JP4738717B2

JP4738717B2 - 乳酸菌からのリポテイコ酸、およびグラム陰性菌、潜在的病原性グラム陽性菌によって媒介される免疫応答を調節するためのその使用

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Publication number: JP4738717B2
Application number: JP2002591013A
Authority: JP
Inventors: ヴィダル、カリーン; − ヒューズ、アンドネット; − アンヌグラナト、ドミニク; − テウラス、イレーネコルテシー
Original assignee: ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
Priority date: 2001-05-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2011-08-03
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Also published as: KR20040018375A; RU2003136828A; AU2002338873A1; EP1395269A1; US20090142375A1; CA2449403C; CN1525863A; ATE394111T1; CA2449403A1; ZA200309821B; CN100502888C; JP2005500267A; EP1395269B1; US20140056927A1; AU2002338873B2; BR0209975A; NO20035187D0; SG101083A1; US20040147010A1; ES2305256T3

Description

本発明は、グラム陰性菌、潜在的病原性グラム陽性菌及び／又はそれらの誘導体によって誘導される免疫応答を調節するための、乳酸菌からのリポテイコ酸を含む組成物に関する。本発明は、胃腸管、骨、皮膚、眼、耳、肺及び口腔中の、細菌のコロニー形成、免疫応答を調節するため、細菌媒介性疾患及び感染と関連がある炎症過程を減少させるための、医薬、化粧品用、皮膚科用又は眼科用の経口又は局所製品、食物又はペットフード組成物の製造における、活性成分としての乳酸菌からのリポテイコ酸の使用にも関する。本発明は、その中の選択したリポテイコ酸にも関する。

分娩時には、さまざまな微生物接種原による、以前に無菌状態であった胎児の腸のコロニー形成がある。腸微生物相の確立は、胃腸管の決まった領域で安定した個体群が確立される前の、生命の第１日中の非常に動的なプロセスである。第１の大腸菌及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ種（Ｍａｔａ、Ｌ．Ｊ．ａｎｄＪ．Ｊ．Ｕｒｒｕｔｉａ．１９７１．ＡｎｎＮＹＡｃａｄＳｃｉ１７６：９３〜１０８）、次いで母乳育ちの赤ん坊において非常に優勢であり、潜在的病原菌に対していくらかの防御を与える、ビフィズス菌の微生物相（Ｇｉｂｓｏｎ、Ｇ．Ｒ．ａｎｄＸ．Ｗａｎｇ．１９９４．ＪＡｐｐｌＢａｃｔｅｒｉｏｌ．７７：４１２〜４２０）による、一連のコロニー形成がある。

ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ及びｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａなどの乳酸菌（ＬＡＢ）は、ヒト成人の胃腸管の正常共生生物である。共生（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）と名付けられた、これらの属から選択された菌株は、宿主に経口的に投与すると、健康上の利点がある（Ｂｒａｓｓａｒｔ、Ｄ．ａｎｄＥ．Ｊ．Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎ．１９９７．ＴｒｅｎｄｓＦｏｏｄＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ９：３２１〜３２６）。片利共生のＬＡＢと同様に、共生は病原性微生物を相殺し、免疫防御機構を刺激する。これらの生物学的影響の根底にある正確な機構についてはほとんど知られていないが、健康上の利点を発揮する可能性が最も高い菌株は、おそらくその細胞壁中のリポテイコ酸（ＬＴＡ）によって腸上皮に一時的に付着することができる菌株であることは、広く認められている。

ＬＴＡは、疎水性脂質成分に連結した、複合グリセロ−リン酸ポリマーである（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗ．１９９０．「糖脂質、リン糖脂質及びスルホ糖脂質」の中の、「細菌のリン糖脂質及びリポテイコ酸」（Ｂａｃｔｅｒｉａｌｐｈｏｐｈｏｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓａｎｄｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄｓ．ＩｎＧｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ、ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓａｎｄｓｕｌｆｏｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ）Ｍ．Ｋａｔｅｓ、ｅｄｉｔｏｒ．Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ．Ｊ．、ＮｅｗＹｏｒｋａｎｄＬｏｎｄｏｎ．１２３〜２３４）。ＬＴＡは大部分のグラム陽性菌の細胞壁の成分であり、異なる細菌ではＬＴＡは非常に多様であるが、ＬＴＡは、グラム陰性菌の細胞壁中で見られるＬＰＳと構造類似性を有する。

グラム陰性菌からのＬＰＳは、免疫細胞に対するその前炎症的影響で有名であるが、グラム陽性菌からのＬＴＡを使用する作業はあまりなされていない。それにもかかわらず、特定の種の細菌からのＬＴＡのみが、このような影響を媒介するようである（Ｓｕｄａ、Ｙ他、１９９５、ＦＥＭＳＩｍｍｕｎｏｌＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１２：９７〜１１２；Ａｒａｋａｋｉ、Ｒ他、１９９８、ＦＥＭＳＩｍｍｕｎｏｌＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ２２：２８３〜２９１）

グラム陽性菌からのＬＴＡは、細菌の菌株ごとに非常な多様性を示すが、グラム陰性菌の細胞壁中に存在するＬＰＳといくらかの構造類似性がある。パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、細菌構造の保存領域、及び宿主へのシグナル、細菌接種原の存在を認識する。骨髄細胞上に存在するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー型糖タンパク質、ＣＤ１４は、１つのこのような受容体である。ＣＤ１４がＬＴＡとＬＰＳの両方に結合することができることは、現在知られている。実際、グラム陰性菌によって引き起こされる敗血症は、単球−マクロファージの膜上のＣＤ１４へのＬＰＳの結合によるものである。可溶形のＣＤ１４受容体が、ＬＰＳのＣＤ１４陰性細胞への結合を媒介している証拠が増加している。しかしながら、この分子は、他の細菌成分、例えばペプチドグリカン、リポアラビノマンナン及びマネロン酸ポリマーなども認識する（Ｄｚｉａｒｓｋｉ、Ｒ他、２０００．ＣｈｅｍＩｍｍｕｎｏｌ．７４：８３〜１０７）。生きたグラム陽性菌又はその細胞壁成分を投与した後ではなく、非病原性大腸菌又はそのＬＰＳを投与した後に（Ｌａｂｅｔａ、Ｍ．Ｏ．他、２０００．ＪＥｘｐＭｅｄ１９１：１８０７〜１８１２）、ヒト母乳中に存在する可溶形のＣＤ１４（ｓＣＤ１４）がヒトの腸上皮細胞（ＩＥＣ）を刺激して、サイトカインを放出することを、我々は報告してきている。

本発明は、ヒト又は動物の胃腸管、骨、皮膚、眼、肺、耳及び口腔中の、細菌のコロニー形成又は感染中に関連する免疫応答を調節すること、及びそれによって誘導される任意の炎症応答を予防又は減少させることができる組成物を提供することを目的とする。

したがって第１の態様では本発明は、グラム陰性菌、潜在的病原性グラム陽性菌及び／又はそれらの誘導体によって誘導される免疫応答を調節するための、乳酸菌からのリポテイコ酸を活性成分として含む組成物を提供する。

乳酸菌からのリポテイコ酸を含むこの組成物は、免疫恒常性を維持し、グラム陰性菌によって誘導される炎症過程、及び／又はＬＰＳ媒介の障害を予防するかあるいは減少させることができる。この組成物は、病原性又は潜在的病原性グラム陽性菌、及び／又はＬＴＡ媒介の障害に対して使用することもできる。

実際、たとえばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株Ｌａ１及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株Ｌａ１０などの乳酸菌株からのＬＴＡの、大腸菌及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｄｉｓから精製したＬＰＳ、又はすべて大腸菌菌株で攻撃されたＩＥＣの応答性に対する、相殺的影響が存在することが見出されている。さらに、ヒト乳汁の存在下においてＬＰＳと同時に、いずれかのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ菌株からのＬＴＡを与えると、ＬＰＳ−ｓＣＤ１４媒介のＩＬ−８の産生が阻害された。

前記組成物は医薬、経口用又は局所用の化粧、皮膚用又は眼科用製品、食物又はペットフード組成物であってよい。前記組成物は、胃腸管、骨、皮膚、眼、肺、耳及び口腔中の細菌媒介性疾患又はＬＰＳ媒介の障害と関連がある炎症過程に対する影響があり、これを使用して、前記組織中の細菌のコロニー形成及び免疫応答を調節することができる。

他の態様では、本発明は、ＣＤ１４に結合するその能力、及びＩＥＣからのＩＬ−８又はＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカインの放出を誘導することができないことによって選択されている、乳酸菌からのリポテイコ酸を提供する。

経口的に与えると、本発明のリポテイコ酸を使用して、胃腸管中だけでなく、骨、皮膚、眼、耳、肺及び口腔中でも、免疫恒常性を維持し、細菌のコロニー形成を調節し、あるいは細菌媒介性疾患及び感染、又はＬＴＡ／ＬＰＳ媒介の疾患を標的化することができる。

したがって他の態様では、本発明は、グラム陰性菌及び／又はその誘導体によって誘導される免疫応答を調節することを目的とする組成物を調製するための、乳酸菌からの少なくとも１つのリポテイコ酸の使用を提供する。リポテイコ酸は、ヒト又は動物中の細菌媒介性疾患又はＬＴＡ／ＬＰＳ媒介障害と関連がある炎症過程を減少させるための、医薬、クリーム又はローションなどの局所用製品、食物又はペットフード組成物の製造において使用することができる。

他の態様では本発明は、ヒト又は動物中の前述の応答を調節する方法であって、乳酸菌からの有効量のリポテイコ酸、又はそれを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。

他の態様では本発明は、ペット動物中でグラム陰性菌、潜在的病原性グラム陽性菌及び／又はそれらの誘導体によって誘導される免疫応答を調節する方法であって、そのような応答を調節することができる共生細菌株の成分を含む組成物を、ペット動物に投与することを含む方法を提供する。

この方法は、共生（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ）微生物、その培養物の上澄み、又はその代謝産物を含む組成物をペット動物に投与することを含んでよく、前記共生微生物はペット動物の腸上皮に少なくとも一時的に付着することができる。

一実施形態では、本発明の方法は、栄養学的にバランスの取れた食事の成分として組成物を投与することを含む。好ましい実施形態では、この成分が、湿っているかあるいは乾燥したペットフード配合物中に含まれる。

最後の態様では、本発明は、栄養学的にバランスの取れた食事、及びペット動物中でグラム陰性菌株、潜在的病原性グラム陽性菌株及び／又はそれらの誘導体によって誘導される免疫応答を調節するその能力によって選択された活性成分を含む、ペットフード配合物に関する。

一実施形態では、活性成分は、ＬＴＡを有する微生物を含む。ＬＴＡは、前記微生物の細胞壁中に存在することが好ましい。

微生物は、それを摂取するペットの腸上皮に一時的に付着することができる、共生微生物であることが好ましい。好ましい実施形態では、微生物は乳酸菌である。

本発明の１つの利点は、グラム陰性菌、病原性又は潜在的病原性グラム陽性菌、又はこれらの誘導体ＬＰＳ又はＬＴＡに対する免疫応答を制御するための手段、特にＩＥＣによるＩＬ−８、ＴＮＦ−α及び上皮細胞由来の好中球活性化タンパク質（ＥＮＡ）−７８などの、前炎症性サイトカインの産生などの炎症過程を減少させる手段を、本発明が提供することである。

本発明の他の利点は、たとえばＩＬ−８及びＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカインの放出を減少させることによって、マクロファージの免疫応答を下方制御するための手段を、本発明が提供することである。

本発明の更に他の利点は、本発明の食品組成物を単に消費することによって、哺乳動物の防御免疫プロセスが改善され、有害な炎症及び感染の危険性が低下する可能性があることである。医薬の静脈内又は皮下投与は専門知識を必要とし、経口投与と比較すると、それは患者に対してそれほど安全、好都合、あるいは許容可能ではないことは理解されるであろう。これらの事柄を照らしてみると、本発明は、経口的に投与することができる栄養及び／又は治療製品という、明らかな利点を与える。

さらに本発明は、食品等級の細菌種、及びＧＲＡＳ（ＧｅｎｅｒａｌｌｙＲｅｇａｒｄｅｄＡｓＳａｆｅ）状態を有するような細菌種からのＬＴＡを使用し、共生生物に起因するいくつかの利点を提供する。このように本発明は、生きている共生生物を使用することができない臨床的障害及び感染用の、滅菌済み医薬、経腸又は局所用組成物において使用することができる。

詳細な説明
以下の説明中では、以下の略語を使用している：ＥＮＡ−７８、上皮細胞由来の好中球活性化タンパク質−７８；ＨＭ、ヒト乳汁；ＩＥＣ、腸上皮細胞；ＩＬ、インターロイキン；ＬＰＳ，；リポ多糖；ＬＴＡ、リポテイコ酸；ｍＡｂ、モノクローナル抗体；ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＰＲＲ、パターン認識受容体；ＴＮＦ、腫瘍壊死因子。

最後に「ＮＣＣ」は、ＮｅｓｔｌｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮｅｓｔｌｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ，Ｖｅｒｓｃｈｅｚ−ｌｅｓ−Ｂｌａｎｃ、Ｌａｕｓａｎｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を示す。

第１の態様は、グラム陰性菌、潜在的病原性グラム陽性菌及び／又はそれらの誘導体によって誘導される免疫応答、特に炎症過程を調節するための、乳酸菌からのリポテイコ酸を含む組成物に関する。

このような炎症過程は、たとえばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｓｓｐ．、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｓｐｐ、Ｓａｍｏｎｅｌｌａｓｐｐなどのグラム陰性菌及び／又はグラム陰性菌のそのＬＰＳによって誘導される可能性がある。このような炎症過程は、病原性又は潜在的病原性グラム陽性菌、すなわち、いくつかの条件で病原性になる可能性がある細菌によって、誘導される可能性もある。

乳酸菌からのリポテイコ酸は、ＣＤ１４に結合するその能力、及びＩＥＣからのＩＬ−８又はＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカインの放出を誘導できないことによって選択されていることが好ましい。リポテイコ酸は、その脂質成分を含むはずである。

リポテイコ酸は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌、たとえば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ種など、最も好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株Ｌａ１（ＮＣＣ５３３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株Ｌａ１０（ＮＣＣ９０）、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ（ＮＣＣ２４９３）から単離されることが好ましい。

たとえば、菌株ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉＮＣＣ５３３、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＮＣＣ９０は、ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ、２８ｒｕｅｄｕＤｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ、Ｆ−７５０２４Ｐａｒｉｓｃｅｄｅｘ１５、ＦＲＡＮＣＥに、それぞれ９２年６月３０日、及び９９年１０月１２日に、それぞれ寄託番号ＣＮＣＭＩ−１２２５及びＣＮＣＭＩ−２３３２で寄託されている。

最も好ましい実施形態では、乳酸菌からのＬＴＡは、ｓＣＤ１４などの分子と組み合わせて使用することができる。

リポテイコ酸、及び／又はリポテイコ酸を生成する乳酸菌、及び／又は乳酸菌の培養物の上澄みは、乳児の栄養、ペットの栄養及び動物飼料用、臨床栄養用又は医薬的施用のための乾燥状又は液体状食品組成物又は経腸栄養物に取り込ませることができる。

局所用（クリーム及び軟膏）又は経口用調製物、眼科的施用物（洗眼剤）、又は経口用施用物（口内洗剤、練り歯磨き）の形での、化粧的又は皮膚科的施用に、それを使用することもできる。ＬＴＡを使用して、耳感染を予防することができると思われる。さらに、製品中のＬＴＡを使用して、ＬＰＳ媒介の骨障害を予防することができる。

したがって前記組成物は、医薬、経口用又は局所用化粧品、皮膚科的又は眼科的調製物、食物又はペットフード組成物であってよい。

使用するリポテイコ酸の量は変化してよいが、食品組成物中の細菌のレベルに対応し、１０^５ｃｆｕ／ｇ〜約１０^１１ｃｆｕ／ｇ、最も好ましくは約１０^７ｃｆｕ／ｇ〜１０^９ｃｆｕ／ｇで変化してよい。医薬調製物の場合、ＬＴＡの量は変化し、細菌の量に対応してよく、１０^５ｃｆｕ／ｇ〜１０^１６ｃｆｕ／ｇ、好ましくは約１０^７ｃｆｕ／ｇ〜１０^１０ｃｆｕ／ｇで変化する。

リポテイコ酸は、胃腸管、骨、皮膚、眼、耳、肺及び口腔中の、細菌媒介性疾患又はＬＴＡ／ＬＰＳ媒介障害と関連がある炎症過程に対して影響がある。

より詳細には、これらの製品は、新生児期中の細菌のコロニー形成及び感染、したがって幼児の免疫適格性を改変し、また臨床栄養法では、これらを使用して、敗血症、細菌の移動、炎症、感染及び疾患、及び細菌の過剰増殖を治療することができると思われる。

好ましい実施形態では組成物は、完全な栄養学的にバランスの取れた食事又はペットフードであってよい。組成物は、たとえば食用サプリメントであってもよい。

ヒトが消費するための食品組成物を調製する場合、それは完全栄養調合乳、乳製品、冷蔵されているかあるいは貯蔵安定な飲料、スープ、食用サプリメント、食事代替品、栄養バー又は菓子類であってよい。

本発明のリポテイコ酸、及び／又はリポテイコ酸を生成する乳酸菌、及び／又は乳酸菌の培養物の上澄み以外に、栄養調合乳はタンパク質の源を含んでよい。食用タンパク質を、タンパク質源として使用することが好ましい。食用タンパク質は任意の適切なタンパク質、たとえば動物性タンパク質（乳タンパク質、肉のタンパク質及び卵のタンパク質など）、植物性タンパク質（大豆のタンパク質、小麦のタンパク質、米のタンパク質、及びエンドウ豆のタンパク質など）、遊離アミノ酸の混合物、又はこれらの組み合わせであってよい。乳タンパク質、例えばカゼイン、ホエータンパク質、及び大豆のタンパク質が特に好ましい。組成物は、炭水化物の源及び脂肪の源も含んでよい。

栄養調合乳が脂肪源を含む場合、その脂肪源は、栄養調合乳の約５％〜約５５％のエネルギー、たとえば約２０％〜約５０％のエネルギーを与えることが好ましい。脂肪源を構成する脂質は、任意の適切な脂肪又は脂肪の混合物であってよい。植物性脂肪、たとえば大豆油、パーム油、ココナッツ油、ベニバナ油、ヒマワリ油、コーン油、カノーラ油、レシチンなどが、特に適している。乳脂肪などの動物性脂肪を、望むならば加えることもできる。

炭水化物の源を、栄養調合乳に加えることができる。炭水化物の源は、栄養組成物の約４０％〜約８０％のエネルギーを与えることが好ましい。任意の適切な炭水化物、たとえばスクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、固形コーンシロップ、及びマルトデキストリン、及びこれらの混合物を使用することができる。食物繊維を、望むならば加えることもできる。それを使用する場合は、栄養調合乳の約５％までのエネルギーを含むことが好ましい。食物繊維は、たとえば大豆、エンドウ豆、オート麦、ペクチン、グアーゴム、アラビアゴム、及びフラクトオリゴ糖を含めた、任意の適切な源からのものであってよい。

適切なビタミン及びミネラルが、適切なガイドラインを満たす量で栄養調合乳中に含まれてよい。

１つ又は複数の食品等級の乳化剤、たとえばモノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル、レシチン、及びモノ及びジグリセリドを、望むならば栄養調合乳中に取り込ませることができる。同様に適切な塩及び安定剤が含まれてよい。

栄養調合乳は、たとえば粉末、錠剤、カプセル、液体濃縮物、固形品、又はすぐに飲むことができる飲料の形で、腸内に投与可能であることが好ましい。粉末状の栄養調合乳を生成することを望む場合、均質化した混合物を、噴霧乾燥機又は凍結乾燥機などの適切な乾燥装置に移し、粉末に転換する。

他の実施形態では、通常の食品を、本発明の乳酸菌からの少なくとも１つのリポテイコ酸を用いて、栄養価を高めることができる。たとえば、発酵乳、ヨーグルト、新鮮なチーズ、レンネット凝固させた乳、菓子物品、たとえば甘味又は加糖した飲料、菓子バー、朝食用シリアルフレーク又はバー、飲料、乳粉末、大豆系製品、非発酵乳製品、又は臨床栄養用の栄養サプリメント。

他の実施形態では、栄養学的に完全なペットフードを調製することができる。この栄養学的に完全なペットフードは、任意の適切な形、たとえば乾燥形、やや湿った形、あるいは湿った形であってよい。栄養学的に完全なペットフードは、冷蔵されているかあるいは貯蔵安定なペットフード製品であってよい。これらのペットフードは、従来通りに製造することができる。本発明のリポテイコ酸以外に、これらのペットフードは、任意の１つ又は複数の炭水化物源、タンパク質源及び脂肪源を含んでよい。

任意の適切な炭水化物源を使用することができる。炭水化物源は、穀粒、穀粉及び澱粉の形で与えられることが好ましい。たとえば炭水化物源は米、オオムギ、モロコシ、キビ、オート麦、コーンミール又は小麦粉であってよい。スクロース、グルコースなどの単糖類、及びコーンシロップも使用することができる。炭水化物源によって与えられる炭水化物の量は、望むように選択することができる。たとえば、ペットフードは約６０重量％までの炭水化物を含んでよい。

適切なタンパク質源を、任意の適切な動物性又は植物性タンパク質源、たとえば筋肉又は骨格の肉、肉及び骨粉、家禽類の粉末、魚類の粉末、乳タンパク質、コーングルテン、小麦グルテン、大豆粉、大豆タンパク質の濃縮物、大豆タンパク質の単離物、卵のタンパク質、ホエー、カゼイン、グルテンなどから選択することができる。タンパク質源によって与えられるタンパク質の量は、望むように選択することができる。たとえばペットフードは、乾燥状態で約１２重量％〜約７０重量％のタンパク質を含んでよい。

ペットフードは脂肪源を含んでよい。任意の適切な脂肪源として、動物性脂肪と植物性脂肪のいずれも使用することができる。脂肪源は、獣脂などの動物性の脂肪源であることが好ましい。コーン油、ヒマワリ油、ベニバナ油、菜種油、大豆油、オリーブ油、及びモノ不飽和及びポリ不飽和脂肪酸が豊富な他の油などの植物油も使用することができる。必須脂肪酸（リノール酸及びα−リノール酸）に加えて、脂肪源は長鎖脂肪酸を含んでよい。脂肪源によって与えられる脂肪の量は、望むように選択することができる。たとえばペットフードは、乾燥状態で約５重量％〜約４０重量％の脂肪を含んでよい。ペットフードは、比較的少ない量の脂肪を有することが好ましい。

ペットフードは、長鎖脂肪酸などの他の活性成分を含んでよい。適切な長鎖脂肪酸には、α−リノール酸、γ−リノール酸、リノール酸、エイコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸がある。魚類の油は、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸の適切な源である。ボレージ油、ブラックカレントシードオイル、及びマツヨイグサの油は、γ−リノール酸の適切な源である。ベニバナ油、ヒマワリ油、コーン油、及び大豆油は、リノール酸の適切な源である。

炭水化物、タンパク質及び脂肪源の選択は重要ではなく、動物の栄養的必要性、嗜好性に関する考慮事項、及び製造する製品のタイプに基づいて選択されるであろう。さらに、さまざまな他の成分、たとえば糖、塩、スパイス、調味料、ビタミン、ミネラル、香料剤、ガム、前生物的合成物（プレバイオティクス：ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）及び共生（プロバイオティック）微生物も、望むようにペットフード中に取り込ませることができる。

したがって、共生微生物は、動物が消費するのに適しており、腸内の微生物バランスを改善することができる、１つ又は複数の微生物から選択することができる。共生微生物は、粉末状、乾燥形、特に胞子を形成する微生物に関しては胞子の形であってよい。さらに望むならば、共生微生物を、たとえば糖マトリクス、脂肪マトリクス又は多糖マトリクス中に被包して、生存の確率をさらに高めることができる。

乾燥したペットフードに関しては、適切な方法は押し出し調理であるが、ベーキング及び他の適切な方法を使用することができる。押し出し調理すると、乾燥したペットフードは、通常は粗びき穀物の形で与えられる。前生物的合成物を使用する場合、前生物的合成物を加工前に、乾燥したペットフードの他の成分と混合させることができる。適切な方法が、欧州特許出願第０８５０５６９号中に記載されている。共生微生物を使用する場合、微生物は乾燥したペットフード上にコーティングするか、あるいはその中に充填するのが最適である。適切な方法が、欧州特許出願第０８６２８６３号中に記載されている。

湿っているペットフードに関しては、米国特許第４，７８１，９３９号及び５，１３２，１３７号中に記載された方法を使用して、模造の肉製品を製造することができる。塊型の製品を製造するための他の手順、たとえばスチームオーブン中での調理も使用することができる。あるいは、適切な肉材料を乳化して肉の乳濁液を生成させ、適切なゲル化剤を加え、缶又は他の容器に充填する前に肉の乳濁液を加熱することによって、ローフ型の製品を製造することができる。

以下の実施例は例示のためにのみ提供され、決して本出願の主題を制限するものとして解釈すべきではない。パーセンテージ及び部は、他に特に指示しない限りは重量によるものとする。実施例は、図面の簡単な説明の前に置く。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株ＮＣＣ５３３、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株ＮＣＣ９０からのリポテイコ酸は、ヒト腸上皮細胞のＬＰＳ又はグラム陰性菌に対する応答性を相殺する。
物質及び方法
細胞、培地及び試薬。ヒト結腸腺癌細胞系ＨＴ２９を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ．ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３８）から得た。未分化細胞は、５％ＣＯ_２／空気インキュベータ内の、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；ＡｍｉｍｅｄＢｉｏＣｏｎｃｅｐｔ、Ａｌｌｓｃｈｗｉｌｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充したグルコース含有ＤＭＥＭ中に３７℃で保ち、一方分化した細胞は、グルコースを含まない培地中で増殖させた。細胞単層が９０％の集合状態に達するまで、培養基は２日毎に交換した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配遠心分離によって、健康な成人ドナーのヘパリン血から単離した。単離したＰＢＭＣを３回洗浄し、１％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ａｄｄｒｅｓｓ）に再懸濁させた。大腸菌及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ菌株からのＬＰＳは、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ネズミ抗−ＣＤ１４モノクローナル抗体ＭＹ４（ＩｇＧ２ｂ）は、Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。アイソタイプの適合する対照ｍＡｂは、ＭＯＰＣ１４１（Ｓｉｇｍａ）に由来するマウスＩｇＧ２ｂ（ｋａｐｐａ）であった。ヒト母乳は、健康な母親から得た。搾乳器による圧搾によって滅菌遠心分離チューブ中に、分娩後７０日までのサンプルを得て、２時間の回収中に加工した。２００×ｇで３０分間の遠心分離の後に、非細胞性の脂質を含まない分画を、使用するまで−８０℃に凍結させた。

ＬＴＡの単離及び精製。
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉＬａ１ＮＣＣ５３３、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＬａ１０ＮＣＣ９０からのＬＴＡを、Ｆｉｓｃｈｅｒ他（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｗ他、１９８３．Ｅｕｒ．ＪＢｉｏｃｈｅｍ１３３：５２３〜５３０）の方法に従って単離した。簡潔に言うと、細菌をＭＲＳブロス中で一晩培養し、採取し、８００ｍｇｗｅｔｗｔ／ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．５のバッファーに再懸濁させた。次いで２倍容のメタノール、及び１倍容のクロロホルムと一晩室温で混合させることによって、細菌を脱脂した。脱脂した細菌を濾過によって回収し、２倍容のメタノールで洗浄し、バッファー１ｍｌ当たり細菌５００ｍｇの濃度で、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．７に再懸濁させた。この懸濁液を等体積の温かい８０％ｗ／ｖフェノール水溶液と混合させ、６５℃の水浴中で４５分間絶えず攪拌した。冷却後、形成された乳濁液を４℃において５０００×ｇで３０分間遠心分離にかけた。次いで上側の水性層を、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５で充分に透析した（留分６〜８ｋＤａ）。核酸は３０Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）、９Ｕ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、５ｍＭのＭｇＳＯ４、４０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム及び０．２ｍＭのＮａＮ３中において消化し（室温で２４時間）、１ｍｌのトルエンを加えて、細菌汚染を防いだ。消化産物を０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．７でもう１度透析し、１−プロパノールを用いて１５％に調整した。０．１Ｍ酢酸ナトリウム及び１５％１−プロパノール中で平衡状態にした、流量０．１ｍｌ／１分の、オクチルセファロースカラムにこれを施した。５ｍｌの分画を回収した。ＬＴＡの溶離を、同じバッファー中において１５％〜８０％１−プロパノールの勾配で、流量０．５ｍｌ／１分で行った。３ｍｌの分画を回収した。１−プロパノール濃度の監視は、屈折率を測定することによって行った。それぞれの分画を、全中性糖（Ｄｕｂｏｉｓ、Ｍ．Ａ．他、「糖類及び関連物質を決定するための比色法（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｓｕｇａｒｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．）」ＡｎａｌＣｈｅｍ２８：３５０〜３５６）、リン（Ｃｈｅｎ、Ｐ．Ｓ．他、１９５６．「リンの微量定量法（Ｍｉｃｒｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ．）」ＡｎａｌＣｈｅｍ２８：１７５６〜１７５８）、核酸の含量、及び屈折率に関して分析した。ピークの物質をロータリーエバポレーター（ｒｏｔａｖａｐ）で濃縮して、プロパノールを除去し、水で充分に透析した。濃縮後、０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４．７、１ｍｌのＣａＣｌ_２及びＭｇＣｌ_２を加え、小分けにした各分量を−２０℃に凍結させた。Ｌａ１ＬＴＡの抗原活性を、近年記載されたＥＬＩＳＡ（Ｇｒａｎａｔｏ、Ｄ．他、１９９９．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ６５：１０７１〜１０７７）によって確認した。脱アシル化を、Ｔｅｔｉ他（Ｔｅｔｉ、Ｇ他、１９８７．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ５５：３０５７〜３０６４）によって記載されたように行った。

Ｌｉｍｕｌｕｓａｍｏｅｂｏｃｙｔｅの溶解物アッセイ。
細胞を曝したすべての試薬を、濁度測定による動的なＬｉｍｕｌｕｓａｍｅｂｏｃｙｔｅの溶解物塊アッセイ（Ｅ−Ｔｏｘａｔｅ（登録商標）アッセイ）によって、エンドトキシン汚染に関して試験した。この試験は、１ｍｌ当たり０．０５〜０．１エンドトキシン単位（大腸菌０．５５：Ｂ５ＬＰＳ）の感度を有していた。この実験で使用した異なる培地は、不活性であるか、あるいは５０ｐｇ／ｍｌ未満のエンドトキシンを含むことを見出した。

細胞の処理。
ＨＴ２９細胞を、９６ウエルの平底プレート中において、細胞１０^４個／ウエルで平板培養した。５日間のインキュベーションの後、ＨＴ２９細胞を、２００μｌのＤＭＥＭ中にヒト乳汁、ＬＰＳ及び／又はＬＴＡを加える前に、血清を含まない培地で２回洗浄した。いくつかのウエルには、抗−ＣＤ１４モノクローナル抗体も、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。他の実験では、１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地にＰＢＭＣを懸濁させ、次いで細胞２×１０^５個／ウエルの濃度で９６ウエルの平底プレート中に平板培養した。次いで細胞をＬＴＡと共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＬＰＳで刺激した。３７℃での２４時間のインキュベーションの後、上澄みを回収し、サイトカイン含量をさらに測定するために−２０℃で保存した。細胞の生存能力を、細胞毒性検出キット（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して調べ、これによって損傷した細胞のサイトゾルから上澄みに放出された、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を測定した。

培養物の上澄み中のＩＬ−８及びＴＮＦ−αの濃度。
細胞培養物の上澄み中で生成したＩＬ−８の量を、ＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔に言うと、ＩＬ−８に対するモノクローナル抗体（２μｇ／ｍｌ、ＩｍｍｕｎｏＫｏｎｔａｋｔ、Ｂｉｏｇｇｉｏ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、４℃で一晩インキュベーションすることによって、９６ウエルのプレート（Ｎｕｎｃ）上にコーティングした。次いでこのプレートを、ＰＢＳに溶かした０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄した。非特異的な結合は、室温でさらに２時間、ＰＢＳに溶かした１０％ＦＣＳでプレートをインキュベートすることによって阻害した。次いでサンプル、すなわちＦＣＳ−ＰＢＳに溶かした標準濃度の組み換えサイトカイン（１５．６２５〜２０００ｐｇ／ｍｌ．ＩｍｍｕｎｏＫｏｎｔａｋｔ）を、室温で３時間かけて加えた。次いでプレートを、ビオチン標識した抗ヒトＩＬ−８モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ、ＩｍｍｕｎｏＫｏｎｔａｋｔ）を加える前に、室温でさらに１時間、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。４回の洗浄の後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（０．５μｇ／ｍｌ、ＫＰＬ、Ｂｉｏｒｅｂａ、Ｒｅｉｎａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、室温で１時間かけて加えた。次いでプレートを再度洗浄し、基質（ＴＭＢペルオキシダーゼ．ＫＰＬ）を１０〜３０分かけて加えた。酵素反応は、１ＮのＨＣｌを加えることによって停止させた。ＥＬＩＳＡ読み取り装置（ＤｙｎｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。検出限界は約３０ｐｇ／ｍｌであった。細胞培養物の上澄み中に放出されたＴＮＦ−αの量を、市販のＥＬＩＳＡキット（ＲａｎｄＤｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定した。

上皮好中球アクチベーター（ＥＮＡ）−７８の、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅。
ＨＴ２９細胞から全細胞ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ法（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して組織培養皿に抽出した。腸上皮細胞から単離したＲＮＡを、モロニーネズミ白血病ウイルスの逆転写酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ａｄｄｒｅｓｓ）によって逆転写した。簡潔に言うと、ＲＮＡサンプル（全ＲＮＡ０．５μｇ）、０．５単位のＲＮａｓｅ阻害剤、１ｍＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．５ｎｍｏｌ／ｍｌの特異的な３’プライマー、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び１．２５単位の逆転写産物を、製造者によって供給された酵素バッファーを含む、合計体積１０μｌの反応混合物中でインキュベートした。反応混合物を４２℃で３０分間インキュベートし、次いで９５℃で５分間加熱した。次いで逆転写産物を、サーモサイクラー（Ｂｉｏｌａｂｏ、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣｈａｔｅｌＳｔＤｅｎｉｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で、ＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって増幅させた。ＰＣＲバッファー、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、５μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、０．２ｎｍｏｌ／ｍｌのＥＮＡ−７８特異的な３’アンチセンス及び５’センスプライマー（それぞれＣＧＴＴＣＴＣＡＧＧＧＡＧＧＣＴＣ及びＴＣＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＧ、Ｋｅａｔｅｓ他、１９９７Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ２７３Ｇ７５〜Ｇ８２）、及び１．２５単位のＤＮＡポリメラーゼ中で、１０μｌの逆転写産物を使用して、合計体積５０μｌでＰＣＲを行った。９５℃で１０分間の最初の変性の後、９４℃で４５秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分３０秒の伸長、次に７２℃で７分間の伸長ステップという３５サイクルによって、サンプルを増幅させた。すべてのサンプルを、陽性対照としてのβ−アクチンに関するＲＴ−ＰＣＲに施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物のサンプルを、ＴＡＥバッファー中の（臭化エチジウムを含む）１．２％アガロースゲル上に載せ、１５０Ｖで１時間の電気泳動によって分離した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、紫外光の下で目に見える状態にした。バンドの正確なサイズは、ＤＮＡサイズマーカー（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）と比較することによって決定した。

結果
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種からのＬＴＡは、ＨＴ２９細胞による大腸菌又はＬＰＳ誘導型のＩＬ−８、ＴＮＦ−α及びＥＮＡ−７８放出を阻害する。
我々は、グラム陽性菌又はそれらの誘導体も、ヒト腸上皮細胞のＨＴ２９細胞を刺激することができるかどうか調べた。異なるグラム陽性菌を、ｓＣＤ１４の源としてのヒト乳汁の存在下又は不存在下で、ＨＴ２９細胞と共にインキュベートした。大腸菌とは対照的に、グラム陽性菌Ｌ．ｓａｋｅｉ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株Ｌａ１０及びＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株Ｌａ１、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｕｓは、ｓＣＤ１４の存在下でさえ、ＨＴ２９細胞によるＩＬ−８の放出を刺激することができなかった。さらに、Ｌａ１、Ｌａ１０又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓからのＬＴＡを１００μｇ／ｍｌまでの濃度で加えたときに、ＩＬ−８分泌が観察されることはなかった。

ｓＣＤ１４はグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方の成分を認識することが知られているので、我々は、ＬＴＡなどのグラム陽性菌の成分が、ＨＴ２９細胞に対するグラム陰性菌の影響を相殺することができるかどうかを試験した。この目的のために、ＨＴ２９細胞を、ｓＣＤ１４の源としてのヒト乳汁、及びＬａ１（図１Ａ）又はＬａ１０（図１Ｂ）のいずれかからのさまざまな量のＬＴＡの存在下又は不存在下においてＬＰＳ（１０及び１００ｎｇ／ｍｌ）を投与した。予想されたように、ｓＣＤ１４の存在下で１０又は１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳに曝したＨＴ２９細胞は、多量のＩＬ−８（図１、点線）を放出した。Ｌａ１（図１Ａ、実線）又はＬａ１０（図１Ｂ、実線）のいずれかからのＬＴＡを加えることによって、ＬＰＳ誘導型のＩＬ−８分泌の顕著な低下が引き起こされた。この阻害活性は用量依存性であり、１００〜１０００倍過剰なＬＴＡを使用することによって完全な阻害が観察された。ＬＴＡの阻害活性が一般的な現象であることを確認するために、他の源のＬＰＳに対するＨＴ２９細胞の応答性に対する、ＬＴＡの相殺活性を試験した。図２Ａに示すように、Ｌａ１からのＬＴＡは、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｄｉｓからのＬＰＳを投与したＨＴ２９細胞による、ＩＬ−８分泌を阻害した。さらに、Ｌａ１からのＬＴＡは、全大腸菌のｓＣＤ１４のＨＴ２９細胞に対する影響を相殺した（図２Ｂ）。

図３に示すように、Ｌａ１からのＬＴＡ及びＬａ１０からのＬＴＡも、両方共にＨＴ２９細胞による大腸菌ＬＰＳ誘導型のＴＮＦ−α放出を阻害した。さらに、コードされているＥＮＡ−７８ｍＲＮＡのＬＰＳ誘導型の発現も、Ｌａ１からのＬＴＡによって著しく阻害された（図４）。注目すべきことに、観察されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＬＴＡの阻害活性は、ＨＴ２９細胞に対するＬＴＡ調製物の細胞毒性的影響によるものではなかった。なぜなら、培養物の上澄み中ではＬＤＨの著しい放出を、検出することはできなかったからである（データは示さず）。

Ｌａ１及びＬａ１０からのＬＴＡは、分化したＨＴ２９細胞によるＬＰＳ誘導型のＩＬ−８放出を阻害する。
図５に示すように、ヒト乳汁の存在下において１０ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳを投与した分化したＨＴ２９細胞は、多量のＩＬ−８を放出した（点線）。前と同様に、Ｌａ１又はＬａ１０のいずれかからのＬＴＡ（実線）は、この分泌の用量依存性の低下を引き起こした。５０００倍過剰なＬＴＡで、完全な阻害が観察された。

Ｌａ１からのＬＴＡは、ヒト単球のＬＰＳによる刺激を阻害する。
いくつかのＬＴＡは、血液単球及びマクロファージ上の膜結合ＣＤ１４と相互作用し、さまざまなサイトカインの分泌を刺激する。したがって我々は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＬＴＡに曝されたＰＢＭＣによる、ＩＬ−８及びＴＮＦ−αの分泌を分析した。１ｎｇ／ｍｌの濃度で大腸菌ＬＰＳを加える前に、漸増量のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＬＴＡ（１００〜１００００ｎｇ／ｍｌ）の存在下において３０分間、ＰＢＭＣをインキュベートした。図６に示すように、Ｌａ１ＬＴＡを単独で与えると、５μｇ／ｍｌ以上の濃度でＩＬ−８分泌を刺激したが（図６Ａ）、しかしながら、試験したいずれの濃度でも、ＴＮＦ−α放出の刺激は見られなかった。さらに、Ｌａ１からのＬＴＡは、ＰＢＭＣによるＬＰＳ誘導型のＩＬ−８の分泌に対して、非常にわずかな相殺的影響があるが（図６Ｂ）、それは用量依存的にＬＰＳ誘導型のＴＮＦ−αの分泌をより顕著に阻害した（図６Ｃ）。Ｌａ１０からのＬＴＡは、単独あるいはＬＰＳと共に、ＩＬ−８又はＴＮＦ−α産生に対して顕著な影響はなかった。

脱アシル化ＬＴＡの生物学的活性。
ＬＴＡの脱アシル化によって、細胞の生物学的活性の損失がもたらされる。これは、ＬＴＡの脂質成分が免疫調節活性にとって重要であることを示す。したがって我々は、我々の細胞モデルにおいて、ＬＴＡの脱アシル化のそのＬＰＳ相殺性に対する影響を調べた。図７に示すように、ＨＴ２９細胞によるＩＬ−８のＬＰＳ−ｓＣＤ１４型誘導に対する、Ｌａ１からのＬＴＡ（図７Ａ）及びＬａ１０からのＬＴＡ（図７Ｂ）の相殺活性は、脱アシル化後に著しく弱まった。したがって、我々の細胞系でのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのＬＴＡの相殺活性も、脂質成分によって媒介されている。

ＬＰＳ−ｓＣＤ１４の影響の阻害における、ｓＣＤ１４−ＬＴＡ相互作用の役割。
どのようにしてＬＴＡが、グラム陰性菌に対してその相殺的影響を及ぼすことができるのかを理解するために、Ｌａ１からのＬＴＡ及びヒト乳汁ｓＣＤ１４又は大腸菌ＬＰＳと共にＨＴ２９細胞をプレインキュベートした、異なる処理手順を行った。Ｌａ１ＬＴＡ（５０及び１００μｇ／ｍｌ）と共にヒト乳汁あり又はなしで、ＨＴ２９細胞を４時間プレインキュベートし、血清を含まない培地で２回洗浄し、乳汁の存在下においてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を２０時間投与すると、ＩＬ−８の分泌が無くなることはなかった（図８Ａ）。しかしながら、ｓＣＤ１４の存在下においてＬａ１ＬＴＡ（１〜５０μｇ／ｍｌ）と共に、細胞を４時間プレインキュベートし、次いで洗浄せずにＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を２４時間投与すると、ＩＬ−８産生のレベルは、ＬＴＡ、ＬＰＳ及びｓＣＤ１４と一緒にＨＴ２９細胞を２４時間インキュベートしたときに、得られたものと同等であった（図８Ｂ）。図８Ｃは、Ｌａ１ＬＴＡ（１〜５０μｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）と共に４時間プレインキュベートした細胞に、ｓＣＤ１４の源を加えた２４時間後に得られた、ＩＬ−８産生のレベルを示す。このレベルは、混合物ＬＴＡ、ＬＰＳ及びｓＣＤ１４と共にＨＴ２９細胞を２４時間インキュベートしたときに、得られた量と同等であった。ＬＴＡを加える前に、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）及びｓＣＤ１４の源と共に細胞を４時間プレインキュベートしたときに、同等の結果が得られた（図８Ｄ）。

ＩＥＣは膜ＣＤ１４を発現せず、ｉｎｖｉｔｒｏでＬＰＳに応答するために可溶形を必要とする（Ｐｕｇｉｎ、Ｊ他、１９９３ＰＮＡＳ９０：２７４４〜２７４８）。グラム陰性菌及びＬＰＳが、ヒト乳汁ｓＣＤ１４の作用によってＩＥＣの前炎症性サイトカイン産生を媒介することを、我々は以前に示している（Ｌａｂｅｔａ、Ｍ．Ｏ．他、２０００．ＪＥｘｐＭｅｄ１９１：１８０７〜１８１２）。しかしながらＩＥＣは、ｓＣＤ１４が存在するにもかかわらず、さまざまな源のＬＴＡに応答しない。他の研究によって、ＬＴＡの真核細胞膜への結合には脂肪酸成分が必要であることが示唆されており、脂肪酸結合タンパク質は、腸柔突起の上側部分の分化したＩＥＣのみで発現するので、我々は分化したＨＴ２９に対するＬＴＡ−乳汁の影響も調べた。興味深いことに、ＬＴＡは依然としていかなる応答も誘導することができなかったが、一方でＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株Ｌａ１、及びＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株ｌａ１０からのＬＴＡは、血液単球からのＩＬ−８放出を刺激することができた。

これらの結果によって、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株Ｌａ１及びＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株Ｌａ１０の、共生状態に対するさらなる支持が与えられ、グラム陰性菌又はそれらの誘導体によって引き起こされる疾患と戦う際の、それらのＬＴＡの治療的役割が示唆される。

乳児用調合乳
乳児用調合乳を得るために、１００ｍｌの調合乳用に、０．５〜５％、好ましくは２％のペプチド、０．２〜１０％、好ましくは４％の脂肪、１〜２５％、好ましくは８％の非レバン炭水化物（ラクトース６５％、マルトデキストリン２０％、澱粉１５％を含む）、及び少なくとも１０^６ｃｆｕ／ｍｌの以下の菌株：ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＮＣＣ９０（ＣＮＣＭＩ−２３３２）又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭＩ−１２２５）を、日常の要件を満たすための微量のビタミン及びオリゴエレメント、及び０．０１〜２％、好ましくは０．３％のミネラル、及び５０〜９０％、好ましくは７５％の水と組み合わせて含む混合物を、我々は調製する。

乳製品における使用
本発明に従って、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＮＣＣ９０（ＣＮＣＭＩ−２３３２）又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭＩ−１２２５）の１つ又は複数の菌株を、発酵生産されたヨーグルト様の乳製品を製造するために使用することができる。

これを行うために、２．８％の脂肪を含み、２％の脱脂粉乳及び６％のスクロースを補充した１リットルの乳製品を作製し、これを９６℃で３０分間殺菌し、次いでその温度を４２℃に下げる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの非増粘性菌株、及び非粘着性菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓの予備培養物を、１０％の還元粉乳及び０．１％の市販の酵母菌抽出物を含む、滅菌したＭＳＫ培養基中で再活性化させる。

１つ又は複数の菌株の予備培養物も、１０％の還元粉乳及び０．１％の市販の酵母抽出物、及び１％のスクロースを含む培地において再活性化させる。次いで殺菌した乳製品に、１％のこれらの再活性化させた予備培養物それぞれを接種し、次いでこの乳製品を、ｐＨが４．５の値に達するまで、３２℃で発酵させる。発酵生産されたヨーグルト様の乳製品をこのようにして製造し、４℃で保存する。

乾燥したペットフード
配合飼料は約５８重量％のコーン、約６重量％のコーングルテン、約２３重量％のチキンミールで構成され、塩、ビタミン及びミネラルが残りを構成する。

配合飼料を予備調整器に供給し、湿らせる。次いで湿らせた飼料を押し出し調理器に供給し、ゼラチン状にする。押し出し機から出てくるゼラチン状マトリクスは、ダイを介して追いやり押し出す。この押し出し品をネコに与えるのに適した片に切断し、約１１０℃で約２０分間乾燥させ、冷却してペレットを形成させる。この時点で、以下のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種：ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭＩ−１２２５）又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＮＣＣ９０（ＣＮＣＭＩ−２３３２）の、１つ又は複数の菌株の凍結乾燥させた粉末を、ペレットに施すために与える。ペット用の対応する食事摂取量が約１．０Ｅ＋０７〜１．０Ｅ＋９ｃｆｕ／１日となるように、充分な粉末を与える。いくらかの粉末をペレットの第１の塊に混合し、袋に入れる。粉末の第２の量を測定し、液状担体と混合させ、次いでこれをペレットの第２の塊にスプレーする。５０〜６０℃で数分間、コーティングを充分乾燥させた後に、ペレットを袋に入れる。

この乾燥したドッグフードは、細菌のコロニー形成と関連がある炎症過程を減少させることを特に目的とする。

Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ菌株Ｌａ１及びＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ菌株Ｌａ１０からのＬＴＡの、大腸菌から精製したＬＰＳを投与したＨＴ２９細胞によるＩＬ−８の放出に対する影響を示す図である。１０ｎｇ／ｍｌ（●）又は１００ｎｇ／ｍｌ（■）の大腸菌ＬＰＳ、及びＬａ１（Ａ）又はＬａ１０（Ｂ）からのさまざまな量のＬＴＡの存在下において、２％ヒト乳汁（ＨＭ）を補充した培地中で２４時間インキュベートしたＨＴ２９細胞の上澄み中において、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−８産生を測定した。ＬＰＳ−ＨＭ単独によるＨＴ２９細胞の活性化は、破線として示す。エラーバーはＳＤを示す。これらの結果は、３つの独立した実験を表すものである。ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＬａ１からのＬＴＡの、Ｓａｌ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｓ又は全大腸菌からのいずれかのＬＰＳを投与したＨＴ２９細胞によるＩＬ−８の放出に対する、影響を示す図である。Ｌａ１からのさまざまな量のＬＴＡの存在下において、２％ヒト乳汁（ＨＭ）、及び１０ｎｇ／ｍｌ（●）又は１００ｎｇ／ｍｌ（■）のＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｄｉｓのＬＰＳ（Ａ）、又は２．５×１０^５／ｍｌの全大腸菌（Ｂ）のいずれかを補充した培地中で、２４時間インキュベートしたＨＴ２９細胞の上澄み中において、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−８産生を測定した。ＬＴＡの不存在下でのＨＴ２９細胞の活性化は、破線として示す。エラーバーはＳＤを示す。ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＬａ１及びＬａ１０からのＬＴＡの、大腸菌ＬＰＳを投与したＨＴ２９細胞によるＴＮＦ−αの放出に対する、影響を示す図である。１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ、及びＬａ１（■）又はＬａ１０（●）からのさまざまな量のＬＴＡの存在下において、２％ヒト乳汁（ＨＭ）を補充した培地中で、２４時間インキュベートしたＨＴ２９細胞の上澄み中において、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦ−α産生を測定した。ＬＴＡの不存在下でのＨＴ２９細胞の活性化は、破線として示す。エラーバーはＳＤを示す。ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＬａ１からのＬＴＡの、ＨＴ２９細胞中でのＥＮＡ−７８ｍＲＮＡ発現のＬＰＳ誘導に対する、影響を示す図である。１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳを投与したＨＴ２９細胞の、すべてのＲＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲによって、ＥＮＡ−７８の発現を以下の場合について評価した。２％ヒト乳汁の不存在下（レーン１）又は２％ヒト乳汁の存在下（レーン２〜６）、ＭＹ４抗ＣＤ１４ｍＡｂを加えたもの（レーン３）、アイソタイプの適合する抗体の対照（レーン４）、又は１μｇ／ｍｌのＬａ１からのＬＴＡ（レーン５）又は５０μｇ／ｍｌのＬａ１からのＬＴＡ（レーン６）。ＥＮＡ−７８の転写物に関する予想されたＰＣＲ産物のサイズは、２２０ｂｐであった。内部標準に関しては、βアクチンに関する増幅されたバンド（４６０ｂｐ）を、ハウスキーピング遺伝子として使用した。ＳＭはサイズマーカーである。ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＬａ１及びＬａ１０からのＬＴＡの、大腸菌ＬＰＳを投与した分化したＨＴ２９細胞によるＩＬ−８の放出に対する、影響を示す図である。１００ｎｇ／ｍｌの大腸菌ＬＰＳ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉＬａ１（■）又はＬａ１０（●）からの示した量のＬＴＡの存在下において、２％ヒト乳汁（ＨＭ）を補充した培地中で、２４時間インキュベートした分化したＨＴ２９細胞の上澄み中において、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−８産生を測定した。加えたＬＴＡが存在しない下での、分化したＨＴ２９細胞の活性化は、点線として示す。ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＬａ１からのＬＴＡの、ヒトＰＢＭＣの活性化に対する影響を示す図である。（Ａ）新鮮に単離したヒトＰＢＭＣ（細胞２×１０^５個／１ウエル）を、さまざまな量の大腸菌ＬＰＳ（）又はＬａ１からのＬＴＡ（●）のいずれかの存在下において、１％ヒト血清を補充したＲＰＭＩ中でインキュベートした。（Ｂ）及び（Ｃ）ＰＢＭＣを、大腸菌ＬＰＳ（１ｎｇ／ｍｌ）を加える前に、Ｌａ１からのさまざまな量のＬＴＡの不存在下（破線）又は存在下（実線）において、３７℃で３０分間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、培養物の上澄みを回収し、特異的なＥＬＩＳＡによってＩＬ−８（Ａ）及び（Ｂ）、又はＴＮＦ−α（Ｃ）の存在に関して分析した。エラーバーはＳＤを示す。ＬＴＡの脱アシル化の、それらの相殺活性に対する影響を示す図である。さまざまな量の元のＬＴＡ（■）、あるいはＬａ１（Ａ）又はＬａ１０（Ｂ）から精製した脱アシル化ＬＴＡ（●）の不存在下（破線）又は存在下（実線）において、２％ヒト乳汁（ＨＭ）を補充した培地中で、ＨＴ２９細胞に大腸菌ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を投与した。２４時間後、培養物の上澄み中のＩＬ−８の放出を、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＬＴＡ及びｓＣＤ１４、又はＬＴＡ及びＬＰＳを用いた細胞のプレインキュベーションの、相殺性に対する影響を示す図である。（Ａ）ＨＴ２９細胞を、２％ヒト乳汁（ＨＭ）の存在下でＬａ１ＬＴＡ（５０及び１００μｇ／ｍｌ）と共に４時間プレインキュベートし、血清を含まない培地で２回洗浄し、次いでＨＭの不存在下又は存在下において、大腸菌ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を２０時間投与した。（Ｂ）大腸菌ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を加える前に、ＨＴ２９細胞を、ヒト乳汁（ＨＭ）の存在下で４時間、Ｌａ１ＬＴＡ（１、１０及び５０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。（Ｃ）２％ヒト乳汁（ＨＭ）を加える前に、ＨＴ２９細胞を、大腸菌ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で４時間、Ｌａ１ＬＴＡ（１、１０及び５０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。（Ｄ）Ｌａ１ＬＴＡ（１、１０及び５０μｇ／ｍｌ）を加える前に、２％ヒト乳汁（ＨＭ）の存在下で４時間、大腸菌ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）をＨＴ２９細胞に投与した。合計２４時間培養した後の上澄み中のＩＬ−８の放出を、ＥＬＩＳＡによって測定した。エラーバーはＳＤを示す。

Claims

乳酸菌からのリポテイコ酸を活性成分として含み、前記乳酸菌がラクトバチルスジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＮＣＭＩ−１２２５、ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＮＣＭＩ−２３３２である、敗血症、細菌の移動、炎症、感染及び疾患、及び細菌の過剰増殖を治療するための組成物。
乳酸菌からのリポテイコ酸を活性成分として含み、前記乳酸菌がラクトバチルスジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＮＣＭＩ−１２２５、ラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＮＣＭＩ−２３３２である、敗血症、細菌の移動、炎症、感染及び疾患、及び細菌の過剰増殖を治療するための医薬用組成物。
前記リポテイコ酸を生成する乳酸菌、又は乳酸菌の培養物の上澄みを含む、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
前記リポテイコ酸が、１０^５ｃｆｕ／ｇ〜１０^１６ｃｆｕ／ｇの細菌の量に対応する量で存在する、請求項１から請求項３のいずれかに記載の組成物からなる医薬用組成物。
少なくとも１つの乳酸菌からのリポテイコ酸、及び／又はリポテイコ酸を生成する乳酸菌、及び／又は乳酸菌の培養物の上澄みの使用であって、
前記乳酸菌がラクトバチルスジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＮＣＭＩ−１２２５又はラクトバチルスアシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＮＣＭＩ−２３３２であり、
敗血症、細菌の移動、炎症、感染及び疾患、及び細菌の過剰増殖から選択される、ヒト又は動物の胃腸管、骨、皮膚、眼、耳、肺及び口腔中で、細菌媒介性疾患、又はＬＴＡ／ＬＰＳ媒介障害と関連する炎症過程の減少又は予防を目的とする組成物を調製するための上記使用。
前記組成物が、局所用又は経口用調製物、眼科的施用物又は経口用施用物の形態での化粧的又は皮膚科的施用のための組成物である、請求項５に記載の使用。