Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のようなデータバンクとの配列比較を行う。

標的細胞における発現は、コントロール細胞での発現と比較して差異を有する。本発明による方法の１つの実施形態において、標的細胞における発現は、コントロール細胞での発現と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍に増加している。更に好ましい実施形態において、標的細胞内における発現は、コントロール細胞での発現と比較して少なくとも５倍に増加しており、そして最も好ましい実施形態においては、標的細胞でのみ発現が確認でき、コントロール細胞では確認できない。

本発明における「段階ａ）のリボ核酸分子に結合し、それを機能的に不活化するリボ核酸分子の設計」という語句には、リボ核酸分子を機能的に不活化するＲＮＡ不活化ＤＮＡ−Ｅｎｚｙｍｅ（ＤＮＡｚｙｍｅ）および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用が含まれる。

「ＤＮＡｚｙｍｅ」という語句には、核酸の標的配列、ＤＮＡだけでなくＲＮＡも特異的に認識して切断する本発明のＤＮＡ分子が含まれる。

一般的なＤＮＡｚｙｍｅモデルの一例として「１０−２３」モデルを挙げることができる。「１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅ」とも呼ばれる１０−２３モデルのＤＮＡｚｙｍｅは、２つの基質結合ドメインに挟まれた１５のデオキシリボ核酸からなる触媒ドメインを有している。基質結合ドメインの長さは可変で、同じ長さの場合も、異なる場合もある。好ましい実施形態において、基質結合ドメインの長さは、６〜１４ヌクレオチドである。特に好ましい実施形態においては、基質結合ドメインは、切断位置の両側領域に対して完全に相補的である。しかしながら標的ＲＮＡに結合し切断するためには、ＤＮＡｚｙｍｅが完全に相補的である必要はない。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究によって、１０−２３タイプのＤＮＡｚｙｍｅは、標的ｍＲＮＡをプリン−ピリミジン連続配列で切断することが示された。

ＤＮＡｚｙｍｅを疾患の治療に用いるには、ＤＮＡｚｙｍｅを体内（血液中、細胞内環境など）における分解に対して安定化できることが好ましい。本発明の好ましい実施形態として、ＤＮＡｚｙｍｅの一末端あるいは複数の末端への３’−３’−インバージョン（Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）の導入がある。「３’−３’−インバージョン」という語句は、末端ヌクレオチドの３’−炭素と隣接するヌクレオチドとの間のリン酸共有結合を表す。このタイプの結合は、連続するヌクレオチドの３’炭素と５’炭素との間の通常のリン酸結合とは反対である。よって、触媒ドメインの３’末端に隣接する基質結合ドメインの３’末端のヌクレオチドがインバースであることが好ましい。インバースに加えて、ＤＮＡｚｙｍｅは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド化合物も含むことができる。修飾ヌクレオチドは、例えば、Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホルアミド（Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔ）化合物、２’−Ｏ−メチル置換およびペプチド−核酸化合物を含んでいる。これらの製造方法は当業者に公知である。

潜在的なＤＮＡｚｙｍｅ切断部位は広く分布して存在するにもかかわらず、これらはＲＮＡの二次構造によってブロックされていることが多く、従ってＤＮＡｚｙｍｅに接近することができない。よって、ＤＮＡｚｙｍｅのプールから、切断部位に自由に到達することができるものを選択する。この選択されたＤＮＡｚｙｍｅは活性で、標的ｍＲＮＡを切断し、これを機能的に不活化する。各々のＤＮＡｚｙｍｅによるｍＲＮＡの切断効率は、ＤＮＡｚｙｍｅごとの試験、または複数のＤＮＡｚｙｍｅの「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−Ａｓｓａｙｓ」（例えば「Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９」参照）による連結された試験によって明らかにされる。

本発明における「ｓｉＲＮＡ」という語句は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてもｉｎ ｖｉｖｏにおいても相補的な標的ｍＲＮＡを特異的に分解する、二本鎖で２１〜２３塩基の長さのＲＮＡ分子を含む。標的ｍＲＮＡ配列から、ｓｉＲＮＡ分子を作製する方法は、文献（例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕｎｇｅｎ／１００／１０５／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によって当業者に公知である。

３つの選択されたｓｉＲＮＡ分子の中に、少なくとも１つ高い活性（標的ＲＮＡ阻害率が少なくとも８０％）のものが含まれている確率は、文献には少なくとも７０％と記載されている。ｓｉＲＮＡ分子のプールから、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてもｉｎ ｖｉｖｏにおいても相補的な標的ｍＲＮＡを特異的に分解するものを選択する。

本発明において「段階ｂ）の特異的なリボ核酸分子の標的細胞への導入」という語句は、上述の本発明における特異的なリボ核酸分子を含むベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルスまたはバクテリオファージの標的細胞へのトランスフェクションも含まれる。該ベクターは、動物細胞およびヒト細胞の形質転換に適しており、本発明のリボ核酸分子の組み込みが可能であることが好ましい。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＤＭＲＩＥ−Ｃによるリポフェクションのようなトランスフェクションの方法が、文献により当業者に公知である。基本的にはリポソームベクターもこれに適している。転写因子、またはホルモン、サイトカインおよび成長因子を分泌する細胞だけでなく、発現した受容体を表面に有する細胞も標的分子である。本発明のコントロール細胞としては、標的組織内の正常細胞、同一患者のその他の部位または健常者の同一タイプの細胞が使用される。

標的細胞の培養は、ｐＨ値、温度、塩濃度、抗生物質、ビタミン、微量元素および通気のような標的細胞の要求に適合する培地で行われる。「患者」という語句は、ヒトおよび脊椎動物に対して同等に用いる。すなわち該薬剤は、医学の分野でも獣医学の分野でも使用可能である。

「段階ｂ）の特異的なリボ核酸分子または段階ｃ）の標的細胞の薬剤への製剤化」という語句には、信頼できる医学的判断に基づいて、患者に対して過度の毒性、刺激またはアレルギー反応を引き起こさない限りにおいて、修飾および「プロドラッグ」を含む薬学的に許容可能な組成物が含まれる。「プロドラッグ」という用語は、吸収の改善のために、例えば血液内での加水分解において変換される化合物を表す。

特異的なリボ核酸分子は、経口、経腸、非経口、静脈内、筋肉内または皮下、嚢内、腟内、腹腔内、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｋａｌ）、血管内、局所（パウダー、軟膏、点滴）により、またはスプレー剤により、薬学的に許容可能な組成物の形態で患者に投与することができる。

この本発明の薬剤の局所的投与のための剤形（Ｄｏｓｉｅｒｕｎｇｓｆｏｒｍｅｎ）には、軟膏、パウダー、スプレーまたは吸入剤が含まれる。有効成分は無菌条件下、必要に応じて生理学的に許容されるキャリアーおよび可能な保存剤、緩衝剤あるいは発泡剤（Ｔｒｅｉｂｍｉｔｔｅｌｎ）と混合される。用量決定の方法は、担当医が臨床的要因に応じて決定する。用量決定の方法が、例えば患者の体格、体重、体表面積、年齢、性別または一般的な健康状態のような種々の因子、ならびに特に投与される薬剤、投与の期間および方法、および場合により並行して投与されるその他の薬に依存することは、当業者に公知である。

本発明の方法で製造される薬剤は、高い患者特異性、疾患特異性、ステージ特異性またはフェーズ特異性を示す。また本薬剤は細胞特異的に作用し、部位および臓器に対しても特異的である。該薬剤に対しては、免疫系の反応は全く起こらないかまたはほんのわずかしか起こらず、そして副作用プロファイルは疾患の重篤度、予後および経過に対して許容される程度のものである。

該薬剤は、例えば自己免疫疾患、リウマチ性の疾患（皮膚、肺、腎臓、血管系、神経系、結合組織、運動器官、内分泌系等における症状発現）、アレルギー性急性反応および喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、動脈硬化症、乾癬および接触皮膚炎、および臓器移植および骨髄移植後の慢性拒絶反応のような、慢性炎症を伴う全ての疾患群に対する治療に使用することができる。

実施例１：ＧＡＴＡ−３
ａ）その標的細胞における発現が、コントロール細胞での発現と比較して差異を示すリボ核酸分子の同定
ｉ）慢性炎症反応の発症に関与しているナイーブＣＤ４^＋細胞を標的細胞として使用した。

ｉｉ）該ＣＤ４^＋標的細胞は、マグネット・ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社製（Ｍａｃｓ−Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｄｙｎａｌ社製（ＤｙｎａＢｅａｄｓ）またはＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製（ｉＭＡＧ））を用いて単離し、あるいは、例えばＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製（ＭＯＦＬＯ）またはＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製（ＦＡＣＳ−Ｖａｎｔａｇｅ）のセルソーターで蛍光標識抗体を用いて単離した。

ｉｉｉ）ＲＮＡの単離は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （２００１）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」並びに「Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９８）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ」等
に記載されている標準的な方法を用いて行った。

あるいは、Ｑｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔを用いる方法、またはＱｉａｇｅｎ社製Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｋｉｔを用いてＣＤ４^＋標的細胞からｍＲＮＡを直接単離する方法で、製造者の指示に従って行うこともできる。
なおこれは、Ｑｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔを用いる方法、或いは、Ｑｉａｇｅｎ社製Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ Ｋｉｔを用いて直接ＣＤ４^＋目標細胞からｍＲＮＡを単離する方法で、製造者の指示に従って行うこともできる。

ｉｖ）差次的な異なるｍＲＮＡ、すなわち、その標的細胞における発現がコントロール細胞に対して増加しているｍＲＮＡの同定は、遺伝子チップ（例えば、ＭＷＧ、ＣＬＯＮ−ＴＥＣＨ社）を使用して、そして差次的に発現する遺伝子の同定は、ＩｎｆｏｒＭａｘ社のＶｅｃｔｏｒ Ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍｍを使用して行われる。

フィルターハイブリダイゼーション法（例えばＵｎｉｇｅｎｅ社）は製造者の指示に従う。差次的に発現している遺伝子の同定に引き続き、クローニング、配列決定（例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）に参照される標準的な説明に従って）および遺伝子データバンク（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）との配列比較が行われる。標的細胞（ＴＨ２細胞）におけるＧＡＴＡ−３の発現は、コントロール細胞（例えばＴｈ０細胞）での発現と比較して差異を有する。

ｂ）段階ａ）のリボ核酸分子に結合し、それを機能的に不活化する特異的なリボ核酸分子の設計
図３に、ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡに特異的なＤＮＡｚｙｍｅである本発明のプールｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０を示す。該ＤＮＡｚｙｍｅの全長は３３ヌクレオチドであるが、中心の触媒ドメインは１５ヌクレオチド（小文字）であり、公知の１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅ（図２）の触媒ドメインと一致する。この触媒ドメインは、それぞれ９ヌクレオチドからなる２つの基質結合ドメイン（大文字）に左右から挟まれている。左右の基質結合ドメインのヌクレオチド配列は、ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０において異なっており且つ可変であるため、ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡへのワトソン・クリック対合による様々な特異的結合が生じる。

図２は、１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅと、Ｎを用いて示した任意の標的ＲＮＡとの結合に関する一般的なモデルを示しており、矢印は標的ｍＲＮＡにおける切断部位を示している。

ＤＮＡｚｙｍｅは、いかなるプリン−ピリミジン配列も確実に切断することができるが、プリン−ウラシル結合のほうがプリン−シトシン結合よりも効果的に切断されることが、文献により知られている。よってプリン−ウラシル結合を切断するＤＮＡｚｙｍｅを設計することが好ましい。

図２に示したモデルは、その作用様式においてＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０とＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡとの結合にも当てはめることができる。

ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験には修飾されていないものを使用し、培養細胞における実験には修飾されたもの（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社から購入）を使用した。

安定化および保護のための修飾として、以下：
１）３’末端に安定化インバース・チミジン（ｉｎｖｅｒｓｅｓ Ｔｈｙｍｉｄｉｎ）
２）細胞のトランスフェクション効率をＦＡＣＳ分析で評価するための、５’末端のＦＡＭによる標識、
を使用した。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＤＮＡｚｙｍｅを試験するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写で生成されたＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡが必要である。各段階は、以下の通りである。

・ＱＩＡａｍｐ−ＲＮＡ−Ｂｌｏｏｄ−Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、ドイツ）を用い、取扱説明書の指示に従って、ヒトＥＤＴＡ−全血からＲＮＡを単離する。

・以下のプライマー：
フォワードプライマー ＧＧＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＡＴＡＣＴＴＴ
リバースプライマー ＣＣＧＡＡＡＡＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＡ、
を用いて逆転写し、２７３１ヌクレオチドの長さを持つＰＣＲ産物が増幅される（ＪｕｍｐＳｔａｒｔ Ａｃｃｕ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， Ｓｉｇｍａ社製）。

ＰＣＲ条件：初期変性（９６℃、３０秒）、４０サイクルの増幅（９４℃、１５秒；４８℃、３０秒；６８℃、３分）、最終伸張（６８℃、３０分）。

ＰＣＲ産物は、標準的な方法に従ってプラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングされ、確認のために配列決定される。ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡの生成は、ＧＡＴＡ−３を含有するプラスミドｐＣＲ２．１を、制限酵素Ｓｐｅ Ｉを用いた切断により直線化した後、製造者の指示に従ったｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（Ａｍｂｉｏｎ社）によって行われる。該ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡの長さは、全体で２８７６ヌクレオチドである。

図４は、データバンク［ＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）］に登録されている既知のヒトＧＡＴＡ−３遺伝子のヌクレオチド配列であるが、塩基が多様な場合は灰色のバックで強調されている。配列１：ヒトＧＡＴＡ−３、データバンクＮｏ．： ＸＭ＿０４３１２４、配列２：ヒトＧＡＴＡ３、データベースＮｏ．： Ｘ５８０７２、配列３：ヒトＧＡＴＡ−３（プラスミドｐＣＲ２．１より単離）。

ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡ配列は、３’−非翻訳末端または５’−非翻訳末端の長さによりお互いに区別される。ｍＲＮＡの正確な全配列を得るため、プライマーの選択に、登録番号ＸＭ＿０４３１２４およびＸ５８０７２のｍＲＮＡ配列を使用した。ＧＡＴＡ−３クローニング用プライマーの位置は、図４において下線で強調されている。図４には更に、プラスミドｐＣＲ２．１から配列決定されたヌクレオチド配列（配列３）と、データバンクの（配列１および２）ＧＡＴＡ−３の核酸配列とのアライメントも示されている。図から、配列は完全に同一ではなく、それぞれいくつかの塩基が異なっていることが分かる。図４のＧＡＴＡ−３の核酸配列３が、本発明のＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡに対するＤＮＡｚｙｍｅコンストラクトの基礎をなしている。

図４Ａには、図４のヒトＧＡＴＡ−３遺伝子の配列３のヌクレオチド配列が示されており、そしてその間に更なるＤＮＡｚｙｍｅ切断候補となる部位がある各２つのヌクレオチドＧＴまたはＡＴが灰色のバックで強調されて示されている。

ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡのＤＮＡｚｙｍｅ（ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断実験は、以下：５０ ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２５μＭのＤＮＡｚｙｍｅおよび０．０２５μＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡ（基質対ＤＮＡｚｙｍｅ比は、１：１０）、の反応混合物からなる容量１０μｌ内で行われた。反応は、３７°Ｃにおいてそれぞれ記載された時間インキュベートされた。ホルムアミドおよびＥＤＴＡを含むＲＮＡ−Ｓａｍｐｌｅ−Ｌｏａｄｉｎｇ−Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ社）を加えて反応を停止した。変性させた試料を、１．３％ＴＡＥアガロースゲル上で分離し、ＵＶトランスイルミネーターで解析した。

図５は、ゲル電気泳動の結果として、非修飾ＤＮＡｚｙｍｅ［ｈｇｄ １１（レーン２）、ｈｇｄ １３（レーン４）、ｈｇｄ １７（レーン６）、ｈｇｄ ４０（レーン８）］および修飾ＤＮＡｚｙｍｅ［ｈｇｄ １１−Ｍ（レーン３）、ｈｇｄ １３−Ｍ（レーン５）、ｈｇｄ １７−Ｍ（レーン７）、ｈｇｄ ４０−Ｍ（レーン９）］によるＧＡＴＡ−３標的ｍＲＮＡの切断を示す。レーン１は、コントロールとしてＤＮＡｚｙｍｅを加えていないｍＲＮＡを含む。修飾ＤＮＡｚｙｍｅは、Ｍをつけて区別している。使用した分子量スタンダード（図示せず）は、１０００ｂｐ、２０００ｂｐおよび３０００ｂｐのバンドの大きさを示した。矢印は、基質（ここではＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡ）のバンドＳ、および切断生成物Ｐ１およびＰ２を示す。

７０個全てのＤＮＡｚｙｍｅ間での比較から、ｈｇｄ １１、ｈｇｄ １３、ｈｇｄ １７ および ｈｇｄ ４０が特に活性であり、修飾によりＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １１， ｈｇｄ １３およびｈｇｄ １７では効率が下がるものの、ＤＮＡｚｙｍｅｓ ｈｇｄ ４０の効率は下がらないことが分かる。

以下の表に、ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡに対するＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １〜ｈｇｄ ７０を４つのグループに分けて示す。この分類は、ＧＡＴＡ−３ ｍＲＮＡに対するＤＮＡｚｙｍｅのｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性試験の実施結果に基づいている。グループ１：高い切断活性、グループ２：中程度の切断活性、グループ３：弱い切断活性、グループ４：測定可能な切断活性なし。

ｃ）段階ｂ）の特異的なリボ核酸分子の標的細胞への導入
高い活性を示したＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １１、ｈｇｄ １３、ｈｇｄ １７およびｈｇｄ ４０を、上述のように修飾してまたは修飾しないで標的細胞に使用した。

これにあたりまず、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞（ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞）を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％のＦＫＳを含むＲＰＭＩ培地において、３７°Ｃ、高湿度で、５％のＣＯ_２雰囲気下にて培養した。トランスフェクションは、６ウェルプレートで行った。２ｘ１０^６個のＪｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ−Ｉ−細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に移し、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、修飾ＤＮＡｚｙｍｅ（０．３μＭ）で形質転換を行った（方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の指示に従った）。前記条件の培養器内で１０時間インキュベーションを行った後、ＲＰＭＩ培地（前記の成分を含む）を加え、更に１４時間インキュベーションを続けた。細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で洗浄した後、上述のプロトコールに従って再度、形質転換を行った。各々のトランスフェクション後、トランスフェクション効率をＦＡＣＳ解析によって評価した。

引き続き、ＤＮＡｚｙｍｅの活性を、ＧＡＴＡ−３タンパク質量をウェスタンブロット法で調べることにより評価した（図６参照）。

ウェスタンブロット解析用に、細胞質タンパク質および核タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ−Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて、メーカーの指示に従って分離した。タンパク質濃度は、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）で測定した。それぞれ３０ μｇのタンパク質の分離を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける変性ゲル電気泳動によって行った。引き続き、タンパク質を標準的な方法でニトロセルロース膜上にブロットした。該膜を、５％のスキムミルクを含むＰＢＳ（０．０１％のＴｗｅｅｎ ２０含有）でブロッキングした後、マウス抗ＧＡＴＡ−３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）（１：５００）を、続いてＨＲＰ標識マウス抗ウサギ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）（１：２０００）を加えてそれぞれ１時間、室温でインキュベーションを行った。タンパク質は、化学発光によって可視化した。平行してブロット上のベータ−アクチンを検出し、ブロットされたタンパク質量のばらつきを確かめた。この際、まずニトロセルロース膜上のＧＡＴＡ−３を検出した。続いて、同じ膜を高湿度のチャンバー内に一晩置いた。ＰＢＳで２回洗浄後、β−アクチンを特異的抗体（マウス抗ヒトベータ−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ社））による免疫染色によって検出した。

図６は、細胞内におけるＤＮＡｚｙｍｅ活性の結果による免疫ブロットの結果を示す。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞を、ＤＮＡｚｙｍｅ（レーン４＝ｈｇｄ １１−Ｍ、レーン５＝ｈｇｄ １３−Ｍ、レーン６＝ｈｇｄ １７−Ｍ、レーン７＝ｈｇｄ ４０−Ｍ）を伴うリポフェクションにより形質転換した。コントロールとしては、未処理の（レーン１）、トランスフェクション試薬でのみ処理された（レーン２）およびトランスフェクション試薬なしでＤＮＡｚｙｍｅのみで処理された（レーン３）細胞を使用した。４８時間インキュベーションを行った後、可溶化したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＧＡＴＡ−３（Ａ）を特異的抗体による免疫ブロットで検出した。各レーンあたりのタンパク質量が同一であることを確認するために、同一のブロット膜上でβ−アクチン（Ｂ）による免疫染色を行う。一緒に使用した分子量スタンダード（図示せず）は、６３．８ｋＤａ、４９．５ｋＤａおよび３７．４ｋＤａの大きさのタンパク質のバンドを示す。

ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ １１、ｈｇｄ １３およびｈｇｄ １７がｉｎ ｖｉｖｏでは不活性であるのに対し、ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ ４０はＧＡＴＡ−３発現をｉｎ ｖｉｖｏでも阻害する。従って、ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ ４０によるｉｎ ｖｉｖｏでのＧＡＴＡ−３発現の特異的な阻害は、慢性炎症性疾患の治療のための有効な治療手段となる。

ｄ）薬剤中への、段階ｂ）の特異的なリボ核酸および／または段階ｃ）の標的細胞の製剤化
ＧＡＴＡ−３特異的な基質結合ドメインを有する種々のＤＮＡｚｙｍｅの解析により、ＤＮＡｚｙｍｅ ｈｇｄ ４０がＧＡＴＡ−３の発現をｉｎ ｖｉｖｏにおいて特異的に阻害し、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤を製造するための特異的なリボ核酸として適していることが示される。ここでは、ｈｇｄ ４０（５’−ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ）またはｈｇｄ ４０で形質転換された細胞を、薬学的に許容可能なキャリアー、例えばリポソームまたは生分解性ポリマーを含む医薬組成物に組み入れる。

ＧＡＴＡ−３発現の特異的な阻害、および細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤の製造のためのＤＮＡｚｙｍｅの代替としては、ｓｉＲＮＡの使用が考えられる。ｓｉＲＮＡは、マウスおよびヒトＧＡＴＡ−３の阻害に使用されることが好ましい。ｓｉＲＮＡの製造方法は当業者に公知であり、文献にも記載されている。以下にｓｉＲＮＡ配列の例を挙げる。

実施例２：Ｔ−ｂｅｔに対するＤＮＡｚｙｍｅ
ａ）その標的細胞における発現が、コントロール細胞での発現と比較して差異を示すリボ核酸分子の同定
上述の方法と同様に同定を行った。

標的細胞（Ｔｈ１細胞）におけるＴ−ｂｅｔの発現は、コントロール細胞（Ｔｈ０細胞）における発現と比較して差異を有する。

ｂ）段階ａ）のリボ核酸分子に結合し、それを機能的に不活化する特異的なリボ核酸分子の設計
Ｔ−ｂｅｔの切断部位の同定は、ＧＡＴＡ−３に関する記載と同様に行った。

図７は、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに対して特異的なＤＮＡｚｙｍｅである本発明のプール ｔｄ １〜ｔｄ ７８を示す。該ＤＮＡｚｙｍｅの全長は３３ヌクレオチドであるが、中心の触媒ドメインは１５ヌクレオチド（小文字）であり、公知の１０−２３ ＤＮＡｚｙｍｅ（図２）の触媒ドメインと一致する。この触媒ドメインは、それぞれ９ヌクレオチドからなる２つの基質結合ドメイン（大文字）に左右から挟まれている。左右の基質結合ドメインのヌクレオチド配列は、ＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ１〜ｔｄ７８において異なっており且つ可変であるため、Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡへのワトソン・クリック対合による様々な特異的結合が生じる。

ＤＮＡｚｙｍｅは、プリン−シトシン結合よりもプリン−ウラシル結合において標的ｍＲＮＡを効果的に切断することが、文献により知られており、プリン−ウラシル結合を切断するＤＮＡｚｙｍｅを設計することが好ましい。図２に示したモデルは、その作用様式においてＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ１〜ｔｄ７８とＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡとの結合にも当てはめることができる。ＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ １〜ｔｄ ７８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験には修飾されていないものを使用し、培養細胞における実験にはＧＡＴＡ−３の時と同様に修飾されたものを用いた。

ＤＮＡｚｙｍｅの切断特性およびＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの標的ｍＲＮＡの機能的不活化を示すため、ヒトＥＤＴＡ−全血からＱＩＡａｍｐ−ＲＮＡ−Ｂｌｏｏｄ−Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ社製、ドイツ）を用いて単離されたＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡを、製造者の指示に従ってｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。

図８は、配列１を取り出すデータバンク［ＰｕｂＭｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）］に登録されているＮｏ．： ＮＭ＿０１３３５１の配列のような、ヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。

逆転写は、標準的手法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ）に従って、フォワードプライマー：ＣＧＧＣＣＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＣおよびリバースプライマー：ＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＣＡＡＣＣを用いて行われ、長さ２４５０ヌクレオチドのＰＣＲ産物が増幅される。ＰＣＲ産物は、標準的な方法に従ってプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングされ、確認のために配列決定される。

図８は、Ｔ−ｂｅｔ Ｎｏ．： ＮＭ＿０１３３５１（配列１）と配列決定された配列（配列２）の核酸配列の比較を示す。図から、配列は完全に同一ではなく、いくつかの塩基が置換されていることが解る。図８のＴ−ｂｅｔの核酸配列２が、本発明のＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに対するＤＮＡｚｙｍｅコンストラクトの基礎をなしている。

図８Ａには、図８のヒトＴ−ｂｅｔ遺伝子の配列１のヌクレオチド配列が示されており、そしてその間に更なるＤＮＡｚｙｍｅ切断候補となる部位がある各２つのヌクレオチドＧＴまたはＡＴが灰色のバックで強調されて示されている。

Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの生成は、Ｔ−ｂｅｔを含有するプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫを、制限酵素Ｘｂａ Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用いた切断により直線化した後、製造者（Ａｍｂｉｏｎ社）の指示に従ったｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって行われる。該Ｔ− ｂｅｔ ｍＲＮＡの全長は、２５５０ヌクレオチドである。

Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡのＤＮＡｚｙｍｅ（ｔｄ １〜ｔｄ ７８）によるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断実験は、ＧＡＴＡ−３の場合と同様に実施、分析される。図９は、ゲル電気泳動の結果として、修飾ＤＮＡｚｙｍｅ［ｔｄ ５４−Ｍ（レーン３）， ｔｄ ６９−Ｍ（レーン４）およびｔｄ ７０−Ｍ（レーン５）］によるＴ−ｂｅｔ標的ｍＲＮＡの切断を示す。レーン２は、コントロールとしてＤＮＡｚｙｍｅを加えていないＴ−ｂｅｔ標的ｍＲＮＡを含む。使用した分子量スタンダード（レーンＭ）は２０００ｂｐおよび３０００ｂｐのバンドの大きさを示した。矢印Ａは、基質（ここではＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ）のバンドを、矢印Ｂは、２つの切断生成物のうちの１つ（もう一方の切断生成物はこの図には見られない）を示す。

７８個全てのＤＮＡｚｙｍｅ間での比較から、ｔｄ ５４、ｔｄ ６９およびｔｄ ７０が特に活性であり、修飾してもＤＮＡｚｙｍｅの効率は下がらないことが分かった。

以下の表にｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに対するＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ １〜ｔｄ ７８を４つのグループに分けて示す。この分類は、ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡに対するＤＮＡｚｙｍｅのｉｎ−ｖｉｔｒｏ活性試験の実施結果に基づいている。グループ１：高い切断活性、グループ２：中程度の切断活性、グループ３：弱い切断活性、グループ４：測定可能な切断活性なし。

ｃ）段階ｂ）の特異的なリボ核酸分子の標的細胞への導入
ＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ５４、ｔｄ６９およびｔｄ７０を、上述のように修飾してまたは修飾しないで標的細胞に使用した。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞のトランスフェクションは、ＧＡＴＡ−３の実施例同様に行った。Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞のトランスフェクション後、ＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡの発現に対する相対的なＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡ量を、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ， Ｒｏｃｈｅ社）を用いて定量的に測定し、ＤＮＡｚｙｍｅのｉｎ ｖｉｔｒｏ効率を調べた。

ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ分析用に、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞のＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）で精製し、続いて分光学的（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｓｃｈ）に平均化した。製造者の指示に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ社）により逆転写した後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡを定量的に解析した。ＰＣＲの全容量は２０μｌで、その中には、１μｌのＤＮＡ、各１μｌ（０．５μＭ）のセンス−およびアンチセンス−プライマーおよび１０μｌのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ−ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ−ＰＣＲ−Ｍａｓｔｅｒ−Ｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）が含まれる。使用したＴ−ｂｅｔ用ＰＣＲプライマーは：センス５’−ＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＴＡＣＴＡＣＣＧ−３’；アンチセンス５’−ＧＣＡＡＴＣＴＣＡＧＴＣＣＡＣＡＣＣＡＡ−３’である。使用したＧＡＰＤＨ用ＰＣＲプライマーは：センス５’−ＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧ−３’およびアンチセンス５’−ＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡ−３’である。使用したＰＣＲ条件は：変性（１５分９５℃）、増幅（１５秒９５℃、２５秒５９℃、２５秒７２℃を５０サイクル）、さらに最終伸張２分７２℃である。引き続いて、融解曲線を、以下のように作成する：０秒９５℃、１５秒６０℃、続いて温度を０．２℃間隔で９７℃まで上昇させ、同時に蛍光を連続的に測定する。全てのＰＣＲ産物が特有の融解温度を持っているので、融解曲線は内部標準として使用される。

ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎは、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光色素（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに含まれる）である。伸張の間にＤＮＡが二本鎖になると、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎがそこに結合して結合依存性の蛍光シグナルが発生し、各伸張の最後にＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒがこれを検出する。出発物質の量が多いほど、蛍光の有意な増加が早くに検出される。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒのソフトウェアによって、各サイクルに対して収集された蛍光強度が図示される。

図１０において、ナンセンスＤＮＡｚｙｍｅ処理と比較して、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞をＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ５４ｍ、ｔｄ６９ｍおよびｔｄ７０ｍで処理した後の、Ｔ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ増幅曲線を示す。バックグラウンドの蛍光と有意に区別される蛍光の起点をＰＣＲサイクルとして定義する各「交点」（Ｃｔ）は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアのＦｉｔ−Ｐｏｉｎｔ法において手動で決定される。ＤＮＡｚｙｍｅで処理された細胞および比較としてナンセンスＤＮＡｚｙｍｅで処理された細胞内のＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡおよびＧＡＰＤＨ−ｍＲＮＡの半定量化は、説明書［Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２ （ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃２ （２００１） Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｔｔｐ：／／ｄｏｃｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｐｅｂｉｏｄｏｃｓ／０４３０３８５９．ｐｄｆ）］の方法に従って実施した。なおコントロール実験のＴ−ｂｅｔ−ｍＲＮＡの量を１００％とした。半定量化のデータは、図１１にグラフとして示されている。

ナンセンスＤＮＡｚｙｍｅ処理と比較して、ｔｄ６９ｍ−ＤＮＡｚｙｍｅでは抑制が８１．３％、ｔｄ７０ｍ−ＤＮＡｚｙｍｅでは抑制が８１．０％に達する一方、ｔｄ５４ｍ−ＤＮＡｚｙｍｅではＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡ抑制効果は見られなかった。

この結果は、ｔｄ５４ｍ−ＤＮＡｚｙｍｅはｉｎ ｖｉｖｏで不活性であるが、ｔｄ６９ｍ−ＤＮＡｚｙｍｅおよびｔｄ７０ｍ−ＤＮＡｚｙｍｅは、細胞環境においてもＴ−ｂｅｔのｍＲＮＡを不活化することを示している。よってＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ６９ｍおよびｔｄ７０ｍによるｉｎ ｖｉｖｏにおけるＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの特異的な減少は、慢性炎症性疾患の治療に効果的な手段である。

ｄ）薬剤中への、段階ｂ）の特異的なリボ核酸および／または段階ｃ）の標的細胞の製剤化
様々なＴ−ｂｅｔ特異的な基質結合ドメインを有するＤＮＡｚｙｍｅの分析により、ＤＮＡｚｙｍｅ ｔｄ６９およびｔｄ７０がＴ−ｂｅｔの発現をｉｎ ｖｉｖｏにおいて特異的に阻害し、細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤製造のための特異的なリボ核酸として適していることが示される。

ここでは、ｔｄ６９（ＧＧＣＡＡＴＧＡＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＴＧＧＧＴＴＴＣＴ）またはｔｄ７０（ＴＣＡＣＧＧＣＡＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＡＡＣＴＧＧＧＴ）、またはｔｄ６９ｍまたはｔｄ７０ｍで形質転換された細胞を、薬学的に許容可能なキャリアー、例えばリポソームまたは生分解性ポリマーを含む医薬組成物に組み入れる。

Ｔ−ｂｅｔ発現の特異的な阻害、および細胞および／または組織および／または疾患フェーズ特異的な薬剤の製造のためのＤＮＡｚｙｍｅの代替としては、ｓｉＲＮＡの使用が考えられる。ｓｉＲＮＡは、ヒトＴ−ｂｅｔの阻害に使用されることが好ましい。ｓｉＲＮＡの製造方法は、当業者に公知であり、文献にも記載されている。以下にｓｉＲＮＡ配列の例を挙げる。

本発明の記載に基づけば、ＴＨ１細胞またはＴＨ２細胞の分化に関与するさらなる転写因子、例えばＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＲＥＢ２、ＡＴＦ−２、ＡＴＦ−２、Ｈｌｘ、ＩＲＦ−１、ｃ−Ｍａｆ、ＮＦＡＴ、ＮＩＰ４５、ＡＰ１、Ｍｅｌ−１８、ＳＫＡＴ−２、ＣＴＬＡ−４に対する、またはサイトカインの分化および／または発現に関するさらなるシグナル伝達経路の因子、例えばＳｒｃキナーゼ、Ｔｅｃキナーゼ、Ｒｌｋ（ヒトではＴｘｋ）、Ｉｔｋ、Ｔｅｃ、ＲＩＢＰ、ＰＬＣγ、ＭＡＰキナーゼ、ＥＲＫ、ＪＮＫ、Ｐ３８、ＭＫＫ、ＭＫＫ１、ＭＫＫ２、ＭＫＫ３、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７、Ｒａｃ２、ＧＡＤＤ４５、ＧＡＤＤ４５β、ＧＡＤＤ４５γ、ＳＯＣＳ、ＣＩＳ、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＪＡＫ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＮＩＰ４５に対する特異的なＤＮＡｚｙｍｅまたはｓｉＲＮＡを、慢性炎症性疾患および自己免疫疾患に対する薬剤として容易に製造し得るということは、当業者にとって明らかである。

これらのタンパク質は、コントロール細胞での発現と比較して標的細胞において高い発現を示す。

Claims (8)

1. 以下：
   ・ヌクレオチド配列ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡを有する触媒ドメインであって、それが結合する各々のプリン−ピリミジン結合部位においてＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡを切断する触媒ドメイン
   ・触媒ドメインの３’末端に結合する右側の基質結合ドメイン、および
   ・触媒ドメインの５’末端に結合する左側の基質結合ドメインであって、前記２つの基質結合ドメインはＴ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの２つの領域とそれぞれ相補的であるために前記ｍＲＮＡとハイブリダイズする
   ・ｉｎ ｖｉｖｏで活性である、および
   ・配列ｔｄ６９ ＧＧＣＡＡＴＧＡＡ ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ ＴＧＧＧＴＴＴＣＴまたはｔｄ７０ ＴＣＡＣＧＧＣＡＡ ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ ＧＡＡＣＴＧＧＧＴを含む、
   からなることを特徴とする、ＤＮＡｚｙｍｅ。
2. Ｔ−ｂｅｔ ｍＲＮＡの触媒ドメインをプリン−ウラシル結合部位で切断することを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡｚｙｍｅ。
3. ３’−３’インバージョン（Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）の導入により、生体における分解に対して安定化されていることを特徴とする、請求項１または２記載のＤＮＡｚｙｍｅ。
4. 修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド化合物の導入により、生体における分解に対して安定化されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡｚｙｍｅ。
5. 修飾として、３’末端のインバースチミジン（ｉｎｖｅｒｓｅｓ Ｔｈｙｍｉｄｉｎ）および／または５’末端のＦＡＭ標識を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１つに記載のＤＮＡｚｙｍｅ。
6. 請求項２〜５のいずれか１つに記載のＤＮＡｚｙｍｅおよび薬学的に許容可能なキャリアーを含む薬剤。
7. 慢性炎症の治療用薬剤の製造のための、請求項１〜５のいずれか１つに記載のＤＮＡｚｙｍｅの使用。
8. 慢性炎症の治療のために患者の標的細胞におけるＴ−ｂｅｔ発現を特異的に阻害するための薬剤の製造のための、請求項１〜５のいずれか１つに記載のＤＮＡｚｙｍｅの使用。

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