JP4627911B2

JP4627911B2 - Biosensor

Info

Publication number: JP4627911B2
Application number: JP2001088175A
Authority: JP
Inventors: 正次宮崎; 博之徳永; 雅樹藤原; 貴裕中南
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-26
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2021-03-26
Also published as: JP2001343350A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体試料中の特定の成分を分析するバイオセンサに関し、特に、バイオセンサの試薬層を構成する試薬構成に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは、微生物、酵素、抗体等の生物材料の分子認識能力を利用し、生物材料を分子識別素子として応用したセンサである。すなわち、固定化された生物材料が、目的の特定物質を認識したときに起こる反応、微生物の呼吸による酸素の消費、酵素反応、発光などを利用したものである。
【０００３】
バイオセンサの中でも酵素センサの実用化は進んでおり、例えば、グルコース、乳酸、コレステロール、ラクトース、尿素、アミノ酸用の酵素センサは、医療計測や食品工業に利用されている。酵素センサは、検体である試料液に含まれる基質と酵素との反応により生成する電子によって電子受容体を還元し、測定装置がその電子受容体の還元量を電気化学的に計測することにより、検体の定量分析を行う。このようなバイオセンサの一例として、例えば、特願平１１−３２４５１１号で提案されたようなセンサが知られている。
【０００４】
図５は、２電極方式のバイオセンサの分解斜視図の一例である。これは、ポリエチレンテレフタレートのような絶縁性基板５上に、電気伝導性物質からなる測定電極１（作用極とも言う）、対電極２（対極とも言う）が形成されており、これら電極上には試料液中の特定成分と特異的に反応する酵素、及び電子伝達体、親水性高分子を含む試薬層１０が形成されている。
【０００５】
そして、試料液中の特定成分と試薬層１０中の試薬との反応により生じる電流値を前記電極１、２で検出するためのキャビティ１１を形成するため、電極および試薬層上の部分に細長い切り欠け部８を有したスペーサ７と、空気孔９を形成したカバー６とを絶縁基板上に貼りあわせている。
【０００６】
このような構成のバイオセンサにおいて、試料液は、キャビティ１１の入り口（試料液吸引口）から毛細管現象によりキャビティ１１内に供給され、電極１、２と試薬層１０のある位置まで導かれる。そして試料液中の特定成分が試薬層１０の試薬と反応することにより、電流を生じ、生じた電流をバイオセンサのリード３、４を通じて外部の測定装置が読み取ることにより、検体の定量分析が行われる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上述のような試薬構成のバイオセンサにおいて、熱や水分の介在下、特に、温度が３０℃以上で湿度が８０％以上の高温多湿環境下においては、試薬層１０に含まれる酵素蛋白や親水性高分子の一部などと、電子伝達体との還元反応が生じるため、バックグラウンド電流（ノイズ電流）が発生し、経時的にバックグラウンド電流値が上昇することにより、センサ性能が悪化するという問題が顕著に見られる。
【０００８】
また、これを解決するための手段として、アルミシールや樹脂などの成型容器を用いたバイオセンサ保存容器中に、シリカゲルや活性アルミナのような乾燥剤を封入することによって水分を除去し、センサ性能の悪化を防止するように工夫することができるが、このような乾燥剤だけではバイオセンサに含まれる試薬中に残存する分子レベルの水までを完全に除去することは不可能である。
【０００９】
また、上記保存容器においても、長期間にわたり水分の侵入を皆無（ゼロ）にするのは極めて困難であり、電子伝達体と酵素蛋白、親水性高分子の一部との還元反応は、極微量の水分が介在するだけで進行してしまうため、バックグラウンド電流の経時的な上昇を効果的に抑制することは極めて困難であるという問題点があった。
【００１０】
また、酵素や電子伝達体など様々な試薬からなる混合試薬層中にフェリシアン化カリウムなどの無機塩が含まれている場合には、試薬溶液の乾燥過程において試薬層が極めて結晶化しやくなるため、試薬層の表面が粗く不均一な状態になり、センサの基質濃度に対する応答性（直線性、感度）や測定精度などの悪化を招くという問題点があった。
【００１１】
本発明は、前記問題点に鑑みてなされたものであり、水分との接触によるバイオセンサの性能劣化を効率的に防止するとともに、センサの基質濃度に対する応答性（直線性、感度）の高い高精度なバイオセンサを提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明のバイオセンサは、試料溶液中の特定物質の濃度を計測するバイオセンサにおいて、試料溶液に溶解され、試料溶液中の特定物質と特異的に反応するように予め設けられる試薬層中に、その分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩を含むことを特徴とするものである。
【００１３】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記特定物質の濃度を、絶縁性基板上に設けられた少なくとも作用極と対極からなる電極を用いて計測することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記試薬層が、前記電極上、または当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう，形成され、該試薬層が、少なくとも酵素および電子伝達体を含むことを特徴とするものである。
【００１５】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記有機酸が脂肪族カルボン酸、炭素環カルボン酸、複素環カルボン酸、もしくはそれらの置換体あるいは誘導体であることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記カルボン酸が、グルタル酸、アジピン酸、フタル酸、安息香酸のいずれかまたはそれらの組み合わせであることを特徴とするものである。
【００１７】
本発明のバイオセンサは、試料溶液中の特定物質の濃度を計測するバイオセンサにおいて、試料溶液に溶解され、試料溶液中の特定物質と特異的に反応するように予め設けられる試薬層中に、その分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有する有機酸もしくは有機酸塩を含むことを特徴とするものである。
【００１８】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記特定物質の濃度を、絶縁性基板上に設けられた少なくとも作用極と対極からなる電極を用いて計測することを特徴とするものである。
【００１９】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記試薬層が、前記電極上、または当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう，形成され、該試薬層が、少なくとも酵素および電子伝達体を含むことを特徴とするものである。
【００２０】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記有機酸がアミノ酸もしくはそれらの置換体あるいは誘導体であることを特徴とするものである。
【００２１】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記アミノ酸が、グリシン、セリン、プロリン、トレオニン、リシン、タウリンのいずれか、またはそれらの組み合わせであることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明のバイオセンサは、前記バイオセンサにおいて、前記試薬層が、さらに親水性高分子を含むことを特徴とするものである。
【００２３】
【発明の実施の形態】
（実施の形態１）
【００２４】
以下に、本発明の実施の形態１によるバイオセンサについて説明する。なお、以下に説明する本発明の各実施の形態では、試料液中の特定物質と特異的に反応する分子識別素子として酵素を用いる酵素センサを例にとって説明することにする。
【００２５】
図５は、２電極方式のバイオセンサの分解斜視図の一例である。図５において、５は絶縁性の基板であり、この絶縁性の基板５上には、電気伝導性物質からなる測定電極１、対電極２が所定の位置、及び形状をもって形成されている。
なお、好適な上記絶縁性基板５の材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミドなどがある。
【００２６】
また、各電極を構成する電気伝導性物質としては、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどの単体材料、あるいは、カーボンペーストや貴金属ペーストなどの複合材料があげられる。
【００２７】
なお、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどの単体材料、は、スパッタリング蒸着法などで、またカーボンペーストや貴金属ペーストなどの複合材料はスクリーン印刷法などを用いて容易に電気伝導性層を絶縁性基板５に形成することができる。
【００２８】
また、各電極の形成においては、上述したスパッタリング蒸着法やスクリーン印刷法などにより絶縁性基板５の全面、もしくは一部に前記電気伝導性層を形成した後、レーザなどを用いてスリットを設けることにより電極を分割形成することができる。また、あらかじめ電極パターンの形成された印刷版やマスク版を用いたスクリーン印刷法やスパッタリング蒸着法などでも同様に電極を形成することが可能である。
【００２９】
このようにして形成された電極上には、酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩を含む試薬層１０が形成される。
【００３０】
本発明の実施の形態１は、試薬層１０中に分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩を含むことを特徴とするものであり、この分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩は、電極上に形成された試薬層１０中において、酸化型の電子伝達体と、試薬中に含まれる酵素蛋白、及び親水性高分子などに存在する反応性に富んだ一部の官能基などと、が接触して、電子伝達体が酸化型から還元型に変性する（還元される）ことを抑制する働きがある。
【００３１】
そのため、上述の様な試薬構成のバイオセンサにおいて、熱や水分の介在下、特に温度が３０℃以上で湿度が８０％以上の高温多湿環境下において、試薬層１０に含まれる酵素蛋白や親水性高分子の一部などと電子伝達体との還元反応により発生し、経時的に上昇するバックグラウンド電流（ノイズ電流）を抑制することができるため、バイオセンサの性能が悪化することを防ぐことができる。
【００３２】
また、さらには、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩を試薬層中に含むことにより、血液中、特には血球に存在する様々な共雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、直線性の良好な（回帰式の傾きが大きく切片が小さい）、かつ、センサ個々のバラツキの少ない、高性能なバイオセンサを提供することができる。
【００３３】
なお、試薬層１０に含まれる分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩としては、脂肪族カルボン酸、炭素環カルボン酸、複素環カルボン酸等や、それらの塩がある。
例えば、脂肪族カルボン酸としては、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸などやそれらの塩があげられる。
【００３４】
なお、効果の度合いは直鎖が長く分子量の大きいものほど大きく、炭化水素鎖が３つ以上あるものが特に好ましい。また、バイオセンサに用いる試薬としては水に対する溶解性が高いことが求められるため、分子構造中により多くの親水性官能基を持つものがより好ましい。
【００３５】
また、炭素環カルボン酸としては、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸などやそれらの塩があげられ、これらを用いることでも前記と同様の効果を得ることができる。
また、複素環カルボン酸としては、２−フル酸、ニコチン酸、イソニコチン酸などやそれらの塩があげられ、これらを用いることでも前記と同様の効果を得ることができる。
【００３６】
なお、上述の脂肪族ならびに炭素環カルボン酸、複素環を有するカルボン酸もしくはカルボン酸塩以外にも、カルボン酸ならびにカルボン酸塩の一部の官能基が別の官能基に置き換えられた、例えばリンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、ケトグルタル酸などやそれらの塩においても前記と同様の効果を得ることができる。
【００３７】
なお、これらの有機酸もしくは有機酸塩のなかで最も好適なものは、グルタル酸、アジピン酸、フタル酸、安息香酸である。
【００３８】
また、これらの有機酸もしくは有機酸塩の添加量は試薬溶液濃度として、０．０１〜１００ｍＭ範囲が適当であり、より好ましくは０．１〜１０ｍＭである。
【００３９】
なお、図５に示すバイオセンサは、その後、このように形成された試薬層１０及び電極１、２上に、切り欠け部８を有するスペーサ７とカバー６とを貼り合わせることにより、試料液が供給されるキャビティが形成される。
なお、上記スペーサ７およびカバー６の好適な材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ナイロンなどがあげられる。
【００４０】
また、このようなキャビティから構成されたバイオセンサへの試料液供給は毛細管現象により実現されるが、試料液のスムーズな供給を実現するうえでは、キャビティ内にバイオセンサ外部へ空気を逃がすための空気孔９が必要である。
なお、空気孔９の配置は、試料液の供給を妨げない範囲であればキャビティ内のいかなる位置でもよい。
【００４１】
このようにして形成されたバイオセンサにおいて、試料液中の特定成分と、酵素などを含む試薬層１０との反応で得られた電流値は、測定電極１、対電極２のそれぞれのリード部３、４を通じて接続された外部の測定装置により読み取られる。
【００４２】
（実施の形態２）
以下に、本発明の実施の形態２によるバイオセンサについて説明する。
本発明の実施の形態２によるバイオセンサは、図５で示した試薬層１０が、酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有する有機酸もしくは有機酸塩により形成されているものである。なお、他の構成要素は、前述した実施の形態１によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。
【００４３】
本発明の実施の形態２は、試薬層１０に分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有する有機酸もしくは有機酸塩を含むことを特徴とするものであり、この有機酸もしくは有機酸塩を試薬層１０に添加することにより、試薬層１０の表面状態を極めて平滑、且つ均質に形成するができるという効果を得ることができる。
【００４４】
特に、試薬層１０中に電子伝達体として用いられるフェリシアン化カリウムなどの無機塩を含む場合には、試薬溶液の乾燥過程において試薬層が結晶化しやすいが、試薬中に、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有する有機酸もしくは有機酸塩が含まれることにより、当該無機塩の結晶化を阻害することができる。
そして、結晶化を阻害された無機塩は、微少な粒子状態で試薬層中に存在するため、酵素分子と密に、均一に接触することが可能となり、酵素分子との電子伝達効率が良好な試薬層状態が実現できる。
【００４５】
また、試薬層の溶解性を高めることができるため、センサの感度ならびに直線性を飛躍的に高めることが可能となる。
なお、試薬層１０に含まれる，分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有する有機酸もしくは有機酸塩としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンなどやそれらの塩、あるいはサルコシン、ベタイン、タウリンなどの有機酸もしくは有機酸塩があげられる。
【００４６】
また、これらの有機酸もしくは有機酸塩の置換体あるいは誘導体であっても同様の効果を得ることができる。
また、これらの有機酸もしくは有機酸塩の中でも、グリシン、セリン、プロリン、トレオニン、リシン、タウリンは特に結晶化阻害の効果が高く好適である。
なお、これらの有機酸ならびに有機酸塩の添加量は試薬溶液濃度として０．１〜１０００ｍＭが適当であり、より好ましくは１０〜５００ｍＭである。
【００４７】
なお、本発明の実施の形態１、２では、上記試薬層１０中に、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有する有機酸もしくは有機酸塩をそれぞれ添加した例を説明したが、さらにはそれらを組み合わせることも可能である。
【００４８】
また、上記実施の形態１、２の試薬中に含まれる酵素としては、グルコースオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ウリカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼなどを、電子伝達体としてはフェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセンおよびその誘導体などを用いることができる。
【００４９】
また、本発明の実施の形態１、２では、試薬層１０中に親水性高分子を含むものについて説明したが、このように、試薬層１０中に親水性高分子を含むことにより、試薬溶液に粘性を持たせ、電極への試薬形成を容易に均質にするとともに、電極と試薬との密着性を高める効果も得られる。さらに、試薬乾燥後の試薬結晶状態も、親水性高分子を含むことでムラなく均質となり、高精度なバイオセンサを作製することが可能になる。
【００５０】
以上のような目的で使用する親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸およびその塩、メタクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩、アガロースゲルおよびその誘導体などがあげられる。
【００５１】
また、本発明の実施の形態１、２では、前述した試薬層１０が、電極上に設けられるものとして説明をしたが、具体的には、電極上の全面もしくは一部に試薬層１０を配置することができ、また、それ以外にも、バイオセンサの性能を悪化させることのない範囲内、すなわち、試薬層中の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が設けられるよう，試薬層１０を配置してもよい。
【００５２】
【実施例】
（実施例１）
ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁基板上に、スクリーン印刷により作用極と対極とからなる電極層を設け、その上に酵素（グルコースオキシダーゼ）、電子伝達体（フェリシアン化カリウム）、親水性高分子（カルボキシメチルセルロース）、および脂肪族カルボン酸（濃度は試薬溶液として５ｍＭ）を含んだ試薬層を形成したのち、ポリエチレンテレフタレートからなるスペーサと、同じくポリエチレンテレフタレートからなるカバーとの貼り合わせにより、血液が導かれる毛細管となるキャビティが形成された２電極方式の血糖値測定センサを作製した。
【００５３】
なお、ここでは、有機酸として脂肪族カルボン酸であるマロン酸（ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）、グルタル酸（ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）、アジピン酸（ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）の３種類、および脂肪族カルボン酸を含まない従来仕様の計４種類の２電極方式のセンサを作製した。
【００５４】
図１はこのようにして作製した４種類のセンサを用いて過酷環境下（温度４０℃、湿度８０％）でのバックグラウンド電流を測定したものであり、試料液としてはグルコースを含まない精製水を用いた。測定時期はセンサ作製直後（０日目）、７日後、１４日後、３０日後の計４ポイントである。電流測定条件は試料液（精製水）がキャビティ内に充填された後、２５秒間反応を促進し、その後作用極と対極間に０．５Ｖの電圧を印加し、その５秒後に得られた電流値を測定した。
【００５５】
また、測定回数ｎは各測定ポイントごとにｎ＝１０であり、第１図中にはその平均値をプロットしてある。
図１から明らかなように、バックグラウンド電流の上昇は脂肪族カルボン酸を添加したセンサで確実に抑制されており、また、その上昇率はマロン酸、グルタル酸、アジピン酸の順に小さくなっており、分子構造が複雑で、直鎖が長く、分子量の大きいもの程、バックグラウンド電流の上昇を抑制する効果が大きいことが示唆された。なお、ここで得られた電流値は、グルコースオキシダーゼとフェリシアン化カリウム、並びにカルボキシメチルセルロースとフェリシアン化カリウムが反応して生じたフェロシアン化カリウム量に相当する。
【００５６】
（実施例２）
実施例１と同様な手順によりバイオセンサを作製し実施例１と同様な評価を実施した。なお、ここでは有機酸として炭素環カルボン酸である安息香酸とフタル酸、およびコハク酸の炭化水素鎖の一部が水酸基に置き換わった構造をもつリンゴ酸（コハク酸の誘導体）の３種類を用いた。
図２から明らかなように、安息香酸、フタル酸、リンゴ酸の何れの有機酸を用いても、実施例１同様にバックグラウンド電流の上昇を抑制する効果が確認された。
【００５７】
（実施例３）
ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁基板上に、スクリーン印刷により作用極と対極とからなる電極層を設け、その上に酵素（ピロロキノリンキノンを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼ）、電子伝達体（フェリシアン化カリウム）、親水性高分子（カルボキシメチルセルロース）、脂肪族カルボン酸（フタル酸）およびアミノ酸を含んだ試薬層を形成したのち、ポリエチレンテレフタレートからなるスペーサと、同じくポリエチレンテレフタレートからなるカバーとの貼り合わせにより、血液が導かれる毛細管となるキャビティが形成された２電極方式の血糖値測定センサを作製した。
【００５８】
なお、ここでは、有機酸として分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有するアミノ酸であるグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、リシン（Ｌｙｓ）、サルコシン（グリシンの誘導体）、タウリン、およびアミノ酸を含まない従来仕様の計８種類のセンサを作製した。
【００５９】
図３および図４はこのようにして作製した８種類のセンサを用いて、人全血中のグルコースを測定した際のセンサ応答特性を示すものである。なお、ここでは全血中のグルコース濃度が４０、８０、３５０、６００、７００ｍｇ／ｄｌのものを用いた。
【００６０】
電流測定条件は試料液（人全血）がキャビティ内に充填された後、２５秒間反応を促進し、その後作用極と対極間に０．５Ｖの電圧を印加し、その５秒後に得られた電流値を測定した。
【００６１】
また、測定回数ｎは各濃度ごとにｎ＝２０であり、図中にはその平均値をプロットしてある。
【００６２】
図３、図４から明らかなように、アミノ酸の種類にて若干応答値に差異はあるものの、アミノ酸を含まない従来仕様と比較して、特にグルコース濃度が４８０mg/dl以上の高濃度域において飛躍的な応答値ならびに直線性の向上が認められる。
【００６３】
また、表１は、前述のｎ＝２０測定時のセンサ応答値のバラツキをＣＶ値で比較したものである。表１から明らかなように、アミノ酸を添加した本発明のセンサにおいては大幅なＣＶ値の良化が認められる。これは、アミノ酸を試薬層中に添加することでフェリシアン化カリウムの結晶化を防ぎ、試薬層を平滑且つ均質に形成することができたため、試薬の溶解性や拡散が均質になり応答バラツキが軽減されたものと推測される。
【００６４】
【表１】

なお、前記実施例１から３は血液中のグルコース濃度を測定するバイオセンサについて示したが、測定対象とする試料液、物質、およびバイオセンサの形式はこれに限定されるものではなく、例えば、対象試料液としては血液以外にも生体試料液として唾液、細胞間質液、尿や汗などを、また、食品や飲料水などをも用いることができる。また、対象物質としては、グルコース以外にも乳酸、コレステロール、尿酸、アスコルビン酸、ビリルビンなどを用いることができる。また、前記実施例１から３においては、電流測定方式として、図５で示した、測定電極１、対電極２からなる２電極方式を用いたが、その他、測定電極、対電極、及び検知電極からなる３電極方式などがあり、何れの方式を用いてもよい。なお、３電極方式の方が２電極方式より正確な測定が可能である。
【００６５】
また、本実施例では、バイオセンサとして酵素センサを例に挙げて説明したが、本発明は、試料液中の特定物質と特異的に反応する分子識別素子として酵素以外に抗体、微生物、ＤＮＡ、ＲＮＡなどをも利用するバイオセンサにも、同様に適応することができる。
【００６６】
【発明の効果】
以上のように、本発明のバイオセンサによれば、絶縁性基板上に設けられた少なくとも測定電極と対電極からなる電極を用い、試料液中の測定対象物質と、上記電極上、またはその近傍に形成された少なくとも酵素、及び電子伝達体からなる試薬層との反応により得られる電流値から、該測定対象物質の含有量を計測するバイオセンサにおいて、上記試薬層中に脂肪族カルボン酸、炭素環カルボン酸、複素環カルボン酸などの有機酸あるいは有機酸塩を含むものとしたので、試薬中に脂肪族カルボン酸、炭素環カルボン酸、複素環カルボン酸などの有機酸あるいは有機酸塩を添加するという簡易な手法を用いることで酵素反応等を阻害することなく、経時的なバックグラウンド電流の上昇を抑制することができ、さらには、血液中に存在する様々な共雑物質との不必要な反応も併せて抑制できるため、直線性の良好な、センサ個々のバラツキが少ない高性能なバイオセンサを提供することができるという効果が得られる。
【００６７】
また、本発明のバイオセンサによれば、絶縁性基板上に設けられた少なくとも測定電極と対電極からなる電極を用い、試料液中の測定対象物質と、上記電極上、またはその近傍に形成された少なくとも酵素、及び電子伝達体からなる試薬層との反応により得られる電流値から、該測定対象物質の含有量を計測するバイオセンサにおいて、上記試薬層中に分子内に少なくとも一つのカルボキシル基とアミノ基を有するアミノ酸などの有機酸もしくは有機酸塩を含むものとしたので、試薬中にアミノ酸などの有機酸や有機酸塩を添加するという簡易な手法を用いることで、センサの基質濃度に対する応答性（感度、直線性）を飛躍的に高め、センサの性能を向上させる効果が得られる。
【００６８】
また、本発明のバイオセンサによれば、上記試薬層に親水性高分子を含むものとしたので、親水性高分子を含むことで電極面への均質な試薬形成を容易にし、試薬層内において各々の物質が均質な分散状態になることを促進することができる。また、均質な試薬形成を実現できることにより、センサ個々のバラツキが少ない高性能なバイオセンサを提供することができるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１において、試料液として精製水を用いた場合の過酷環境下でのバックグラウンド電流の上昇を示す図である。
【図２】実施例２において、試料液として精製水を用いた場合の過酷環境下でのバックグラウンド電流の上昇を示す図である。
【図３】実施例３において、試料液として全血を用いた場合の全血応答値を示す図である。
【図４】実施例３において、試料液として全血を用いた場合の全血応答値を示す図である。
【図５】２電極方式のバイオセンサの分解斜視図の一例である。
【符号の説明】
１作用極
２対極
３、４リード
５絶縁基板
６カバー
７スペーサー
８切り欠け部
９空気孔
１０試薬層
１１キャビティ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a biosensor that analyzes a specific component in a liquid sample, and particularly to a reagent configuration that constitutes a reagent layer of the biosensor.
[0002]
[Prior art]
A biosensor is a sensor that utilizes the molecular recognition ability of biological materials such as microorganisms, enzymes, and antibodies, and applies the biological material as a molecular identification element. That is, the immobilized biological material utilizes a reaction that occurs when a specific target substance is recognized, oxygen consumption due to respiration of microorganisms, an enzymatic reaction, luminescence, and the like.
[0003]
Among biosensors, enzyme sensors are being put to practical use. For example, enzyme sensors for glucose, lactic acid, cholesterol, lactose, urea, and amino acids are used in medical measurement and the food industry. The enzyme sensor reduces the electron acceptor by electrons generated by the reaction between the substrate and the enzyme contained in the sample liquid that is the specimen, and the measurement device electrochemically measures the reduction amount of the electron acceptor, Perform quantitative analysis of specimens. As an example of such a biosensor, for example, a sensor as proposed in Japanese Patent Application No. 11-324511 is known.
[0004]
FIG. 5 is an example of an exploded perspective view of a two-electrode biosensor. This is because a measurement electrode 1 (also referred to as a working electrode) and a counter electrode 2 (also referred to as a counter electrode) made of an electrically conductive substance are formed on an insulating substrate 5 such as polyethylene terephthalate. A reagent layer 10 containing an enzyme that specifically reacts with a specific component in the sample solution, an electron carrier, and a hydrophilic polymer is formed.
[0005]
Then, in order to form the cavity 11 for detecting the current value generated by the reaction between the specific component in the sample solution and the reagent in the reagent layer 10 with the

electrodes

1 and 2, a slit is formed in the electrode and on the reagent layer. The spacer 7 having the notch 8 and the cover 6 in which the air holes 9 are formed are bonded on the insulating substrate.
[0006]
In the biosensor having such a configuration, the sample liquid is supplied into the cavity 11 by capillary action from the inlet (sample liquid suction port) of the cavity 11 and guided to a position where the

electrodes

1 and 2 and the reagent layer 10 are located. A specific component in the sample solution reacts with the reagent in the reagent layer 10 to generate an electric current. The generated electric current is read by the external measuring device through the biosensor leads 3 and 4 to perform quantitative analysis of the specimen. Is called.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the biosensor having the reagent configuration as described above, in the presence of heat or moisture, particularly in a high-temperature and high-humidity environment where the temperature is 30 ° C. or higher and the humidity is 80% or higher, Since a reduction reaction between a part of the hydrophilic polymer and the electron carrier occurs, a background current (noise current) is generated, and the background current value increases with time, thereby deteriorating the sensor performance. The problem is noticeable.
[0008]
In addition, as a means to solve this, moisture is removed by encapsulating a desiccant such as silica gel or activated alumina in a biosensor storage container using a molded container such as an aluminum seal or resin, and sensor performance Although it is possible to devise so as to prevent the deterioration of the water, it is impossible to completely remove even the water at the molecular level remaining in the reagent contained in the biosensor with such a desiccant alone.
[0009]
Also, in the above storage container, it is extremely difficult to eliminate moisture (zero) over a long period of time, and the reduction reaction between the electron carrier, the enzyme protein, and a part of the hydrophilic polymer is extremely small. However, there is a problem that it is extremely difficult to effectively suppress the increase of the background current over time.
[0010]
In addition, if the mixed reagent layer consisting of various reagents such as enzymes and electron carriers contains an inorganic salt such as potassium ferricyanide, the reagent layer is very easy to crystallize during the drying process of the reagent solution. There is a problem that the surface of the layer becomes rough and non-uniform, and the response (linearity, sensitivity) to the substrate concentration of the sensor and the measurement accuracy are deteriorated.
[0011]
The present invention has been made in view of the above problems, and efficiently prevents performance degradation of the biosensor due to contact with moisture, and has high responsiveness (linearity, sensitivity) to the substrate concentration of the sensor. An object is to provide an accurate biosensor.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve the above problems, Ba biosensor of the present invention, in the biosensor for measuring the concentration of a specific substance in a sample solution, is dissolved in a sample solution, to specifically react with a specific substance in the sample solution The reagent layer provided in advance contains an organic acid or an organic acid salt having at least one carboxyl group in the molecule.
[0013]
Bas biosensor of the present invention, the biosensor, the concentration of the specific substance, and is characterized in that measured using an electrode made of at least a working electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate.
[0014]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor, the reagent layer, on the electrode, or as a reagent of the reagent layer is the electrode is disposed in a diffusion area for diffusing dissolved in a sample solution, formed, The reagent layer contains at least an enzyme and an electron carrier.
[0015]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor, wherein the organic acid is characterized in that an aliphatic carboxylic acid, carbocyclic carboxylic acids, heterocyclic carboxylic acids or substitution products or derivatives thereof.
[0016]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor, the carboxylic acid is characterized in that glutaric acid, adipic acid, phthalic acid, or a combination thereof benzoate.
[0017]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor for measuring the concentration of a specific substance in a sample solution, is dissolved in the sample solution, the reagent layer which is previously formed to specifically react with a particular substance in a sample solution, It contains an organic acid or organic acid salt having at least one carboxyl group and amino group in the molecule.
[0018]
Bas biosensor of the present invention, the biosensor, the concentration of the specific substance, and is characterized in that measured using an electrode made of at least a working electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate.
[0019]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor, the reagent layer, on the electrode, or as a reagent of the reagent layer is the electrode is disposed in a diffusion area for diffusing dissolved in a sample solution, formed, The reagent layer contains at least an enzyme and an electron carrier.
[0020]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor, and is characterized in that the organic acid is an amino acid or substitution products or derivatives thereof.
[0021]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor, wherein the amino acid is intended to glycine, serine, proline, threonine, lysine, characterized in that either taurine, or a combination thereof.
[0022]
Bas biosensor of the present invention, in the biosensor, the reagent layer, in which further comprising a hydrophilic polymer.
[0023]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Embodiment 1)
[0024]
The biosensor according to Embodiment 1 of the present invention will be described below. In each embodiment of the present invention described below, an enzyme sensor using an enzyme as a molecular identification element that specifically reacts with a specific substance in a sample solution will be described as an example.
[0025]
FIG. 5 is an example of an exploded perspective view of a two-electrode biosensor. In FIG. 5, reference numeral 5 denotes an insulating substrate. On this insulating substrate 5, a measurement electrode 1 and a counter electrode 2 made of an electrically conductive material are formed with predetermined positions and shapes.
Suitable materials for the insulating substrate 5 include polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, and the like.
[0026]
Examples of the electrically conductive substance constituting each electrode include noble metals such as gold, platinum and palladium, and simple materials such as carbon, or composite materials such as carbon paste and noble metal paste.
[0027]
In addition, simple materials such as gold, platinum, palladium, and other precious metals and carbon are easily deposited by sputtering, and composite materials such as carbon paste and precious metal paste can be easily formed by screen printing. It can be formed on the insulating substrate 5.
[0028]
In forming each electrode, after forming the electrically conductive layer on the entire surface or a part of the insulating substrate 5 by the above-described sputtering vapor deposition method or screen printing method, a slit is provided using a laser or the like. Thus, the electrodes can be divided and formed. Further, the electrodes can be similarly formed by a screen printing method or a sputtering deposition method using a printing plate or a mask plate on which an electrode pattern is formed in advance.
[0029]
On the electrode thus formed, a reagent layer 10 containing an enzyme, an electron carrier, a hydrophilic polymer, and an organic acid or an organic acid salt having at least one carboxyl group in the molecule is formed.
[0030]
Embodiment 1 of the present invention is characterized in that the reagent layer 10 contains an organic acid or organic acid salt having at least one carboxyl group in the molecule, and at least one carboxyl group in the molecule. In the reagent layer 10 formed on the electrode, the organic acid or the organic acid salt having a reactive property exists in the oxidized electron carrier, the enzyme protein contained in the reagent, the hydrophilic polymer, and the like. It functions to prevent the electron carrier from being denatured (reduced) from an oxidized form to a reduced form by contact with a part of the rich functional group or the like.
[0031]
Therefore, in the biosensor having the reagent configuration as described above, the enzyme protein and hydrophilicity contained in the reagent layer 10 are present under the presence of heat and moisture, particularly in a high temperature and high humidity environment where the temperature is 30 ° C. or higher and the humidity is 80% or higher. The background current (noise current) that occurs due to the reduction reaction between a part of the polymer and the electron carrier and can be suppressed over time can prevent the performance of the biosensor from deteriorating. it can.
[0032]
In addition, by including an organic acid or an organic acid salt having at least one carboxyl group in the molecule in the reagent layer, unnecessary reaction with various coexisting substances present in blood, particularly blood cells, is possible. Therefore, it is possible to provide a high-performance biosensor with good linearity (the slope of the regression equation is large and the intercept is small) and the variation of each sensor is small.
[0033]
Examples of the organic acid or organic acid salt having at least one carboxyl group in the molecule contained in the reagent layer 10 include aliphatic carboxylic acid, carbocyclic carboxylic acid, heterocyclic carboxylic acid, and salts thereof.
For example, examples of the aliphatic carboxylic acid include malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, maleic acid, fumaric acid, and salts thereof.
[0034]
The degree of the effect is larger as the straight chain is longer and the molecular weight is larger, and those having three or more hydrocarbon chains are particularly preferable. Moreover, since it is calculated | required that the solubility to water is high as a reagent used for a biosensor, what has more hydrophilic functional groups in a molecular structure is more preferable.
[0035]
In addition, examples of the carbocyclic carboxylic acid include benzoic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, and the like, and salts thereof. By using these, the same effect as described above can be obtained.
In addition, examples of the heterocyclic carboxylic acid include 2-furic acid, nicotinic acid, isonicotinic acid, and salts thereof, and the same effect as described above can be obtained by using these.
[0036]
In addition to the above-mentioned aliphatic and carbocyclic carboxylic acids, carboxylic acids or carboxylates having a heterocyclic ring, some functional groups of carboxylic acids and carboxylates are replaced with other functional groups, for example apple The same effects as described above can also be obtained with acids, oxaloacetic acid, citric acid, ketoglutaric acid and the like and salts thereof.
[0037]
Among these organic acids or organic acid salts, most preferred are glutaric acid, adipic acid, phthalic acid, and benzoic acid.
[0038]
Moreover, the addition amount of these organic acid or organic acid salt is 0.01-100 mM as a reagent solution concentration, More preferably, it is 0.1-10 mM.
[0039]
In the biosensor shown in FIG. 5, the sample liquid is then bonded by bonding the spacer 7 having the notch 8 and the cover 6 on the reagent layer 10 and the

electrodes

1 and 2 thus formed. A cavity to be supplied is formed.
Suitable materials for the spacer 7 and the cover 6 include polyethylene terephthalate, polycarbonate, polyimide, polybutylene terephthalate, polyamide, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, nylon and the like.
[0040]
In addition, sample liquid supply to a biosensor composed of such cavities is realized by capillary action, but in order to achieve a smooth supply of sample liquid, it is necessary to allow air to escape outside the biosensor in the cavity. Air holes 9 are required.
The air holes 9 may be arranged at any position within the cavity as long as the supply of the sample liquid is not hindered.
[0041]
In the biosensor formed in this way, the current value obtained by the reaction between the specific component in the sample solution and the reagent layer 10 containing an enzyme or the like is the lead value 3 of each of the measurement electrode 1 and the counter electrode 2. 4 is read by an external measuring device connected through 4.
[0042]
(Embodiment 2)
Hereinafter, a biosensor according to the second embodiment of the present invention will be described.
In the biosensor according to Embodiment 2 of the present invention, the reagent layer 10 shown in FIG. 5 includes an enzyme, an electron carrier, a hydrophilic polymer, and an organic acid having at least one carboxyl group and amino group in the molecule or It is formed with an organic acid salt. The other constituent elements are the same as those of the biosensor according to the first embodiment described above, and the description thereof is omitted.
[0043]
Embodiment 2 of the present invention is characterized in that the reagent layer 10 contains an organic acid or organic acid salt having at least one carboxyl group and amino group in the molecule. the by adding to the

reagent

layer 10, the surface state of the reagent layer 10 very smooth, it is possible to obtain an effect that it will be and homogeneously formed.
[0044]
In particular, when the reagent layer 10 contains an inorganic salt such as potassium ferricyanide used as an electron carrier, the reagent layer tends to crystallize during the drying process of the reagent solution, but at least one carboxyl in the molecule is present in the reagent. By including an organic acid or organic acid salt having a group and an amino group, crystallization of the inorganic salt can be inhibited.
And since the inorganic salt whose crystallization is inhibited is present in the reagent layer in a minute particle state, it can be in close contact with the enzyme molecule in a uniform manner, and the electron transfer efficiency with the enzyme molecule is good. A reagent layer state can be realized.
[0045]
Further, since the solubility of the reagent layer can be increased, the sensitivity and linearity of the sensor can be dramatically increased.
The organic acid or organic acid salt having at least one carboxyl group and amino group in the molecule contained in the reagent layer 10 includes glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, methionine, asparagine, and glutamine. , Arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tryptophan, proline, etc. and their salts, or organic acids or organic acid salts such as sarcosine, betaine, taurine.
[0046]
The same effect can be obtained even if these organic acids or organic acid salt substitutes or derivatives are used.
Among these organic acids or organic acid salts, glycine, serine, proline, threonine, lysine and taurine are particularly preferable because of their high crystallization inhibitory effects.
In addition, 0.1-1000 mM is suitable for the addition amount of these organic acids and organic acid salt as a reagent solution density | concentration, More preferably, it is 10-500 mM.
[0047]
In

Embodiments

1 and 2 of the present invention, the reagent layer 10 has an organic acid or organic acid salt having at least one carboxyl group in the molecule, and at least one carboxyl group and amino group in the molecule. Although the example which added the organic acid or the organic acid salt was demonstrated, respectively, Furthermore, it is also possible to combine them.
[0048]
Examples of the enzyme contained in the reagents of the first and second embodiments include glucose oxidase, lactate oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase, uricase, ascorbate oxidase, bilirubin oxidase, glucose dehydrogenase, lactate dehydrogenase, and the like. As the body, potassium ferricyanide, p-benzoquinone and derivatives thereof, phenazine methosulfate, methylene blue, ferrocene and derivatives thereof can be used.
[0049]
In the first and second embodiments of the present invention, the reagent layer 10 containing a hydrophilic polymer has been described. However, the reagent layer 10 contains a hydrophilic polymer so that a reagent solution can be obtained. In addition, it is possible to obtain an effect that makes the formation of the reagent on the electrode uniform and makes the formation of the reagent on the electrode easy, and improves the adhesion between the electrode and the reagent. Furthermore, the reagent crystal state after the reagent is dried also becomes uniform by including a hydrophilic polymer, and a highly accurate biosensor can be manufactured.
[0050]
Examples of the hydrophilic polymer used for the purpose as described above include carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, ethylhydroxyethylcellulose, carboxymethylethylcellulose, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polylysine and the like. Polystyrene sulfonic acid, gelatin and derivatives thereof, acrylic acid and salts thereof, methacrylic acid and salts thereof, starch and derivatives thereof, maleic anhydride and salts thereof, agarose gel and derivatives thereof, and the like.
[0051]
In the first and second embodiments of the present invention, the above-described reagent layer 10 is described as being provided on the electrode. Specifically, the reagent layer 10 is disposed on the entire surface or a part of the electrode. In addition, the electrodes may be provided in a range where the performance of the biosensor is not deteriorated, that is, in a diffusion area where the reagent in the reagent layer is dissolved and diffused in the sample solution. The reagent layer 10 may be disposed.
[0052]
【Example】
Example 1
On an insulating substrate made of polyethylene terephthalate, an electrode layer consisting of a working electrode and a counter electrode is provided by screen printing, on which an enzyme (glucose oxidase), an electron carrier (potassium ferricyanide), a hydrophilic polymer (carboxymethylcellulose), And a cavity that becomes a capillary tube through which blood is guided by bonding a spacer made of polyethylene terephthalate and a cover made of polyethylene terephthalate after forming a reagent layer containing aliphatic carboxylic acid (concentration is 5 mM as a reagent solution) A two-electrode blood glucose level measurement sensor having a shape of
[0053]
Note that here, as an organic acid, an aliphatic carboxylic acid such as malonic acid (HOOC—CH ₂ —COOH), glutaric acid (HOOC—CH ₂ —CH ₂ —CH ₂ —COOH), adipic acid (HOOC—CH ₂ —) A total of four types of two-electrode type sensors having three types (CH ₂ —CH ₂ —CH ₂ —COOH) and conventional specifications not containing an aliphatic carboxylic acid were prepared.
[0054]
FIG. 1 shows the measurement of background current in a harsh environment (temperature of 40 ° C. and humidity of 80%) using the four types of sensors produced in this manner, and the sample solution is purified water not containing glucose. Was used. The measurement time is 4 points in total immediately after sensor production (day 0), 7 days, 14 days, and 30 days. Current measurement conditions were that the sample solution (purified water) was filled in the cavity, then the reaction was promoted for 25 seconds, and then a voltage of 0.5 V was applied between the working electrode and the counter electrode, and the current obtained 5 seconds later. The value was measured.
[0055]
The measurement number n is n = 10 for each measurement point, during the first drawing is plotted the average value.
As is clear from FIG. 1, the increase in the background current is reliably suppressed by the sensor to which the aliphatic carboxylic acid is added, and the increasing rate decreases in the order of malonic acid, glutaric acid, and adipic acid. These results suggest that the more complex the molecular structure, the longer the straight chain, and the larger the molecular weight, the greater the effect of suppressing the increase in background current. The current value obtained here corresponds to the amount of potassium ferrocyanide produced by the reaction of glucose oxidase and potassium ferricyanide, and carboxymethylcellulose and potassium ferricyanide.
[0056]
(Example 2)
A biosensor was prepared by the same procedure as in Example 1, and the same evaluation as in Example 1 was performed. In this case, benzoic acid and phthalic acid, which are carbocyclic carboxylic acids, and malic acid (succinic acid derivative) having a structure in which a part of the hydrocarbon chain of succinic acid is replaced with a hydroxyl group are used as organic acids. It was.
As is apparent from FIG. 2, the effect of suppressing the increase in background current was confirmed in the same manner as in Example 1 using any organic acid such as benzoic acid, phthalic acid, and malic acid.
[0057]
(Example 3)
An electrode layer composed of a working electrode and a counter electrode is provided on an insulating substrate made of polyethylene terephthalate by screen printing, on which an enzyme (glucose dehydrogenase using pyrroloquinoline quinone as a coenzyme), an electron carrier (potassium ferricyanide), hydrophilic After forming a reagent layer containing a functional polymer (carboxymethylcellulose), aliphatic carboxylic acid (phthalic acid) and amino acids, blood is introduced by bonding a spacer made of polyethylene terephthalate and a cover made of polyethylene terephthalate. A two-electrode blood glucose level measurement sensor having a cavity to be a capillary to be formed was produced.
[0058]
Here, glycine (Gly), serine (Ser), proline (Pro), threonine (Thr), lysine (Lys), sarcosine, which are amino acids having at least one carboxyl group and amino group in the molecule as organic acids. A total of eight types of sensors of conventional specifications not containing (glycine derivative), taurine, and amino acids were prepared.
[0059]
FIG. 3 and FIG. 4 show sensor response characteristics when measuring glucose in human whole blood using the eight types of sensors thus prepared. In addition, here, glucose concentrations in whole blood were 40, 80, 350, 600, 700 mg / dl.
[0060]
Current measurement conditions were obtained 5 seconds after the sample solution (whole human blood) was filled in the cavity and the reaction was accelerated for 25 seconds, and then a voltage of 0.5 V was applied between the working electrode and the counter electrode. The current value was measured.
[0061]
The number of measurements n is n = 20 for each concentration, and the average value is plotted in the figure.
[0062]
As is clear from FIG. 3 and FIG. 4, although there is a slight difference in the response value depending on the type of amino acid, it jumps especially in the high concentration range where the glucose concentration is 480 mg / dl or more compared to the conventional specification that does not contain amino acids. Response value and improvement in linearity are recognized.
[0063]
Table 1 compares the variation in sensor response values at the time of the above-mentioned n = 20 measurement in terms of CV values. As apparent from Table 1, in the sensor of the present invention to which an amino acid was added, a significant improvement in CV value was observed. This is because the addition of an amino acid to the reagent layer prevented crystallization of potassium ferricyanide, and the reagent layer could be formed smoothly and uniformly, so that the solubility and diffusion of the reagent became uniform and response variation was reduced. Presumed to have been.
[0064]
[Table 1]

Although Examples 1 to 3 show biosensors that measure glucose concentration in blood, the sample liquid, substance, and biosensor format to be measured are not limited to this, for example, In addition to blood, saliva, cell interstitial fluid, urine, sweat, and the like, and food and drinking water can be used as the target sample solution. In addition to glucose, lactic acid, cholesterol, uric acid, ascorbic acid, bilirubin, and the like can be used as the target substance. Further, in Examples 1 to 3, the two-electrode method including the measurement electrode 1 and the counter electrode 2 shown in FIG. 5 was used as the current measurement method, but in addition, the measurement electrode, the counter electrode, and the detection electrode were used. There are three electrode methods, and any method may be used. Note that the three-electrode method can measure more accurately than the two-electrode method.
[0065]
Further, in this example, an enzyme sensor is described as an example of a biosensor. However, the present invention is not limited to an enzyme as a molecular identification element that specifically reacts with a specific substance in a sample solution. The present invention can be similarly applied to a biosensor using RNA or the like.
[0066]
【The invention's effect】
As described above, according to the biosensor of the present invention, an electrode composed of at least a measurement electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate is used, and the substance to be measured in the sample liquid is placed on or near the electrode. In the biosensor for measuring the content of the substance to be measured from the current value obtained by the reaction with the reagent layer formed of at least the enzyme and the electron carrier formed in the aliphatic carboxylic acid, carbon in the reagent layer Since organic acids or organic acid salts such as cyclic carboxylic acids and heterocyclic carboxylic acids are included, organic acids or organic acid salts such as aliphatic carboxylic acids, carbocyclic carboxylic acids, and heterocyclic carboxylic acids are added to the reagent. By using a simple method, it is possible to suppress an increase in background current over time without inhibiting an enzyme reaction or the like. Can be suppressed together also unnecessary reactions with various Kyozatsu materials, good linearity, the effect is obtained that the sensor individual variation can provide a small high performance biosensor.
[0067]
In addition, according to the biosensor of the present invention, an electrode composed of at least a measurement electrode and a counter electrode provided on an insulating substrate is used, and is formed on or near the measurement target substance in the sample liquid. In the biosensor for measuring the content of the substance to be measured from the current value obtained by the reaction with the reagent layer comprising at least an enzyme and an electron carrier, at least one carboxyl group in the reagent layer Since it contains an organic acid or organic acid salt such as an amino acid having an amino group, the response to the substrate concentration of the sensor can be achieved by using a simple method of adding an organic acid or organic acid salt such as an amino acid to the reagent. Effect (sensitivity, linearity) can be dramatically improved, and the sensor performance can be improved.
[0068]
Further, according to the biosensor of the present invention, since the reagent layer contains a hydrophilic polymer, the inclusion of the hydrophilic polymer facilitates the formation of a homogeneous reagent on the electrode surface. Each substance can be promoted to be in a homogeneous dispersion state. In addition, since the formation of a homogeneous reagent can be realized, an effect of providing a high-performance biosensor with little variation among sensors can be obtained.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an increase in background current in a harsh environment when purified water is used as a sample solution in Example 1. FIG.
FIG. 2 is a graph showing an increase in background current in a harsh environment when purified water is used as a sample solution in Example 2.
3 is a graph showing whole blood response values when whole blood is used as a sample solution in Example 3. FIG.
4 is a graph showing whole blood response values when whole blood is used as a sample solution in Example 3. FIG.
FIG. 5 is an example of an exploded perspective view of a two-electrode biosensor.
[Explanation of symbols]
1 Working electrode 2 Counter electrode 3, 4 Lead 5 Insulating substrate 6 Cover 7 Spacer 8 Notch 9 Air hole 10 Reagent layer 11 Cavity

Claims

In a biosensor comprising an electrode comprising a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate, and a reagent layer containing at least an enzyme and an electron carrier, and measuring the concentration of a specific substance in a sample solution,
Biosensor wherein the reagent layer further characterized in that it comprises adipic acid, the carboxylic acid is any or a combination thereof benzoate.

The biosensor according to claim 1 , wherein
Biosensor wherein the reagent layer is a reagent of the upper electrode, or the reagent layer so that the electrodes are disposed in a diffusion area for diffusing dissolved in a sample solution, which is formed, characterized the Turkey.

In a biosensor comprising an electrode comprising a working electrode and a counter electrode on an insulating substrate, and a reagent layer containing at least an enzyme and an electron carrier, and measuring the concentration of a specific substance in a sample solution,
Biosensor wherein the reagent layer further characterized in that it comprises serine, proline, threonine, Sa Rukoshin, either taurine or a combination thereof.

The biosensor according to claim 3 , wherein
Biosensor wherein the reagent layer is a reagent of the upper electrode, or the reagent layer so that the electrodes are disposed in a diffusion area for diffusing dissolved in a sample solution, which is formed, characterized the Turkey.

The biosensor according to any one of claims 1 to 4 ,
The biosensor, wherein the reagent layer further contains a hydrophilic polymer.