JP4964752B2 - 粒子を選別する方法および装置 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、2002年4月17日に出願された米国仮特許出願第60/373,256号、2002年6月24日に出願された米国特許出願第10/179,586号、2002年9月16日に出願された米国仮特許出願第60/411,058号、2002年12月23日に出願された米国特許出願第10/329,008号に対する優先権を主張する。本出願は、2002年6月24日に出願された米国特許出願第10/179,488号の一部係属出願である。それらの内容はすべて参照として本明細書に組み入れられる。

発明の技術分野
本発明は、懸濁液中の粒子を選別する方法および装置に関連するが、選別モジュールの投入流路は数本の産出通路に分岐することができる。より詳細には、本発明は高スループットで粒子を処理できるように複数の選別モジュールが相互接続されている粒子選別システムに関する。

発明の背景技術
バイオテクノロジー、および特別には細胞学および薬物スクリーニングの分野では、高スループット（処理能力）での粒子選別に対する必要がある。選別を必要とする粒子の例は、血小板、白血球、腫瘍細胞、胚細胞等の様々なタイプの細胞である。これらの粒子に対しては、特に細胞学の分野において関心が高い。その他の粒子は、タンパク質、酵素およびポリヌクレオチド等の（高）分子種である。この粒子ファミリーに対しては、新薬開発中の薬物スクリーニングの分野において特に関心が高い。

粒子選別のための方法および装置は知られており、その大多数は先行技術の研究に記載されている。それらの方法および装置の条件では、粒子は液体中に懸濁しており、少なくとも1つの分岐点を下流に有する通路網を通って流れ、検出−判定−偏向原理によって作動させられる。移動する粒子は、光吸収、蛍光強度、サイズ等の特定の特徴について最初に分析される。この検出期の結果に依存して、さらに下流で粒子を処理する方法が決定される。決定の結果は次に、通路網の所定の分岐部へ向けて特異的粒子の方向を偏向させるために適用される。

重要なのは選別装置のスループット、すなわち時間単位毎に選別することのできる粒子数である。閉鎖通路内の粒子懸濁液の流れを使用する選別機にとって典型的な選別速度は、単一選別装置について、毎秒数百個から毎秒数千個の範囲内の粒子数である。

選別装置の1つの例は、その内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,175,662号（以下第‘662号特許という）に記載されている。第‘662号特許では、この場合には細胞である粒子の流れは、下流の分岐点（T−分岐）で2本の垂直通路に分岐する直線状通路の中央を通って流れる。流入してきた粒子は、粒子を通路の中心に限定させて維持する適合性の液体のシースによって取り囲まれる。通常の条件では、2本の分岐導管を通過する流速は粒子が2本の分岐導管の1本を自動的に通って流れるように調整される。通路の1区域では、粒子の特徴が光学系であってよい検出器を使用して決定される（検出期）。検出器は、検出器が決定期において所定の特徴を有する粒子を検出するとシグナルを発生する。粒子が検出されると、偏向期に粒子を偏向させるために偏向器が作動させられる。この場合、偏向器は、粒子が通常は偏向器の非作動状態で貫流する通路の分岐導管に配置された電極対を含む。電流パルスを適用することによって、水溶液が電気分解され、電極対の間で発生する気泡を産生する。発生期中には、気泡のサイズが大きくなるにつれてこの分岐部を通過する流速は低下する。電流パルスが適用されると、気泡の成長が停止して気泡は流れに沿って運ばれる。その結果、特定分岐導管を通過する流れはすぐに減少し、対象となる粒子は流路を変更して別の分岐導管へ流下する。

第‘662号特許の装置は、粒子を選別するために有効である。しかし、気泡が作り出され、これが流路網の一定地点で潜在的に蓄積する可能性があるという1つの重大な欠点がある。この気泡生成は流路を詰まらせ、誤った選別を生じさせることがある。生成した気体（ほとんどは酸素と水素）およびイオン種（ほとんどはOH⁻およびH^＋）が電極対と共に分岐導管を通って流れる粒子に影響を及ぼすというまた別の欠点もある。さらに、細胞および酵素等の繊細なタンパク質は極めて脆弱であり、気泡と共生成される汚損成分によって破壊される可能性がある。また別の欠点は、選別装置全体の複雑性である。詳細には、微小電極の構成はシステムの小さな通路内に取り付けて組み立てるのが極めて複雑である。その結果、選別装置の費用は相当な高額になる。

先行技術の粒子選別システムのまた別の例は、その内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第3,984,307号（以下第‘307号特許）に記載されている。第‘307号特許では、粒子は、流れているシース液によって限定され、通路の中心を通って流れる。検出器区域を通過した後、通路は2本の通路に分岐してそれらの間に鋭角を形成する（例、Y−分岐）。分岐点の直前には、適切な所定の特徴を有する特異的粒子を偏向させるために、電気作動式のトランスデューサーが通路内に配置されている。上記のトランスデューサーは圧電型アクチュエーターまたは超音波トランスデューサーであり、電気的作動後に通路内で圧力波を産生する。生成した圧力波は一方の分岐導管では瞬間的に流れを妨害し、他の分岐導管へ対象となる粒子を偏向させる。

第‘307号特許の装置では、上記で考察した装置と同様に、通路システム内に偏向器が組み込まれているので、相当に高額の建造コストを生じさせる。この装置のまた別の欠点は、使用される偏向器の原理である。生成する圧力波は分岐点には限定されず、むしろ検出器区域内へ向かって上流へ、ならびに両方の分岐導管へ向かって下流へ伝播する。これは通路を通る流れ全体に影響を及ぼす。これは、このタイプの選別機が高スループットの選別システムを構築するために典型的に実施されるように、直列または並列で接続されている場合は特に欠点となる。1つの選別機内で生成した圧力波は次に、隣接する選別機装置内の粒子の流れおよび偏向に影響を及ぼす可能性がある。

また別の選別機は、その内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,756,427号に記載されている。この選別機は、第‘662号特許に記載の選別機に類似する。しかしこの場合、1本の分岐導管内の流れは分岐導管の抵抗を瞬間的に変化させることにより妨害される。抵抗は、外部アクチュエーターによって分岐通路の高さを変化させることによって変化させられる。好ましい態様では、この外部アクチュエーターは通路の上部に接着剤で取り付けられた圧電性ディスクであり、作動すると通路が下方へ向かって移動することを引き起こす。

第‘427号特許に記載された選別機の構築は上記に記載した選別機の構造より複雑ではないが、選別速度を上昇させるために記載したタイプの複数の選別機モジュールを一緒に結合することはなお問題が多い。これは、第‘307号特許に記載した選別機における場合と同様に、生成した圧力波が他の選別モジュールへの干渉を惹起するためである。

また別の粒子選別装置は、その内容が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,837,200号に記載されている。第‘200号特許は、粒子をそれらの磁気特性に基づいて分類または選択するために磁気偏向モジュールを使用する選別装置について記載している。第‘200号特許は、並列で個別の粒子の流れを処理および分離する方法について記載している。

発明の要約
本発明は、キャピラリーサイズの閉鎖通路システム内を移動する粒子を選別する方法および装置を提供する。本発明の粒子選別システムは、単位時間当たり大量の粒子を選別する正確な手段を提供しながら、低コストで組み立てることのできる選別モジュールを提供する。この粒子選別システムは、選別速度をさらに上昇させるために結合された複数の緊密に結合した選別モジュールを含むことができる。粒子選別システムは、エラー率を低下させるために、粒子の流れを連続的に選別するための多段式選別装置を含むことができる。

本粒子選別システムは、本発明による改良された流体粒子スイッチング法およびスイッチユニットを実行する。本粒子選別システムは、粒子を選別するためのキャピラリーサイズの閉鎖通路システムを含む。通路システムは、粒子の流れを導入するための第1供給導管および担体液を供給するための第2供給導管を含む。第1供給導管は、担体液の流れの中に粒子の流れを導入するためのノズルを形成する。第1供給導管および第2供給導管は測定導管と流体連通しており、測定導管は分岐点で第1分岐導管および第2分岐導管に分岐する。測定領域は測定導管内に限定されており、測定領域内の粒子の所定の特徴を感知するために検出器と結び付けられている。2つの対向する気泡弁は測定導管と連通して配置されており、間隔をあけて相互に対向している。気泡弁は、1対の対向するサイド通路を通って測定導管と連通している。気泡弁のリザーバーとともに担体液と接触するメニスカスを形成するために、これらのサイド通路には液体が部分的に満たされる。さらに気泡弁の1つを作動させるために、外部アクチュエーターが用意されている。外部アクチュエーターが作動すると、作動させられた気泡弁のリザーバー内の圧力は上昇し、メニスカスを偏向させ、その中の流れを偏向させるために測定導管内の流れ妨害を引き起こす。

測定領域内に配置されたセンサーが測定領域内を流れる粒子中で所定の特徴を感知すると、センサーは感知した特徴に反応してシグナルを発生する。このセンサーに外部アクチュエーターが反応して第1気泡弁の圧力チャンバー内で圧力パルスを発生させて所定の特徴を備える粒子を偏向させ、選択された粒子が第2分岐導管に流下することを引き起こす。

1つの局面では、本発明は入口および導管が2本の分岐導管に分離する分岐点を有する測定導管を提供する段階と、粒子が通常は第1分岐導管を通って流れるようにその中に懸濁した粒子の流れとともに流体の流れを導管入口へ導入する段階と、および導管内の流れを瞬間的に偏向させるために分岐点の上流に2本の対向するサイド通路を提供する段階と、を含む粒子を選別する方法を含む。第1サイド通路は、その中の圧力を加減させるために外部アクチュエーターによって作動させられる第1気泡弁の圧力チャンバーへ油圧接続している。第2サイド通路は、圧力変動を吸収するために第2気泡弁のバッファーチャンバーと油圧接続している。本方法はさらに、流れの中の粒子の所定の特徴を感知するため、および所定の特徴が感知したときにシグナルを発生するためにサイド通路の上流で測定導管に沿って測定ステーションを提供する段階を含む。本方法はさらに、所定の特徴の感知に反応して、サイド通路間で導管内の流れ妨害を作り出すために外部アクチュエーターを作動させ、それにより所定の特徴を有する粒子を偏向させ、そして選択された粒子が第2分岐導管へ流下することを引き起こす段階を含む。

本発明のまた別の局面では、複数の選別モジュールを並列で接続することによって、または複数の選別モジュールを2進木様形状で直列接続することによって、粒子選別速度が個々に上昇させられる、または選別される粒子のタイプが増加させられる。

本発明の1つの局面によると、粒子選別システムが提供される。本粒子選別システムは、入口、第1出口および第2出口を含む担体液中に閉じ込められた懸濁した粒子の流れを運ぶための第1導管、粒子内の所定の特徴を感知するセンサー、第1導管と連通しているサイド通路、サイド通路に隣接して配置された密閉チャンバーであって、担体液が担体液から密閉チャンバーを分離するためにサイド通路内にメニスカスを形成する密閉チャンバー、およびアクチュエーターを含む。アクチュエーターは、センサーが所定の特徴を感知するとメニスカスを偏向させるために密閉チャンバー内の圧力を加減する。メニスカスの偏向は、所定の特徴を有する粒子が第2出口内に流入し、所定の特徴を有していない粒子が第1出口内に流入することを引き起こす。

発明の詳細な説明
本発明は、液体中に懸濁した粒子を選別するための粒子選別システムを提供する。本粒子選別システムは、所定の特徴に基づいて粒子の高スループットかつ低エラーの選別を提供する。下記では、実例の態様を参照しながら本発明について説明する。当業者は、本発明を多数の様々な用途および態様で実施するできること、そしてその適用が本明細書に記載した特定態様に特別には限定されないことを理解するであろう。

本明細書で使用する用語「導管」、「通路」および「流路」は、液体および気体等の流体の移動を可能にする媒体内または媒体を通って形成された経路を意味する。マイクロ流体システム内の通路は、好ましくは約1．0μmから約500μm、好ましくは約25μmから約250μm、および最も好ましくは約50μmから約150μmの範囲内の断面寸法を有する。当業者であれば、適切な流路の容積および長さを決定することができるであろう。その範囲は、上限または下限として上記に言及した数値を含むことが意図されている。流路は、あらゆる選択された形状または配置を有することができ、その例には線形または非線形構成およびU形構成が含まれる。

用語「粒子」は、細胞を含むがそれに限定されない個別物質単位を意味する。

本明細書で使用する用語「センサー」は、粒子等の物体の特徴を測定するための装置を意味する。

本明細書で使用する用語「気泡弁」は、通路を通る流れを制御するための圧力パルスを発生させる装置を意味する。

本明細書で使用する用語「担体液」は、導管または通路を通って一つまたは複数の粒子を運ぶために粒子を取り囲んでいる適合性の液体のシースを意味する。

図1は、本発明の教示による粒子選別システム10の略図である。本発明の1つの適用によると、粒子選別システム10は、粒子を選別するためのキャピラリーサイズの閉鎖通路システムを含む。通路システムは、粒子の流れ18を導入するための第1供給導管12および担体液を供給するための第2供給導管14を含む。第1供給導管12はノズル12aを形成し、そして粒子の流れは担体液の流れの中に導入される。第1供給導管12および第2供給導管14は、担体液中に懸濁した粒子を運ぶために測定導管16と流体連通している。測定導管は、分岐点21で第1分岐通路22aおよび第2分岐通路22bへ分岐する。測定領域20は測定導管16内に限定されており、測定領域20を通過する粒子の所定の特徴を感知するために検出器19と結び付けられている。2つの対向する気泡弁100aおよび100bは、測定導管に関連して配置され、それらと流体連通して配置されている。弁は相互に対向して間隔をあけて置かれているが、当業者はその他の構成も使用できることを理解するであろう。気泡弁100aおよび100bは、各々1対の対向するサイド通路24aおよび24bを通って測定導管16と連通している。その中でメニスカス25を形成するように、これらのサイド通路24aおよび24bには液体が部分的に満たされる。メニスカスは、担体液と関連する気泡弁100のリザーバー内の気体等の他の流体との界面を定義する。アクチュエーター26は、さらにどちらかの気泡弁を作動させるために提供されており、気泡弁はアクチュエーター26によって作動させられるとその中で流れを偏向させるために導管内の流れ妨害を瞬間的に引き起こす。図示したように、アクチュエーターは気泡弁100bと結合されている。第2気泡弁100aは、第1気泡弁100bによって作り出される圧力パルスを吸収するためのバッファーとして機能する。

第1サイド通路24bは第1気泡弁100b内で圧縮チャンバー70bと油圧接続されているので、このチャンバー内の圧力が上昇すると、サイド通路近くの測定導管内の流れが内側へ、実質的には導管内の通常の流れに対して垂直に移動させられる。第1サイド通路24bの反対側に位置する第2サイド通路24aは、圧力変動を吸収するために第2気泡弁100a内のバッファーチャンバー70aと油圧接続されている。第1サイド通路24bは第2サイド通路24aと協働して圧縮チャンバー70bに加圧することによって引き起こされる、つい先程言及した液体移動を指示するので、この移動は測定導管を通る粒子の通常の流れに対して垂直な成分を有する。

圧縮チャンバー70bが加圧されると、第1サイド通路24bからある量の液体が一時的に放出される。第2サイド通路24aの弾力性は、加圧性放出を受けて導管内の液体の第2サイド通路24a内への一時的な流れを生じさせる。2本のサイド通路およびそれらが相互連通している流体構造の協働は、検出手段19により発生したシグナルに反応して外部アクチュエーター26によって惹起された圧縮チャンバー70bの加圧および減圧を受けて、測定導管16を通る流れが一時的に左右に往復するように移動することを引き起こす。導管内の正常な流れに対して垂直な成分を有するこの一時的な液体移動は、混合液中の残りの粒子からそれらを分離するために所定の特徴を有する粒子を偏向させる際に適用できる。

図示したように、測定導管16は分岐点21で2本の分岐導管22a、22b内へ分岐し、これらの分岐導管内の流速は、粒子が正常には2本の分岐導管の第2分岐導管22bを通って流れるように調整される。分岐導管22a、22b間の角度は、0から180度、および好ましくは10から45度である。しかし角度は、それらの間に直線状分離壁を備える2本の並列導管に一致するたとえ0度であってもよい。

貯蔵される粒子は、好ましくは粒子を含まない液体シースによって取り込まれている中心の流体の流れの中の測定位置に適用される。粒子の流れを限定する工程は知られており、そしてしばしば「シース流」構成と呼ばれる。通常、限定は懸濁させた粒子の流れを細い出口ノズルに通して導管16内を流れる粒子を含まない担体液の中へに注入することによって達成される。懸濁液および担体液の流速の比率を調整することによって、導管内の半径方向限定および粒子間距離を調整することができる。担体液の相当に大きな流速は、粒子間の大きな間隔を有するより閉じ込められた粒子の流れを生じさせる。

第1供給導管12によって導入された懸濁液中では、標準粒子18aおよび対象となる粒子18bの2つのタイプの粒子を識別することができる。測定領域20内で粒子18bにおける所定の特徴を感知すると、検出器19はシグナルを発生する。外部アクチュエーター26は、所定の特徴の感知に反応して検出器19によってシグナルが発生されると、第1アクチュエーター気泡弁100bを作動させ、測定導管16内のサイド通路24a、24b間で流れ妨害を作り出す。この流れ妨害は所定の特徴を有する粒子18bを偏向させるので、粒子18bは第2分岐導管22bではなく第1分岐導管22aへ流下する。検出器はアクチュエーター26と連通しているので、検出器19が粒子内の所定の特徴を感知すると、アクチュエーターは第1気泡弁100bを作動させて第1気泡弁のリザーバー70b内での圧力変動を引き起こす。第1気泡弁の作動は、第1気泡弁100b内のメニスカス25bを偏向させ、第1サイド通路24b内で一時的な圧力変動を引き起こす。第2サイド通路24aおよび第2気泡弁100aは、アクチュエーター26を通って誘導された測定導管16内の一時的な圧力変動を吸収する。基本的には、第2気泡弁100aのリザーバー70aは、弾力性の壁を有する、または気体等の圧縮性流体を含有するバッファーチャンバーである。弾力性の特性は、測定導管から第2サイド通路24a内に液体を流入させ、圧力パルスを吸収させ、そして粒子の流れの中で選択されなかった粒子の流れに対する妨害を防止することを可能にする。

測定領域20では、個々の粒子がサイズ、形状、蛍光強度等の特定の特徴、ならびに当業者には明白な他の特徴について適切なセンサー19を使用して検査される。当技術分野において知られている適用可能なセンサーの例は、顕微鏡、機械視覚システムおよび粒子の電子的特性を測定するための電子手段等の様々なタイプの光学検出システムである。当技術分野において特によく知られているのは、粒子の蛍光強度を測定するためのシステムである。これらのシステムは、蛍光を誘導するための適切な波長を有する光源および誘導された蛍光の強度を測定するための検出システムを含む。このアプローチは、しばしば蛍光マーカー、すなわち特定第1波長の光線を用いて照明するとまた別の特定の第2波長で光線（蛍光）を産生する付着分子を用いて標識された粒子と組み合わせて使用される。この第2波長光線が検出されると、特徴が感知され、シグナルが発生される。

その他の例には、測定領域を通って流れる粒子によって散乱させられた光線の測定が含まれる。散乱を解釈すると粒子のサイズおよび形状に関する情報が産み出されるが、これを取り入れると所定の特徴が検出されたときにシグナルを発生することができる。

第1気泡弁の圧縮チャンバーに加圧するためのアクチュエーター26は、粒子が選択された所定の特徴を有するというセンサーからのシグナルに反応する外部アクチュエーターを含むことができる。圧力を増加させるために適切な外部アクチュエーターには2つのクラスがある。第1クラスは、第1サイド通路24b内の液体へ直接的に気体の圧力を提供する。例えば、アクチュエーターはサイド通路24b内の液体柱へ切替弁を用いて接続される加圧ガス源を含んでいてよい。スイッチの作動は通路を加圧ガス源へ接続し、これにより液体内のメニスカスが偏向する。作動が停止すると、スイッチは通路24bを標準作動圧へ接続し直す。

または、可動壁を有する閉鎖圧縮チャンバーと組み合わせて移動アクチュエーターを使用することができる。移動アクチュエーターが圧縮チャンバーの壁を内側へ移動させると、内部の圧力が上昇する。可動壁が最初の位置へ戻されると、圧力は標準作動圧へ再び低下する。適切な移動アクチュエーターの例は、コイルにエネルギーが付加されるとプランジャーの移動を引き起こす電磁式アクチュエーターである。もう1つの例は、電圧が適用されると線形移動を生じさせる例えばシリンダーまたは円板の積み重ねの形状にある圧電材料の使用である。どちらのタイプのアクチュエーターも、圧縮チャンバー70の可動壁に連結してその中の圧力変動を引き起こす。

図2から4は、図1の粒子選別システム10におけるスイッチ40のスイッチング作動を示した図である。図2では、検出器19は粒子内の所定の特徴を感知し、アクチュエーター26を作動させるためにシグナルを発生させる。アクチュエーターが作動すると、第1気泡弁100bのリザーバー70b内の圧力が上昇し、メニスカス25bを偏向させ、矢印で示したように第1サイド通路24bからの液体の一時的放出を引き起こす。導管内のこの地点で惹起された突然の圧力上昇は、第2気泡弁100aのリザーバーの弾力性の特性のために、液体が第2サイド通路24a内に流入することを引き起こす。第2サイド通路24a内へのこの液体の移動は矢印で示されている。結果として、図から明らかなように、測定導管16を通る流れは偏向させられ、第1サイド通路24bと第2サイド通路24aとの間に位置する選択された対象となる粒子18bが標準状態における流れ方向に対して垂直に変化させられることを引き起こす。測定導管16、第1分岐導管22aおよび第2分岐導管22bに対する流れ抵抗は、第1サイド通路24bおよび第2サイド通路24aへの、およびそれらからの好ましい流れ方向が、測定導管16を通過する標準流れに対して垂直な測定可能な成分を有するように選択される。この目的は、例えば第1分岐導管22aおよび第2分岐導管22bによって達成することができ、その結果それらの流れ抵抗は第1サイド通路24bおよび第2サイド通路24aの流れ抵抗に比較して大きくなる。

図3は、対象となる粒子18bが第1サイド通路24bおよび第2サイド通路24aの間の容積から離れた場合の第1気泡弁リザーバーの減圧の特定選別システム10を示している。アクチュエーター26の作動が停止すると、リザーバー70a、70bの内側の圧力が標準圧力へ戻ることを引き起こす。この減圧期中には、気泡弁の2つのリザーバー70a、70b間には負圧差が生じ、上記の図および矢印によって示したように、液体の流れに逆らって第1サイド通路24bおよび第2サイド通路24aの間を通る液体の流れを引き起こす。

図4は、スイッチングシーケンスの完了後の粒子選別システム10を示した図である。気泡弁のリザーバーの内側の圧力は均等化され、測定導管16を通る流れの標準化を可能にする。対象となる粒子18bは半径方向に移動するにつれて第1分岐導管22a内に流入するが、他方他の粒子は第2分岐導管22b内に流入し続け、それにより所定の特徴に基づいて粒子が分離される。

粒子を検出する段階および選択的に偏向させる段階からなるこの工程は、高速で粒子を選別するために毎秒多数回繰り返すことができる。上記のような流体スイッチングを採用すると、スイッチング作動は毎秒約数千回のスイッチング作動まで実行することができ、毎時間約百万個の粒子が選別される選別率を生じさせる。

本発明のまた別の態様によると、アクチュエーター気泡弁100bおよびバッファー気泡弁100aは相違する位置に配置することができる。例えば、図5に示したように、アクチュエーター気泡弁100bおよび第1サイド通路24bおよび/またはバッファー気泡弁100aおよび第2サイド通路24aは、分岐点21の上流に配置することができる。これらの構成要素は、アクチュエーターチャンバー70bとバッファーチャンバー70aとの間の流れ抵抗がこれら後者の構成要素およびその他の圧力源との間の流れ抵抗より小さいように、あらゆる適切な位置に配置することができる。より特別には、アクチュエーターチャンバー70bおよびバッファーチャンバー70aは、これらの間の流れ抵抗が粒子の流れの中の選択された粒子とその後の粒子との間の流れ抵抗より小さいように配置することができる。したがってこの方法での構成要素の配置は、単一の選択された粒子を偏向させる上記の方法によって発生した圧力波が、上流または下流へ進むことを、そして粒子の流れの中の残りの粒子の流れに影響を及ぼすことを防止する。流れ抵抗における大きな差は、システムの残り部分における流れ特徴から結び付いた圧力過渡変動を伴う流体スイッチング作動の高レベルの隔離を生じさせる。さらに、選別のために適用される発生した圧力パルスのインサイチュー減衰は、その各々が他のスイッチから油圧的および空気圧的に隔離されている複数のスイッチ40を含む選別網の実行を可能にする。

図6に示したまた別の態様によると、本発明の粒子選別システムは、気泡弁100b等のバッファーとして機能する一つまたは複数の気泡弁と組み合わせて（気泡弁の代わりに）あらゆる適切な圧力波発生装置を使用できる。例えば、圧力波発生装置260は、アクチュエーターがシグナルによって作動したときに粒子を選択的に偏向させるために、直接的もしくは通路システムの偏向によってのどちらかで流れる液体に作用できるプランジャーを備える圧電カラムまたはステッピングモーター等のアクチュエーターを含むことができる。その他の適切な圧力波発生装置には、電磁式アクチュエーター、熱空気圧式アクチュエーターおよび熱パルスを適用することにより流れている液体中で蒸気気泡を発生させる熱パルス発生装置が含まれる。バッファー気泡弁100bは、粒子の流れの他の粒子における流れ妨害を防止するために圧力波発生装置260により作り出された圧力波を吸収するように配置されている。バッファー100bのバネ定数は、バッファーチャンバー70bの容積、サイド通路24bの断面積および/またはバッファーチャンバー70bを形成している柔軟性膜（図7の参照番号72）の剛性または厚さを変動させることにより特定要件によって変化させることができる。

図7は、対象となる粒子を粒子の流れの中の他の粒子から分離するための圧力パルスを発生させるために、および/または本発明の教示による圧力パルスを吸収するためのバッファーとして機能するために適切な弁100の1つの態様を示している。図示したように、弁100は基質内に形成された測定導管16へ通じるサイド通路24aまたは24bに隣接して形成される。サイド通路24aは、通路の側壁内のアパーチャによって形成された流体界面ポート17を含む。密閉圧縮チャンバー70はサイド通路24aに隣接して配置されており、流体界面ポートを通るサイド通路と連通している。例示したチャンバー70は、シール71および柔軟性膜72によって形成されている。サイド通路24a内の担体液は、サイド通路とチャンバーとの界面でメニスカス25を形成する。アクチュエーター26は、柔軟性膜を押してチャンバー内の圧力を上昇させ、これがメニスカスを偏向させて担体液中で圧力パルスを発生させる。

図8は、選別される粒子の流れを提供するために適切な供給導管52ならびにそのどちらかが選別モジュール50内で選別された粒子を運ぶことのできる第1出口導管54および第2出口導管56を有する選別モジュール50を示している。選別モジュール50は、粒子を選別するために必要なスイッチング能力を提供するためにスイッチ40へ機能的に接続できる供給導管52を通って選別モジュール50内に入ってくる粒子を感知するための検出器システム19を含む。図1の第1分岐導管22bおよび第2分岐導管22aは、第1出口導管54および第2出口導管56と流体連通させて配置できる。

図9は、いずれか適切な構成で一緒に結合できる複数の選別モジュール50を含んでいる、本発明の代替態様による粒子選別システム500を示している。例えば、この態様におけるモジュール50は並列で結合されている。選別モジュール50の出口導管54は第1結合出口58へ結合されており、第2出口導管56は第2結合出口60へ結合されている。選別モジュールの並列配列は、Nが並列接続された選別モジュール50の数であるときに、個別選別モジュール50の選別率×Nの総合選別率を有する結合した選別モジュール50のシステムを生じさせる。

図10は、第2選別モジュール50bと直列関係にある第1選別モジュール50aを含むまた別の態様による粒子選別システム550を示している。第2選別モジュール50bは、第1選別モジュール50aによって選別される粒子の所定の特徴と同一または相違する所定の特徴を有する粒子を選別するために装備することができる。供給導管52を通って第1選別モジュール50a内に入る粒子の流れは、少なくとも2つのタイプの粒子を含んでいてよい。第1のタイプの粒子は選別モジュール50a内で選別され、第1出口導管54aを通って排出される。残りの粒子は第2出口導管56aを通って第1選別モジュール50aから排出され、第2供給導管52bを通って第2選別モジュール50b内に導入される。この粒子の流れから、他の所定の特徴を有する粒子が選別され、第2出口導管54bを通って排出される。2つの所定の特徴のどちらも有していない粒子は、第2出口導管56bを通って第2選別モジュール50bから排出される。当業者であれば、あらゆる適切なタイプの選別モジュール50を使用できること、そして所望の結果に依存して、様々な方法で一緒に結合できることを容易に理解するであろう。

図11は、本発明のまた別の態様による高スループット−低エラー選別のための階層的構造を示した図である。例示した態様は、第1段階において複数の並列の粒子の流れを選別し、第1段階の産出量を総計し、次に第1段階の産出量に対して第2選別工程を実施する2段階式粒子選別システム800である。粒子投入チャンバー88からの懸濁液80中の粒子の投入流れはN本の単一選別通路81a〜81n間で分割されるが、このとき各通路は毎秒選択された数の粒子を選別することができる。各通路81は、粒子を試験して所定の特徴を有する粒子を同定するための検出領域84と、および所定の特徴を有する粒子を上記のように流れの中の他の粒子から分離するためのスイッチング領域82と、を含む。スイッチング領域82は、検出領域84で測定された粒子の特徴に基づいてそのスイッチング領域82において「選択された」流れおよび「拒絶された」流れの2つの粒子の産出流れを作り出す。各通路から「選択された」流れは、凝集領域86内において第2選別通路810内に再び貯蔵される1つの流れに凝集させられる。図示したように、第2選別通路810は所定の特徴に基づいて検出する段階および選別する段階の選別工程を繰り返す。

各単一通路選別工程が誤選択の何らかのエラー（y）率を作り出すことを前提に（yは粒子が誤って「選択」される1未満の確率である）、この階層的構造は図示したような2段階の階層に対してはy²の、またはn段階の階層に対してはyⁿのより低いエラー率を作り出す。例えば、単一通路エラー率が1％である場合、2段階エラー率は0．01％または10⁴分の1である。

または、この構造は第2通路につきMセットのN本の選別通路を有することができよう。その用途は投入における存在を有する粒子を比率zで捕捉することを所望し、単一通路選別機は毎秒粒子x個の最高選別率を有することを前提とする。このシステムのスループットは毎秒粒子数でM^＊N^＊xである。毎秒N本の通路に凝集する粒子数はN^＊x^＊zであり、したがってN本の通路から凝集した全ての粒子を単一の第2通路によって選別することができるようにN^＊zは1未満でなければならない。スループットをN＝1/zより上へ上昇させるためには、N本の第1通路の並列群＋1本の第2通路を追加しなければならない。すると総合スループットはM本の第2通路を備えるM^＊N^＊xから生じる。

図12は、本発明のまた別の態様による並直列粒子選別システム160を示した図である。並直列粒子選別システム160は、第1並列選別モジュール161および第2並列選別モジュール162を含む。第1選別モジュール161は多数のマーキングされた粒子に適用され、両方のマーカーを有する粒子が選別されて出口通路165を通って運ばれる。

図13は、また別の並直列粒子選別システム170を示した図である。第1並列選別モジュール171は第1マーカーを有する粒子を分離し、相違する通路から粒子を収集し、そして第1出口通路175を通して第1マーカーを有する粒子を運び出す。その他すべての粒子は、次に第2マーカーを有する粒子を選別するために第2並列選別機172内へ供給される。第2マーカーを有する粒子が収集され、第2出口通路176を通して運ばれる。第1マーカーも第2マーカーも有していない粒子は、第3出口通路177を通して運ばれる。

図14aおよび14bに示した本発明の1つの態様によると、粒子選別システムは粒子の速度、位置および/またはサイズを測定するためのセンサーを含んでいてよい。速度、位置および/またはサイズの測定は、選別のための粒子の分類と同時に、または相違する時点に行うことができる。図11に示したように、並列通路に基づくシステムでは、各通路内の粒子または細胞の速度の相違を引き起こすように、相違する通路は相違する流れ抵抗を有していてよい。検出領域84が間隔Lによってスイッチング領域82から分離されているシステムでは、スイッチング時間の遅延T（すなわち、標的粒子の検出時点に対してスイッチ作動を遅延させる時間）を設定するために通路81内の粒子の速度が分かっていなければならない。

細胞または粒子を検出するための大多数の光学システムでは、検出領域内の光検出器上に細胞が光線を作り出す領域は細胞径のサイズよりはるかに大きなサイズを有するであろう。このため、検出領域で光線が検出される場合は、細胞は領域内のあらゆる場所に存在する可能性があるので、細胞の正確な位置を特定することが困難になる。より正確な検出を提供するために、光学検出器の多数のピクセルを検出領域の全域でパック化することができるが、これには極めて多額の費用がかかり、複雑な支援用電子機器を必要とするであろう。

本発明の実例の態様によると、選別チップ上に「マスキングパターン」を直接配置することによって、正確な速度検出を提供するために光学マスク140を検出領域に追加することができる。マスキングパターンは、マスキングパターンにおける縁が細胞選別アクチュエーター領域82に対して（最新テクノロジーを用いて＜1μmの精密さまで）精密に定位されるように配置することができる。検出領域84内の細胞から光線を捕捉する単一光学検出器は、細胞がマスキングされていない場合は光線に遭遇するであろう。長さが分かっている接続されたマスクの不透明部分である「バー」の1つによってスイッチが切られる光線の持続時間が速度の測定値を提供する。

1μm刻みで10μmから30μmの範囲内の数本のバー141を有するマスクパターンは、細胞からのシグナルを最小限に抑えて細胞よりサイズが大きなバーだけを生じさせる。このため、このようなパターンはさらにまたそのシグナルとは無関係に細胞のサイズを測定するためにも使用できる。そのような「勾配マスク」はさらにまた、光学検出器において速度推定値における変動を減少させる目的で速度を数回測定するために分析できるパターンを生じさせる。マスク140によって惹起される光線におけるパターンはさらに、検出器がマスク140における各縁を同定することを可能にする。バー141がすべて同一であった場合、各バーに対する光シグナルは同一となり、順序でしかそれらを区別することができない。このため、勾配マスクパターンは、単一検出器で細胞の速度を測定し、通路構造およびチップ上のアクチュエーターの位置に対して約1μmの精密さで検出領域84の内側の正確な位置を測定する、および勾配パターンによって与えられる精密さで細胞のサイズを同定するために、広い領域（細胞のサイズの数倍）を見ることを可能にする。勾配マスク140は、検出器が光学システムの倍率および光学検出器自体の性質とは無関係に、これらのパラメーターを測定するのを可能にする。

当業者は、本発明の教示によって選別システム内の粒子のサイズ、位置および/または速度を測定するための他の装置を認識できるであろう。適切な装置は、容易に入手でき、当業者には知られている。

図15に示したまた別の態様によると、粒子選別システムは同一ではない選別通路のアレイ8000を含む。一連の同一ではない選別機通路810a〜810nを含んでいる並列アレイの使用は、スペース、光出力の使用および最適な外部アクチュエーターへの適応に関してより効率的である。粒子の速度は上記のようなセンサーを使用して正確に感知することができるので、通路は特性の検出と検出される特性を有する粒子を偏向させるスイッチの作動との間に一定の遅延を必要としない。このため、検出器84とスイッチ82との間の間隔Lまたは検出器84とスイッチ82との間の経路の形状等の通路の一定のパラメーターを変化させることができる。

チップに対して垂直に方向付けた各波長の光学的照明に対して単一レーザーを使用するためには、レーザーは（通路の数）×（（検出領域での通路の幅）＋（通路間の間隔C））（図15を参照）によって限定された領域を照明する必要がある。しかし、光線を吸収して蛍光を生成できる放射面は、（通路の幅）/（通路の幅＋C）のフィルファクターを残す通路の面積：（通路の数）×（通路の幅）だけである。フィルファクターは、好ましくは入手できる入射光線を浪費するのを回避するために100％に近い。

このため、並列選別システムにおける通路間の間隔を最小限に抑えることは光学検出領域および光学システムの効率にとって重要である。図16に示した本発明の可変式アレイデザインでは、検出領域84内の通路の間隔は通路の幅に近付くので、光線利用率は約50％に近付く。作動領域82における通路間隔は、図16に示したようにもっと大きくてもよい。通路に沿ったアクチュエーター26の位置は、外部駆動アクチュエーターのために利用できる半径をより大きくするために変化させることができる。

可変式アレイ8000はさらにまた、全通路に渡って一定の圧力低下が生じることを前提に粒子の速度がほぼ釣り合うように、全通路の流れ抵抗を平衡させるために選択された通路内に蛇行路を有していてよい。これらは、例示したシステムの上流または下流のどちらか、すなわち検出器とアクチュエーターとの間の領域内に追加することができる。各通路の検出領域82Iとそのアクチュエーター26iとの間の長さLiはデザインから分かっているので、どの粒子を維持すべきかに関する決定と同時に行われる粒子速度の測定は向上したセル選別システムを提供する。

図17は、本発明のまた別の態様による粒子選別システム1700を示した図である。粒子選別システム1700は、並列で作動する複数の選別モジュール1701を含む。システム1700は、検出領域内の各選別通路1702内の粒子の所定の特徴を測定するためにサンプルを各選別モジュールおよび検出領域1720へ導入するための投入領域1710を含む。このシステムは、さらにまた所定の特徴を有する粒子を所定の特徴を有していない粒子から分離するために各選別モジュール内に1つのアクチュエーターを含むスイッチ領域1730を含む。図示したように、図17の態様では、検出領域1720内の各選別通路間の選別通路1702の間隔はスイッチ領域1730内の通路間の間隔より小さい。検出領域における緊密な間隔は粒子を検出するためにレーザーを使用した場合の費用節約を可能にし、他方スイッチ領域1730におけるより大きく離れた分離は様々なサイズのアクチュエーターに適応する。

粒子選別システム1700はさらに、選別工程の精度を上昇させるために所定の特徴に基づいて検出および選別する選別工程を繰り返すために第2選別モジュール1740を含むことができる。1つの態様によると、このシステムは第1選別工程から第2選別工程へ粒子を運ぶために第1選別モジュール1701と第2選別モジュール1740との間に濃縮領域1750を含むことができる。実例の態様によると、濃縮領域1750は粒子が第2選別モジュール1740を通過する前に粒子から過剰な担体液を除去することによって粒子を運ぶ。濃縮領域1750は、さらにまた濃縮後に粒子へ第2シート液を添加するために水和装置を含むことができる。濃縮領域1750は、出口通路1703内に挿入された1枚の膜を含むことができ、濃縮通路は出口通路1703を横断し、膜は濃縮通路から出口通路を分離している。過剰な担体液は、選択された粒子が第2選別モジュール1740内へ通過する前に、膜を通って濃縮通路内への出口通路1703内の選択された粒子の流れから除去される。

濃縮領域を形成するために適切なシステムは、その内容が参照として本明細書に組み入れられる、本特許と同一日に提出された代理人明細書第TGZ−023号に記載されている。

実例の態様によると、除去された担体液は再循環させて第1通路の入口内へ送り戻すことができる。再循環通路またはその他の装置は、引き続いての選別工程のために担体液を再使用できるように濃縮領域を第1通路へ接続することができる。または、担体液は拒絶された粒子を廃棄する前に、拒絶された粒子から除去し、第1通路入口内に導入することができる。

本発明について、実例の態様を参照しながら説明してきた。本発明の範囲から逸脱することなく上記の構成には一定の変更を加えることができるので、上記の説明に含まれている、または添付の図面に示されているすべての事物は例示であり、限定する意味ではないと解釈することが意図されている。

さらにまた、添付の特許請求の範囲は本明細書に記載したすべての一般的および特定の特徴を含んでいる、そして言葉の問題として本発明の範囲のすべての陳述がそれらの中に含まれると言えると理解されなければならない。

本明細書で説明した本発明は新規であり、特許証によって保護されるべきである。

本発明の1つの実例の態様による粒子選別システムの略図である。 図1の粒子選別システムの作動を示した図である。 図1の粒子選別システムの作動を示した図である。 図1の粒子選別システムの作動を示した図である。 アクチュエーターチャンバーおよびバッファーチャンバーの代替位置を示している粒子選別システムを示した図である。 本発明のまた別の態様による粒子選別システムを示した図である。 本発明の粒子選別システムにおいて使用するために適切な気泡弁を示した図である。 本発明の1つの実例の態様の粒子選別システムの略図である。 本発明の教示による並列の粒子の流れを選別するための粒子選別システムの1つの態様を示した図である。 本発明の教示による選別モジュールの二進木様形状に構成された粒子選別システムの1つの態様を示した図である。 多段階で並列の粒子の流れを選別するための多段式粒子選別システムのまた別の態様を示した図である。 本発明の代替態様による並列粒子選別システムを示した図である。 本発明のまた別の態様による並列粒子選別システムを示した図である。 粒子のサイズおよび/または速度の測定を可能にする光学マスクを含んでいる、本発明のまた別の態様による粒子選別システムを示した図である。 本発明のまた別の態様による可変通路を有する並列選別システムを示した図である。 本発明のまた別の態様による並列選別システムの可変型アレイデザインを示した図である。 本発明のまた別の態様による並列選別システムを示した図である。

Claims (13)

1. 以下を含む、粒子選別システム：
   担体液中に閉じ込められた懸濁した粒子の流れが流れる複数の第1選別通路であって、各第1選別通路が粒子内の所定の特徴を検出するに適した検出領域および各第1受入通路内に流入する所定の特徴を有する粒子を各第2受入通路内に流入する所定の特徴を有していない粒子から分離するに適したスイッチング領域を有する第1選別通路；
   所定の特徴を有する粒子を各第1受入通路から1本又はそれ以上の出口通路に凝集させるのに適した、各スイッチング領域の下流の凝集領域；
   所定の特徴を有する粒子を取り囲んでいる担体液の容量を調整するのに適した、各スイッチング領域の下流の濃縮領域；ならびに
   該出口通路の1本から粒子を受け入れるとともに所定の特徴に基づき該出口通路から受け取った粒子を第2選別通路内の他の粒子から分離するに適した、複数の並列第1選別通路と直列している少なくとも1本の第2選別通路。
2. 濃縮領域が、所定の特徴を有する粒子から過剰な担体液を除去する、請求項1のシステム。
3. 濃縮領域が、
   受入通路の1つと交差する濃縮通路；および
   濃縮通路を受入通路から分離する膜、を含む、請求項1のシステム。
4. 濃縮領域が、
   凝集領域と交差する濃縮通路；および
   濃縮通路を凝集領域から分離する膜、を含む、請求項1のシステム。
5. 濃縮領域が、
   第2選別通路と交差する濃縮通路；および
   濃縮通路を第2選別通路から分離する膜、を含む、請求項1のシステム。
6. 各第1通路の検出領域が、対応する第1選別通路内の粒子の速度を測定するセンサーを含む、請求項1のシステム。
7. 濃縮領域の後に粒子へ第2担体液を添加する水和装置をさらに含む、請求項2のシステム。
8. 除去されたシース液を第1選別通路内へ導入するために濃縮領域を第1選別通路へ接続する再循環通路をさらに含む、請求項2のシステム。
9. 以下の段階を含む、粒子選別方法：
   複数の並列第1選別通路を通して担体液中に閉じ込められた懸濁した粒子の複数の流れを運ぶ段階であって、各第1選別通路が粒子内の所定の特徴を検出するに適した検出領域を含むとともに各第1受入通路への所定の特徴を有する粒子を各第2受入通路内に流入する所定の特徴を有していない粒子から分離するに適したスイッチング領域を含む、段階；
   所定の特徴を有する粒子を所定の特徴を有していない粒子から分離する段階；
   所定の特徴を有する粒子を、該各スイッチング領域の下流の凝集領域内の各第1受入通路から1本又はそれ以上の出口通路へ凝集させる段階；
   該スイッチング領域の下流の濃縮領域中で該粒子を取り囲んでいる担体液の容量を調整する段階；
   粒子を該出口通路の1本から複数の並列第1選別通路と直列している少なくとも1本の第2選別通路を通して運ぶ段階；ならびに
   第2選別通路内の所定の特徴を有する該粒子を第2選別通路内の他の粒子から分離する段階。
10. 所定の特徴を有する粒子および所定の特徴を有していない粒子を含有する液体が流れる入口導管を含む、液体中に懸濁した粒子を選別するための粒子選別システムであって、
    a）入口導管が並列で作動して同時に入口導管から液体が供給される複数の第1選別通路に分岐しており、各通路が1つの選別モジュールおよび該第1選別通路から分岐する2本の相違する出口通路を有し、そして各選別モジュールが第1の所定の特徴を有する粒子および第1の所定の特徴を有していない粒子を2本の相違する出口通路間へ分配するためのスイッチユニットを有しており、
    b）各選別モジュールが、第1の所定の特徴を有する粒子を検出して分類する少なくとも1つのセンサー、および第1の所定の特徴を有する粒子を2本の相違する出口通路の1つへ選択的に偏向させるために該スイッチユニット上に配列された該センサーによって制御されるアクチュエーターとを含んでおり；
    c）各選別モジュールのための2本の相違する出口通路の各々が第1の所定の特徴を有する粒子および第1の所定の特徴を有していない粒子をそれに選択的に分配するために別個の集合通路へ接続されており；ならびに
    d）少なくとも1つの第2選別モジュールが第1所定の特徴を有する粒子のための集合通路に接続されており、第2選別モジュールの各々が第1出口通路および第2出口通路、粒子を感知するための検出器、および第2の所定の特徴を有する粒子を第2の所定の特徴に基づいて出口通路の1つへ選択的に偏向させるためのスイッチユニットを有している、粒子選別システム。
11. 第2の所定の特徴が第1の所定の特徴と同一である、請求項10の粒子選別システム。
12. 第2の所定の特徴が第1の所定の特徴と異なる、請求項10の粒子選別システム。
13. 以下を含む、粒子選別システム：
    それぞれが担体液中に閉じ込められた懸濁した粒子の流れを受け入れるに適した複数の並列第1選別通路であって、各第1選別通路は粒子内の所定の特徴を検出するに適した検出領域を含むとともに第1受入通路内に流入する所定の特徴を有する粒子を第2受入通路内に流入する所定の特徴を有していない粒子から分離するに適したスイッチング領域を含む第1選別通路；
    所定の特徴を有する粒子を各第1受入通路から選択された粒子の凝集した流れの中へ凝集させるための凝集領域；ならびに
    複数の第1出口通路から選択された粒子の凝集した流れを受け入れるとともに所定の特徴を有する第2選別通路内の粒子を第2選別通路内の他の粒子から分離するに適した、複数の並列第1選別通路と直列している少なくとも1本の第2選別通路。

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