JP4427825B2

JP4427825B2 - Pharmaceutical composition having cholesterol lowering action

Info

Publication number: JP4427825B2
Application number: JP50965799A
Authority: JP
Inventors: 晃彦下川; 智見西嶋; 光陽松田; 祐一飯泉; 誠一橋本
Original assignee: Astellas Pharma Inc
Current assignee: Astellas Pharma Inc
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2010-03-10
Anticipated expiration: 2018-07-22
Also published as: AU8355998A; ATE421336T1; CA2295930C; DE69840510D1; US6300364B1; ES2320181T3; EP1023907A4; WO1999004815A1; EP1023907B1; CA2295930A1; EP1023907A1

Abstract

Pharmaceutical compositions having a cholesterol-lowering effect which comprises as the active ingredient a compound having a PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) delta activating effect or a PPAR delta - and PPAR gamma -activating effect or a pharmaceutically acceptable salt thereof; pharmaceutical compositions wherein the cholesterol-lowering effect is an LDL-cholesterol-lowering effect; and a method for identifying a compound having a cholesterol-lowering effect characterized by measuring the PPAR delta -activating effect or the PPAR delta - and PPAR gamma -activating effect thereof. Means for Solution: It is found out that a compound exerting an excellent cholesterol-lowering effect on higher animals such as humans and ape has an effect of activating PPAR delta or PPAR delta and PPAR gamma . Also, a method for identifying a compound having an excellent cholesterol-lowering effect was found, wherein the desired compound can be quickly and efficiently screened from among a number of compounds by measuring the PPAR delta -activating effect or the PPAR delta - and PPAR gamma -activating effect.

Description

技術分野
本発明は，（1）PPARδ活性化作用若しくはPPARδ及びγ活性化作用を有する化合物，又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコレステロール低下を有する医薬組成物，（2）コレステロール低下作用がＬＤＬ−コレステロール低下作用である医薬組成物，（3）ｐ−［３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピルフェノキシ）プロポキシ］フェニル酢酸，又はその製薬学的に許容される塩を有効成分とするコレステロール低下作用を有する医薬組成物，及び（4）コレステロール低下作用を有する化合物を同定するための方法であって、ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体PPARδ活性化作用，又はPPARδ及びPPARγ活性化作用を測定することを特徴とする方法，に関する。
背景の技術
血中脂質レベルの増加，特にＬＤＬ（low density lipoprotein）−コレステロールレベルの増加は，動脈硬化症を引き起こす重要な原因の一つとして考えられている。今までに知られているＬＤＬ−コレステロール低下薬としては，コレステロール生合成の律速酵素であるHMG-CoA（ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ;3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeA）還元酵素の阻害剤や腸管内でのコレステロールの再吸収抑制剤などがある。例えば，HMG-CoA還元酵素阻害剤投与による血清ＬＤＬ−コレステロール低下の機序は，主として肝臓でのコレステロール生合成阻害による細胞内コレステロールとその代謝産物生成量の低下及びそれによるＬＤＬ受容体発現亢進作用に基づくものであるとされる（J.Lipid Res.,33,p1569-1582,1992）。
HMG-CoA還元酵素阻害剤の１つ，シンバスタチンの第Ｉ相臨床試験では，健常人の血清コレステロールレベルは投与開始約１週間で約２０％の低下率を示し，その後の投与でもより継続した低下は期待できないことが示されている。また、血清総コレステロール220mg/dl以上の高脂血症患者においても，その低下率は約２０％程度であることが示されている（山本章ほか，臨床医薬，4（3）,p409,1988）。
一方，特公昭63-35626号公報に記載されているYM-16638化合物は，元来，強いSRS-A（スロー・リアクティング・サブスタンス・オブ・アナフィラキシー;slow reacting substance of anaphylaxis）拮抗作用を有する化合物であり，種々のアレルギー性疾患（例えば気管支喘息，じん麻疹）や虚血性の心及び脳疾患，炎症などの予防・治療剤並びに抗潰瘍剤として有用なことが知られている（Arzneim.-Forsch.Drug Res.,38（1）,p682-685,1988,Prostaglandins Leukotrienes,and Essential Fatty Acids,36,p43-47,1989）。
この化合物の抗潰瘍・抗喘息薬としての臨床試験において，意外にもヒトで強力な血清コレステロール低下作用を有することが見出され，また動物実験においても同様な作用を示すことが確認されている（Drug Dev.Res.,38,p86-92,1996，特開平2-215717号公報）。上記の血清コレステロールの低下率は，健常人に対して約２６％（60mg投与）〜４１％（120mg投与）であり（Drug Dev.Res.,38,p86-92,1996），初期第II相臨床試験においても約２０％〜５０％の低下率を示す割合は被検者の約８０％を示した。このようなヒトに対する強い血清コレステロールの低下作用は，ＨＤＬ（high density lipoprotein）−コレステロールの低下ではなく，ＬＤＬ−コレステロール，アポ蛋白質Ｂの有意な低下に起因するものであり，一方，血清トリグリセリドレベルに対してはその低下作用は弱いことが判っている（Drugs,53（2）,p299-336,1997）。
YM-16638の血清コレステロール低下作用機序に関するこれまでの研究から，肝臓でのコレステロール生合成阻害効果を有すること（Br.J.Pharmacol.,118,p174-178,1996）並びに肝臓でのＬＤＬ受容体の活性化とＬＤＬ受容体遺伝子発現レベルを増加させる作用を有することが知見されている（Drug Dev.Res.,38,p86-92,1996）。しかしながら，これらの作用を引き起こすYM-16638化合物の作用機序の更なる詳細については不明であった。
近年，血中脂質レベルの低下にも関与する脂肪細胞の分化増殖の機序に関する研究の中で，核内受容体であるPPAR（ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体；peroxisome proliferator-activated receptor）の存在が見出された（Nature,347,p645-650,1990）。PPARにはこれまでに大きく分けて３つのサブタイプの存在が知られており，PPARα，PPARδ，PPARγと称する（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,p7355-7359,1994,蛋白質・核酸・酵素，40（13）,p50-55,1995）。更に，種々の化合物について，PPARのサブタイプの活性化やその脂質低下作用についての報告がなされている。例えば，糖尿病治療薬であるチアゾリジンジオン系化合物は，PPARγのリガンドであり，ヒトにおいて血清中のコレステロールレベルは低下させないが，血清トリグリセリドレベルを有意に低下させることが知られている（Diabetes,46,p433-439,1997,Diabetes Care,19（2）,p151-156,1996,15（2）,p193-203,Diabetologia,39,p701-709,1996＜文献１＞）。一方，古くから脂質低下薬として用いられているフィブレート系薬剤は，PPARαのリガンド効果を有することが知られており，臨床では，強い血清トリアシルグリセロールレベルの低下が総じて認められている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,p4312-4317,1997,Drugs,40（2）,p260-290,1990＜文献２＞）。
フィブレート系薬剤と共にPPARαの特異的リガンドとして，Wy14,643（Pirinixic acid）が知られているが（EMBO J.,11,p433-439,1992,Arch.Biochem.Biophys.,228（1）,p185-196,1984,＜文献３＞），高等生物に対する脂質低下作用について報告はない。この他，抗血栓薬などとして用いられるプロスタサイクリン（PGI₂）自体にはPPARαもPPARδも活性化作用はないことが確認されているが（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,94,p4312-4317,1997），その誘導体であるカルバプロスタサイクリン（cPGI₂）には，PPARαとPPARδの両リガンド活性のあることが報告されている。しかし，該化合物の脂質低下作用に関する詳細は未だ報告されてはいない（J.Biol.Chem.,272（9）,p5367-5370,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,p4312-4317,1997＜文献４＞）。
一方、英国公開公報GB 2292885には、NUC1（ヒトPPARδ）受容体を活性化する物質を投与することによる高脂血症薬がクレームされているが、明細書に開示された脂肪酸酸化に関連する酵素のレベルを調節する旨の記載は、トリグリセリドの代謝に関連するものであり、コレステロール低下作用については何ら開示も示唆もされていない。
従って，以上の知見にも拘わらず，血清コレステロール低下作用にPPARのいずれのサブタイプが関与しているのかについては，未だ確認されていない。
PPARのサブタイプが関与する新規作用機序に基づくコレステロール低下剤は，治療上従来薬よりも優れた効果を示すことが期待できる。現状では，上記作用機序が明らかにされておらず，充分満足できる薬剤が見い出されてはいない。そこで，PPARのサブタイプが関与する作用機序が明らかであり，優れたコレステロール低下作用を有し，医薬品として充分満足できる薬剤の開発が切望されている。
発明の開示
本発明者等は，上記YM-16638のコレステロール低下の作用機序について，鋭意研究を行った結果，該化合物がPPARδ及びγ活性化作用を有することを本発明により初めて見い出した。この知見，及びPPARγのリガンドであるチアゾリジンジオン系化合物が血清コレステロールレベルを低下させないとの従来の報告から，上記コレステロールの低下作用にはPPARδが主に関与しているのではないかと考え，PPARδ活性化作用を有する化合物について更に研究した。即ち，PPARδ活性化作用，又はPPARδ及びγ活性化作用を測定することを特徴とする方法を用いることにより，PPARδ活性化作用を有する化合物を探索した。この結果，チェコ登録特許CZ 281130に抗炎症作用、抗喘息作用を示す化合物として開示されたｐ−［３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピルフェノキシ）プロポキシ］フェニル酢酸がPPARδ及びγ活性化作用を有し，且つ意外にもYM-16638と同様に優れた血清コレステロール低下作用及びＬＤＬ−コレステロール低下作用を示すことが高等動物を用いた実験において見出され，これらの知見に基づいて本発明を完成した。
即ち，本発明は，PPARδ活性化作用若しくはPPARδ及びγ活性化作用を有する化合物，又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコレステロール低下作用を有する医薬組成物に関する。
また、本発明は、上記コレステロール低下作用がＬＤＬ−コレステロール低下作用である医薬組成物に関する。
更に本発明は，ｐ−［３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピルフェノキシ）プロポキシ］フェニル酢酸又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有するコレステロール低下作用を有する医薬組成物に関する。
更にまた，本発明は，コレステロール低下作用を有する化合物を同定するための方法であって、PPARδ活性化作用，又はPPARδ及びγ活性化作用を測定することを特徴とする方法に関する。
以下，本発明について詳細に説明する。
本発明において，「ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体PPAR活性化作用」とは，その受容体のリガンド結合部位に化合物が直接的に結合・作用し，もしくは間接的に作用し，そのリガンド結合受容体によって機能発現が引き起こされる初期段階の作用の全てを意味し，その受容体活性化作用を測定することにより求められる測定値が，化合物非添加（ここでは溶媒として用いたジメチルスルフォキサイド添加）の細胞での活性値と比較して，統計学的に有意差があると判定した場合に「活性化作用あり」と判断する。
本発明において「コレステロール低下作用」とは，病態レベルの血清中のコレステロール値（治療の必要とされる通常220mg以上）を有意に低下させる作用を意味し，コレステロール低下作用を示す医薬組成物は、血清コレステロールの上昇に起因する各種疾患の予防及び治療に有用である。
本発明のコレステロール低下作用を有する医薬組成物が有効成分として含有する「PPARδ活性化作用若しくはPPARδ及びγ活性化作用を有する化合物」とは，ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物の中から本発明のコレステロール低下作用を有する化合物の同定方法により選択されたもの，あるいはこれら選択された化合物の母核を利用した置換基変換により新規に合成した化合物等，公知又は新規に拘わらずPPARδ活性化作用，又はPPARδ及びγ活性化作用を有する化合物を全て包含するものである。
「製薬学的に許容される塩」とは，該化合物が酸又は塩基と形成する塩であり，生体に対し非毒性であるものを意味する。
具体的には，無機酸若しくは有機酸との酸付加塩，あるいは無機若しくは有機塩基との塩であり，製薬学的に許容しうるこれらの塩としては，具体的には塩酸，臭化水素酸，ヨウ化水素酸，硫酸，硝酸若しくは燐酸等の鉱酸，又はギ酸，酢酸，プロピオン酸，シュウ酸，マロン酸，コハク酸，フマル酸，マレイン酸，乳酸，リンゴ酸，酒石酸，クエン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸若しくは，トルエンスルホン酸等の有機酸，又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの酸性アミノ酸との付加塩，ナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，アルミニウム，リチウムなど無機塩基，メチルアミン，エチルアミン，エタノールアミンなどの有機塩基，リジン，オルニチンなどの塩基性アミノ酸との塩やアンモニウム塩等を挙げることが出来る。
更に，本発明化合物は水和物，エタノール等との溶媒和物や結晶多形を形成する場合があり、本発明は，これらの水和物，溶媒和物又は結晶多形の分離されたものあるいは混合化合物を全て包含する。
本発明のコレステロール低下作用を有する化合物の同定方法は，ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体PPARδ活性化作用，又はPPARδ及びγ活性化作用を測定することを特徴とする方法であり，化合物のPPARδ、又はPPARδ及びγ活性化作用の確認や、コレステロール低下作用を有する化合物を選択する方法を提供するものである。該方法は，（a）PPARδあるいはPPARγ受容体の機能的断片をコードする発現カセットの構築物の作成，（b）上記受容体断片と結合する機能蛋白断片についての１，又は複数の応答要素，及びレポーター遺伝子の結合した構築物の作成，（c）この構成物を用いる宿主への共トランスフェクション，（d）試験される化合物の添加，及び（e）レポーター遺伝子の発現の測定，（f）試験化合物をコントロールと比較し、PPARδ活性化作用，又はPPARδ及びγ活性化作用を示す化合物を選択する工程からなり，該方法を用いることにより多数の化合物を迅速且つ効率的に測定し、ランダムスクリーニングすることが可能である。
上記工程（a）及び（b）は，近年，核内受容体のリガンド評価系として確立されたものであり，詳細は，酵母（Saccharomyces cerevisiae）に発現するガラクトース代謝酵素調節蛋白質GAL4［GAL1（galactokinase）,GAL7（α-D-galactose-1-phosphate uridyltransferase）,GAL10（uridine diphosphoglucose-4-epimerase）の発現調節因子とその応答配列UAS_G（galactose upstream activating region）との結合を利用したレポーター系である（Cell,40,p767-774,1985,52,p161-167,1988,52,p169-178,1988,54,p199-207,1988）。後記実施例１に記載の，酵母のＧＡＬ４蛋白のＤＮＡ結合能を利用したレポーターシステム（J.Biol.Chem.,270（22）,p12953-12956,1995）以外に，PPARのDNA結合領域が結合する応答領域（peroxisome proliferator responsive element,PPRE）を利用したレポーターシステム（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,p4312-4317,1997,91,p7355-7359,1994,J.Biol.Chem.,268（8）,p5530-5534,1993）やバクテリアテトラサイクリンオペロンを利用したレポーターシステム（J.Biol.Chem.,270（41）,p23975-23983,1995）などが利用可能である。
実施例１に記載の，ベクターの構築に必要な遺伝子操作に関する基本的技術については，Basic Methods in Molecular Biology,2^ndEdition（Leonard G.Davis,W.Michael Kuehl,James F.Battey,Prentice-Hall International Inc.,1994）及び細胞工学・別冊，“バイオ実験イラストレイテッド▲２▼遺伝子解析の基礎”［中山広樹，西方敬人著（秀潤社）（１９９５年）］を参考に行うことが可能である。
本発明の工程（a）で使用する遺伝子発現ベクターは，ＧＡＬ４蛋白質のＤＮＡ結合領域（GAL4-DBD）をコードする遺伝子を既に含む市販のベクター，pGBT9 DNA-Binding Domain Vector（ベクターサイズ5.5kb,GAL4-DBD領域とアンピシリン耐性遺伝子Amp^R配列をベクター内に有する；クロンテック社製）であり，そのGAL4-DBD領域の近傍にあるマルチプルクローニングサイト（MCS）に目的とする核内受容体のリガンド結合領域を導入することによって，細胞内で発現されるキメラ蛋白質が本同定法におけるセンサーとなり得るのに充分都合の良いものであって，pGBT9に代えて製品pAS2 DNA-Binding Domain Vector（クロンテック社製）を用いることもできるし，文献（Cell,52,p169-178,1988）に記載の方法やその変法を利用することによっても構築は可能である。
工程（b）で使用する，活性化キメラ蛋白質に対する応答要素とレポーター遺伝子の融合ベクターは，公知である応答要素を構築して市販のルシフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクター（ピカジーンベクター２（PGV-B2），東洋インキ製造（株））に導入したものであり，その方法は，通常，適当な制限酵素部位を有する短い断片を経由して挿入される。即ち，例えば，レポーター遺伝子の近くに組み込むために，例えば適当な制限酵素を有するレポーター遺伝子を切断し，応答要素を挿入するというような慣用手段を用いて行い，使用する適当な末端を有する応答要素の構築はＤＮＡ合成機上で合成される。
更には，公知の応答要素は，DNA合成機により作成することも可能であるが，pG5CAT reporter plasmid（クロンテック社製）のように既に市販の適当なベクターに組み込まれているものを使用することも可能であり，好ましくは，化合物の同定に使用する後記宿主中で応答性の良い応答要素を選択，使用することが望ましい。
適当なプロモーター，及びターミネーター配列は，好ましくは後記宿主中で活性であるように選択され，当業界で良く知られているものである。それらは，構造遺伝子，及び任意にマーカー基，及び他の遺伝子工学における標準的技術によって好都合な要素と結合し得る。
本発明のコレステロール低下作用を有する化合物の同定方法で述べた，工程（c）で作成した構築物の発現に用いる好ましい宿主細胞とは，例えば細菌，例えば酵母のような真菌，昆虫又は哺乳類の細胞であり，HepG2細胞，NIH-3T3,COS-1,COS-7,U-937,CV-1,KI-293等が代表的なものであり，特にHepG2やCV-1,NIH-3T3細胞が好ましい。これらの細胞を用いた遺伝子導入に関する実験条件は，好ましくは細胞障害性の少ない，導入遺伝子量が多くかつ分解されにくい条件であって，後記実施例１において利用したリポフェクトアミンによる遺伝子導入方法に限らない。
工程（d）は，ケミカルファイルに登録されている公知化合物あるいは新規に合成した化合物を適当な希釈倍率で希釈したものを，遺伝子を導入しておいた細胞の培地に添加し，後記工程（e）の測定を行うものであり，例えば９６ウェルプレートを用いるHigh through put screening系として処理することが可能である。
工程（d）において，化合物は適当な溶媒に溶解した条件下で細胞の培地中に添加されるものであって，そのインキュベーションの方法としては，細胞内に導入した２つの遺伝子とそれらに作用する物質が，最終的にレポーター活性として測定するのに必要充分な条件下で行い，化合物が細胞膜を通過できなければ，適当な単体を加えるか，細胞のない系を用いることも可能である。
本発明におけるレポーター遺伝子の発現に関しては，例えば，産生蛋白質，酵素活性，もしくは細胞増殖量のような，転写レベル，又は翻訳レベルで測定し得る。
工程（e）において測定の対象となる指標としては，適当なレポーター遺伝子が当業界では良く知られている。例としては，ホタルルシフェラーゼ（luc,PGV，ピカジーン社製）の他に，シーパンジールシフェラーゼ（luc,pRL，ピカジーン社製），細菌ハイブリドルシフェラーゼ（lu×AB），クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT），β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（lacZ）である。
工程（f）において、コントロールとして試験化合物の溶媒を用い、溶媒のみで処理した細胞で工程（e）のレポーター遺伝子発現の指標を測定し、その活性値（コントロール値）を1.0として，試験化合物の相対的なリガンド活性を算出する。PPARδ若しくはPPARδ及びγに対して有意に活性化作用を示す化合物を選択する。
産業上の利用可能性
本発明により提供される医薬組成物は，新規作用機序，即ち，ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体のサブタイプであるPPARδ活性化作用若しくはPPARδ及びγ活性化作用を有することを特徴とするものであり，特にヒトやサルなどを含む高等生物において従来薬よりも薬効の点において非常に優れていることが期待されるものである。
本発明のｐ−［３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピルフェノキシ）プロポキシ］フェニル酢酸は，その化学構造中の水酸基等に基づき，ケト−エノール互変異性体等の各種異性体が存在するが，本発明はこれらの異性体の単離されたもの，あるいは混合物の全てを包含する。
また本発明化合物は，塩基と塩を形成する。塩基との塩としては，ナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，アルミニウム等の無機塩基，メチルアミン，エチルアミン，エタノールアミン，リジン，アルギニン，オルニチン等の有機塩基との塩やアンモニウム塩が挙げられる。更に，本発明化合物は，その理化学的性質や製造条件により水和物，エタノール等との溶媒和物，あるいは結晶多形をなす種々の結晶形を有する物質として得られることがある。本発明にはこれら水和物，エタノール等との溶媒和物，及び種々の結晶形の物質全てが包含される。
本発明化合物は，後記製造例１に記載の方法又は当業者に公知のその変法により製造することが可能であり，遊離のまま，あるいはその塩として単離される。本発明化合物の塩は遊離の酸又は塩基である本発明化合物に通常の造塩反応を付することにより製造できる。単離精製は，抽出，濃縮，留去，結晶化，濾過，再結晶，各種クロマトグラフィー等，通常の化学操作を適用して行われる。各種の異性体は，異性体間の物理化学的な性質の差を利用して常法により単離できる。
発明の効果
本発明のコレステロール低下作用を有する医薬組成物は，新規作用機序であるPPARδ活性化作用，又はPPARδ及びγ活性化作用に基づき，特にヒトあるいはサル等の高等生物において，優れた血清コレステロール低下作用、特にＬＤＬ−コレステロール低下作用を示すものである。
また、本発明のコレステロール低下作用を有する化合物の同定方法は，実際にコレステロール低下作用に優れた化合物を選択するのに有用な方法であることが確認されており，多数の化合物から迅速且つ効率的に目的とするコレステロール低下作用を有する化合物をスクリーニングし選択する上で極めて有用である。
従って，本発明の医薬組成物は，上記作用に基づき，血清コレステロール特にＬＤＬ−コレステロールの増加に起因する各種疾患，即ち，高コレステロール血症，高脂血症，黄色腫，動脈硬化，又は動脈硬化に起因する各種疾患（冠状動脈硬化に基づく狭心症や心筋梗塞等の虚血性心疾患，脳血管の硬化による脳梗塞や脳出血等の脳血管障害，硬化した脳動脈の機械的圧迫による視神経萎縮や水頭症，腎動脈硬化に基づく腎硬化症，大動脈や末梢動脈の内腔狭窄による動脈留や閉塞性動脈硬化症等）等の予防及び治療に極めて有用である。
本発明の，PPARδ活性化作用若しくはPPARδ及びγ活性化作用を有する化合物，又はその塩の１種，又は２種以上を有効成分として含有する製剤は，通常製剤化に用いられる担体や賦形剤，その他の添加剤を用いて調製される。投与は錠剤，丸剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，液剤等による経口投与，あるいは静注，筋注等の注射剤，坐剤，経皮等による非経口投与のいずれの形態であってもよい。投与量は，症状，投与対象の年齢，性別等を考慮して，個々の場合に応じて適宜決定されるが，通常，経口投与の場合，成人１日当たり１〜５００ｍｇ程度，非経口投与の場合，成人１日当たり０．１〜５０ｍｇ程度であり，これを１回で，あるいは２〜４回に分けて投与する。
本発明による経口投与のための固体組成物としては，錠剤，散剤，顆粒剤等が用いられる。このような固体組成物においては，１つ又はそれ以上の活性物質が，少なくとも１つの不活性な希釈剤，例えば乳糖，マンニトール，ブドウ糖，ヒドロキシプロピルセルロース，微結晶セルロール，デンプン，ポリビニルピロリドン，メタケイ酸，アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は，常法に従って，不活性な希釈剤以外の添加剤，例えばステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤や繊維素グルコール酸カルシウムのような崩壊剤，ラクトースのような安定化剤，グルタミン酸，又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は，必要によりショ糖，ゼラチン，ヒドロキシプロピルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の糖衣又は胃溶性あるいは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は，薬剤的に許容される乳濁剤，溶液剤，懸濁剤，シロップ剤，エリキシル剤等を含み，一般的に用いられる不活性な希釈剤，例えば精製水，エタノールを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤，懸濁剤のような補助剤，甘味剤，風味剤，芳香剤，防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては，無菌の水性，又は非水性の溶液剤，懸濁剤，乳濁剤を包含する。水溶性の溶液剤，懸濁剤としては，例えば，注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤，懸濁剤としては，例えば，プロピレングリコール，ポリエチレングリコール，オリーブ油のような植物油，エタノールのようなアルコール類，ポリソルベート８０（商品名）等がある。このような組成物は，更に防腐剤，湿潤剤，乳化剤，分散剤，安定剤（例えば，ラクトース）溶解補助剤（例えば，グルタミン酸，アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは例えば，バクテリア保留フィルターを通す濾過，殺菌剤の配合，又は照射によって無菌化される。また，これらは無菌の固体組成物を製造し，使用前に無菌水，又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を掲記し，本発明のコレステロール低下作用を有する化合物の同定方法，コレステロール低下剤及び化合物について更に詳細に説明する。
実施例１（コレステロール低下作用を有する化合物の同定方法）
（1）アクチベーションベクターの構築
PPARδ及びPPARγのリガンド効果を有する化合物を同定するために，酵母転写活性化蛋白質ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（GAL4-DNA binding domain,GAL4-DBD）とPPARのリガンド結合ドメイン（ligand binding domain,LBD）との融合遺伝子発現ベクター（作成した３つのアクチベーションベクターをGAL-PPARα,GAL-PPARδ,GAL-PPARγと命名した）の構築を行った。操作は，i）第一段階をPPAR-LBDのクローニング，ii）第二段階をGAL4-DBD遺伝子含有ベクターへの導入による融合ベクターの構築，iii）第三段階を発現ベクターへのサブクローニングの３工程からなる（J.Biol.Chem.,270（22）,p12953-12956,1995,Cell,83,p803-812,1995）。
i）ペルオキシソーム増殖薬活性化受容体（mPPAR;mouse peroxisome proliferator-activated receptor;mPPARα,mPPARδ,mPPARγ）のリガンド結合領域（PPAR-LBD）をPCR（polymerase chain reaction）により増幅させた。増幅に用いたテンプレートはマウス副睾丸周囲脂肪組織から，総ＲＮＡ抽出試薬Isogen（ニッポンジーン社製）を用い，添付マニュアルに従って総ＲＮＡを調製し用いた。各PPARサブタイプのリガンド結合領域をコードする遺伝子をクローニングする為に合成したプライマーの塩基配列は次の通り:mPPARα（Gly¹⁶⁵〜Tyr⁴⁶⁷）;5’-TTC CCG GGG ATG TCA CAC AAT GCA ATT CGC-3’（配列番号1）と5’-TTG GAT CCT CAG TAC AAA ATG TCT CTG TAG ATC TC-3’（配列番号2）,mPPARδ（Met¹³⁷〜Tyr⁴³⁹）;5’-TTC CCG GGC ATG TCG CAC AAC GCT AT-3’（配列番号3）と5’-TTG GAT CCT TAG TAC ATG TCC TTG TAG ATT-3’（配列番号4）,mPPARγ（Gly¹⁷²〜Tyr⁴⁷⁴）;5’-TTC CCG GGG ATG TCT CAC AAT GCC ATC-3’（配列番号5）と5’-TTG GAT CCC TAA TAC AAG TCC TTG TAG AT-3’（配列番号6）。GeneAmp PCRシステム９６００型を用いてＰＣＲ反応を行った。
ii）予め，合成したプライマーの片側には，制限酵素SmaIあるいはBamHIで切断可能なようにそれら認識配列を挿入しておいた。増幅後のPCR断片は，SmaIとBamHIで切断しておいたpGBT9 DNA-Binding Domain Vector（5.5kb,GAL4-DBD領域とアンピシリン耐性遺伝子Amp^R配列を有する；クロンテック社製）にライゲーションすることによって導入し，これにより作成されたベクターをpGBT9-PPAR-LBDと命名した。
iii）pGBT9-PPAR-LBDの中に含まれるGAL4-DBDとPPAR-LBDを結合させた融合遺伝子領域（GAL4-DBD+PPAR-LBD）をHindIII/SalIを用いて切り出し，発現ベクター，pZeoSV（3.5kb，ゼオシン耐性遺伝子Zeo^R配列を有する；クロンテック社製）のマルチプルクローニングサイト（MCS）にHindIII/XhoIを用いて導入した。このようにして得られたGAL4-DBDとPPAR-LBDのキメラ蛋白質発現ベクターを，それぞれGAL-PPARα,GAL-PPARδ,GAL-PPARγと命名した。
（2）レポーターベクターの構築
ルシフェラーゼ遺伝子の発現を指標とするレポーターベクター（以下，RE-LUCと命名する）の構築は，i）第一段階としてGAL4応答配列の作成，及びii）第二段階としてルシフェラーゼ発現ベクターへのサブクローニングの２工程からなる（J.Biol.Chem.,270（22）,p12953-12956,1995,Cell,83,p803-812,1995）。
i）GAL4-DBDの結合配列［GAL4応答配列;GAL4 responsive element,RE，又はUAS_G］を１回（ＲＥ×１）及び３回繰り返したＤＮＡ配列（ＲＥ×３）をＤＮＡ合成機（Beckman DNA合成装置Oligo1000M，ベックマン社製）を使用して合成した。適当な制限酵素サイトを両端に入れ，これらを結合させて４回繰り返し配列断片（ＲＥ×４）を作成し，更にこれらを用いて８回繰り返し配列断片（ＲＥ×８）を作成した。
ii）GAL4応答配列（RE×8）にTATA box部分を連結させたＤＮＡ断片をＰＣＲにより作成し，ルシフェラーゼアッセイシステム用ベクター［ピカジーンベクター２（PGV-B2），東洋インキ製造（株）］のルシフェラーゼ遺伝子配列上流5’-側にこれを挿入した（RE-LUC）。作成したRE-LUCに含まれるＲＥ×８及びTATAボックスを含む挿入領域の塩基配列は，シーケンシングキット（PRISM^TMReady Reaction DyeDeoxy^TMTerminator Cycle Sequencing Kit，アプライドバイオシステムズ社製）を用いて試料調製後，シーケンサー（ABI 373A DNA sequencer，アプライドバイオシステムズ社製）を使用してその塩基配列を確認した。ＲＥ×８を含むＲＥ−ＬＵＣは，GAL-PPARγと併せて細胞に導入し，PPARγのリガンドであるＣＳ−０４５（トログリタゾン）を添加した際，得られるリガンド応答性（ルシフェラーゼ活性）が，繰り返し回数の異なる他のもの（ＲＥ×２，×３，×４，×５，×６，×１０）と比較して最も強い活性を示すことから，本評価試験にはＲＥ×８を使用した。
（3）PPARα，PPARδ及びPPARγ活性化作用の測定
上記項目（１）及び（２）で作成したアクチベーションベクターとレポーターベクターを用いて，以下の３つの工程［ｉ）構築物の宿主への共トランスフェクション，ii）化合物添加による細胞処理，iii）レポーター遺伝子発現量の測定］により，化合物のPPAR活性化作用を測定した。
i）（構築物の宿主への共トランスフェクション）
HepG2細胞（American Type Culture Collection,Meryland,USA）を１ウェル当たり1×10⁴個の細胞濃度で，コラーゲンタイプＩＶ処理９６ウェルプレート（イワキ（株）社製）にまき，２日間，１０％の濃度で胎児ウシ血清（FCS）を添加したダルベッコ改変イーグル培地［200μl/well,FCS-DMEM（GIBCO BRL）］の存在下において培養した。その後，３７℃に保温した100μl/wellの細胞培養用培地OPTI-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO-BRL製）で細胞を洗い，DNA含有溶液〔９６ウェルプレートの１ウェル（５０μｌ添加溶液）当たり，以下の成分を含有するもの；0.01μgのGAL-PPARαあるいは-PPARδあるいは-PPARγ,0.1μgのRE-LUCルシフェラーゼベクター，0.02μgのpCH110真核細胞発現ベクター［β−ガラクトシダーゼ発現用ベクター（遺伝子導入効率補正用），ファルマシアバイオテク（株）社製］，1μlのLipofectAMINE（GIBCO BRL），これらをOPTI-MEMに室温で１５分間攪拌しながら溶解したもの〕を添加して，３７℃で３時間培養した。
ii）（化合物添加による細胞処理）
細胞を10%FCS-DMEM 100μlで2回洗い，供試化合物（10^-4M,５％ジメチルスルフォキシド（DMSO）に溶解したもの）を含む１０％ FCS-DMEM 200μlに新たに交換して更に４８時間，３７℃で培養を継続した。
iii）（レポーター遺伝子発現レベルの測定）
培地を除いた後，１ウェル当たり，ルシフェラーゼ活性測定用可溶化緩衝液（１倍希釈液，ピカジーン社製）100μlを添加して，室温で１５〜３０分間放置した。そのうちの20μlを別な測定用プレートに分取して，ルシフェラーゼ基質溶液100μl（ピッカジーン社製）を添加し，AB-2100型化学発光測定装置（アトー社製）を用いて１０秒間の発光量（ルシフェラーゼ活性）を求めた。ルシフェラーゼ遺伝子の添加と同時に，加えておいたβ−ガラクトシダーゼ発現遺伝子の細胞内導入による活性発現量を測定し，化合物添加によるルシフェラーゼ活性の変動を導入遺伝子のトランスフェクション効率で補正した。β−ガラクトシダーゼ活性の測定方法は，プロメガ（株）のマニュアルに準じて行った（Methods Enzymol.,152,p704-720,1987,Biotechniques,7,p576,1989）。
20μlの可溶化試料を別な９６ウェルプレートに分取し，ONPG溶液（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，プロメガ社製）100μlを添加して３７℃で９０分間インキュベートした。反応停止薬（1M炭酸ナトリウム溶液，プロメガ社製）50μlを加え，室温にて415nmの吸光度を測定した。溶媒として用いたジメチルスルフォニィルオキサイド（DMSO,０．５％濃度）のみで処理した細胞のルシフェラーゼ活性値（コントロール値）を1.0とし，相対的なリガンド活性を算出した（表1）。
この結果，YM-16638及び製造例１は，PPARδ及びγの活性化作用を有することが確認された。
【表1】

実施例２（アカゲザルを用いた血清コレステロール低下作用評価試験）
Br.J.Pharmacol.,118,p174-178,1996に記載の方法に準じ，アカゲザルを用いた血清コレステロール低下作用評価試験を行った。
i）体重約４．５〜５kgの雄性アカゲザル（ハムリー社から購入）に対して，１匹当たり，５０gのピュリナー粉末飼料（Code#5408，オリエンタル酵母社製）に５０mlの水及びビタミンＣ（５mg/kg/day，シグマ社製）を添加して固形状にしたものを５０g，及びバナナ約１００gを１日２回供与し飼育した。この条件下で飼育したアカゲザルに有意な体重の変動がないことを確認した。
ii）コントロール食に適応させたサルを，対照群４匹，投与群３匹に分け，対照群には化合物非添加飼料を，投与群にはYM-16638が３０mg/kg/day、製造例１が３０mg/kg/dayとなるように添加調製した同飼料を１日２回投与した。バナナは飼料の食べ残しを避けるため飼料５０gの摂食後に与えるようにした。
iii）両群とも上記飼料で２週間飼育し，投与最終日の前日の約１６時間前から絶食させた条件下で大腿部から採血した。採血は，被検薬剤の投与前及び投与後の２回，体重測定後に行った。採血したヘパリン処理血液から血清を分離し，日立736-10型自動分析装置を用いて，酵素法により総コレステロール（TC）及びＬＤＬ−コレステロール（LDL-C）を求めた（表２）。
なお、低下率は投与前値との比較により算出した。
【表２】

この結果，YM-16638及び製造例１は，優れた血清総コレステロール（TC）低下作用を示し、特にＬＤＬ−コレステロール（LDL-C）低下作用を示すことが確認された。
製造例１
４−ヒドロキシフェニル酢酸メチル５．００ｇ，１，３−ジブロモプロパン１２．１５ｇ，及び炭酸カリウム８．３２ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド30ml中室温で３晩攪拌した。氷水200mlを加えて酢酸エチルで抽出し（200ml×1回），有機層を水洗後（150ml×1回），無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。ろ過後，ろ液を濃縮して残さ８．１２ｇを得た。本残さ２．８７ｇ，２−プロピル−３−ヒドロキシ−４−アセチルフェノール１．９４ｇ，及び炭酸カリウム２．７６ｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌ中室温で１晩攪拌した。氷水２００ｍｌを加えて酢酸エチルで抽出し（200ml×1回），有機層を水洗後（200ml×1回），無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。ろ過後，ろ液を濃縮して得られた残さ４．３０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Merck,Kieselgel 60）に付し，クロロホルム溶出分から前駆体（Rf=0.75,TLC板:Merck DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F254，展開溶媒:クロロホルム）を１．６３ｇ得た。本前駆体１．６３ｇをメタノール４０ｍｌ及び１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液２０．４ｍｌ中で１時間加熱還流した。放冷後，１Ｎ塩酸水４０ｍｌを加えた。析出した結晶をろ取，メタノール／水で洗った後，減圧下に乾燥することにより，ｐ−［３−（４−アセチル−３−ヒドロキシ−２−プロピルフェノキシ）プロポキシ］フェニル酢酸１．１３ｇを得た。
融点:106-108℃
元素分析値（C₂₂H₂₆O₆として）

赤外線吸収スペクトルνmax（KBr）cm^-1:
2968,1700,1638,1586,1520,1504,1472,1420,1378,1274,1250,1126,1066,814,790.

Technical field
The present invention relates to (1) a pharmaceutical composition having a cholesterol lowering containing, as an active ingredient, a compound having PPARδ activating action or PPARδ and γ activating action, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, (2) cholesterol (3) p- [3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propylphenoxy) propoxy] phenylacetic acid, or a pharmaceutically acceptable product thereof, wherein the lowering action is LDL-cholesterol lowering action A pharmaceutical composition comprising a salt as an active ingredient and having a cholesterol-lowering action, and (4) a method for identifying a compound having a cholesterol-lowering action, which comprises a peroxisome proliferator-activated receptor PPARδ activating action, or PPARδ and The present invention relates to a method characterized by measuring a PPARγ activation action.
Background technology
An increase in blood lipid level, particularly an increase in LDL (low density lipoprotein) -cholesterol level, is considered as one of the important causes of arteriosclerosis. LDL-cholesterol lowering drugs known so far include inhibitors of HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymeA) reductase, which is the rate-limiting enzyme of cholesterol biosynthesis, and intestinal Inhibitors of cholesterol reabsorption in Japan. For example, the mechanism of serum LDL-cholesterol lowering by administration of an HMG-CoA reductase inhibitor is mainly due to the decrease in intracellular cholesterol and its metabolite production by inhibition of cholesterol biosynthesis in the liver and the enhancement of LDL receptor expression (J. Lipid Res., 33, p1569-1582, 1992).
In a phase I clinical trial of simvastatin, one of the HMG-CoA reductase inhibitors, the serum cholesterol level in healthy volunteers was reduced by about 20% in the first week of administration, and continued to decline in subsequent administrations. Has been shown not to be expected. Moreover, it has been shown that the reduction rate is about 20% even in hyperlipidemic patients with serum total cholesterol of 220 mg / dl or more (Akira Yamamoto et al., Clinical Medicine, 4 (3), p409, 1988). ).
On the other hand, the YM-16638 compound described in Japanese Patent Publication No. 63-35626 is originally a compound having a strong SRS-A (slow reacting substance of anaphylaxis) antagonistic action. It is known to be useful as a prophylactic / therapeutic agent for various allergic diseases (eg bronchial asthma, urticaria), ischemic heart and brain diseases, inflammation, and an anti-ulcer agent (Arzneim.-Forsch Drug Res., 38 (1), p682-685, 1988, Prostaglandins Leukotrienes, and Essential Fatty Acids, 36, p43-47, 1989).
Surprisingly, in clinical trials of this compound as an anti-ulcer / anti-asthma drug, it was found to have a strong serum cholesterol-lowering effect in humans, and similar effects were confirmed in animal experiments. (Drug Dev. Res., 38, p86-92, 1996, JP-A-2-157717). The serum cholesterol reduction rate is about 26% (60 mg administration) to 41% (120 mg administration) for healthy individuals (Drug Dev. Res., 38, p86-92, 1996). In clinical trials, the rate of reduction of about 20% to 50% was about 80% of subjects. Such a strong lowering effect of serum cholesterol on humans is not due to a decrease in HDL (high density lipoprotein) -cholesterol, but is due to a significant decrease in LDL-cholesterol and apoprotein B. On the other hand, it is known that the lowering effect is weak (Drugs, 53 (2), p299-336, 1997).
From previous studies on the mechanism of serum cholesterol lowering action of YM-16638, it has an effect of inhibiting cholesterol biosynthesis in the liver (Br. J. Pharmacol., 118, p174-178, 1996) and LDL reception in the liver. It has been found to have an effect of increasing body activation and LDL receptor gene expression level (Drug Dev. Res., 38, p86-92, 1996). However, further details of the mechanism of action of the YM-16638 compound that causes these effects were unclear.
In recent years, PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor), a nuclear receptor, has been studied in the mechanism of adipocyte differentiation and proliferation, which is also involved in lowering blood lipid levels. Was found (Nature, 347, p645-650,1990). PPARs are known to have three subtypes, and are called PPARα, PPARδ, and PPARγ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, p7355-7359, 1994, protein and nucleic acid).・ Enzyme, 40 (13), p50-55, 1995). In addition, various compounds have been reported on the activation of PPAR subtypes and their lipid-lowering effects. For example, thiazolidinedione compounds, which are antidiabetics, are ligands for PPARγ and do not reduce serum cholesterol levels in humans but are known to significantly reduce serum triglyceride levels (Diabetes, 46, p433-439, 1997, Diabetes Care, 19 (2), p151-156, 1996, 15 (2), p193-203, Diabetologia, 39, p701-709, 1996 <Reference 1>). On the other hand, fibrates that have been used for a long time as lipid-lowering drugs have been known to have a ligand effect of PPARα, and in clinical practice, strong reductions in serum triacylglycerol levels have been generally observed (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, p4312-4317, 1997, Drugs, 40 (2), p260-290, 1990 (Reference 2)).
Wy14,643 (Pirinixic acid) is known as a specific ligand of PPARα together with fibrates (EMBO J., 11, p433-439, 1992, Arch. Biochem. Biophys., 228 (1), p185 -196,1984, <Reference 3>), there is no report on lipid lowering action on higher organisms. In addition, prostacyclin (PGI) used as an antithrombotic drug ₂ ) Itself, PPARα and PPARδ have been confirmed to have no activating effect (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, p4312-4317, 1997), but its derivative carbaprostacyclin (cPGI) ₂ ) Has been reported to have both PPARα and PPARδ ligand activities. However, details on the lipid-lowering action of the compound have not yet been reported (J. Biol. Chem., 272 (9), p5367-5370, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, p4312- 4317, 1997 <Reference 4>).
Meanwhile, UK publication GB 2292885 claims a hyperlipidemic drug by administering a substance that activates the NUC1 (human PPARδ) receptor, but is related to fatty acid oxidation disclosed in the specification. The statement that the level of the enzyme is regulated relates to the metabolism of triglycerides, and no disclosure or suggestion is made regarding the cholesterol lowering action.
Therefore, despite the above findings, it has not yet been confirmed which subtype of PPAR is involved in the serum cholesterol lowering action.
Cholesterol-lowering agents based on a novel mechanism of action involving PPAR subtypes can be expected to be therapeutically superior to conventional drugs. At present, the above mechanism of action has not been clarified, and no sufficiently satisfactory drug has been found. Therefore, the mechanism of action involving the subtype of PPAR is clear, and there is an urgent need to develop a drug that has excellent cholesterol-lowering action and is sufficiently satisfactory as a pharmaceutical product.
Disclosure of the invention
As a result of earnest studies on the mechanism of action of YM-16638 for lowering cholesterol, the present inventors have found for the first time that the compound has PPARδ and γ activating effects. Based on this finding and the previous report that thiazolidinedione compounds, which are ligands of PPARγ, do not lower serum cholesterol levels, we believe that PPARδ is mainly involved in the cholesterol lowering action. Further studies were carried out on compounds having a converting action. That is, a compound having a PPARδ activation action was searched by using a method characterized by measuring a PPARδ activation action, or a PPARδ and γ activation action. As a result, p- [3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propylphenoxy) propoxy] phenylacetic acid disclosed as a compound exhibiting anti-inflammatory action and anti-asthma action in Czech Registered Patent CZ 281130 is converted to PPARδ and γ. Based on these findings, it was found in experiments using higher animals that it has an activating action and surprisingly exhibits an excellent serum cholesterol lowering action and LDL-cholesterol lowering action similar to YM-16638. The present invention has been completed.
That is, the present invention relates to a pharmaceutical composition having a cholesterol-lowering effect containing a compound having a PPARδ activating action or a PPARδ and γ activating action, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
The present invention also relates to a pharmaceutical composition wherein the cholesterol lowering action is LDL-cholesterol lowering action.
Furthermore, the present invention relates to a medicament having cholesterol-lowering action, which contains p- [3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propylphenoxy) propoxy] phenylacetic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Relates to the composition.
Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a compound having a cholesterol lowering action, which comprises measuring PPARδ activation action, or PPARδ and γ activation action.
The present invention will be described in detail below.
In the present invention, “peroxisome proliferator-activated receptor PPAR activating action” means that a compound directly binds to or acts indirectly on the ligand binding site of the receptor, and the ligand-bound receptor thereof. Means all of the early stage actions that cause functional expression, and the measured value obtained by measuring the receptor activation action is the absence of compound addition (in this case addition of dimethyl sulfoxide used as a solvent) When it is judged that there is a statistically significant difference in comparison with the activity value in the cells, it is judged as “activate”.
In the present invention, “cholesterol lowering action” means an action of significantly lowering the cholesterol level in serum at a disease level (usually 220 mg or more required for treatment), and a pharmaceutical composition showing a cholesterol lowering action is: It is useful for the prevention and treatment of various diseases caused by elevated serum cholesterol.
The “compound having PPARδ activating action or PPARδ and γ activating action” contained in the pharmaceutical composition having cholesterol lowering action of the present invention as an active ingredient is selected from various known compounds registered in the chemical file. PPARδ activation, whether known or new, such as those selected by the method for identifying compounds having cholesterol-lowering activity of the present invention, or compounds newly synthesized by substituent substitution using the mother nucleus of these selected compounds All compounds having an action or PPARδ and γ activating action are included.
“Pharmaceutically acceptable salt” means a salt that the compound forms with an acid or base and is non-toxic to living organisms.
Specifically, it is an acid addition salt with an inorganic acid or an organic acid, or a salt with an inorganic or organic base. These pharmaceutically acceptable salts include hydrochloric acid and hydrobromic acid. , Hydroiodic acid, sulfuric acid, nitric acid or phosphoric acid, or formic acid, acetic acid, propionic acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, fumaric acid, maleic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, methane Addition salts with organic acids such as sulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid or toluenesulfonic acid, or acidic amino acids such as aspartic acid or glutamic acid, inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium, aluminum and lithium, methyl With organic bases such as amine, ethylamine and ethanolamine, and basic amino acids such as lysine and ornithine And ammonium salts and the like can be mentioned.
In addition, the compounds of the present invention may form hydrates, solvates and crystal polymorphs with ethanol, etc., and the present invention is a product of these hydrates, solvates or crystal polymorphs separated. Alternatively, all mixed compounds are included.
The method for identifying a compound having a cholesterol-lowering action of the present invention is a method characterized by measuring a peroxisome proliferator-activated receptor PPARδ activation action, or PPARδ and γ activation action, wherein the compound PPARδ, or The present invention provides a method for confirming PPARδ and γ activating effects and selecting a compound having a cholesterol lowering effect. The method comprises (a) creating a construct of an expression cassette encoding a functional fragment of PPARδ or PPARγ receptor, (b) one or more response elements for a functional protein fragment that binds to the receptor fragment, and Creation of a reporter gene linked construct, (c) co-transfection into a host using this construct, (d) addition of the compound to be tested, and (e) measurement of reporter gene expression, (f) test compound The method comprises the step of selecting a compound exhibiting PPARδ activation activity or PPARδ activation activity, or PPARδ activation activity, and using this method to rapidly and efficiently measure a large number of compounds and perform random screening. Is possible.
The above steps (a) and (b) have recently been established as a nuclear receptor ligand evaluation system, and the details are described in detail in the galactose metabolic enzyme regulatory protein GAL4 [GAL1 (galactokinase) expressed in yeast (Saccharomyces cerevisiae). ), GAL7 (α-D-galactose-1-phosphate uridyltransferase), GAL10 (uridine diphosphoglucose-4-epimerase) expression regulator and its response element UAS _G (Cell, 40, p767-774,1985,52, p161-167,1988,52, p169-178,1988,54, p199-207,1988) Reporter system utilizing binding to (galactose upstream activating region) ). In addition to the reporter system (J. Biol. Chem., 270 (22), p12953-12956, 1995) that uses the DNA binding ability of the GAL4 protein of yeast described in Example 1 below, the DNA binding region of PPAR binds. Reporter system (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, p4312-4317,1997,91, p7355-7359,1994, J.Biol.Chem.,) Using a response region (peroxisome proliferator responsive element, PPRE) 268 (8), p5530-5534, 1993) and a reporter system using a bacterial tetracycline operon (J. Biol. Chem., 270 (41), p23975-23983, 1995) can be used.
For basic techniques related to gene manipulation necessary for the construction of vectors described in Example 1, see Basic Methods in Molecular Biology, 2 ^nd Edition (Leonard G. Davis, W. Michael Kuehl, James F. Battey, Prentice-Hall International Inc., 1994) and cell engineering / separate volume, “Bio-Experiment Illustrated (2) Fundamentals of Gene Analysis” [Hiroki Nakayama, It can be done with reference to Takato Nishikata (Shyujunsha) (1995)].
The gene expression vector used in step (a) of the present invention is a commercially available vector already containing a gene encoding the DNA binding region (GAL4-DBD) of GAL4 protein, pGBT9 DNA-Binding Domain Vector (vector size 5.5 kb, GAL4 -DBD region and ampicillin resistance gene Amp ^R By introducing the ligand-binding region of the target nuclear receptor into the multiple cloning site (MCS) in the vicinity of the GAL4-DBD region. The expressed chimeric protein is sufficiently convenient to serve as a sensor in this identification method. The product pAS2 DNA-Binding Domain Vector (Clontech) can be used instead of pGBT9, and the literature (Cell , 52, p169-178, 1988) and its modification can be used.
The fusion vector of the response element to the activated chimeric protein and the reporter gene used in the step (b) is an expression vector (Picagene Vector 2 (PGV-B2) containing a commercially available luciferase gene by constructing a known response element. , Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.), and the method is usually inserted via a short fragment having an appropriate restriction enzyme site. That is, for example, in order to incorporate in the vicinity of the reporter gene, for example, a reporter gene having an appropriate restriction enzyme is cleaved and a response element having an appropriate end to be used is used. Is constructed on a DNA synthesizer.
Furthermore, known response elements can be prepared by a DNA synthesizer, but it is also possible to use those already incorporated in an appropriate commercially available vector such as pG5CAT reporter plasmid (Clontech). Preferably, it is desirable to select and use a response element having good responsiveness in the host described later used for identification of the compound.
Suitable promoter and terminator sequences are preferably selected to be active in the host described below and are well known in the art. They can be combined with structural elements and, optionally, marker groups, and other convenient elements by standard techniques in other genetic engineering.
Preferred host cells used for the expression of the construct prepared in step (c) described in the method for identifying a compound having cholesterol-lowering activity of the present invention include, for example, bacteria, fungi such as yeast, insect or mammalian cells. Yes, HepG2 cells, NIH-3T3, COS-1, COS-7, U-937, CV-1, KI-293, etc. are typical, especially HepG2 and CV-1, NIH-3T3 cells are preferred . The experimental conditions for gene transfer using these cells are preferably conditions that have low cytotoxicity, a large amount of transferred gene, and are difficult to be decomposed, and the gene transfer method using lipofectamine used in Example 1 described later. Not exclusively.
In step (d), a known compound registered in the chemical file or a newly synthesized compound diluted at an appropriate dilution rate is added to the cell culture medium into which the gene has been introduced, and the step (e For example, a high through put screening system using a 96-well plate.
In step (d), the compound is added to the cell culture medium under the condition of being dissolved in an appropriate solvent. The incubation method includes two genes introduced into the cell and their action. If the substance is finally subjected to conditions necessary and sufficient to measure the reporter activity and the compound cannot pass through the cell membrane, an appropriate simple substance can be added or a system without cells can be used.
The expression of the reporter gene in the present invention can be measured at the transcriptional level or the translational level, such as the production protein, the enzyme activity, or the amount of cell proliferation.
An appropriate reporter gene is well known in the art as an index to be measured in step (e). Examples include firefly luciferase (luc, PGV, Picagene), seapan luciferase (luc, pRL, Picagene), bacterial hybrid luciferase (lu × AB), chloramphenicol acetyltransferase (CAT) , Β-D-galactosidase (lacZ).
In step (f), the test compound solvent was used as a control, the reporter gene expression index in step (e) was measured in cells treated with only the solvent, and the activity value (control value) was set to 1.0. Relative ligand activity is calculated. Compounds that exhibit a significant activating effect on PPARδ or PPARδ and γ are selected.
Industrial applicability
The pharmaceutical composition provided by the present invention is characterized by having a novel mechanism of action, that is, PPARδ activation action or PPARδ and γ activation action which is a subtype of peroxisome proliferator-activated receptor. In particular, it is expected to be superior to conventional drugs in higher organisms including humans and monkeys.
The p- [3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propylphenoxy) propoxy] phenylacetic acid of the present invention is based on hydroxyl groups in its chemical structure, and various isomers such as keto-enol tautomers. However, the present invention encompasses all of these isomers isolated or mixtures thereof.
The compounds of the present invention form salts with bases. Examples of the salt with a base include inorganic bases such as sodium, potassium, magnesium, calcium, and aluminum, and salts with organic bases such as methylamine, ethylamine, ethanolamine, lysine, arginine, ornithine, and ammonium salts. Further, the compound of the present invention may be obtained as a hydrate, a solvate with ethanol or the like, or a substance having various crystal forms forming a crystal polymorph, depending on its physicochemical properties and production conditions. The present invention includes all of these hydrates, solvates with ethanol and the like, and various crystal forms of the substance.
The compound of the present invention can be produced by the method described in Production Example 1 below or a modification thereof known to those skilled in the art, and is isolated as it is or as a salt thereof. The salt of the compound of the present invention can be produced by subjecting the compound of the present invention which is a free acid or base to a usual salt formation reaction. Isolation and purification are performed by applying ordinary chemical operations such as extraction, concentration, distillation, crystallization, filtration, recrystallization, and various chromatography. Various isomers can be isolated by conventional methods using the difference in physicochemical properties between isomers.
The invention's effect
The pharmaceutical composition having cholesterol-lowering action of the present invention is based on PPARδ activating action or PPARδ and γ-activating action, which is a novel action mechanism, and has excellent serum cholesterol-lowering action particularly in higher organisms such as humans or monkeys. In particular, it exhibits LDL-cholesterol lowering action.
In addition, it has been confirmed that the method for identifying a compound having a cholesterol lowering action of the present invention is a method useful for actually selecting a compound having an excellent cholesterol lowering action. It is extremely useful in screening and selecting a desired compound having a cholesterol lowering action.
Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is based on the above-mentioned action, and various diseases caused by an increase in serum cholesterol, particularly LDL-cholesterol, that is, hypercholesterolemia, hyperlipidemia, xanthoma, arteriosclerosis, or arteriosclerosis. -Related diseases (ischemic heart disease such as angina pectoris and myocardial infarction based on coronary atherosclerosis, cerebrovascular disorders such as cerebral infarction and cerebral hemorrhage due to cerebrovascular hardening, optic nerve atrophy due to mechanical compression of hardened cerebral artery And hydrocephalus, renal sclerosis based on renal arteriosclerosis, arterial retention due to lumen narrowing of the aorta and peripheral arteries, obstructive arteriosclerosis, etc.).
The preparation of the present invention containing a compound having PPARδ activating action or PPARδ and γ activating action, or one or more of its salts as an active ingredient, is a carrier or excipient usually used for formulation. , Prepared using other additives. Administration may be in the form of oral administration such as tablets, pills, capsules, granules, powders, liquids, or parenteral administration such as injections such as intravenous injections, intramuscular injections, suppositories, and transdermal. Good. The dosage is appropriately determined depending on the individual case, taking into account the symptoms, age of the subject, sex, etc. Usually, in the case of oral administration, about 1 to 500 mg per day for adults, parenteral administration The dose is about 0.1 to 50 mg per day for an adult, and is administered once or divided into 2 to 4 times.
As the solid composition for oral administration according to the present invention, tablets, powders, granules and the like are used. In such solid compositions, one or more active substances are present in at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose, starch, polyvinylpyrrolidone, metasilicic acid. , Mixed with magnesium aluminate. The composition may be prepared according to conventional methods with additives other than inert diluents, such as lubricants such as magnesium stearate, disintegrants such as calcium calcium glycolate, stabilizers such as lactose, glutamic acid, or It may contain a solubilizing agent such as aspartic acid. If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating such as sucrose, gelatin, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose phthalate, or a film of a gastric or enteric substance.
Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs, etc., and commonly used inert diluents such as purified water. Contains ethanol. In addition to the inert diluent, the composition may contain adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweeteners, flavors, fragrances and preservatives.
Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions. Examples of the water-soluble solution and suspension include distilled water for injection and physiological saline. Examples of water-insoluble solutions and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, polysorbate 80 (trade name), and the like. Such compositions may further contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (eg lactose) solubilizers (eg glutamic acid, aspartic acid). These are sterilized, for example, by filtration through a bacteria-retaining filter, blending with a bactericide, or irradiation. These can also be used by producing a sterile solid composition and dissolving it in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Examples will be described below, and the method for identifying a compound having a cholesterol-lowering action, a cholesterol-lowering agent and a compound of the present invention will be described in more detail.
Example 1 (Method for identifying compound having cholesterol-lowering action)
(1) Construction of activation vector
In order to identify compounds having the ligand effect of PPARδ and PPARγ, the DNA binding domain (GAL4-DNA binding domain, GAL4-DBD) of the yeast transcriptional activation protein GAL4 and the ligand binding domain (LBD) of PPAR Fusion gene expression vectors (the three activation vectors prepared were named GAL-PPARα, GAL-PPARδ, and GAL-PPARγ) were constructed. The operation consists of three steps: i) cloning of PPAR-LBD in the first step, ii) construction of a fusion vector by introduction into a GAL4-DBD gene-containing vector, and iii) subcloning of the third step into an expression vector. (J. Biol. Chem., 270 (22), p12953-12956, 1995, Cell, 83, p803-812, 1995).
i) The ligand binding region (PPAR-LBD) of a peroxisome proliferator-activated receptor (mPPAR; mouse peroxisome proliferator-activated receptor; mPPARα, mPPARδ, mPPARγ) was amplified by PCR (polymerase chain reaction). As the template used for amplification, total RNA was prepared from mouse adipose testicular adipose tissue using total RNA extraction reagent Isogen (manufactured by Nippon Gene) according to the attached manual. The nucleotide sequences of the primers synthesized to clone the gene encoding the ligand binding region of each PPAR subtype are as follows: mPPARα (Gly ¹⁶⁵ ~ Tyr ⁴⁶⁷ ); 5'-TTC CCG GGG ATG TCA CAC AAT GCA ATT CGC-3 '(SEQ ID NO: 1) and 5'-TTG GAT CCT CAG TAC AAA ATG TCT CTG TAG ATC TC-3' (SEQ ID NO: 2), mPPARδ ( Met ¹³⁷ ~ Tyr ⁴³⁹ ); 5'-TTC CCG GGC ATG TCG CAC AAC GCT AT-3 '(SEQ ID NO: 3) and 5'-TTG GAT CCT TAG TAC ATG TCC TTG TAG ATT-3' (SEQ ID NO: 4), mPPARγ (Gly ¹⁷² ~ Tyr ⁴⁷⁴ ); 5'-TTC CCG GGG ATG TCT CAC AAT GCC ATC-3 '(SEQ ID NO: 5) and 5'-TTG GAT CCC TAA TAC AAG TCC TTG TAG AT-3' (SEQ ID NO: 6). PCR reaction was performed using GeneAmp PCR system 9600 type.
ii) A recognition sequence was inserted in advance on one side of the synthesized primer so that it could be cleaved with restriction enzymes SmaI or BamHI. The amplified PCR fragment was a pGBT9 DNA-Binding Domain Vector (5.5 kb, GAL4-DBD region and ampicillin resistance gene Amp that had been cleaved with SmaI and BamHI. ^R The vector thus prepared was named pGBT9-PPAR-LBD.
iii) The fusion gene region (GAL4-DBD + PPAR-LBD) that combines GAL4-DBD and PPAR-LBD contained in pGBT9-PPAR-LBD is excised using HindIII / SalI, and the expression vector, pZeoSV (3.5 kb, Zeocin resistance gene Zeo ^R It was introduced into a multiple cloning site (MCS) having a sequence (manufactured by Clontech) using HindIII / XhoI. The GAL4-DBD and PPAR-LBD chimeric protein expression vectors thus obtained were named GAL-PPARα, GAL-PPARδ, and GAL-PPARγ, respectively.
(2) Construction of reporter vector
Construction of a reporter vector (hereinafter referred to as RE-LUC) using luciferase gene expression as an index consists of i) creating a GAL4 response element as the first step, and ii) subcloning into a luciferase expression vector as the second step. It consists of two steps (J. Biol. Chem., 270 (22), p12953-12956, 1995, Cell, 83, p803-812, 1995).
i) GAL4-DBD binding sequence [GAL4 responsive element; GAL4 responsive element, RE, or UAS _G ] Was synthesized using a DNA synthesizer (Beckman DNA synthesizer Oligo1000M, manufactured by Beckman) once (RE × 1) and 3 times. Appropriate restriction enzyme sites were inserted at both ends, and these were combined to produce a sequence fragment (RE × 4) repeated 4 times. Further, a sequence fragment (RE × 8) was repeated 8 times using these.
ii) A DNA fragment in which the TATA box part was linked to the GAL4 response element (RE × 8) was prepared by PCR, and the luciferase assay system vector [Picagene Vector 2 (PGV-B2), Toyo Ink Manufacturing Co., Ltd.] This was inserted 5'-side upstream of the luciferase gene sequence (RE-LUC). The nucleotide sequence of the insert region containing REx8 and TATA box included in the created RE-LUC is the sequencing kit (PRISM ^TM Ready Reaction DyeDeoxy ^TM After preparing a sample using Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), the base sequence was confirmed using a sequencer (ABI 373A DNA sequencer, Applied Biosystems). When RE-LUC containing RE × 8 is introduced into cells together with GAL-PPARγ and CS-045 (troglitazone), which is a ligand of PPARγ, is added, the resulting ligand responsiveness (luciferase activity) RE × 8 was used in this evaluation test because it showed the strongest activity compared to other (RE × 2, × 3, × 4, × 5, × 6, × 10) having different values.
(3) Measurement of PPARα, PPARδ and PPARγ activation
Using the activation vector and reporter vector prepared in the above items (1) and (2), the following three steps [i) co-transfection of the construct into the host, ii) cell treatment by addition of the compound, iii) reporter gene The measurement of expression level] measured the PPAR activation effect of the compounds.
i) (Co-transfection of construct into host)
HepG2 cells (American Type Culture Collection, Meryland, USA) 1 x 10 per well ^Four Dulbecco's modified Eagle's medium [200 μl / well, supplemented with fetal bovine serum (FCS) at a concentration of 10% at a concentration of 10% in a collagen type IV-treated 96-well plate (Iwaki Co., Ltd.) for 2 days. The cells were cultured in the presence of FCS-DMEM (GIBCO BRL). Thereafter, the cells were washed with 100 μl / well cell culture medium OPTI-MEM I Reduced Serum Medium (GIBCO-BRL) kept at 37 ° C., and the DNA-containing solution [per well of a 96-well plate (50 μl added solution) Containing the following components: 0.01 μg GAL-PPARα or -PPARδ or -PPARγ, 0.1 μg RE-LUC luciferase vector, 0.02 μg pCH110 eukaryotic expression vector [β-galactosidase expression vector (gene transfer efficiency (For correction), manufactured by Pharmacia Biotech Co., Ltd.], 1 μl of LipofectAMINE (GIBCO BRL), which was dissolved in OPTI-MEM with stirring for 15 minutes at room temperature], and incubated at 37 ° C. for 3 hours .
ii) (Cell treatment by compound addition)
The cells were washed twice with 100 μl of 10% FCS-DMEM and the test compound (10 ^-Four M was replaced with 200 μl of 10% FCS-DMEM containing 5% dimethyl sulfoxide (DMSO), and the culture was continued at 37 ° C. for a further 48 hours.
iii) (Measurement of reporter gene expression level)
After removing the medium, 100 μl of a solubilization buffer for luciferase activity measurement (1-fold diluted solution, manufactured by Picagene) was added per well and left at room temperature for 15 to 30 minutes. 20 μl of this was dispensed to another measuring plate, 100 μl of luciferase substrate solution (Piccagene) was added, and the amount of luminescence for 10 seconds using an AB-2100 chemiluminescence measuring device (Ato) Luciferase activity) was determined. Simultaneously with the addition of the luciferase gene, the amount of activity expressed by the intracellular introduction of the added β-galactosidase expression gene was measured, and the change in luciferase activity due to the addition of the compound was corrected by the transfection efficiency of the transgene. The β-galactosidase activity was measured according to the manual of Promega Corp. (Methods Enzymol., 152, p704-720, 1987, Biotechniques, 7, p576, 1989).
20 μl of the solubilized sample was collected in another 96-well plate, and 100 μl of ONPG solution (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, Promega) was added and incubated at 37 ° C. for 90 minutes. 50 μl of a reaction terminator (1M sodium carbonate solution, Promega) was added, and the absorbance at 415 nm was measured at room temperature. Relative ligand activity was calculated by setting the luciferase activity value (control value) of cells treated only with dimethyl sulfonyloxide (DMSO, 0.5% concentration) used as a solvent to 1.0 (Table 1).
As a result, it was confirmed that YM-16638 and Production Example 1 have PPARδ and γ activating effects.
【table 1】

Example 2 (Evaluation test for serum cholesterol lowering effect using rhesus monkey)
According to the method described in Br. J. Pharmacol., 118, p174-178, 1996, a serum cholesterol lowering action evaluation test using rhesus monkeys was performed.
i) For male rhesus monkeys (purchased from Hamley) weighing approximately 4.5-5 kg, 50 g of puriner powder feed (Code # 5408, manufactured by Oriental Yeast) per animal and 50 ml of water and vitamin C (5 mg) / kg / day, manufactured by Sigma) was added to a solid and 50 g and about 100 g of banana were provided twice a day for breeding. It was confirmed that rhesus monkeys reared under these conditions had no significant weight fluctuation.
ii) The monkeys adapted to the control diet were divided into 4 control groups and 3 administration groups, the compound-free feed was used for the control group, and YM-16638 was 30 mg / kg / day for the administration group. The same feed added and prepared so as to be 30 mg / kg / day was administered twice a day. Banana was given after feeding 50g of feed to avoid uneaten feed.
iii) Both groups were raised with the above feed for 2 weeks, and blood was collected from the thigh under the condition of fasting from about 16 hours before the last day of administration. Blood was collected before and after administration of the test drug, and after body weight measurement. Serum was separated from the collected heparinized blood, and total cholesterol (TC) and LDL-cholesterol (LDL-C) were determined by an enzymatic method using a Hitachi 736-10 automatic analyzer (Table 2).
The rate of decrease was calculated by comparison with the pre-dose value.
[Table 2]

As a result, it was confirmed that YM-16638 and Production Example 1 showed an excellent serum total cholesterol (TC) lowering action, particularly an LDL-cholesterol (LDL-C) lowering action.
Production Example 1
Methyl 4-hydroxyphenylacetate (5.00 g), 1,3-dibromopropane (12.15 g) and potassium carbonate (8.32 g) were stirred in 30 ml of N, N-dimethylformamide at room temperature for 3 nights. After adding 200 ml of ice water and extracting with ethyl acetate (200 ml × 1), the organic layer was washed with water (150 ml × 1) and dried over anhydrous magnesium sulfate. After filtration, the filtrate was concentrated to obtain 8.12 g of residue. 2.87 g of this residue, 1.94 g of 2-propyl-3-hydroxy-4-acetylphenol, and 2.76 g of potassium carbonate were stirred in 30 ml of N, N-dimethylformamide at room temperature overnight. After adding 200 ml of ice water and extracting with ethyl acetate (200 ml × 1 time), the organic layer was washed with water (200 ml × 1 time) and dried over anhydrous magnesium sulfate. After filtration, 4.30 g of the residue obtained by concentrating the filtrate was subjected to silica gel column chromatography (Merck, Kieselgel 60). 1.63 g of F254 (developing solvent: chloroform) was obtained. 1.63 g of this precursor was heated to reflux in 40 ml of methanol and 20.4 ml of 1N aqueous sodium hydroxide for 1 hour. After allowing to cool, 40 ml of 1N aqueous hydrochloric acid was added. The precipitated crystals were collected by filtration, washed with methanol / water, and then dried under reduced pressure to obtain 1.13 g of p- [3- (4-acetyl-3-hydroxy-2-propylphenoxy) propoxy] phenylacetic acid. Obtained.
Melting point: 106-108 ℃
Elemental analysis value (C _{twenty two} H ₂₆ O ₆ As)

Infrared absorption spectrum νmax (KBr) cm ^-1 :
2968, 1700, 1638, 1586, 1520, 1504, 1472, 1420, 1378, 1274, 1250, 1126, 1066, 814, 790.

Claims

p- [3- (4- acetyl-3-hydroxy-2-propyl phenoxy) propoxy] phenylacetic acid or a pharmaceutical composition for lowering LDL- cholesterol containing a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient .

A method for identifying a compound having LDL-cholesterol lowering action, comprising measuring a peroxisome proliferator-activated receptor PPARδ activating action and selecting a compound having a peroxisome proliferator-activated receptor PPARδ activating action A method characterized by that.