JP4276439B2 - ポリチオ尿素の脂質誘導体 - Google Patents

Description

本出願は、２００１年６月１３日出願の米国特許仮出願第６０／２９７，４８２号の利益を主張し、また２００１年５月１４日出願のフランス特許仮出願第０１０６３３０号に基づく優先権を主張するものであって、これら２つの出願の内容は参照してここに組み込まれる。
本発明は、核酸を細胞に導入することを可能にする新規化合物に関する。それらは、インビトロ、半ビボ又はインビボでの様々な細胞型への核酸のトランスフェクションのために有用である。

バイオテクノロジーの発達と共に、核酸を細胞内に有効に導入できることが必要となってきた。それは、例えば組換えタンパク質の生産のために、又は遺伝子の発現の調節、遺伝子のクローニング又はＤＮＡに関わる他の何らかの操作を検討するために研究室において、インビトロで細胞内に核酸を導入することを含みうる。また、例えばトランスジェニック動物の創造、ワクチンの生産、標識試験あるいはまた治療アプローチのために、インビボで細胞内に核酸を導入することも含みうる。また、骨髄移植、免疫療法又はその後の再投与のために生物から採集した細胞への遺伝子の導入に関わる他の方法を含むアプローチにおいて、半ビボで細胞内に核酸を導入することも含みうる。

外来性遺伝物質の細胞内送達のためにいくつかの方法が提案されてきた。それらの１つは、特に、全く危険性がないとは言えないウイルス法に対して極めて好都合な代替法を構成する、非ウイルスベクターの使用に基づく。これらの合成ベクターは２つの主要な機能を有する：導入される核酸と複合して核酸を緊密化すること、及び形質膜及びおそらくは核エンベロープを横切る核酸の通過を促進すること。

例えばポリマー又は選択的に生化学的ベクター（細胞受容体リガンドと結合したカチオンタンパク質から成る）のように、いくつかのファミリーの合成ベクターが開発されてきたが、重要な進歩は、特にリポフェクタントの開発、より特定するとカチオン脂質の開発によって為された。カチオン脂質は、それらの全体的な正電荷のために、全体として負であるＤＮＡに自発的に干渉して、ヌクレアーゼからＤＮＡを保護すること及びＤＮＡの細胞内放出のために細胞膜に結合することができるヌクレオ脂質複合体を形成することが明らかにされた。

これまでに様々なタイプのカチオン脂質が合成されている：第四級アンモニウム基を含む脂質（例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＬＲＩＥ等）、例えばＤＯＧＳ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ又は選択的に特許願ＷＯ９７／１８１８５号に開示されているリポポリアミンのようなリポポリアミン、第四級アンモニウム基とＤＯＳＰＡのようなポリアミンの両方を含む脂質、又は選択的に様々な他のカチオン単位、特にアミジニウム基を含む脂質（例えばＡＤＰＤＥ、ＡＤＯＤＥ又は特許願ＷＯ９７／３１９３５号の脂質）。

しかし、これらのカチオン脂質をトランスフェクション剤として使用することにはまだ数多くの問題があり、それらの効率も改善の余地がある。特に、効率的で安定なヌクレオ脂質複合体を得るためには、一般に、これらの複合体が高度に陽イオン性である必要があることが認められた。しかし、核酸と共に、全体として中性又は陰性である粒子を形成するためには、陽イオン性でないベクターが利用可能であることが望ましいであろう。実際に、核酸とカチオン脂質の間で形成される全体として陽イオン性の複合体は、それらの排出を誘導する細網内皮系によって捕獲される傾向があることが認められている。さらに、形成される複合体の全体的正電荷のために、血漿タンパク質がそれらの表面に吸着する傾向があり、これはトランスフェクション力の低下をもたらす。さらに、局所注入に関して、大きな全体的正電荷の存在は、複合体が細胞外マトリックスに吸着するため、核酸複合体が投与部位から遠くへと拡散するのを妨げる；複合体は、それ故、標的細胞に到達することができず、結果として注入された複合体の量に比べて導入効率の低下を生じさせる。最後に、多くの場合、カチオン脂質は炎症作用を有することも認められている。

本発明の目的は、明白に、そのポリチオ尿素官能基の故に革新的であり、インビトロ、半ビボ又はインビボでの核酸のトランスフェクションのために効率的に使用することができる新規トランスフェクション化合物を提供することである。これらの新規化合物は、
−それらの構造から正電荷が存在しないことにより、上記で論じたカチオンベクターの使用によって引き起こされる多くの問題を解決することが可能になり、
−カチオン脂質と同じように、核酸と複合して核酸を緊密化することができ、且つそれらのトランスフェクションを促進することができる
ので、特に有益である。

本発明の第一の対象は、従って、スペーサーによって脂質に結合されたポリチオ尿素部分から成ることを特徴とするトランスフェクション化合物である。

特に、本発明の対象は、一般式（Ｉ）：

［式中、
・ｌは、０及び１から選択される整数であり、
・ｎは、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり、
・ｍは、２、３及び４から選択される整数であり、ｍは、種々の基−［ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−（ＣＨ）_ｍ］−の中で異なる値をとることが可能であり、
・Ｒ’は、一般式（ＩＩ）：

［式中、ｑは、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり、及びｐは、２、３及び４から選択される整数であり、ｐは、種々の基−［（ＣＨ_２）_ｐ−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ］−の中で異なる値をとることが可能である］
の基を表わし、
・Ｒは、水素原子又は上記で定義した一般式（ＩＩ）の基のいずれかを表わし、ｎが１であり、及びｌが０であるとき、少なくとも１個のＲ基は式（ＩＩ）であることは明白であり、
・Ｘは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、１個から８個の炭素原子を含む飽和又は不飽和直鎖又は環状脂肪族基、メルカプトメチル（−ＣＨ_２ＳＨ）基、又は選択的に次の群：
−（ＣＨ_２）_ｘ−（ＣＨＯＨ）_ｕ−Ｈ［式中、ｘは１〜１０から選択される整数であり、及びｕは１、２、３、４、５及び６から選択される整数である］、又は選択的に、
−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｖ−Ｈ［式中、ｖは、１、２及び３から選択される整数である］
から選択される親水鎖を表わし、１個以下の置換基Ｘは、式（Ｉ）及び（ＩＩ）の両方において、親水鎖を表わすことは明白であり、
・Ｙはスペーサーを表わし、
・及びＬは、
−Ｎ（Ｒ_１）Ｒ_２基［式中、Ｒ_１とＲ_２は、互いに独立して、水素原子又は選択的に脂肪族鎖を表わす］、又は選択的に式−（ＣＨ_２）_ｔ−ＯＺの基［式中、ｔは、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される整数を表わし、及びＺは、糖、ポリオール又はＰＥＧを表わす］、但し、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１個は水素原子でないことは明白である、
・若しくは−ＯＲ_３基［式中、Ｒ_３はステロイド誘導体を表わす］
を表わす］
のトランスフェクション化合物である。

本発明によれば、「スペーサー」の語は、分子のポリチオ尿素部分と脂質部分の間の結合を提供すること、及びこれら２つの部分の間の望ましくない切断を減弱させるためにそれらを離して保持することの両方を可能にする化学基を意味すると理解される。好ましいスペーサーは、例えば、１個から６個の炭素原子を有するアルキル、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は芳香環から選択される１個又はそれ以上の化学官能基で構成されうる。例えば、スペーサーは、式：
−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２−
又は、−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｗ−（ＣＨ_２）_ｊ−
［式中、ｉ及びｊは、１から６まで（両端を含む）から選択される整数であり、及びＷは、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は選択的に芳香環から選択される基である］
の群から選択されうる。

本発明のために、「脂肪族鎖」の表現は、脂質特性を示すことを条件として、飽和又は不飽和で、任意に１個又はそれ以上のヘテロ原子を含む、１０個から２２個の炭素原子を有するアルキル基を意味すると理解される。好ましくは、それらは、１０個から２２個の炭素原子及び１、２又は３個の不飽和を含む直鎖又は分枝アルキル基である。好ましくは、前記アルキル基は、１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２２個の炭素原子を含む。より特定すると、脂肪族基、−（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_１３ＣＨ_３、−（ＣＨ_２）_１５ＣＨ_３及び−（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３が挙げられよう。

「糖」の語は、本発明のために、１個又はそれ以上のサッカリドから成る分子を意味すると理解される。例として、ピラノース及びフラノースなどの糖類、例えばグルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトース又は選択的にマルトース、ラクトース、サッカロース、スクロース、フコース、セロビオース、アロース、ラミナラビオース、ゲンチオビオース、ソフォロース、メリビオース等が挙げられるであろう。好ましくは、糖（類）は、グルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、サッカロース及びセロビオースから選択される。さらに、この語は、いわゆる「複合」糖質、すなわち互いに共有結合しているいくつかの糖も包含し、各々の糖は、好ましくは上記に列挙したリストから選択される。適切な多糖類として、デキストラン、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン、マンナン、キシラン及びアラビナンが挙げられよう。一部の好ましい糖は、さらに、例えばある種のレクチンのように、細胞受容体と相互作用しうる。

本発明によれば、「ポリオール」の語も、少なくとも２個のヒドロキシル官能基を含む直鎖、分枝又は環状炭化水素分子を意味すると理解される。例として、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、テトリトール、ペンチトール、環状ペンチトール（又はケルシトール）、マンニトール、ソルビトール、ダルシトール、環状ヘキシトール又はイノシトールなどのヘキシトール等が挙げられるであろう（Ｓｔａｎｅｋら、Ｔｈｅ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，６２１−６５５ページ及び７７８−８５５ページ）。好ましい態様に従えば、ポリオールは、一般式：

［式中、ｓは２、３、４、５及び６から選択される］
のアルコールから選択される。

本発明による一般式（Ｉ）の化合物がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含むとき、後者は一般に２個から１２０個、好ましくは２個から８０個の−ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ−単位を含む。これは、単純ＰＥＧ、すなわちその鎖がヒドロキシル基で終わるもの、又はその末端基がアルキルから選択される、例えばメチルである、ＰＥＧを包含しうる。

本発明のために、「ステロイド誘導体」の表現は、コレスタン型の多環式化合物を意味すると理解される。これらの化合物は、天然であるか又はそうでなくてもよく、より好ましくはコレステロール、コレスタノール、３−α−５−シクロ−５−α−コレスタン−６−β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレスタニル、３α、５−シクロ−５α−コレスタン−６β−イルギ酸塩、コレステリルアミン、６−（１，５−ジメチルヘキシル）−３ａ，５ａ−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ［ａ］シクロプロパ［２，３］−シクロペンタ［１，２−ｆ］ナフタレン−１０−イルアミン、又はコレスタニルアミンから選択される。

本発明の好ましい変法に従えば、トランスフェクション化合物は、一般式（ＩＩＩ）：

［式中、Ｘ、ｍ、ｎ及びＹは、ｎが１ではないこと、及びＲ_１とＲ_２が、互いに独立して、水素原子又は脂肪族鎖を表わすことを除いて、一般式（Ｉ）において定義したとおりであり、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１個が水素ではないことは明白である］
を有する。

より好ましくは、本発明のトランスフェクション化合物は、一般式（ＩＶ）：

［式中、ｍ、ｎ及びＹは、ｎが１ではないこと、及びＲ_１とＲ_２が、互いに独立して、水素原子又は脂肪族鎖を表わすことを除いて、一般式（Ｉ）において定義したとおりであり、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１個が水素ではないことは明白である］
を有する。

本発明がまた、一般式（Ｉ）の生成物の異性体が存在するときには一般式（Ｉ）の生成物の異性体、ならびにそれらの混合物も対象とすることは明白である。

本発明による一般式（Ｉ）の化合物の製造は、次の段階を提示されている順序で又は他の何らかの既知の変法及び等しく適切な変法に従って使用して、当業者に周知である、溶液中又は保持体上での従来の有機合成手法を用いて、実施される。

１）脂質部分Ｌの製造
一般式（Ｉ）の化合物の脂質部分Ｌが−Ｎ（Ｒ_１）Ｒ_２基［式中、Ｒ_１及び／又はＲ_２は脂肪族鎖を表わす］によって表わされるときは、最初に、式ＨＮ（Ｒ_１）Ｒ_２のアミンを生成する。前記アミンは、一方が置換基Ｒ_１を含み、他方が置換基Ｒ_２を含む、カルボン酸とアミンを縮合して、対応するアミドを生成し、次にそのようにして得た前記アミドを還元することによって入手しうる。

アミドの生成は、成分を混合し、当該物質の融点より高い温度、一般には２０℃から２００℃に加熱して融解し、その後媒質を脱水して生成された水を除去することによって、又はより好都合には、例えば五酸化リンのような乾燥剤又は水分を吸収することができる他の何らかの物質の存在下で、好都合に実施される。この中間体アミドの生成はまた、この方法の変法を使用して、若しくはカルボン酸又はそれらの誘導体を含む、アミド（例えばペプチド共役型のような）を生成するためのもう１つ別の方法を使用して、及び当業者に周知の条件及び試薬を変化させて［Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ］実施しうる。

前記で得たアミドの、式ＨＮ（Ｒ_１）Ｒ_２のアミンへの還元は、例えば水素化アルミニウムウリチウムなどの還元剤、若しくはこの場合に有効な他の何らかの水素化物又は還元剤を使用して実施しうる。その手順は、好ましくは、溶媒の沸点より低い温度で又は無水及び／又は不活性ガス体下に、非プロトン性溶媒（例えばテトラヒドロフラン又はエーテル）中で実施する。

もう１つの変法に従えば、ＨＮ（Ｒ_１）Ｒ_２と称される脂質部分は、市販のものを入手してもよい。

Ｒ_１及び／又はＲ_２が式−（ＣＨ_２）_ｔ−ＯＺの基を表わすとき、手順は、アルキル部分を生成するために上述したように実施し、その後、当業者に既知の従来の手法に従って市販のＰＥＧ、ポリオール又は糖と単純カップリングする。

一般式（Ｉ）の化合物の脂質部分Ｌが−ＯＲ_３基で表わされるとき、後者は、好ましくは市販の製品から選択される。

２）スペーサーＹの連結
次に、先の段階で得た脂質部分Ｌに、当業者に既知の従来の手法に従ってスペーサーＬを結合する。好ましい変法に従えば、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の何らかのエーテルのような適切な溶媒中、溶媒の沸点より低い温度で、及び無水及び／又は不活性ガス体下に、脂質部分ＬをＮ−アシル化してアミド結合を形成する。この反応は、好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンのようなアミン含有塩基の存在下で、若しくはトリエチルアミン又はエチルジイソプロピルアミンのような非求核アミン含有塩基と混合したこの塩基の存在下で実施する。ピリジンも、単独で又はもう１つ別の塩基と混合して使用するか、上述した溶媒の１つで希釈してもよく、若しくはそれ自体を溶媒として使用してもよい。

３）ポリチオ尿素鎖の形成
一般式（Ｉ）の化合物の合成の第三の部分は、チオ尿素単位の連続的な導入である。これは、所望ポリチオ尿素部分を得るために必要な回数だけ反復しうる一連の反応において実施する。好ましい方法によれば、その手順は次のような実施する：
Ａ）最初に、先の段階で得たＹ−Ｃ（Ｏ）−Ｌに、−ＨＮ−（ＣＨＲ）_ｍ−基の成員の形態で単位の最初の部分を連結する。そのために、手順は、カップリング剤、例えば、保持されているか又は保持されていない、１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又はテトラフルオロボレート（ＨＢＴＵ又はＴＢＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、又は１−（３−トリメチルアンモニオプロピル）−３−エチルカルボジイミドヨージドの存在下に、ジアミンを含有する、式Ｈ_２Ｎ−（ＣＨＲ）_ｍ−ＮＨ_２の成員から出発して好都合に実施される。このカップリングは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の何らかのエーテルのような適切な溶媒中、溶媒の沸点より低い温度で、及び無水及び／又は不活性ガス体下で実施する。この手順はまた、非求核アミン含有塩基、例えばエチルジイソプロピルアミン、トリエチルアミン又はトリイソプロピルアミンの存在下でも実施される。脂質部分とスペーサーの性質が適合性であれば、ＳＣＮ−（ＣＨＲ）_ｍ−型の配列又は前駆体を連結することができ、それによって、下記のＣ）で述べるような段階を通して合成を継続することが可能となる。

Ｂ）次に、先の段階で得た生成物を、好ましい手法に従って、二硫化炭素（ＣＳ_２）で又はそのような官能性を得るための当業者に既知の他の試薬で処理することによってイソチオシアネートに変換する［Ｈ．Ｕｌｒｉｃｈ，イソシアネートの化学と技術（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓ），Ｗｉｌｅｙ（１９９６）、イソシアネートの化学とそのチオ誘導体（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃｙａｎａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｔｈｉｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ），Ｓ．Ｐａｔａｉ編集、Ｗｉｌｅｙ（１９７７）、Ｓ．Ｏｚａｋｉ，イソシアネート化学の近年の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７２，４５７（１９７２）］。この反応は、例えばテトラヒドロフラン又は他の適合性エーテル溶媒のような溶媒中、冷却混合物の温度から約２０℃までの間の温度で好都合に実施される。この手順はまた、反応を促進する及び／又は反応中に放出される硫化水素を捕獲することができる試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下でも実施される。

Ｃ）次に、適切な場合には、式−（ＣＨＲ）_ｍ−のもう１つのセグメントを導入できるように、先の段階で得たイソチオシアネートからチオ尿素単位を生成する。好都合には、任意に保護された、式Ｈ_２Ｎ−（ＣＨＲ）_ｍ−ＮＨ_２のジアミンを、その中性形態又は酸性塩の形態で、先の形態で得たイソチオシアネートと反応させる。この反応は、任意に、非求核アミン含有基、例えばトリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、トリイソプロピルアミン又は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）の存在下で実施する。その手順は、好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の適合性のエーテル又は溶媒のような適切な溶媒中、冷却混合物の温度から溶媒の還流温度までの間でありうる温度で実施する。

所望単位をｎコピー数分導入できるように、所望構造が得られるまで連続的に必要なだけ上述した段階Ｂ）及びＣ）を反復する。分枝構造を得るには、前記の手順を、適切な時点で、式（ＩＩ）で述べた置換基Ｒを得るために必要な分子を導入することによって同様に実施する。

４）置換基Ｘを導入することによるポリチオ尿素部分の末端
ポリチオ尿素型の鎖の末端を生成する最後の段階は、置換基Ｘを導入することである。そのために、置換基Ｘの性質に従って選択される、当業者に既知である従来の連結方法を使用する。例えば、Ｘがアルキルを表わすときは、必要であれば、例えばトリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、トリイソプロピルアミン又は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）のような非求核アミン含有塩基の存在下で、アルキルイソチオシアネートを反応させることによって手順を実施する。その反応は、適切な溶媒中、例えばジクロロメタン、クロロホルム、テトラヒドロフラン又は他の適合性エーテル中、冷却混合物の温度から溶媒の還流温度までの温度で実施する。

当然ながら、様々な置換基が反応に干渉しうるときには、分子の残りの部分に影響を及ぼすことなく配置し、除去することができる適合性の基であらかじめ保護することが好ましい。そのために、当業者に既知の従来の方法に従って、特にＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＭｃＯｍｉｅ，有機化学における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、又はＰ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ，保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ），Ｔｈｉｅｍｅの中で述べられている方法に従って、手順を実施する。

さらに、製造方法の各々の段階のあとに、適切な場合には、当業者に既知の何らかの方法に従って得た化合物を分離し、精製するための段階を実施してもよい。

本発明による好ましい化合物は：
ここではＤＴＴＵ又はＤＴ−３ＴＵと称する、３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチル）−１−メチルチオ尿素は、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ_３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝３；ｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ_１）Ｒ_２［式中、Ｒ_１＝Ｒ_２＝Ｃ_１４Ｈ_２９］である］に対応する。この化合物のＤＴ−３ＴＵという名称は、その中に含まれる３個のチオ尿素基を指す；さらに、この命名法の例は、４個のチオ尿素を含むＤＴ−４ＴＵ、２個のチオ尿素を含むＤＴ−２ＴＵ等々を含む。

３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［ジテトラデシルカルバモイル］プロピオニルアミノ｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−１−メチルチオ尿素又はＤＴ−４ＴＵは、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ_３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝４；ｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ_１）Ｒ_２［式中、Ｒ_１＝Ｒ_２＝Ｃ_１４Ｈ_２９］である］に一致する。

ＤＴ−３ＴＵジオール又は［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールの合成は、一般式（Ｉ）［式中、

に従う。

ＤＴ−２ＴＵジオール又は［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールは、一般式（Ｉ）［式中、

に一致する。

本発明のもう１つの対象は、本発明によるトランスジェニック化合物と核酸を含有する組成物に関する。各々の成分のそれぞれの量は、使用するトランスフェクション化合物、核酸及び所望適用（特にトランスフェクトする細胞型）に応じて、当業者によって容易に調整されうる。

本発明のために、「核酸」の表現は、デオキシリボ核酸及びリボ核酸の両方を意味すると理解される。それらは、天然又は人工配列、特にゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡキメロプラスト又は合成又は半合成配列のようなハイブリッド配列、及び修飾された又は修飾されていないオリゴヌクレオチドでありうる。これらの核酸は、ヒト、動物、植物、細菌又はウイルス由来等でありうる。それらは、当業者に既知の何らかの手法によって、特にライブラリーのスクリーニングによって、化学合成によって、又はライブラリーのスクリーニングによって得た配列の化学修飾又は酵素的修飾を含む混合方法によって入手しうる。それらは化学修飾されていてもよい。一般に、それらは少なくとも１０、２０、５０又は１００個の連続ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含む。さらに一層好ましくは、それらは少なくとも５００個の連続ヌクレオチドを含む。

より特定のデオキシリボ核酸に関して、それらは一本鎖又は二本鎖のいずれでもよく、ならびに短いオリゴヌクレオチド又はより長い配列のいずれでもよい。特に、該核酸は、好都合にはプラスミド、ベクター、エピソーム、発現カセット等から成る。これらのデオキシリボ核酸は、標的細胞において機能性であるか又はそうでない原核生物又は真核生物複製基点、１個又はそれ以上のマーカー遺伝子、転写又は複製を調節するための配列、治療的重要性を持つ遺伝子、修飾されている又は修飾されていないアンチセンス配列、他の細胞成分に結合するための領域等を担いうる。

好ましくは、該核酸は、調節配列の制御下の１個又はそれ以上の治療的重要性を持つ遺伝子、例えば１個又はそれ以上のプロモーター及び標的細胞において活性な転写終結信号を含む。

本発明のために、治療的重要性を持つ遺伝子の表現は、特に治療作用を有するタンパク質産物をコードする遺伝子を意味すると理解される。そのようにコードされるタンパク質産物は、特にタンパク質又はペプチドでありうる。このタンパク質産物は、標的細胞に関して外来性、相同性又は内因性でありうる、すなわち標的細胞が病的状態を有していないとき、標的細胞において正常に発現される産物でありうる。この場合、タンパク質の発現は、例えば、細胞における不十分な発現又は修飾のために不活性であるか又は活性が低いタンパク質の発現を補うこと、若しくは前記タンパク質を過剰発現することを可能にする。治療的重要性を有する遺伝子はまた、高い安定性、変化した活性等を有する、細胞タンパク質の突然変異体をコードしうる。前記タンパク質産物はまた、標的細胞に関して非相同でもよい。この場合、発現されるタンパク質は、例えば、細胞において欠損している活性を補足するか又は提供して、細胞が病的状態に対抗することを可能にするか、若しくは免疫応答を刺激しうる。

本発明のための治療的生成物の中で、より特定すると、酵素、血液誘導体、ホルモン、リンホカイン及びサイトカインならびにそれらの阻害因子又は拮抗物質：インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、インターロイキン１の拮抗物質、インターロイキン１又はＴＮＦαの可溶性受容体等（ＦＲ９２／０３１２０号）、成長因子、神経伝達物質又はそれらの前駆体又は合成酵素、栄養因子（ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＨＡＲＰ／プレイオトロフィン等）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等、ＦＲ９３／０５１２５号）、ジストロフィン又はミニジストロフィン（ＦＲ９１／１１９４７号）、嚢胞性線維症に関連するＣＦＴＲタンパク質、癌抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ等、ＦＲ９３／０４７４５号）、凝固に関わる因子（第ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ因子）をコードする遺伝子、ＤＮＡ修復に関わる遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビン又は他のタンパク質担体に関する遺伝子、代謝酵素、異化酵素等が挙げられよう。

治療的重要性を持つ核酸はまた、標的細胞におけるその発現が遺伝子の発現又は細胞ｍＲＮＡの転写を制御することを可能にする、遺伝子又はアンチセンス配列又はリボソーム機能を有するＲＮＡをコードするＤＮＡでありうる。そのような配列は、例えば、欧州特許欧州特許第１４０３０８号に述べられている手法に従って、標的細胞内で細胞ｍＲＮＡに相補的なＲＮＡに転写されて、それらがタンパク質へと翻訳されるのを遮断することができる。治療遺伝子はまた、標的ＲＮＡを選択的に破壊することができるリボザイムをコードする配列を含む（欧州特許第３２１２０１号）。

上述したように、該核酸はまた、ヒト又は動物において免疫応答を生じることができる抗原性ペプチドをコードする１個又はそれ以上の遺伝子を含みうる。この特定実施形態において、本発明は、ワクチンの生産又は、特に感染、例えばウイルス又は細菌感染、若しくは癌状態を治療する又は予防するために、ヒト又は動物に適用される免疫療法処置の実施を可能にする。それらは特に、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（欧州特許第１８５５７３号）、仮性狂犬病ウイルス、シンシチウム（合胞体）形成ウイルス、他のウイルスに特異的な抗原性ペプチド、又は腫瘍に特異的な抗原性ペプチド（欧州特許第２５９２１２号）でありうる。

好ましくは、該核酸はまた、所望細胞又は器官において、治療的重要性を持つ遺伝子及び／又は抗原性ペプチドをコードする遺伝子の発現を可能にする配列を含む。それらは本来、これらの配列が感染細胞において機能することができるとき、考慮される遺伝子の発現の責任を担う配列でありうる。それらはまた、異なる由来の（他のタンパク質の発現の責任を担う、又はさらには合成の）配列でありうる。特に、それらは真核生物又はウイルス遺伝子のプロモーター配列でありうる。例えば、それらは、感染を所望する細胞のゲノムから誘導されるプロモーター配列でありうる。同様に、それらはウイルスのゲノムから誘導されるプロモーター配列でありうる。これに関しては、例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ及びＲＳＶ遺伝子のプロモーター等が挙げられるであろう。さらに、これらの発現配列は、活性化配列又は調節配列の付加等によって修飾されうる。そのプロモーターはまた、誘導的又は抑制的でありうる。

さらに、該核酸はまた、特に治療的重要性を持つ遺伝子の上流に、標的細胞の分泌経路において治療的生成物の合成を指令するシグナル配列を含みうる。このシグナル配列は、治療的生成物の天然シグナル配列でありうるが、他の何らかの機能的シグナル配列又は人工シグナル配列であってもよい。該核酸はまた、合成された治療的生成物を細胞の特定画分へと指令するシグナル配列も含みうる。

本発明による組成物は、さらに、トランスフェクション化合物／核酸複合体と組み合わせて、そのトランスフェクション力を改善することができる１つ又はそれ以上のアジュバントを含有しうる。もう１つの実施形態では、本発明はそれ故、核酸、上記で定義したトランスフェクション化合物、及びトランスフェクション化合物／核酸複合体と組み合わせてそのトランスフェクション力を改善することができる少なくとも１つのアジュバントを含有する組成物に関する。この種のアジュバント（例えば脂質、ペプチド、タンパク質又はポリマー）の存在は、好都合にも、前記化合物のトランスフェクション力を高めることを可能にしうる。これに関して、本発明の組成物は、アジュバントとして、特に脂質凝集物を形成する特性を有する１つ又はそれ以上の中性脂質を含有しうる。「脂質凝集物」の語は、あらゆる種類のリポソーム（単層及び多重膜の両方）ならびにミセル又はより無定形の凝集物を包含する総称名である。

より好ましくは、本発明の枠内で使用する中性脂質は、２つの脂肪鎖を含む脂質である。特に好都合には、生理的条件下で両性イオン性であるか又はイオン電荷を持たない天然又は合成脂質を使用する。それらは、より特定すると、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに１回から３回Ｎ−メチル化されているそれらの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシドなど）、スフィンゴ脂質（特にスフィンゴミエリンなど）、又はアシアロガングリオシド（特にアシアロＧＭ１及びＧＭ２など）から選択されうる。好都合には、本発明に関して使用する脂質アジュバントは、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ又はコレステロールから選択される。

これらの様々な脂質は、当業者に周知の従来の手法により、合成によって若しくは器官（例えば脳）又は卵からの抽出によって、入手しうる。特に、天然脂質の抽出は有機溶媒によって実施しうる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙも参照のこと）。

好ましくは、本発明の組成物は、モル／モルで核酸１当量につき０．０１当量から２０当量のアジュバント、より好ましくは０．５モル当量から５モル当量を含有する。

もう１つの選択法に従えば、本発明による組成物のトランスフェクション力を改善することを可能にする上述したアジュバント、特にペプチド、タンパク質又はポリエチレングリコールのようなある種のポリマーは、本発明によるトランスフェクション化合物と、単に混合するのではなく複合してもよい。この場合、それらは、一般式（Ｉ）における置換基Ｘに、又はアルキル鎖が脂肪族鎖であるときにはアルキル鎖Ｒ_１及び／又はＲ_２の末端に、共有結合される。また、コレステロールに共有結合したポリエチレングリコール（ｃｈｏｌ−ＰＥＧ）をアジュバントとして使用することも好都合である。実際に、そのようなアジュバントを本発明によるトランスフェクション組成物と共に使用するとき、生じる粒子はより小さなサイズを有しており、それによってそれらの凝集を低下させ、血液循環におけるそれらの半減期を上昇させる。本発明により使用するトランスフェクタントＤＴ−３ＴＵの量は、粒子が５００ｎｍ未満の大きさを有するような量である。使用するＤＴ−３ＴＵの好ましい量は、少なくとも４０ｎｍｏｌの脂質ＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡ
に等しい（下記の実施例１１、１３及び１４参照）。

特に好都合な実施形態によれば、本発明の組成物は、さらに、核酸の導入を方向づけることを可能にする標的エレメントを含む。この標的エレメントは、核酸の導入をある種の細胞型又はある種の所望組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞等）へと方向づけることを可能にする細胞外標的エレメントでありうる。それはまた、核酸の導入をある種の好ましい細胞画分（ミトコンドリア、核等）へと方向づけることを可能にする細胞内標的エレメントでありうる。標的エレメントは、本発明によるトランスフェクション化合物及び核酸と混合してもよく、この場合、標的エレメントは、好ましくは脂肪アルキル鎖（少なくとも１０個の炭素原子）又はポリエチレングリコールに共有結合する。もう１つの選択法に従えば、標的エレメントは、置換基Ｘ又はスペーサーＹのレベルで、若しくはＲ_１及び／又はＲ_２が脂肪族鎖を表わすときはＲ_１及び／又はＲ_２の末端で、本発明によるトランスフェクション化合物に共有結合する。最後に、標的エレメントはまた、上記で規定したとおりである核酸に結合しうる。

本発明の枠内で使用しうる標的エレメントの中でも特に、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ビタミン又はそれらの誘導体が挙げられるであろう。好ましくは、それらは、糖、ペプチド、ビタミン、又は例えば抗体又は抗体フラグメント、細胞受容体のリガンド又はそのフラグメント、受容体又は受容体フラグメントなどのタンパク質である。例えば、それらは、成長因子受容体のリガンド、サイトカイン受容体、細胞レクチン型受容体、葉酸塩受容体、又はインテグリンのような接着タンパク質についての受容体に親和性を有するＲＧＤ配列含有リガンドでありうる。また、トランスフェリン、ＨＤＬ及びＬＤＬについての受容体、又は葉酸輸送体も挙げられよう。標的エレメントはまた、シアリルルイスＸ、又は選択的に抗体のＦａｂフラグメント、又は一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）などの、アシアロ糖タンパク質又はシアリドについての受容体のようなレクチンを標的することを可能にする糖でありうる。

本発明の対象はまた、インビトロ、インビボ又は半ビボで核酸を細胞に導入するための、上記で定義したトランスフェクション化合物の使用である。より正確には、本発明の対象は、疾患、特にタンパク質又は核生成物の欠損から生じる疾患を治療することを意図した薬剤の製造のための、本発明によるトランスフェクション化合物の使用である。前記薬剤に含有されるポリヌクレオチドは、前記タンパク質又は核生成物をコードするか、若しくはインビボ又は半ビボで前記疾患を矯正することができる前記核生成物を構成する。

インビボでの使用のために、例えば治療において、若しくは遺伝子の調節又は病的状態の動物モデルの創造を検討するために、本発明による組成物は、局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内、経皮、気管内又は腹腔内経路等による投与用に製剤することができる。好ましくは、本発明の組成物は、注射用製剤、特に所望器官への直接注射のため、又は局所経路（皮膚及び／又は粘膜上）による投与のための、医薬適合性の賦形剤を含有する。それらは特に等張無菌溶液、又は、場合によって、無菌水又は生理食塩水を添加して注射用溶液に還元することができる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物でありうる。注射のために使用する核酸の用量ならびに投与回数は、様々なパラメータに従って、特に使用する投与様式、該当する病的状態、発現される遺伝子、又は所望治療期間に従って、適合させうる。より特定して投与様式に関しては、組織内への、例えば腫瘍のレベルでの直接注射、又は循環系への注入、又は培養細胞の処理とそれに続く注入又は移植によるインビボでのそれらの再移植のいずれかでありうる。本発明の枠内での該当組織は、例えば、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、直腸、神経系、眼、腺、結合組織等である。

本発明のもう１つの対象は、次の段階：
（１）該核酸を本発明によるトランスフェクション化合物と接触させて複合体を形成すること；及び
（２）該細胞を（１）で形成された複合体と接触させること
を含む、核酸を細胞に導入する方法に関する。

本発明は、さらに、次の段階：
（１）該核酸を本発明によるトランスフェクション化合物と接触させて複合体を形成すること；及び
（２）ヒト又は動物の身体の細胞を（１）で形成された複合体と接触させること
を含む、ヒト又は動物の身体を治療する方法に関する。

該細胞は、前記複合体と共に細胞をインキュベートすることによって（インビトロ又は半ビボでの使用のため）、又は前記複合体を器官内に注入することによって（インビボでの使用のため）、複合体と接触させうる。一般に、投与を意図する核酸の量は、例えば治療する又は予防する疾患、核酸の実際の性質、プロモーターの強さ、核酸によって発現される産物の生物活性、個人又は動物の生理状態（体重、年齢等）、投与様式及び製剤の種類のような、数多くの因子に依存する。一般に、前記のインキュベーションは、好ましくは、例えば１０^６細胞につき０．０１μｇから１０００μｇの核酸の存在下で実施する。インビボでの投与については、例えば０．０１ｍｇから５０ｍｇの範囲の核酸用量が使用しうる。投与は、単回投与として実施するか又は間隔をおいて反復しうる。

本発明の組成物が、さらに、上記で定義した１つ又はそれ以上のアジュバントを含む場合、そのアジュバントは、本発明によるトランスフェクション化合物及び／又は核酸とあらかじめ混合しうる。選択的に、ヌクレオ脂質複合体の投与の前にアジュバントを投与してもよい。

もう１つの好都合な選択法に従えば、組織を、トランスフェクションを改善することを意図した化学的又は物理的処理に供してもよい。物理的処理の場合は、エレクトロトランスファーの場合のような電気パルス、又はソドポレーション（ｓｏｄｏｐｏｒａｔｉｏｎ）の場合のような機械的力を使用しうる。

本発明は、それ故、インビボで核酸を導入するため、特に疾患の治療のための、タンパク質をコードする又は前記疾患を供することができる核酸に転写されうる核酸のインビボ又はインビトロでの投与を含み、前記核酸が上記で定義した条件下で本発明によるトランスフェクション化合物と結合している、特に好都合な方法を提供する。

本発明のトランスフェクション化合物は、一次細胞又は樹立細胞系に核酸を導入するために特に有用である。それらは、分化した形態又は多能性形態（前駆体）の、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞（ニューロン、神経膠星状細胞、グリア細胞）、肝細胞、造血細胞（リンパ球、ＣＤ３４、樹状細胞等）、上皮細胞等でありうる。

本発明のもう１つの対象はまた、本発明による１つ又はそれ以上のトランスフェクション化合物及び／又はそれらの混合物を含むトランスフェクションキットに関する。そのようなキットは、例えばバイアル又はチューブのような様々な容器を収納するように区画分けされた包装の形態で提供されうる。これらの容器の各々は、個別の又は混合された、トランスフェクションを実施するために必要な様々なエレメント：例えば本発明による１つ又はそれ以上のトランスフェクション化合物、１つ又はそれ以上の核酸、１つ又はそれ以上のアジュバント、細胞等を含む。

前記の説明に加えて、本発明はまた、本発明の範囲を限定することなく本発明を例示するものとみなされるべきである、下記の実施例及び図面から生じる他の特徴及び利点も包含する。特に、出願人は、限定を伴わずに、本発明によるトランスフェクション化合物を製造するために使用しうる操作プロトコールならびに反応中間体を提示する。言うまでもなく、このプロトコール又は中間生成物から、これらの同じ化合物に到達するための同様の方法を開発する教示を引き出すことは、当業者の能力の範囲内である。

（使用する略語）
ＥｔＢｒ：臭化エチジウム
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＰＰＣ：１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＤＴＴＵ：３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチル）−１−メチルチオ尿素（ＤＴ−３ＴＵとも称する）
ＥＰＣ：Ｌ−α−ホスファチジルコリン９５％（卵）
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＴＢＥ：トリス−ボレート−ＥＤＴＡ
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
本発明を下記の非制限的実施例によって例示する。

（実施例）
トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、二硫化炭素、テトラデシルアミン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート、４−ジメチルアミノピリジン、又はジイソプロピルエチルアミンなどの慣用試薬及び触媒は、市販のものを入手した。

プロトン核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ３００、４００及び６００ＭＨｚ分光計で記録した。化学的変化はｐｐｍ（ｐａｒｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ、百万分量単位中の絶対数）で表わし、重複する用語は慣用略語で表わした。

下記の文中で、使用した核酸は、サイトメガロウイルスＣＭＶ Ｅ／Ｐプロモーターの制御下のルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子を含む、出版物「遺伝子治療（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」（１９９９），１４８２−１４８８ページに述べられているプラスミドｐＸＬ３０３１であった。このプラスミドは図７に示されている。その大きさは３６７１塩基対である。使用したプラスミド溶液は、注射用に水中で１．２６２ｇ／ｌに希釈した。

ＤＴ−３ＴＵの合成
ここではＤＴＴＵ又はＤＴ−３ＴＵと称する、３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチル）−１−メチルチオ尿素は、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ_３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝３；ｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ_１）Ｒ_２又はＲ_１＝Ｒ_２＝Ｃ_１４Ｈ_２９］に対応する。

ａ）ジテトラデシルアミド（１）の合成
テトラデカン酸（３０ｇ）１３１．６ｍｍｏｌ及びテトラデシルアミン（３０ｇ）１４０．８ｍｍｏｌを、乾燥剤（Ｐ_２Ｏ_５）の入った捕集フラスコに接続された磁気攪拌機を備える丸底フラスコ中で混合した。次のその反応混合物を減圧下で（５０ｍｍＨｇ）１７０℃に４時間加熱した。その粗物質をＴＨＦ（７００ｍｌ；可溶化を助けるためにわずかに加熱した）に可溶化し、その後過剰のアミンに結合するために４当量のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５樹脂（８ｇ）を加えた。２０分間攪拌したあと、その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して白色固体５５．１１ｇを得た（収率：９９％）。

ｂ）ジテトラデシルアミン（２）の合成
ジテトラデシルアミド（２０ｇ）４７ｍｍｍｏｌを、冷却機と乾燥管を備えた丸底フラスコ中で、窒素下に、無水ＴＨＦ７００ｍｌに溶解した。その混合物を０℃に冷却し、その後水素化アルミニウムリチウムＬｉＡｌＨ_４（３．４ｇ）８９ｍｍｏｌを加えた。添加後、その混合物を、強く攪拌しながら還流下で５時間加熱した。ひとたび反応が完了すれば、水３．４ｍｌ、１Ｎ水酸化ナトリウム６．８ｍｌ及び水３．４ｍｌを連続的に加えることによって加水分解を実施するために、前記混合物を０℃に冷却した。室温で１時間攪拌した後、粗反応物質をブフナー漏斗でろ過し、ろ液を濃縮した。得られた生成物を、次に、攪拌しながら３０分間、ＴＨＦ３００ｍｌ中１．５当量のＡ−１５樹脂（１５ｇ）で精製した。その樹脂をろ過し、ＴＨＦ３００ｍｌに再溶解して、２当量のトリエチルアミン（１９．２ｍｌ）を加えた。３０分間攪拌したあと、その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して、白色固体１７．７２ｇを得た（収率：９２％）。

ｃ）Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルスクシンアミド酸（３）の合成
無水コハク酸（１．２６６ｇ）１２．６５ｍｍｏｌ、４−ジメチルアミノピリジン（１．５４６ｇ）１２．６５ｍｍｏｌ及びジテトラデシルアミン（４．４０７ｇ）１０．７５ｍｍｏｌを、丸底フラスコ中のジクロロメタン１２５ｍｌに連続的に添加した。その反応混合物を室温で１８時間攪拌した。ひとたび反応が完了すれば、その混合物をジクロロメタンと塩酸（１Ｎ）で抽出した。次にその有機相をブラインで洗い、硫酸マグネシウムで乾燥して、ろ過し、濃縮して、生成物（３）４．２１ｇを得た（収率：６６％）。

ｄ）２−アミノエチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（４）の合成
ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（４ｇ）１８．６ｍｍｏｌを、窒素下で、クロロホルム（２０ｍｌ）中のエチレンジアミン（６．１７ｇ）１０２．８３ｍｍｏｌの溶液に滴下した。次にその反応混合物を室温で１８時間攪拌した。ひとたび反応が完了すれば、その溶液を濃縮した。生じた油をジクロロメタンに溶解し、飽和炭酸ナトリウム水溶液で洗った。次のその有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して、濃縮した。その粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール９：１）によって精製し、生成物（４）２．３８ｇを得た（収率：８０％）。

ｅ）２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（５）の合成
ＰｙＢＯＰ（４．６０１ｇ）８．８４ｍｍｏｌ、前の段階で得たアミン（４）（１．５５８ｇ）９．７２ｍｍｏｌ及びジイソプロピルエチルアミン（４．２４ｍｌ）２４．３１ｍｍｏｌを、ジクロロメタン８８ｍｌ中の上記で得た酸（３）（４．５ｇ）８．８４ｍｍｏｌの溶液に連続的に添加した。次にその溶液を室温で４時間攪拌した。反応終了時に、その反応混合物をろ過し、その生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン／酢酸エチル５：５及びその後ヘプタン／酢酸エチル２：８）によって精製した。このようにして該エステル（５）３．７９ｇを得た（収率：６６％）。

ｆ）２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチルアミン（６）の合成
蒸留したＴＦＡ（０．９４ｍｌ）１２．２ｍｍｏｌを、前の段階で得たエステル（５）（１．５９ｇ）２．４４ｍｌに加えた。２時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器においてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。

ｇ）（（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）アミノ）エチルイソチオシアネート（７）の合成
ＤＣＣ（９．０１５ｇ）４３．６９ｍｍｏｌ、ＴＨＦ２７．５ｍｌ中の二硫化炭素（１７．９ｍｌ）２９７．９ｍｍｏｌを連続的に丸底フラスコに加えた。その混合物を氷と塩化アンモニウムＮＨ_４Ｃｌ（４／１）の浴で−７℃に冷却した。次に、無水ＴＨＦ２０．５ｍｌに溶解した、上記で得たアミン（４）（７ｇ）４３．６９ｍｍｏｌを３０分間かけて滴下した。その混合物を室温に戻し、その混合物を２１時間攪拌し続けた。蒸発後、ジエチルエーテルを加え、形成されたジシクロヘキシル尿素を沈殿させた。その溶液をろ過し、ろ液を濃縮して、その後フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン／酢酸エチル８０：２０）によって精製し、所望生成物（７）６．３５７ｇを得た（収率：７２％）。

ｈ）２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（８）の合成
トリエチルアミン（１．３６ｍｌ）９．７６ｍｍｏｌを上記で得たアミン（６）（１．６２ｇ）２．４４ｍｍｏｌに直接加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン２４．４ｍｌ及び前の段階で得たイソチオシアネート（７）（０．５９ｇ）２．９２ｍｍｏｌを加えた。その反応混合物を室温で１２時間攪拌した。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン６：４及びその後酢酸エチル１００％）によって精製した。このようにして所望エステル（８）１．３４３ｇを得た（収率：７３％）。

ｉ）２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチルアミン（９）の合成
蒸留したＴＦＡ（０．７６ｍｌ）９．８６ｍｍｏｌを前の段階で得た生成物（８）（１．５ｇ）１．９８ｍｍｏｌに加えた。３時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器を用いてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。

ｊ）２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝−チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（１０）の合成
トリエチルアミン（１．１ｍｌ）７．９２ｍｍｏｌを前の段階で得たアミン（９）（１．４７ｇ）１．９８ｍｍｏｌに直接加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン１９．８ｍｌ及び上記で得たイソチオシアネート（７）（０．４６１ｇ）２．３８ｍｍｏｌを加え、攪拌しながら室温で１２時間反応を進行させた。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン６：４及びその後酢酸エチル／メタノール９８：２）によって精製した。このようにして所望生成物（１０）１．１３６ｇを得た（収率：６７％）。

ｋ）２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］エチル｝チオウレイド）エチル］チオウレイド｝エチルアミン（１１）の合成
蒸留したＴＦＡ（０．４５ｍｌ）５．８４ｍｍｏｌを前の段階で得た生成物（１０）（１ｇ）１．１５ｍｍｏｌに加えた。３時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器においてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その収率は定量的であった。

ｌ）ＤＴ−３ＴＵ（１２）の合成
トリエチルアミン（０．１６ｍｌ）１．１２ｍｍｏｌを前の段階で得たアミン（１１）（０．２４ｇ）０．２８ｍｍｏｌに直接加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ジクロロメタン２．８ｍｌ及びメチルイソチオシアネート（０．０２４ｇ）０．３４ｍｍｏｌを加え、攪拌しながら室温で１２時間反応を進行させた。次にその混合物を蒸発させ、次の勾配：最初は水／メタノール９５：５混合物からメタノール１００％までで、Ｃ_４カラムでのＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって精製した。得られた生成物を小さなシリカカラム（酢酸エチル／ヘプタン８０：２０及びその後酢酸エチル１００％）で再び精製した。このようにしてＤＴＴＵ １１８ｍｇを得た（収率：５１％）。

ＤＴ−４ＴＵの合成
３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［ジテトラデシルカルバモイル］プロピオニルアミノ｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−１−メチルチオ尿素又はＤＴ−４ＴＵは、一般式（Ｉ）［式中、Ｘ＝−ＣＨ_３；ｍ＝２；Ｒ＝Ｈ；ｎ＝４；及びｌ＝０；Ｙ＝ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２；及びＬ＝−Ｎ（Ｒ_１）Ｒ_２［式中、Ｒ_１＝Ｒ_２＝Ｃ_１４Ｈ_２９］］に一致する。

ＤＴ−４ＴＵの合成のために、アミン（１１）を出発物質として使用した。

ａ）２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチルカルバミン酸のｔｅｒｔ−ブチルエステル（１３）の合成

トリエチルアミン（０．６４３ｍｌ、４．６ｍｍｏｌ）を前記アミン（１１）（０．８ｇ、０．９２ｍｍｏｌ）に加え、その混合物を１５分間攪拌し続けた。次に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（９．２ｍｌ）をその混合物に加え、次いでイソチオネート（７）（０．２２４ｇ、１．１０４ｍｍｏｌ）を加えて、その反応混合物を攪拌下に室温で２０時間反応させた。その後、その混合物を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘプタン８：２、次いで酢酸エチル／メタノール９０：１０）で精製して、所望生成物２５２ｍｇを得た（収率４６％）。

ｂ）２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチルアミン（１４）の合成

蒸留したＴＦＡ（０．１４２ｍｌ、１．８４ｍｍｏｌ）を前の段階で得たアミンｂｏｃ（１３）（０．２２ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）に加えた。６時間後、反応が完了した。その生成物を、低温状態で回転蒸発器を用いてシクロヘキサンと共に２回同時蒸発させた。その生成物を一晩デシケーター内で水酸化ナトリウム上に置いた。その収率は定量的であった。

ｃ）３−（２−｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［ジテトラデシルカルバモイル］プロピオニルアミノ｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−１−メチルチオ尿素（ＤＴ−４ＴＵ）（１５）の合成

トリエチルアミン（１．３８ｍｍｏｌ、０．１９ｍｌ）を前の段階で得たアミン（１４）（０．２３ｍｍｏｌ、０．２２４ｇ）に直接加え、その反応混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２．３ｍｌ）及びメチルイソチオシアネート（０．４６ｍｍｏｌ、０．０３４ｇ）を加え、その反応混合物を攪拌下に室温で１２時間放置した。次にその混合物を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（１００％酢酸エチル、次いで酢酸エチル／メタノール９５：５）によって精製した。このようにしてＤＴ−４ＴＵ １０９ｍｇを得た（収率：５１％）。

ＤＴ−２ＴＵジオールの合成
ＤＴ−２ＴＵジオール又は［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールは、一般式（Ｉ）［式中、

に従って定義される。

ａ）４−イソチオシアナトメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキサラン（１６）の合成

ＤＣＣ（３．１４６ｇ、１５．２５ｍｍｏｌ）及びＴＨＦ（９．６０７５ｍＬ）中の二硫化炭素（６．２５３ｍｌ、１０４．００５ｍｍｏｌ）を連続的に丸底フラスコに加えた。その混合物を、氷／ＮＨ_４Ｃｌ（４：１）浴を用いて−７℃に冷却し、無水ＴＨＦ（７．１６７５ｍＬ）に溶解した２，２−ジメチル−１，２−ジオキサラン−４−メタンアミン（２ｇ、１５．２５ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。その反応混合物を室温に戻し、２１時間攪拌し続けた。蒸発後、ジエチルエーテルを加えた。その混合物をろ過し、蒸発させて、クロマトグラフィーによって精製した。

ｂ）２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル｝−４−イルメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキサラン（１７）の合成

ジイソプロピルエチルアミン（０．９５ｍｍｏｌ、０．１６５ｍｌ）を前の段階で得たアミン（９）（０．１９ｍｍｏｌ、０．１４６ｇ）に直接加え、その反応混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．９ｍｌ）及びイソチオシアネート（１６）（０．２０９ｍｍｏｌ、０．０２７ｇ）を加え、その反応混合物を攪拌下に室温で１２時間反応させた。次にその混合物を蒸発させ、１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。４９％の収率で生成物（１７）を得た。

ｃ）［２−（３−｛２−［３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオール（ＤＴ−２ＴＵジオール）（１８）の合成

保護されたジオール（１７）（０．０５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を室温でＨＣｌ １Ｎ／ＴＨＦ（１／１）１ｍＬに溶解し、その反応混合物を１８時間攪拌した。次にその反応混合物をジクロロメタン（２×５ｍｌ）で抽出し、有機相を一緒に混合して、炭酸水素ナトリウムで中和した。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、その後溶媒を蒸発させた。得られた生成物を１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。４９％の収率で生成物（１８）を得た。

ＤＴ−３ＴＵジオールの合成
ＤＴ−３ＴＵジオールの合成のために、アミン（１１）を出発物質として使用した。

ＤＴ−３ＴＵジオール又は｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオールの合成は、一般式（Ｉ）［式中、

に従う。

ａ）２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］エチル｝−チオウレイド）−エチル−４−イルメチル−２，２−ジメチル−［１，３］ジオキサラン（１９）の合成

ジイソプロピルエチルアミン（０．９５ｍｍｏｌ、０．１６５ｍｌ）を前の段階で得たアミン（１１）（０．１９ｍｍｏｌ、０．１６５ｇ）に直接加え、その反応混合物を１５分間攪拌し続けた。その後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．９ｍｌ）及びイソチオシアネート（１６）（０．２０９ｍｍｏｌ、０．０２７ｇ）を加え、その反応混合物を攪拌下に室温で１２時間反応させた。次にその混合物を蒸発させ、１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。４９％の収率で生成物（１９）を得た。

ｂ）｛３−［２−（３−｛２−［３−（２−｛３−［２−（３−（ジテトラデシルカルバモイル）プロピオニルアミノ）−エチル］−チオウレイド｝−エチル）−チオウレイド］−エチル｝−チオウレイド）−エチル］−プロパン−１，２−ジオール（ＤＴ−３ＴＵジオール）（２０）の合成

保護されたジオール（１９）（０．０５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を室温でＨＣｌ １Ｎ／ＴＨＦ（１／１）１ｍＬに溶解し、その反応混合物を１８時間攪拌した。次にその反応混合物をジクロロメタン（２×５ｍｌ）で抽出し、有機相を一緒に混合して、炭酸水素ナトリウムで中和した。水相をジクロロメタンで抽出した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、その後溶媒を蒸発させた。得られた生成物を１００％水から１００％アセトニトリルまでの勾配で逆相液体クロマトグラフィーＣ８によって精製した。５５％の収率で生成物（１８）を得た。

ＤＴ−３ＴＵの存在下での核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸と結合する能力を示すことである。

これは臭化エチジウムによる蛍光試験によって容易に明らかにすることができる：蛍光が存在しないことは遊離核酸が存在しないことを示唆し、それは核酸がトランスフェクション化合物によって緊密化されたことを意味する。

該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＤＴ−３ＴＵ（１２）と接触させた。０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＤＴ−３ＴＵ（１２）を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した。

同様に、該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＥＰＣ（図１参照）又はＤＰＰＣ（図２参照）と接触させることにより、対照を調製した。このようにして、０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＥＰＣ又はＤＰＰＣを含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した（それぞれ図１及び図２）。

臭化エチジウム蛍光を、それぞれ２６０ｎｍと５９０ｎｍの励起及び発光波長でＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を使用して経時的に測定した（２０℃で測定）。励起と発光のためのスリット幅は５ｎｍに設定した。ＤＮＡ／脂質溶液（０．０１ｍｇＤＮＡ／ｍｌ）１ｍｌにつき臭化エチジウム（１ｇ／ｌ）３μｌを加えた後、蛍光値を記録した。

その結果を図１及び２に要約した。

図１において、四角記号の曲線は、固定量の核酸（８μｇ）に対する漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ）の添加が、ＤＮＡの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導することを示している。これは、ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、９０％までの蛍光の排除を得ることができ、これは９０％のＤＮＡ−ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ脂質結合であった。この脂質／ＤＮＡ結合におけるＤＴ−３ＴＵ脂質の積極的な役割を示すため、対照を調製した。それは、ＥＰＣ脂質とＤＮＡの間の相互作用を観察することであり、ダイアモンド形記号の曲線で表わしている。ＥＰＣを、ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ−ＤＮＡ複合体の試験で使用したのと同じ条件下でＤＮＡに接触させたとき、蛍光の弱い低下だけが認められ（約５％）、これは混合物の混濁度の上昇によるものと考えられる。この対照は、それ故、上述した実験条件下でＥＰＣ単独とＤＮＡの結合が存在しないことを反映している。

この実施例は、それ故、核酸に結合するＤＴ−３ＴＵ脂質の能力を示している。

同様に、図２において、四角記号の曲線は、同一量の臭化エチジウムを様々な試料に加えたとき、固定量の核酸（８μｇ）に対する漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌのＤＴＴＵ）の添加が蛍光の低下を誘導することを示している。これは、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、９０％のＤＮＡ−ＤＴＴＵ／ＤＰＰＣ結合に当たる、９０％までの蛍光の排除を得ることができた。この脂質／ＤＮＡ結合におけるＤＴＴＵ脂質の積極的な役割を示すため、対照を調製した。それは、ＤＰＰＣ脂質とＤＮＡの間の相互作用を観察することであり、ダイアモンド形記号の曲線で表わしている。ＤＰＰＣを、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ−ＤＮＡ複合体の試験で使用したのと同じ条件下でＤＮＡに接触させたとき、蛍光の弱い低下だけが認められた（約５％）。この対照は、それ故、上述した実験条件下でＤＰＰＣ単独とＤＮＡの結合が存在しないことを反映している。

この実施例は、それ故、ＤＴ−３ＴＵ脂質の核酸に結合する能力を例示している。

ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ複合体によるＤＮＡの緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸を緊密化する能力を示すことである。

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる：ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じなかった。

ＤＮＡに対して漸増量のＤＴＴＵ脂質を含む様々なＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に沈着させた。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、そのゲルを１時間半７０Ｖ及び７０ｍＡの電流に供した。バンドをＥｔＢｒ及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図３に示した。

ゲルは、ＤＮＡが脂質と結合しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及びＤＮＡが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル２〜６は、漸増量のＤＴＴＵ／ＥＰＣリポソーム：０．７５、次いで５、次いで１０、次いで１５及び最後に２０ｎｍｏｌのＤＴＴＵ脂質と結合したＤＮＡ（０．０１ｇ／ｌ）を示す。ウエル１と他のウエルとの比較は、ＤＴ−３ＴＵ脂質の量が高いほど、より多くのＤＮＡがゲル上に保持され、複合体の凝集の範囲である３ｎｍｏｌのＤＴＴＵ／μｇＤＮＡからは全面的に遅滞した。ウエル８−１３はそれぞれ、ＤＮＡ単独（０．１ｇ／ｌ、ゲルについて１μｇ）、脂質／ＤＮＡ比：０．７５又は５又は１０又は１５の、０．１ｇ／ｌ ＤＮＡの濃度で形成されるリポプレックス及び最後に２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡに対応する。同様に、インビボ実験と適合性であるＤＮＡのこの濃度では、５ｎｍｏｌ脂質／μｇＤＮＡの割合からＤＮＡが緊密化された。

この実施例は、それ故、ＤＴ−３ＴＵ脂質の核酸を緊密化する能力を示している。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＮＡ組成物のζ電位の測定
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、全体的な陰イオン性、中性又は非常に弱い陽イオン性構造を保持しながら核酸を緊密化する能力を示すことである。

これは、ζ電位の測定によって明らかにしうる；ｍＶで表わした測定値は、試料の電気泳動移動度に対する粒子の表面電荷を示す。

該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ脂質混合物と接触させた。０．０１ｇ／ｌの濃度の核酸複合体２ｍｌの試料を、漸増量のＤＴ−３ＴＵを含む２０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した。

ゼータサイズ測定器３０００ Ｈｓａ（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いてζ電位（ｍＶ）の測定を実施した。ＤＴ−３ＴＵ／ＥＰＣ−ＤＮＡ試料２ｍｌに関して電位の値を３回連続して測定した。その結果を図４に要約した。

ＤＮＡμｇ当り０．７５ｎｍｏｌから２０ｎｍｏｌ脂質の範囲内でＤＴＴＵ／ＥＰＣリポソームをＤＮＡに加えた。脂質量のこの変動範囲内で、ζ電位は−３５ｍＶから＋１５ｍＶまで変動する。負の部分は図１、２及び３に示すものに相当し、すなわちＤＮＡが完全に緊密化されていないときζ電位は負であった。より多くの脂質を加えるほどより多くのＤＮＡが緊密化され、ζ電位はより一層ゼロに近づき、リポプレックスは事実上ゼロの表面電位を示す。その後ζ電位は８ｎｍｏｌ脂質／μｇＤＮＡ付近から正となる。この測定の相対性については、同じ実験の中の様々な試料の比較を考慮に入れるべきである。従って、弱い正の値までの脂質量の増加の関数としてのζ電位の推移に注目することが重要である。

この実施例は、それ故、本発明によるトランスフェクション化合物、特にＤＴ−３ＴＵによるＤＮＡの緊密化を確認し、形成されるリポプレックスが中性に近い表面電位を示すことを明らかにしている。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＮＡ組成物のインビトロでのトランスフェクション
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビトロで細胞をトランスフェクトする能力を示すことである。

この試験は、様々な量のＤＴ−３ＴＵ：１．５又は５又は１０又は１５又は２０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを含むリポプレックスについて実施した。これらの条件の各々を、ウシ胎仔血清と共に及びウシ胎仔血清なしで（「＋血清」又は「−血清」）で試験した。

細胞培養：ヒト頸部上皮の癌から誘導したＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡを、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０単位／ｍｌのペニシリン及び５０単位／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＭＥＭ（「最小必須培地」）型培地の存在下で培養した。培地及び添加物は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）より入手した。細胞を、インキュベーターにおいて５％二酸化炭素、３７℃で、フラスコ内で培養した。

トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、ＨｅＬａ細胞を３０，０００〜５０，０００細胞／穴の細胞数で２４０穴プレートに移した。これらの希釈度は、２４時間後に約８０％の集密度を示す。トランスフェクションのために、細胞を２回洗い、血清を含む（１０％ＦＣＳｖ／ｖ）又は血清を含まない培地５００μｌと共に３７℃でインキュベートした。

プラスミドＤＮＡ０．５μｇを含む複合体５０μｌを各々の穴に加えた（複合体は少なくとも穴に添加する３０分前に調製した）。３７℃で２時間後、血清を含まないプレートに１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ（「ウシ胎仔血清」）を補足した。

すべてのプレートを３７℃、５％二酸化炭素で２４時間放置した。

ルシフェラーゼ活性の定量：簡単に述べると、トランスフェクションした細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）５００μｌで２回洗い、その後、試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍキットのＰｒｏｍｅｇａ細胞培養溶解試薬）２５０μｌで溶解した。４℃で５分間遠心分離した（１２，０００×ｇ）溶解産物の上清１０μｌのアリコートをＷａｌｌａｃｅ Ｖｉｃｔｏｒ ２ルミノメーター（１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ）で測定した。

ルシフェラーゼ活性は、ルシフェリン、補酵素Ａ及びＡＴＰの存在下で発光によって１０秒間検定し、２０００処置細胞に関して表わした。次にルシフェラーゼ活性を相対光単位（ＲＬＵ、ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）で表わし、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて得られた試料中のタンパク質濃度に関して基準化した。

図５に要約する結果は、５又は１０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを含むリポプレックスについての最適トランスフェクション効率を示している。血清の存在は、すべての場合に、トランスフェクションの弱い阻害を誘導する。

細胞に対するＤＴＴＵ／ＤＮＡリポプレックスの毒性の測定
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物に毒性がないことを示すことである。

トランスフェクション後に該タンパク質レベルを測定した。トランスフェクションのプロトコールは実施例８で述べたのと同じであった。

タンパク質レベルの定量：簡単に述べると、トランスフェクションした細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）５００μｌで２回洗い、その後、試薬（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍキットのＰｒｏｍｅｇａ細胞培養溶解試薬）２５０μｌで溶解した。４℃で５分間遠心分離した（１２，０００×ｇ）溶解産物の上清５０μｌのアリコートを、０．１Ｍヨードアセトアミド５０μｌ、ｐＨ８．２の０．１Ｍ塩酸トリスの入った管に移し、３７℃で１時間放置した。前記溶液２０μｌを９６穴プレートに入れ、「ＢＣＡタンパク質アッセイ」試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍｏｎｔｌｕｓｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）２００μｌを加えた。次にプレートを２５００回転／分で遠心分離し、その後３７℃で３０分間インキュベートした。平行して、試料に関して得た吸光度値を試料中に存在するタンパク質の量と相関させるために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）レンジを調製した。

図６に要約する結果は、０．７５又は５又は１０又は１５又は２０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを含むリポプレックスという使用条件に関わりなく、同様のタンパク質レベルを示している。ＤＴＴＵ脂質の存在は、それ故、細胞に有害な影響を及ぼさず、使用した条件下で毒性を認めなかった。

この実施例は、それ故、本発明によるトランスフェクション化合物の重要な利点の１つ、すなわち、おそらくそれらの構造内に正電荷が存在しないことに結びついた非常に低い毒性を示している。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤による核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸と結合する能力を示すことである。

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる：ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じない。

ＤＮＡに対して種々の製剤のＤＴ−３ＴＵ脂質を含む様々なＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、そのゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドをＴＢＥ及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図８に示した。

同様に、アガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）を使用し、その上に、ＤＮＡに対して種々の製剤のＤＴ−３ＴＵジオール脂質を含むＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵジオールの様々な試料を置いて、ＤＴ−３ＴＵジオール化合物がＤＮＡを緊密化する能力を示す。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、ゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。

ゲルは、ＤＮＡが脂質と結合しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及びＤＮＡが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル２〜５は、カルシウム及びエタノールを含む又は含まないＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ（６０ｎｍｏｌＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡ）ナノ乳剤と結合したＤＮＡ（０．０１ｇ／ｌ）を示す。ウエル２は、Ｃａ^２＋及びエタノールを含まない６０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡを示す。ウエル３には、２％のＥｔＯＨを加えた。ウエル４では、６０当量のＣａ^２＋／ＰＯ⁻ ＤＮＡを加えた。ウエル５には、２％のＥｔＯＨと６０当量のＣａ^２＋を加えた。ウエル１と他のウエルとの比較は、検討した種々のＤＴ−３ＴＵ製剤がゲル上のＤＮＡ移動を遅延させることを示唆している。Ｃａ^２＋及びＥｔＯＨの透析後、同じ結果を認めた。

この実施例は、それ故、種々の製剤に組み込まれたＤＴ−３ＴＵ脂質が核酸を緊密化する能力を示している。

安定化ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ複合体による核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸に結合する能力を示すことである。

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる：ゲル上の核酸の移動が存在しないことは核酸の緊密化を示唆する。遊離核酸については、ゲル上での遅延を生じない。

コレステロール−ＰＥＧに結合した又は結合していないＤＮＡに対して漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質を含む様々なＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ及びＤＮＡ／ＤＴ−３ＴＵジオール／ＤＰＰＣ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、そのゲルを１時間半７０Ｖ及び７０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図９に示す。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ製剤においてコレステロール−ＰＥＧを使用することは、脂質−ＰＥＧが存在しない場合は凝集を導くであろうような脂質の量まで粒子サイズを縮小することを可能にするという利点を持つ。この結果の興味深い点は、インビボで注入するトランスフェクション化合物の量を最適化することである。実際に、血清タンパク質を潜在的対象とするのに必要な粒子の大きさは、血流中での半減期を上昇させるために、主として５００ｎｍ未満でなければならない。この大きさの粒子を得るためには、少なくとも４０ｎｍｏｌの脂質ＤＴ−３ＴＵ／μｇＤＮＡを使用する必要がある。それ故、脂質ＤＴ−３ＴＵの製剤中で脂質−ＰＥＧを使用することは、ＤＮＡを緊密化し、５００ｎｍより小さいサイズの粒子を形成するために必要なＤＴ−３ＴＵの量を低減するという利点を持つ。

ゲルは、ＤＮＡが脂質と結合しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及びＤＮＡが脂質と結合したときの保持率の差を示す。ウエル２〜５は、粒子の安定化剤としてコレステロール−ＰＥＧ（２０単位のエチレングリコール）を含む又は含まない、漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤と結合したＤＮＡ（０．０１ｇ／ｌ）を示す。ウエル２は、２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋１５％コレステロール−ＰＥＧを示す。ウエル３は、２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋２０％コレステロール−ＰＥＧを含む。ウエル４は、３０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋１５％コレステロール−ＰＥＧを示し、ウエル５は、２０ｎｍｏｌ／μｇＤＮＡ＋２０％コレステロール−ＰＥＧを示す。ウエル１と他のウエルとの比較は、検討した種々のＤＴ−３ＴＵ製剤がゲル上のＤＮＡ移動を遅延させることを示唆しており、複合体からＤＮＡを遊離させることなく、従って複合体を不安定にすることなく、これらの製剤中にポリエチレングリコールのポリマーが組み込まれている可能性を示している。
この実施例は、それ故、安定化粒子の形態のＤＴ−３ＴＵ脂質が核酸を緊密化する能力を示している。

ＤＴ−４ＴＵ（１５）の存在下での核酸の緊密化
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が核酸に結合する能力を示すことである。

これは臭化エチジウムによる蛍光試験によって容易に明らかにすることができる：蛍光が存在しないことは遊離核酸が存在しないことを示唆し、それは核酸がトランスフェクション化合物によって緊密化されたことを意味する。

該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合によって、漸増量のＤＴ−４ＴＵと接触させた。０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＤＴ−４ＴＵ（１５）を含む１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中で調製した。

同様に、３チオ尿素を含む脂質（図２参照）と４チオ尿素を含む脂質の複合体形成の効率を比較するために、該核酸を、核酸の溶液中での様々な力価の脂質溶液の等容量混合により漸増量のＤＴ−３ＴＵ（１２）と接触させることによって対照を調製した。このようにして、０．０１μｇ／ｍｌの濃度の核酸複合体８００μｌの試料を、漸増量のＤＰＰＣを含む５％グルコース溶液中で調製した。

臭化エチジウム蛍光を、それぞれ２６０ｎｍと５９０ｎｍの励起及び発光波長でＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を使用して測定した。励起と発光のためのスリット幅は５ｎｍに設定した。ＤＮＡ／脂質溶液（０．０１ｇ／ｌ ＤＮＡ）１ｍｌにつき臭化エチジウム（１ｇ／ｌ）３μｌを加えた後、蛍光値を記録した。その結果を図１０に要約する。

四角記号の曲線は、固定量の核酸（８μｇ）に対する漸増量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから３０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ）の添加が、ＤＮＡの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導することを示している。これは、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、３０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質／μｇＤＮＡを使用して７０％のＤＮＡ緊密化を得ることができた。この脂質／ＤＮＡ結合におけるＤＴ−３ＴＵの積極的な役割は図１及び２に示されている。同様に、漸増量のＤＴ−４ＴＵ／ＤＰＰＣ脂質混合物（０．７５ｎｍｏｌから３０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ）を固定量の核酸（８μｇ）に加えた。この組合せは、ＤＮＡの塩基対の間への臭化エチジウムの挿入の低下に結びつく蛍光の低下を誘導する。これは、ＤＴ−４ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームとＤＮＡの間の結びつきが、その複合体から臭化エチジウムを排除するのに十分なほど強かったことを示唆する。我々はそれ故、３０ｎｍｏｌの脂質／μｇＤＮＡに関して６０％のＤＮＡ緊密化を得ることができ（図１０、丸印記号の曲線）、これは同じ条件を使用したＤＴ−３ＴＵ複合体形成の効率と同様であった。

この実施例は、それ故、ＤＴ−４ＴＵ脂質が核酸に結合する能力を示している。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ複合体によるデオキシリボヌクレアーゼからのＤＮＡの保護
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が酵素加水分解、すなわちデオキシリボヌクレアーゼから核酸を保護する能力を示すことである。

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる。遊離ＤＮＡ又は脂質と複合したＤＮＡを適切な量のデオキシリボヌクレアーゼで処理した。そのＤＮＡを酵素消化混合物から抽出し、アガロースゲル上に置いた。その移動を処理しなかった核酸の移動と比較することによってＤＮＡの完全性を確認した。

あらかじめ２×１０^−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ）で処理した様々なＤＮＡ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。遊離ＤＮＡ及びＤＮＡと比較して漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質と複合したＤＮＡに関して、デオキシリボヌクレアーゼによる処理を実施した。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、ゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図１１に示す。

ゲルは、デオキシリボヌクレアーゼで処理しなかったときのＤＮＡの電気泳動移動（ウエル１）、及び処理後の保持率の差を示す。ウエル２は、２×１０^−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼで処理したときの同じ量のＤＮＡ（３μｇ）を示す。この処理（２×１０^−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼ、３０分間、３７℃）後、対応するバンドは認められず、ＤＮＡの分解を示唆している。３０及び４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡ及び４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質＋Ｃｈｏｌ−ＰＥＧと複合した核酸を２×１０^−４Ｍのデオキシリボヌクレアーゼで処理した。フェノール／クロロホルムの混合物を使用してＤＮＡを抽出し、沈殿させたあと、それぞれウエル３、４及び５のアガロースゲル上に置いた。それらのＤＮＡの移動は、あらかじめデオキシリボヌクレアーゼで処理しなかったＤＮＡの移動と同様であった。これは、前記ＤＮＡが無傷であり、デオキシリボヌクレアーゼでの処理によって損なわれていなかったこと、従ってＤＴ−３ＴＵ脂質がＤＮＡを保護したことを示唆している。ＤＴ−３ＴＵ脂質複合体中のＤＮＡは、従って、酵素加水分解の影響を受けず、核酸はデオキシリボヌクレアーゼの加水分解から保護された。

この実施例は、それ故、ＤＴ−３ＴＵ脂質が核酸を酵素加水分解から保護する能力を示している。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ複合体による血清からのＤＮＡの保護
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、血清中での分解から核酸を保護する能力を示すことである。

これは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を使用して視覚化したＤＮＡのアガロースゲル上での電気泳動遅延試験によって容易に明らかにしうる。遊離ＤＮＡ又は脂質と複合したＤＮＡを種々の量の血清と共に３７℃でインキュベートした。血清から抽出した後、ＤＮＡをアガロースゲル上に置き、その移動をインキュベートしなかった核酸の移動と比較することによってＤＮＡの完全性を確認した。

あらかじめ１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０％及び１００％血清中でインキュベートした様々なＤＮＡ試料をアガロースゲル（１Ｎ ＴＢＥ中０．８％アガロース）上に置いた。遊離ＤＮＡ及びＤＮＡと比較して漸増量のＤＴ−３ＴＵと複合したＤＮＡに関して、塩類溶液及び血清による処理を実施した。電気泳動によってＤＮＡを移動させるため、ゲルを１時間半７０Ｖ及び４０ｍＡの電流に供した。バンドを臭化エチジウム及び紫外線灯の下での吸収によって明らかにした。その結果を図１２に示す。

ゲルは、処理しなかったＤＮＡ（ブランク）の電気泳動移動（ウエル１）、遊離ＤＮＡを塩類溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で処理したとき（ウエル２）、ＤＮＡを４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡと複合したとき（ウエル３）の保持率の差を示す。塩類溶液から抽出したＤＮＡの移動は２つのウエルにおいて同様であった。これは、ＤＮＡがこれらの条件下で無傷に保持されたことを示唆する。次のウエルは、同じ順序で、２つの異なる血清条件：ウエル４〜５については２０％血清及びウエル６〜７については１００％血清、でのＤＮＡ（ウエル４及び６）、ＤＮＡ＋４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質（ウエル５及び７）を示す。ＤＮＡが遊離しているとき、上述した両方の血清条件下で、３７℃で３０分後に核酸は完全に分解された（ウエル４及び６）。他方で、ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤とのＤＮＡ複合体形成は、ＤＮＡに対応する移動バンドが認められたことから、核酸の保護を誘導する（ウエル５及び７）。ＤＴ−３ＴＵ脂質複合体中のＤＮＡは、それ故、遊離ＤＮＡと比較したとき、血清中で分解から保護された。

この実施例は、それ故、血清中での分解から核酸を保護するＤＴ−３ＴＵ脂質の能力を示している。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＮＡ組成物のインビボトランスフェクション
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビボで生体組織をトランスフェクトする能力を示すことである。

これは、ルシフェラーゼについてのコードＤＮＡ複合体を筋肉内注入することによって明らかにしうる。注入の９６時間後に筋肉試料を採取し、ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃｅ）を使用してルシフェラーゼの発現レベルを測定した。

漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡを含む複合体をマウスの脛骨筋及び頭蓋筋に注入し、それに電気パルスを適用するか又は適用しなかった（Ｂｕｒｅａｕ，Ｍ．ら、ＢＢＡ２０００）。

４０ｎｍｏｌ及び６０ｎｍｏｌの漸増量のＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡを含む複合体を、３μｇＤＮＡ／動物を含有する３０μＬの容量で脛骨筋及び頭蓋筋に注入した。マウスＣ５７ｂｌ／６には、あらかじめケタミン／キシラジンの混合物で麻酔を施した。注入に続いて、筋の両方の末端に設置した電極を使用して経皮的に電気パルスを適用するか又は適用しなかった（Ｂｕｒｅａｕ，Ｍ．ら、ＢＢＡ２０００）。

注入の９６時間後、マウスを安楽死させ、筋肉試料を採取して、緩衝溶解溶液１ｍｌ中で摩砕した。遠心分離（１０分間、１２０００ｒｐｍ、４℃）後、上清（１０μｌ）を採取し、９６穴プレートに入れて、ルシフェラーゼ基質５０μｌを加えた後ルシフェラーゼを読み取った。ルミノメーター（Ｗａｌｌａｃｅ，Ｖｉｃｔｏｒ）を使用して上清中の発光のレベルを読み取った。

得られた結果を図１３に示す。それらの結果は、核酸と結合した脂質の量、２０ｎｍｏｌ及び４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡに対する発現のレベルを表わしている。得られた種々の発現レベルは有意であり、筋を対照としたときに得られたバックラウンドノイズ（５．０×１０^４）を上回っていた。種々の量のＤＴ−３ＴＵ脂質と複合したＤＮＡは、それ故、有意のトランスフェクションレベルで筋肉組織をトランスフェクトすることができた。

この実施例は、本発明によるトランスフェクション化合物がインビボで組織をトランスフェクトする能力を示している。

ＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ／ＤＮＡ複合体のインビボでの生体分布
この実施例の目的は、本発明によるトランスフェクション化合物が、それらの中性特性のゆえにインビボで血流中により長い時間とどまる能力を示すことである。

これは、蛍光脂質を含むＤＮＡをマウス血流中に注入することによって明らかにしうる。注入後種々の時点で血液試料を採取し、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を用いて血流中の蛍光のレベルを測定した。

４０ｎｍｏｌのＤＴ−３ＴＵ脂質／μｇＤＮＡを含む複合体、１モル当量のＤＰＰＣ／ＤＴ−３ＴＵ脂質及び（脂質総量の）０．７％の脂質−ローダミンを、１１μｇＤＮＡ／動物を含有する２００μＬの容量で尾静脈に注入した。マウスＣ５７ｂｌ／６にはケタミン／キシラジンの混合物で麻酔を施した。

注入後、３０分、１時間及び６時間目に、マウスを麻酔した状態で心臓穿刺によって血液試料を採取した。マウスを安楽死させたあと、直ちに肝臓、脾臓及び肺を摘出し、計量して、ＰＢＳ（５μｌ／ｍｇ組織）中で均質化した。血液１００μＬから脂質を抽出し、クロロホルム／メタノール混合物（１／１）３ｍｌを使用して、３０分間強く攪拌し、その後遠心分離することによって器官を均質化した。ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を用いてそれぞれ５５０ｎｍと５９０ｎｍの励起及び発光波長で、上清中の蛍光を測定した。励起及び発光のためのスリット幅は５ｎｍに設定した。

結果を図１４に要約する。それらは、注入後３０分、１時間及び６時間眼に血液、肺及び細網内皮系（肝臓と脾臓を合わせて）から得た注入用量のパーセンテージを表わしている。３０分後の血液中の蛍光の測定値は注入用量の５０％であり、カチオン型のＤＮＡ界面活性剤に関して得られるものをはるかに上回っていた。１時間後には、注入用量の１７％が検出でき、やはりカチオン型複合体と比較して著明な改善を示している。これらの脂質／ＤＮＡ複合体の中性特性（ζ電位は非常に弱い正であった：図４）は、それ故、血清タンパク質に対して潜伏性の（ｆｕｒｔｉｖｅ）粒子を得るための事実上の利点である。中性特性はまた、マクロファージ及び肝臓及び脾臓のクップファー細胞との相互作用も制限するはずであり、このことが、注入後３０分及び１時間目に血液中で認められたリポソームの量を説明すると考えられる。

肺で検出されたリポプレックスの量は、カチオン性リポプレックスを使用したときに認められた量と比較して低かった。リポソームの中性特性は、肺の陰性内皮との非特異的相互作用も低下させるはずである。

この実施例は、本発明によるトランスフェクション化合物が血清タンパク質に対して潜伏性である能力を示している。

核酸μｇ当りのＥＰＣ／ＤＴＴＵ混合物の量（ｎｍｏｌ）の関数として及び核酸μｇ当りのＥＰＣ単独の量（ｎｍｏｌ）（対照混合物）の関数としての、蛍光のレベルの変化（％）。 核酸μｇ当りのＤＰＰＣ／ＤＴＴＵ混合物の量（ｎｍｏｌ）の関数として及び核酸μｇ当りのＤＰＰＣ単独の量（ｎｍｏｌ）（対照混合物）の関数としての、蛍光のレベルの変化（％）。 使用したＥＰＣ／ＤＴＴＵリポソームの量（ｎｍｏｌ）の関数としてのプラスミドｐＸＬ３０３１の緊密化（μｇ）を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。 核酸μｇ当りの脂質の量（ｎｍｏｌ）の関数としてのＤＰＰＣ／ＤＴＴＵ−ＤＮＡリポソームの表面の電位に対応するζ（ゼータ）電位（ｍＶ）。 血清を含む又は含まない、様々な脂質／ＤＮＡ比（ｎｍｏｌ／μｇ）でのＤＮＡとＤＴＴＵ／ＤＰＰＣ（１：２）リポソームの間で形成される複合体によるＨｅＬａ細胞のインビトロトランスフェクションの効率。 ｙ軸は、ＲＬＵ／μｇタンパク質でのルシフェラーゼの発現を表わす。 ｘ軸は、ＤＮＡμｇ当りのＤＴＴＵの量（ｎｍｏｌ）を示す。 ＥＰＣ＋様々な脂質／ＤＮＡ比（ｎｍｏｌ／μｇ）のＤＴＴＵ／ＤＮＡリポソームで処理していない又は処理したＨｅＬａ細胞のタンパク質のレベル（吸光度として）。 プラスミドｐＸＬ３０３１の図式的表示。 使用したＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤の量（ｎｍｏｌ）の関数としてのプラスミドｐＸＬ３０３１の緊密化（μｇ）を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。 使用したＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌ−ＰＥＧナノ乳剤の量（ｎｍｏｌ）の関数としてのプラスミドｐＸＬ３０３１の緊密化（μｇ）を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。 核酸μｇにつき様々な量のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ（ｎｍｏｌ）と比較した、核酸μｇ当りのＤＴ−４ＴＵ／ＤＰＰＣの量（ｎｍｏｌ）の関数としての緊密化されたＤＮＡのパーセンテージの変化。 デオキシリボヌクレアーゼ分解に対するプラスミドｐＸＬ３０３１のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ混合物（μｇ）による保護を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。 血清中に入れたときのプラスミドｐＸＬ３０３１のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ混合物（μｇ）による保護を示すアガロースゲル（０．８％／ＴＢＥ）。レーン１は、ＤＮＡに対応する；レーン２及び３は、ＤＮＡ単独、又はＮａＣｌ １５０ｍＭ及び２０％血清中（レーン４及び５）、及び１００％血清中（レーン６及び７）のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣナノ乳剤１０ｎｍｏｌ／μｇの存在下でのＤＮＡに対応する。 エレクトロトランスファーを伴って又は伴わずに（ｅ−／ｅ＋）様々な量の脂質／ｎｍｏｌ ＤＮＡ／μｇで存在する、ＤＮＡとＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣリポソームの複合体によるインビボ筋肉トランスフェクションの効率。 血液、肺及びＲＥＳ（肝臓及び脾臓）中の、３０分、１時間及び６時間後のＤＴ−３ＴＵ／ＤＰＰＣ／ＤＯＰＥ−Ｒｈ／ＤＮＡ複合体のマウスにおけるインビボ生体分布。この図は、該粒子が潜伏（ｆｕｒｔｉｖｅ）特性を有することを示す：前記複合体の５０％が３０分後に血液循環中で回収される。

Claims (28)

1. 式（ＩＩＩ）：
   

   

   ［式中、
   ｎは、２、３、４、５、又は６であり、
   ｍは、２、３、又は４であり、各々のｍ値は、各々の基−［ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−（ＣＨ）_ｍ］−について独立して選択され、
   Ｘは、１個から８個の炭素原子を含む飽和又は不飽和直鎖又は環状脂肪族基、メルカプトメチル（−ＣＨ_２ＳＨ）基、又は−（ＣＨ_２）_ｘ−（ＣＨＯＨ）_ｕ−Ｈ［式中、ｘは１〜１０から選択される整数であり、ｕは１、２、３、４、５又は６である］もしくは−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｖ−Ｈ［式中、ｖは、１、２又は３である］で表される親水鎖であり、
   Ｙは１個から６個の炭素原子を有するアルキル、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は芳香環から選択される少なくとも１個の化学官能基を含むスペーサーであって、
   Ｒ_１とＲ_２は、互いに独立して、水素原子又は脂肪族鎖であり、該脂肪族鎖は１０個から２２個の炭素原子及び任意に少なくとも１つの不飽和を含むアルキル基から選択され、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１個は水素原子ではない］
   の化合物、又はその異性体、又はそれらの混合物。
2. 式（ＩＶ）：
   

   

   ［式中、ｍ、ｎ及びＹは、請求項１で定義したとおりである］
   を含む、請求項１に記載の化合物、又はその異性体、又はそれらの混合物。
3. 前記スペーサーが、式（Ｖ）又は式（ＶＩ）：
   −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_２−ＣＨ_２− （Ｖ）
   又は−（ＣＨ_２）_ｉ−Ｗ−（ＣＨ_２）_ｊ− （ＶＩ）
   ［式中、ｉ及びｊは、１から６までの整数であり、及びＷは、ケトン、エステル、エーテル、アミド、アミジン、カルバメート又はチオカルバメート官能基、グリセロール、尿素、チオ尿素、又は選択的に芳香環である］
   の基である、請求項１又は２に記載の化合物。
4. 脂肪族鎖が、脂肪族基（ＣＨ_２）_１１ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_１３ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_１５ＣＨ_３及び（ＣＨ_２）_１７ＣＨ_３から選択される、請求項１に記載の化合物。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物と核酸とを含む核酸を細胞に導入するための組成物。
6. 前記核酸が、デオキシリボ核酸又はリボ核酸である、請求項５に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
7. 前記核酸が、少なくとも１つの調節配列の制御下の少なくとも１個の治療的重要性を持つ遺伝子を含む、請求項５又は６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
8. 前記核酸が、遺伝子、アンチセンス配列又はリボザイム機能を有するＲＮＡをコードするＤＮＡである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
9. 少なくとも１個のアジュバントをさらに含有する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
10. 前記アジュバントが、脂質、ペプチド、タンパク質、又はポリマーである、請求項９に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
11. 前記ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
12. 前記ポリマーが、コレステロールに共有結合されたポリエチレングリコールである、請求項１０に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
13. 前記アジュバントが中性脂質から選択される、請求項１０に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
14. 前記中性脂質が、天然脂質又は合成脂質であり、前記脂質が、生理的条件下で両性イオン性であるか又はイオン電荷を持たない、請求項１３に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
15. 前記中性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジ−ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジ−ミリストイルホスファチジルエタノールアミン、又は１、２又は３回Ｎ−メチル化されている、前記ホスファチジルエタノールアミンのいずれかの誘導体、ホスファチジルグリセロール、ジアシルグリセロール、グリコシルジアシルグリセロール、セレブロシド（特にガラクトセレブロシドなど）、スフィンゴ脂質（特にスフィンゴミエリンなど）、又はアシアロガングリオシド（特にアシアロＧＭ１又はアシアロＧＭ２など）である、請求項１４に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
16. 少なくとも１つの細胞外標的エレメント又は少なくとも１つの細胞内標的エレメントをさらに含有する、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
17. 前記標的エレメントが、糖、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、神経伝達物質、ホルモン、ビタミン、又はそれらの誘導体である、請求項１６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
18. 前記標的エレメントが、少なくとも１０個の炭素原子を含む脂肪アルキル鎖又はポリエチレングリコールに共有結合されている、請求項１６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
19. 前記標的エレメントが、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物及び前記核酸に共有結合されている、請求項１６に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
20. 注射用製剤のための医薬適合性の賦形剤をさらに含有する、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
21. 皮膚及び／又は粘膜への投与のための医薬適合性の賦形剤をさらに含有する、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の核酸を細胞に導入するための組成物。
22. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける核酸の導入のための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
23. 疾病の治療のための医薬を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
24. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法であって、（１）核酸を請求項１〜４で定義した化合物と接触させることによって複合体を形成すること；及び（２）細胞を前記複合体と接触させること、を含む、核酸を前記細胞に導入するための方法。
25. 前記複合体を形成する前に、前記化合物及び／又は前記核酸を、請求項９〜１９で定義した少なくとも１つのアジュバント及び／又は標的エレメントと混合することをさらに含む、請求項２４に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法。
26. 前記細胞を前記複合体と接触させる前に、請求項９〜１５で定義した少なくとも１つのアジュバントを該細胞に投与する、請求項２４に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法。
27. 該細胞を、少なくとも１つの化学的処理又は少なくとも１つの物理的処理又はそれらの組合せに供することをさらに含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて核酸を細胞に導入するための方法。
28. 少なくとも１つの請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物及び／又はその混合物を含む、トランスフェクションキット。

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