JP3851807B2 - 免疫反応におけるプロゾーン現象抑制方法及び免疫反応測定用試薬 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫凝集反応や免疫沈降反応等の免疫反応において、被測定物質を広濃度範囲にわたって測定しようとする際に障害となるプロゾーン現象を抑制する薬剤及び方法、これを利用した免疫測定方法、及び免疫反応測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、臨床検査等の分野における各種検査では、自動化及び測定時間の短縮が図られている。それら検査において、免疫反応を利用する測定方法が、生体試料中の微量物質を測定するために広く用いられている。免疫測定方法には、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法、免疫比濁法、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法、イムノクロマト法等多くの方法があるが、その中でもラテックス凝集法や金属コロイド凝集法は反応液の分離や洗浄を行わないため、自動化に適している。
【０００３】
従来、生体試料中の被測定物質を免疫測定する際、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性界面活性剤を免疫反応液中に添加することにより、被測定物質である抗原（又は抗体）の低濃度領域において測定感度及び測定精度を改良できることが知られていた（特開昭５８−１８７８０２号公報）。一方、免疫沈降反応や免疫凝集反応などの免疫反応において、等量域より抗原（又は抗体）が過剰に存在する場合、沈降物や凝集塊が生成しにくくなって沈降物量が却って減少する現象（「プロゾーン（prozone）現象」という。）が知られている。このため、生体試料中の被測定物質である抗原（又は抗体）が免疫反応液中に高濃度に存在する場合等、ラテックスや金属コロイド等不溶性担体粒子に結合させた抗体（又は抗原）に比して抗原（又は抗体）が過剰に存在する場合、ラテックス凝集法や金属コロイド凝集法で測定するとプロゾーン現象のために測定値が却って小さくなり、このため測定に全く信頼が置けなくなる場合があった。
【０００４】
このような問題を改善する方法としては、硫酸塩類および必要に応じてポリエチレングリコールを含有させた免疫学的凝集反応試薬（特開平１１−３４４４９２号公報）、又は特定量のジカルボン酸を含有させた免疫学的凝集反応試薬（特開平１１−３４４４９４号公報）を用いる測定法等が提案されている。
【０００５】
しかしながら、これらの方法では、プロゾーン現象を幾らかは抑制できるものの、ラテックス凝集法や金属コロイド凝集法等の、自動化に適したホモジニアス測定系に用いるには、抑制効果が不十分であり、プロゾーン現象の抑制のための新たな技術が切望されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記背景のもとで、プロゾーン現象を十分に抑制し、免疫反応液中に被測定物質である抗原（又は抗体）が不溶性担体粒子に結合させた抗体（又は抗原）に比して過剰に含まれていても適切な測定値が得られるようにし、それにより、低濃度から高濃度まで、広い濃度範囲にわたる被測定物質の測定を可能にする方法、これに用いるプロゾーン現象抑制剤、またこれを用いた免疫反応測定用試薬、免疫反応測定方法及びプロゾーン現象の抑制方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、免疫測定においてプロゾーン現象を抑制する新たな技術を求めて検討した結果、被測定物質を含む免疫反応液中に、各種の界面活性剤のうちスルホン酸塩型又は硫酸エステル塩型の陰イオン性界面活性剤を含有させれば、意外にもプロゾーン現象を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、硫酸エステル塩系及びスルホン酸塩系の陰イオン性界面活性剤よりなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物よりなる、免疫反応測定用プロゾーン現象抑制剤を提供する。ここに、硫酸エステル塩系及びスルホン酸塩系の陰イオン性界面活性剤の好ましい例としては、アルキル硫酸エステル塩系、アルキルベンゼンスルホン酸塩系、アルキルナフタレンスルホン酸塩系、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸塩系、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩系、ポリオキシエチレンアルキルアリル硫酸エステル塩系及びアルカンスルホン酸塩系の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
また本発明は、これらの化合物を免疫反応におけるプロゾーン現象抑制剤として含有することを特徴とする、免疫反応測定用試薬をも提供する。該免疫反応測定用試薬は、該プロゾーン現象抑制剤を、免疫反応液中の該プロゾーン現象抑制剤の濃度が０．００８〜４％になる量で含有するものであることが好ましい。該免疫反応測定用試薬は、更に好ましくは金コロイド凝集反応によるものである。該免疫反応測定用試薬は、反応促進剤を含有することが更に好ましい。
【００１０】
また本発明は、上記免疫反応測定用プロゾーン現象抑制剤を含有する反応液中で免疫反応を行うことにより、免疫反応におけるプロゾーン現象を抑制して免疫反応を行わせることを特徴とする、免疫反応測定方法をも提供する。該免疫反応測定方法においては、上記免疫反応測定用プロゾーン現象抑制剤の含有量を０．００８〜４％とすることが好ましい。また、本発明における該免疫反応測定方法は、免疫凝集反応測定法によるものの場合特に効果的であり、金コロイド凝集反応測定法は、特に好ましい免疫反応凝集測定法の一例である。また、反応液中に反応促進剤を含有させることが更に好ましい。
【００１１】
本発明はまた、免疫反応液中に、硫酸エステル塩系及びスルホン酸塩系の陰イオン性界面活性剤よりなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物を含有させることを特徴とする、免疫測定法におけるプロゾーン現象抑制方法をも提供する。ここに、硫酸エステル塩系及びスルホン酸塩系の陰イオン性界面活性剤の好ましい例としては、アルキル硫酸エステル塩系、アルキルベンゼンスルホン酸塩系、アルキルナフタレンスルホン酸塩系、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸塩系、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩系、ポリオキシエチレンアルキルアリル硫酸エステル塩系及びアルカンスルホン酸塩系の陰イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。該プロゾーン現象抑制方法において、該免疫反応液中の該化合物の濃度は、好ましくは０．００８〜４％である。本発明における該プロゾーン現象抑制方法は、免疫凝集反応測定法において特に効果的であり、金コロイド凝集反応測定法は、特に好ましい免疫凝集反応測定法の一例である。また、反応液中に反応促進剤を含有させることが更に好ましい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のプロゾーン現象抑制剤としては、公知のスルホン酸塩型または硫酸エステル塩型の陰イオン性界面活性剤の中から適宜選択して使用でき、特にアルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系〔例：ペレックスＳＳＨ；花王（株）、エレミノールＭＯＮ２；三洋化成工業（株）〕、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系〔例：ペレックスＮＢＬ；花王（株）〕、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系〔例右：ラテムルＰＳ；花王（株）〕、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系〔例：エマールＥ７０Ｃ；花王（株）〕、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系〔例：サンデットＥＮＭ；三洋化成工業（株）〕、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系〔例：サンデットＥＮ；三洋化成工業（株）〕、アルキル硫酸エステル塩系、アルキルベンゼンスルホン酸系、ポリオキシエチレンアルキルアリル硫酸塩系の陰イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１３】
本発明のプロゾーン現象抑制剤は、免疫測定法に用いられる試薬中に添加して使用することができる。本発明の免疫反応測定用試薬は、プロゾーン現象抑制剤を用いること以外は、公知の免疫測定法で通常用いられる試薬を使用することで足りる。
【００１４】
免疫反応液中のこれら陰イオン性界面活性剤の濃度は０．００８〜４％（本発明において重量％を表す。）であり、好ましくは０．００８〜１％、更に好ましくは０．０１６〜０．４％である。
【００１５】
更に免疫反応測定用試薬に反応促進剤を配合することにより、プロゾーン現象を抑制したまま測定感度を高めることができる。反応促進剤としては、測定感度を上昇させるものであれば何れのものでもよく、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピリドン等が挙げられるが、これらに限られない。
【００１６】
例えば、ポリエチレングリコールは、公知のポリエチレングリコールのうちから適宜選択して使用できる。その平均分子量は１０００〜５００００で、好ましくは４０００〜２００００である。測定時の免疫反応液中のポリエチレングリコール濃度には、反応促進効果を発揮させる上で特に明確な上限はないが、通常０．０１〜５．０％、好ましくは０．１〜３．０％、特に好ましくは０．２〜２．０％になるように、免疫反応測定用試薬に配合すればよい。
【００１７】
また、本発明は、免疫反応測定用試薬に非イオン性界面活性剤を配合することを妨げるものではない。非イオン性界面活性剤を配合する場合、公知の非イオン性界面活性剤の中から適宜選択すればよい。特に好ましいのは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテル系、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル系、ソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル系、グリセリン脂肪酸エステル系、ポリオキシエチレンアルキルアミン系、アルキルアルカノールアミド系の非イオン性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤を配合する場合、測定時の免疫反応液中の濃度が０．００１〜３．０％、好ましくは０．０２〜２．０％になるように免疫反応測定用試薬に配合すればよい。
【００１８】
本発明の免疫反応測定用試薬を使用するのに特に適した免疫測定法は、免疫凝集反応を伴うものである。それらのうち、特に好ましいのは、ラテックス凝集法及び金属コロイド凝集法である。金属コロイド凝集法で用いられる金属コロイドとしては、金、銀、セレン等のコロイドがあり、何れでもよいが、利用しやすいという点からは、金コロイドが好ましい。
【００１９】
例えば、抗原（又は抗体）である被測定物質を測定する場合、ラテックス凝集法、金属コロイド凝集法では、被測定物質である抗原（又は抗体）に対応する抗体（又は抗原）を、担体のラテックスや金属コロイドにあらかじめ結合させておく。その測定例として、金コロイド凝集法の場合、あらかじめ金コロイドと結合させた標識抗体（又は標識抗原）が、被測定物質である抗原（又は抗体）を介して凝集する。その際に生じる色差（色調変化）を光学的に測定し、抗原量または抗体量を測定する。
【００２０】
本発明の免疫反応測定試薬にて測定される被測定物質としては、タンパク質、脂質、糖類があり、それには例えば、各種抗原、抗体、レセプター、酵素などが含まれる。具体的にはＣ反応性タンパク（ＣＲＰ）、繊維素分解産物（ＦＤＰ）、ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ，α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、シスタチンＣ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ペプシノーゲンＩおよびII、コラーゲン、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、フェリチン、トランスフェリン、α１−マイクログロブリン、α２−マクログロブリン、β２−マイクログロブリン、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、ミオグロビンなどの血液中タンパク質や、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヘリコバクターピロリ、およびこれらに対する抗体などの、感染症に関する抗原や抗体などが挙げられる。本発明によれば、免疫測定反応におけるプロゾーン現象、取り分け抗原過剰によるプロゾーン現象が抑制され、これら被測定物質を、広い濃度範囲にわたって測定することができる。
【００２１】
本発明において、免疫反応を過度に酸性又はアルカリ性の条件下で行うことは好ましくない。反応液のｐＨとしては４．５〜９．５の範囲とするのがよく、より好ましいのは５．５〜８．５の範囲である。ｐＨの維持のためには適当な緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、コハク酸緩衝液、あるいはグリシルグリシン、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ'−エタンスルホン酸）、ＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＤＩＰＳＯ（３−（Ｎ'Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−２−ヒドロキシエチルプロパンスルホン酸）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）等のグッド緩衝液が好適に用いられる。緩衝剤の使用濃度としては、測定時の免疫反応液中における濃度が５〜１０００ｍＭになるように、免疫反応測定用試薬に配合すればよく、より好ましくは２０〜５００ｍＭの範囲になるようにすればよい。
【００２２】
なお、本発明の免疫反応用試薬中には、動物血清、γ−グロブリン、ヒトＩｇＧやＩｇＭに対する特異抗体、アルブミン、またはそれらの変性物や分解物、塩化ナトリウムやその他の無機塩類、糖類、アミノ酸類、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ＤＴＴ等のＳＨ試薬、アジ化ナトリウム等を配合してもよい。これらの物質は、通常この分野で使用される濃度範囲で含まれてよい。
【００２３】
【作用】
本発明の試薬を用いれば、試料中に被測定物質である抗原（又は抗体）が高濃度に存在するなど、ラテックスや金属コロイド等不溶性担体粒子に結合させた抗体（又は抗原）に比して過剰量の抗原（又は抗体）が存在している場合でも、プロゾーン現象を抑制することができ、試料の希釈等により抗原と抗体の濃度バランスを調節し直すことなしに、広い濃度範囲での被測定物質の免疫反応測定が可能となる。
【００２４】
【実施例】
以下、典型的な実施例として金コロイド凝集反応に基づいて本発明を更に具体的に説明するが、本発明がこれらによって限定されることは意図しない。
なお、実施例において以下の陰イオン性界面活性剤を使用した。
・ペレックスＳＳＨ： アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム（花王（株））
・ペレックスＮＢＬ： アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム（花王（株））
・ラテムルＰＳ： アルカンスルホン酸ナトリウム（花王（株））
・エマールＥ７０Ｃ： ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム（花王（株））
・エレミノールＭＯＮ２： アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム（三洋化成工業（株））
・サンデットＥＮＭ： 高級アルキルエーテル硫酸エステル塩（三洋化成工業（株））
・サンデットＥＮ： ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルナトリウム塩（三洋化成工業（株））
【００２５】
＜参考例１＞ 金コロイド液の調製
９５℃の蒸留水１Ｌに１０％塩化金酸溶液２ｍＬを撹拌しながら加え、１分後に２％クエン酸ナトリウム溶液１０ｍＬを加え、さらに２０分間撹拌した後３０℃に冷却した。冷却後、０．１Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ７．１に調整した。
【００２６】
＜参考例２＞ 抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬の調製
抗シスタチンＣ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１で希釈して５０μｇ／ｍＬの濃度に調整した。この液１００ｍＬを上記参考例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵条件下で２時間撹拌した。次いでこれに５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分撹拌した。８，０００回転で４０分遠心し、上清を除去した後、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、８，０００回転で４０分遠心し、上清を除去し、Ａ溶液で抗体結合金コロイドを分散させ全量を１６０ｍＬとし、抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド試薬を調製した。
【００２７】
＜参考例３＞ 抗ＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬の調製
抗ＡＦＰ抗体（ダコ・ジャパン株式会社）を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１で希釈して５０μｇ／ｍＬの濃度に調整した。この液１００ｍＬを上記参考例１で調製した金コロイド液約１Ｌに加え、冷蔵条件下で２時間撹拌した。次いでこれに５．４６％マンニトール、０．５％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．１を１１０ｍＬ添加し、３７℃で９０分撹拌した。８，０００回転で４０分遠心し、上清を除去した後、３％マンニトール、０．１％ＢＳＡ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５（Ａ溶液）を約１Ｌ加え、抗体結合金コロイドを分散させた後、８，０００回転で４０分遠心し、上清を除去し、Ａ溶液で抗体結合金コロイドを分散させ全量を１６０ｍＬとし、抗ＡＦＰ抗体結合金コロイド試薬を調製した。
【００２８】
＜実施例１＞
０〜５０μｇ／ｍＬの濃度のシスタチンＣを含む血清３μＬに、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に、下記の何れかの陰イオン性界面活性剤を、それぞれ示した濃度で添加することにより、又は何れの陰イオン性界面活性剤も添加せずに、調製した各Ｒ１試薬溶液を２４０μＬ加えた。
ペレックスＳＳＨ・・・・・・０．０３％（図１）
ペレックスＮＢＬ・・・・・・０．１％（図１）
ラテムルＰＳ・・・・・・・・０．０３％（図１）
エマールＥ７０Ｃ・・・・・・０．０５％（図２）
エレミノールＭＯＮ２・・・・０．０３％（図２）
ラテムルＳ−１８０Ａ・・・・０．１％（図２）
サンデットＥＮＭ・・・・・・０．２％（図３）
サンデットＥＮ・・・・・・・０．２％（図３）
次いで、３７℃で５分後に、Ｒ２試薬溶液として参考例２で調製した抗シスタチンＣ抗体結合金コロイド溶液を６０μＬ添加し、３７℃で反応させ、日立７１５０型自動分析装置により２７ポイントと５０ポイントにおける吸光度差（主波長５４６ｎｍ副波長６６０ｎｍ）を測定した。その結果を図１、２及び３に示す。図から明らかなように、これらの陰イオン性界面活性剤を添加して製した何れの反応液においても、プロゾーン現象は認められなかった。これに対して陰イオン性界面活性剤無添加の反応液では、プロゾーン現象が起こるのが認められた。
【００２９】
＜実施例２＞
免疫反応液に非イオン性界面活性剤を添加して、プロゾーン現象の抑制効果の有無を、陰イオン性界面活性剤ペレックスＳＳＨ添加の場合と比較した。非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｔｗｅｅｎ８０及びレオドール−ＴＷ?Ｌ１２０を用い、それらの何れかを濃度０．２％で含有する、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を各Ｒ１試薬溶液とし、それを用いて実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。同時に、ペレックスＳＳＨを０．０３％の濃度になるように添加した、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）をＲ１試薬溶液とし、それを用いて実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。その結果を図４に示す。図から明らかなように、非イオン性界面活性剤には、プロゾーン現象の抑制効果は認められなかった。
【００３０】
＜実施例３＞
特開平１１−３４４４９２号には、硫酸塩によるプロゾーン現象の抑制効果が記載されている。そこで、硫酸ナトリウムを添加した免疫反応液を調製し、プロゾーン現象の抑制効果につき、硫酸エステル基を含む陰イオン性界面活性剤ペレックスＳＳＨを添加した免疫反応液と比較した。硫酸ナトリウムをそれぞれ０、２．０、５．０又は９．０％の濃度で含有させた、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）をＲ１試薬溶液とし、これらを用いて実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。同時に、ペレックスＳＳＨを０．０３％の濃度になるように添加した、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）をＲ１試薬溶液とし、これを用いて実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。結果を図５に示す。図より明らかなとおり、硫酸ナトリウム添加では、シスタチンＣの高濃度５０μｇ／ｍＬにおける測定値が、シスタチンＣ濃度４μｇ／ｍＬにおける測定値を下回っており、プロゾーン現象は全く解消されていなかった。これに対し、ペレックスＳＳＨ０．０３％添加では、シスタチンＣの高濃度５０μｇ／ｍＬにおける測定値がこれより低濃度域における測定値を下回ることがなく、プロゾーン現象は完全に解消された。
【００３１】
＜実施例４＞
ペレックスＳＳＨ又はエマールＥ７０Ｃを０、０．０１、０．０２又は０．０３％の濃度になるように添加した、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）をＲ１試薬溶液とし、これらを用いて実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。その結果を図６、７に示す。図６より明らかなとおり、ペレックスＳＳＨの濃度０．０１％を添加した場合、シスタチンＣの高濃度５０μｇ／ｍＬにおける測定値が、無添加の場合に比して上昇することが認められた。ペレックスＳＳＨの濃度０．０３％の添加では、シスタチンＣの高濃度５０μｇ／ｍＬにおける測定値が、それより低濃度域におけるシスタチンＣの測定値を下回ることがなく、プロゾーン現象は完全に解消された。
【００３２】
図７のエマールＥ７０Ｃ添加においても、濃度０．０１％の添加でシスタチンＣの高濃度５０μｇ／ｍＬにおける測定値が無添加の場合に比して上昇することが認められた。エマールＥ７０Ｃの濃度０．０２％の添加では、シスタチンＣの高濃度５０μｇ／ｍＬにおける測定値が、それより低濃度域におけるシスタチンＣの測定値を下回ることがなく、プロゾーン現象は完全に解消された。
【００３３】
これらのことから、ペレックスＳＳＨ又はエマールＥ７０Ｃには、０．０１％の低濃度でもプロゾーン現象の抑制効果があるあることが判る。
【００３４】
＜実施例５＞
非イオン性界面活性剤共存下での陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果ついて検討した。非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ８０を０．２％の濃度になるように添加した、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に、陰イオン性界面活性剤としてペレックスＮＢＬを濃度がそれぞれ０、０．２、０．３、０．４、０．５％になるように添加し、Ｒ１試薬溶液とした。これらを用いて実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。その結果を図８に示す。ペレックスＮＢＬの濃度０．３％で、シスタチンＣの高濃度５０μｇ／ｍＬにおける測定値が、それより低濃度領域のシスタチンＣの測定値を下回ることがなく、プロゾーン現象は完全に解消された。ペレックスＮＢＬの濃度を０．３％より高めると、全体的に測定値の低下が認められるが、プロゾーン現象は抑制されたままであった。このことから、陰イオン性界面活性剤を非イオン性界面活性剤と共に用いても、陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果は損なわれないことが判る。
【００３５】
＜実施例６＞
実施例５においてペレックスＮＢＬの濃度を０．５％になるように添加したとき、シスタチンＣの測定値は全体的に著しく低下した（図５）。そこで、反応促進剤共存下での陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象の抑制効果ついて検討した。反応促進剤としてポリエチレングリコール２００００を用い、濃度がそれぞれ０、０．５、０．７５、１．０又は１．２５％になるように、実施例５のペレックスＮＢＬを０．５％含有するＲ１試薬溶液に添加して、実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。同時に、ペレックスＮＢＬ無添加のＲ１試薬溶液に０．５％になるようにポリエチレングリコール２００００を添加して、実施例１と同様にシスタチンＣを測定した。結果を図９に示す。ペレックスＮＢＬ無添加のＲ１試薬溶液にポリエチレングリコール２００００を添加した場合、ポリエチレングリコールによる反応促進効果により測定値は上昇するが、シスタチンＣの全濃度域で単に均一に上昇するために、ポリエチレングリコールのみの添加ではプロゾーン現象の抑制効果は認められない。これに対し、ペレックスＮＢＬを０．５％含有するＲ１試薬溶液にポリエチレングリコール２００００を添加した場合、プロゾーン現象を抑制したまま、測定値が上昇した。しかも、このポリエチレングリコールの効果は、試験した濃度に対応して一貫して高まり、その効果が頭打ちとなる明確な上限濃度は認められなかった。このことから、陰イオン性界面活性剤添加でプロゾーン現象を抑制した際に測定値が全体的に低下しても、ポリエチレングリコールなどの反応促進剤を適宜の量添加することでプロゾーン現象を抑制したまま測定値を上昇させ、自由に測定感度を設定できることが判る。
【００３６】
＜実施例７＞
陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果を、シスタチンＣ以外の測定試薬であるＡＦＰ測定試薬について検討した。０〜２５０μｇ／ｍＬの濃度のＡＦＰを含む血清３μＬに、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．２％ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１％ＮａＣｌを含む、０．２ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）をＲ１試薬溶液として２４０μＬ加えた。次いで３７℃で５分後に、Ｒ２試薬溶液として参考例３で調製した抗ＡＦＰ抗体結合金コロイド溶液を６０μＬ添加し、３７℃で反応させ、日立７１５０型自動分析装置により２７ポイントと５０ポイントにおける吸光度差（主波長５４６ｎｍ副波長６６０ｎｍ）を測定した。前記Ｒ１試薬溶液に、陰イオン性界面活性剤としてペレックスＳＳＨを０．１％濃度で添加し、同様にしてＡＦＰを測定し、陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果について検討した。結果を図１０に示す。ＡＦＰ測定試薬においても、陰イオン性界面活性剤ペレックスＳＳＨ添加により、プロゾーン現象の抑制効果が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図２】 陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図３】 陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図４】 非イオン性界面活性剤添加でのプロゾーン現象を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図５】 プロゾーン現象抑制における硫酸ナトリウムと陰イオン性界面活性剤との比較を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図６】 ペレックスＳＳＨの濃度とプロゾーン現象抑制効果との関係を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図７】 エマール７０Ｃの濃度とプロゾーン現象抑制効果との関係を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図８】 非イオン性界面活性剤共存下での陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図９】 非イオン性界面活性剤及び反応促進剤の共存下での陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果を示すグラフ（シスタチンＣ）。
【図１０】 陰イオン性界面活性剤のプロゾーン現象抑制効果を示すグラフ（ＡＦＰ）。
【符号の説明】
Ａｂｓ＊１０００＝吸光度×１０００
Ｃｙｓ．Ｃ＝シスタチンＣ

Claims (23)

1. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤よりなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物よりなる、免疫反応測定用プロゾーン現象抑制剤。
2. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルカンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系の陰イオン性界面活性剤が高級アルキルエーテル硫酸エステル塩、又は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルナトリウムである請求項１に記載の免疫反応測定用プロゾーン現象抑制剤。
3. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤よりなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物を免疫反応におけるプロゾーン現象抑制剤として含有することを特徴とする、免疫反応測定用試薬。
4. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系又はアルカンスルホン酸ナトリウム塩系の界面活性剤を濃度０．０３〜４％、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系又はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の界面活性剤を濃度０．１〜４％、又は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系の界面活性剤を濃度０．０２〜４％になる量で含有することを特徴とする、請求項３に記載の免疫反応測定用試薬。
5. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルカンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系の陰イオン性界面活性剤が高級アルキルエーテル硫酸エステル塩、又は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルナトリウムである請求項３又は４に記載の免疫反応測定用試薬。
6. 該免疫反応が、免疫凝集反応である、請求項３ないし５の何れかに記載の免疫反応測定用試薬。
7. 該免疫反応が、金コロイド凝集反応である、請求項３ないし６の何れかに記載の免疫反応測定用試薬。
8. 反応促進剤を更に含有することを特徴とする、請求項３ないし７の何れかに記載の免疫反応測定用試薬。
9. 反応促進剤が、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリビニルアルコール及びポリビニルピリドンよりなる群より選ばれるものである、請求項８に記載の免疫反応測定用試薬。
10. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系、アルキルナフ タレンスルホン酸ナトリウム塩系、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤よりなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物を免疫反応用プロゾーン現象抑制剤として免疫反応液中に含有させることにより、免疫反応におけるプロゾーン現象を抑制して免疫反応を行わせることを特徴とする、免疫反応測定方法。
11. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系又はアルカンスルホン酸ナトリウム塩系の界面活性剤を濃度０．０３〜４％、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系又はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の界面活性剤を濃度０．１〜４％、又は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系の界面活性剤を濃度０．０２〜４％で含有させるものである、請求項１０に記載の免疫反応測定方法。
12. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルカンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系の陰イオン性界面活性剤が高級アルキルエーテル硫酸エステル塩、又は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルナトリウムである請求項１０又は１１に記載の免疫反応測定方法。
13. 免疫凝集反応測定法によるものである、請求項１０ないし１２に記載の免疫反応測定方法。
14. 金コロイド凝集反応測定法によるものである、請求項１０ないし１３の何れかに記載の免疫反応測定方法。
15. 反応液中に反応促進剤を更に含有させることを特徴とする、請求項１０ないし１４の何れかに記載の免疫反応測定方法。
16. 反応促進剤が、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリビニルアルコール及びポリビニルピリドンよりなる群より選ばれるものである、請求項１５に記載の免疫反応測定方法。
17. 免疫反応液中に、アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系及びポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤よりなる群より選ばれる１種又は２種以上の化合物を含有させることを特徴とする、免疫測定法におけるプロゾーン現象の抑制方法。
18. 該免疫反応液中、アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系又はアルカンスルホン酸ナトリウム塩系の界面活性剤の濃度が０．０３〜４％、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系又はポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の界面活性剤の濃度が０．１〜４％、又は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系の界面活性剤の濃度が０．０２〜４％である、請求項１７に記載の、免疫測定法におけるプロゾーン現象の抑制方法。
19. アルキルフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルジフェニルエーテルジスルホン酸ナトリウム、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がアルカンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム塩系の陰イオン性界面 活性剤がポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、高級アルキルエーテル硫酸エステル塩系の陰イオン性界面活性剤が高級アルキルエーテル硫酸エステル塩、又は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステルナトリウム塩系の陰イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルナトリウムである請求項１７又は１８に記載の、プロゾーン現象の抑制方法。
20. 該免疫測定法が免疫凝集反応測定法によるものである、請求項１７ないし１９に記載の、免疫測定法におけるプロゾーン現象の抑制方法。
21. 該免疫測定法が金コロイド凝集反応測定法によるものである、請求項１７ないし２０の何れかに記載の免疫測定法におけるプロゾーン現象の抑制方法。
22. 該免疫反応液中に反応促進剤を更に含有させることを特徴とする、請求項１７ないし２１の何れかに記載の、免疫測定法におけるプロゾーン現象の抑制方法。
23. 反応促進剤が、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、プルラン、ポリビニルアルコール及びポリビニルピリドンよりなる群より選ばれるものである、請求項２２に記載の、免疫測定法におけるプロゾーン現象の抑制方法。

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