JP3680324B2 - Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene and amino acid production method thereof - Google Patents

Description

【００２９】
【化２】

【００３０】
【化３】

【００３１】
これらのアナログ化合物による大腸菌の生育阻害を図１〜３に示す。さらに、上記阻害回復物質を単独で、あるいは２種類もしくは３種類の混合物として加えたときの、大腸菌の生育回復を図４〜６に示す。また、対照として、阻害物質非存在下で阻害回復物質を添加したときの生育を図７に示す。尚、図４〜７中、添加物１、２、３は、各々核酸、グルタミン酸、あるいはアスパラギン酸族のアミノ酸を示す。
【００３２】
さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼに対するアナログ化合物による活性阻害を調べた。Yoshinaga, T., Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970)に記載の方法に準じて、酵素活性を測定した。
【００３３】
ＬＢ培地で培養したエシェリヒア・コリＨＢ１０１を破砕し、懸濁液を遠心分離して上清を粗酵素液とした。酵素活性の測定は、２ｍＭホスホエノールピルビン酸カリウム、０．１ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１Ｍ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、１．５Ｕマレートデヒドロゲナーゼ、及び粗酵素を含む測定系中に、活性に影響する事が知られているアセチルコエンザイムＡを０．１ｍＭの濃度で存在させて、３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより行った。結果を図８に示す。
【００３４】
以上の結果から、上記の３種のアナログ化合物は、大腸菌の生育を阻害し、核酸単独ではこの阻害を回復できないが、グルタミン酸あるいはアスパラギン酸族アミノ酸の添加により阻害を回復できることが明らかである。したがって、これらのアナログ化合物はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの選択的な阻害剤であると推定された。本発明において、後記実施例に示したように、これら３種の化合物を用いて変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する大腸菌を選択することに成功している。
【００３５】
上記化合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する形質転換体をスクリーニングし、組換えＤＮＡを回収すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。また、微生物自体を変異処理した場合には、上記化合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する変異株をスクリーニングし、該株より目的とする変異型酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、適当なベクターに連結すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。
【００３６】
このようにして変異が導入されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ断片を、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させることによって、変異型酵素を生産させることができる。また、本発明のＤＮＡ断片を、宿主染色体ＤＮＡ内に組み込むことにより形質転換しても、目的の変異型酵素を産生できる。
【００３７】
宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物、例えば、大腸菌、コリネホルム細菌等が挙げられる。コリネホルム細菌は、コリネバクテリウム属細菌、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。尚、アミノ酸製造に好適な宿主については、後述する。
【００３８】
一方、ベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましい。宿主が大腸菌の場合には、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００３９】
また、宿主がコリネホルム細菌の場合に使用できるベクター及びそれを保持する宿主を以下に例示する。尚、かっこ内に国際寄託機関の寄託番号を示した。
【００４０】

【００４１】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００４２】
本発明のＤＮＡ配列を上記ベクターに挿入して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するには、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を高める方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)）等、通常大腸菌の形質転換に用いられる方法を用いることができる。
【００４３】
また、コリネホルム細菌の形質転換法としては、上記の細胞を塩化カルシウムで処理する方法、または細胞がＤＮＡを取込可能な特定の成長時期に取り込む方法（Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチリスに関する報告）がある。さらに、プラチミドＤＮＡを容易に取り込むＤＮＡ受容体のプロトプラストまたはスフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブチリス、アクチノマイセス及び酵母について知られている（Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979)、Bibb et al., Nature, 274, 398, (1978)、Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)）。 その他、特開平２−２０７７９１号公報にコリネホルム細菌の形質転換法が開示されている。
【００４４】
本発明のＤＮＡ配列を上記宿主内で発現させるには、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で効率よく働くプロモーターを用いてもよく、本発明のＤＮＡ配列がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを含んでいる場合は、これをそのまま用いてもよい。また、コリネホルム細菌を宿主とする場合は、公知のブレビバクテリウム属細菌由来のｔｒｐプロモーター（特開昭６２−２４４３８２号公報）等を使用することもできる。
【００４５】
また、上記のように、本発明のＤＮＡ配列を自立複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドとして宿主に保持させてもよいが、本発明のＤＮＡ配列を、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972)）を用いた方法で微生物の染色体に組み込んでもよい。また、コリネホルム細菌の染色体に本発明のＤＮＡを組み込むには、特開平５−７４９１号公報に開示される温度感受性プラスミドが利用できる。
【００４６】
上記のようにして本発明のＤＮＡ配列で形質転換された微生物を培養し、このＤＮＡ配列を発現させると、変異型酵素が得られる。このようにして得られた変異型酵素が、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除されているかどうかは、酵素反応系にアスパラギン酸を添加して活性を測定することにより、明かとなる。
【００４７】
また、本発明のＤＮＡ配列は、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除された変異酵素をコードしているので、このＤＮＡ配列を有する微生物を、以下に示すように、アスパラギン酸族やグルタミン酸族のアミノ酸の効率的な醗酵生産に利用することができる。
【００４８】
後記実施例で得られた変異型酵素遺伝子を保持するエシェリヒア・コリＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０８、ＡＪ １２９０９、ＡＪ １２９１０は、平成５年８月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７７として寄託されており、平成６年７月１１日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されている。
【００４９】
＜３＞アミノ酸の製造方法
本発明のＤＮＡ配列を保持する微生物を好適な培地で培養し、生じたアミノ酸を分離することにより、アミノ酸を製造することができる。このようなアミノ酸として、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンが挙げられる。
【００５０】
以下に、本発明のＤＮＡ配列を導入し各アミノ酸の製造に使用するのに好適な宿主及び培養法を例示する。
【００５１】
（１）本発明のアミノ酸の製造方法に好適な宿主
(i)Ｌ−リジン製造に好適な宿主
本発明によるＬ−リジン製造に用いる宿主として、エシェリヒア属細菌、好ましくはＬ−リジン生産性の大腸菌が挙げられる。具体的には、リジンアナログに耐性を有する変異株が例示できる。このリジンアナログは、エシェリヒア属の微生物の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制はＬ−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的に解除されるようなものである。例えば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「ＡＥＣ」と略記する）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等がある。これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微生物に施すことにより得られる。Ｌ−リジン製造に用いる菌株として、具体的には、エシェリヒア・コリ ＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭ Ｐ−５０８４として寄託されている。特開昭５６−１８５９６号公報第４７１頁左下欄参照）が挙げられる。
【００５２】
一方、コリネホルム細菌の種々の人工変異株が、Ｌ−リジン生産菌として用いられており、これらを本発明に使用することができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。ＡＥＣ耐性変異株、その成長にＬ−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株（特公昭４８−２８０７８号，特公昭５６−６４９９号），ＡＥＣに耐性を示し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン，Ｌ−プロリン，Ｌ−セリン，Ｌ−アルギニン，Ｌ−アラニン，Ｌ−バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第３７０８３９５号及び第３８２５４７２号），ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム，α−アミノ−ラウリルラクタム，キノイド，Ｎ−ラウロイルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株，オキザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラ−ゼ）または呼吸系酵素の阻害剤に耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号，特開昭５０−３１０９３号，特開昭５２−１０２４９８号，特開昭５３−８６０８９号，特開昭５５−９７８３号，特開昭５５−９７５９号，特開昭５６−３２９９５号，特開昭５６−３９７７８号，特公昭５３−４３５９１号，特公昭５３−１８３３号），イノシトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号，特開昭５６−８６９２号），フルオロピルビン酸または３４℃以上の温度に対して感性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号，特開昭５３−８６０９０号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株（米国特許出願第３３３４５５号参照）。
【００５３】
リジン製造に用いる具体的なコリネホルム細菌としては、次のものが挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12031 (FERM BP-277) 特開昭60-62994号公報第525頁左下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC39134 特開昭60-62994号公報第473頁右下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3463 (FERM P-1987) 特公昭51-34477号公報参照
また、以下に示すコリネホルム細菌の野生株も同様に本発明に使用することができる。
【００５４】

【００５５】
(ii)Ｌ−スレオニン製造に好適な宿主
エシェリヒア・コリ B-3996 (RIA 1867) 特表平3-501682号公報参照
エシェリヒア・コリ AJ 12349 (FERM P-9574) 特開平2-458号公報第887頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12351 (FERM P-9576) 特開平2-458号公報第887頁右下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12352 (FERM P-9577) 特開平2-458号公報第888頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11332 (FERM P-4898) 特開平2-458号公報第889頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12350 (FERM P-9575) 特開平2-458号公報第889頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12353 (FERM P-9578) 特開平2-458号公報第889頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12358 (FERM P-9764) 特開平2-458号公報第890頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12359 (FERM P-9765) 特開平2-458号公報第890頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11334 (FERM P-4900) 特公平1-29559号公報第201頁６欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11333 (FERM P-4899) 特公平1-29559号公報第201頁６欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11335 (FERM P-4901) 特公平1-29559号公報第202頁７欄参照
【００５６】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11188 (FERM P-4190) 特開昭60-87788号公報第473頁右上欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11682 (FERM BP-118) 特公平2-31956号公報第230頁８欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11683 (FERM BP-119) 特公平2-31956号公報第231頁10欄参照
【００５７】
(iii)Ｌ−メチオニン製造に好適な宿主
Ｌ−メチオニン製造には、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11457 (FERM P-5175) 特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11458 (FERM P-5176) 特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11459 (FERM P-5177) 特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11539 (FERM P-5479) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11540 (FERM P-5480) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11541 (FERM P-5481) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11542 (FERM P-5482) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
【００５８】
(iv)Ｌ−アスパラギン酸製造に好適な宿主
Ｌ−アスパラギン酸製造には以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 3859 (FERM P-2799) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3860 (FERM P-2800) 特開昭51-61689号公報第524頁 左上欄参照
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ 3877 (FERM P-2803) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 3876 (FERM P-2802) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
【００５９】
(v)Ｌ−イソロイシン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ KX141 (VKPM-B4781)（特開平4-330275号公報４５段落参照）が、コリネホルム細菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12404 (FERM P-10141)（特開平2-42988号公報第603頁左下欄参照）、ブレビバクテリウム・フラバム AJ 12405 (FERM P-10142)（特開平2-42988号公報第524頁左下欄参照）が挙げられる。
【００６０】
(vi)Ｌ−グルタミン酸製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 12628 (FERM P-12380) '93年フランス特許公開No. 2 680 178号参照
エシェリヒア・コリ AJ 12624 (FERM P-12379) '93年フランス特許公開No. 2 680 178号参照
【００６１】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12745 (FERM BP-2922) 特開平3-49690号公報第561頁右下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12746 (FERM BP-2923) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12747 (FERM BP-2924) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12748 (FERM BP-2925) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 21492 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
【００６２】
(vii)Ｌ−アルギニン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11593 (FERM P-5616) 特開昭57-5693号公報第468頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11594 (FERM P-5617) 特開昭57-5693号公報第468頁右上欄参照
【００６３】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 12144 (FERM P-7642) 特公平5-27388号公報第174頁４欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 12145 (FERM P-7643) 特公平5-27388号公報第174頁４欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 21493 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 21659 特開平5-3793号公報第３頁表１参照
【００６４】
(viii)Ｌ−プロリン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11543 (FERM P-5483) 特開昭56-144093号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11544 (FERM P-5484) 特開昭56-144093号公報第435頁左下欄参照
【００６５】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11225 (FERM P-4370) 特開昭60-87788号公報第473頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11512 (FERM P-5332) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11513 (FERM P-5333) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11514 (FERM P-5334) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11522 (FERM P-5342) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11523 (FERM P-5343) 特公昭62-36679号公報第185頁２欄 参照
【００６６】
（２）培養法
上記宿主を培養する方法は、従来のアミノ酸生産菌の培養方法と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものである。
【００６７】
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。尚、アミノ酸等の栄養要求性変異株を宿主に使用する場合は、その株が要求するアミノ酸等の栄養素を培地に適宜加える必要がある。以下に、アミノ酸製造に用いる培地として、リジン製造用の培地の一例を表１に示す。尚、炭酸カルシウムは別個に殺菌後、他成分に添加する。
【００６８】
【表１】

【００６９】
培養は、好気的条件下で培地のｐＨ及び温度を適宜調節しつつ、実質的にアミノ酸の生成蓄積が停止するまで行われる。こうして培養液中に蓄積されたアミノ酸を採取するには、通常の方法を適用できる。
【００７０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
【００７１】
【実施例１】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の取得
すでにクローニングされ、塩基配列も決定されているホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をベクタープラスミドｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位に挿入して得られたプラスミドｐＳ２を用いて、変異型遺伝子の作製を行った。ｐＳ２は、薬剤耐性マーカー遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子を有する（Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984）。
【００７２】
ｐＳ２ＤＮＡを、ヒドロキシルアミン処理溶液（２０μｇ／ｍｌ ｐＳ２ＤＮＡ、０．０５Ｍ リン酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４Ｍヒドロキシルアミン）で、７５℃、２時間処理した。ヒドロキシルアミン処理は、ｐＨの影響を受けるので、水酸化ナトリウムでｐＨを６．０に調整した１Ｍヒドロキシルアミン・ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液８０μｌと、０．１Ｍ リン酸ナトリウム（pH6.0）、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１００μｌと、２μｇのｐＳ２ＤＮＡを含むＴＥ（10mM Tris-HCl、1mM EDTA）緩衝液とを混合し、最終的に水で２００μｌとした。
【００７３】
上記条件は、処理後のｐＳ２でエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換したときに、アンピシリン含有培地での形質転換体の生存率が処理前の０．２％となる条件である。
【００７４】
ヒドロキシルアミン処理したｐＳ２でエシェリヒア・コリＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリンを含む平板培地に塗布し、約１００００コロニーの形質転換体を得た。これらを液体培地に懸濁し、アスパラギン酸のアナログ化合物である３−ブロモピルビン酸（３ＢＰ）、アスパラギン酸−β−ヒドラジド（ＡＨＹ）、ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸（βＨＡ）のいずれかを最小阻止濃度付近の濃度で含む平板培地に、培地１枚あたり１０³〜１０⁵個となるように塗布し、生育するコロニーを選択した。
【００７５】
こうして得られたアナログ化合物耐性株１００株から、The Journal of Biochemistry, Vol.67, No.4, 1970に記載の方法に準じて、各々の生産するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを粗精製し、アナログ化合物による活性阻害を調べた。酵素活性の測定は、前記と同様にして行った。
【００７６】
さらに、アナログ化合物により活性を阻害されない変異型酵素を生産する菌株からプラスミドを単離し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損変異株であるエシェリヒア・コリＰＣＲ１（Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984）に導入し、変異型酵素を産生することを確認した。
【００７７】
こうして、変異型酵素遺伝子を有する５株の形質転換体を得た。これらの遺伝子の塩基配列を決定した結果、２株については同一の変異を有しており、４種類の変異型遺伝子が得られた。これらを保持する形質転換体は、ＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０８、ＡＪ １２９０９、ＡＪ １２９１０と命名され、平成５年８月３日に工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、各々順にＦＥＲＭ Ｐ−１３７７４、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７５、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７６、ＦＥＲＭ Ｐ−１３７７７として寄託されており、平成６年７月１１日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されている。また、これらの保持するプラスミドは、各々順にｐＢＰ５、ｐＨＡ１９、ｐＢＰ１２２、ｐＲ６と名付けた。各々のプラスミドに含まれるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が有する変異を、表２に示す。表中の数字は、配列番号１におけるヌクレオチド番号またはアミノ酸番号を表す。
【００７８】
【表２】

【００７９】
尚、ＡＪ １２９０７、ＡＪ １２９０９は、５００μｇ／ｍｌの３ＢＰを含む培地で、ＡＪ １２９０８は、１０００μｇ／ｍｌのβＨＡを含む培地で、ＡＪ １２９１０は、５００μｇ／ｍｌのＡＨＹを含む培地で選択されたものである。
【００８０】
【実施例２】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
上記４株の形質転換体の産生するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼについて、アスパラギン酸に対する感受性を調べた。これらの菌株は、宿主由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠損しているので、産生するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、プラスミド由来のものである。
【００８１】
アスパラギン酸に対する感受性は、既知の方法（Yoshinaga,T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Biochem.,68,747-750(1970)）に従って調べた。すなわち、活性測定系中に、活性に影響することが知られているアセチルコエンザイムＡを０．１ｍＭあるいは１ｍＭの濃度で存在させて、各形質転換体及びｐＳ２を保持する大腸菌が産生する酵素の活性を測定したところ、アスパラギン酸に対する感受性は、図９、１１のように測定された。
【００８２】
この結果から、アスパラギン酸が高濃度になると、野生型の酵素は活性を失うのに対し、本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、活性を実質的に保持し続けていることが明らかである。
【００８３】
【実施例３】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−スレオニンの発酵生産
エシェリヒア・コリのスレオニン生産菌としてはＢ−３９９６株（特表平3-501682号公報）が現在知られている内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの評価を行うにあたり、Ｂ−３９９６を宿主として用いることにした。このＢ−３９９６株は、Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding に、登録番号 RIA 1867 のもとに寄託されている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしてはｐＢＰ５を選び、実験に供した。
【００８４】
エシェリヒア・コリＢ−３９９６に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離した。対照として、野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＳ２でエシェリヒア・コリＢ−３９９６を同様に形質転換した。
【００８５】
エシェリヒア・コリＢ−３９９６及びその形質転換体を、それぞれ表３の組成の培地２０ｍｌを注入した５００ｍｌ坂口フラスコに接種して３７℃にて４０時間培養し、Ｌ−スレオニンの生産量を調べたところ、表４に示す結果を得た。尚、前記培地は、グルコースとＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、及びそれ以外の成分とに２分し、ＫＯＨでpH7.0 に調整した後に、１１５℃で１０分間オートクレーブし、これらを混合した後に別殺菌したＣａＣＯ₃を３０ｇ／ｌ添加した。
【００８６】
【表３】

【００８７】
【表４】

【００８８】
この結果から明らかなように、本発明のＤＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＢ−３９９６は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＢ−３９９６よりもスレオニン生産能が向上した。
【００８９】
【実施例４】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるＬ−グルタミン酸の発酵生産
エシェリヒア・コリ グルタミン酸生産菌としては、特開平４−１１４６１号公報に示されるエシェリヒア・コリＡＪ １２６２８が、現在知られている内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを評価するにあたり、ＡＪ １２６２８を宿主として用いることにした。ＡＪ １２６２８株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に登録番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５３のもとに寄託されている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしてはｐＢＰ５を選び、実験に供した。
【００９０】
エシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
【００９１】
エシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドｐＢＰ５を、Hanahan（J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983)）の方法により導入し、形質転換体を分離した。同様に、ｐＳ２によるエシェリヒア・コリ ＡＪ １２６２８の形質転換体を分離した。
【００９２】
し、これらを混合した後に別殺菌したＣａＣＯ₃を３０ｇ／ｌ添加した。
【００９３】
【表５】

【００９４】
【表６】

【００９５】
この結果から明らかなように、本発明のＤＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリＡＪ １２６２８は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリＡＪ １２６２８よりもグルタミン酸生産能が向上した。
【００９６】
【実施例５】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したコリネホルム細菌によるリジンの生産
変異型遺伝子をコリネホルム細菌に導入して発現させるために、ブレビバクテリウム属細菌由来のプロモーターの取得を行い、変異型遺伝子に連結し、発現型プラスミドを作製した。さらに、これをブレビバクテリウム属細菌に導入し、Ｌ−リジンの製造を行った。
【００９７】
＜１＞ブレビバクテリウム属細菌由来アスパルトキナーゼ（ＡＫ）遺伝子の取得ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）野生株ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCR（polymerase chain reaction；White,T.J. et al. ;Trends Genet., 5,185(1989)参照）によりＡＫ遺伝子を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列（Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照）を基にしてＡＫ遺伝子をコードする約1643bpの領域を増幅すべく、23merのオリゴヌクレオチド（配列番号２）及び21merのオリゴヌクレオチド（配列番号３）を合成した。
【００９８】
ＤＮＡの合成は、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法（Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照）を用いて、常法に従って合成した。PCR反応は、宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。
【００９９】
増幅した1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI（宝酒造（株）製）及びEcoRI（宝酒造（株）製）にて切断した。遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399（Takeshita, S. et al.;Gene(1987),61,63-74参照）を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI（宝酒造（株）製）及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅したＡＫ遺伝子断片と接続した。
【０１００】
ＤＮＡの接続はＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）製）を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム染色体より増幅されたＡＫ遺伝子断片の接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13869由来のＡＫ遺伝子を有するプラスミドをp399AKYと命名した。
【０１０１】
＜２＞ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのＡＫ遺伝子の塩基配列の決定
ＡＫプラスミドp399AKYを調製し、ＡＫ遺伝子の塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方法（F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74,5463(1977)などがある）によった。結果を配列表配列番号４に記す。同ＤＮＡ断片は２つのオープン・リーディング・フレームをもち、これらはおのおの、ＡＫのαサブユニットとβサブユニットに対応する。各々のオープン・リーディング・フレームに対応するアミノ酸配列を、配列番号４及び配列番号５に示す。
【０１０２】
＜３＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミドの作製
野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持するプラスミドであるｐＳ２、及び取得した変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持するプラスミドであるｐＢＰ５より、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含む約４．４ｋｂのSalI断片を抽出し、大腸菌に汎用されているプラスミドベクターｐＨＳＧ３９９のSalIサイトに導入した。作製したプラスミドを、野生型をｐＨＳ２、変異型をｐＨＢＰ５と各々命名した。
【０１０３】
ｐＨＳ２およびｐＨＢＰ５をブレビバクテリウム中で発現するプラスミドとすべく、ブレビバクテリウム中で機能するプロモーター、及びプラスミドの複製起点の導入を行った。プロモーターとしては、クローン化したＡＫ遺伝子のプロモーター領域と推定される、塩基配列の１番目のNruIサイトから２０７番目のApaLIサイトまでを含む遺伝子断片をp399AKYより抽出し、ｐＨＳ２およびｐＨＢＰ５の構造遺伝子の約６０ｂｐ手前にあるAvaIサイトに転写方向が順方向となるよう挿入した。
【０１０４】
更に、ベクター上にあるサイトにブレビバクテリウム中でプラスミドの自律増殖を可能にする遺伝子断片、すなわちプラスミドの複製起点を導入した。プラスミドの複製起点を含む遺伝子断片は、ブレビバクテリウム用ベクターｐＨＣ４（特開平５−７４９１号公報段落番号１０参照、同プラスミドを保持するエシェリヒア・コリAJ 12036は工業技術院微生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号FERM P12215が付されている）より抽出し、両末端の制限酵素部位をリンカーの導入によりPstIサイトに改変した。
【０１０５】
この断片を、ブレビバクテリウムのプロモーターを付加したプラスミドの、ベクター部分であるPstIサイトに導入した。構築した発現型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドを、ｐＳ２に由来する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドをｐＨＳ２Ｂ、ｐＢＰ５に由来する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドをｐＨＢＰ５Ｂと各々命名した。
【０１０６】
＜４＞ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミドを用いたＬ−リジンの生産
作成したｐＨＳ２Ｂ、ｐＨＢＰ５Ｂを各々ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＬ−リジン生産菌であるＡＪ ３４６３（特公平51-34477号公報参照）に導入した。遺伝子の導入は、電気パルスを用いた形質転換法を用いた（特開平２−２０７７９１号公報参照）。宿主及び形質転換体を表７の組成のリジン生産培地にて７２時間、３１．５℃にて振蘯培養を行った。前記培地は、表に記載の成分のうちＣａＣＯ₃以外を１ｌの水に添加し、KOHを用いてpH8.0に調整後、115℃、15分間オートクレーブした後、乾熱滅菌したＣａＣＯ₃をさらに添加して調製した。培養後の培地中のＬ−リジンの蓄積量を表８に示す。
【０１０７】
【表７】

【０１０８】
【表８】

【０１０９】
この結果に示されるように、本発明のＤＮＡ配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６３は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ＡＪ ３４６３よりもリジン生産能が向上した。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡ配列は、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードし、このＤＮＡ配列を保持する微生物は、前記酵素を産生する。
【０１１１】
本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、アスパラギン酸による活性阻害を実質的に受けないので、アスパラギン酸により生合成の調節を受けるアミノ酸の醗酵生産等に利用することができる。
【０１１２】
【配列表】

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ３−ブロモピルビン酸による生育阻害を示す図。
【図２】 アスパラギン酸−β−ヒドラジドによる生育阻害を示す図。
【図３】 ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸による生育阻害を示す図。
【図４】 ３−ブロモピルビン酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図５】 アスパラギン酸−β−ヒドラジドに対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図６】 ＤＬ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図７】 生育に与える生育回復因子の影響。
【図８】 生育阻害物質のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性に対する阻害を示す図。
【図９】 本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
【図１０】 本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, a gene encoding the same, and a method for producing an amino acid. More specifically, the present invention relates to a gene having a mutation that cancels feedback inhibition by aspartic acid and use thereof.
[0002]
[Prior art]
Phosphoenolpyruvate carboxylase is an enzyme found in most bacteria and all plants. The role of this enzyme is to supply C4 dicarboxylic acid for biosynthesis of aspartic acid and glutamic acid and for maintaining rotation in the citric acid cycle. However, there are few reports showing the effect of this enzyme on the fermentative production of amino acids using microorganisms, and its importance is not clear (Atushi, Yokota and Isamu, Shiio, Agric. Biol. Chem., 52, 455- 463 (1988), Josef, Cremer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (1991), Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274 (1993)) .
[0003]
By the way, amino acids are compounds that are universally present in cells as protein components, but their production is strictly controlled for economic energy metabolism and substance metabolism. This control is mainly feedback control, i.e., control by inhibiting the activity of an enzyme that catalyzes an upstream reaction by a product downstream of the metabolic pathway, and phosphoenolpyruvate carboxylase is also subject to various regulation of activity expression. Yes.
[0004]
For example, the activity of phosphoenolpyruvate carboxylase of the genus Escherichia and Corynebacterium is inhibited by aspartic acid.
[0005]
Conventionally, various techniques have been developed for efficient production in amino acid fermentation, and fermentation production of leucine, isoleucine, tryptophan, phenylalanine and the like using mutants that have become insensitive to feedback control has been performed. However, there is no known phosphoenolpyruvate carboxylase mutant enzyme that has become insensitive to inhibition by aspartic acid, or an attempt to use it for fermentation production of amino acids of the aspartic acid group or glutamic acid group.
[0006]
On the other hand, the ppc gene, which encodes the phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli, has already been cloned and the nucleotide sequence has been determined (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki HJ Biochem. 95, 909-916 (1984)), but there is no report of a mutant in which inhibition by aspartic acid is released even in this enzyme.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and an object of the present invention is to provide a phosphoenolpyruvate carboxylase, a gene thereof, and a method for using the same, in which feedback inhibition by aspartic acid is substantially eliminated.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has succeeded in substantially inhibiting inhibition by aspartic acid by substituting an amino acid at a specific site of E. coli phosphoenolpyruvate carboxylase with another amino acid. It was found that the gene was released, and succeeded in obtaining a gene encoding such a mutant enzyme, thereby completing the present invention.
[0009]
That is, the present invention is a phosphoenolpyruvate carboxylase derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia, wherein the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase has a mutation that cancels feedback inhibition of aspartate of phosphoenolpyruvate carboxylase, and This is a DNA sequence encoding this mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
[0010]
The present invention further comprises a microorganism belonging to the genus Escherichia or coryneform which retains this DNA fragment, and these microorganisms are cultured in a suitable medium, from which L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine are cultured. A method for producing an amino acid, comprising separating an amino acid selected from L-glutamic acid, L-arginine and L-proline.
[0011]
In the present specification, a DNA sequence encoding a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase or a DNA sequence including a promoter is simply referred to as “the DNA sequence of the present invention”, “mutant gene” or phosphoenolpyruvate carboxylase gene. Sometimes.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0013]
<1> Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
The mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention (hereinafter also simply referred to as “mutant enzyme”) cancels feedback inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase by aspartate in phosphoenolpyruvate carboxylase of microorganisms belonging to the genus Escherichia. It has a mutation to do.
[0014]
As such a mutation, any mutation can be used as long as it substantially cancels the feedback inhibition without losing the enzyme activity of phosphoenolpyruvate carboxylase. When enolpyruvate carboxylase is present in a cell of a microorganism belonging to the genus Escherichia, a mutation that confers resistance to a compound having the following properties on the cell;
Shows growth inhibitory action against microorganisms belonging to the genus Escherichia that produce wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase,
The growth inhibitory action is restored by the presence of L-glutamic acid or L-aspartic acid, and
Inhibits wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase activity.
[0015]
More specifically, from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase.
(1) A mutation that replaces the 625th glutamic acid with lysine,
(2) Mutation that replaces the 222nd arginine with histidine and the 223rd glutamic acid with lysine,
(3) Mutations that replace 288th serine with phenylalanine, 289th glutamic acid with lysine, 551st methionine with isoleucine, and 804th glutamic acid with lysine,
(4) Mutation that replaces 867th alanine with threonine,
Is mentioned.
[0016]
As the phosphoenolpyruvate carboxylase of microorganisms belonging to the genus Escherichia, the amino acid sequence deduced from the phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki HJBiochem. 95, 909-916 (1984)) is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0017]
The mutant enzyme is encoded by the following DNA sequence of the present invention, and is produced by expressing this DNA sequence in Escherichia coli or the like.
[0018]
<2> DNA sequence of the present invention and microorganisms holding the same
On the other hand, the DNA sequence of the present invention is a DNA sequence encoding the above-mentioned mutant enzyme, and feedback inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase by aspartate in a DNA fragment encoding phosphoenolpyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia. It has a mutation in the coding region that cancels.
[0019]
Specifically, in the DNA sequence encoding the phosphoenolpyruvate carboxylase having the mutations (1) to (4) above, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
i) a mutation in which GAA of base numbers 2111 to 2113 is converted to AAA or AAG;
ii) a mutation that converts CGCs of base numbers 902 to 904 to CAT or CAC, and GAA of 905 to 907 to AAA or AAG, respectively.
iii) TCT of base numbers 1100 to 1102 is TTT or TTC, GAA of 1103 to 1105 is AAA or AAG, ATG of 1889 to 1891 is ATT, ATC or ATA, and GAA of 2648 to 2650 is AAA or AAG Mutation to convert each
iv) Mutations in which 2837-2839 GCG is converted to ACT, ACC, ACA, or ACG
Or a DNA sequence having any of the following.
[0020]
Such a mutant gene is obtained by mutating a recombinant DNA obtained by linking a phosphoenolpyruvate carboxylase gene having a wild-type enzyme gene or other mutation and a vector DNA suitable for the host, It is obtained by screening from the transformant according to 1. Alternatively, a microorganism that produces a wild-type enzyme may be mutated to create a mutant strain that produces the mutant enzyme, and then a mutant gene may be screened from the mutant strain. Hydroxylamine or the like is used for the mutation treatment of the recombinant DNA. In addition, when the microorganism itself is mutated, a drug or method usually used for artificial mutation may be used.
[0021]
The phosphoenolpyruvate carboxylase gene having the above wild-type enzyme gene or other mutation may be any gene that encodes phosphoenolpyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia, and its base sequence has been determined. Preferably it has been cloned. If not cloned, a DNA fragment containing the gene can be amplified and isolated using PCR or the like and then cloned using an appropriate vector.
[0022]
As the above gene, for example, an E. coli gene (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki, HJ Biochem. 95, 909- 916 (1984)). The sequence of the coding region of this gene is as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (base numbers 239 to 2890).
[0023]
Screening of a host having a mutated gene can be performed using an aspartic acid analog compound. The analog compound preferably has the following properties. That is, it exhibits a growth inhibitory action against microorganisms belonging to the genus Escherichia that produce wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase, which is restored by the presence of L-glutamic acid or L-aspartic acid, Inhibits enol pyruvate carboxylase activity.
[0024]
Aspartic acid can be obtained by selecting an analog compound as described above as an indicator of inhibition of growth of a microorganism belonging to the genus Escherichia that produces a wild-type enzyme, for example, Escherichia coli HB101, and screening for a mutant strain resistant to the analog compound. It is highly possible to obtain a host that produces phosphoenolpyruvate carboxylase in which feedback inhibition by is released.
[0025]
As a general structure of inhibitors of phosphoenolpyruvate carboxylase, it has been proposed that it is essential to adopt a C4 dicarboxylic acid structure. From such a viewpoint, the present inventor screened various compounds. Escherichia coli HB101 is pre-cultured in LB medium, DL-2-amino-4-phosphonobutyric acid, meso-2,3-dibromosuccinic acid bromosuccinate, 2,2-difluorosuccinic acid, 3-bromopyruvic acid, α -Ketobutyric acid, α-ketoadipic acid, DL-threo-β-hydroxyaspartic acid, L-aspartic acid-β-methyl ester, α-methyl-DL-aspartic acid, 2,3-diaminosuccinic acid or aspartic acid-β -Main culture in M9 medium containing hydrazide (thiamin 20 μg / ml, Leu, Pro 3 μg / ml each) and measuring the absorbance at 660 nm over time, the growth was examined.
[0026]
Furthermore, when these compounds are present at growth inhibitory concentrations, addition of nucleic acids (uridine, adenosine 10 mg / dl each), glutamic acid, or aspartic acid group amino acids (Asp 0.025%, Met, Thr, Lys 0.1% each) Was used to determine whether the inhibition was restored.
[0027]
As a result, three compounds, 3-bromopyruvic acid (3BP) (Chemical formula 1), aspartic acid-β-hydrazide (AHY) (Chemical formula 2), DL-threo-β-hydroxyaspartic acid (βHA) (Chemical formula 3) ) Was selected.
[0028]
[Chemical 1]

[0029]
[Chemical formula 2]

[0030]
[Chemical 3]

[0031]
The growth inhibition of E. coli by these analog compounds is shown in FIGS. Furthermore, the growth recovery of Escherichia coli when the inhibitory recovery substance is added alone or as a mixture of two or three types is shown in FIGS. As a control, FIG. 7 shows the growth when an inhibitory recovery substance was added in the absence of the inhibitory substance. In FIGS. 4 to 7, additives 1, 2, and 3 represent nucleic acids, glutamic acid, or aspartic acid group amino acids, respectively.
[0032]
Furthermore, activity inhibition by analog compounds against phosphoenolpyruvate carboxylase was examined. The enzyme activity was measured according to the method described in Yoshinaga, T., Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970).
[0033]
Escherichia coli HB101 cultured in LB medium was crushed, the suspension was centrifuged, and the supernatant was used as a crude enzyme solution. Measurement of enzyme activity affects activity in a measurement system containing 2 mM potassium phosphoenolpyruvate, 0.1 mM NADH, 0.1 M tris-acetic acid (pH 8.5), 1.5 U malate dehydrogenase, and crude enzyme. This was done by measuring the decrease in absorbance at 340 nm in the presence of acetyl coenzyme A, known to be present, at a concentration of 0.1 mM. The results are shown in FIG.
[0034]
From the above results, it is clear that the above three analog compounds inhibit the growth of Escherichia coli and cannot recover this inhibition by nucleic acid alone, but can recover the inhibition by addition of glutamic acid or aspartic acid group amino acids. Therefore, these analog compounds were presumed to be selective inhibitors of phosphoenolpyruvate carboxylase. In the present invention, as shown in the examples described later, these three compounds were used to successfully select E. coli that produces mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
[0035]
By screening a transformant having the target mutant enzyme gene using the above compound and recovering the recombinant DNA, the mutant enzyme gene can be obtained. When the microorganism itself is mutated, the above compound is used to screen for a mutant strain having the target mutant enzyme gene, and a DNA fragment containing the target mutant enzyme gene is isolated from the strain, When ligated to an appropriate vector, the mutant enzyme gene can be obtained.
[0036]
A mutant enzyme can be produced by expressing a DNA fragment encoding a phosphoenolpyruvate carboxylase having a mutation introduced in this manner, using an appropriate host-vector system. Moreover, even if it transforms by incorporating the DNA fragment of this invention in host chromosomal DNA, the target mutant enzyme can be produced.
[0037]
Examples of the host include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli and coryneform bacteria. Coryneform bacteria have been classified as Corynebacterium, traditionally Brevibacterium, but are now integrated as Corynebacterium, and Brevi, which is closely related to Corynebacterium. Contains bacteria belonging to the genus Bacteria. A host suitable for amino acid production will be described later.
[0038]
On the other hand, as the vector DNA, a plasmid vector is preferable, and a vector capable of autonomous replication in a host cell is preferable. When the host is Escherichia coli, examples thereof include pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 and the like. In addition, phage DNA vectors can also be used.
[0039]
Moreover, the vector which can be used when a host is coryneform bacteria, and the host holding it are illustrated below. The deposit number of the international depository is shown in parentheses.
[0040]

[0041]
These vectors are obtained from the deposited microorganism as follows. Cells collected in the logarithmic growth phase are lysed using lysozyme and SDS, centrifuged at 30000 × g, polyethylene glycol is added to the supernatant obtained from the lysate, and cesium chloride-ethidium bromide equilibrium density gradient centrifugation. Separate and purify by separation.
[0042]
In order to transform Escherichia coli with a recombinant vector obtained by inserting the DNA sequence of the present invention into the above vector, for example, a method in which cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)), and the like can be used.
[0043]
Coryneform bacteria can also be transformed by treating the cells with calcium chloride or by incorporating the cells at a specific growth stage in which the cells can take up DNA (related to Bacillus subtilis by Duncan, CH et al.). Report). Furthermore, it can be incorporated into bacterial cells by shaping protoplasts or spheroplasts of DNA receptors that readily incorporate platimide DNA. These are known for Bacillus subtilis, Actinomyces and yeast (Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979), Bibb et al., Nature, 274, 398. (1978), Hinnnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). In addition, JP-A-2-207791 discloses a method for transforming coryneform bacteria.
[0044]
In order to express the DNA sequence of the present invention in the above-mentioned host, a promoter that works efficiently in microorganisms such as lac, trp, and PL may be used, and the DNA sequence of the present invention can be used as a promoter of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene. If included, this may be used as it is. In addition, when a coryneform bacterium is used as a host, a known trp promoter derived from a bacterium belonging to the genus Brevibacterium (Japanese Patent Laid-Open No. 62-244382) or the like can also be used.
[0045]
In addition, as described above, the DNA sequence of the present invention inserted into a vector DNA capable of autonomous replication may be introduced into the host and retained as a plasmid in the host, but the DNA sequence of the present invention may be transposon (Berg DE and Berg, CM, Bio / Technol., 1,417 (1983)), Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985) or homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)). It may be integrated into the chromosome of the microorganism by a method. In order to incorporate the DNA of the present invention into the chromosome of coryneform bacteria, a temperature sensitive plasmid disclosed in JP-A-5-7491 can be used.
[0046]
When a microorganism transformed with the DNA sequence of the present invention is cultured as described above and this DNA sequence is expressed, a mutant enzyme is obtained. Whether the mutant enzyme thus obtained has been released from feedback inhibition by aspartic acid can be clarified by measuring the activity by adding aspartic acid to the enzyme reaction system.
[0047]
In addition, since the DNA sequence of the present invention encodes a mutant enzyme in which feedback inhibition by aspartic acid has been released, a microorganism having this DNA sequence can be used as an amino acid of aspartic acid group or glutamic acid group as shown below. It can be used for efficient fermentation production.
[0048]
Escherichia coli AJ 12907, AJ 12908, AJ 12909, and AJ 12910, which retain the mutant enzyme gene obtained in the examples described later, were founded on August 3, 1993 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (zip code). 305, Ibaraki Prefecture Tsukuba City East 1-3-3, respectively) are deposited in order as FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13777, FERM P-13777, respectively, July 11, 1994 In addition, this original deposit was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty and deposited as deposit numbers FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, and FERM BP-4737.
[0049]
<3> Amino acid production method
An amino acid can be produced by culturing a microorganism retaining the DNA sequence of the present invention in a suitable medium and separating the resulting amino acid. Examples of such amino acids include L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, L-glutamic acid, L-arginine, and L-proline.
[0050]
Examples of suitable hosts and culture methods for introducing the DNA sequence of the present invention and using them for the production of each amino acid are shown below.
[0051]
(1) A suitable host for the method for producing an amino acid of the present invention
(i) Suitable host for L-lysine production
Examples of a host used for producing L-lysine according to the present invention include Escherichia bacteria, preferably L-lysine-producing Escherichia coli. Specifically, mutants having resistance to lysine analogs can be exemplified. This lysine analog is such that it inhibits the growth of Escherichia microorganisms, but its suppression is such that it is released in whole or in part if L-lysine coexists in the medium. Examples include oxalysine, lysine hydroxamate, S- (2-aminoethyl) -cysteine (hereinafter abbreviated as “AEC”), γ-methyllysine, α-chlorocaprolactam, and the like. Mutant strains resistant to these lysine analogs can be obtained by subjecting Escherichia microorganisms to normal artificial mutation procedures. Specific examples of the strain used for the production of L-lysine include Escherichia coli AJ11442 (deposited as FERM P-5084; see JP-A-56-18596, page 471, lower left column).
[0052]
On the other hand, various artificial mutants of coryneform bacteria are used as L-lysine-producing bacteria, and these can be used in the present invention. Examples of such artificial mutants are as follows. AEC resistant mutants, mutants that require amino acids such as L-homoserine for their growth (Japanese Patent Publication No. 48-28078, Japanese Patent Publication No. 56-6499), AEC resistant, L-leucine, L- Mutants requiring amino acids such as homoserine, L-proline, L-serine, L-arginine, L-alanine, L-valine (US Pat. Nos. 3,708,395 and 3,825,472), DL-α-amino-ε-caprolactam , Α-amino-lauryl lactam, quinoid, L-lysine production mutants resistant to N-lauroylleucine, oxaloacetate decarboxylase (decarboxylase) or L-lysine production resistant to respiratory enzyme inhibitors Mutants (JP 50-53588, JP 50-31093, JP 52-102498, JP 53-8608) No. 55-9783, No. 55-9759, No. 56-32995, No. 56-39778, No. 53-43591, No. 53-1833), Inositol Or L-lysine production mutants requiring acetic acid (JP 55-9784, JP 56-8692), L-lysine production mutants having sensitivity to fluoropyruvic acid or a temperature of 34 ° C. or higher (JP-A-55-9783, JP-A-53-86090), a Brevibacterium or Corynebacterium mutant that exhibits resistance to ethylene glycol and produces L-lysine (see US Patent Application No. 333455) .
[0053]
Specific coryneform bacteria used for lysine production include the following.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12031 (FERM BP-277) Refer to JP-A-60-62994, page 525, lower left column
Brevibacterium lactofermentum ATCC39134 Refer to JP-A-60-62994, page 473, lower right column
Brevibacterium lactofermentum AJ 3463 (FERM P-1987) Japanese Patent Publication No. 51-34477
Further, the following wild strains of coryneform bacteria can also be used in the present invention.
[0054]

[0055]
(ii) Suitable host for L-threonine production
Escherichia coli B-3996 (RIA 1867) Refer to Japanese Patent Publication No. 3-501682
Escherichia coli AJ 12349 (FERM P-9574) JP-A-2-458, page 887, upper left column
Escherichia coli AJ 12351 (FERM P-9576) JP-A-2-458, page 887, lower right column
Escherichia coli AJ 12352 (FERM P-9577) Refer to JP-A-2-458, page 888, upper left column.
Escherichia coli AJ 11332 (FERM P-4898) Refer to JP-A-2-458, page 889, upper left column.
Escherichia coli AJ 12350 (FERM P-9575) Refer to JP-A-2-458, page 889, upper left column.
Escherichia coli AJ 12353 (FERM P-9578) JP-A-2-458, page 889, upper right column
Escherichia coli AJ 12358 (FERM P-9764) Refer to JP-A-2-458, page 890, upper left column
Escherichia coli AJ 12359 (FERM P-9765) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2-458, page 890, upper left column
Escherichia coli AJ 11334 (FERM P-4900) Japanese Patent Publication No. 1-29559, page 201, column 6
Escherichia coli AJ 11333 (FERM P-4899) See Japanese Patent Publication No. 1-29559, page 201, column 6
Escherichia coli AJ 11335 (FERM P-4901) Japanese Patent Publication No. 1-29559, page 202, column 7
[0056]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium lactofermentum AJ 11188 (FERM P-4190) Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-87788, page 473, upper right column
Corynebacterium glutamicum AJ 11682 (FERM BP-118) Japanese Patent Publication No. 2-31956, page 230, column 8
Brevibacterium flavum AJ 11683 (FERM BP-119) See Japanese Patent Publication No. 2-31956, p.231, column 10.
[0057]
(iii) Suitable host for L-methionine production
The following strains are mentioned for L-methionine production.
Escherichia coli AJ 11457 (FERM P-5175) Japanese Patent Laid-Open No. 56-35992, page 552, upper right column
Escherichia coli AJ 11458 (FERM P-5176) Japanese Patent Laid-Open No. 56-35992, page 552, upper right column
Escherichia coli AJ 11459 (FERM P-5177) Japanese Patent Laid-Open No. 56-35992, page 552, upper right column
Escherichia coli AJ 11539 (FERM P-5479) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 56-144092, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11540 (FERM P-5480) Japanese Patent Laid-Open Publication No. 56-144092, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11541 (FERM P-5481) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 56-144092, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11542 (FERM P-5482) Japanese Patent Laid-Open No. 56-144092, page 435, lower left column
[0058]
(iv) A suitable host for the production of L-aspartic acid
The following strains can be mentioned for the production of L-aspartic acid.
Brevibacterium flavum AJ 3859 (FERM P-2799) JP 51-61689, page 524, upper left column
Brevibacterium lactofermentum AJ 3860 (FERM P-2800) JP 51-61689, page 524, upper left column
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 3877 (FERM P-2803) See JP-A-51-61689, page 524, upper left column
Corynebacterium glutamicum AJ 3876 (FERM P-2802) JP 51-61689, page 524, upper left column
[0059]
(v) Suitable host for L-isoleucine production
Examples of Escherichia bacteria include Escherichia coli KX141 (VKPM-B4781) (see JP-A-4-330275, paragraph 45), and examples of coryneform bacteria include Brevibacterium lactofermentum AJ 12404 (FERM P-10141) ( JP-A-2-42988, page 603, lower left column) and Brevibacterium flavum AJ 12405 (FERM P-10142) (see JP-A-2-42988, page 524, lower left column).
[0060]
(vi) A suitable host for the production of L-glutamic acid
Examples of the Escherichia bacterium include the following strains.
Escherichia coli AJ 12628 (FERM P-12380) '93 See French Patent Publication No. 2 680 178
Escherichia coli AJ 12624 (FERM P-12379) See '93 French Patent Publication No. 2 680 178
[0061]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12745 (FERM BP-2922) Refer to JP-A-3-49690, page 561, lower right column
Brevibacterium lactofermentum AJ 12746 (FERM BP-2923) See JP-A-3-49690, page 562, upper left column
Brevibacterium lactofermentum AJ 12747 (FERM BP-2924) Refer to JP-A-3-49690, page 562, upper left column
Brevibacterium lactofermentum AJ 12748 (FERM BP-2925) Refer to JP-A-3-49690, page 562, upper left column
Brevibacterium flavum ATCC 14067 See Table 1 on page 3 of JP-A-5-3793
Corynebacterium glutamicum ATCC 21492 See Table 1 on page 3 of JP-A-5-3793
[0062]
(vii) A suitable host for L-arginine production
Examples of the Escherichia bacterium include the following strains.
Escherichia coli AJ 11593 (FERM P-5616) Japanese Patent Laid-Open No. 57-5693, page 468, upper left column
Escherichia coli AJ 11594 (FERM P-5617) Japanese Patent Laid-Open No. 57-5693, page 468, upper right column
[0063]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium flavum AJ 12144 (FERM P-7642) Japanese Patent Publication No. 5-27388, page 174, column 4
Corynebacterium glutamicum AJ 12145 (FERM P-7643) Japanese Patent Publication No. 5-27388, page 174, column 4
Brevibacterium flavum ATCC 21493 See Table 1 on page 3 of JP-A-5-3793
Corynebacterium glutamicum ATCC 21659 See Table 1 on page 3 of JP-A-5-3793
[0064]
(viii) A suitable host for producing L-proline
Examples of the Escherichia bacterium include the following strains.
Escherichia coli AJ 11543 (FERM P-5483) Japanese Patent Laid-Open Publication No. 56-144093, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11544 (FERM P-5484) Japanese Patent Laid-Open No. 56-144093, page 435, lower left column
[0065]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium lactofermentum AJ 11225 (FERM P-4370) See JP-A-60-87788, page 473, upper left column
Brevibacterium flavum AJ 11512 (FERM P-5332) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185, column 2
Brevibacterium flavum AJ 11513 (FERM P-5333) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185, column 2
Brevibacterium flavum AJ 11514 (FERM P-5334) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185, column 2
Corynebacterium glutamicum AJ 11522 (FERM P-5342) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185, column 2
Corynebacterium glutamicum AJ 11523 (FERM P-5343) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185, column 2
[0066]
(2) Culture method
The method for culturing the host is not particularly different from the conventional method for culturing amino acid-producing bacteria. That is, the medium is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and, if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins.
[0067]
As the carbon source, glucose, sucrose, lactose and the like, starch hydrolyzate containing them, whey, molasses and the like are used. As the nitrogen source, ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt and the like can be used. When an auxotrophic mutant such as an amino acid is used as a host, it is necessary to appropriately add nutrients such as an amino acid required by the strain to the medium. Table 1 shows an example of a medium for producing lysine as a medium used for amino acid production. In addition, calcium carbonate is added to other components after sterilizing separately.
[0068]
[Table 1]

[0069]
Culturing is performed until the production and accumulation of amino acids is substantially stopped while appropriately adjusting the pH and temperature of the medium under aerobic conditions. In order to collect amino acids accumulated in the culture medium in this way, ordinary methods can be applied.
[0070]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0071]
[Example 1]
Acquisition of mutant phosphoenolpyruvate carboxylase gene
Using the plasmid pS2 obtained by inserting the phosphoenolpyruvate carboxylase gene, which has already been cloned and whose nucleotide sequence has been determined, into the SalI site of the vector plasmid pBR322, a mutant gene was prepared. pS2 has an ampicillin resistance gene as a drug resistance marker gene (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984).
[0072]
pS2DNA was treated with hydroxylamine treatment solution (20 μg / ml pS2DNA, 0.05 M sodium phosphate (pH 6.0), 1 mM EDTA, 0.4 M hydroxylamine) at 75 ° C. for 2 hours. Since hydroxylamine treatment is affected by pH, 80 μl of 1 M hydroxylamine / HCl, 1 mM EDTA solution adjusted to pH 6.0 with sodium hydroxide, 0.1 M sodium phosphate (pH 6.0), 1 mM EDTA 100 μl of the solution and TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) buffer containing 2 μg of pS2 DNA were mixed and finally made up to 200 μl with water.
[0073]
The above conditions are such that when Escherichia coli HB101 is transformed with pS2 after the treatment, the viability of the transformant in the ampicillin-containing medium is 0.2% before the treatment.
[0074]
Escherichia coli HB101 was transformed with pS2 treated with hydroxylamine and applied to a plate medium containing ampicillin to obtain transformants of about 10,000 colonies. These are suspended in a liquid medium, and any one of 3-bromopyruvic acid (3BP), aspartic acid-β-hydrazide (AHY), DL-threo-β-hydroxyaspartic acid (βHA), which is an analog compound of aspartic acid, is added. 10 per plate of medium containing a plate around the minimum inhibitory concentration. ^Three -10 ^Five The colonies were applied so as to be individual, and colonies to grow were selected.
[0075]
According to the method described in The Journal of Biochemistry, Vol.67, No.4, 1970, the phosphoenolpyruvate carboxylase produced by each was roughly purified from 100 analog compound resistant strains thus obtained, The inhibition of the activity was investigated. The enzyme activity was measured as described above.
[0076]
Furthermore, a plasmid was isolated from a strain that produced a mutant enzyme whose activity was not inhibited by the analog compound, and Escherichia coli PCR1 (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279), which is a phosphoenolpyruvate carboxylase-deficient mutant. -283, 1984) and confirmed that a mutant enzyme was produced.
[0077]
In this way, 5 strains of transformant genes were obtained. As a result of determining the base sequences of these genes, the two strains had the same mutation, and four mutant genes were obtained. The transformants retaining these were designated as AJ 12907, AJ 12908, AJ 12909, and AJ 12910. On August 3, 1993, the Institute of Biotechnology, Tsukuba, Japan 1-3, Shitohigashi) are deposited in order as FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13777, FERM P-13777, respectively. It has been transferred to the international deposit under the Budapest Treaty and has been deposited under the accession numbers FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736 and FERM BP-4737. Moreover, these retained plasmids were named pBP5, pHA19, pBP122, and pR6, respectively. Table 2 shows the mutations possessed by the phosphoenolpyruvate carboxylase gene contained in each plasmid. The numbers in the table represent nucleotide numbers or amino acid numbers in SEQ ID NO: 1.
[0078]
[Table 2]

[0079]
AJ 12907 and AJ 12909 are mediums containing 500 μg / ml 3BP, AJ 12908 is a medium containing 1000 μg / ml βHA, and AJ 12910 is selected from a medium containing 500 μg / ml AHY. It is.
[0080]
[Example 2]
Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
The phosphoenolpyruvate carboxylase produced by the four transformants was examined for its sensitivity to aspartate. Since these strains are deficient in the host-derived phosphoenolpyruvate carboxylase gene, the produced phosphoenolpyruvate carboxylase is derived from a plasmid.
[0081]
Sensitivity to aspartic acid was examined according to a known method (Yoshinaga, T., Izui, K and Katsuki, HJ Biochem., 68, 747-750 (1970)). That is, the activity of an enzyme produced by Escherichia coli that holds each transformant and pS2 in the presence of acetyl coenzyme A, which is known to affect the activity, at a concentration of 0.1 mM or 1 mM in the activity measurement system. As a result, the sensitivity to aspartic acid was measured as shown in FIGS.
[0082]
From this result, it is clear that when the aspartic acid concentration is high, the wild-type enzyme loses its activity, whereas the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention substantially keeps its activity. is there.
[0083]
[Example 3]
Fermentative production of L-threonine by Escherichia coli introduced with a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
As a threonine-producing bacterium of Escherichia coli, B-3996 strain (Japanese Patent Publication No. 3-501682) is currently known and has the highest production capacity. Therefore, in evaluating mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, B-3996 was used as a host. This B-3996 strain has been deposited with the Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding under the registration number RIA 1867. In addition, pBP5 was selected as the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase to be evaluated and used for the experiment.
[0084]
Plasmid pBP5 having a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli B-3996 was introduced by the method of Hanahan (J. Mol. Biol., Vol. 106, p577, (1983)), and the transformant was isolated. did. As a control, Escherichia coli B-3996 was similarly transformed with pS2, which is a plasmid expressing the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase gene.
[0085]
Escherichia coli B-3996 and its transformant were inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask into which 20 ml of the medium having the composition shown in Table 3 had been injected, and cultured at 37 ° C. for 40 hours, and the amount of L-threonine produced was examined. The results shown in Table 4 were obtained. The medium is glucose and MgSO. _Four ・ 7H ₂ OCO and other components for 2 minutes, adjusted to pH 7.0 with KOH, autoclaved at 115 ° C. for 10 minutes, mixed, and then sterilized CaCO _Three Was added at 30 g / l.
[0086]
[Table 3]

[0087]
[Table 4]

[0088]
As is apparent from the results, Escherichia coli B-3996 holding the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention is more threonine than Escherichia coli B-3996 holding the plasmid expressing the wild type enzyme. Productivity improved.
[0089]
[Example 4]
Fermentative production of L-glutamic acid by Escherichia coli introduced with a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
As an Escherichia coli glutamic acid-producing bacterium, Escherichia coli AJ12628 disclosed in JP-A-4-11461 has the highest production capacity among currently known. Therefore, in evaluating mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, it was decided to use AJ12628 as a host. The AJ 12628 strain has been deposited with the registration number FERM BP-3853 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry. In addition, pBP5 was selected as the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase to be evaluated and used for the experiment.
[0090]
Plasmid pBP5 having a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli AJ 12628 was introduced by the method of Hanahan (J. Mol. Biol., Vol. 106, p577, (1983)), and the transformant was isolated. . Similarly, a transformant of Escherichia coli AJ 12628 by pS2 was isolated.
[0091]
Plasmid pBP5 having a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli AJ 12628 was introduced by the method of Hanahan (J. Mol. Biol., Vol. 106, p577, (1983)), and the transformant was isolated. . Similarly, a transformant of Escherichia coli AJ 12628 by pS2 was isolated.
[0092]
And sterilized CaCO after mixing them _Three Was added at 30 g / l.
[0093]
[Table 5]

[0094]
[Table 6]

[0095]
As is clear from this result, Escherichia coli AJ 12628 holding the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention has a higher glutamate producing ability than Escherichia coli AJ 12628 holding the plasmid expressing the wild type enzyme. Improved.
[0096]
[Example 5]
Production of lysine by coryneform bacteria introduced with mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
In order to introduce and express a mutant gene in coryneform bacteria, a promoter derived from the genus Brevibacterium was obtained and linked to the mutant gene to prepare an expression plasmid. Further, this was introduced into a bacterium belonging to the genus Brevibacterium to produce L-lysine.
[0097]
<1> Acquisition of Brevibacterium genus Aspartokinase (AK) gene Chromosomal DNA was prepared from Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) wild strain ATCC13869 according to a conventional method. The AK gene was amplified from the chromosomal DNA by PCR (polymerase chain reaction; White, TJ et al .; see Trends Genet., 5,185 (1989)). DNA primers used for amplification are based on sequences known in Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990) 224, 317-324). In order to amplify an approximately 1643 bp region encoding the AK gene, a 23-mer oligonucleotide (SEQ ID NO: 2) and a 21-mer oligonucleotide (SEQ ID NO: 3) were synthesized.
[0098]
DNA was synthesized according to a conventional method using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems and using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). For PCR reaction, DNA thermal cycler PJ2000 type manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used, and Taq DNA polymerase was used for gene amplification according to the method specified by the supplier.
[0099]
After confirming the amplified 1643 kb gene fragment by agarose gel electrophoresis, the fragment cut out from the gel was purified by a conventional method, and restriction enzymes NruI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) were used. Disconnected. PHSG399 (see Takeshita, S. et al .; Gene (1987), 61, 63-74) was used as a gene fragment cloning vector. pHSG399 was cleaved with restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and restriction enzyme EcoRI and connected to the amplified AK gene fragment.
[0100]
DNA was connected by a designated method using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). In this manner, a plasmid in which the AK gene fragment amplified from the Brevibacterium chromosome was connected to pHSG399 was prepared. A plasmid having the AK gene derived from the wild-type ATCC 13869 was named p399AKY.
[0101]
<2> Determination of nucleotide sequence of AK gene of Brevibacterium lactofermentum
AK plasmid p399AKY was prepared and the nucleotide sequence of the AK gene was determined. The nucleotide sequence was determined by the method of Sanger et al. (F. Sanger et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977), etc.). The results are shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. The DNA fragment has two open reading frames, which correspond to the α and β subunits of AK, respectively. The amino acid sequences corresponding to each open reading frame are shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
[0102]
<3> Preparation of phosphoenolpyruvate carboxylase expression type plasmid
From the plasmid pS2 carrying the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase gene and the obtained mutant phosphoenolpyruvate carboxylase gene pBP5 from the plasmid pBP5, about 4.4 kb of SalI containing the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is obtained. The fragment was extracted and introduced into the SalI site of plasmid vector pHSG399, which is widely used in E. coli. The prepared plasmid was named pHS2 for the wild type and pHBP5 for the mutant type.
[0103]
In order to make pHS2 and pHBP5 into plasmids that are expressed in Brevibacterium, a promoter that functions in Brevibacterium and an origin of replication of the plasmid were introduced. As the promoter, a gene fragment including the first NruI site to the 207th ApaLI site of the base sequence, which is presumed to be the promoter region of the cloned AK gene, is extracted from p399AKY, and about the structural genes of pHS2 and pHBP5. It was inserted into the AvaI site 60 bp before so that the transcription direction was the forward direction.
[0104]
Furthermore, a gene fragment that enables autonomous growth of the plasmid in Brevibacterium, that is, a plasmid replication origin, was introduced into a site on the vector. The gene fragment containing the origin of replication of the plasmid is the Brevibacterium vector pHC4 (see paragraph No. 10 of JP-A-5-7491, Escherichia coli AJ 12036 carrying the plasmid is the Institute of Microbiological Engineering, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) The restriction enzyme sites at both ends were modified to PstI sites by introducing linkers.
[0105]
This fragment was introduced into a PstI site, which is a vector portion, of a plasmid to which a Brevibacterium promoter was added. The constructed expression type phosphoenolpyruvate carboxylase plasmid was named pHS2B, the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase plasmid derived from pS2, and the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase plasmid derived from pBP5 was named pHBP5B.
[0106]
<4> Production of L-lysine using phosphoenolpyruvate carboxylase expression type plasmid
The prepared pHS2B and pHBP5B were each introduced into AJ 3463 (see Japanese Patent Publication No. 51-34477), which is a Brevibacterium lactofermentum L-lysine producing bacterium. The gene was introduced by a transformation method using an electric pulse (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791). The host and transformant were subjected to shaking culture at 31.5 ° C. for 72 hours in a lysine production medium having the composition shown in Table 7. The medium is CaCO among the components listed in the table. _Three Was added to 1 liter of water, adjusted to pH 8.0 with KOH, autoclaved at 115 ° C for 15 minutes, and then dry-heat sterilized CaCO _Three Was further added. Table 8 shows the amount of L-lysine accumulated in the culture medium.
[0107]
[Table 7]

[0108]
[Table 8]

[0109]
As shown in this result, Brevibacterium lactofermentum AJ 3463 holding the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention is Brevibacterium lactoferfer holding the plasmid expressing the wild type enzyme. The lysine production ability was improved over Mentum AJ 3463.
[0110]
【The invention's effect】
The DNA sequence of the present invention encodes a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, and a microorganism that retains this DNA sequence produces the enzyme.
[0111]
Since the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention is not substantially inhibited in activity by aspartic acid, it can be used for fermentation production of amino acids whose biosynthesis is regulated by aspartic acid.
[0112]
[Sequence Listing]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing growth inhibition by 3-bromopyruvic acid.
FIG. 2 is a graph showing growth inhibition by aspartic acid-β-hydrazide.
FIG. 3 is a diagram showing growth inhibition by DL-threo-β-hydroxyaspartic acid.
FIG. 4 is a graph showing the effect of an inhibitory recovery substance on 3-bromopyruvic acid.
FIG. 5 is a graph showing the effect of an inhibitory recovery substance on aspartic acid-β-hydrazide.
FIG. 6 is a graph showing the effect of an inhibitory recovery substance on DL-threo-β-hydroxyaspartic acid.
FIG. 7 shows the effect of growth recovery factors on growth.
FIG. 8 is a graph showing inhibition of a growth inhibitory substance on phosphoenolpyruvate carboxylase activity.
FIG. 9 shows inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention by aspartic acid.
FIG. 10 shows inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention by aspartic acid.

Claims (2)

A phosphoenolpyruvate carboxylase derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia , which has at least one mutation selected from the following mutations and encodes a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in which feedback inhibition by aspartic acid is released A microorganism belonging to the genus Escherichia or coryneform bacterium transformed with the DNA fragment to be incorporated into the chromosomal DNA, cultured in a suitable medium, from which L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, A method for producing an amino acid, comprising separating an amino acid selected from L-glutamic acid, L-arginine and L-proline;
(I) a mutation that substitutes lysine for the 625-th glutamic acid from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase;
(Ii) a mutation that replaces the 222nd arginine from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase with histidine and the 223rd glutamic acid with lysine,
(Iii) a mutation for substituting the 288th serine from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase with phenylalanine, the 289th glutamic acid with lysine, the 551st methionine with isoleucine, and the 804th glutamic acid with lysine;
(Iv) A mutation that substitutes threonine for the 867th alanine from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase. A phosphoenolpyruvate carboxylase derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia, which has at least one mutation selected from the following mutations and encodes a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in which feedback inhibition by aspartate is released Culturing a microorganism belonging to the genus Escherichia or coryneform bacterium transformed with a recombinant DNA obtained by linking a DNA fragment to be ligated with a vector DNA capable of autonomous replication in Escherichia or coryneform bacteria cells in a suitable medium, A method for producing an amino acid, comprising separating an amino acid selected from L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, L-glutamic acid, L-arginine and L-proline from this medium;
(I) a mutation that substitutes lysine for the 625-th glutamic acid from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase;
(Ii) a mutation for substituting the 222nd arginine from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase with histidine and the 223rd glutamic acid with lysine,
(Iii) a mutation for substituting the 288th serine from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase with phenylalanine, the 289th glutamic acid with lysine, the 551st methionine with isoleucine, and the 804th glutamic acid with lysine;
(Iv) A mutation that substitutes threonine for the 867th alanine from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase.

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