JP3016160B2 - 悪性腫瘍の検出のための免疫学的方法およびその方法を実施するためのキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、悪性腫瘍を検出しそして患者の血清−免疫
グロブリンＧ（IgG）の特徴によって腫瘍塊を測定する
方法に関する。

背景技術 悪性腫瘍を持つ患者には、血清−IgGの範囲内で（ジ
チオニトロベンゾエート反応によって測定された）スル
フヒドリルまたはジスルフィド基の量に重大な変化を検
出できることが数年間にわたって知られてきた。スルフ
ヒドリル対ジスルヒド基の比率に対する実験測定値はΣ
Ｓ値を意味する；それによってΣＳ値の変化の理由は最
近まで不明であった。ここで、ΣＳ値とは全ヒト血清Ig
Gの１モル当たりに存在する反応性の遊離−SH基（スル
フヒドリル基）の値と反応性の−Ｓ−Ｓ−基（ジスルヒ
ド基）のＳ原子の値との和を意味する。

この領域のさらに進んだ研究の間に、ΣＳ値の変化は
他のサブクラス（例えばIgG2）に対するサブクラスIgG1
の比率の変位を追跡することができることが示された。

この相関関係は新しく、基本的な科学的知識に加え
て、診断学にその現象を利用する可能性を当業者に提供
する。

それらと無関係に、この分野における研究は、新鮮な
血液または血清試料の測定値は短期間内に比較的強く変
化することを繰り返して示した。それゆえ、未処理血液
または血清試料についてIgGに対するさまざまな分析手
順を実施することは、再現可能で計画可能な結果を与え
るものではない。

発明の開示 それゆえ、本発明の目的は、患者の悪性腫瘍の起りう
る存在および大きさおよび発育に関して、少なくとも１
日という目的にかなった時間の間に、再現性のある結果
を提供することである。

これは、患者の新鮮な血液または血清試料はラジカル
抑制剤、好ましくはスーパーオキシドジスムターゼ（SO
D）によって安定化されること、および変位は標準の比
率と比べた、IgGサブクラスの和に対するIgGサブクラス
の少なくとも１種類の比率について試料の血清にて決定
されることで達成される。

好ましくは、サブクラスIgG1および／またはサブクラ
スIgG2の比率の変位は、標準の比率に比べた、IgGサブ
クラスの和に対する安定化された試料の血液で決定され
る。

血清試料が空気にさらされて耐えているとき、血清の
IgG1濃度の強い損失を示すマンシーニ（Mancini）によ
る放射免疫拡散法（RID）の使用によってIgG1値の安定
性に関する実験を未処理試料について行った。この効果
は血液回収の実質的に直後に続いて起こり、それは平均
して７時間後20％であり、36時間後少なくとも25％であ
る。なお、測定は両性の健康な供給者の血液試料を使用
して行った。

効果の程度は、とりわけ、最初の値の高さによって決
まる： 高いIgG1値を持つ試料は普通はその値の強い減少を示
すが、予備的結果によって、あたかも他の因子もまた含
まれるように見える。

前記のことは、血液の血清中のIgG1濃度の正確な定量
は効果的な安定化なしには臨床的環境においては不可能
であることは既に明瞭であるが、そのような安定化は、
IgGサブクラス間の比率の変位が本発明による方法にお
いて腫瘍のマーカーとして癌患者の血液中で評価される
とき絶対的に必要なことになる。

ラジカル抑制剤による安定化は非常にうまく行きそう
に思われるが、明らかに最善の結果はいままでのところ
SODの添加によって達成されてきた。SODは新鮮な完全血
液試料または血球物質が分離された後の血清試料に添加
してもよい。

非常に有利な安定化結果が、SODによる血清の安定化
が100〜1,000、好ましくは300〜400国際単位SOD/ml血清
の質量比で行なわれるときに得られる。

したがって、5,000〜10,000国際単位SOD/mlの濃度を
有する溶液にてSODを血清試料に添加することが好都合
である。このやり方で安定化される試料は、続いて普通
の比率と比較して、IgGサブクラスの和に対するサブク
ラスIgG1の比率の変位について試験される。

血液の血清中の互いに対するIgGサブクラスの比率の
変化は、非常に驚くべきことに、悪性腫瘍の出現および
身体中に存在する腫瘍塊の数および広がりにさえ結び付
き、その結果悪性腫瘍に関する定性的のみならず定量的
な情報をも提供することができる。

それゆえ、本発明による方法は、患者の腫瘍発育の外
部（対外の）監視に好ましく利用される。そのような方
法は、主として治療的処理の間にまたは続いて世話をす
る（監視する）医師に特に興味を持たれる。本発明によ
る方法はまた予防医学に非常に首尾良く適用でき、それ
によって起こりうる腫瘍の発育に対する最初の前兆を単
純なやり方で得ることができる。

その方法は患者に少しでも不便ではなく、今までのと
ころ得られた経験によれば、現在利用できる他の方法よ
りも更に信頼できる。それらに関して、現在最もしばし
ば使用されている方法は腫瘍マーカー法である。

実際の状況に本発明による方法を適用することにおい
て、上記に言及した比率の計算はIgGに対するこれまで
知られた分析方法、特にクロマトグラフ法または免疫学
的方法に好都合に基づいていることが明らかになる。免
疫−拡散−検定の適用は、この状況において特に成功し
たことを証明した。単純な免疫−吸着カラム法もまた適
用できる。

その上、液体吸着クロマトグラフィもまた利用され、
それによって個々の成分間の異常な選択性（分離識別）
が達成できる。得られるフラクトグラムは定性的および
定量的に説明することができる。

クロマトグラフ法の代わりに、測定値、すなわち免疫
グロブリンＧ中のスルフヒドリル−ジスルフィド比の原
因である値としてΣＳ値を測定することを望んでもよ
い。この比率はIgGサブクラス間の比率に関係があると
いう認識に基づいているので、この測定値もまた本発明
による方法を実施するために有用な手段である。

本発明による方法の状況においてΣＳ値を測定するた
めの条件の試験において、観測値は悪性腫瘍が高度の精
度を持って良性腫瘍から区別できることを確認した。

乳房の癌腫について、それはまた個々の段階に対し相
関関係を確立することができる。例えば、T₁段階におい
てほぼ65％の陽性反応が生じ、T₄段階で91％に上昇す
る。他の腫瘍マーカー（例えばCEA）と比較したとき、
それらはT₁段階において約５％の検出率を有するので、
これは異常な増加である。これに関しては、次の刊行
物、M.Smola,W.Estelberger,M.Reiter,K.Schauenstein,
and E.Schauenstein;in CANCER,Vol.68,Nr.5,1991;pa
ge 1026.を参照した。

ΣＳ値は外科手術後正常化した。手術が成功したかど
うかによって、その値は正常のままでいるかまたは再び
異常になった。M.Lahousen,E.Schauenstein,et al.,Wi
ener Klin.Wschr.101,858（1989）〔Vienna Clin.Wee
kly 101〕。したがって、ΣＳ値は体液性免疫状態、す
なわち免疫防御に対する基準であると推定される。

IgGサブクラス間の比率を測定する別の可能性は、放
射免疫拡散（RID）の方法にある。

しかしながら、すべての方法について、結果は試料が
予め安定化されていたときだけ価値を有することが普通
である。

例えばRIDによって検出できない、非共有結合の凝集
体の生成は、IgG1濃度の不安定性の理由であると推定さ
れる。この凝集体の生成が酸素含有ラジカルにより開始
されることを示した先の結果および、事実、SODを使用
した安定化の試みは、特に好結果であることを証明し
た。

これらの実験を行うために、完全な凝結（凝固）まで
同一の放置をさせておくことにより健康な供給者の完全
血液から血清を得て、次いで遠心分離を行ない、その血
清を直ちにまたは36時間後にSODを使用してまたは使用
せずにIgG1について試験した。

これらの試験を第１の研究室の実験においてRIDによ
って行なった。等初期濃度のIgG1に関して、SODを組合
せた試料は36時間後ほぼ同じ濃度を保持したが、一方非
安定化試料は最初の値のほぼ半分に減った。

タンパク質−Ａ−セファロースを使用する最適化実験
によりIgGをその画分に分離する結果は、96〜100％の免
疫グロブリン成分の純度を得ることは、流通速度を減少
することにより主として可能であることを示した。

これらの研究結果に基づいて、本発明はまた、本発明
による方法を実施するための、安定化反応物SODを有
し、そしてサブクラスIgG1対他のIgGサブクラスの比率
を測定するための系を有することを特徴とするキットを
提供する。

次の実施例は、如何なるやり方においても本発明を限
定することなく、本発明による方法の説明に役立つもの
である。

実施例 １ 安定化実験の原案： 10mlの完全血液を健康な供給者の腕の静脈から抜き取
った。５〜10分凝結は完了した。遠心分離を440xgで10
分間行なった。血清をピペットで抜き取り各0.1mlの４
個のアリコート： ２個０時間の試料「０−」および「０＋」並びに２個
の36時間後に試験するための試料「36−」および「36
＋」に分けた。試料「０＋」および「36＋」は５μｌの
SOD溶液（35国際単位）（Biotrade社を通じてSrgma社の
ロット番号100H9311のSOD）と混合した。２種類の０試
料をRID緩衝液を使用して1:50に希釈した（0.05Mトリ
ス、0.10MNaCl;1gNaN₃/l;HCl希釈にてpH8.0に調整）。
試料「36＋」および「36−」は、日光を中へ入れない状
態で室温にて36時間非希釈貯蔵した。試料「０−」およ
び「０＋」は直ちにRID板上に置き、それによってくぼ
み当り３μｌ挿入した。RID板に対するアガロースゲル:
5mlの１％アガロース溶液、0.5mlのRID緩衝液、0.5抗Ig
G1血清（Binding Site社、PE006）。標準血清（Bindin
g Site社、PB062）の希釈のために同じ板上に適用し
た：希釈1:10、1:15、1:25および1:50。RID緩衝液で1:5
0に希釈後、試料「36−」および「36＋」もまた板上に
置いた。「０−」および「０＋」並びに希釈標準血清の
沈殿物の環の表面を測定し、そして２日後に36時間試料
のそれを測定した。次いで標準血清の希釈液について測
定した沈殿物の環の表面の値を既知IgG1濃度の希釈液に
対してグラフ表示した。最後に、４種類の試料から得た
沈殿物の環の表面をこのようにして得た検定図中にグラ
フ表示し、IgG1濃度を内挿によってそれらから決定し
た。

実施例 ２ 実施例１の実験と類似した７時間の実現で次の結果を
得た： 今まで行なわれた全ての実験は、記述された条件下の
SODの阻害効果は36〜40時間に限定される、すなわちIgG
測定はいかなる場合においてもその時間間隔の間に行な
われるべきであることを示した。

実施例 ３ 時間線はIgG1とIgG2の濃度がSOD（350国際単位を有す
る５μｌ）の添加なしおよび添加後にRIDによって測定
される各血清試料（0.1ml）について認められた。評価
は、いろいろな時間の後で得られた測定値が最初の値の
パーセントで表わされるようなやり方で達成された。結
果は、それぞれ添付の図１および２に示されるように時
間にわたる挙動であった。

添付図面の図１〜４に関する考察 1. 48時間の待ち時間（密閉された、好気性の、室温）
後のRIDによって測定できるIgG1の減少は平均30％であ
った。

2. IgG1の減少の効果は明らかに直ちに続いて起こり、
僅か７時間後に約20％の減少に達する。動力学的挙動は
指数因子をさし示し、実現はそれぞれの反応量のIgG1の
比較的一時的の減少はこのサブクラスに直接比例するこ
とを示した。したがって、ミハエリ／メンテン関数に従
う動力学的挙動は除外することができ、二次反応、多分
それからより高い凝集体がそのあと生成する二量体の最
初の生成をここで生じることを推論することができる。
また、熱凝集体がRIDで検出できる沈殿物の環を生成し
ないことを示すように、そのような凝集体の生成はRID
で検出できないことを説明する。

3. 12〜24時間の間に、さらなる反応が系の中間の自己
安定化に到達するか、それが測定点のバラツキであるか
どうか安全に決定することができない。ただ反応過程工
程が後で連続的に継続することだけが明白である。

4. SODによる凝集反応の阻害は、それが多分Ｏラジカ
ルにより引き起こされた自己凝集であることを示唆す
る。Wichenset al.（Biochim.Biophis.Acta,Vol.742:60
7−616,1983）によれば、少線量の紫外線による照射は
自己凝集を引き起こし、ところで、活性白血球により引
き起こされるそのような凝集体は、沈殿物の線に実質的
な減少を示す。

図１から、IgG1の濃度は平均して24時間以内に約15
％、36時間以内に約22％減少することが続いて来る。こ
の時間範囲内で、減少はSODの添加によって実質的に完
全に抑制できた。この結果の重要性は、図１に平均減少
パーセントがグラフで示されていることおよび別個の試
料について測定した個々の減少がある特定の場合に、次
の表３に示されるように実質的に大きくなりうることを
考えるならば明白になる。

実施例 ４ この実施例において、健康な供給者の16種類の血清試
料を試験した。最初にIgG1とIgG2の濃度をRIDによって
測定した。このようにして得た値を次の表４に示す。

その上、本発明者等は表５に示される６個の別の値を
再参照することができた。

このようにして得た平均値を平均するとき、22の健康
な供給者の血清に対する結果は、8.33±0.48mg IgG1お
よび3.04±0.25mg IgG2/ml血清であった。

癌血清のIgG1濃度は平均して正常な血清よりも23〜24
％低く、その結果有効な阻害の無条件の必要性が明白で
ある。SODはこの必要条件を満たすが、しかしながら約4
0時間という血清の保存時間までだけである。しかしな
がら、これは大部分の場合に十分である。

図１に示されるように、明確に限定された時間効果が
IgG1に対してだけ起こり、一方第２の主成分、IgG2は不
規則な変動を示した。しかしながら、これもまたSODに
より阻害された（図２）。SODはRIDにおいて示されたIg
G1の減少を阻害し、そしてこのサブクラスだけ分子内に
反応性のジスルフィド架橋SS^＊を含有するから、SODは
また、85％までのSS^＊に対する項からなるΣＳ値の測定
のための安定剤として利用できる。

実施例 ５ タンパク質−Ａ−セファロースカラムでのIgGサブクラ
ス１および２の分離 緩衝液の組成： 0.05Mリン酸塩・クエン酸塩緩衝液pH4.7、0.086Mリン
酸塩・クエン酸塩緩衝液pH4.3、流速は70〜10ml/hに変
化した。

関係があるピークＢおよびＣにおいて、成分に対して
それぞれ95％までおよび100％純度が達成される、添付
のフラクトグラム（図３および４）を得た。

実施例 ６ 一方においてタンパク質−Ａ−セファロースを有する
アフィニティクロマトグラフィーによる、他方において
参照のためにRIDを使用するIgG1およびIgG2各濃度の測
定 ２種類の方法を比較する目的のために、20人の健康な
供給者の血清および卵巣の、子宮頸管部の、および結腸
癌腫を持つ40人の女性患者の血清を使用したが、血液試
料は手術に先立って採血した。

血液試料（２〜10ml）は採血直後に440xgで10分間遠
心分離し、血清をピペットで抜き取り、RID緩衝液で1:5
0に希釈し、RID板に適用した。沈殿物の環を２日後に測
定し、IgG1およびIgG2濃度を標準血清（マンシーニ技
法）を使用して測定した。

0.3mlの血清をタンパク質−Ａ−セアァロースによっ
てIgG1およびIgG2の単離のためにカラム（K9/15）に適
用し、0.16Mリン酸塩・クエン酸緩衝液pH7.0および10ml
/hの流速を使用して溶離させた。それによりIgGはFc部
分によってタンパク質−Ａに結合し、他の血清タンパク
質は非結合状態で溶離された。IgGのほかに、IgMおよび
IgAもまたタンパク質−Ａに結合した。基線に到達後、
緩衝液交換を達成した：最初に、IgG2を0.05Mリン酸塩
・クエン酸塩緩衝液pH4.7で、次いでIgG1を0.086Mリン
酸塩・クエン酸塩緩衝液pH4.3で溶離した。それからゲ
ルを0.1Mクエン酸塩緩衝液で清浄化し、次いでクエン酸
塩緩衝液を出発緩衝液（0.16Mリン酸塩・クエン酸塩緩
衝液pH7.0）と交換した。IgG1およびIgG2の溶離液を1NN
aOHでpH7.0まで滴定し、タンパク質濃度を278nmで光度
測定法で定量した。吸光係数ε′は1.58であり、さらに
はまた濃度の定量ができる。

表６に、RIDおよびタンパク質−Ａを使用して測定し
た、血清試料（±sem）のIgG1およびIgG2濃度の平均値
を示す。比率G1/G2を次いでこれら２つの値から決定で
きる。

RIDを使用して測定した、健康な供給者と腫瘍患者と
の間のIgG1濃度の平均値は、非常にいちじるしく（Ｐ＝
0.005）相違し、それにより27.5％の間違った負のおよ
び25％の間違った正の結果を得た。タンパク質−Ａを使
用したIgG1の単離も同様の結果:P＝0.005および30％の
間違った負のおよび35％の間違った正の結果を示した。

フロントページの続き (72)発明者 シャウエンスタイン，アーヴィン オーストリア国 グラツ、アム・アイザ ーネン・トール ２ (72)発明者 シャウエンスタイン，コンラート オーストリア国 グラツ、カーネリーガ ーセ 20 (72)発明者 ダハ，フランツ オーストリア国 ガルネウキルヒェン、 スパテンドルフ 10 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/574 G01N 33/53 G01N 33/50

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】患者の新鮮な血液または血清試料がラジカ
   ル抑制剤、好ましくはスーパーオキシドジスムターゼ
   （SOD）によって安定化されること、および試料の血清
   における変位が標準の比率と比較した、IgGサブクラス
   の和に対するIgGサブクラスの少なくとも１種類の比率
   から決定されることを特徴とする、患者の血清免疫グロ
   ブリンＧ（IgG）の特徴によって悪性腫瘍が検出または
   それらの腫瘍塊を測定する方法。
2. 【請求項２】標準の比率と比較した、IgGサブクラスの
   和に対するサブクラスIgG1および／またはサブクラスIg
   G2の比率の変位が、安定化された試料の血清において決
   定される請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 【請求項３】比率の前記変位がΣＳ値（全ヒト血清IgG
   の１モル当たりに存在する反応性の遊離−SH基（スルフ
   ヒドリル基）の値と反応性の−Ｓ−Ｓ−基（ジスルヒド
   基）のＳ原子の値との和）を測定することにより決定さ
   れる請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
4. 【請求項４】比率の前記変位が本質的に知られているIg
   Gに対する分析方法、特にクロマトグラフ法または免疫
   学的方法の結果から計算される請求の範囲第１項または
   第２項に記載の方法。
5. 【請求項５】比率の前記変位が免疫拡散検定によって決
   定される、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. 【請求項６】血清の安定化が100〜1000、好ましくは300
   〜400国際単位ml血清の質量比のSODによって達成される
   請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項記載の方法。
7. 【請求項７】患者の腫瘍発育の体外測定のための請求の
   範囲第１項〜第６項のいずれか１項記載の方法。
8. 【請求項８】安定化試薬、好ましくはSOD、およびIgGサ
   ブクラスの和に対する少なくとも１種類のIgGサブクラ
   スの比率を決定するための組体を有することを特徴とす
   る請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項記載の方法
   を実施するためのキット。