JP2750017B2 - 新規酵素およびその製造方法、並びに光学活性な（ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法 - Google Patents
新規酵素およびその製造方法、並びに光学活性な（ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法Info
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な酵素およびその
製造方法、並びに前記酵素を用いる光学活性な（Ｒ）−
２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法に関す
る。
製造方法、並びに前記酵素を用いる光学活性な（Ｒ）−
２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、酵素的不斉還元反応を利用して、光学活性体を得る
方法が検討されている。例えば、特公昭６１−１１５９
１号公報、特公平１−２７７１７号公報、特開昭６２−
２８６号公報および特開昭６３−３２４８０号公報に
は、乳酸菌が生産する数種の脱水素酵素が報告されてい
る。これらの脱水素酵素は、還元型ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという）を補
酵素として、各種の２−オキソカルボン酸を不斉的に還
元し、対応する光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を
生成する。
年、酵素的不斉還元反応を利用して、光学活性体を得る
方法が検討されている。例えば、特公昭６１−１１５９
１号公報、特公平１−２７７１７号公報、特開昭６２−
２８６号公報および特開昭６３−３２４８０号公報に
は、乳酸菌が生産する数種の脱水素酵素が報告されてい
る。これらの脱水素酵素は、還元型ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨという）を補
酵素として、各種の２−オキソカルボン酸を不斉的に還
元し、対応する光学活性な２−ヒドロキシカルボン酸を
生成する。
【０００３】また、特開昭６３−３０４９７９号公報に
は、還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
・リン酸（以下、ＮＡＤＰＨという）を補酵素とし、γ
−置換アセト酢酸エステルから（Ｒ）−γ−置換−β−
ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素として、スポロ
ボロマイセス(Sporobolomyces)属に属する菌株から抽出
した還元酵素が開示されている。
は、還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
・リン酸（以下、ＮＡＤＰＨという）を補酵素とし、γ
−置換アセト酢酸エステルから（Ｒ）−γ−置換−β−
ヒドロキシ酪酸エステルを生成する酵素として、スポロ
ボロマイセス(Sporobolomyces)属に属する菌株から抽出
した還元酵素が開示されている。
【０００４】一方、光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ
−４−フェニル酪酸は、医薬品などの合成中間体として
有用な化合物である。しかしながら、前記酵素に関し
て、２−オキソ−４−フェニル酪酸を不斉還元し、
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成する
活性は知られていない。
−４−フェニル酪酸は、医薬品などの合成中間体として
有用な化合物である。しかしながら、前記酵素に関し
て、２−オキソ−４−フェニル酪酸を不斉還元し、
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成する
活性は知られていない。
【０００５】従って、本発明の目的は、２−オキソ−４
−フェニル酪酸を選択的に不斉還元し、光学活性な
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率よく
生成する新規酵素とその製造方法を提供することにあ
る。
−フェニル酪酸を選択的に不斉還元し、光学活性な
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率よく
生成する新規酵素とその製造方法を提供することにあ
る。
【０００６】本発明の他の目的は、酵素の作用により、
２−オキソ−４−フェニル酪酸から光学活性な（Ｒ）−
２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率よく得ること
ができる製造方法を提供することにある。
２−オキソ−４−フェニル酪酸から光学活性な（Ｒ）−
２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率よく得ること
ができる製造方法を提供することにある。
【０００７】
【発明の構成】本発明者らは、２−オキソ−４−フェニ
ル酪酸を不斉還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フ
ェニル酪酸を生成しうる酵素を探索した結果、ロイコノ
ストック(Leuconostoc）属に属する微生物が、前記目的
を達成しうる酵素を生産することを見いだすと共に、こ
の酵素の理化学的性質を明らかにすることにより、本発
明を完成した。
ル酪酸を不斉還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フ
ェニル酪酸を生成しうる酵素を探索した結果、ロイコノ
ストック(Leuconostoc）属に属する微生物が、前記目的
を達成しうる酵素を生産することを見いだすと共に、こ
の酵素の理化学的性質を明らかにすることにより、本発
明を完成した。
【０００８】すなわち、本発明は、下記(1) 〜(8) に示
す理化学的性質を有する新規酵素を提供する。
す理化学的性質を有する新規酵素を提供する。
【０００９】(1) 作用および基質特異性：ＮＡＤＰＨの
存在下、２−オキソ−４−フェニル酪酸を不斉還元し、
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成する (2) 至適ｐＨ：６．０付近（リン酸緩衝液） (3) 安定ｐＨ範囲：６〜７（リン酸緩衝液） (4) 至適温度：４５℃付近（ｐＨ６．０） (5) 熱安定性：４０℃以下で安定（ｐＨ７．２、処理時
間２０分） (6) ２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するミハエリス
定数Ｋｍ値：０．２９ｍＭ (7) 分子量：４６０００（ゲル濾過法） (8) 阻害剤：塩化水銀およびパラクロロ水銀安息香酸 また、本発明は、ロイコノストック(Leuconostoc）属に
属する微生物を培養し、該培養物から、前記理化学的性
質を有する酵素を採取する新規酵素の製造方法を提供す
る。
存在下、２−オキソ−４−フェニル酪酸を不斉還元し、
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を生成する (2) 至適ｐＨ：６．０付近（リン酸緩衝液） (3) 安定ｐＨ範囲：６〜７（リン酸緩衝液） (4) 至適温度：４５℃付近（ｐＨ６．０） (5) 熱安定性：４０℃以下で安定（ｐＨ７．２、処理時
間２０分） (6) ２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するミハエリス
定数Ｋｍ値：０．２９ｍＭ (7) 分子量：４６０００（ゲル濾過法） (8) 阻害剤：塩化水銀およびパラクロロ水銀安息香酸 また、本発明は、ロイコノストック(Leuconostoc）属に
属する微生物を培養し、該培養物から、前記理化学的性
質を有する酵素を採取する新規酵素の製造方法を提供す
る。
【００１０】さらに、本発明は、ＮＡＤＰＨの存在下、
前記酵素を、２−オキソ−４−フェニル酪酸に作用させ
て不斉還元する、光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−
４−フェニル酪酸の製造方法をも提供する。
前記酵素を、２−オキソ−４−フェニル酪酸に作用させ
て不斉還元する、光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−
４−フェニル酪酸の製造方法をも提供する。
【００１１】本発明の新規酵素の起源は、特に限定され
るものではなく、前記理化学的性質を有する酵素を生産
しうる微生物であればよい。好ましい微生物は、例えば
乳酸菌、特にロイコノストック(Leuconostoc）属に属す
る微生物である。これらの微生物の中で好ましい菌株
は、ロイコノストック・デキストラニカム(Leuconostoc
dextranicum）ＡＴＣＣ２７３１０である。
るものではなく、前記理化学的性質を有する酵素を生産
しうる微生物であればよい。好ましい微生物は、例えば
乳酸菌、特にロイコノストック(Leuconostoc）属に属す
る微生物である。これらの微生物の中で好ましい菌株
は、ロイコノストック・デキストラニカム(Leuconostoc
dextranicum）ＡＴＣＣ２７３１０である。
【００１２】前記ＡＴＣＣ番号が付された微生物は、ア
メリカン タイプ カルチャー コレクション（Americ
an Type Culture Collection、ＡＴＣＣ）発行の「Cata
logue of Bacteria Phages rDNA Vectors,第１６版（１
９８５）」に記載されており、該ＡＴＣＣから入手でき
る。
メリカン タイプ カルチャー コレクション（Americ
an Type Culture Collection、ＡＴＣＣ）発行の「Cata
logue of Bacteria Phages rDNA Vectors,第１６版（１
９８５）」に記載されており、該ＡＴＣＣから入手でき
る。
【００１３】さらに、これらの微生物は、前記理化学的
性質を有する酵素を生産する限り、野生株、変異株、又
は細胞融合もしくは遺伝子操作法などの遺伝的手法によ
り誘導される組み換え株などのいずれの菌株でも好適に
用いることができる。
性質を有する酵素を生産する限り、野生株、変異株、又
は細胞融合もしくは遺伝子操作法などの遺伝的手法によ
り誘導される組み換え株などのいずれの菌株でも好適に
用いることができる。
【００１４】なお、酵素の理化学的性質は、測定上不可
避的な誤差を含んでいる。従って、例示すれば、本発明
の酵素には、下記の理化学的性質を有する酵素も含まれ
る。
避的な誤差を含んでいる。従って、例示すれば、本発明
の酵素には、下記の理化学的性質を有する酵素も含まれ
る。
【００１５】(2) 至適ｐＨ：５．５〜６．５程度、 (3) 安定なｐＨ範囲：５．５〜７．５程度、 (4) 至適温度：４０〜５０℃程度、 (6) ２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するミハエリス
定数Ｋｍ値：０．２〜０．５ｍＭ程度 (7) 分子量：４００００〜５００００程度 前記酵素は、前記(1) 〜(8) の理化学的性質に加えて、
(9) ＮＡＤＰＨの存在下、アセトアルデヒド、ｎ−ブチ
ルアルデヒドなどのアルデヒド類、２−オキソヘキサン
酸、２−オキソオクタン酸などのケトン類を還元し、こ
れらに対応する等モルのアルコールを生成する作用を有
するのが好ましい。
定数Ｋｍ値：０．２〜０．５ｍＭ程度 (7) 分子量：４００００〜５００００程度 前記酵素は、前記(1) 〜(8) の理化学的性質に加えて、
(9) ＮＡＤＰＨの存在下、アセトアルデヒド、ｎ−ブチ
ルアルデヒドなどのアルデヒド類、２−オキソヘキサン
酸、２−オキソオクタン酸などのケトン類を還元し、こ
れらに対応する等モルのアルコールを生成する作用を有
するのが好ましい。
【００１６】前記酵素は、ＮＡＤＨではなく、補酵素と
してのＮＡＤＰＨの存在下、２−オキソ−４−フェニル
酪酸を選択的に不斉還元する。
してのＮＡＤＰＨの存在下、２−オキソ−４−フェニル
酪酸を選択的に不斉還元する。
【００１７】本発明の酵素は、前記微生物を培地で培養
し、培養菌体から抽出精製することにより得ることがで
きる。
し、培養菌体から抽出精製することにより得ることがで
きる。
【００１８】培地は、微生物が増殖し得るものであれば
特に制限されない。培地の炭素源としては、上記微生物
が利用可能であればいずれも使用でき、例えば、グルコ
ース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デ
ンプンなどの糖類；ソルビトール、エタノール、グリセ
ロールなどのアルコール類；フマル酸、クエン酸、酢
酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類；パラフ
ィンなどの炭化水素類；これらの混合物などが使用でき
る。窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアン
モニウム塩；フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニ
ウムなどの有機酸のアンモニウム塩；肉エキス、酵母エ
キス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカ
ー、カゼイン加水分解物、尿素などの無機又は有機含窒
素化合物；これらの混合物を使用できる。また、培地に
は、前記成分以外に、通常の培養に用いられる栄養源、
例えば、無機塩、微量金属塩、ビタミン類などを適宜、
混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、
微生物の増殖を促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な
物質、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、例
えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸なども添加でき
る。
特に制限されない。培地の炭素源としては、上記微生物
が利用可能であればいずれも使用でき、例えば、グルコ
ース、フルクトース、シュクロース、デキストリン、デ
ンプンなどの糖類；ソルビトール、エタノール、グリセ
ロールなどのアルコール類；フマル酸、クエン酸、酢
酸、プロピオン酸などの有機酸類及びその塩類；パラフ
ィンなどの炭化水素類；これらの混合物などが使用でき
る。窒素源としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアン
モニウム塩；フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニ
ウムなどの有機酸のアンモニウム塩；肉エキス、酵母エ
キス、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカ
ー、カゼイン加水分解物、尿素などの無機又は有機含窒
素化合物；これらの混合物を使用できる。また、培地に
は、前記成分以外に、通常の培養に用いられる栄養源、
例えば、無機塩、微量金属塩、ビタミン類などを適宜、
混合して用いることができる。さらに、必要に応じて、
微生物の増殖を促進する因子、培地のｐＨ保持に有効な
物質、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、例
えば、２−オキソ−４−フェニル酪酸なども添加でき
る。
【００１９】微生物の培養は、生育に適した条件下、例
えば、培地のｐＨ３．０〜９．５、好ましくは４〜８、
培養温度２０〜４５℃、好ましくは２５〜３７℃の条件
で行なうことができる。微生物の培養は、嫌気的又は好
気的条件下で行なうことができる。培養時間は、例え
ば、５〜１２０時間、好ましくは１２〜７２時間程度で
ある。
えば、培地のｐＨ３．０〜９．５、好ましくは４〜８、
培養温度２０〜４５℃、好ましくは２５〜３７℃の条件
で行なうことができる。微生物の培養は、嫌気的又は好
気的条件下で行なうことができる。培養時間は、例え
ば、５〜１２０時間、好ましくは１２〜７２時間程度で
ある。
【００２０】本発明の酵素は、培養した微生物菌体から
抽出し精製することにより得ることができる。例えば、
培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、超音波破砕
や、機械的破砕法と遠心分離法とを組合わせる方法など
により無細胞抽出液を得る。次いで、抽出液を、例え
ば、ストレプトマイシン硫酸処理、硫酸アンモニウム分
画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、溶出液による溶出、ゲル濾過法、限
外濾過法などの通常の精製方法を一種又は二種以上組合
せて精製することにより、酵素を得ることができる。
抽出し精製することにより得ることができる。例えば、
培養物を遠心分離に供して菌体を回収し、超音波破砕
や、機械的破砕法と遠心分離法とを組合わせる方法など
により無細胞抽出液を得る。次いで、抽出液を、例え
ば、ストレプトマイシン硫酸処理、硫酸アンモニウム分
画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、溶出液による溶出、ゲル濾過法、限
外濾過法などの通常の精製方法を一種又は二種以上組合
せて精製することにより、酵素を得ることができる。
【００２１】以下に、２−オキソ−４−フェニル酪酸か
ら光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪
酸を製造する方法について説明する。
ら光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪
酸を製造する方法について説明する。
【００２２】本発明の方法において、前記理化学的性質
を有する酵素により、基質である２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸を不斉還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−
フェニル酪酸を生成させるためには、基質と共に補酵素
ＮＡＤＰＨが必要である。
を有する酵素により、基質である２−オキソ−４−フェ
ニル酪酸を不斉還元し、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−
フェニル酪酸を生成させるためには、基質と共に補酵素
ＮＡＤＰＨが必要である。
【００２３】不斉還元反応は、前記酵素の活性が安定に
発現する条件下、基質、酵素、ＮＡＤＰＨを適当な比率
で混合して反応すればよい。反応系のｐＨは、例えば、
５〜９、好ましくは６〜８程度である。また、反応温度
は、例えば、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃程
度である。反応は、撹拌下又は静置下、１〜１２０時間
程度行うことができる。
発現する条件下、基質、酵素、ＮＡＤＰＨを適当な比率
で混合して反応すればよい。反応系のｐＨは、例えば、
５〜９、好ましくは６〜８程度である。また、反応温度
は、例えば、１０〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃程
度である。反応は、撹拌下又は静置下、１〜１２０時間
程度行うことができる。
【００２４】基質の濃度は、目的とする光学活性体の生
成量および光学純度が低下しない限り特に制限されない
が、例えば、０．１〜１０重量％程度が好ましい。ま
た、基質と、酵素との比率、補酵素と酵素との比率は、
目的とする光学活性体の生成量および光学純度が低下し
ない範囲で選択できる。
成量および光学純度が低下しない限り特に制限されない
が、例えば、０．１〜１０重量％程度が好ましい。ま
た、基質と、酵素との比率、補酵素と酵素との比率は、
目的とする光学活性体の生成量および光学純度が低下し
ない範囲で選択できる。
【００２５】また、反応に際して、補酵素を反応系にリ
サイクルするリサイクル系を構築することにより、
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸をさらに効
率的に製造できる。補酵素のリサイクル系は、反応液か
ら補助酵素を分離する分離手段、リサイクルラインなど
を組合せる慣用の方法により構築できる。
サイクルするリサイクル系を構築することにより、
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸をさらに効
率的に製造できる。補酵素のリサイクル系は、反応液か
ら補助酵素を分離する分離手段、リサイクルラインなど
を組合せる慣用の方法により構築できる。
【００２６】さらに、本発明の酵素は、慣用の方法、例
えば、吸着、包括、共有結合、イオン結合、架橋結合な
どの方法により、種々の固定化担体に固定化することに
より固定化酵素として使用することも可能である。担体
の種類は特に制限されず、例えばポリアクリルアミド、
セルロース系材料、スチレン系ポリマー、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス、イオン交換樹脂、コラーゲン、アルブミ
ン、カラギーナン、アルギン酸、寒天などであってもよ
い。
えば、吸着、包括、共有結合、イオン結合、架橋結合な
どの方法により、種々の固定化担体に固定化することに
より固定化酵素として使用することも可能である。担体
の種類は特に制限されず、例えばポリアクリルアミド、
セルロース系材料、スチレン系ポリマー、ＤＥＡＥ−セ
ファデックス、イオン交換樹脂、コラーゲン、アルブミ
ン、カラギーナン、アルギン酸、寒天などであってもよ
い。
【００２７】生成した光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸は、慣用の分離精製手段により回
収できる。例えば、反応液を、膜分離、有機溶媒による
抽出、カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂によ
る分離、減圧濃縮、再結晶などの通常の精製方法に供す
ることにより、前記光学活性体を容易に得ることができ
る。なお、光学活性（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェ
ニル酪酸の光学純度は、例えば、光学異性体分離カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り測定できる。
シ−４−フェニル酪酸は、慣用の分離精製手段により回
収できる。例えば、反応液を、膜分離、有機溶媒による
抽出、カラムクロマトグラフィー、イオン交換樹脂によ
る分離、減圧濃縮、再結晶などの通常の精製方法に供す
ることにより、前記光学活性体を容易に得ることができ
る。なお、光学活性（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェ
ニル酪酸の光学純度は、例えば、光学異性体分離カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
り測定できる。
【００２８】
【発明の効果】本発明の新規な酵素は、２−オキソ−４
−フェニル酪酸を選択的に不斉還元し、光学活性な
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率よく
生成する。
−フェニル酪酸を選択的に不斉還元し、光学活性な
（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効率よく
生成する。
【００２９】本発明の酵素の製造方法によれば、前記の
如き優れた性質を有する酵素を得ることができる。
如き優れた性質を有する酵素を得ることができる。
【００３０】さらに、本発明の製造方法では、前記酵素
の作用により、２−オキソ−４−フェニル酪酸から光学
活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効
率よく製造できる。
の作用により、２−オキソ−４−フェニル酪酸から光学
活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を効
率よく製造できる。
【００３１】
【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。
【００３２】なお、酵素活性は、次のような標準活性測
定法により測定した。
定法により測定した。
【００３３】１０μＭの２−オキソ−４−フェニル酪
酸、０．１μＭのＮＡＤＰＨ、１００μＭのリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）及び適量の酵素液を含む全容
１ｍｌの反応系を構成し、３７℃で、３４０ｎｍにおけ
るＮＡＤＰＨの吸光度の減少を分光光度計にて追跡し、
酵素活性を求めた。なお、上記条件下で、１分間に、１
μＭのＮＡＤＰＨが酸化される酵素量を、酵素活性１単
位（Ｕ）とした。
酸、０．１μＭのＮＡＤＰＨ、１００μＭのリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．０）及び適量の酵素液を含む全容
１ｍｌの反応系を構成し、３７℃で、３４０ｎｍにおけ
るＮＡＤＰＨの吸光度の減少を分光光度計にて追跡し、
酵素活性を求めた。なお、上記条件下で、１分間に、１
μＭのＮＡＤＰＨが酸化される酵素量を、酵素活性１単
位（Ｕ）とした。
【００３４】また、比活性は、蛋白質１ｍｇ当たりの単
位（Ｕ）数として算出した。なお、蛋白量は、牛血清ア
ルブミンを標準物質として用い、ローリイ（Lowry ）法
により測定した。
位（Ｕ）数として算出した。なお、蛋白量は、牛血清ア
ルブミンを標準物質として用い、ローリイ（Lowry ）法
により測定した。
【００３５】実施例１（酵素の精製） グルコース８％、酵母エキス１％、硫酸マンガン１０ｐ
ｐｍ、炭酸カルシウム２％より成る組成の培地１８Ｌを
３０Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、加熱殺菌した
後、前記と同様な培地で予め培養したロイコノストック
・デキストラニカムＩＦＯ２７３１０の培養液５００ｍ
ｌを植菌した。３０℃で、２００ｒｐｍ、気相通気の条
件下、１８時間培養した。
ｐｍ、炭酸カルシウム２％より成る組成の培地１８Ｌを
３０Ｌ容のジャーファーメンターに入れ、加熱殺菌した
後、前記と同様な培地で予め培養したロイコノストック
・デキストラニカムＩＦＯ２７３１０の培養液５００ｍ
ｌを植菌した。３０℃で、２００ｒｐｍ、気相通気の条
件下、１８時間培養した。
【００３６】得られた培養液を遠心分離に供し集菌した
後、生理的食塩水にて洗浄した。得られた湿菌体２００
ｇに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（０．０２％
の２−メルカプトエタノールを含む）２００ｍｌを加
え、菌体を超音波破砕した。この破砕液を１００００
Ｇ、１０分間遠心分離し、上澄液１８０ｍｌを得た。
後、生理的食塩水にて洗浄した。得られた湿菌体２００
ｇに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（０．０２％
の２−メルカプトエタノールを含む）２００ｍｌを加
え、菌体を超音波破砕した。この破砕液を１００００
Ｇ、１０分間遠心分離し、上澄液１８０ｍｌを得た。
【００３７】この粗抽出液を上記と同じ緩衝液で平衡化
したＤＥＡＥ−セルロースのカラム（１０×２０ｃｍ）
に負荷した。このカラムを前記と同じ緩衝液１Ｌで洗浄
した後、ＫＣｌ濃度を順次上げるステップワイズ法で目
的酵素を溶出したところ、０．２Ｍ濃度のところで、溶
出した。
したＤＥＡＥ−セルロースのカラム（１０×２０ｃｍ）
に負荷した。このカラムを前記と同じ緩衝液１Ｌで洗浄
した後、ＫＣｌ濃度を順次上げるステップワイズ法で目
的酵素を溶出したところ、０．２Ｍ濃度のところで、溶
出した。
【００３８】この活性画分を限外濾過法で濃縮した後、
前記と同様にして、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍのカ
ラム（４×３０ｃｍ）に負荷し、同様な方法で溶出した
ところ、ＫＣｌ濃度０．１５Ｍのところで目的酵素が溶
出した。
前記と同様にして、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍのカ
ラム（４×３０ｃｍ）に負荷し、同様な方法で溶出した
ところ、ＫＣｌ濃度０．１５Ｍのところで目的酵素が溶
出した。
【００３９】この活性画分を前記と同様に濃縮した後、
０．２ＭのＫＣｌを含む前記と同様の緩衝液で平衡化し
たセルロファインＧＣＬ−２０００のカラム（２×１０
０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行なった。活性画分を前記
と同様に濃縮し、常法に従ってポリアクリルアミドゲル
電気泳動法により、純度を調べたところ、単一のバンド
として検出され、酵素標品の均一性が確認された。
０．２ＭのＫＣｌを含む前記と同様の緩衝液で平衡化し
たセルロファインＧＣＬ−２０００のカラム（２×１０
０ｃｍ）を用いてゲル濾過を行なった。活性画分を前記
と同様に濃縮し、常法に従ってポリアクリルアミドゲル
電気泳動法により、純度を調べたところ、単一のバンド
として検出され、酵素標品の均一性が確認された。
【００４０】精製過程を表１に纏めて示す。
【００４１】
【表１】 実施例２（基質特異性） 標準活性測定法に準拠し、実施例１で得られた酵素標品
を用い、表２に記載の各種の基質について反応速度を調
べた。２−オキソ−４−フェニル酪酸に対する活性を１
００とし、得られた結果を、表２に相対活性として示
す。
を用い、表２に記載の各種の基質について反応速度を調
べた。２−オキソ−４−フェニル酪酸に対する活性を１
００とし、得られた結果を、表２に相対活性として示
す。
【００４２】なお、この反応において、ＮＡＤＰＨをＮ
ＡＤＨで代替できない。
ＡＤＨで代替できない。
【００４３】
【表２】 実施例３（至適ｐＨ） 実施例１で得られた酵素標品の至適ｐＨを次のようにし
て調べた。すなわち、標準活性測定法に準拠し、緩衝液
の種類及びｐＨを変化させて、酵素標品の活性を測定し
た。なお、ｐＨ調整に際して、ｐＨ５〜８の範囲では２
００ｍＭリン酸緩衝液を用い、ｐＨ７〜９の範囲では２
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液を用いた。
て調べた。すなわち、標準活性測定法に準拠し、緩衝液
の種類及びｐＨを変化させて、酵素標品の活性を測定し
た。なお、ｐＨ調整に際して、ｐＨ５〜８の範囲では２
００ｍＭリン酸緩衝液を用い、ｐＨ７〜９の範囲では２
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液を用いた。
【００４４】リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で測定した活
性を１００とし、得られた結果を、図１に相対活性とし
て示す。
性を１００とし、得られた結果を、図１に相対活性とし
て示す。
【００４５】図１より、リン酸緩衝液において、酵素標
品の至適ｐＨは６付近である。
品の至適ｐＨは６付近である。
【００４６】実施例４（ｐＨ安定性） 実施例１で得られた酵素標品のｐＨ安定性を次のように
して調べた。すなわち、ｐＨの異なる緩衝液２ｍｌに酵
素標品０．５ｍｌを添加し、２０℃で２０分間処理し
た。なお、ｐＨ５〜７では２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７〜９では２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液を用いた。
次いで、処理液０．１ｍｌをサンプリングし、１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを添加し、酵素を含
む液０．０５ｍｌを用い、標準活性測定法により、残存
活性を測定した。
して調べた。すなわち、ｐＨの異なる緩衝液２ｍｌに酵
素標品０．５ｍｌを添加し、２０℃で２０分間処理し
た。なお、ｐＨ５〜７では２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７〜９では２００ｍＭトリス−塩酸緩衝液を用いた。
次いで、処理液０．１ｍｌをサンプリングし、１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌを添加し、酵素を含
む液０．０５ｍｌを用い、標準活性測定法により、残存
活性を測定した。
【００４７】リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で処理した場
合の残存活性を１００とし、結果を、図２に相対活性と
して示す。
合の残存活性を１００とし、結果を、図２に相対活性と
して示す。
【００４８】図２より、酵素標品は、リン酸緩衝液にお
いてｐＨ６〜７で安定である。
いてｐＨ６〜７で安定である。
【００４９】実施例５（至適温度） 実施例１で得られた酵素標品の至適温度を、次のように
して調べた。すなわち、標準活性測定法に準拠して、反
応温度を変化させ、反応速度を測定した。そして、反応
温度４５℃での反応速度を１００とし、得られた結果を
図３に相対反応速度として示す。
して調べた。すなわち、標準活性測定法に準拠して、反
応温度を変化させ、反応速度を測定した。そして、反応
温度４５℃での反応速度を１００とし、得られた結果を
図３に相対反応速度として示す。
【００５０】図３より、酵素標品の至適温度は４５℃付
近である。
近である。
【００５１】実施例６（熱安定性） 実施例１で得られた酵素標品の熱安定性を、次のように
して調べた。すなわち、酵素標品に２００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．２）を添加し、ｐＨを７．２に調整した
後、異なる温度条件下で２０分間処理し、処理液の残存
活性を、標準活性測定法により測定した。そして、２０
℃での活性を１００とし、結果を図４に残存活性（％）
として示す。
して調べた。すなわち、酵素標品に２００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．２）を添加し、ｐＨを７．２に調整した
後、異なる温度条件下で２０分間処理し、処理液の残存
活性を、標準活性測定法により測定した。そして、２０
℃での活性を１００とし、結果を図４に残存活性（％）
として示す。
【００５２】図４より、酵素標品は４０℃以下では安定
である。
である。
【００５３】実施例７（２−オキソ−４−フェニル酪酸
に対するＫｍ値） 実施例１で得られた酵素標品を用い、２−オキソ−４−
フェニル酪酸の濃度を変化させ、標準活性測定法によ
り、活性を測定し、Ｋｍ値を求めたところ、０．２９ｍ
Ｍであった。
に対するＫｍ値） 実施例１で得られた酵素標品を用い、２−オキソ−４−
フェニル酪酸の濃度を変化させ、標準活性測定法によ
り、活性を測定し、Ｋｍ値を求めたところ、０．２９ｍ
Ｍであった。
【００５４】実施例８（阻害剤） 実施例１で得られた酵素標品に対する各種の阻害剤の影
響を、次のようにして調べた。すなわち、標準活性法に
よる反応系に、表７に示す阻害剤を添加し、酵素と共に
３０℃で５分間インキュベートした後、ＮＡＤＰＨを添
加して反応を開始し、活性を測定した。そして、阻害剤
を添加しない場合の活性を１００とし、得られた活性
を、表３に相対活性として示す。
響を、次のようにして調べた。すなわち、標準活性法に
よる反応系に、表７に示す阻害剤を添加し、酵素と共に
３０℃で５分間インキュベートした後、ＮＡＤＰＨを添
加して反応を開始し、活性を測定した。そして、阻害剤
を添加しない場合の活性を１００とし、得られた活性
を、表３に相対活性として示す。
【００５５】
【表３】 表３より、酵素標品の活性は、塩化水銀およびパラクロ
ロ水銀安息香酸で阻害される。
ロ水銀安息香酸で阻害される。
【００５６】実施例９（分子量） 実施例１で得られた酵素標品の分子量を、ＨＰＬＣ法に
よるゲル濾過法により測定した。すなわち、アサヒパッ
ク（Asahipak）ＧＳ−５２０（０．７５×６０ｃｍ）
（旭化成（株）製）をカラムとして用い、常法により、
ＨＰＬＣ法で分子量を求めたところ、４６０００であっ
た。
よるゲル濾過法により測定した。すなわち、アサヒパッ
ク（Asahipak）ＧＳ−５２０（０．７５×６０ｃｍ）
（旭化成（株）製）をカラムとして用い、常法により、
ＨＰＬＣ法で分子量を求めたところ、４６０００であっ
た。
【００５７】実施例１０（（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４
−フェニル酪酸の製造） ２−オキソ−４−フェニル酪酸１００ｍｇを、２０ｍｌ
の水に溶解し、１ＮのＮａＯＨにてｐＨ６とした。この
溶液にＮＡＤＰＨ５００ｍｇを添加し溶解した後、１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０ｍｌを添加し
た。次いで、実施例１と同様にして得られた酵素の溶液
５ｍｌ（２００Ｕ）を添加し、３０℃で２４時間反応し
た。
−フェニル酪酸の製造） ２−オキソ−４−フェニル酪酸１００ｍｇを、２０ｍｌ
の水に溶解し、１ＮのＮａＯＨにてｐＨ６とした。この
溶液にＮＡＤＰＨ５００ｍｇを添加し溶解した後、１０
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２０ｍｌを添加し
た。次いで、実施例１と同様にして得られた酵素の溶液
５ｍｌ（２００Ｕ）を添加し、３０℃で２４時間反応し
た。
【００５８】反応液を、１Ｎ硫酸にてｐＨ２．５とし、
塩化ナトリウムを飽和になるまで溶解させ、反応生成物
を酢酸エチル５０ｍｌにて２回抽出した。有機層を合わ
せて、溶媒を留去し、粗結晶８０ｍｇを得た。この粗結
晶をトルエンで再結晶し、結晶６８ｍｇ（収率６８％）
を得た。
塩化ナトリウムを飽和になるまで溶解させ、反応生成物
を酢酸エチル５０ｍｌにて２回抽出した。有機層を合わ
せて、溶媒を留去し、粗結晶８０ｍｇを得た。この粗結
晶をトルエンで再結晶し、結晶６８ｍｇ（収率６８％）
を得た。
【００５９】ｍｐ：１１３．５℃ ［α］D ＝−８．５（ｃ＝１，エタノール） 得られた結晶を少量の水に溶解し、光学分割カラムを用
いる高速液体クロマトグラフィー（カラム：ダイセル化
学工業（株）製、キラルセルＯＢ、溶媒：ｎ−ヘキサン
／２−プロパノール＝１９：１）に供し、絶対配置及び
光学純度を測定したところ、生成物と（Ｒ）−２−ヒド
ロキシ−４−フェニル酪酸とのリテンションタイムが完
全に一致し、生成物の光学純度も１００％ｅ．ｅ．であ
った。
いる高速液体クロマトグラフィー（カラム：ダイセル化
学工業（株）製、キラルセルＯＢ、溶媒：ｎ−ヘキサン
／２−プロパノール＝１９：１）に供し、絶対配置及び
光学純度を測定したところ、生成物と（Ｒ）−２−ヒド
ロキシ−４−フェニル酪酸とのリテンションタイムが完
全に一致し、生成物の光学純度も１００％ｅ．ｅ．であ
った。
【図１】実施例３における酵素標品の至適ｐＨを示すた
めのグラフである。
めのグラフである。
【図２】実施例４における酵素標品の安定なｐＨ範囲を
示すためのグラフである。
示すためのグラフである。
【図３】実施例５における酵素標品の至適温度を示すた
めのグラフである。
めのグラフである。
【図４】実施例６における酵素標品の安定な温度範囲を
示すためのグラフである。
示すためのグラフである。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/04 C12P 7/52 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (4)
- 【請求項１】 下記(1) 〜(8) の理化学的性質を有する
新規酵素。 (1) 作用および基質特異性：還元型ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド・リン酸の存在下、２−オキソ
−４−フェニル酪酸を不斉還元し、（Ｒ）−２−ヒドロ
キシ−４−フェニル酪酸を生成する (2) 至適ｐＨ：６．０付近（リン酸緩衝液） (3) 安定ｐＨ範囲：６〜７（リン酸緩衝液） (4) 至適温度：４５℃付近（ｐＨ６．０） (5) 熱安定性：４０℃以下で安定（ｐＨ７．２、処理時
間２０分） (6) ２−オキソ−４−フェニル酪酸に対するミハエリス
定数Ｋｍ値：０．２９ｍＭ (7) 分子量：４６０００（ゲル濾過法） (8) 阻害剤：塩化水銀およびパラクロロ水銀安息香酸 - 【請求項２】 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチド・リン酸の存在下、アルデヒド類及びケトン
類を還元し、これらに対応する等モルのアルコールを生
成する請求項１記載の新規酵素。 - 【請求項３】 ロイコノストック(Leuconostoc）属に属
する微生物を培養し、該培養物から、請求項１記載の酵
素を採取する、新規酵素の製造方法。 - 【請求項４】 還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌ
クレオチド・リン酸の存在下、請求項１記載の酵素を、
２−オキソ−４−フェニル酪酸に作用させて不斉還元す
る、光学活性な（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル
酪酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3131964A JP2750017B2 (ja) | 1991-05-07 | 1991-05-07 | 新規酵素およびその製造方法、並びに光学活性な（ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3131964A JP2750017B2 (ja) | 1991-05-07 | 1991-05-07 | 新規酵素およびその製造方法、並びに光学活性な（ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04335886A JPH04335886A (ja) | 1992-11-24 |
| JP2750017B2 true JP2750017B2 (ja) | 1998-05-13 |
Family
ID=15070341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3131964A Expired - Fee Related JP2750017B2 (ja) | 1991-05-07 | 1991-05-07 | 新規酵素およびその製造方法、並びに光学活性な（ｒ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2750017B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060045912A1 (en) * | 2004-08-30 | 2006-03-02 | Peter Truog | 4-phenylbutyric acid controlled-release formulations for therapeutic use |
-
1991
- 1991-05-07 JP JP3131964A patent/JP2750017B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04335886A (ja) | 1992-11-24 |
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