JP2702285B2 - Ｔａｔ由来の輸送ポリペプチド - Google Patents

Ｔａｔ由来の輸送ポリペプチド

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Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、1992年８月21日に出願した同時係属出願
第07/934,375号の一部継続出願である。
発明の技術分野 本発明は、ポリペプチドおよび核酸のような生物学的
に活性なカーゴ分子の、細胞の細胞質および核へのイン
ビボおよびインビトロでの送達に関する。本発明のカー
ゴ分子の細胞内送達は、１つ以上のHIV tatタンパク質
を含み、カーゴ分子に共有結合する新規の輸送ポリペプ
チドの使用により達成される。本発明の輸送ポリペプチ
ドは、天然に存在するtatタンパク質のtat塩基性領域
（アミノ酸49−57）の存在、tatシステインに富む領域
（アミノ酸22−36）の不在、およびtatエクソン２コー
ド化カルボキシ末端ドメイン（アミノ酸73−86）の不在
に特徴がある。従来のtatタンパク質に見出されるシス
テインに富む領域の不在により、本発明の輸送ポリペプ
チドは見せかけのトランス活性化（trans−activatio
n）およびジスルフィド擬集の問題を解決する。また、
本発明の輸送ポリペプチドのサイズの減少により、カー
ゴ分子の生物学的活性の妨害が最小となる。
発明の背景 生物学的細胞は、一般的に、タンパク質および核酸を
含む高分子に対して不透過性である。いくつかの小分子
は、非常に低い割合で生細胞に進入する。インビボで細
胞内に高分子を送達する方法がないことが、細胞内の作
用部位を有するおそらく多くのタンパク質および核酸
の、治療用、予防用、および診断用の使用の障害となっ
てきた。従って、組換えDNA技術を用いて今日まで生成
されたほとんどの治療用、予防用、および診断用の候補
は、細胞外環境中または標的細胞の表面上で作用するポ
リペプチドである。
種々の方法が、インビトロで細胞中に高分子を送達す
るために開発された。このような方法のリストには、エ
レクトロポレーション、リポソームによる膜融合、DNA
をコートしたマイクロプロジェクタイル（microproject
ile）を用いる高速注入（bombardment）、リン酸カルシ
ウム−DNA沈降とのインキュベーション、DEAE−デキス
トラン仲介形質転換、改変ウイルス核酸の注入、および
単細胞への直接マイクロインジェクションが含まれる。
これらのインビトロの方法は、典型的には全細胞群の一
部分にのみ核酸分子を送達し、そしてこれらは多くの細
胞に障害を与える傾向にある。インビボでの細胞への高
分子の実験的な送達は、リン酸カルシウム沈降、および
リポソームを摩擦塗布（scrape loading）することで達
成された。しかし、これらの技術は、今日までインビボ
での細胞送達への有用性に限界を示してきた。さらに、
インビトロでの細胞でさえ、このような方法は、タンパ
ク質の送達に対する有用性をかなり制限する。
生物学的に活性なタンパク質の無傷細胞へのインビト
ロおよびインビボでの効果的な送達のための一般的な方
法が必要である。（L.A.Sternson,「ポリペプチド送達
に対する障害」，Ann.N.Y.Acad.sci.,57,19−21頁（198
7））。リポペプチドの化学的付加（P.Hoffmannら、
「バクテリアのリポタンパク質および合成リポペプチド
アナログによるヒトおよびマウス粘着細胞の刺激」，Im
munobiol.,177,158−70頁（1988））、あるいは、ポリ
リシンまたはポリアルギニンのような塩基性ポリマー
（Ｗ−C.Chenら、「ポリ−Ｌ−リシンアルブミンおよび
西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体化：タンパク質の
細胞取り込みを増強する新規の方法」，Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,75,1872−76頁（1978））は、高く信頼でき
ることあるいは一般的に有用であることを証明しなかっ
た（後述の実施例４参照）。葉酸が、輸送部分として用
いられた（C.P.LeamonおよびLow,「生細胞への高分子の
送達：葉酸レセプターのエンドサイトシスを活用する方
法」，Proc,Natl.Acad.Sci.USA,88,5572−76頁（199
1））。その証拠は、葉酸複合体のインターナリゼーシ
ョンについては示されたが、細胞質送達については示さ
れなかった。インビボで高レベルの循環葉酸塩がある場
合、この系の有用性は十分に示されなかった。シュード
モナス外毒素もまた輸送部分として用いられた（T.I.Pr
iorら、「バルナーゼ（Barnase）トキシン：シュードモ
ナス外毒素Ａおよびバルナーゼを組合せた新規のキメラ
毒素」，Cell,64,1017−23頁（1991））。しかし、この
系の有効性および一般適用性は公開された著述からは明
らかではない。
ヒト免疫不全ウイルスＩ型（「HIV」）のtatタンパク
質は、細胞へのカーゴタンパク質の送達についての可能
性を示す（PCT出願番号WO91/09958で公開）。しかし、
全長のtatタンパク質の化学的特性のため、生物学的に
活性なカーゴの送達における有効な使用のための一般適
用法は、当該分野で教示されていない。
tatは、特定のHIV遺伝子をトランス活性化するHIVコ
ード化タンパ質であり、ウイルス複製に必須である。全
長のHIV−1 tatタンパク質は86アミノ酸残基を有する。
HIV tat遺伝子は２つのエクソンを有する。tatアミノ酸
１−72はエクソン１にコードされ、アミノ酸73−86はエ
クソン２にコードされる。全長のtatタンパク質は、２
つのリシンおよび６つのアルギニンを含む塩基性領域
（アミノ酸49−57）、ならびに７つのシステイン残基を
含むシステインに富む領域（アミノ酸22−37）を特徴と
する。精製したtatタンパク質は、培養で増殖するヒト
細胞により、周囲の培地から取り込まれる（A.D.Franke
lおよびC.O.pabo,「ヒト免疫不全ウイルス由来のtatタ
ンパク質の細胞取り込み」，Cell,55,1189〜93頁（198
8））。当該分野では、tatタンパク質のシステインに富
む領域（凝集および不溶性を引き起こす）が、tatタン
パク質の細胞取り込みに要求されるかどうかは知られて
いない。
PCT特許出願番号WO 91/09958（「'958出願」）は、パ
ピローマウイルスE2トランス活性化リプレッサーのポリ
ペプチドに遺伝子的に融合したHIV tatタンパク質のア
ミノ酸１−67からなる異種タンパク質が、培養細胞によ
り取り込まれることを開示している。しかし、カーゴポ
リペプチドの生物学的活性の保持（E2トランス活性化の
抑制）は、ここでは示されていない。
'958出願に教示されるように、カーゴタンパク質の細
胞送達に用いる場合、tatタンパク質の使用は実用上の
困難さの可能性を含む。これらの実用上の困難さは、ta
tタンパク質のシステインに富む領域に係わるタンパク
質の凝集および不溶性を含む。さらに'958出願では、カ
ーゴタンパク質へのtatタンパク質の化学的架橋の実施
例は提供されていない。この化学的架橋は、カーゴタン
パク質へのtatの遺伝的融合が、tatタンパク質、カーゴ
タンパク質、またはその両方の適切な折り畳みを干渉す
る位置で重要であり得る。加えて'958出願とFrankelお
よびPabo（前出）との両方が、細胞毒性であるクロロキ
ンと組み合わせるtat輸送タンパク質の使用を教示して
いる。従って、生細胞の細胞質および核への生物学的に
活性なカーゴ分子の安全で、有効な送達のための一般的
に適用し得る手段についての必要性がある。
発明の要旨 本発明は、（１）標的の細胞または細胞核に本来進入
し得ない、あるいは（２）有用な割合で標的細胞に本来
進入し得ない、生物学的に活性な、tatでない、タンパ
ク質、核酸、および他の分子を、有効な細胞質および核
に送達するための方法および生成物を提供することによ
り、上記の問題を解決する。本発明のカーゴ分子の細胞
内送達は、HIV tatタンパク質の１つ以上の部分を含
み、そしてそのカーゴ分子に共有結合している、新規の
輸送タンパク質の使用により達成される。さらに詳細に
は、本発明は、新規の輸送ポリペプチド、これらの輸送
ポリペプチドの作製方法、輸送ポリペプチド−カーゴ複
合体、輸送ポリペプチド−カーゴ複合体を含む薬学的組
成物、予防用組成物、および診断用組成物、および、ta
t関連輸送ポリペプチドを用いる細胞へのカーゴの送達
方法に関する。
本発明の輸送ポリペプチドは、tat塩基性領域のアミ
ノ酸配列（天然に存在するtatタンパク質のアミノ酸49
−57）の存在；システインに富む領域のアミノ酸配列
（天然に存在するtatタンパク質のアミノ酸22−36）の
不在、およびtatエクソン２コード化カルボキシ末端ド
メイン（天然に存在するtatタンパク質のアミノ酸73−8
6）の不在を特徴とする。このような輸送ポリプチドの
好ましい実施態様は、tat37−72（配列番号:2）、tat37
−58（配列番号:3）、tat38−58GGC（配列番号:4）、ta
tCGG47−58（配列番号:5）、tat47−58GGC（配列番号:
6）、およびtatΔcys（配列番号:7）である。輸送ポリ
エプチドがカーゴ部分に遺伝子的に融合する場合に、ア
ミノ末端メチオニンを加えなければならないが、スペー
サーアミノ酸（例えば、CysGlyGlyまたはGlyGlyCys）を
加える必要はないことが当業者により知られている。従
来のtatタンパク質に存在するシステインに富む領域の
不在により、本発明の輸送タンパク質は、ジスルフィド
凝集の問題を解決する。このジスルフィド凝集は、カー
ゴの生物学的活性の損失、輸送ポリペプチド−カーゴ複
合体の不溶性、またはその両方を生じ得る。また、本発
明の輸送ポリペプチドのサイズの減少により、カーゴの
生物学的活性の妨害が都合よく最小となる。輸送ポリペ
プチドのサイズを減少するさらなる利点は、カーゴ分子
当たり複合の輸送ポリペプチドの結合に関わる、本発明
の実施態様で、取り込み効果を増強することである。
本発明の輸送ポリペプチドは、化学的架橋または遺伝
的融合によりカーゴ分子に都合良く結合し得る。本発明
の好ましい実施態様に従って、輸送ポリペプチドおよび
カーゴ分子は化学的架橋される。唯一の末端システイン
残基は、化学的架橋の好ましい手段である。本発明の他
の好ましい実施態様に従って、輸送部分のカルボキシ末
端はカーゴ部分のアミノ末端に遺伝子的に融合される。
本発明の特に好ましい実施態様は、JB106であり、これ
は、アミノ末端メチオニンに次いで、tat残基47−58、
次いでHPV−16 E2残基245−365からなる。
多くの場合、本発明の新規の輸送ポリペプチドは、ク
ロロキシ関連の毒性を都合良く避ける。本発明の１つの
好ましい実施態様に従って、生きているヒトまたは動物
中に輸送ポリペプチド−カーゴ複合体を導入した後、生
物学的に活性なカーゴが種々の器官および組織の細胞中
に送達される。上記の特性により、本発明は、細胞質ま
たは核の作用部位を有するタンパク質、核酸、および他
の分子に関わる生物学研究および病気の治療に道を開
く。
図面の簡単な説明 図１は、HIV−1 tatタンパク質のアミノ酸配列（配列
番号:1）を示す。
図２は、輸送ポリペプチド−シュードモナス外毒素リ
ボシル化ドメイン複合体を用いた細胞取り込み実験の結
果をまとめる（黒塗り、非複合体；斜線、複合体）。
図３は、輸送ポリペプチド−リボヌクレアーゼ複合体
を用いた細胞取り込み実験の結果をまとめる（黒四角、
輸送部分を含まないリボヌクレアーゼ−SMCC;黒丸、tat
37−72−リボヌクレアーゼ；黒三角、tat38−58GGC−リ
ボヌクレアーゼ；黒菱形、tatCGG−58−リボヌクレアー
ゼ；白四角、tatCGG47−58−リボヌクレアーゼ）。
図４は、プラスミドpAHE2の構築を模式的に示す。
図５は、プラスミドpET8c123の構築を模式的に示す。
図６は、プラスミドpET8c123CCSSの構築を模式的に示
す。
図７は、輸送ポリペプチドE2リプレッサー複合体を用
いた細胞取り込み実験の結果をまとめる（白菱形、tat3
7−72に架橋したE2.123、クロロキンを含まない；黒菱
形、tat37−72に架橋したE2.123、クロロキンを含む；
白丸、tat37−72に架橋したE2.123CCSS、クロロキンを
含まない；黒丸、tat37−72に架橋したE2.123CCSS、ク
ロロキンを含む）。
図８は、プラスミドpTATΔcysの構築を模式的に示
す。
図９は、プラスミドpFTE501の構築を模式的に示す。
図10は、プラスミドpTATΔcys−249の構築を模式的に
示す。
図11は、プラスミドpJB106の構築を模式的に示す。
図12は、タンパク質JB106の完全なアミノ酸配列を示
す。
図13は、JB106（四角）、TxHE2CCSS（菱形）、および
HE2.123（丸）に関するE2抑制アッセイの結果をまとめ
る。このアッセイは、実施例14に記載したように、クロ
ロキンを含まずに、COS7細胞中で行った。
発明の詳細な説明 本明細書に記載の発明をさらに十分理解し得るため
に、次に詳細な説明を記載する。
本明細書中では、次の用語が用いられる： アミノ酸−−ペプチド、ポリペプチド、またはタンパ
ク質のモノマー単位。20種のタンパク質アミノ酸（Ｌ−
異性体）は：アラニン（「Ala」または「Ａ」）、アル
ギニン（「Arg」または「Ｒ」）、アスパラギン（「As
n」または「Ｎ」）、アスパラギン酸（「Asp」または
「Ｄ」）、システイン（「Cys」または「Ｃ」）、グル
タミン（「Gln」または「Ｑ」）、グルタミン酸（「Gl
u」または「Ｅ」）、グリシン（「Gly」または
「Ｇ」）、ヒスチジン（「His」または「Ｈ」）、イソ
ロイシン（「Ile」または「Ｉ」）、ロイシン（「Leu」
または「Ｌ」）、リシン（「Lys」または「Ｋ」）、メ
チオニン（「Met」または「Ｍ」）、フェニルアラニン
（「Phe」または「Ｆ」）、プロリン（「Pro」または
「Ｐ」）、セリン（「Ser」または「Ｓ」）、トレオニ
ン（「Thr」または「Ｔ」）、トリプトファン（「Trp」
または「Ｗ」）、チロシン（「Tyr」または「Ｙ」）、
およびバリン（「Val」または「Ｖ」）である。本明細
書で用いられる用語アミノ酸はまた、タンパク質アミノ
酸のアナログ、ならびに、タンパク質アミノ酸のＤ−異
性体およびそのアナログを含む。
カーゴ−−tatタンパク質またはそのフラグメントで
はない分子であって、（１）本来標的細胞に進入し得な
いか、または（２）本来標的細胞に有用な割合で進入し
得ない分子。（本出願中で用いられる「カーゴ」は、本
来のすなわち複合体化前の分子か、輸送ポリペプチド−
カーゴ複合体のカーゴ部分のいずれかをいう。）「カー
ゴ」の例は、ポリペプチド、核酸、および多糖のような
小分子および高分子を含むが、それに限定されない。
化学的架橋−−２つ以上の前もって形成された分子の
共有結合。
カーゴ複合体−−少なくとも１つの輸送ポリペプチド
部分および少なくとも１つのカーゴ部分を含む分子であ
って、輸送ポリプペチドとカーゴ分子との遺伝的融合ま
たは化学的架橋のいずれかにより形成された分子。
遺伝的融合−−それぞれのタンパク質をコードする隣
接したDAN配列の遺伝子発現を通じて、２つ以上のタン
パク質のポリペプチド骨格を介するそれらの共直線性の
共有結合。
高分子−−ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ま
たは核酸のような分子。
ポリペプチド−−そのサイズに関係なく、20種のタン
パク質アミノ酸（上記）のいずれかから本質的になる任
意のポリマー。「タンパク質」がしばしば比較的大きな
ポリペプチドについて用いられ、「ペプチド」はしばし
ば小さいポリペプチドについて用いられるが、当該分野
におけるこれらの用語の使用は重複し、そして多様であ
る。本明細書中で用いられる用語「ポリペプチド」は、
他に記載のない限り、ペプチド、ポリペプチド、および
タンパク質をいう。
リポーター遺伝子−−その発現が、目的の細胞の事象
の発生に依存する遺伝子であり、そしてその発現が遺伝
的に形質転換された宿主細胞中で都合良く観察され得
る、遺伝子。
リポータープラスミド−−１つ以上のリポーター遺伝
子を含むプラスミドベクター。
小分子−−高分子以外の分子。
スペーサーアミノ酸−−化学的架橋に用いられる輸送
部分とアミノ酸残基との間に含まれるアミノ酸（好まし
くは小分子の側鎖を有する）（例えば、分子の柔軟性を
提供し、立体障害を避けるたけの）。
標的細胞−−カーゴが輸送ポリペプチドにより送達さ
れる細胞。「標的細胞」は、インビボまたはインビトロ
のいずれかでの、ヒト細胞を含む任意の細胞であり得
る。
輸送部分または輸送ポリペプチド−−共有結合したカ
ーゴを標的細胞へ送達し得るポリペプチド。
本発明は、一般的に治療用、予防用、または診断用
の、タンパク質、核酸、および多糖のような、小分子お
よび高分子（本来標的細胞に有用な割合で進入し得な
い）の細胞内送達に適用可能である。しかし、本発明の
他の実施態様は、臨床応用に限定されないことが認めら
れるべきである。本発明は、医学研究およに生物学研究
に都合良く適用され得る。本発明の研究応用において、
カーゴは薬物またはリポーター分子であり得る。本発明
の輸送ポリペプチドは、単独でまたは輸送ポリペプチド
複合体化キットの一部のとしてのいずれかで、研究機関
用の試薬として用いられ得る。
標的細胞は、インビボ細胞、すなわち生きている動物
またはヒトの器官または組織を構成する細胞であり得
る。標的細胞はまた、インビトロ細胞、すなわち培養し
た動物細胞、ヒト細胞、または微生物であり得る。
本発明の実施における使用のための薬物およびリポー
ター分子の選択には広い自由範囲がある。リポーター分
子の選択において考えられる要因は、求められる実験の
情報の型、非毒性、検出の利便性、検出の定量可能性、
および入手可能性を含むが、それに限定されない。多く
のこのようなリポーター分子は当業者に公知である。
下記の実施例から認められるように、呈色アッセイに
存在する酵素をモデルカーゴとして用いて、本発明の輸
送ポリペプチドの使用可能性、および有用な特性を示し
た。これらの酵素カーゴは、感度、利便性、細胞取り込
みの可視検出、を提供する。さらに、カーゴの酵素活性
が保持される場合にのみ可視的な解読が生じるので、こ
れらの酵素は、本発明の輸送ポリペプチド−カーゴ複合
体中のカーゴ部分の生物学的活性の保持に関する感度の
高いおよび信頼できる試験を提供する。本発明の好まし
い実施態様は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（「HR
P」）を輸送ポリペプチド−カーゴ複合体のカーゴ部分
として含む。本発明の実施のための特に好ましいモデル
カーゴ部分はβ−ガラストシダーゼである。
モデルカーゴタンパク質はまた、細胞内のそれらの作
用部位によって選択され得る。下記の実施例６および７
に記載したように、シュードモナス外毒素（「PE」）由
来のADPリボシル化ドメインおよび膵リボヌクレアーゼ
を用いて、本発明の輸送ポリペプチドによる適切に折り
畳まれたカーゴタンパク質の細胞質送達を確認した。
全長のシュードモナス外毒素はそれ自身で細胞に進入
し得、ADPリボシル化反応によりリボソームを不活性化
し、従って細胞を殺す。ADPリボシル化ドメインとして
知られているシュードモナス外毒素タンパク質の一部は
細胞に進入し得ないが、細胞と接触した場合、リボソー
ムを不活性化する能力を維持する。従って、輸送ポリペ
プチド−PE ADPリボシル化ドメイン複合体により誘発さ
れた細胞の死は、輸送ポリペプチドによるカーゴの細胞
質送達に関する試験となる。
本発明者らは、リボヌクレアーゼを用いて本発明の輸
送ポリペプチドによる適切に折り畳まれたカーゴタンパ
ク質の細胞質送達を確認した。RNAによる方法のタンパ
ク質合成は、RNAを消化するリボヌクレアーゼに感度が
高い。しかし、リボヌクレアーゼはそれ自身で細胞に進
入し得ない。従って、輸送ポリペプチド−リボヌクレア
ーゼ複合体によるタンパク質合成の阻害は、生物学的に
活性なリボヌクレアーゼの細胞内送達に関する試験とな
る。
もちろん、与えられたカーゴ分子の細胞質への送達に
次いで、同カーゴ分子の核へのさらなる送達が続き得
る。核送達は細胞質のいくつかの部分を横断することを
必然的に含む。
パピローマウイルスE2リプレッサーのタンパク質は、
本発明の輸送ポリペプチドにより標的細胞の核へ送達さ
れ得る高分子薬物の例である。パピローマウイルスE2タ
ンパク質はホモダイマーとして通常存在するが、パピロ
ーマウイルスゲノムの転写および複製の両方を制御す
る。E2タンパク質のカルポキシ末端ドメインは、DNA結
合活性および二量体化活性を含む。トランスフェクトさ
れた哺乳類細胞中の種々のE2アナログまたはE2カルボキ
シ末端フラグメントをコードするDNA配列の短い発現
が、全長のE2タンパク質によるトランス活性化を阻害す
る（J.Barsoumら、「パピローマウイルスE2リプレッサ
ーの作用機構:DNA結合の不在における抑制」，J.Viro
l.,66,3941−3945頁（1992））。培養哺乳類細胞の成長
培地に添加したE2リプレッサーは細胞に進入しない。従
って、E2リプレッサーは、これらの細胞ではE2のトラン
ス活性化を阻害しない。しかし、本発明の輸送ポリペプ
チドのE2リプレッサーへの複合の結果、成長培地から生
物学的活性を示す培養細胞へのE2リプレッサーの移動が
生じ、リポーター遺伝子のE2依存性の発現を抑制する。
インビトロおよにインビボで、一本鎖および二本鎖の
核酸が細胞に進入する割合は、本発明の輸送ポリペプチ
ドを用いて都合良く増強され得る。実施例11（下記）に
示すように、核酸へのポリペプチドの化学的架橋の方法
は当該分野で周知である。本発明の好ましい実施態様で
は、カーゴは一本鎖アンチセンス核酸である。アンチセ
ンス核酸は、それらと相補的である配列の細胞の発現を
阻害するのに有用である。本発明の他の実施態様におい
て、カーゴは核酸結合タンパク質に認識される結合部位
を含む二本鎖の核酸である。このような核酸結合タンパ
ク質の例はウイルス性のトランスアクティベーターであ
る。
天然に存在するHIV−1 tatタンパク質（図１）は、16
個のアミノ酸の内７個がシステインである領域（アミノ
酸22−37）を有する。これらのシステイン残基は、他の
tatタンパク質分子のシステインに富む領域におけるシ
ステイン残基、およびカーゴタンパク質または複合体の
カーゴ部分におけるシステイン残基とで、互いにジスル
フィド結合を形成し得る。このようなジスルフィド結合
形成は、カーゴの生物学的な活性の損失を引き起こす。
さらに、カーゴ部分にジスルフィド結合の可能性がない
場合でさえ（例えば、カーゴタンパク質がシステイン残
基を持たない場合）、輸送ポリペプチド間のジスルフィ
ド結合の形成が、輸送ポリペプチド、輸送ポリペプチド
−カーゴ複合体、またはその両方の凝集および不溶性を
引き起こす。tatシステインに富む領域は、カーゴタン
パク質の細胞送達に対する天然に存在するtatタンパク
質の使用において、おそらく重大な問題の原因となる。
システインに富む領域は、tatのインビトロでの二量
体化に必要であり、そしてHIV DNA配列のトランス活性
化に必要である。従って、tatシステインに富む領域の
除去は、tatの本来の活性（すなわちHIVの転写および複
製の誘導）を除くのにさらに有利である。しかし、当該
分野は、tatタンパク質のシステインに富む領域が細胞
取り込みに要求されるかどうか教示していない。
本発明は、この領域が本明細書中に記載された輸送タ
ンパク質に存在しないため、tatシステインに富む領域
に関連する問題が解決される実施態様を含む。これらの
実施態様において、輸送ポリペプチドまたは輸送ポリペ
プチド−カーゴ分子複合体の細胞取り込みは依然として
起こる。本発明の好ましい実施態様の１つの群では、シ
ステインに富む領域の前のアミノ酸配列が、システイン
に富む領域に続くアミノ酸配列に直接融合される。この
ような輸送ポリペプチドはtatΔcysと呼ばれ、一般式
（tatl−21）−（tat38−ｎ）を有し、ここでｎはカル
ボキシ末端残基の数、すなわち49−86である。好ましく
は、ｎは58−72である。下記の実施例から認められるよ
うに、tatタンパク質のシステインに富む領域の前のア
ミノ酸配列が細胞取り込みに必要である。好ましい輸送
ポリペプチド（または輸送部分）は、tatタンパク質の
アミノ酸37−72からなり、そしてtat37−72（配列番号:
2）と呼ばれる。化学的架橋に有用であるので、輸送ポ
リペプチドのアミノ末端のtat残基37のシステインの保
持が好ましい。
tatΔcysポリペプチド、tat37−72、および本発明の
他の実施態様の利点は、以下を含む： ａ）tatタンパク質の本来の活性、すなわちHIVの転写の
誘導が除かれる； ｂ）輸送ポリペプチドのダイマーおよび高マルチマーが
避けられる； ｃ）E.coli中でのtatΔcys遺伝的融合の発現レベルが改
善され得る； ｄ）いくつかの輸送ポリペプチド複合体は、溶解度の増
加、および取扱いの容易さに優れていることを示す；そ
して、 ｅ）いくつかの融合タンパク質は、カーゴ部分による活
性が、システインに富む領域を含む融合物に比較して増
加することを示す。
多くの化学的架橋法が知られており、本発明の輸送ポ
リペプチドのカーゴ高分子への複合体化におそらく適用
可能である。多くの公知の化学的架橋法は非特異的であ
る（すなわち、輸送ポリペプチドまたはカーゴ高分子の
任意の特定部位に結合するポイントに向けられない）。
つまり、非特異的架橋剤の使用は、機能部位または立体
的にブロックされている活性部位に作用し得、複合タン
パク質を生物学的に不活性化する。
本発明の実施において、結合特異性を増加する好まし
い試みは、架橋するポリペプチドの１つまたは両方で１
回のみまたは数回見出される官能基に直接化学結合する
ことである。例えば、多くのタンパク質の中で唯一チオ
ール基を含むタンパク質アミノ酸であるシステインはほ
んの数回生じる。また、例えば、ポリイペプチドがリシ
ン残基を含まない場合、第一アミンに特異的な架橋剤は
そのポリペプチドのアミノ末端に選択的である。結合特
異性を増加するこの試みを首尾よく利用するには、ポリ
ペプチドがこの分子の生物学的活性を損失することなく
変化し得る、この分子の領域に適格な非常に良い反応性
残基を有することが必要である。
下記の実施例に記載したように、架橋反応におけるそ
の関与が、生物学的活性を妨害しそうなポリペプチド配
列部分で起こる場合、システイン残基を置換し得る。シ
ステイン残基を置換する場合、ポリペプチドの折り畳み
で生じる変化を最小にすることが一般的に望ましい。ポ
リペプチドの折り畳みにおける変化は、置換体がシステ
インと化学的におよび立体的に似ている場合に最小にな
る。これらの理由で、セリンがシステインの置換体とし
て好ましい。下記の実施例に記載したように、システイ
ン残基は架橋の目的のためにポリペプチドのアミノ酸配
列に導入され得る。システイン残基が導入される場合
は、アミノ末端またはカルボキシ末端で、あるいはその
近辺での導入が好ましい。このようなアミノ酸配列の改
変には、目的のポリペプチドが化学合成で生成されるの
かまたは組換えDNAの発現で生成されるのかに関わら
ず、従来の方法が適用される。
架橋剤は、ホモ二官能性（homobifunctional、すなわ
ち同じ反応を行う２つの官能基を有する）であり得る。
好ましいホモ二官能性架橋剤は、ビスマレイミドヘキサ
ン（「BMH」）である。BMHは、緩和な条件（pH6.5−7.
7）でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２
つのマレイミド官能基を含む。２つのマレイミド基は炭
化水素鎖でつながっている。従って、BMHはシステイン
残基を含有するポリペプチドの不可逆的な架橋に有用で
ある。
架橋剤はまた、ヘテロ二官能性（heterobifunctiona
l）であり得る。ヘテロ二官能性架橋剤は２つの異なる
官能基、例えばアミン反応基およびチオール反応基を有
し、フリーのアミンおよびチオールをそれぞれ有する２
つのタンパク質を架橋する。ヘテロ二官能性架橋剤の例
は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン−１−カルノキシレート（「SMCC」）、ｍ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（「MBS」）、およびスクシンイミド４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「SMPB」）、
MBSの延長した鎖のアナログである。これらの架橋剤の
スクシンイミジル基が第一アミンと反応し、チオール反
応性マレイミドと反応して、システイン残基のチオール
と共有結合を形成する。
架橋剤はしばしは水中では低い溶解度を有する。スル
ホン酸基のような親水性部分を架橋剤に加えて水への溶
解度を改善し得る。スルホ−MBSおよびスルホ−SMCCは
水溶性に改変された架橋剤の例である。
多くの架橋剤は細胞内の条件下で本来切断されない複
合体を生じる。しかし、いくつかの架橋剤はジスルフィ
ドのような共有結合を含み、それは細胞内の条件下で切
断可能である。例えば、ジチオビス（スクシンイミジル
プロピオネート）（「DSP」）、トラウト試薬（Traut's
reagent）、およびＮ−シクシンイミジル３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート（「SPDP」）は周知の切
断可能な架橋剤である。切断可能な架橋剤の使用で、標
的細胞への送達後、カーゴ部分を輸送ポリペプチドから
分離し得る。直接的なジスルフィド結合もまた有用であ
り得る。
ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシ−スクシンイミド
エステル（「GMBS」）、およびスルホ−GMBSのような、
いくつかの新規の架橋剤は免疫原性が低い。本発明のい
くつかの実施態様において、このような低い免疫原性は
有利であり得る。
上記に記載したものを含む多くの架橋剤は市販で入手
可能である。これらの使用のための詳細な指示は市販者
から容易に入手可能である。タンパク質の架橋および複
合体の調製における一般的な参考文献は、S.S.Wong,Che
mistry of Protein Conjugation and Cross−Linking,C
RC Press（1991）である。
化学的架橋はスペーサーアームの使用を含み得る。ス
ペーサーアームは、分子内柔軟性を提供するかまたは複
合部分間の分子内距離を調節し、それにより生物学的活
性の保持の助けになり得る。スペーサーアームは、スペ
ーサーアミノ酸を含むポリペプチド部分の形態であり得
る。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖SPDP」（Pi
erce Chem.Co.,Rockford,IL,カタログ番号21651 H）に
おけるように架橋剤の一部であり得る。
本発明の薬学的組成物は、治療用、予防用、または診
断用であり得、そして種々の形態であり得る。これら
は、例えば、固体、半固体、および液体の投与剤形（例
えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤または懸濁剤、噴霧剤、
リポソーム、坐剤、注入可能なおよび浸透可能な溶液、
ならびに持続性放出剤型）を含む。好ましい形態は、意
図する投与形態、および治療用、予防用、または診断用
の適用に依存する。本発明の輸送ポリペプチド−カーゴ
分子複合体は、従来の投与経路（例えば、経口、経皮、
血管内、筋肉内、病巣内（intralesional）または噴霧
経路）により投与され得る。好ましくは、組成物はまた
当業者に公知の従来の薬学的に受容可能なキャリアおよ
びアジュバントを含む。
一般的に、本発明の薬学的組成物は、例えばαインタ
ーフェロンのような薬学的に重要なポリペプチドに用い
られたのと類似の方法および組成物を用いて、処方およ
び投与され得る。従来の投与量は、含まれる特定のカー
ゴに依存して変化することが理解される。
本発明の方法および組成物は、ヒトを含むあらゆる生
物に適用され得る。本発明の方法および組成物はまた、
動物およびヒトに子宮内で適用し得る。
本発明の多くの薬学的な適用のために、カーゴ分子が
成長培地から培養細胞へよりむしろ、体液から体の組織
の細胞へ移動することが必要である。従って、培養細胞
を含む下記の実施例に加えて、本発明者らは、生きてい
る動物への輸送ポリペプチド−カーゴタンパク質複合体
の静脈注射の後の、種々の哺乳類の器官および組織の細
胞へのモデルカーゴタンパク質の送達を証明する実施例
を提供した。これらのカーゴタンパク質は、インビボで
の細胞への送達後に生物学的活性を示した。
次の実施例に記載したように、本明細書で提供された
アミノ酸およびDNA配列情報を用いて、本発明の輸送ポ
リペプチドを、化学合成または組換えDNA法により生成
し得る。公知のアミノ酸配列を有するポリペプチドの化
学合成または組換えDNA生成の方法は周知である。ポリ
ペプチドまたはDNAの合成のための自動化装置は市販で
入手可能である。宿主、クローニングベクター、DNA発
現制御配列、およびオリゴヌクレオチドリンカーもまた
市販で入手可能である。
周知の技術を用いて、当業者は本明細書中に記載の好
ましい輸送ポリペプチドのアミノ酸配列に、小さい追
加、削除、または置換を容易に行い得る。しかし、この
ような変更は本発明の範囲内であると理解されるべきで
ある。
さらに他のウイルス、例えばHIV−２（M.Guyaderら、
「ヒト免疫不全ウイルス２型のゲノムの構成およびトラ
ンス活性化」，Nature,326,662−669頁（1987））、ウ
マ伝染性貧血ウイルス（R.Carrollら、「ウマ伝染性貧
血ウイルス／ヒト免疫不全ウイルス１型tat遺伝子キメ
ラの発生によるレンチウイルスtat機能性ドメインの同
定」，J.Virol.,65,3460−67頁（1991）、およびシミア
ン免疫不全ウイルス（L.Chakrabartiら、「マカク由来
のシミアン免疫不全ウイルスの配列およびその他のヒト
およびシミアンレトロウイルスとの関係」，Nature,32
8,543−47頁（1987）;S.K.Aryaら、「新規なヒトおよび
シミアンHIV関連レトロウイルス保有機能トランスアク
ティベーター（tat）遺伝子」Nature,328,548−550頁
（1987））由来のタンパク質が知られている。これらの
tatタンパク質由来で生あり、そしてtat塩基性領域の存
在およびtatシステインに富む領域の不在を特徴とする
ポリペプチドが、本発明の範囲内にあることが理解され
るべきである。
本明細書に記載の発明がさらに十分理解され得るため
に、次の実施例を記載する。これらの実施例は単に例示
の目的であり、いかようにも本発明を限定するように解
釈されるべきではないことが理解されるべきである。こ
れらの実施例を通して、全ての分子クローニング反応
は、他に記載のない限り、J.Sambrookら、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manual，第２版,Cold Spring Harb
or Laboratory（1989）の方法に従って行った。
実施例１ 輸送ポリペプチドの生成および精製 組換えDNA プラスミドpTat72を、tat由来輸送ポリペプチドの細
菌での生成および輸送ポリペプチド−カーゴタンパク質
融合物をコードする遺伝子の構築のための開始クローン
とした。本発明者らは、Alan Frankel（The Whitehead
Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA）か
らプラスミドpTat72（FrankelおよにPaboに記載、前
出）を得た。プラスミドpTat72は、HIV−1 tatのアミノ
酸１位から72位をコードする合成遺伝子の挿入により、
F.W.Studierら（「クローニングした遺伝子の直接発現
へのT7 RNAポリメラーゼの使用」，Methods Enzymol.,1
85,60−90頁（1990））のpET−3a発現ベクターから得
た。tatコード領域は、E.coliコドン用法を使用し、イ
ソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「IPT
G」）で誘導可能なバクテリオファージT7ポリメラーゼ
プロモーターにより運ばれる。IPTG誘導後、tatタンパ
ク質は総E.coliタンパク質の５％を構成した。
細菌からのTat1−72の精製 tat1−72タンパク質を発現するE.coliを、10容量の25
mM Tris−HCl（pH7.5）、1mM EDTA中に懸濁した。細胞
をフレンチプレスで溶解し、10,000×ｇで１時間遠心分
離にかけ不溶性の残渣を除いた。上清液をＱセファロー
スファーストフロー（Pharmacia LKB,piscataway,NJ）
イオン交換カラム（20ml樹脂/60ml溶解物）にのせた。t
atタンパク位置を沈殿させる0.5M NaClで素通り画分を
処理した。50.2ローター中35,000rpmで１時間遠心分離
することで塩析したタンパク質を集めた。6Mグアニジン
−HClで沈殿を溶解し、50.2ローター中35,000rpmで１時
間遠心分離することにより清澄化した。清澄化した試料
を、6Mグアニジン−HCl、50mMリン酸ナトリウム（pH5.
4）、10mM DTTで平衡化したA.5アガロースゲル濾過カラ
ムにのせた。次いで、同緩衝液で試料を溶出した。tat
タンパク質含有ゲル濾過画分を、C4逆相HPLCカラムおよ
び０−75％のアセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸
でグラディエントをかけて溶出した。これらの手順を用
いて、E.coli培養物１リットル（推定で１リットル当り
6gの細胞）当り約20mgのtat1−72タンパク質を生成し
た。これは、全体の約50％の回収率を示した。
SDS−PAGE分析で、tatl−72ポリペプチドは10kDの１
本のバンドに移動した。精製したtat1−72ポリペプチド
は、取り込み／トランス活性化アッセイで活性であっ
た。このポリペプチドをtat−反応性組織のプラスミノ
−ゲン活性化因子（「tPA」）リポーター遺伝子を含む
ヒト肝癌細胞の培地に加えた。0.1mMクロロキンの存在
下で、精製tat1−72タンパク質（100ng/ml）は約150培
のtPA発現を誘導した。
輸送ポリペプチドの化学合成 種々の輸送ポリペプチドの化学合成のために、市販の
自動化システム（Applied Biosystems 430A型合成機）
を用いて、システム製造者の推奨する手段に従った。HF
処理によりブロック基を除去し、従来の逆相HPLC法によ
り合成ポリペプチドを単離した。全ての合成ポリペプチ
ドンの完全性はマススペクトル分析により確認された。
実施例２ β−ガラクトシダーゼ複合体 SMCCとの化学的架橋 β−ガラクトシダーゼのアセチル化（システインスル
フヒドリル基をブロックする）のために、6.4mgの市販
で入手したβ−ガラクトシダーゼ（Pierce Chem.Co.,カ
タログ番号32101G）を、200μｌの50mMのリン酸緩衝液
（pH7.5）に溶解した。この200μｌのβ−ガラストシダ
ーゼ溶液に、30mgのヨード酢酸を4mlの50mMリン酸緩衝
液（pH7.5）に溶解することにより調製した、ヨード酢
酸を10μｌ添加した。（引き続く実験において、ヨード
アセトアミドがヨード酢酸の好適な代替物であるがわか
った。）この反応を、室温で60分間進行させた。次い
で、反応混合物を小Ｇ−25（Parmacia LKB、Piscatawa
y、NJ）ゲル濾過カラムにのせ、そしてボイドボリュー
ムを集めることにより、未反応のヨード酢酸からアセチ
ル化β−ガラストシダーゼを分離した。
アセチル化β−ガラクトシダーゼのアミン基のSMCC活
性化に先立って、Ｇ−25カラムから集めた酵素の2ml
を、Centricon10（Amicon、Danvers、MA）限外濾過装置
中で、0.3mlまで濃縮した。濃縮したアセチル化β−ガ
ラストシダーゼに、15μｌのジメチルホムアミド（「DM
F」）中に溶解した19μｇのスルホ−SMCC（Pierce Che
m.Co.、カタログ番号22322G）を添加した。反応を室温
で30分間進行させた。次いで、小Ｇ−25ゲル濾過カラム
を通過させることにより、β−ガラシトシダーゼ−SMCC
を、DMFおよび未反応のSMCCから分離した。
輸送ポリペプチドのβ−ガラストシダーゼへの化学的
架橋のために、β−ガラクトシダーゼ−SMCC溶液を、20
0μｌの50mMリン酸緩衝液（pH7.5）に溶解した。100μ
ｇの輸送ポリペプチド（tat1−72、tat37−72、tat38−
58GGC、tat37−58、tat47−58GGC、またはtatCGG47p4
8）と混合した。反応を室温で60分間進行させた。次い
で、反応混合物をＳ−200HRゲル濾過カラム上にのせ、
そしてボイドボリュームを集めることにより、輸送ポリ
ペプチド−β−ガラストシダーゼ複合体を単離した。
このようにして得た輸送ポリペプチド−β−ガラスト
シダーゼ複合体は、ウサギ坑tatポリクローナル抗体を
用いて実施した従来のウェスタンブロットおよびELISA
分析で、tatに対してアッセイされたとき陽性の結果を
生じた。ウェスタンブロットおよびELISA分析の一般的
論議は、E.HarlowおよびD.Lane、Antibodies:A Laborat
ory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory（1988）
を参照のこと。スパロース（Superose）６（Pharmacia
LKB、Piscataway、NJ）を用いたゲル濾過分析は、輸送
ポリペプヂド−β−ガラクトシダーゼ複合体が、約540,
000ダルトンの分子量を有することを示した。輸送ポリ
ペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合体の比活性は、ｏ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（「ON
PG」）を用いてアッセイしたとき、β−ガラストシダー
ゼ出発物質の比活性の52％であった。ONPGアッセイ手法
は、Sambrookら（前出）の16.66−16.67頁に詳細に記載
されている。
β−ガラクトシダーゼ複合体の細胞取り込み 複合体を、100μＭクロロキンの存在下または非存在
下で、HeLa細胞（ATCC番号CCL2）の培地に、20μg/mlで
添加した。細胞を、37℃/5.5％CO2で、４−18時間イン
キュベートした。細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水
（「PBS」）中の、２％ホルムアルデヒド、0.2％グルタ
ルアルデヒドを用いて４％で５分間おいて固定化した。
次いで、細胞をPBS中で2mM MgCl2で３回洗浄し、そして
それらの37℃でＸ−galを用いて染色した。Ｘ−galは、
β−ガラクトシダーゼによる切断に際し青色の生成物を
生じる、無色のβ−ガラクトシダーゼ基質（５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリルＤ−ガラクトシド）であ
る。用いたＸ−gal染色溶液は、5mMフェリシアン化カリ
ウム、5mMフェロシアン化カリウム、および2mM MgCl2を
含むPBSの1mlあたり、1mgのＸ−gal（Bio−Rad、Richmo
nd、CA、カタログ番号170−3455）を含有した。
染色した細胞を、400倍までの倍率で顕微鏡検査し
た。このような顕微鏡検査は、核染色および細胞質染色
を示した。
tat37−72−β−ガラストシダーゼ複合体またはtat1
−72−β−ガラクトシダーゼ複合体を添加した細胞は、
暗青色に染色された。β−ガラクトシダーゼ活性は、15
分程度の展開時間後に観察され得た。比較のために、β
−ガラストシダーゼ活性が、β−ガラクトシダーゼ遺伝
子のトランスフェクションにより細胞内に導入されたと
きは、少なくとも６時間の染色展開時間が、通常、必要
とされることに注目すべきである。クロロキン処理細胞
中で、核染色の強度は、よりわずかに大きかったが、ク
ロロキン非存在下で核染色が見られた。複合体を形成し
ていないβ−ガラクトシダーゼで処理されたコントロー
ル細胞は、検出可能な染色を示さなかった。
直接ジスルフィドによる切断可能な複合 各β−ガラクトシダーゼテトラマーは、輸送ポリペプ
チドのシステイン残基への直接ジスルフィド結合に使用
され得る12のシステイン残基を有する。tat37−72のス
ルフヒドリルを還元および次いで保護するために、1.8m
g（411nmole）のtat37−72を、1mlの、50mMリン酸ナト
リウム（pH8.0）、150mM NaCl、2mM EDTAに溶解し、そ
してこの溶液を、Reduce−Immカラム（Pierce Chem.Co.
Rockford、IL）にかけた。室温で30分後、tat37−72
を、カラムから、同緩衝液の1mlのアリコート（aliqout
s）を用いて、0.1mlの10mM5,5′−ジチオ−ビス（２−
ニトロ安息香酸）（「DTNB」）を含むチューブに溶出し
た。還元tat37−72ポリペプチドを３時間DTNBの存在下
で静置した。次いで、9mlのセファデックスＧ−10カラ
ム（Pharmacia LKB、Piscataway、NJ）上のゲル濾過に
より、tat37−72−TNBから未反応のDTNBを除去した。5m
gのβ−ガラクトシダーゼを、0.5mlの緩衝液に溶解し、
そしてそれを、9mlのセファデックスＧ−25カラム（Pha
rmacia LKB、Piscataway、NJ）上で脱塩し、3.8mgβ−
ガラクトシダーゼ/ml緩衝液を得た。脱塩したβ−ガラ
クトシダーゼ溶液の0.5mlのアリコートを、0.25mlまた
は0.5mlのtat37−72−TNB調製液と混合し、そして室温
で30分間おいて、直接ジスルフィド架橋反応を進行させ
た。9mlのセファクリルＳ−200カラム上のゲル濾過によ
り、未反応のtat37−72−TNBを、β−ガラクトシダーゼ
複合体から除去した。架橋反応の程度を、遊離したTNB
に起因する412nmでの吸光度を測定することにより間接
的にモニターした。このようにして生成された直接ジス
ルフィド複合体を、細胞に取り込ませた（データは示さ
ず）。
SPDPを用いた切断可能な複合 ヘテロ２官能性の架橋試薬（「SPDP」）を用いた。こ
の試薬は、切断可能なジスルフィド結合を含み、以下の
間に架橋を形成する：（１）β−ガラクトシダーゼの第
一アミン基、およびtat1−72（代謝的に35Sで標識され
た）のシステインスルフヒドリル；または（２）ローダ
ミンで標識されたβ−ガラクトシダーゼの第一アミン
基、およびtat37−72のアミノ末端システインスルフヒ
ドリル。
tat1−72複合体化のために、5mgのβ−ガラクトシダ
ーゼを、0.5mlの、50mMリン酸ナトリウム（pH7.5）、15
0mM NaCl、2mM MgCl2中に溶解し、そして9mlのセファデ
ックスＧ−25カラム（Pharmacia LKB、Piscataway、N
J）上でβ−ガラクトシダーゼを脱塩した。脱塩したβ
−ガラクトシダーゼを、室温で２時間、88倍モル過剰の
ヨードアセトアミドで処理し、フリーのスルフヒドリル
基をブロックした。未反応のヨードアセトアミドをゲル
濾過により除去した後、ブロックされたβ−ガラクトシ
ダーゼを、10倍モル過剰のSPDPを用いて室温で処理し
た。２時間後、限外濾過（Ultrafree30、Millipore、Be
dford、MA）により緩衝液を交換した。次いで、４倍モ
ル過剰の標識されたtat1−72を添加し、そして架橋反応
を、一晩、室温で進行させた。未反応のtat1−72を、9m
lのセファクリルＳ−200カラム上のゲル濾過により除去
した。標識されたtat1−72の既知の比活性を用いると、
β−ガラクトシダーゼテトラマーあたり、1.1のtat1−7
2ポリペプチドが架橋されていると計算された。ONPGア
ッセイを用いて、複合β−ガラクトシダーゼはその酵素
活性の100％を保持することが分かった。細胞に取り込
まれた放射活性およびＸ−gal染色の測定を用いて、複
合体が、培養HeLa細胞に取り込まれたことを実証した。
tat37−72複合体化のために、ヨードアセトアミド処
理（100:1ヨードアセトアミドモル過剰）の前に、室温
で１時間、ローダミンマレイミドの5:1のモル比でβ−
ガラクトシダーゼを標識したことを除いて、上記段落中
で記載の手順を用いた。架橋反応では、20:1のSPDP比、
および10:1のtat37−72比を用いた。この複合生成物
は、約５つのローダミン分子を有し（UV吸光度によ
る）、そしてβ−ガラクトシダーゼテトラマーあたり約
２個のtat37−72部分を有する（ゲル濾過による）と推
定された。この手順からの複合体、初期β−ガラクトシ
ダーゼ酵素活性の約35％を保持した。Ｘ−gal染色およ
びローダミン蛍光を用いて、SPDP複合体が培養されたHe
La細胞に取り込まれることを実証した。
実施例３ β−ガラクトシダーゼ複合体を用いて動物試験 複合体の半減期測定および生体分布分析のために、20
0μｇの、SMCC−β−ガラクトシダーゼ（コントロー
ル）またはtat1−72−β−ガラクトシダーゼのいずれか
を静脈（「IV」）注射により、Balb/cマウス（Jackson
Laboratories）の尾静脈に、クロロキンと共にまたはな
しで、注射した。30分までの間隔で血液試料を集めた。
30分後、動物を殺し、そして組織化学的分析のために器
官および組織を取り出した。
ONPGアッセイにより血液試料中のβ−ガラクトシダー
ゼを測定した。ONPGアッセイ手順は、Sambrookら（前
出）の16.66−16.67頁に詳細に記載されている。β−ガ
ラクトシダーゼおよびtat1−72−β−ガラクトシダーゼ
は、速やかに血流から浄化された。それらの半減期は、
３−６分と推定した。これらの実験的比較は、tat1−72
輸送ポリペプチドの複合体化は、血液からのβ−ガラク
トシダーゼのクリアランス速度にほとんどまたは全く影
響しないことを示した。
輸送ポリペプチド−β−ガラクトシダーゼ複合体の細
胞取り込みを検出するために、殺した動物（前出）か
ら、薄い凍結組織切片を調製し、実施例２（前出）に記
載されたように固定化を行い、そしてそれらを標準Ｘ−
gal染色法に供した。肝臓、脾臓および心臓が強く染色
された。肺および骨格筋はより弱く染色された。脳、膵
臓、および腎臓は、検出可能な染色を示さなかった。高
出力の顕微鏡検査により、組織への血液供給を取り囲む
内皮細胞であると思われる細胞、そして幾つかの場合に
は、核の強い染色が示された。
実施例４ β−ガラクトシダーゼ−ポリアルギニン複合体およびβ
−ガラクトシダーゼ−ポリリシン複合体を用いる細胞取
り込み試験 本発明のtat由来輸送ポリペプチドの有効性と塩基性
アミノ酸単純ポリマーの有効性とを比較するために、市
販で入手可能なポリアルギニン（Sigma Chem Co.、St.L
ouis、M0、カタログ番号Ｐ−4663）およびポリリシン
（Sigmaカタログ番号Ｐ−2658）を、上記の実施例２に
記載したように、β−ガラクトシダーゼに複合体化し
た。この複合体を、クロロキンと共におよびなしで、He
La細胞の培地に、１−30μｇ−mlで添加した。複合体と
のインキュベーションに続いて、上記の実施例２に記載
したように、細胞を固定化し、染色し、そして顕微鏡検
査した。
ポリリシン−β−ガラクトシダーゼ複合体では、低レ
ベルの表面染色が得られたが、核染色は得られなかっ
た。ポリアルギニン−β−ガラクトシダーゼ複合体で
は、強い全体の染色が得られたが、tat1−72−β−ガラ
クトシダーゼ複合体およびtat37−72−β−ガラクトシ
ダーゼ複合体より結い核染色を示した。ポリアルギニン
−β−ガラクトシダーゼ複合体の細胞表面結合と、実際
のインターナリゼーションの区別するために、固定化お
よび染色手順の前に、細胞をトリプシン（一種のプロテ
アーゼ）で処理した。トリプシン処理は、ポリアルギニ
ン−β−ガラクトシダーゼ処理細胞のＸ−gal染色の大
部分を除去し、よってポリアルギニン−β−ガラクトシ
ダーゼ複合体は、実際にインターナリゼーションしてい
るよりはむしろ、細胞の外側表面に結合していたことが
示された。対照的に、tat1−72または37−72−β−ガラ
クトシダーゼ複合体に曝された細胞、トリプシン処理に
かかわらず染色され、よってβ−ガラクトシダーゼのカ
ーゴは、細胞の内側にあり、そしてトリプシン消化から
保護されたことが示された。複合体化していないβ−ガ
ラクトシダーゼで処理されたコントロール細胞は、検出
可能な染色を示さなかった。
実施例５ 西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体 化学的架橋 tat1−72−HRP複合体およびtat37−72−HRP複合体を
生成するために、市販の入手可能なHRPのカップリング
キット（Immunopureマレイミド活性化HRP、Pierce Che
m.Co.、カタログ番号31498G）を用いた。キット中で提
供されるHRPは、フリーの−SH基に選択的に反応性の形
態にある。（システインは、20のタンパク質アミノ酸の
なかで、フリーの−SH基を有する唯一のアミノ酸であ
る。）tat1−72を含む輸送ポリペプチド−HRP複合体実
験では、上記の実施例１に記載したように、tat1−72出
発物質を、E.coli中で産生し、そしてそれをHPLCにより
精製した。精製tat1−72（TFA/アセトニトリル中に溶解
した）の200μｇを凍結乾燥し、そして100μｌの100mM
HEPES緩衝液（pH7.5）、0.5mM EDTA中に再溶解した。50
μｌのtat1−72溶液またはtat37−72溶液を、250mMトリ
エタノールアミン（pH8.2）中の50μｌのImmunopure HR
P（750μｇの酵素）に添加した。反応を室温で70分間進
行させた。これらの条件下で、約70％のHRPが化学的にt
at1−72分子に結合した。結合反応の程度は、SDS−PAGE
分析によりモニターした。
HRP複合体の細胞取り込み 複合体を、100μＭのクロロキンの存在下または非存
在下で、HeLa細胞の培地に20μg/mlで添加した。細胞
を、37℃/5.5％CO2で、４−18時間インキュベートし
た。HRP染色を、４−クロロ−１−ナフトール（Bio−Ra
d、Richmond、CA、カタログ番号170−6431）および過酸
化水素HRP基質を用いて展開した。引き続く実験で、４
−クロロ−１−ナフトールをジアミノベンジジン（Sigm
a Chem.Co.、St.Louis、MO）に置き換えた。
輸送ポリペプチド−HRP複合体を添加した細胞は、細
胞結合HRP活性を呈示した。短時間複合体に曝すことに
より、小さな斑点状の染色パターンを得、これは多分、
エンドサイトーシス小胞（endocytic vesicle）中のHRP
を反映している。より長くインキュベーションを行った
後、核および細胞質染色の拡散を観察した。複合体化し
ていないHRPで処理されたコントロール細胞は、検出可
能な染色を示さなかった。
実施例６ PE ADPリボシル化ドメイン複合体 E.coli中で、シュードモナス内毒素（「PE」）を、そ
の全長形態、およびそのADPリボシル化ドメインの形態
の両方で、クローニングし、そして発現させた。輸送ポ
リペプチド−PE複合体を、遺伝的融合および化学的架橋
の両方で生成した。
プラスミド構築 プラスミドpTat70（Apa I）を構築するため、BamH1お
よびEcoR1でpTat72を消化し、そして以下の合成オリゴ
ヌクレオチドからなる二本鎖のリンカーを挿入すること
により、tatオープンリーディングフレーム中に唯一のA
pa I部位を挿入した： リンカーは、tatのＣ末端であるLysGlnStopをGlyProSto
pと置換した。リンカーはまた、PE配列中の天然に存在
するApa I部位により、tat配列のPE ADPリボシル化ドメ
インコード配列とのフレームがあった、融合に適した唯
一のApa I部位を付加する。プラスミドpTat70PE（配列
番号:10）を構築するために、プラスミドCD4（181）−P
E（392）から、PE ADPリボシル化ドメインをコードする
Apa I−EcoR Iフラグメントを取り出した。プラスミドC
D4（181）−PE（392）の構築は、G.Winklerら（「CD4−
シュードモナス外毒素ハイブリッドタンパク質：構造設
計および細胞インターナリゼーションの特徴付けによる
効力および治療側面の調節」、AIDS Research and Huma
n Retroviruses、７、393−401頁（1991））に記載され
ている。Apa I−EcoR Iフラグメントを、Apa IおよびEc
oR Iで消化したpTat70（Apa I）中に挿入した。
プラスミドpTat8PE（配列番号:11）を構築するため
に、pTat70PEから214塩基対のNde I−Apa Iフラグメン
トを取り出し、そしてそれを、Nde IおよびApa I付着末
端を有しtat残基１−４および67−70をコードしそして
以下の合成オリゴヌクレオチドからなる、二本鎖のリン
カーと置換した： TAT8−PEの調製 pTat8−PE構築物の発現は、tatタンパク質のアミノ酸
１−４および67−70に融合したPE ADPリボシル化ドメイ
ンポリペプチドを生じた。pTat8−PE発現産物（「tat8
−PE」）を、以下に記載の化学的架橋実験において、PE
ADPリボシル化ドメイン部分（および複合体化していな
いコントロール）として取り扱った。８つのtatアミノ
酸に対するコドンは、便宜上選択されたクローニング手
順からの人工構築物である。このPE ADPリボシル化ドメ
インに融合した、８つのtatアミノ酸は、輸送活性を有
さなかった（図２）。
tat8−PEの精製のために、50mMトリス−HCl（pH8.
0）、2mM EDTAの20ml中に、4.5gのpTat8−PE−形質転換
E.coliを懸濁した。フレンチプレスで細胞を溶解し、そ
してSA600ローター中で、10,000rpmで１時間の遠心分離
により不溶性残基を除去した。大部分のtat8−PEは上清
液中にあった。この上清液を、3mlのＱ−セファロース
ファーストフロー（Pharmacia LKB、Piscataway、NJ）
イオン交換カラムにのせた。試料をのせた後、カラムを
50mMトリス−HCl（pH8.0）、2mM EDTAで洗浄した。カラ
ムの洗浄後、100mM、200mM、および400mMのNaClを含む
同一の緩衝液を用いて、ステップグラディエント溶出を
行った。tat8−PEは、200mM NaClで溶出した。イオン交
換クロマトグラフィーに続いて、さらに、スーパーデッ
クス（superdex）75FPLCカラム（Pharmacia LKB、Pisca
taway、NJ）上でのゲル濾過によりtat8−PEをさらに精
製した。ゲル濾過カラムを、50mM HEPES（pH7.5）を用
いて平衡化した。次いで、試料を加え、平衡緩衝液を用
いて0.34ml/分で溶出を行った。1.5分の画分を集め、そ
して−70℃でtat8−PE画分を貯蔵した。
TAT8−PEの架橋 PE ADPリボシル化ドメインは、システイン残基を有さ
ないので、輸送ポリペプチド−tat8−PE複合体化にスル
ホ−SMCC（Pierce Chem.Co.、Rockford、ILカタログ番
号22322G）を用いた。複合体化、２工程反応手順で行っ
た。第１番目の反応工程では、tat8−PE（3mg/ml）を、
10mMスルホ−SMCCを有する50mM HEPES（pH7.5）中、室
温で40分間処理した。（スルホ−SMCCを、1M HEPES、pH
7.5中の100mMストック溶液として反応液に添加した。）
tat8−PE−スルホ−SMCCを、未反応のスルホ−SMCCか
ら、25mM HEPES（pH6.0）、25mM NaClで平衡化したP6DG
カラム（Bio−Rad、Richmond、CA）上のゲル濾過により
分離した。第２番目の反応工程で、tat8−PE−スルホ−
SMCC（1.5mg/ml 100mM HERES（pH7.5）、1mM EDTA）
を、精製tat37−72（600μＭ最終濃度）と、室温で１時
間反応させた。架橋反応を停止するために、システイン
を添加した。架橋反応生成物を、SDS−PAGEにより分析
した。約90％のtat8−PEが、これらの条件下で、tat37
−72輸送ポリペプチドに架橋した。複合生成物の約半分
が、１つの輸送ポリペプチド部分を有し、そして約半分
が、２つの輸送ポリペプチ部分を有した。
PE ADPリボシル化の無細胞アッセイ PEリボシル化ドメインは、輸送ポリペプチドへの複合
体化後、その生物学的活性（すなわち、破壊的なリボソ
ーム改変）を保持したことを確かめるために、輸送ポリ
ペプチド−PE ADPリボシル化複合体のインビトロ（すな
わち、無細胞）翻訳に対する効果を試験した。各インビ
トロ翻訳実験のために、新鮮な翻訳調合液（cocktail）
を調合し、そしてそれを氷上で保存した。インビトロ翻
訳調合液は、200μｌウサギ網状赤血球溶解液（Promeg
a、Madison、WI）、２μl 10mM ZnCl2（必要に応じ
て）、メチオニンを除く20のタンパク質アミノ酸混合物
の４μｌ、および20μl 35S−メチオニンを含んでい
た。９μｌの翻訳調合液に、１〜100ngの輸送ポリペプ
チド−PE複合体（好適には１μｌの容量で）またはコン
トロールを添加し、そしてこの混合液を、30℃で60分間
プレインキュベートした。次いで、0.5μｌのBMV RNAを
各試料に添加し、そして、30℃でさらに60分間インキュ
ベートした。試料あたり50％グリセロールの５μｌを添
加した後、試料を−70℃で貯蔵した。SDS−PAGE法によ
り、インビトロ翻訳反応生成物を分析した。SDSゲル上
の各レーンあたり、２μｌの各翻訳反応混合物（適切な
容量のSDS−PAGE試料緩衝液を添加して）をのせた。電
気泳動後、フルオログラフィーにより、35Sを含むイン
ビトロ翻訳生成物を可視化した。
上記段落中に記載した手法を用いて、tat1−70輸送ポ
リペプチドに遺伝子的に融合されたPE ADPリボシル化ド
メインは、生物学的活性を有さない、すなわち、インビ
トロ翻訳を阻害しないことが分かった。これに対し、同
一の手順を用いて、tat37−72輸送ポリペプチドに化学
的に架橋されたPE ADPリボシル化ドメインは、完全な生
物学的活性を保持した、すなわち、複合体化していない
PE ADPリボシル化ドメインコントロール同様に、インビ
トロ翻訳活性を阻害したことが分かった（図２）。
PE ADPリボシル化の細胞毒性アッセイ tat37−72−PE ADPリボシル化ドメイン複合体に関わ
るさらなる試験において、複合体の、100μＭクロロキ
ンの存在下または非存在下で、培養HeLa細胞に添加し
た。次いで、細胞抽出物中のトリクロロ酢酸（「TC
A」）沈澱生の放射活性により示されるように、インビ
ボタンパク質合成を測定することにより細胞毒性をアッ
セイした。
この細胞毒性アッセイは以下のように行った。HeLa細
胞層を破壊し、細胞を遠心分離し、そしてそれらを培養
液に2.5x104/mlの密度で再懸濁した。24ウェルプレート
を用いるときウェルあたり0.5mlの懸濁液を、または48
ウェルプレートを用いるときウェルあたり0.25mlの懸濁
液を用いた。細胞を沈降させるために少なくとも４時間
放置した後、100μｌのPBS中に溶解した、複合体または
複合体化していないコントロールをウェルに添加した。
これら細胞を、複合体またはコントロールの存在下で、
37℃、60分インキュベートし、次いで、各細胞に0.5ml
の新鮮培地を添加し、そしてさらに５−24時間細胞をイ
ンキュベートした。このインキュベーションに続いて、
各ウェルから培地を除去し、そして約0.5mlのPBSで１回
細胞を洗浄した。次いで、１μCiの35S−メチオニン（A
mersham、インビボ細胞標識グレードSJ.1015）、ウェル
あたり100μｌあたり添加し、これら細胞を２時間イン
キュベートした。２時間後、放射活性培地を除去し、そ
して細胞を３回冷５％TCAを用いて、そして次いで１回P
BSを用いて洗浄した。100μｌの0.5M NaOHを各ウェルに
添加し、そして少なくとも45分間、細胞溶解そしてタン
パク質溶解が起こるように放置した。次いで、50μｌの
1M HClを各ウェルに添加し、そして各ウェルの全内容物
を、放射活性の液体シンチレーション測定のためにシン
チレーション液に移した。
クロロキンの非存在下では、輸送ポリイイペプチド−
PE ADPリボシル化ドメイン複合体を用いた処理に応じて
（複合体化していないPE ADPリボシル化ドメインを用い
た処理に応じてではなく）細胞タンパク質合成の、明瞭
な投与量依存性の阻害があった。これらの結果は図２に
要約される。tat37−72に複合体化されたとき、PE ADP
リボシル化ドメインは、tat1−72に複合体化したときよ
り３〜10倍効果的に輸送されるようであった。さらに、
輸送ポリペプチドtat38−58GGC、tat37−58、tat47−58
GGC、およびtatCGG−47−58もまた、PE ADPリボシル化
ドメインに複合体化した。これら複合体のすべては、生
物学的に活性なPE ADPリボシル化ドメインの細胞取り込
みの結果をもたらした（データ示さず）。
実施例７ リボヌクレアーゼ複合体 化学的架橋 7.2mgのウシ膵臓リボヌクレアーゼＡ、Type12A（Sigm
a Chem.Co.、St.Lousi、MO、カタログ番号R5500）を、2
00μl PBS（pH7.5）中に溶解した。このリボヌクレアー
ゼ溶液に、1.4mgのスルホ−SMCC（Pierce Chem.Co.、Ro
ckford、IL、カタログ番号22322H）を添加した。ボルテ
ックスで撹拌した後、反応を室温で１時間進行させた。
未反応のSMCCを、リボヌクレアーゼ−SMCCから、反応混
合液を9mlのP6DGカラム（Bio−Rad、Richmond、CA）を
通過させ、そして0.5ml画分を集めることにより除去し
た。ボイドボリュームのピーク画分（リボヌクレアーゼ
−SMCC複合体を含む）を、280nmでのUV吸光度をモニタ
ーすることにより同定した。プールしたりリボヌクレア
ーゼ−SMCC含有画分を５つの等量のアリコートに分け
た。４つのリボヌクレアーゼ−SMCCアリコートの各々
に、以下のtat残基に相当する化学合成輸送ポリペプチ
ドを添加した:37−72（「37−72」）;38−58、プラス、
カルボキシ末端のGGC（「38−58GGC」）;37−58（「CGG
37−58」）；または47−58、プラス、アミノ末端（「CG
G47−58」）のCGG。輸送ポリペプチドリボヌクレアーゼ
複合体化反応を、室温で２時間、そして次いで４℃で一
晩進行させた。10−20％グラディエントゲル上のSDS−P
AGEにより反応生成物を分析した。架橋効率は、輸送ポ
リペプチドtat38−58GGC、tat37−58、およびtatCGG47
−58に対しては約60％、そしてtat37−72に対しては40
％であった。改変種の中では、72％が１つの、そして25
％が２つの輸送ポリペプチド置換体を含んでいた。
Tat37−72−リボヌクレアーゼ複合体の細胞取り込み 細胞を、10％のドナー子ウシ血清およびペニシリウム
／ストレプトマイシンを補充したダルベッコの改変イー
グル培地において、組織培養インキュベーター中、37℃
で維持した。細胞の取り込みアッセイのために、24ウェ
ルプレート中に105細胞をプレートし、それらを一晩培
養させた。これらの細胞をダルベッコのPBSで洗浄し、
そして80μＭクロロキンを含む300μｌのPBS中に溶解し
たリボヌクレアーゼ複合体を、０、10、20、40、および
80μg/ml濃度で添加した。37℃で1.25時間のインキュベ
ーションの後、750μｌの成長培地を添加し、そしてさ
らに細胞試料を一晩インキュベートした。一晩のインキ
ュベーションの後、細胞をPBSを用いて１回洗浄し、そ
してそれらを35Sメチオニン（１μCi/ウェル）を含む、
メチオニンなしの最小必須培地（Flow Labs）（250μl/
ウェル）中で１時間インキュベートした。放射活性メチ
オニンを用いた１時間のインキュベーションの後、この
培地を除去し、そして細胞を３回、５％TCA（1ml/ウェ
ル／洗浄）で洗浄した。次いで、ウェルあたり250μｌ
の0.5M NaOHを添加した。室温で１時間後、各ウェルの
内容物の200μｌをシンチレーションバイアルにピペッ
トで移し、100μｌの1M HClおよび4mlのシンチレーショ
ン液を添加した。各バイアルの内容物を完全に混合した
後、液体シンチレーションカウンティングにより、各試
料中の放射活性を測定した。
細胞取り込みの結果を図３に要約する。輸送ポリペプ
チドtat38−58GGCは、tat37−72と同様に、またはわず
かに良好に機能した。輸送ポリペプチドtatCGG47−58は
減少した活性を有した（データを示さず）。このポリペ
プチドが減少した取り込み活性を有したか否か、または
リボヌクレアーゼへの塩基性領域の近接が酵素活性を妨
害したか否かは不明である。
カチオン交換クロマトグラフィー（BioCAD、perfusio
n chromatograhpy system,PerSeptive Biosystems）を
用いて、１つまたは２つの輸送ポリペプチド部分を有す
るリボヌクレアーゼ複合体を精製した。
実施例８ タンパク質キナーゼＡインヒビター複合体 化学的架橋 タンパク質キナーゼＡインヒビター（「PKA I」）ペ
プチド（アミノ酸20個）をBachem California（Torrenc
e,CA）から購入した。PKA Iの輸送ポリペプチドの化学
的架橋のために、スルホ−MBS（10mMで）またはスルホ
−SMPB（15mMで）のいずれかを使用した。これらの架橋
試薬はいずれも、チオール基および一級アミン基に対し
てヘテロ二官能性である。PKA Iにはリシン残基および
システイン残基がないので、スルホ−MBSおよびスルホ
−SMPBはいずれも、選択的にPKA Iのアミノ末端への架
橋を標的にする。PKA Iを2mg/mlの濃度で、50mMのHEPES
（pH7.5）、25mMのNaClと共に、室温で50分間、これら
の架橋試薬のいずれかと反応させた。スルホ−MBS反応
混合物は、スルホ−MBSを10mM、およびDMFを20％含有し
ていた。スルホ−SMPB反応混合物は、スルホ−SMPBを15
mM、およびジメチルスルホキシド（「DMSO」）を20％含
有していた。このPKA I−架橋剤付加物を、C4カラムを
用いる逆相HPLCによって精製した。0.1％のトリフルオ
ロ酢酸を含有するアセトニトリルの20〜75％の勾配を用
いて、C4カラムから試料を溶出させた。凍結乾燥によっ
て付加物からアセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸を
除去し、そしてこの付加物を25mMのHEPES（pH6.0）、25
mMのNaClに再溶解した。tat1−72またはtat37−72を添
加し、そして1MのHEPES（pH7.5）を添加して100mMにす
ることによって、反応混合物のpHを7.5に調整した。そ
の後、架橋反応を室温で60分間進行させた。
輸送ポリペプチド:PKA Iを変えることによって、架橋
の程度を調節した。SDS−PAGEによって架橋反応生成物
を分析した。tat37−72を用いたときは、単一の新たな
電気泳動バンドが架橋反応で生成した。この結果は、１
分子のtat37−72が、１分子のPKA Iに付加することと一
致した。tat1−72を用いたときは、６個の新たな生成物
が架橋反応で生成した。この結果は、tat1−72に複数の
システイン残基が存在する結果として、tat1−72ポリペ
プチド１個あたりに複数のPKA I分子が付加することと
一致する。PKA Iをモルで大過剰に架橋反応に添加した
とき、tat1−72の１個につき５個または６個のPKA I部
分を有する複合体だけを得た。
PKA I活性についてのインビトロリ酸化アッセイ PKA Iの生物学的活性の保持について、スルホ−MBSに
よって架橋した複合体を試験するために、インビトロの
リン酸アッセイを用いた。このアッセイでは、ヒストン
Ｖを、PKA I（またはPKA I複合体）の存在または非存在
下の、タンパク質キナーゼＡによるリン酸化の基質とし
て供した。次いで、SDS−PAGEを用いて、リン酸化の程
度におけるPKA Iに依存する差異をモニターした。それ
ぞれの反応において、PKA IまたはPKA I複合体の量を変
えて、タンパク質キナーゼＡ（Sigma）の触媒サブユニ
ット５単位と、37℃で30分間インキュベートした。アッ
セイ反応混合物は、24mMの酢酸ナトリウム（pH6.0）、2
5mMのMgCl2、100mMのDTT、50μCiの［γ−32P］ATP、お
よび２μｇのヒストンＶを全反応容積４μｌ中に含有し
ていた。このアッセイを用いて、tat1−72またはtat37
−72に複合体化体化したPKA Iは、非結合PKA Iと同様
に、リン酸化を阻害することを見出した（データは示さ
ない）。
細胞アッセイ PKA Iおよび輸送ポリペプチド−PKA I複合体の細胞取
り込みを試験するために、cAMP応答性発現制御配列の制
御下にあるクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（「CAT」）リポーター遺伝子を含有する培養細
胞を用いた。このようにCAT活性を測定することによっ
てタンパク質キナーゼＡの活性を間接的に定量した。こ
のアッセイは、J.R.Groveらによって詳細に説明されて
いる（「組換えタンパク質キナーゼインヒビターを用い
た、予備結合（Probind）cAMP関連遺伝子発現」、Molec
ular Aspects of Cellular Regulation,Vol.6,P.Cohen
およびJ.G.Folkes編、Elsevier Scientific,Amsterdam,
pp.173−95（1991））。
このアッセイを用いて、PKA Iまたは輸送ポリペプチ
ド−PKA I複合体の全てに活性がないことを見出した。
この結果は、PKA I部分が、細胞中に入る際、急速に分
解を受けているかもしれないということを示唆した。
PKA IとTat37−72−β−ガラクトシダーゼとの架橋 本発明者らは、以前に、tat37−72−β−ガラクトシ
ダーゼの細胞取り込みがクロロキサンに依存性がないこ
とを見出した（上記実施例２）。それ故に、急速分解に
対してPKA Iを保護することができるように、PKA Iをta
t37−72−β−ガラクトシダーゼに架橋した。
β−ガラクトシダーゼを、室温で30分間、20mMの（DT
T還元剤）で処理し、そしてMES緩衝液（pH5）中のG50カ
ラムでのゲル濾過によってDTTを除去した。還元したβ
−ガラクトシダーゼをSMPB活性化したPKA I（上記）とp
H6.5で60分間反応させた。残存するフリーのスルフヒド
リル基をブロックするために、Ｎ−エチルマレイミドま
たはヨードアセトアミドを添加した。SDS−PAGE分析
は、β−ガラクトシダーゼの少なくとも95％が結合した
ことを示した。結合したβ−ガラクトシダーゼ生成物の
約90％が、サブユニットあたり１個のPKA Iを含有し、
そして約10％が２個のPKA Iを含有していた。PKA I−β
−ガラクトシダーゼ複合体を10倍モル過剰のスルホ−SM
CCで処理した。次に、このPKA I−β−ガラクトシダー
ゼ−SMCCをtat1−72と反応させた。SDS−PAGE分析によ
って、PKA I−β−ガラクトシダーゼ:tat1−72の比は、
1:0.5であるように思われた。最終生成物約100μｇを生
成した。沈殿の問題のために、溶液中の最終生成物の濃
度は、100μg/mlに制限された。
実施例９ E2リプレッサー複合体 輸送ポリペプチド−E2リプレッサー複合体の細胞取り
込みおよびE2リプレッサー活性を試験するために、E2依
存性のリポータープラスミドおよびE2発現プラスミド
を、SV40で形質変換されたアフリカミドリザル（Africa
n green monkey）腎臓（「COS7」）細胞に、同時にトラ
ンスフェクトした。次に、トランスフェクトした細胞
を、輸送ポリペプチド−E2リプレッサー複合体（遺伝子
融合または化学的架橋によって作製した）、または適切
なコントロールに曝した。以下に記載の抑制アッセイ
は、本質的にBarsoumらによって説明されている（前
出）。
抑制アッセイ細胞 COS7細胞をアメリカタイプカルチャーコレクション、
Rockville,MD（ATCC番号CRL1651）から得た。このCOS7
細胞を、10％の胎仔ウシ血清（JRH Biosciences,Lenex
a,KS）および4mMグルタミン（「成長培地」）を含むダ
ルベッコの可変イーグル培地（「GIBCO,Grand Island,N
Y）で増殖させた。細胞のインキュベーション条件は、3
7℃でCO25.5％であった。
抑制アッセイプラスミド E2依存性リポータープラスミド、すなわちpXB332hGH
は、切形SV40初期プロモーター（３個の上流E2結合部位
を有する）によって作動する、ヒト成長ホルモンリポー
ター遺伝子を含有していた。このhGHリポータープラス
ミド、すなわちpXB332hGHをBarsoumらの記載（前出）に
記載のように構築した。
完全長のHPV E2遺伝子の発現のために、プラスミドpA
HE2（図４）を構築した。プラスミドpAHE2は、上流のSV
40エンハンサーによって増強されたアデノウィルス主要
後期プロモーターに作動可能に連結されたHPV株16から
のE2遺伝子を有する。プラスミドpHPV16（pBR322中にク
ローン化された完全長のHPV16ゲノム）からHPV E2遺伝
子を単離した。この遺伝子は、M.Durstら、「子宮頸癌
から得た乳頭腫ウィルスDNAおよび種々の地理的領域か
ら得た癌生体検査試料におけるその羅患率」、Proc.Nat
1.Acad.Sci.USA、80、pp.3812〜15（1983）に、Tth111I
−Ase Iフラグメントとして記載されている。HPV16ゲノ
ムにおいて、Tth111Iはヌクレオチド2711で切断し、そ
してAse Iはヌクレオチド3929で切断する。DNAポルメラ
ーゼＩクレノウ反応で、Tth111I−Ase Iフラグメントの
末端を平滑化し、そしてBamH Iリンカー（New England
Biolabs、カタログ番号1021）を連結した。このリンカ
ーを有するフラグメントをBamH I切断プラスミドpBG331
に挿入して、プラスミドpAHE2を作製した。
プラスミドpBG331は、SV40ポリアデニル化シグナルの
下流のBamH I部位がないこと以外は、pBG312（R.L.Cate
ら、「ミューラー（Mullerian）阻害物質のための、ウ
シおよびヒト遺伝子の単離、ならびに動物細胞でのヒト
遺伝子の発現」、Cell,45,685〜98頁（1986））と同じ
で、プロモーターとSV40イントロンとの間のBamH I部位
が唯一になる。pBG312をBamH Iで部分的に消化し、線状
化したプラスミドをゲル精製し、DNAポリメラーゼＩク
レノウ処理によって平滑末端を形成し、自己連結させ、
そして所望の、BamH I部位が欠失したプラスミドをスク
リーニングすることによって、所望でないBamH I部位を
除去した。
E2リプレッサータンパク質の細菌による産生 E2リプレッサータンパク質の一つ、E2.123は、アミノ
末端に付加したMetValを有するHPV16 E2のカルボキシ末
端の121個のアミノ酸からなっていた。また、E2.123CCS
Sと呼ばれる、E2.123の異変体を用いた。E2.123は、HPV
16 2Eのアミノ酸位置251、281、300、および309にシス
テイン残基を有する。E2.123CCSSでは、位置300および3
09でシステイン残基をセリンに変え、そして位置299で
リシン残基をアルギニンに変えた。位置300および309の
システイン残基を置換し、その結果、システイン依存性
の化学的架橋がE2リプレッサーのアミノ末端部分では起
こるが、E2の最小のDNA結合／二量体化ドメインでは起
こらない。最小のDNA結合ドメインでの架橋は、リプレ
ッサーの生物学的活性を妨害する可能性があると考え
た。
プラスミドpET8c−123（図5;配列番号:14）の構築の
ために、プラスミドpHPV16をテンプレートとして用い
て、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）手法に
よって必要なDNAフラグメントを生成した。（PCR手法の
一般的な議論については、Sambrookら、上述の14章を参
照。自動化されたPCR装置および化学物質が市販されて
いる。）EA52（374個の塩基対のE2−123フラグメント
５′末端のためのPCRオルゴヌクレオチドプライマー）
のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号:15に記載し
ている。EA54（E2−123フラグメントの３′末端のため
に用いられるPCRオリゴヌクレオチドプライマー）のヌ
クレオチド配列は、表列表の配列番号:16に記載してい
る。このPCR産物をNco IおよびBamH Iを用いて消化し、
そして得られたフラグメントを、Nco I/BamH Iで消化し
た発現プラスミドpET8c（Studierら、前出）にクローン
化して、プラスミドpET8c−123を作製した。
異なる５′オリゴヌクレオチドPCRプライマーを用い
た、同様の手順を用いることによって、HPV16 E2のカル
ボキシ末端の83個のアミノ酸に対するコドンに直ちにつ
ながる、メチオニンコドンおよびアラニンコドンを含
む、260個の塩基対のフラグメント（「E2−85」）を得
た。EA57（すなわちE2−85を生成するためのPCR5′プラ
イマー）のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号:34
に記載している。
E2.123CCSSの細菌による産生のための、プラスミドpE
T8c−123CCSS（図6;配列番号:17）を構築するために、P
CR手法によって、882 bp Pst I−Eag I DNAフラグメン
トを合成した。PCRテンプレートは、pET8c−123であっ
た。PCRプライマーの一つ（374.140と呼ぶ）は以下のよ
うに３個のアミノ酸の変化の全てをコードした： もう一つのPCRプライマー374.18は、以下の配列を有し
ていた： このPCR反応生成物をPst IプラスEag Iを用いて消化
し、そして882bpフラグメントを標準手法で単離した。
最終工程は、３切片（３−piece）結合でのpET8c−123C
CSSの生成であり、図６に示されるように、pET8c−123
から得られた3424pb EcoR I−Eag Iフラグメントと、88
2bp PCRフラグメントおよび674−bp Pst I−EcoR I pET
8c−123フラグメントとを結合した。DNA配列分析によっ
て構築を確認した。E2.123およびE2.123CCSSタンパク質
の産生のために、Studierによる記載（前出）に記載さ
れたように、E.coliのBL21（DE3）pLysS株で、プラスミ
ドpET8c−123およびpET8c−123CCSSを発現させた。
2Eリプレッサータンパク質の精製 3.6gの凍結したpET8c−123−形質点かE.coli細胞を解
凍し、そしてこれらの細胞を、25mMのトリスHCl（pH7.
5）、0.5mMのEDTA、2.5mMのDTT、およびプロテアーゼイ
ンヒビター（1mMのPMSF、3mMのベンズアミジン、50μg/
mlのペプスタチンＡ、10μg/mlのアプロチニン）を含む
35mlに懸濁した。10,000psiでフレンチプレスを２回通
過させることによって、これらの細胞を溶解した。SA60
0ロータを用いて、12,000rpmで１時間、溶解物を遠心分
離した。E2.123タンパク質は、上清液の中に存在した。
この上清液に、MES緩衝液（pH6）を25mMまで、MES緩衝
液（pH5）を10mMまで、そしてNaClを125mMまで添加し
た。次に、この上清液を、2mlのＳセファロースファー
ストフローカラムに6ml/時間で付与した。カラムに付与
した後、カラムを50mMのトリス−HCl（pH7.5）と1mMのD
TTとを用いて洗浄した。その後、50mMのトリス−HCl（p
H7.5）、1mMのDTT中の200mM、300mM、400mM、500mM、70
0mM、および1000mMのNaClを用いた、ステップグラディ
エント溶出（2ml/ステップ）を行った。E2.123リプレッ
サータンパク質は、500mMおよび700mMのNaCl画分中に溶
出された。SDS−PAGE分析によって、E2.123リプレッサ
ーの純度は95％を超えていることが示された。
3.0gの凍結したpE8Tc−123CCSS−形質転換E.coli細胞
を解凍し、そしてこれらの細胞をpET8c−123−形質転換
細胞に対して用いたのと同じ緩衝液（上記）30mlに懸濁
した。細胞溶解、不溶性の細胞残渣の除去、ならびにME
S緩衝液およびNaClの添加もまた、E2−123の精製につい
て記載されたように行った。E2.123CCSSのための精製手
順は、MES緩衝液およびNaClの添加の後は異なった。な
ぜなら、手順のこの時点で、沈殿がE2.123CCSSと共に生
成したからである。この沈殿を遠心分離によって除去
し、そして沈殿と上清液はいずれも実質的なE2リプレッ
サー活性を有することを見出した。それ故に、これらの
両方とも精製工程にかけた。上清液を2mlのＳセファロ
ースファーストフローカラム（Pharmacia LKB,Piscataw
ay,NJ）に6ml/時間で付与した。カラムに付与した後、
このカラムを50mMのトリス−HCl（pH7.5）、1mMのDTTを
用いて洗浄した。カラムの洗浄後、50mMのトリス−HCl
（pH7.5）、1mMのDTT中の300mM、400mM、500mM、700m
M、および1000mMのNaClを用いて、ステップグラディエ
ント溶出（2ml/ステップ）を行った。E2.123CCSSタンパ
ク質は、700mMのNaClで溶出した。SDS−HAGE分析によっ
て、この純度は95％を超えていることが示された。E2.1
23CCSSの沈殿を、25mMのトリス−HCl（pH7.5）、125mM
のNaCl、1mMのDTT、および0.5mMのEDTAを含む7.5mlに溶
解した。溶解した物質を2mlのＳセファロースファース
トフローカラムにのせ、そしてE2.123および沈殿しなか
ったE2.123CCSSについて記載したようにカラムを洗浄し
た。300mM、500mM、700mM、および1000mMのNaClを用い
て、ステップグラディエント溶出（2ml/ステップ）を行
った。E2リプレッサーは、500〜700mMのNaCl画分で溶出
した。SDS−PAGE分析によって、その純度は98％を超え
ていることが示された。E2.123およびE2.123CCSSタンパ
ク質の精製後直ちに、グリセロールを最終濃度15％（v/
v）まで添加し、そして瞬間凍結（液体窒素）アリコー
トを−70℃で保存した。1mg/mlでの吸光係数1.8を用い
て、280nmにおけるUV吸収によって、精製E2リプレッサ
ーを定量した。
化学的架橋 実施例１の記載の通りに、tatアミノ酸37−72からな
る輸送ポリペプチドの化学合成を行った。ポリペプチド
（5mg/ml）を、10mMのMES緩衝液（pH5.0）、50mMのNaC
l、0.5mMのEDTA（吸光係数は1ml/mlで0.2）に溶解し
た。この輸送ポリエプチド溶液に、ビスマレイミドヘキ
サン（「BMH」）（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL、
カタログ番号22319G）ストック溶液（6.25mg/ml DMF）
を最終濃度1.25mg/mlになるように、そしてpH7.5のHEPE
S緩衝液ストック溶液（1M）を最終濃度100mMになるよう
に加えた。室温で30分間、このBMHをタンパク質と反応
させた。次に、10mMのMES（pH5）、50mMのNaCl、0.5mM
のEDTAで平衡化したＧ−10カラム上でゲル濾過すること
によって、タンパク質−BMHを未反応のBMHから分離し
た。輸送ポリペプチド−BMH複合体のアリコートを−70
℃で保存した。
輸送ポリペプチド−BMH複合体のE2リプレッサーへの
架橋のために、E2リプレッサータンパク質をその保存緩
衝液から取り出した。このE2リプレッサータンパク質
を、25mMのMES（pH6.0）、0.5mMのEDTAの３容量で希釈
し、そして樹脂1mlあたりタンパク質5mgで、Ｓセファロ
ースファーストフロー（Pharmacia LKB,Piscataway,N
J）にバッチ式でロードした。タンパク質をロードした
樹脂のスラリーをカラムに注いだ後、このカラムを25mM
のMES（pH6.0）、0.5mMのEDTA、250mMのNaClで洗浄し
た。次に、800mMのNaClを含有する同じ緩衝液を用い
て、結合したE2リプレッサータンパク質をカラムから溶
出した。E2リプレッサーを含有する溶出液を、25mMのME
S（pH6.0）、0.5mMのEDTAを用いて、1mg/mlまで希釈し
た。E2リプレッサータンパク質およびBMH活性化輸送ポ
リペプチドを有するバッチのそれぞれを用いて行った、
試験的な架橋の研究から、1mgのE2リプレッサータンパ
ク質を0.6mgのBHH活性化輸送ポリペプチドで処理するこ
とで、E2リプレッサーホモダイマー１個あたり輸送分子
１個の所望の組み込みを生ずることを確認した。代表的
には、2mlのE2リプレッサー（1mg/ml）を、300μｌのta
t37−72−BMH（4mg/ml）および200μｌの1MのHEPES（pH
7.5）と混合した。この架橋反応を、室温で30分間進行
させた。２−メルカプトエタノールを最終濃度14mMまで
添加することによって、架橋反応を停止させた。SDS−P
AGE分析によって、架橋の程度を測定した。tat37−72−
E2リプレッサー複合体のアリコートを−70℃で保存し
た。同一の手順を用いて、tat37−72輸送ポリペプチド
をHPVE2 123リプレッサータンパク質およびHPVE2CCSSプ
レッサータンパク質に架橋した。
E2リプレッサー複合体の細胞取り込み E2抑制アッセイには、COS7細胞にトランスフェクトし
たプラスミドの一過性発現を用いた。E2抑制アッセイの
手順は、Barsoumらの記載の手順（前出）と同様であっ
た。２つの別々のトランスフェクション（「EP1」およ
び「EP2」）において、エレクトロポレーション（elect
roporation）によって４×106個のCOS7細胞（採収時で
約50％集密度）をトランスフェクトした。トランスフェ
クションEP1では、20μｇのpXB332hGH（リポータープラ
スミド）プラス380μｇの超音波処理したサケ精子キャ
リアDNA（Phamacia LKB,Piscataway,NJ）を用いた。ト
ランスフェクションEP2では、20μｇのpXB332hGHプラス
30μｇのpAHE2（E2トランスアクティベーター）および3
50μｇのサケ精子キャリアDNAを用いた。Bio−Rad Gene
Pulserを用いて、270ボルト、960μFDで、約11ミリ秒
のパルス時間で、エレクトロポレーションを行った。エ
レクトロポレーションに続いて、６ウェルの皿（６−we
ll dish）に、ウェル１個当たり２×105個の細胞を接種
した。エレクトロポレーション後５時間で、成長培地を
吸引し、細胞を成長培地と共に洗浄し、そして1.5mlの
新鮮な成長培地をそれぞれのウェルに加えた。この時点
で、クロロキン（「CQ」）を最終濃度80μＭまで添加し
た（または、ブランク溶液をコントロールに添加し
た）。次に、tat37−72架橋したE2.123（「TxHE2」）ま
たはtat37−72架橋したE2.123CCSS（「TxHE2CCSS」）を
添加した。これらの輸送ポリペプチド−カーゴ複合体の
最終濃度は、細胞成長培地で６、20または60μg/mlであ
った（表Ｉ）。
18時間インキュベーションした後、培地を除去し、そ
して先行する18時間のインキュベーションの場合と同じ
濃度のクロロキンおよび輸送ポリペプチド−カーゴ複合
体を含有する、新鮮培地を1.5ml添加した。この培地変
換は、リプレッサーが細胞内に入る前に存在し得る任意
のhGHを除去するためであった。培地変換後24時間で、
細胞を採収し、そして生存度を調べるために細胞計数を
行った。次に、成長培地の希釈していない試料上で、Se
ldonの方法（Protocols in Molecular Biology,Green P
ublishing Associates,New York,pp.9.7.1−9.7.2（198
7）に記載）に従って、Allegro Human Growth Hormone
一過性遺伝子発現システムキット（Nichols Institute,
San Juan Capistrano,CA）を用いて、hGHについてアッ
セイした。全ての試料について、アッセイバックグラウ
ンド（すなわち、添加された非調整培地にあるアッセイ
成分）をhGH cpmから引き算した。タンパク質取り込み
試験において、クロロキンが存在する（「（＋）CQ」）
か、または欠如している（「（−）CQ」）かによって、
与えられたタンパク質処理について別々の抑制率計算を
行った。抑制率を以下の式に従って計算した： ここで:BKG＝リポーターのみのトランスフェクション
におけるhGH cpm（例えば、（−）CQに対するEP1.1およ
び（＋）CQに対するEP1.2）； ACT＝リポーターおよびトランスアクティベーターの
トランスフェクションにおけるhGH cpmであり、これに
は、リプレッサー複合体は添加されなかった（例えば、
（−）CQに対するEP2.1および（＋）CQに対するEP2.
8）； REP＝リポーターおよびトランスアクティベーターの
トランスフェクションにおけるhGH cpmであり、これに
は、リプレッサー複合体が添加された（例えば、（−）
CQに対するEP2.2〜2.7および（＋）CQに対するEP2.9〜
2.14）。代表的なE2抑制アッセイのデータを、表IIに示
す。表Ｉによって、表IIに挙げられた種々の試料が同定
される。図７は、表IIに示した結果を図式的に描いてい
る。
E2リプレッサー（E2.123またはE2.123CCSS）のいずれ
に架橋した輸送ポリペプチドtat37−72は、培養した哺
乳動物細胞で、E2依存性の遺伝子発現を、投与量に依存
して阻害した（表II;図７）。この実験を４回繰り返し
て同様の結果を得た。この効果は、他のtat37−72複合
体は、pXB332hGHのE2誘導に効果がない（データは示さ
ず）という点で、E2に特異的である。また、tat37−72x
HE2複合体は、リポーターのhGH発現レベルに効果がな
く、ここでは、hGH遺伝子の発現は、E2には応答しない
構成性プロモーターによって駆動された。CCSS突然変異
を有するE2リプレッサーは、野生型アミノ酸配列を有す
るリプレッサーよりも、より大きな程度で抑制した。こ
れは期待されたとおりであった。なぜなら、輸送ポリペ
プチドの野生型リプレッサーの最後の２個のシステイン
のいずれかへの架橋によって、リプレッサー活性が低下
したり、または奪われてしまう可能性があるからであ
る。クロロキンは、抑制活性のためには不要であった。
しかし、クロロキンは、全ての試験において抑制を増強
した。これらの結果を、表IIおよび図７に要約する。
実施例10 TATΔCYS複合体 TatΔcysの産生 tatアミノ酸38−72に直接に融合したtatアミノ酸１−
21からなる輸送ポリペプチドの細菌による産生のため
に、発現プラスミドpTATΔcysを構築した（図8;配列番
号:20）。プラスミドpTATΔcysを構築するために、従来
のPCR技術を、PCRテンプレートとしてのプラスミドpTAT
72と共に用いた。PCRに用いたオリゴヌクレオチドプラ
イマーの１つは、374.18（配列番号:19）であり、これ
はtatコード配列の上流のEag I部位をカバーしている。
（本発明者らはまた、プラスミドpET8c−123CCSSの構築
にオリゴヌクレオチド374.18を用いた。実施例９を参照
のこと。）他方のPCRのオリゴヌクレオチドプライマー
の374.28は、tatコード配列内のEag I部位をカバーして
おり、そしてアミノ酸22−37をコードするtatDNA配列の
欠失を有する。374.28のヌクレオチド配列は以下であ
る:TTTACGGCCG TAAGAGATAC CTAGGGCTTT GGTGATGAAC GCG
GT（配列番号:21）。PCR暗部付をEag Iで消化し、生じ
る762塩基対フラグメントを単離した。Eag Iフラグメン
トをpTAT72のEag I切断により生成した4057塩基対ベク
ターに挿入した。DNA配列分析により構築を確認し、Stu
dierら（前出）の方法によりtatΔcysポリペプチドを発
現させた。SDS−PAGE分析により、tatΔcysポリペプチ
ドが正確な大きさであることが示された。
tatΔcysタンパク質の精製のために、4.5gのpTATΔcy
s形質転換E.coli細胞を融解し、35mlの20mM MES（pH6.
2）、0.5mM EDTA中にこの細胞を再懸濁した。この細胞
をフレンチプレスにより10,000psiで２回通過により溶
解した。SA600ロータにおいて、10,000rpmで１時間遠心
分離することにより、不溶性の残渣を除去した。この上
清を15ml/時で5ml Sセファロースファーストフローカラ
ムにかけた。50mM トリス−HCl（pH7.5）、0.3mM DTTで
カラムを洗浄した。次いで、300mM、400mM、500mM、700
mM、および950mMのNaClを含む同じ緩衝液でステップグ
ラディエント溶出（2ml/ステップ）を行った。tatΔcys
タンパク質は950mM NaCl画分中に溶出した。
tatΔcys輸送ポリペプチドをローダミンイソチオシア
ネートに複合し、それを細胞取り込みに対して直接アッ
セイすることにより試験した。結果は陽性であった（ta
t1−72での関連実験での結果に類似する）。
TATΔcys−249遺伝的融合 天然E2リプレッサータンパク質のアミノ末端に遺伝子
的に融合したtatΔcys輸送ポリペプチド（すなわち、BV
P−1 E2のカルボキシ末端の249アミノ酸）の細菌による
発現のために、プラスミドpTATΔcys−249を以下のよう
に構築した。プラスミドpTAT72（FrankelおよびPabo、
前出）およびpXB314（Barsoumら、前出）からプラスミ
ドpFTE501（図９）を構築した。プラスミドpXB314か
ら、249アミノ酸のBPV−1 E2リプレッサーをコードする
Nco I−Spe I DNAフラグメントを単離した。（Nco Iは
ヌクレオチド296位で切断し、そしてSpe IはpXB314のヌ
クレオチド1118位で切断する。）このフラグメントの末
端をDNAポリメラーゼＩクレノウ処理により平滑化し、
市販により入手可能なBgl IIリンカー（New England Bi
olabs,カタログ番号1090）を加えた。このリンカーを有
するフラグメントをBamH I切断（完全消化）プラスミド
pTAT72に挿入した。pTAT72では、BamH I切断部位がtatu
コード領域内でその３′末端近くに存在し、第二のBamH
I切断部位はtat遺伝子のわずかに下流に存在する。Bal
IIリンカーは、フレームが合って、tatおよびE2コード
配列を連結し、これらはセリン残基に続くtatタンパク
質の最初の62アミノ酸およびBPV−1 E2タンパク質の最
後の249アミノ酸の融合物をコードする。本発明者らは
この細菌発現プラスミドをpFTE501と称した（図９）。
プラスミドpTATΔcys−249（図10;配列番号:22）を構築
するために、プラスミドpTAT cys由来の762塩基対のEag
Iフラグメント（これはシステインの欠失を含むtatの
部分を含む）をプラスミドpFTE501の4821塩基対Eag Iフ
ラグメントに挿入した。
tatΔcy−249の精製 tatΔcys−249を発現する5gのE.coliを融解し、プロ
テアーゼインヒビター（1.25mM PMSF、3mMベンズアミジ
ン、50μg/mlペプスタチンＡ、50μg/mlアプロチニン、
４μg/ml E64）を加えた、40mlの25mMトリスHCl（pH7.
5）、25mM NaCl、0.5mM EDTA、5mM DTT、中にこの細胞
を再懸濁した。この細胞を10,000psiでフレンチプレス
のセルを２回通過させることにより溶解した。SA600ロ
ータにおいて、12,000rpmで１時間遠心分離をかけるこ
とにより、不溶性の残渣を除去した。可溶画分さらtat
Δcys−249を精製した。この上清を2ml Sセファロース
ファーストフローカラム（Pharmacia LKB,Piscataway,N
J）に流速6ml/時で加えた。カラムを、25mMトリスHCl
（pH7.5）、25mM NaCl、0.5mM EDTA、1mM DTTで洗浄
し、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、およ
び800mMのNaClを含む同じ緩衝液で連続的な塩濃度ステ
ップで処理した。TatΔcys−249を600−800mM塩画分で
回収した。このピーク画分をプールし、グリセロールを
15％まで加え、アリコートを−70℃で貯蔵した。
免疫蛍光アッセイ tatΔcys−E2リプレッサー融合タンパク質の細胞取り
込みを分析するために、間接免疫蛍光法を用いた。HeLa
細胞を６ウエル組織培養皿中でカバーガラス上に50％集
密で植え付けた。一晩インキュベートした後、tatΔcys
−E2リプレッサー融合タンパク質（１μg/ml最終濃度）
およびクロロキン（0.1mM最終濃度）を加えた。６時間
後、融合タンパク質／クロロキン含有成長培地を除去
し、細胞をPBSで２回洗浄した。洗浄した細胞を室温で
3.5％ホルムアルデヒド中に固定化した。固定化した細
胞を、1mM MgCl2/0.1mM CaCl2を含有するPBS（「PBS
＋」）中で0.2％Triton X−100/2％ウシ血清アルブミン
（「BSA」）で室温で５分間透過処理した。透過処理し
た細胞をブロックするために、２％BSAを含有するPBS
で、これら細胞を４℃で１時間処理した。
このカバーガラスを、各ウエル中で20μｌの一次抗体
溶液と共に４℃で１時間、２％BSAを含有するPBS＋の1:
100希釈でインキュベートした。一次抗体は、BPV−1 E2
リプレッサーに対するウサギポリクローナル抗体（E2の
精製カルボキシ末端85アミノ酸を注射することにより生
成される）、またはtatに対するウサギポリクローナル
抗体（tatタンパク質の精製アミノ末端72アミノ酸を注
射することにより生成される）のいずれかであった。PB
S＋中の0.2％Tween−20/2％BSA中で、1:100希釈で４℃
で30分間、二次抗体を加えた。
二次抗体は、ローダミン複合ヤギ抗ウサギIgG（Cappe
l no.2212−0081）であった。細胞を二次抗体とインキ
ュベートさせた後、この細胞をPBS＋中0.2％Tween−20/
2％BSAで洗浄し、90％グリセロール、25mMリン酸ナトリ
ウム（pH7.2）、150mM NaCl中でカバーガラスを乗せ
た。ローダミンフィルターを有する蛍光顕微鏡で細胞を
試験した。
TatΔcys融合の細胞取り込み tatΔcys−E2リプレッサー融合タンパク質の顕著な細
胞取り込みを、tat抗体またはE2抗体のいずれかを用い
て観察した。複合体化していないtatタンパク質にさら
したコントロール細胞では、tat抗体による細胞内蛍光
を観察したが、E2抗体では観察されなかった。複合体化
していないE2リプレッサーとtatタンパク質またはtatΔ
cysとの混合物にさらしたコントロール細胞では、rat抗
体による蛍光を観察したが、E2抗体では観察されなかっ
た。これにより、tatは、tatタンパク質に複合体化した
ときにのみE2リプレッサーの取り込みを仲介することが
証明された。複合体化していないtatタンパク質と同様
に、細胞全体にtatΔcys−E2リプレッサー融合タンパク
質を観察したが、これは細胞内小胞中に密集していた。
これらの結果は、完全にシステイン残基を欠失している
tat由来ポリペプチドが、動物細胞中に異種タンパク質
（すなわち、輸送ポリペプチド−カーゴタンパク質の遺
伝的融合）を運搬し得ることを示す。
上記と同様の手順で、tatΔcysとHPV E2のＣ末端123
アミノ酸との遺伝的融合物を作製した。成長培地に加え
たとき、この融合ポリペプチドは、COS7細胞においてE2
依存性遺伝子発現の抑制を示した（データは示さず）。
実施例11 アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド複合体 自動化DNA/RNAシンセサイザー（Applied Biosystems
モデル394）を用いて、DNAホスホロチオネートアナログ
（長さ４−18ヌクレオチド）を合成した。このアナログ
はそれぞれ５′末端にフリーアミノ基を含む。このアミ
ン基は市販の修飾ヌクレオチド（アミノリンク２、Appl
ied Biosystems）を用いて、オリゴヌクレオチドに結合
した。このオリゴヌクレオチドは、ヒト成長ホルモンお
よびCATメッセンジャーRNAの領域に由来のセンス鎖およ
びアンチセンス鎖に相当した。
各架橋反応のために、200μｇのオリゴヌクレオチド
を100μｌの257mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中
に溶解した。次いで、10μｌのスルホ−SMCCの50mMスト
ック溶液を加え、反応を室温で１時間進行させた。25mM
HEPES（pH6.0）中のP6DGカラム（Bio−Rad）での反応
混合物のゲル濾過により未反応のスルホ−SMCCを除去し
た。オリゴヌクレオチド−スルホSMCC付加物を減圧下で
乾燥した。この手順におけるオリゴヌクレオチドの回収
率は、58〜95％の範囲であった。輸送ポリペプチドとの
反応のために、各オリゴヌクレオチド−スルホ−SMCC付
加物を50μｌの0.5mM EDTA中に再溶解し、この溶液を50
μｇの凍結乾燥した輸送ポリペプチドを含有する試験管
に移し、そして反応を室温で２時間進行させた。反応産
物をSDS−PAGEにより分析した。
実施例12 抗体複合体 抗チューブリン複合体１ 市販のマウスIgG1 mAb抗チューブリン（Amersham）を
得て、プロテインＡを用いて従来法により腹水からそれ
を精製した。精製抗体をローダミンイソチオシアネート
で、1.2モルローダミン／モルAbで標識した。固定化し
透過処理したHeLa細胞を標識抗体にさらすと、顕微鏡検
査により鮮やかに染色された微小管が明らかになった。
ローダミン標識で十分であるが、抗マウスFITCで抗体シ
グナルを増強した。
本質的に実施例２に記載された手順（前出）で、250
μｇの抗体をスルホ−SMCCの10:1モル過剰と反応させ
た。次いで、48μｇの（35S−標識）tat1−72を加え
た。tat1−72:Abのモル比は2.7:1であった。放射活性の
取り込みによると、tat1−72は、抗体に0.6:1の比で架
橋した。
tat1−72−Ab複合体の取り込みの分析のために、複合
体をカバーガラス上で増殖した細胞を侵している培養液
（10μg/ml）に加えた。細胞において蛍光の斑点パター
ンを観察した。斑点パターンは、複合体の小胞体への局
在化を示し、従って細胞質送達に関しては決定的ではな
い。
複合抗体に免疫反応性を示すために、この抗体がチュ
ーブリンに結合する能力を試験した。精製チューブリン
を臭化シアン−活性化セファロース4B（Sigma Chem.C
o.,st.Louis,MO）に結合させた。放射活性複合体の試料
をチューブリンカラム（およびセファロース4Bコントロ
ールカラム）にかけ、結合した複合体の量を測定した。
コントロールカラムよりもアフィニティーマトリクスに
対してより大きい放射活性が結合し、チューブリン結合
活性を示した。
抗チューブリン複合体２ 別の架橋実験において、抗チューブリンラットモノク
ローナル抗体IgG2a（Serotec）を得、プロテインＧを用
いて従来法により腹水からそれを精製した。この抗体を
Caps緩衝液（pH10）で溶出した。精製抗体は、チューブ
リン結合アッセイで陽性であった。tatl−72をローダミ
ンイソチオシアネートと1:1のモル比で反応させた。反
応産物は、0.63のA555/A280比を示し、tat1−72 1モル
に対し色素約0.75モルの置換を示した。未反応の色素を
tatl−72−ローダミンからＧ−25ゲル濾過（Pharmacia
LKB.Piscataway,NJ）により分離した際、反応において1
50μｇのtat1−72から52μｇのみを回収した。
tat1−72−ローダミンのアリコートを、細胞取り込み
実験での使用（コントロールとしての）のために保存
し、残りをSMCC（20:1）と反応させた0.4mgの抗体に加
えた。反応混合物は、意図された5:1ではなく約1:1の比
のtatl−72:Abを含んでいた。（続く実験では、5:1の比
は沈殿を生じ、満足しない結果となることがわかっ
た。）架橋反応を４℃で一晩進行させた。次いで、モル
過剰のシステインを加え、残存するマレイミド基をブロ
ックし、このようにして架橋反応を停止させた。反応混
合物を遠心分離し、存在する沈殿物をすべて取り除い
た。
４−20％ポリアクリルアミドグラディエントゲルを用
いて電気泳動を行い、還元条件下および非還元条件下で
上清液を分析した。また、この手順により沈殿ペレット
を分析した。抗体−tat1−72（ローダミンなし）からの
上清液では、４−20％ゲルではほんのわずかしか物質は
観察されなかった。しかし、抗体−tat1−72−ローダミ
ン複合体実験からの上清液では、還元試料について、抗
体よりも相対的に大きな分子量のバンドを観察した。抗
体は、tat1−72に約1:1の比で複合体化したと思われ
た。
複合体２で行った細胞取り込み実験（複合体１に関し
て上述した手順）では、複合体１で得た結果と同様の結
果を得た。複合体ローダミン蛍光または二次抗体に結合
したフルオレセインにより可視化したとき、小胞体内で
複合体が観察された。
実施例13 付加的Tat−E2複合体 化学的に架橋したTat−E2複合体 輸送ポリペプチドtat37−72を、E2の４つの異なるリ
プレッサー型に化学的に架橋した。これらの実験に用い
た４つのE2リプレッサー部分は、BPV−１（「E2.10
3」）のカルボキシ末端103残基（すなわち、308−41
0）;BPV−１（「E2.249」）のカルボキシ末端249残基
（すなわち、162−410）;HPV−16（「HE2」）のカルボ
キシ末端121残基（すなわち、245−365）；およびHPV−
16のカルボキシ末端121残基であり、ここでは、300位お
よび309位でシステイン残基をセリンに変えており、そ
して299位でリシン残基をアルギニンに変えた（「HE2CC
SS」）。HE2およびHE2CCSSの組換え産生および精製、そ
の後のHE2およびHE2CCSSのtat37−72への架橋により、
それぞれTxHE2およびTxHE2CCSSの形成を実施例９に記載
している（上記）。tat37−72へE2.103およびE2.249を
化学的に架橋（TxE2.103およびTxE2.249と名付けた複合
体を生ずる）するために、TxHE2およびTxHE2CCSSを作製
するために用いた同じ方法を用いた（実施例、前出）。
E.coli中でプラスミドpET−E2.103からタンパク質E2.
103を発現させた。実施例９（上記）および図５に記載
した、pET8c−123を生成するのに用いた手順と類似のPC
Rクローニング手順により、pET−E2.103を得た。pET8c
−123の構築におけるように、PCRで生成したNco I−Bam
H I E2フラグメントのNco I−BamH Iで切断したpET8cに
連結した。E2フラグメントに対するPCR鋳型は、プラス
ミドpCO−E2であった（Hawley−Nelsonら、EMBO J.、７
巻、525−31頁（1988）；米国特許第5,219,990号）。pC
O−E2からE2フラグメントを生成するのに用いたオリゴ
ヌクレオチドプライマーは、EA21（配列番号:36）、お
よびEA22（配列番号;37）であった。プライマーEA21
は、BPV−1 E2のカルボキシ末端101残基に対するコード
領域の５′側に隣接するアラニンコドンが続くメチオニ
ンコドンを付加するNco I部位を導入した。
E.coli中でプラスミドpET8c−249からタンパク質E2.2
49を発現させた。プラスミドpXB314（図９）の1362bpの
Nco I−BamH IフラグメントをNco I−BamH Iで切断した
pET8c（図５）に挿入することにより、pET8c−249を構
築した。
TATΔcys−BPV E2遺伝的融合 TATΔcys−249に加えて、幾つかの他のTATΔcys−BPV
−1 E2リプレッサー融合体を試験した。プラスミドpTAT
Δcys−105は、tat残基１−21および38−67、その後ろ
にBPV−１のカルボキシ末端105残基をコードしていた。
プラスミドpTATΔcys−161は、tat残基１−21および38
−62、その後ろにBPV−１のカルボキシ末端161残基をコ
ードしていた。プラスミドpTATΔcys−105およびpTATΔ
cys−161を、中間体プラスミドのpFTE103およびpFTE403
からそれぞれ構築した。
pFTE103およびpFTE403（およびpFTE501）を、BamH I
で切断した（完全消化）ベクターpTAT72に異なる挿入物
を連結することにより生成した。
pFTE103への挿入フラグメントを得るために、pXB314
から929塩基対のPle I−BamH Iフラグメントを単離し、
そしてそれを合成オリゴヌクレオチドFTE.3（配列番号:
23）および合成オリゴヌクレオチドFTE.4（配列番号:2
4）からなる二本鎖リンカーに連結した。このリンカー
は、tat残基61−67をコードしており、そして５′末端
でBamH I突出部、および３′末端でPle I突出部を有し
た。pXB3314由来のリンカーを有するフラグメントをBam
H Iで切断したpTAT72に連結し、pFTE103を得た。pFET40
3への挿入フラグメントを得るために、pXB314をNco Iお
よびSpe Iで消化し、クレノウ処理し平滑末端を生成
し、そしてそれ自身で二重らせんであるGAAGATCTTC（Ne
w England Biolanbs,Beverly,MA,カタログ番号No.109
0）（配列番号;35）からなるBgl IIリンカーを連結し
た。得られた822−塩基対フラグメントを電気泳動によ
り精製し、次いで、それをBamH Iで切断したpTAT72ベク
ターに連結してpFTE403を得た。
tat残基22−37を欠失するために、それによってpFTE1
03からプラスミドpTATΔcys−105を、およびpFTE403か
らpTATΔcys−161を得、pFTE501からプラスミドpTATΔc
ys−249を得るために用いた同一の方法（上に記載）を
用いた。
TATΔcys−HPV E2遺伝的融合 tatΔcys輸送部分（tat残基１−21、38−72）に続くH
PV−16のカルボキシ末端85残基または121残基からなる
融合タンパク質をコードする、プラスミドpTATΔcys−H
E2.85およびpTATΔcys−HE2.121をそれぞれ構築した。
pTATΔcys−HE2.85およびpTATΔcys−HE2.121の構築
における出発プラスミドは、それぞれpET8c−85およびp
ET8c−123であった（両者とも上に記載）。pET8c−85お
よびpET8c−123をBgl IIおよびNco Iで消化し、そし
て、それぞれの場合に、ベクターとして用いるために大
きなフラグメント（pET8c−85から4769塩基対またはpET
8c−123から4880塩基対）を単離した。両方のベクター
とも、Nco I部位からE2コード領域が始まる。両方のベ
クターに、プラスミドpTATΔcys由来の220bpのBgl II−
Aat IIフラグメントおよび合成フラグメントを挿入し
た。Bgl II−Aat IIフラグメントの５′末端は、T7プロ
モーターの上流であり、そしてtatΔcysの最初の40残基
（すなわち、残基１−21、38−56）をコードする。アニ
ールしたオリゴヌクレオチド374.67（配列番号:25）お
よび374.68（配列番号:26）からなる合成フラグメント
は、tat残基57−72をコードし、５′末端にAat II突出
部、および３′末端にNco I突出部を有する。
遺伝的融合のJBシリーズ プラスミドpJB106は、融合タンパク質をコードし（図
12）（配列番号:38）、そこではアミノ末端メチオニン
残基の後にtat残基47−58、次いで、HPV−16 E2残基245
−365が続く。pJB106を得るために、図11に図式で表現
したように、３つの断片の連結を行った。プラスミドpE
T8cをNco IおよびBamH Iで消化することにより、4602塩
基対ベクターフラグメントを生成した。１つの挿入物
は、pET8c−123由来の359塩基対のMsp I−BamH Iフラグ
メントであり、HPV−16 E2残基248−365をコードしてい
た。他の挿入物は、アニールしたオリゴヌクレオチド対
の374.185（配列番号:27）および374.186（配列番号;2
8）からなる合成フラグメントであった。合成フラグメ
ントは、アミノ末端メチオニンおよにtat残基47−58、
プラスHPV16残基245−247（すなわち、ProAspThr）をコ
ードした。合成フラグメントは、５′末端でNco I突出
部および３′末端でMsp I突出部を有した。
pTATΔcysに用いた方法と類似の方法（上記および図
８に記載）でPCR欠失クローニングにより、プラスミドp
JB117（配列番号:59）、pJB118（配列番号:60）、pJB11
9（配列番号:61）、pJB120（配列番号:62）、およびpJB
122（配列番号:63）を得た。pTATΔcys−HE2.121のセグ
メントを欠失することのより、プラスミドpJB117および
pJB118を構築した。pTATΔcys−161のセグメントを欠失
することにより、プラスミドpJB119およびpJB120を構築
した。４つのクローニングすべてにおいて、PCRプライ
マー374.122（配列番号:29）を用いて、tat−E2コード
領域下流のHind III部位をカバーした。それぞれの場合
において、別のプライマーがtatΔcysコード配列の開始
部のNde I部位がtatΔcysのはじめの残基に対する欠失
コドン（すなわち、pJB117およびpJB119に対する残基２
−21および38−46;およびpJB118およびpJB120に対する
残基２−21）にたがった。残基２−21の欠失には、プラ
イマー379.11（配列番号:30）を用いた。残基２−21お
よび38−46の欠失には、プライマー379.12（配列番号:3
1）を用いた。PCR反応に続き、PCR産物をNde IおよびHi
nd IIIで消化した。次いで、得られた制限酵素切断フラ
グメントをベクターpTATΔcys−HE2.121にクローニング
した。このベクターは、前もってNde IプラスHind III
で切断して、4057塩基付のレセプターフラグメントとし
て生成していた。このように、以下のアミノ酸残基から
なる融合タンパク質をコードする発現プラスミドを構築
した： JB117＝Tat47−72−HPV16 E2 245−365; JB118＝Tat38−72−HPV16 E2 245−365; JB119＝Tat47−62−BPV1 E2 250−410;および JB120＝Tat38−62−BPV1 E2 250−410。
tat残基59−72に対するコドンをpJB118から欠失する
ことにより、tat残基38−58に続くHPV16 E2残基245−36
5（すなわち、E2カルボキシ末端121アミノ酸）をコード
するpJB122を構築した。プライマー374.13（配列番号:3
2）を用いてPCRによりこの欠失を行った。このプライマ
ーは、tatコード領域内のAat II部位をカバーし、そし
てプライマー374.14（配列番号:33）は、Tat−E2遺伝子
下流の唯一のHind III部位の少し下流のAat II部位をカ
バーする。PCR産物をAart IIで消化し、そして得られた
制限酵素切断断片フラグメントを単離した。pJB122構築
最終工程において、単離したAat IIフラグメントをAat
IIで消化したベクターpJB118に挿入した。
上記の５つのpJB構築物すべてにおいて、tatコード配
列は、翻訳開始のためのメチオニンコドンが先行してい
ることに注目すべきである。
Tat−E2融合タンパク質の精製 全ての場合において、E.coliを用いてtat−E2遺伝子
融合物を発現させた。tat−E2タンパク質精製のための
一般的な手順は、以下の初期工程を包含する：細胞のペ
レット化；プロテアーゼインヒビター−−一般的に1mM
PMSF、４μg/ml E64、50μg/mlアプロチニン、50μg/ml
ペプスタチン（pepstatin）Ａ、および3mMベンズアミジ
ン（benzamidine）を含む８−10容量の溶菌緩衝液（25m
Mトリス（pH7.5）、25mM NaCl、1mM DTT、0.5mM EDTA）
に細胞を再懸濁；フレンチプレス（12,000psiの２回通
過）で細胞を溶解；および溶解液を10,000−12,000×ｇ
で４℃で１時間遠心分離する（FTEタンパク質を除
く）。特にtat−E2融合タンパク質の精製において、さ
らに行った工程を以下に記載する。
E2.103およびE2.249−−溶解液の遠心分離の後、ファ
ーストＳセファロースカラムに上清をロードし、そして
1MのNaClでE2.103またはE2.249タンパク質を溶出した。
次いで、100mM HEPE（pH7.5）、0.1mM EDTAおよび1mM D
TTで平衡化したP60ゲル濾過カラムでのクロマトグラフ
ィーにより、E2.103およびE2.249をさらに精製した。
FTE103−−溶解液を10,000×ｇで４℃で10分間遠心分
離した後、ペレットを6M尿素に再懸濁し、そして固体の
グアニジン−HClを最終濃度が7Mになるように添加する
ことにより、FTE103タンパク質（沈殿した）を回収し
た。懸濁液を遠心分離した後、6Mグアニジン、50mMリン
酸ナトリウム（pH5.4）、10mM DTT中でA.5Mゲル濾過カ
ラムでのクロマトグラフィーにより、上清からFTE103を
精製した。クーマジー染色したSDSポリアクリルアミド
電気泳動ゲル上で、19kDaの見かけの分子量を有するバ
ンドの出現に従って、ゲル濾過カラムからFTE103含有画
分を集めた。
FTE403−−FTE403の精製手順は、25kDaの見かけ分子
量を有するFTE403がゲル濾過カラム上を移動した以外
は、FTE103に対する手順と本質的に同じである。
FTE501−−溶解液10,000×ｇで30分間遠心分離した
後、ペレットを6M尿素に再懸濁し、固体のグアニジン−
HClを最終濃度が6Mになるように添加し、そしてDTTを濃
度が10mMになるように添加した。37℃で30分後、10,000
×ｇで30分間の遠心分離により、溶液を清澄にした。次
いで、6Mグアニジン−HCl、50mMリン酸ナトリウム（pH
5.4）、10mM DTT中で4.5Mアガロースゲル濾過カラムに
試料をロードし、そしてクーマジー染色したSDSポリア
クリルアミド電気泳動ゲル上で、40kDaの見かけの分子
量を有するバンドの出現に従って、ゲル濾過カラムから
FTE501含有画分を集めた。ゲル濾過精製したFTE501を、
C18逆相HPLCカラムにロードし、そして0.1％のトリフル
オロ酢酸中の０−75％のアセトニトリルのグラディエン
トで溶出した。40kDaの見かけの分子量を有するFTE501
タンパク質を、単一ピーク中に集めた。
TatΔcys−105−−溶解液の遠心分離の後、上清を25m
Mトリス（pH7.5）、0.5mM EDTAで平衡化したＱ−セファ
ロースカラムにロードした。Ｑ−セファロースカラムの
通過液を、MES（pH6.0）を最終濃度が30mMになるように
添加して約pH6.0に調節した後、Ｑ−セファロースカラ
ム通過液を、25mM MES（pH6.0）で平衡化したＳ−セフ
ァロースカラムにロードした。25mM MES（pH6.0）中の
連続的なNaCl濃度ステップの適用により、Ｓ−セファロ
ースカラムからtatΔcys−105を回収した。TatΔcys−1
05は、800−1000mM NaClでpH6.0の緩衝液中に溶出し
た。
TatΔcys−161−−溶解液の遠心分離の後、上清を25m
Mトリス（pH7.5）、0.5mM EDTAで平衡化したＳ−セファ
ロースカラムにロードした。25mMトリス（pH7.5）中のN
aCl濃度ステップグラディエントの適用により、Ｓ−セ
ファロースカラムからtatΔ−cys−161を回収した。Tat
Δcys−161は、500−700mM NaClでpH7.5の緩衝液中に溶
出した。
TatΔcys−249−−溶解液の遠心分離の後、上清を25m
Mトリス（pH7.5）、0.5mM EDTAで平衡化したＱ−セファ
ロースカラムにロードした。25mMトリス（pH7.5）中のN
aClステップグラディエントの適用により、Ｓ−セファ
ロースカラムからtatΔcys−249を回収した。TatΔcys
−249は、NaClステップグラディエントの600−800mMの
部分の溶出した。
TatΔcys−HE2.85およびTatΔcys−HE2.121−−溶解
後の遠心分離の後、上清をＱ−セファロースカラムにロ
ードした。通過液をＳ−セファロースカラムにロードし
た。NaClステップグラディエントの適用により、Ｓ−セ
ファロースカラムからtat−Δcys−HE2.85またはtatΔc
ys−HE2.121を回収した。両タンパク質は、1M NaClで溶
出した。
HPV E2およびHPV E2CCSS−−実施例９参照（上記）。
JB106−−溶解液の遠心分離、および上清の回収後、N
aClを300mMまで添加した。25mM HEPES（pH7.5）で平衡
化したＳ−セファロースカラムに、NaClを添加した上清
をロードした。25mM HEPES（pH7.5）、1.5mM EDTA、1mM
DTT中の連続的な塩濃度ステップでカラムを処理した。
JB106タンパク質を、1M NaClでＳ−セファロースカラム
から溶出した。
JB117−−溶解液の遠心分離、および上清の回収後、N
aClを300mMまで添加した。JB117が300mM NaClで沈殿す
るので、JB117上清を100mM NaClまで希釈し、そしてＳ
−セファロースカラムにタンパク質をバッチ式でロード
した。JB117を、25mMトリス（pH7.5）、0.3mM DTT中の1
M NaClでＳ−セファロースカラムから溶出した。
JB118−溶解液の遠心分離、および上清の回収後、NaC
lを300mMまで添加した。25mMトリス（pH7.5）で平衡化
したＳ−セファロースカラムに、NaClを添加した上清を
ロードした。JB118タンパク質は、25mMトリス（pH7.
5）、0.3mM DTT中の1M NaClでＳ−セファロースカラム
から溶出した。
JB119、JB120、JB121、およびJB122−−溶解液の遠心
分離、および上清の回収後、NaClをJB119およびJB121に
対しては150mMまで、そしてJB120およびJB122に対して
は200mMまで添加した。25mMトリス（pH7.5）で平衡化し
たＳ−セファロースカラムに、NaClを添加した上清をロ
ードした。JB119、JB120、JB121、およびJB122は、25mM
トリス（pH7.5）、0.3mM DTT中の1M NaClでＳ−セファ
ロースカラムから溶出した。
実施例14 E2抑制アッセイ−付加的複合体 tat−E2融合タンパク質を、全長の乳頭腫ウイルスE2
タンパク質により、転写活性化の阻害（「抑制」）に対
して試験した。COS7細胞中での一時的な共トランスフェ
クションアッセイで、E2抑制を測定した。本アッセイに
おいて使用したCOS7細胞は、ほんの短い期間だけ培養で
維持した。COS7細胞を13継代で馴化（thaw）し、そして
25継代までだけそれらの細胞を使用した。長い期間増殖
させると、E2の転写活性化の低レベル化を招き、そして
抑制および再現性が減少した。抑制アッセイおよび抑制
活性の計算方法は、実施例９（上記）に記載してある。
複合体TxE2.103、TxE22.249、FTE103、FTE202、FTE40
3、およびFTE501について、HPV−16 E2トランスアクテ
ィベーターに、等量のBPV−1 E2トランスアクティベー
ターを置換した。従って、HPV−16 E2発現プラスミドpA
HE2でトランスフェクションする代わりに、BPV−1 E2発
現プラスミドpXB323でトランスフェクトした。これは米
国特許第5,219,990号に全て記載されている。
遺伝的融合タンパク質JB106は、首尾一貫して最も強
力なtat−E2リプレッサー複合体であった。JB106とTxHE
2CCSSとを比較した抑制アッセイのデータを表IIIに示
す。図13は、表IIIにある結果をグラフで表している。
JB106に加えて、幾つかの他のtat−E2リプレッサー複
合体が、顕著な抑制を生じた。表IVに示したように、Tx
HE2、TxHE2CCSS、JB117、JB118、JB119、JB120,およびJ
B122は、＋＋の範囲の抑制レベルを示した。
表IVは、tat−E2リプレッサーアッセイの結果を要約
している。同様のアッセイでtat−E2リプレッサー複合
体全部を試験したが、同じアッセイで複合体を全て同時
には試験しなかった。従って、抑制活性のレベルを半定
量的に、＋＋＋、＋＋、＋、＋／−、または−として表
した。＋＋＋は強い抑制、−は検出可能な抑制がないこ
とを示す。図13は、表IVで用いた抑制活性評価システム
を図示している。JB106は、＋＋＋活性レベルの例であ
る。TxHE2CCSSは、＋＋活性レベルの例である。負のコ
ントロールであるHE2.123は、−活性レベルの例であ
る。＋活性レベルは、TxHE2CCSSとHE2.123との間で観測
される活性の中間である。活性が＋／−と表示される２
つの複合体は、幾つかのアッセイでは弱い（が検出可能
な）活性を有し、他のアッセイでは検出可能な活性がな
い。
アミノ末端領域（すなわち、残基１−12）およびシス
テインに富む領域（すなわち、残基22−37）を有する４
つの複合体FTE103、FTE403、FTE208、およびFTE501は、
完全に抑制欠失である。間接的な免疫蛍光法によりFTE5
01が細胞に入ることを示したので、2Eリプレッサー活性
は、一連のFTEにおいてはtat輸送ポリペプチドに結合し
た結果として失われたようであると考えられている。デ
ータは、tat部分のシステインに富む領域が無ければ、
一般的にE2リプレッサー活性が増加することを示す。さ
らに、tat−E2複合体中にシステインに富む領域が無け
れば、標的細胞への輸送の損失もなく、E.coli中でのタ
ンパク質産生レベルが増加するようであり、そしてタン
パク質の溶解性が増加した。tatのアミノ末端領域の欠
失はまた、E2リプレッサー活性を増加させた。tat残基4
7−58のみ有する融合タンパク質JB106は、最も強力なta
t−E2リプレッサー複合体であった。しかし、システイ
ンに富む領域の不在により、複合体にE2リプレッサー活
性が常に保存されているわけではない。例えば、化学的
複合体TxE2.249は、不溶性であり、そして細胞に対して
毒性である。このように、たとえtatのシステインの無
い部分の結合でさえ、非機能的なE2リプレッサー複合体
となり得る。
実施例15 切断可能なE2複合体 E2タンパク質へのtat部分の化学的結合は、DNA上のE2
結合部位へのE2タンパク質の結合が少なくとも20培減少
した（データは示さず）。従って、実験を行って、tat
輸送部分とE2リプレッサー部分との間の切断可能な架橋
を評価した。種々の切断可能な架橋方法を試験した。
一連の実験において、HPV E2−CCSSタンパク質のシス
テインスルフヒドリル基を、100mM HERES（pH7.5）、50
0mM NaCl中のアルドリチオール（aldrithiol）で活性化
した。ゲル濾過クロマトグラフィーにより活性化E2リプ
レッサーを単離し、そしてそれをtat37−72で処理し
た。アルドリチオールで処理すると、急速にE2−CCSS二
量体が形成するので、低い架橋効率であった。この問題
をさけるために、E2−CCSSを室温で8Mの尿素に入れて、
そして変性条件下で23℃で60分間、アルドリチオールで
処理した。次いで、E2CCSS−アルドリチオール付加物を
再生し、それをゲル濾過クロマトグラフィーにより単離
し、次いで、tat37−72と反応させた。この手順で優れ
て架橋を得た。尿素方法の改変法を用いて、E2CSSSおよ
ひE2CCSCもまたtat37−72に架橋した。ここでは、ゲル
濾過の代わりにＳ−セファロースクロマトグラフィーを
用いて、E2−アルドリチオール付加物を単離した。この
改変により、付加物の回収率が増加し、そして反応に用
いたE2出発物質の約90％が架橋した。
切断可能なtat−E2複合体は、抑制アッセイにおいて
活性を示した。しかし、切断可能な複合体の抑制活性
は、不可逆的に架橋した類似の複合体の抑制活性よりわ
ずかに低かった。切断可能な複合体のわずかに低い活性
は、細胞中でのタンパク質の半減期の反映であり得る。
Tatは細胞中で比較的安定である。E2タンパク質は、一
般的に細胞中では半減期は短い。従って、tat部分とE2
部分との間の不可逆的架橋は、E2部分を安定化し得る。
実施例16 単純疱疹ウイルスプレッサー複合体 単純疱疹ウイルス（「HSV」）は、急速な初期HSV遺伝
子の発現を誘導する転写アクティベーターのVP16をコー
ドする。Friedmanらは、VP16のカルノボキシ末端転写活
性化ドメインを欠失することにより、HSV VP16リプレッ
サーを生成した（「先欠のウイルストランスアクティベ
ーターの発現は、その同系のウイルスによる溶菌感染を
選択的に妨害する」、Nature,335,452−54頁（198
8））。類似の方法でHSV−2 VP16リプレッサーを生成し
た。
輸送ポリペプチド−VP16リプレッサー複合体の、細胞
取り込みおよびVP16リプレッサー活性を試験するため
に、VP16依存性リポータープラスミドおよびVP16リプレ
ッサープラスミドを、COS7細胞に同時にトランスフェク
トした。次いでトランスフェクトした細胞を、輸送ポリ
ペプチド−VP16リプレッサー複合体または適切なコント
ロールにさらした。以下に記載の抑制アッセイは、実施
例９において上記の2E抑制アッセイと類似であった。
VP16抑制アッセイプラスミド VP16抑制アッセイのためのリポーター構築物は、プラ
スミドp175kCATであり、これはG.Haywardから入手した
（P.O'HareおよびG.S.haywardの「単純疱疹ウイルス遅
滞型初期および急速型初期調節領域を包含する組換え遺
伝子の発現および疱疹ウイルス感染によるトランス活性
化」、J.Virol.52,522−31頁（1984）参照。プラスミド
p175kCATは、CATリポーター遺伝子を作動させるHSV−1
IE175プロモーターを含む。
VP16抑制アッセイのためのHSV−２トランスアクティ
ベーター構築物は、プラスミドpXB324であり、これはニ
ワトリβ−アクチンプロモーターのコントロール下で、
野生型HSV−2 VP16遺伝子を含有していた。pXB100（P.H
anら、「HIV−1 Tatによる異種プロモーターのトランス
活性化」、Nuc.Acids Res.,19,7225−29頁（1991））の
Xho I部位とBamH I部位との間に、ニワトリβ−アクチ
ンプロモーターを含280塩基対フラグメント、および野
生型HSV−2 VP16タンパク質全体をコードするプラスミ
ドpCA5（O'HareおよびHayward,前出）由来の2318塩基対
のBamH I−EcoR Iフラグメントを挿入してpXB324を構築
した。
Tat−VP16リプレッサー融合タンパク質 細菌中で、HIV tatタンパク質のアミノ酸47−58とそ
れに続くHSV VP16タンパク質のアミノ酸43−412からな
る融合タンパク質tat−VP16R.GF（配列番号:58）を産生
した。tat−VP16リプレッサー融合タンパク質を細菌で
産生するために、３つの断片を連結してプラスミドpET/
tat−VP16R.GFを構築した。第１番目のフラグメント
は、Nco IおよびBgl IIで消化したベクターpET−3d（別
の名称「pET−8c」上記）であった（約4600塩基対）。
第２番目のフラグメントは、アニールとして二本鎖DNA
分子の形態になった合成オリゴヌクレオチド374.219
（配列番号:39）および374.220（配列番号:40）からな
る。合成フラグメントの５′末端は、ATG翻訳開始ゴド
ンを含むNco I突出部を有した。開始コドンに続いて、t
at残基47−58に対するコドンが存在した。tatコドンの
すぐ次は、フレーム（読み取り枠）が合ったVP16残基43
−47に対するコドンであった。合成フラグメントの３′
末端は、HSV−2 VP16のコドン48−412を含む、pXB324R4
由来の1134塩基対のPvu II−Bal IIフラグメントである
第３番目のフラグメントと連結するための平滑末端であ
った。pXB324からpXB324Rを誘導した（上記）。プラス
ミドpXB324R2は、pXB324R4の構築における場合の中間体
であった。
pXB100に、HSV−2 VP16のＮ末端の419アミノ酸をコー
ドするpXB324由来の1342塩基対のBamH I−Aat IIフラグ
メントを挿入してpXB324R2を構築した。フレームのあっ
た停止コドンを提供するために、pSV2−CAT由来の73塩
基対Aat II−EcoR Iフラグメントを用いた（C.M.Gorman
ら、Molecular ＆ Cellular Biology,2,1044−51頁（19
82））。従って、pXB324R2は、HSV−2 VP16の最初の419
アミン酸および停止コドンに先行するVP16でないさらに
７つのアミン酸をコードした。pXB324R4を構築するため
に、pXB324R2由来の5145塩基対のMlu I−EcoR Iフラグ
メント、および２つの挿入フラグメントを含有する３つ
の断片の連結を行った。１つの挿入物は、VP16の最初の
198残基をコードするpXB324R2由来の115塩基対のMlu I
−Nsp Iフラグメントであった。第２番目の挿入フラグ
メントは、合成オリゴヌクレオチド374.32（配列番号:4
1）および374.33（配列番号:42）からなる二本鎖合成DN
A分子であった。アニールしたとき、これらのオリゴヌ
クレオチドは、５′Nsp I付着末端および３′EcoR I付
着末端を形成した。この合成フラグメントは、終始コド
ンが続くVP16残基399−412コードしていた。このように
プラスミドpXB324R4は、VP16アミノ酸413−419に対する
コドン、および停止コドンに先行する７つの外部からの
アミノ酸を欠くことにより、pXB324R2と異なった。
tat−VP16R.GF融合タンパク質の精製 tat−VP16R.GFに対する遺伝子構築物を、E.coli中で
発現させた。遠心分離により形質転換させたE.coliを集
め；細胞を８−10容量の溶菌緩衝液（25mMトリス（pH7.
5）、25mM NaCl、1mM DTT、0.5mM EDTA、1mM PMSF、４
μg/ml E64、50μg/mlアプロチニン、50μg/mlペプスタ
チンＡ、および3mMベンズアミジン）に再懸濁し；フレ
ンチプレス中で細胞を溶菌し（12,000psiで２回通
過）；そして、溶解液を10,000〜12,000×ｇで４℃で１
時間、遠心分離した。溶解液を遠心分離した後、25mMト
リス（pH7.5）、0.5mM EDTAで平衡化したファーストＱ
−セファロースカラムに上清をロードした。Ｑ−セファ
ロース通過後を、25mM MES（pH6.0）、0.2mM EDTA、2mM
DTTで平衡化したファーストＳ−セファロースカラムに
ロードした。tat−VP16融合タンパク質を、Ｓ−セファ
ロースカラムから、25mM MES（pH6.0）、0.1mM EDTA、2
mM DTT中のNaClの連続的な濃度ステップを用いて回収し
た。tat−VP16融合タンパク質は、600−1000mM Nacl画
分中に溶出した。
VP16抑制アッセイ HeLa細胞を、１ウェル当たり105細胞で、24ウェル培
養プレートに接種した。翌日、DEAE−デキストラン法
（B.R.Cullen、「クローン欠した遺伝子の機能的分析に
おける真核生物発現技術の使用」、Meth Enzymol.,152
巻、684頁（1987）に記載）を用いて、細胞をトランス
フェクトした。DNAをトランスフェクションのために沈
殿させ、そしてそれを100mM NaCl、10mMトリス（pH7.
5）中に約100μg/mlの濃度で再溶解した。各トランスフ
ェクション用のDNA−DEAE混合液は以下からなる；最終
体積100μｌに対して、200ng p175kCAT（＋／−1ng pXB
324）または200ng pSV−CAT（コントロール）、1mg/ml
DEAE−デキストラン、およびPBS。細胞をこの混合液に3
7℃で15−20分間、培養プレートをときどき揺らしなが
らさらした。次いで、1mlの新鮮DC培地（DMEM＋10％血
清）を80μＭクロロキンとともに各ウェルに添加した。
細胞を37℃で2.5時間インキュベートした後、各ウェル
から培地を吸引し、そしてそれを10％DMSOを含有する新
鮮DCで置き替えた。室温で2.5分後、DMSO含有培地を吸
引し、そしてそれを０、10、または50μg/mlのの精製ta
t−VP16.GFを含有する新鮮度DCで置き替えた。翌日、各
ウェル中の培地を同じ組成の新鮮培地で置き替えた。24
時間後、HeLa細胞を10mMトリス（pH8.0）、1mM EDTA、1
50mM NaCl中の0.65％NP−40（界面活性剤）で溶解し
た。アッセイにおいて試料の標準化のために、各抽出物
中のタンパク質濃度を測定した。
tat−VP16.GFの濃度が50μg/mlの場合、細胞毒性がア
ッセイを妨害した。10μg/mlの濃度では、tat−VP16.GF
融合タンパク質は、VP16−依存性のCAT発現をほとんど
完全に抑制した。ここでは、観察し得る細胞の死滅はな
く、そしてコントロール中ではVP16−依存性でないCAT
発現が約30％抑制された。このように、より少ない量の
非特異的抑制に加えて、VP16依存性のトランス活性化の
特異的な抑制を観察した。
実施例17 輸送ポリペプチド−DNA複合体 DNA結合性転写因子による転写活性化は、その転写因
子に対する結合部位を有するDNAを細胞中に導入するこ
とにより阻害し得る。転写因子は導入されたDNAに結合
するようになり、そして正常に機能するプロモーター部
位で結合しない。この戦略は、NF−κＢによる転写活性
化を阻害するのに用いた（Bielinskaら、「二本鎖ホス
ホロチオエートオリゴヌクレチオドを用いる遺伝子発現
調節」、Science,250巻、997−1000頁（1990））。Biel
inskaらは、二本鎖DNAを細胞培養培地に入れた場合、投
与量に依存する阻害を観察した。輸送ポリペプチドtat3
7−72を、二本鎖DNA分子に結合し、このような複合体
が、DNAの細胞取り込みを増加することにより阻害を増
強し得るか否かを測定した。
NF1、NF2、NF3およびNF4と命名した、それぞれヌクレ
オチド配列（配列番号:43）、（配列番号:44）、（配列
番号:45）および（配列番号:46）を有する、４つの注文
合成された39マーのホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドを購入した。NF1およびNF2は、野生型NF−κＢ結合
部位に相当する二重らせんを形成した。NF3およびNF4
は、変異型NF−κＢ結合部位に相当する二重らせんを形
成した。
NF1およびNF3を、約4mg/mlの濃度で水に溶解した。次
いで800μｇのNF1およびNF3を別々に、400μｌの50mMト
リエタノールアミン（pH8.2）、50mM NaCl、10mM TrauT
試薬に入れた。室温で50分間反応を進行させた。50mM H
EPES（pH6.0）、50mM NaClで平衡化したP6DGカラム（Bi
oRad,Richmond,CA）上のゲル濾過により反応を停止し
て、過剰のTraut試薬を除去した。260nmの吸収をモニタ
ーして、オリゴヌクレオチドを含有する画分を同定し
た。オリゴヌクレオチドの回収率は、約75％であった。
次いで、Traut修飾NF1とNF2とをアニールし（最終濃度
0.55mg/ml）、そしてTraut修飾NF3とNF4とをアニールし
た（最終濃度0.50mg/ml）。最終的に、室温で60分間、1
mlの100mM HEPES（pH7.5）中で、0.4mgの各Traut修飾DN
Aを0.6Gmとtat37−72−BMH（上記の実施例９に記載のよ
うに調製した）と反応させた。ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、その後のゲルのエチジウムブロミド染色によ
り、架橋反応の信号をモニターした。一般に、これらの
条件下で、約50％のDNAが修飾されたことを観察した。
これらの二本鎖DNA分子を、本質的にBielinskaら（前
出）の方法に従って、tat結合がある場合および無い場
合についてNF−κＢ転写活性化の阻害を試験した。Tat
結合は、NF−κＢにより著しく転写活性化を増強した。
本明細書中に記載した方法により調製される組換えDN
A配列は、アメリカンタイプカルチャーコレクション、R
ockville,Marylandにおいて寄託されたカルチャーによ
り例示される。pJB106とEscherichia coliカルチャー
は、1993年７月28に寄託され、そしてATCC受託番号6936
8が与えられた。
本発明の多くの実施態様を記載したが、発明者らの基
本的な構築物は改変され得、本発明の方法および産生物
を利用する他の実施態様を提供し得ることは明らかであ
る。従って、本発明の範囲は実施例により提供された特
定の実施態様により規定されるのではなく添付の請求項
により規定されるべきであることが理解され得る。
配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：バイオジェン，インコーポレイテッ
ド． バースム．ジェイムズ ジー． （米国のみ） ファウエル，スティーブン イー． （米国のみ） ペピンスキー，アール．ビー． （米国のみ） （ii）発明の名称:TAT由来輸送ポリペプチド （iii）配列数:63 （iv）連絡住所 （Ａ）住所人：フィッシュ アンド ニーブ （Ｂ）番地：アベニュー オブ ジ アメリカ
ズ 1251 （Ｃ）市：ニューヨーク （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号:10020 （ｖ）コンピューター読み出し形態： （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC互換用 （Ｃ）OS:PC−DCS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース
＃1.0、バージョン＃1.25 （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先願データ： （Ａ）出願番号:US 07/934,375 （Ｂ）出願日:1992年８月21日 （viii）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：ハーレー ジュニア.,ジェイムズ
エフ． （Ｂ）登録番号:27,794 （Ｃ）照会／記録暗号:B170CIP （ix）電話回線情報： （Ａ）電話：（212）596−9000 （Ｂ）テレファックス：（212）596−9090 （Ｃ）テレックス:14−8367 （２）配列番号:1の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:86アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （vi）起源： （Ａ）生物名：ヒト 免疫不全ウイルス （Ｆ）株名:1型 （xi）配列：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:36アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:22アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:24アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:15アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:15アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:56アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:39塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:8: （２）配列番号:9の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ:39塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノム） （xi）配列：配列番号:9: （２）配列番号:10の情報： 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フロントページの続き (72)発明者 ペピンスキー，アール．ブレイク アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02174，アーリントン，フォルマス ロ ード 30 (56)参考文献 特表 平５−505102（ＪＰ，Ａ)

Claims (29)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸
    送部分とからなる融合タンパク質であって、 （ａ）輸送部分が： （ｉ）HIV tatタンパク質のアミノ酸49−57の存在； （ii）HIV tatタンパク質のアミノ酸22−36の不在；お
    よび、 （iii）HIV tatタンパク質のアミノ酸73−86の不在；で
    特徴付けられ、そして、 （ｂ）カーゴ部分が輸送部分依存性の細胞内送達後に有
    意な生物学的活性を維持する、融合タンパク質。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の融合タンパク質であっ
    て、前記カーゴ部分が、治療用分子、予防用分子、およ
    び診断用分子からなる群より選択される、融合タンパク
    質。
  3. 【請求項３】カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端輸
    送部分とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ部
    分が、標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するヒト
    パピローマウイルスE2リプレッサーからなり、そして該
    輸送部分が： （ａ）HIV tatタンパク質のアミノ酸47−58（配列番号:
    47）； （ｂ）HIV tatタンパク質のアミノ酸47−72（配列番号:
    48）； （ｃ）HIV tatタンパク質のアミノ酸38−72（配列番号:
    49）；および、 （ｄ）HIV tatタンパク質のアミノ酸38−58（配列番号:
    50）； からなる群より選択される、融合タンパク質。
  4. 【請求項４】請求項３に記載の融合タンパク質であっ
    て、前記輸送部分の前にアミノ末端メチオニンがある、
    融合タンパク質。
  5. 【請求項５】請求項１から４のいずれかに記載の融合タ
    ンパク質であって、前記カーゴ部分がヒトパピローマウ
    イルスE2タンパク質のアミノ酸245−365（配列番号:5
    1）からなる、融合タンパク質。
  6. 【請求項６】融合タンパク質JB106（配列番号:38）。
  7. 【請求項７】融合タンパク質JB117（配列番号:59）。
  8. 【請求項８】融合タンパク質JB118（配列番号:60）。
  9. 【請求項９】融合タンパク質JB122（配列番号:63）。
  10. 【請求項１０】カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端
    輸送部分とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ
    部分が、標的細胞に送達後に生物学的活性を維持するウ
    シパピローマウイルスE2リプレッサーからなり、そして
    該輸送部分が： （ａ）HIV tatタンパク質のアミノ酸47−62（配列番号:
    52）；および、 （ｂ）HIV tatタンパク質のアミノ酸38−62（配列番号:
    53）； からなる群より選択される、融合タンパク質。
  11. 【請求項１１】請求項10に記載の融合タンパク質であっ
    て、前記輸送タンパク質の前にアミノ末端メチオニンが
    ある、融合タンパク質。
  12. 【請求項１２】請求項１、２、10、または11のいずれか
    に記載の融合タンパク質であって、前記カーゴ部分が、
    ウシパピローマウイルスE2タンパク質のアミノ酸250−4
    10（配列番号:56）からなるE2リプレッサーである、融
    合タンパク質。
  13. 【請求項１３】融合タンパク質JB119（配列番号:61）。
  14. 【請求項１４】融合タンパク質JB120（配列番号:62）。
  15. 【請求項１５】輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とか
    らなる共有結合した化学的複合体であって： （ａ）複合体の輸送ポリペプチド部分が： （ｉ）HIV tatタンパク質のアミノ酸49−57の存在； （ii）HIV tatタンパク質のアミノ酸22−36の不在；お
    よび、 （iii）HIV tatタンパク質のアミノ酸73−86の不在；で
    特徴付けられ、そして、 （ｂ）複合体のカーゴ部分が、輸送部分依存性の細胞内
    送達後に有意な生物学的活性を維持する、化学的複合
    体。
  16. 【請求項１６】請求項15に記載の共有結合した化学的複
    合体であって、前記輸送ポリペプチド部分が、HIV tat
    タンパク質のアミノ酸37−72（配列番号:2）からなる、
    化学的複合体。
  17. 【請求項１７】請求項16に記載の共有結合した化学的複
    合体であって、前記カーゴ部分が： （ａ）ヒトパピローマウイルスE2タンパク質のアミノ酸
    245−365（配列番号:51）；および、 （ｂ）ヒトパピローマウイルスE2タンパク質のアミノ酸
    245−365（ここでアミノ酸300および309はシステインに
    置換している）（配列番号:55）、 からなる群より選択される、化学的複合体。
  18. 【請求項１８】輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とか
    らなる共有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリ
    ペプチド部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37−72
    （配列番号:2）からなり、そして該カーゴ部分が： （ａ）ヒトパピローマウイルスE2タンパク質のアミノ酸
    245−365（配列番号:51）；および、 （ｂ）ヒトパピローマウイルスE2タンパク質のアミノ酸
    245−365（ここでアミノ酸300および309がシステインに
    置換している）（配列番号:55）、 からなる群より選択される、化学的複合体。
  19. 【請求項１９】カルボキシ末端カーゴ部分とアミノ末端
    輸送部分とからなる融合タンパク質であって、該カーゴ
    部分がHSV VP16タンパク質のアミノ酸43−412からな
    り、そして該輸送部分がHIV tatタンパク質のアミノ酸4
    7−58からなる、融合タンパク質。
  20. 【請求項２０】請求項19に記載の融合タンパク質であっ
    て、前記輸送部分の前にアミノ末端メチオニンがある、
    融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】輸送ポリペプチド部分とカーゴ部分とか
    らなる共有結合した化学的複合体であって、該輸送ポリ
    ペプチド部分が、HIV tatタンパク質のアミノ酸37−72
    （配列番号:2）からなり、そして該カーゴ部分が： （ａ）オリゴヌクレオチドNF2（配列番号:44）にアニー
    ルするオリゴヌクレオチドNF1（配列番号:43）、およ
    び、 （ｂ）オリゴヌクレオチドNF4（配列番号:46）にアニー
    ルするオリゴヌクレオチドNF3（配列番号:45）、 からなる群より選択される、化学的複合体。
  22. 【請求項２２】次の： （ａ）JB106（配列番号:38）、 （ｂ）JB117（配列番号:59）、 （ｃ）JB118（配列番号:60）、 （ｄ）JB119（配列番号:61）、 （ｅ）JB120（配列番号:62）、および、 （ｆ）JB122（配列番号:63）、 からなる群より選択される融合タンパク質をコードする
    ヌクレオチド配列を含む、DNA分子。
  23. 【請求項２３】融合タンパク質tat−VP16R.GF（配列番
    号:58）をコードするヌクレオチド配列を含むDAN分子。
  24. 【請求項２４】請求項22に記載のDNA分子であって、前
    記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、発
    現制御配列に作動可能に連結している、DNA分子。
  25. 【請求項２５】請求項23に記載のDNA分子であって、前
    記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、発
    現制御配列に作動可能に連結している、DNA分子。
  26. 【請求項２６】請求項24に記載のDNA分子で形質転換し
    た単細胞性宿主。
  27. 【請求項２７】請求項25に記載のDNA分子で形質転換し
    た単細胞性宿主。
  28. 【請求項２８】次の、 （ａ）JB106（配列番号:38）、 （ｂ）JB117（配列番号:59）、 （ｃ）JB118（配列番号:60）、 （ｄ）JB119（配列番号:61）、 （ｅ）JB120（配列番号:62）、および、 （ｆ）JB122（配列番号:63）、 からなる群より選択される融合タンパク質を生成する方
    法であって、 該方法が以下の工程： （ａ）請求項26に記載の形質転換した単細胞性宿主を培
    養する工程；および、 （ｂ）該培養から融合タンパク質を回収する工程、 を包含する、方法。
  29. 【請求項２９】HIV tatタンパク質のアミノ酸47−58に
    続くHSV VP16タンパク質のアミノ酸43−412からなる融
    合タンパク質を生成する方法であって、 該方法が以下の工程： （ａ）請求項27に記載の形質転換した単細胞性宿主を培
    養する工程；および、 （ｂ）該培養から融合タンパク質を回収する工程、 を包含する、方法。
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