JP4667568B2 - 免疫増強組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビタミンＥと他の免疫賦活物質、特に乳酸菌またはその処理物やニゲロオリゴ糖を配合した免疫増強組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はＴリンパ球である。Ｔリンパ球はこれらの微生物や腫瘍を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原特異的に活性化され、これらの異物を排除する能力を高める。常に微生物に曝され、また細胞が変異している生体内では、こうしたＴリンパ球は抗原受容体を介して常に活性化される一方で、抗原受容体以外の経路でも抗原非特異的に活性化されている。抗原特異的および抗原非特異的のいずれの活性化においても、他からの刺激、すなわち共刺激が加わるとＴリンパ球の活性化はさらに促進される。現在用いられている免疫賦活剤は、免疫担当細胞を非特異的に活性化することにより、微生物感染、腫瘍に対する生体の防御機構を高めるものであるが、有効性において満足しうるものは少なく、また、これらの免疫賦活剤は、一般に作用の特異性が低いため、例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リュウマチ等の自己免疫疾患のような副作用が懸念される。
これまで免疫力を増強するといわれる物質は多数報告されている。それらの中の１つに、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類がある。この３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)の菌糸中に含有されるニゲラン、そのニゲランの部分酸加水分解等によって得られるα−Ｄ−グルコピラノース（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノース（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノース（１→３）−Ｄ−グルコースをはじめとする様々な３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有するオリゴ糖があり、これらは、上記のニゲランの加水分解によっても得ることが可能である。また、ニゲロースと称される３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースなどもある。
本発明者らは、これら３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類が、抗原受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させ、また、菌体成分またはレクチンを認識する受容体を介する刺激により、抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させることを見出し、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類を有効成分として含有する免疫賦活剤の発明をなし、特許出願をした（特開平９−５２８３４号）。
【０００３】
一方、乳酸菌、たとえばラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体が、抗原受容体を介するＴリンパ球の活性化を上昇させることにより、生体内で常時起こっている微生物および腫瘍細胞に対する排除反応を高め、特にインターフェロンγの産生を増強することから、ウイルスや腫瘍に対する防御能を高めることが知られている。さらにこの菌体はインターフェロンγによるＴヘルパー１型機能を上昇させるので、Ｉ型アレルギーの予防や治療に有効である。
【０００４】
またこのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、腫瘍細胞傷害性を有するナチュラルキラー細胞を活性化するサイトカインであるインターロイキン−１２のマクロファージからの産生を高める結果、腫瘍に対する防御能を特に高めるとともに、後天性免疫不全症候群（AIDS）の発症予防にも有用である。しかしこの菌体は、腫瘍壊死因子αの産生は軽度にしか上昇させないため、通常のマクロファージの活性化剤により上昇する腫瘍壊死因子αにより引き起こされる、発熱、体重減少などの副作用を誘導しない。
これらの知見を基に、本発明者らは、ラクトバチルス属に属する菌またはその処理物を含む免疫賦活剤の発明を成し遂げ、既に特開平１０−１６７９７２号として特許出願した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、実質的な副作用がなく、且つ従来のものに比べてさらに強い免疫増強効果を奏する組成物、例えば医薬、食品、飼料、化粧品等を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、より強い免疫増強効果を示す組成物を求め、種々の既知物質を併用して、その免疫増強作用を調べていたところ、偶然にもビタミンＥと他の免疫賦活物質、特に乳酸菌またはその処理物や３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類と併用すると予想を超える強い免疫増強効果が発揮されることを知見し、その知見を基にさらに検討を重ね本発明を完成した。
すなわち本発明は
（１）ビタミンＥおよびラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である乳酸菌またはそれらの磨砕物、破砕物、それらからの抽出物またはそれらの乾燥品、ならびにニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースの少なくとも一種類を含んでなるニゲロオリゴ糖を含有してなるＩＬ−１２産生誘導組成物、である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の組成物の形態としては、粉末状、顆粒状、錠剤、液剤などの経口医薬、注射剤、輸液剤などの非経口医薬、ゼリー、飲料などの食品などが含まれ、その他飼料、各種化粧品であってもよい。
本発明の組成物は、担体としては各種キャリアー担体、イクステンダー、希釈剤（水、ミルクなど）、増量剤、分散剤、賦形剤、結合剤、溶媒（水、エタノール、植物油）、溶解補助剤、緩衝剤、溶解促進剤、ゲル化剤（ＣＭＣ−Ｎa、ＨＰＭＣなど）、懸濁化剤（ＣＭＣ−Ｎa、ナトリウムアルギネートなど）等を用い、常法により、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤、チュアブル剤、ドレッシング類、菓子類等の医薬や食品等の形態にすることができ、免疫増強の必要な人に対して経口的に摂取させることができる。また、必要に応じて、可溶化等の公知の技術に従って、非経口投与の形態としてもよく、注射剤とすることもできる。また、公知の賦形剤ないし担体を用い、自体公知の方法に従い、例えば化粧水、乳液、クリーム等の基礎化粧料、ファンデーション、アンダーメークアップ、白粉等のメークアップ料等の化粧料剤形として外用経路で適用することもできる。また、ヒトに限らず、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、ニワトリ等の家禽、ハマチ等の養殖魚、さらにはイヌやネコ等のペット動物の免疫増強に用いることができ、例えば、常法に従い、飼料用の固体ないしは液体の添加剤とすることもできる。
本発明の組成物は、その相乗的に増強された免疫賦活作用から、ウイルス、バクテリア等の微生物による感染症、例えば、経口感染にるコレラ菌、毒素原性大腸菌、赤痢菌、サルモネラ、ウイルス等の感染性腸炎や、気道感染によるインフルエンザ、かぜ症候群や、口腔内感染による口内炎、歯周疾患等、また、各種悪性腫瘍、例えば、消化管や呼吸器粘膜、肝・腎等の実質臓器に発生する上皮性悪性腫瘍や、運動器や軟部組織などに発生する非上皮性悪性腫瘍の予防や治療に有効である。また、本発明の製剤はインターロイキン１２および／またはインターフェロンγ産生誘導作用を有し、Ｔヘルパー機能をＴヘルパー１型に傾けるために、腫瘍により誘導される免疫抑制状態や抗癌剤治療により誘導される免疫機能低下からの回復に適しており、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の発症予防、リステリア菌、サルモネラ菌、結核菌、癩菌等の細胞内寄生性細菌の防除、Ｉ型アレルギーの予防や治療、ストレスに起因するＴヘルパー１型免疫機能低下の改善等に有効であり、加齢に伴う免疫機能低下の抑制等にも適している。また、細胞内寄生性細菌のクラミジア菌に対する感染防御作用により、クラミジア菌感染との関わりが強く示唆されている動脈硬化発症に対しても予防的に働く。したがって、種々の生体機能調節、各種疾患に対する抵抗性の向上、日常の保健強壮の促進に有効である。
本発明において用いられるビタミンＥとしては、天然型ビタミンＥであるｄ体のα−、β−、γ−およびσ−トコフェロールとα−、β−、γ−およびσ−トコトリエノール、その合成体であるｄｌ体のα−、β−、γ−およびσ−トコフェロールとα−、β−、γ−およびσ−トコトリエノール、およびこれらのエステルであるコハク酸ｄ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロールカルシウム、酢酸ｄ−α−トコフェロールおよび酢酸ｄｌ−α−トコフェロール等の１種または２種以上が使用できる。これらビタミンＥの組成物への配合量は、組成物が経口的に摂取される場合、消化管からの吸収率を考慮して、成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量がα−トコフェロールとして０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは２．５ｍｇ〜２５０ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇ摂取されるよう設定するのが望ましい。また、注射剤、輸液剤の場合は成人１人１日当りの投与量がα−トコフェロールとして０．２５ｍｇ〜２５０ｍｇ、好ましくは１．２５ｍｇ〜１２５ｍｇ、更に好ましくは５ｍｇ〜５０ｍｇ投与されるよう設定するのが望ましい。
【０００８】
本発明に用いられる乳酸菌としては、乳酸を産生しうるすべての菌が含まれるが特に、ストレプトコッカス・フェーカリス（Streptococcus faecalis)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)またはラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)が好ましい。より具体的な菌株としては、例えば、ストレプトコッカス・フェーカリスＡＨＵ１２５７株(Streptococcus faecalis AHU1257)、ラクトバチルス・カゼイＡＨＵ１６９６株(Lactobacillus casei AHU1696)またはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株(Lactobacillus plantarum L-137)があげられ、中でもラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株は特に好ましいものである。乳酸菌の菌体は生菌でもよく、また死菌でもよい。菌の処理物としては、例えばその磨砕物、破砕物、それらからの抽出液、その乾燥品、凍結乾燥品などがあげられる。乳酸菌の処理物として、食品を本発明において用いられる菌により発酵させた菌を含む発酵物をそのまま用いてもよいし、発酵物から菌体を採取し、生菌のまま、またはたとえば加熱、紫外線照射などにより不活性化し、ペースト状態あるいは乾燥して用いることもできる。分離した生菌体、死菌体をさらに摩砕、破砕、酸素分解、抽出処理をし、得られた処理物を必要により加熱滅菌、乾燥して用いることもできる。これら乳酸菌またはその処理物の配合量も適宜選択できるが、経口剤の場合、吸収率を考慮して、乾燥菌体として成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜２５０ｍｇ、更に好ましくは２．５ｍｇ〜１００ｍｇ採取されるよう設定するのが望ましい。また、注射剤、輸液剤の場合は成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が乾燥菌体として０．００２ｍｇ〜２５ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１２．５ｍｇ、更に好ましくは０．０５ｍｇ〜５ｍｇ投与されるよう設定するのが望ましい。
【０００９】
３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類としては、例えばニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースなどのニゲロオリゴ糖が挙げられるが、それらの２種以上の混合物であってもよい。
ニゲロオリゴ糖の配合量も適宜選択できるが、経口剤の場合、吸収率を考慮して、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースからなるニゲロオリゴ糖混合物として成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が２ｍｇ〜２０ｇ、好ましくは５ｍｇ〜５ｇ、更に好ましくは２５ｍｇ〜２．５ｇ摂取されるよう設定するのが望ましい。又、注射剤、輸液剤の場合、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースからなるニゲロオリゴ糖混合物として成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が０．２ｍｇ〜２ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、更に好ましくは２．５ｍｇ〜２５０ｍｇ投与されるよう設定するのが望ましい。
【００１０】
本発明における、ビタミンＥと併用する他の免疫賦活剤としては、キノコ菌糸の細胞壁に含まれる植物繊維を酵素的に処理した活性化へミセルロース、サルノコシカケの菌糸体成分であるＰＳＫ、スエヒロタケの菌糸体成分であるＳＰＧ、シイタケの菌糸体成分であるレンチナン、並びにアガリクス、霊芝、ニンギョータケ、カワリハラタケ、マイタケ等の菌糸体成分や、溶連菌の菌体成分であるＯＫ−４３２、乳酸菌またはその処理物、ニゲロオリゴ糖等が挙げられるが、乳酸菌またはその処理物とニゲロオリゴ糖を併用した場合、効果が一段と向上する。
併用する場合のビタミンＥに対する乳酸菌の配合割合（重量比）は、ビタミンＥの１に対し乳酸菌０．０１〜１０、好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜３であり、ビタミンＥに対するニゲロオリゴ糖の配合割合（重量比）は、ビタミンＥの１に対しニゲロオリゴ糖０．１〜１００、好ましくは０．５〜５０、さらに好ましくは１〜３０である。
【００１１】
【実施例】
以下に実施例および試験例をあげて本発明を具体的に示す。
【００１２】
実施例１
清涼飲料水
処方
ニゲロオリゴ糖 １５．０ｇ
α−トコフェロール １．０ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．２ｇ
ビタミンＣ ８．０ｇ
レモン果汁 ９．４ｇ
グラニュー糖 １５．４ｇ
果糖ブドウ糖液糖 ７４．８ｇ
精製ハチミツ ２２．２ｇ
クエン酸 １．５ｇ
レモンフレーバー １．６ｇ
蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１６） ０．１ｇ
蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１） ０．１ｇ
水 全量が１０００ｍｌとなる量
【００１３】
調製法
純水５００ｍｌに、上記処方におけるニゲロオリゴ糖、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥菌体、レモン果汁、グラニュー糖、果糖ブドウ糖液糖、精製ハチミツ 、クエン酸およびレモンフレーバーを加え撹拌後、１０分間超音波処理し懸濁溶解させた。これに、α−トコフェロール、蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１６）および蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１）を純水１００ｍｌに加えホモジナイズした乳化液を加え、さらに純水を加えて１０００ｍｌとした後、６５℃で１０分間殺菌して清涼飲料水を得た。得られた清涼飲料水はニゲロオリゴ糖を１．５％、ビタミンＥ（α−トコフェロール）を０．１％、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体を約０．０２％含有するものである。
【００１４】
実施例２
顆粒剤
処方
α−トコフェロール ６ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 １ｇ
乳糖 ２０４ｇ
結晶セルロース １５ｇ
ブドウ糖 ７１ｇ
【００１５】
調製法
上記処方における各原料粉末を均一に混合し、造粒破砕後、乾燥して顆粒剤とした。
【００１６】
実施例３
錠剤
実施例２で得られた顆粒剤９９ｇにステアリン酸カルシウム１ｇを混合し、打錠機で圧縮整形して１錠当たり９００ｍｇの錠剤を得た。１錠は、ビタミンＥを約１８ｍｇ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を約３ｍｇ含有するものである。
【００１７】
実施例４
カプセル剤
処方
ニゲロオリゴ糖 １００ｍｇ
ビタミンＥ ５ｍｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ３ｍｇ
コーンスターチ ７５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０ｍｇ
調製法
上記処方に示された各原料粉末を均一に混合し、ゼラチンカプセルに充填し、カプセル１個当たり、ニゲロオリゴ糖１００ｍｇ、ビタミンＥ５ｍｇ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体３ｍｇを含有するカプセル剤を得た。
【００１８】
実施例５
クッキー
処方
α−トコフェロール ０．５ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．１ｇ
小麦粉 ９７．９ｇ
グラニュー糖 ５５．０ｇ
ショートニング ５０．０ｇ
脱脂粉乳 ２５．０ｇ
ベーキングパウダー １．５ｇ
水 ２０．０ｇ
調製法
上記処方で原料を混合し、生地を調製し、成型した後、オーブンに入れて１８０℃／１３分間加熱して、クッキーを製造した。
【００１９】
実施例６
乳液
処方
Ａ
α−トコフェロール １．０ｇ
流動パラフィン １０．０ｇ
セタノール ５．０ｇ
ＰＯＥ（３０）セチルエーテル ２．０ｇ
パルミチン酸 １．０ｇ
ブチルパラベン ０．１ｇ
Ｂ
ニゲロオリゴ糖 ５．０ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．１ｇ
１，３−ブタンジオール ５．０ｇ
メチルパラベン ０．３ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．２ｇ
水 ７０．３ｇ
調製法
Ａ、Ｂをそれぞれ８０℃で加熱混合し、ＡにＢを加え粗乳化し、ホモゲナイザーで均一に乳化し冷却して乳液を得た。
【００２０】
実施例７
飼料
α−トコフェロール ２．５ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．５ｇ
大麦圧ペン ２０．０ｋｇ
ふすま ２０．０ｋｇ
とうもろこし圧ペン １７．５ｋｇ
大豆粕 １０．０ｋｇ
大豆皮 １０．０ｋｇ
加熱大豆 ８．０ｋｇ
綿実 ７．０ｋｇ
調整法
上記処方で原料を混合し、粉末状の乳牛用濃厚飼料を製造した。
【００２１】
試験例１
この試験では、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とα−トコフェロールを用いて、マウスの脾臓細胞のインターロイキン１２産生誘導に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とα−トコフェロールの相乗効果を調べた。
マウス（BALB/c、雌、２１週齢）から脾臓を摘出しRPMI 1640培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５．０×１０６／ｍｌの濃度にRPMI 1640培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。
これにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を４００ｎｇ／ｍｌの濃度でRPMI 1640培地に分散させた溶液またはRPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
α−トコフェロール溶液を１６ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらにこれをRPMI 1640培地で希釈し、α−トコフェロール６４μｇ／ｍｌ溶液を得た。６４μｇ／ｍｌα−トコフェロール溶液を、０．４％DMSO-RPMI 1640培地で、４、８あるいは１６μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ１穴当たり５０μｌ加えた。対照には０．４％DMSO-RPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養し、培養後の培養上清のインターロイキン１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。
インターロイキン１２のエンザイムイムノアッセイは、捕捉抗体としてラット抗マウスインターロイキン１２IgG2a抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を用い、捕捉抗体をホウ酸緩衝液で１μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え４℃で３日間放置しラット抗マウスインターロイキン１２IgG2a抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり５０μｌ加え、室温で９０分間放置し、培養上清のインターロイキン１２をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２IgG2a抗体と結合させた。洗浄後、検出抗体のビオチン化抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を加え、プレートに結合させたインターロイキン１２に結合させた。洗浄後ペルオキシダーゼ標識アビジン（ファーミンジェン社製）を加え、プレートに結合させたビオチンに結合させた。洗浄後、過酸化水素０．００６％とオルトフェニレンジアミン０．１％を含有するリン酸緩衝液を１穴当たり１００μｌ加え、室温で４０分間反応させ、反応を１．５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４９２ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン１２で作成した標準曲線から、培養上清中のインターロイキン１２の濃度を求めた。
〔表１〕にその結果を示す。
【００２２】
【表１】
〔表１〕から明らかなごとく、α−トコフェロール単独ではインターロイキン１２の産生を誘導しなかったが、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体で誘導されたインターロイキン１２の産生をα−トコフェロールは有意に上昇させた。これにより、インターロイキン１２産生誘導におけるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とα−トコフェロールの相乗効果が実証された。
【００２３】
試験例２
この試験では、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロオリゴ糖からなる組成物とα−トコフェロールを用いて、マウス脾臓細胞のインターロイキン１２およびインターフェロンγ産生誘導に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロオリゴ糖からなる組成物とα−トコフェロールの相乗効果を調べた。
マウス（BALB/c、雌、２６週齢）から脾臓を摘出し、RPMI 1640培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を１．０×１０７／ｍｌの濃度にRPMI 1640培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり５０μｌを播種した。
これにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を４００ｎｇ／ｍｌの濃度でRPMI 1640培地に分散させた溶液５０μｌとニゲロオリゴ糖を４μｇ／ｍｌ濃度でRPMI 1640培地に溶解した溶液５０μｌを、またはRPMI 1640培地１００μｌを各穴に加えた。
α−トコフェロール溶液を１６ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらにこれをRPMI 1640培地で希釈し、α−トコフェロール６４μｇ／ｍｌ溶液を得た。６４μｇ／ｍｌα−トコフェロール溶液を、０．４％DMSO-RPMI 1640培地で、４μｇ／ｍｌに希釈し、１穴当たり５０μｌ加えた。対照には０．４％DMSO-RPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
３７℃の５％炭酸ガス培養器内で５日間培養し、培養後の培養上清のインターロイキン１２およびインターフェロンγをエンザイムイムノアッセイで測定した。
インターフェロンγのエンザイムイムノアッセイには、捕捉抗体としてハムスター抗マウスインターフェロンγ抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を、検出抗体としてビオチン化抗マウスインターフェロンγ抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を用いた。
〔表２〕にその結果を示す。
【００２４】
【表２】
〔表２〕から明らかなごとく、α−トコフェロール単独ではインターロイキン１２並びにインターフェロンγの産生を誘導しなかったが、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロオリゴ糖からなる組成物で誘導されたインターロイキン１２並びにインターフェロンγの産生をα−トコフェロールは有意に上昇させた。これにより、インターロイキン１２並びにインターフェロンγ産生誘導におけるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロオリゴ糖からなる組成物とα−トコフェロールの相乗効果が実証された。
【００２５】
試験例３
この試験では各種乳酸菌乾燥死菌体とα−トコフェロールを用いて、マウス脾臓細胞のインターロイキン１２およびインターフェロンγ産生誘導に対する各種乳酸菌とα−トコフェロールの相乗効果を調べた。
マウス（BALB/c、雌、２６週齢）から脾臓を摘出し、RPMI 1640培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５．０×１０６／ｍｌの濃度にRPMI 1640培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。
これに各種乳酸菌乾燥死菌体を４００ｎｇ／ｍｌの濃度でRPMI 1640培地に分散させた溶液５０μｌを各穴に加えた。
α−トコフェロール溶液を１６ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらにこれをRPMI 1640培地で希釈し、α−トコフェロール６４μｇ／ｍｌ溶液を得た。６４μｇ／ｍｌα−トコフェロール溶液を、０．４％DMSO-RPMI 1640培地で、１６μｇ／ｍｌに希釈し、１穴当たり５０μｌ加えた。対照には０．４％DMSO-RPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１および４日間培養し、１日間培養後の培養上清のインターロイキン１２および４日間培養後の培養上清のインターフェロンγをエンザイムイムノアッセイで測定した。
〔表３〕にその結果を示す。
【００２６】
【表３】
〔表３〕から明らかなごとく、いずれの各種乳酸菌乾燥死菌体で誘導されたインターロイキン１２並びにインターフェロンγも、α−トコフェロールを共存させることでさらに上昇した。この結果から、インターロイキン１２並びにインターフェロンγ産生誘導における乳酸菌乾燥死菌体とα−トコフェロールの相乗効果が実証された。
【００２７】
【発明の効果】
ビタミンＥに他の免疫賦活剤、特に乳酸菌またはその処理物やニゲロオリゴ糖を配合した本発明の組成物を経口または非経口的にヒトや動物の体内に投与することにより、体内におけるインターロイキン１２やインターフェロンγなどの産生誘導が相乗的に向上し、免疫力が著しく増強される。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ビタミンＥと他の免疫賦活物質、特に乳酸菌またはその処理物やニゲロオリゴ糖を配合した免疫増強組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の免疫系は、細菌、酵母、カビ、ウイルスなどの微生物による感染や、腫瘍に対する防御に重要な役割を果たしており、その防御機構の中心はＴリンパ球である。Ｔリンパ球はこれらの微生物や腫瘍を、抗原受容体を介して認識することにより刺激を受け、抗原特異的に活性化され、これらの異物を排除する能力を高める。常に微生物に曝され、また細胞が変異している生体内では、こうしたＴリンパ球は抗原受容体を介して常に活性化される一方で、抗原受容体以外の経路でも抗原非特異的に活性化されている。抗原特異的および抗原非特異的のいずれの活性化においても、他からの刺激、すなわち共刺激が加わるとＴリンパ球の活性化はさらに促進される。現在用いられている免疫賦活剤は、免疫担当細胞を非特異的に活性化することにより、微生物感染、腫瘍に対する生体の防御機構を高めるものであるが、有効性において満足しうるものは少なく、また、これらの免疫賦活剤は、一般に作用の特異性が低いため、例えば全身性エリテマトーデス、慢性関節リュウマチ等の自己免疫疾患のような副作用が懸念される。
これまで免疫力を増強するといわれる物質は多数報告されている。それらの中の１つに、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類がある。この３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger)の菌糸中に含有されるニゲラン、そのニゲランの部分酸加水分解等によって得られるα−Ｄ−グルコピラノース（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノース（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノース（１→３）−Ｄ−グルコースをはじめとする様々な３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有するオリゴ糖があり、これらは、上記のニゲランの加水分解によっても得ることが可能である。また、ニゲロースと称される３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースなどもある。
本発明者らは、これら３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類が、抗原受容体を介する刺激により活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させ、また、菌体成分またはレクチンを認識する受容体を介する刺激により、抗原非特異的に活性化されたＴリンパ球およびＢリンパ球の活性をさらに上昇させることを見出し、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含む糖類を有効成分として含有する免疫賦活剤の発明をなし、特許出願をした（特開平９−５２８３４号）。
【０００３】
一方、乳酸菌、たとえばラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体が、抗原受容体を介するＴリンパ球の活性化を上昇させることにより、生体内で常時起こっている微生物および腫瘍細胞に対する排除反応を高め、特にインターフェロンγの産生を増強することから、ウイルスや腫瘍に対する防御能を高めることが知られている。さらにこの菌体はインターフェロンγによるＴヘルパー１型機能を上昇させるので、Ｉ型アレルギーの予防や治療に有効である。
【０００４】
またこのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体は、腫瘍細胞傷害性を有するナチュラルキラー細胞を活性化するサイトカインであるインターロイキン−１２のマクロファージからの産生を高める結果、腫瘍に対する防御能を特に高めるとともに、後天性免疫不全症候群（AIDS）の発症予防にも有用である。しかしこの菌体は、腫瘍壊死因子αの産生は軽度にしか上昇させないため、通常のマクロファージの活性化剤により上昇する腫瘍壊死因子αにより引き起こされる、発熱、体重減少などの副作用を誘導しない。
これらの知見を基に、本発明者らは、ラクトバチルス属に属する菌またはその処理物を含む免疫賦活剤の発明を成し遂げ、既に特開平１０−１６７９７２号として特許出願した。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、実質的な副作用がなく、且つ従来のものに比べてさらに強い免疫増強効果を奏する組成物、例えば医薬、食品、飼料、化粧品等を提供することを目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、より強い免疫増強効果を示す組成物を求め、種々の既知物質を併用して、その免疫増強作用を調べていたところ、偶然にもビタミンＥと他の免疫賦活物質、特に乳酸菌またはその処理物や３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類と併用すると予想を超える強い免疫増強効果が発揮されることを知見し、その知見を基にさらに検討を重ね本発明を完成した。
すなわち本発明は
（１）ビタミンＥおよびラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である乳酸菌またはそれらの磨砕物、破砕物、それらからの抽出物またはそれらの乾燥品、ならびにニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースの少なくとも一種類を含んでなるニゲロオリゴ糖を含有してなるＩＬ−１２産生誘導組成物、である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の組成物の形態としては、粉末状、顆粒状、錠剤、液剤などの経口医薬、注射剤、輸液剤などの非経口医薬、ゼリー、飲料などの食品などが含まれ、その他飼料、各種化粧品であってもよい。
本発明の組成物は、担体としては各種キャリアー担体、イクステンダー、希釈剤（水、ミルクなど）、増量剤、分散剤、賦形剤、結合剤、溶媒（水、エタノール、植物油）、溶解補助剤、緩衝剤、溶解促進剤、ゲル化剤（ＣＭＣ−Ｎa、ＨＰＭＣなど）、懸濁化剤（ＣＭＣ−Ｎa、ナトリウムアルギネートなど）等を用い、常法により、油剤、エマルジョン、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、固形剤、チュアブル剤、ドレッシング類、菓子類等の医薬や食品等の形態にすることができ、免疫増強の必要な人に対して経口的に摂取させることができる。また、必要に応じて、可溶化等の公知の技術に従って、非経口投与の形態としてもよく、注射剤とすることもできる。また、公知の賦形剤ないし担体を用い、自体公知の方法に従い、例えば化粧水、乳液、クリーム等の基礎化粧料、ファンデーション、アンダーメークアップ、白粉等のメークアップ料等の化粧料剤形として外用経路で適用することもできる。また、ヒトに限らず、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、ニワトリ等の家禽、ハマチ等の養殖魚、さらにはイヌやネコ等のペット動物の免疫増強に用いることができ、例えば、常法に従い、飼料用の固体ないしは液体の添加剤とすることもできる。
本発明の組成物は、その相乗的に増強された免疫賦活作用から、ウイルス、バクテリア等の微生物による感染症、例えば、経口感染にるコレラ菌、毒素原性大腸菌、赤痢菌、サルモネラ、ウイルス等の感染性腸炎や、気道感染によるインフルエンザ、かぜ症候群や、口腔内感染による口内炎、歯周疾患等、また、各種悪性腫瘍、例えば、消化管や呼吸器粘膜、肝・腎等の実質臓器に発生する上皮性悪性腫瘍や、運動器や軟部組織などに発生する非上皮性悪性腫瘍の予防や治療に有効である。また、本発明の製剤はインターロイキン１２および／またはインターフェロンγ産生誘導作用を有し、Ｔヘルパー機能をＴヘルパー１型に傾けるために、腫瘍により誘導される免疫抑制状態や抗癌剤治療により誘導される免疫機能低下からの回復に適しており、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の発症予防、リステリア菌、サルモネラ菌、結核菌、癩菌等の細胞内寄生性細菌の防除、Ｉ型アレルギーの予防や治療、ストレスに起因するＴヘルパー１型免疫機能低下の改善等に有効であり、加齢に伴う免疫機能低下の抑制等にも適している。また、細胞内寄生性細菌のクラミジア菌に対する感染防御作用により、クラミジア菌感染との関わりが強く示唆されている動脈硬化発症に対しても予防的に働く。したがって、種々の生体機能調節、各種疾患に対する抵抗性の向上、日常の保健強壮の促進に有効である。
本発明において用いられるビタミンＥとしては、天然型ビタミンＥであるｄ体のα−、β−、γ−およびσ−トコフェロールとα−、β−、γ−およびσ−トコトリエノール、その合成体であるｄｌ体のα−、β−、γ−およびσ−トコフェロールとα−、β−、γ−およびσ−トコトリエノール、およびこれらのエステルであるコハク酸ｄ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロール、コハク酸ｄｌ−α−トコフェロールカルシウム、酢酸ｄ−α−トコフェロールおよび酢酸ｄｌ−α−トコフェロール等の１種または２種以上が使用できる。これらビタミンＥの組成物への配合量は、組成物が経口的に摂取される場合、消化管からの吸収率を考慮して、成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量がα−トコフェロールとして０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは２．５ｍｇ〜２５０ｍｇ、さらに好ましくは１０ｍｇ〜１００ｍｇ摂取されるよう設定するのが望ましい。また、注射剤、輸液剤の場合は成人１人１日当りの投与量がα−トコフェロールとして０．２５ｍｇ〜２５０ｍｇ、好ましくは１．２５ｍｇ〜１２５ｍｇ、更に好ましくは５ｍｇ〜５０ｍｇ投与されるよう設定するのが望ましい。
【０００８】
本発明に用いられる乳酸菌としては、乳酸を産生しうるすべての菌が含まれるが特に、ストレプトコッカス・フェーカリス（Streptococcus faecalis)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)またはラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)が好ましい。より具体的な菌株としては、例えば、ストレプトコッカス・フェーカリスＡＨＵ１２５７株(Streptococcus faecalis AHU1257)、ラクトバチルス・カゼイＡＨＵ１６９６株(Lactobacillus casei AHU1696)またはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株(Lactobacillus plantarum L-137)があげられ、中でもラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株は特に好ましいものである。乳酸菌の菌体は生菌でもよく、また死菌でもよい。菌の処理物としては、例えばその磨砕物、破砕物、それらからの抽出液、その乾燥品、凍結乾燥品などがあげられる。乳酸菌の処理物として、食品を本発明において用いられる菌により発酵させた菌を含む発酵物をそのまま用いてもよいし、発酵物から菌体を採取し、生菌のまま、またはたとえば加熱、紫外線照射などにより不活性化し、ペースト状態あるいは乾燥して用いることもできる。分離した生菌体、死菌体をさらに摩砕、破砕、酸素分解、抽出処理をし、得られた処理物を必要により加熱滅菌、乾燥して用いることもできる。これら乳酸菌またはその処理物の配合量も適宜選択できるが、経口剤の場合、吸収率を考慮して、乾燥菌体として成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜２５０ｍｇ、更に好ましくは２．５ｍｇ〜１００ｍｇ採取されるよう設定するのが望ましい。また、注射剤、輸液剤の場合は成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が乾燥菌体として０．００２ｍｇ〜２５ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜１２．５ｍｇ、更に好ましくは０．０５ｍｇ〜５ｍｇ投与されるよう設定するのが望ましい。
【０００９】
３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類としては、例えばニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースなどのニゲロオリゴ糖が挙げられるが、それらの２種以上の混合物であってもよい。
ニゲロオリゴ糖の配合量も適宜選択できるが、経口剤の場合、吸収率を考慮して、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースからなるニゲロオリゴ糖混合物として成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が２ｍｇ〜２０ｇ、好ましくは５ｍｇ〜５ｇ、更に好ましくは２５ｍｇ〜２．５ｇ摂取されるよう設定するのが望ましい。又、注射剤、輸液剤の場合、ニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースからなるニゲロオリゴ糖混合物として成人（体重６０ｋｇ）１人当りの１日量が０．２ｍｇ〜２ｇ、好ましくは０．５ｍｇ〜５００ｍｇ、更に好ましくは２．５ｍｇ〜２５０ｍｇ投与されるよう設定するのが望ましい。
【００１０】
本発明における、ビタミンＥと併用する他の免疫賦活剤としては、キノコ菌糸の細胞壁に含まれる植物繊維を酵素的に処理した活性化へミセルロース、サルノコシカケの菌糸体成分であるＰＳＫ、スエヒロタケの菌糸体成分であるＳＰＧ、シイタケの菌糸体成分であるレンチナン、並びにアガリクス、霊芝、ニンギョータケ、カワリハラタケ、マイタケ等の菌糸体成分や、溶連菌の菌体成分であるＯＫ−４３２、乳酸菌またはその処理物、ニゲロオリゴ糖等が挙げられるが、乳酸菌またはその処理物とニゲロオリゴ糖を併用した場合、効果が一段と向上する。
併用する場合のビタミンＥに対する乳酸菌の配合割合（重量比）は、ビタミンＥの１に対し乳酸菌０．０１〜１０、好ましくは０．０５〜５、さらに好ましくは０．１〜３であり、ビタミンＥに対するニゲロオリゴ糖の配合割合（重量比）は、ビタミンＥの１に対しニゲロオリゴ糖０．１〜１００、好ましくは０．５〜５０、さらに好ましくは１〜３０である。
【００１１】
【実施例】
以下に実施例および試験例をあげて本発明を具体的に示す。
【００１２】
実施例１
清涼飲料水
処方
ニゲロオリゴ糖 １５．０ｇ
α−トコフェロール １．０ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．２ｇ
ビタミンＣ ８．０ｇ
レモン果汁 ９．４ｇ
グラニュー糖 １５．４ｇ
果糖ブドウ糖液糖 ７４．８ｇ
精製ハチミツ ２２．２ｇ
クエン酸 １．５ｇ
レモンフレーバー １．６ｇ
蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１６） ０．１ｇ
蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１） ０．１ｇ
水 全量が１０００ｍｌとなる量
【００１３】
調製法
純水５００ｍｌに、上記処方におけるニゲロオリゴ糖、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥菌体、レモン果汁、グラニュー糖、果糖ブドウ糖液糖、精製ハチミツ 、クエン酸およびレモンフレーバーを加え撹拌後、１０分間超音波処理し懸濁溶解させた。これに、α−トコフェロール、蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１６）および蔗糖脂肪酸エステル（ＨＬＢ１）を純水１００ｍｌに加えホモジナイズした乳化液を加え、さらに純水を加えて１０００ｍｌとした後、６５℃で１０分間殺菌して清涼飲料水を得た。得られた清涼飲料水はニゲロオリゴ糖を１．５％、ビタミンＥ（α−トコフェロール）を０．１％、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体を約０．０２％含有するものである。
【００１４】
実施例２
顆粒剤
処方
α−トコフェロール ６ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 １ｇ
乳糖 ２０４ｇ
結晶セルロース １５ｇ
ブドウ糖 ７１ｇ
【００１５】
調製法
上記処方における各原料粉末を均一に混合し、造粒破砕後、乾燥して顆粒剤とした。
【００１６】
実施例３
錠剤
実施例２で得られた顆粒剤９９ｇにステアリン酸カルシウム１ｇを混合し、打錠機で圧縮整形して１錠当たり９００ｍｇの錠剤を得た。１錠は、ビタミンＥを約１８ｍｇ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体を約３ｍｇ含有するものである。
【００１７】
実施例４
カプセル剤
処方
ニゲロオリゴ糖 １００ｍｇ
ビタミンＥ ５ｍｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ３ｍｇ
コーンスターチ ７５ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １０ｍｇ
調製法
上記処方に示された各原料粉末を均一に混合し、ゼラチンカプセルに充填し、カプセル１個当たり、ニゲロオリゴ糖１００ｍｇ、ビタミンＥ５ｍｇ、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７菌体３ｍｇを含有するカプセル剤を得た。
【００１８】
実施例５
クッキー
処方
α−トコフェロール ０．５ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．１ｇ
小麦粉 ９７．９ｇ
グラニュー糖 ５５．０ｇ
ショートニング ５０．０ｇ
脱脂粉乳 ２５．０ｇ
ベーキングパウダー １．５ｇ
水 ２０．０ｇ
調製法
上記処方で原料を混合し、生地を調製し、成型した後、オーブンに入れて１８０℃／１３分間加熱して、クッキーを製造した。
【００１９】
実施例６
乳液
処方
Ａ
α−トコフェロール １．０ｇ
流動パラフィン １０．０ｇ
セタノール ５．０ｇ
ＰＯＥ（３０）セチルエーテル ２．０ｇ
パルミチン酸 １．０ｇ
ブチルパラベン ０．１ｇ
Ｂ
ニゲロオリゴ糖 ５．０ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．１ｇ
１，３−ブタンジオール ５．０ｇ
メチルパラベン ０．３ｇ
カルボキシビニルポリマー ０．２ｇ
水 ７０．３ｇ
調製法
Ａ、Ｂをそれぞれ８０℃で加熱混合し、ＡにＢを加え粗乳化し、ホモゲナイザーで均一に乳化し冷却して乳液を得た。
【００２０】
実施例７
飼料
α−トコフェロール ２．５ｇ
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体 ０．５ｇ
大麦圧ペン ２０．０ｋｇ
ふすま ２０．０ｋｇ
とうもろこし圧ペン １７．５ｋｇ
大豆粕 １０．０ｋｇ
大豆皮 １０．０ｋｇ
加熱大豆 ８．０ｋｇ
綿実 ７．０ｋｇ
調整法
上記処方で原料を混合し、粉末状の乳牛用濃厚飼料を製造した。
【００２１】
試験例１
この試験では、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とα−トコフェロールを用いて、マウスの脾臓細胞のインターロイキン１２産生誘導に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とα−トコフェロールの相乗効果を調べた。
マウス（BALB/c、雌、２１週齢）から脾臓を摘出しRPMI 1640培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５．０×１０６／ｍｌの濃度にRPMI 1640培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。
これにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を４００ｎｇ／ｍｌの濃度でRPMI 1640培地に分散させた溶液またはRPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
α−トコフェロール溶液を１６ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらにこれをRPMI 1640培地で希釈し、α−トコフェロール６４μｇ／ｍｌ溶液を得た。６４μｇ／ｍｌα−トコフェロール溶液を、０．４％DMSO-RPMI 1640培地で、４、８あるいは１６μｇ／ｍｌに希釈し、それぞれ１穴当たり５０μｌ加えた。対照には０．４％DMSO-RPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養し、培養後の培養上清のインターロイキン１２をエンザイムイムノアッセイで測定した。
インターロイキン１２のエンザイムイムノアッセイは、捕捉抗体としてラット抗マウスインターロイキン１２IgG2a抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を用い、捕捉抗体をホウ酸緩衝液で１μｇ／ｍｌに調製した溶液を、９６穴組織培養プレート１穴当たり１００μｌ加え４℃で３日間放置しラット抗マウスインターロイキン１２IgG2a抗体を各穴に付着させたプレートを用いて行った。培養上清を１穴当たり５０μｌ加え、室温で９０分間放置し、培養上清のインターロイキン１２をプレートに付着したラット抗マウスインターロイキン１２IgG2a抗体と結合させた。洗浄後、検出抗体のビオチン化抗マウスインターロイキン１２抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を加え、プレートに結合させたインターロイキン１２に結合させた。洗浄後ペルオキシダーゼ標識アビジン（ファーミンジェン社製）を加え、プレートに結合させたビオチンに結合させた。洗浄後、過酸化水素０．００６％とオルトフェニレンジアミン０．１％を含有するリン酸緩衝液を１穴当たり１００μｌ加え、室温で４０分間反応させ、反応を１．５Ｎ硫酸で停止し、マイクロプレートリーダーで吸光度４９２ｎｍを測定し、リコンビナントマウスインターロイキン１２で作成した標準曲線から、培養上清中のインターロイキン１２の濃度を求めた。
〔表１〕にその結果を示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
試験例２
この試験では、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロオリゴ糖からなる組成物とα−トコフェロールを用いて、マウス脾臓細胞のインターロイキン１２およびインターフェロンγ産生誘導に対するラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体とニゲロオリゴ糖からなる組成物とα−トコフェロールの相乗効果を調べた。
マウス（BALB/c、雌、２６週齢）から脾臓を摘出し、RPMI 1640培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を１．０×１０７／ｍｌの濃度にRPMI 1640培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり５０μｌを播種した。
これにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を４００ｎｇ／ｍｌの濃度でRPMI 1640培地に分散させた溶液５０μｌとニゲロオリゴ糖を４μｇ／ｍｌ濃度でRPMI 1640培地に溶解した溶液５０μｌを、またはRPMI 1640培地１００μｌを各穴に加えた。
α−トコフェロール溶液を１６ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらにこれをRPMI 1640培地で希釈し、α−トコフェロール６４μｇ／ｍｌ溶液を得た。６４μｇ／ｍｌα−トコフェロール溶液を、０．４％DMSO-RPMI 1640培地で、４μｇ／ｍｌに希釈し、１穴当たり５０μｌ加えた。対照には０．４％DMSO-RPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
３７℃の５％炭酸ガス培養器内で５日間培養し、培養後の培養上清のインターロイキン１２およびインターフェロンγをエンザイムイムノアッセイで測定した。
インターフェロンγのエンザイムイムノアッセイには、捕捉抗体としてハムスター抗マウスインターフェロンγ抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を、検出抗体としてビオチン化抗マウスインターフェロンγ抗体（Ｒ＆Ｄ Systems社製）を用いた。
〔表２〕にその結果を示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】
試験例３
この試験では各種乳酸菌乾燥死菌体とα−トコフェロールを用いて、マウス脾臓細胞のインターロイキン１２およびインターフェロンγ産生誘導に対する各種乳酸菌とα−トコフェロールの相乗効果を調べた。
マウス（BALB/c、雌、２６週齢）から脾臓を摘出し、RPMI 1640培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５．０×１０６／ｍｌの濃度にRPMI 1640培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴当たり１００μｌを播種した。
これに各種乳酸菌乾燥死菌体を４００ｎｇ／ｍｌの濃度でRPMI 1640培地に分散させた溶液５０μｌを各穴に加えた。
α−トコフェロール溶液を１６ｍｇ／ｍｌの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、さらにこれをRPMI 1640培地で希釈し、α−トコフェロール６４μｇ／ｍｌ溶液を得た。６４μｇ／ｍｌα−トコフェロール溶液を、０．４％DMSO-RPMI 1640培地で、１６μｇ／ｍｌに希釈し、１穴当たり５０μｌ加えた。対照には０．４％DMSO-RPMI 1640培地を１穴当たり５０μｌ加えた。
３７℃の５％炭酸ガス培養器内で１および４日間培養し、１日間培養後の培養上清のインターロイキン１２および４日間培養後の培養上清のインターフェロンγをエンザイムイムノアッセイで測定した。
〔表３〕にその結果を示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【発明の効果】
ビタミンＥに他の免疫賦活剤、特に乳酸菌またはその処理物やニゲロオリゴ糖を配合した本発明の組成物を経口または非経口的にヒトや動物の体内に投与することにより、体内におけるインターロイキン１２やインターフェロンγなどの産生誘導が相乗的に向上し、免疫力が著しく増強される。
Claims (1)
- ビタミンＥおよびラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である乳酸菌またはそれらの磨砕物、破砕物、それらからの抽出物またはそれらの乾燥品、ならびにニゲロース、ニゲロシルグルコース、ニゲロシルマルトースの少なくとも一種類を含んでなるニゲロオリゴ糖を含有してなるＩＬ−１２産生誘導組成物。
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