JP2023545521A

JP2023545521A - 抗ｐｄ－１／ｃｄ４０二重特異性抗体及びその使用

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Publication number: JP2023545521A
Application number: JP2023523084A
Authority: JP
Inventors: バイホンリュウ; ユイヤン; ユエレイシェン
Original assignee: ユーキュア（ベイジン）バイオファーマカンパニーリミテッド
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2021-10-13
Publication date: 2023-10-30
Also published as: CA3197463A1; CN116390755A; EP4229096A1; EP4229096A4; MX2023004275A; WO2022078357A1; BR112023006989A2; IL302042A; US20230220082A1; AU2021359495A1; KR20230092932A

Abstract

本開示は、抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体又はその抗原結合断片）に関し、ここで当該抗原結合タンパク質構築物は、２つの異なる抗原（例えば、ＰＤ－１及びＣＤ４０）に特異的に結合する。【選択図】図１Ｂ

Description

［優先権の主張］
本願は、２０２０年１０月１４日に提出されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１２０９１８及び２０２１年４月２日に提出されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８５３３５の利益を主張するものである。これらの２つの特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体又はその抗原結合断片）に関する。

二重特異性抗体は、２つの異なるタイプの抗原又は２つの異なるエピトープに同時に結合することができる人工タンパク質である。このような二重特異性は、腫瘍細胞へのＴ細胞のリダイレクト、異なる疾患媒体の二重標的化、及び標的部位へのペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）の送達を含む、広範な応用を切り開く。カツマキソマブ（ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ、抗ＥｐＣＡＭ及び抗ＣＤ３）及びブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３）の承認は、二重特異性抗体研究開発の重要なマイルストーンとなっている。

二重特異性抗体は、様々な用途を有する。従って、二重特異性抗体に基づく様々な治療剤の開発を継続する必要がある。

本開示は、２つ以上の異なる抗原（例えば、ＰＤ－１及びＣＤ４０）に特異的に結合する抗原結合タンパク質構築物に関する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＰＤ－１及びＣＤ４０を標的とする二重特異性抗体である。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体は、様々な機序によってがんを効果的に治療する。例えば、二重特異性抗体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断し、それによって免疫応答を活性化することができる。更に、二重特異性抗体は、Ｔ細胞及びＡＰＣ細胞を架橋して抗原提示を促進し、ＡＰＣ細胞におけるＣＤ４０経路を活性化することができる。更に、二重特異性抗体は、ＰＤ－１依存的な方式でＣＤ４０経路を活性化し、それによって腫瘍微小環境又は腫瘍排出リンパ節内の免疫応答シグナルを増幅することができる。当該機序はまた、全体的な免疫活性化を低下させ、肝臓における毒性などの副作用を減少させることができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体は、Ｆｃ受容体媒介性（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ媒介性）ＣＤ４０凝集（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）によってＣＤ４０経路を活性化することができず、それによって高レベルのＦＣγＲＩＩＢを発現する組織（例えば、肝臓）における毒性などの毒性を更に低減することができる。

一態様において、本開示は、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む、抗原結合タンパク質構築物を提供する。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＰＤ－１を発現する細胞に結合するときにＣＤ４０経路の活性化を誘導する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＰＤ－１を発現する１つ又は複数の細胞の存在下でＣＤ４０経路の活性化を誘導する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、腫瘍微小環境又は腫瘍排出リンパ節においてＣＤ４０経路の活性化を誘導する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＰＤ－１を発現する１つ又は複数の細胞の非存在下でＣＤ４０経路の活性化を誘導しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＣＤ４０経路を活性化することができ、ここで、ＣＤ４０経路の活性化は、抗原結合タンパク質構築物とＰＤ－１を発現する細胞との結合に依存する。

幾つかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、ＰＤ－１を発現する細胞に結合する。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１を発現する細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又は骨髄細胞（例えば、Ｔ細胞）である。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１を発現する細胞は、Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は、骨髄系細胞（例えば、マクロファージ、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）又はＴ細胞）である。

幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、ＣＤ４０を発現する細胞に結合する。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０を発現する細胞は、抗原提示細胞である。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、Ｆｃ領域に連結される。幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、Ｆｃ領域のＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ）媒介性機序又はＦｃ受容体（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ）媒介性凝集によってＣＤ４０を活性化することができない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ）媒介性凝集を誘導することができない。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、二重特異性抗体である。

幾つかの実施形態において、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１に特異的に結合する抗原結合部位は、ＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）又はその可溶性部分を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位は、ＣＤ４０リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）又はその可溶性部分を含む。

幾つかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、本明細書に記載される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、本明細書に記載される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。

幾つかの実施形態において、ＰＤ－１リガンドは、配列番号１５９のアミノ酸１９～２３８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０リガンドは、配列番号１６０のアミノ酸４７～２６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。

一態様において、本開示は、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域と、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域と、を含む抗原結合タンパク質構築物に関し、幾つかの実施形態において、当該第１の重鎖可変領域と当該第１の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、幾つかの実施形態において、当該第２の重鎖可変領域と当該第２の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、第１の重鎖可変領域、第１の重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び第１の重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む第１のポリペプチドと、第２の重鎖可変領域、第２の重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び第２の重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む第２のポリペプチドと、を含む。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、第１の軽鎖可変領域を含む第３のポリペプチドと、第２の軽鎖可変領域を含む第４のポリペプチドと、を含む。

幾つかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の軽鎖可変領域を更に含む。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、第１の軽鎖可変領域を含む第３のポリペプチドを含む。

幾つかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域を更に含む。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、第１の重鎖可変領域、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、第１の軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチドと、を含む。

幾つかの実施形態において、第１のポリペプチドは、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を更に含む。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）は、ＣＤＲ１、２及び３を含む。幾つかの実施形態において、ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、

（３）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、８及び９に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１１及び１２に示され、

（４）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、２６及び２７に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２８、２９及び３０に示され、

（５）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、１４及び１５に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、１７及び１８に示され、及び

（６）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１、３２及び３３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４、３５及び３６に示される。

幾つかの実施形態において、第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）は、ＣＤＲ１、２及び３を含む。幾つかの実施形態において、ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）は、ＣＤＲ１、２及び３を含む。幾つかの実施形態において、ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、選択されたVH2 CDR1、2及び3アミノ酸配列及び選択されたVL2 CDR1、2及び3アミノ酸配列は、以下の何れかである：

（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５９、６０及び６１に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６２、６３及び６４に示され、

（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７７、７８及び７９に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８０、８１及び８２に示され、

（３）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、

（４）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示され、

（５）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７１、７２及び７３に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７４、７５及び７６に示され、及び
（６）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８９、９０及び９１に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号９２、９３及び９４に示される。
幾つかの実施形態において、本開示は、抗原結合タンパク質構築物に関し、ここで、
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、又は
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号４０、４１、４２又は５３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号４３、４４、４５又は５４と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号４６、４７、４８、４９又は５５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号５０、５１、５２又は５６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号５７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番号９８、９９、１００又は１２０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４又は１２１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１２２、１２６又は１２８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１０９、１１０、１１１、１２３、１２７又は１２９と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番号１１２、１１３、１１４、１１５又は１２４と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１１６、１１７、１１８、１１９又は１２５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２の重鎖可変領域は、配列番号１０８又は１２６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１１０又は１２７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第３のポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第２のポリペプチドは、配列番号１３２又は１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１３２又は１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第３のポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号１３４又は１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号１３７又は１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃである。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＴｒｉｏＭａｂ、共有軽鎖を有する二重特異性抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂ、２：１ＣｒｏｓｓＭａｂ、２：２ＣｒｏｓｓＭａｂ、Ｄｕｏｂｏｄｙ、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＩｇＧ形態抗体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ形態抗体、ＴＦ、ＡＤＡＰＴＩＲ、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）、ＢｉＴＥ－Ｆｃ、二重親和性再標的抗体（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ（Ｆｃを有するＤＡＲＴ）、四価ＤＡＲＴ、タンデム二重抗体（ＴａｎｄＡｂ）、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、ＩｍｍＴＡＣ、三重特異性ナノボディ又は三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）である。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来する１つ又は複数の重鎖定常ドメインを含む。

幾つかの実施形態において、当該１つ又は複数の重鎖定常ドメインは、ＬＡＬＡ突然変異及び／又はノブイントホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ，ＫＩＨ）突然変異を含む。

一態様において、本開示は、第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、第２の重鎖可変領域を含む第２の重鎖ポリペプチドと、第２の軽鎖可変領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、を含む二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関する。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域と第１の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、第２の重鎖可変領域と第２の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。

幾つかの実施形態において、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）と、ＣＤＲ１、２及び３を含む第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）と、ＣＤＲ１、２及び３を含む第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）と、を含む二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関し、幾つかの実施形態において、当該ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、当該ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、当該ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、当該ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、及び
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

一態様において、本開示は、第１の重鎖可変領域を含む重鎖ポリペプチドと、第１の軽鎖可変領域を含む軽鎖ポリペプチドと、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む一本鎖可変断片ポリペプチドと、を含む二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関する。幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域と第１の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、第２の重鎖可変領域と第２の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。

幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の重鎖可変領域と、リンカーペプチド配列と、第２の軽鎖可変領域と、重鎖定常領域２（ＣＨ２）と、重鎖定常領域３（ＣＨ３）と、を含む。

幾つかの実施形態において、リンカーペプチド配列は、ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５２）と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、本開示は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）と、ＣＤＲ１、２及び３を含む第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含む第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）と、ＣＤＲ１、２及び３を含む第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）と、を含む本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関し、幾つかの実施形態において、当該ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、当該ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、当該ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、幾つかの実施形態において、当該ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：

（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、及び

（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される。

幾つかの実施形態において、本開示は、二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関し、ここで、
（１）重鎖ポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、且つ
（２）一本鎖可変断片ポリペプチドは、配列番号１３２又は１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

一態様において、本開示は、第１の重鎖可変領域を含む重鎖ポリペプチドと、第１の軽鎖可変領域を含む軽鎖ポリペプチドと、を含む二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関する。幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ポリペプチドは、重鎖ポリペプチドのＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ポリペプチドは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域と、を含む。幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域と第１の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、且つ第２の重鎖可変領域と第２の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。

幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ポリペプチドは、第１のリンカーペプチド配列によって第１の重鎖ポリペプチドに連結される。

幾つかの実施形態において、第１のリンカーペプチド配列は、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５３）と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の軽鎖可変領域と、第２のリンカーペプチド配列と、第２の重鎖可変領域と、を含む。

幾つかの実施形態において、第２のリンカーペプチド配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５４）と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。

（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、且つ選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される。

幾つかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関し、ここで、
（１）重鎖ポリペプチドは、配列番号１３４又は１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、及び
（２）軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片に関し、ここで、

（１）重鎖ポリペプチドは、配列番号１３７又は１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、及び

（２）軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

一態様において、本開示は、Ｆｃ領域を含む抗ＰＤ－１抗体と、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位とを含む二重特異性抗体を提供する。幾つかの実施形態において、抗原結合部位は、抗ＰＤ－１抗体のＦｃ領域に連結される。

幾つかの実施形態において、二重特異性抗体は、ＰＤ－１を発現する１つ又は複数の細胞の存在下で免疫細胞におけるＣＤ４０経路の活性化を誘導する。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、ＣＤ４０リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）又はその可溶性部分を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、Ｆｃ領域のＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、Ｆｃ領域（例えば、３Ａ部位）に挿入される。

一態様において、本開示は、Ｆｃ領域を含有する抗体と、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位（例えば、１つ又は２つの抗原結合部位）と、を含むか、又はそれらからなる抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体又はその抗原結合断片）を提供し、ここで、当該抗体は、標的に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合部位は、抗体のＦｃ領域に連結される。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、標的を発現する１つ又は複数の細胞の存在下で免疫細胞におけるＣＤ４０経路の活性化を誘導する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＣＤ４０経路を活性化することができる。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０経路の活性化は、抗原結合タンパク質構築物と標的を発現する細胞との結合に依存する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、腫瘍微小環境又は腫瘍排出リンパ節においてＣＤ４０経路の活性化を誘導する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、標的を発現する１つ又は複数の細胞の非存在下でＣＤ４０経路の活性化を誘導しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ受容体媒介性機序又はＦｃ受容体媒介性凝集によってＣＤ４０経路を活性化することができない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＰＤ－１を発現する細胞の非存在下でＣＤ４０経路を活性化することができない。

幾つかの実施形態において、標的は、免疫チェックポイント分子である。幾つかの実施形態において、標的は、がん特異的抗原又はがん関連抗原である。幾つかの実施形態において、標的は、ＰＤ－１である。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、ＣＤ４０リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）又はその可溶性部分を含む。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、Ｆｃ領域のＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位は、Ｆｃ領域（例えば、３Ａ部位）に挿入される。

一態様において、本開示は、治療剤に共有結合する本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物又は本明細書に記載される二重特異性抗体又は抗原結合断片を含む、抗体薬物複合体に関する。

幾つかの実施形態において、治療剤は、細胞毒性剤又は細胞阻害剤である。

一態様において、本開示は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物、本明細書に記載される二重特異性抗体又は抗原結合断片、又は本明細書に記載される抗体薬物複合体を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む、がんに罹患している対象を治療する方法に関する。

幾つかの実施形態において、対象は、固形腫瘍に罹患している。

幾つかの実施形態において、がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、黒色腫、膀胱がん、胃がん、尿路上皮がん、メルケル細胞がん（Ｍｅｒｋｅｌ－ｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）又は結腸直腸がんである。

幾つかの実施形態において、がんは、黒色腫、膵臓がん、中皮腫又は悪性血液腫瘍である。

幾つかの実施形態において、方法は、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｈｅｒ２抗体又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする抗体を対象に投与することを更に含む。

幾つかの実施形態において、方法は、対象に化学療法を投与することを含む。
一態様において、本開示は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物、本明細書に記載される二重特異性抗体又は抗原結合断片、又は本明細書に記載される抗体薬物複合体を含む有効量の組成物を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍の増殖速度を低下させる方法に関する。

一態様において、本開示は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物、本明細書に記載される二重特異性抗体又は抗原結合断片、又は本明細書に記載される抗体薬物複合体を含む有効量の組成物を必要とする対象に投与することを含む、腫瘍細胞を死滅させる方法に関する。

一態様において、本開示は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物或いは本明細書に記載される二重特異性抗体又は抗原結合断片、及び薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物に関する。

一態様において、本開示は、本明細書に記載される抗体薬物複合体、及び薬学的に許容されるベクターを含む医薬組成物に関する。

一態様において、本開示は、ＣＤ４０に特異的に結合する一本鎖可変断片ポリペプチドを含む二重特異性又は多重特異性抗体又はその抗原結合断片に関する。幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ポリペプチドは、二重特異性又は多重特異性抗体又はその抗原結合断片の重鎖ポリペプチドのＣ末端に連結される。

幾つかの実施形態において、二重特異性又は多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、がん特異的抗原又はがん関連抗原に特異的に結合する。

幾つかの実施形態において、二重特異性又は多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。

一態様において、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドの何れかをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。幾つかの実施形態において、核酸は、二重特異性抗体をコードする。幾つかの実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡである。

一態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸のうちの１つ又は複数を含むベクターを提供する。

一態様において、本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む細胞を提供する。幾つかの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸のうちの１つ又は複数を含む細胞を提供する。

本明細書で使用されるように、用語「抗原結合タンパク質構築物」は、（ｉ）１つ又は複数の抗原結合ドメインを含む単一ポリペプチド又は（ｉｉ）１つ又は複数の抗原結合ドメインを共に形成する２つ以上のポリペプチド（例えば、同一又は異なるポリペプチド）の複合体である。本明細書では、抗原結合タンパク質構築物の非限定的な例及び態様が記載される。

本明細書で使用されるように、用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」又は「抗原結合部位」とは、抗原に特異的に結合することができる１つ又は複数のタンパク質ドメイン（例えば、単一ポリペプチド由来のアミノ酸から形成されるか又は２つ以上のポリペプチド（例えば、同一又は異なるポリペプチド）由来のアミノ酸から形成される）を指す。幾つかの実施形態において、抗原結合ドメインは、天然に存在する抗体の特異性及び親和性と類似の特異性及び親和性で抗原又はエピトープに結合することができる。幾つかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体又はその断片であってもよい。抗原結合ドメインの一例は、ＶＨ－ＶＬ二量体から形成される抗原結合ドメインである。幾つかの実施形態において、抗原結合ドメインは、代替骨格を含むことができる。幾つかの実施形態において、抗原結合ドメインは、リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１５４又はその可溶性部分）である。例えば、抗原は、ＰＤ－１受容体であってもよく、且つ抗原結合ドメイン（例えば、ＰＤ－Ｌ１の可溶性部分）は、ＰＤ－１受容体に特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである。本明細書では、抗原結合ドメインの非限定的な例が記載される。

本明細書で使用されるように、用語「抗体」とは、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、免疫グロブリン軽鎖由来の３つのＣＤＲの何れか、又は免疫グロブリン重鎖由来の３つのＣＤＲの何れか）を含み、且つ抗原又はエピトープに特異的に結合することができる任意の抗原結合分子を指す。抗体の非限定的な例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、キメラ抗体、重鎖抗体、単一ドメイン抗体（ナノボディ）、ヒト抗体及びヒト化抗体を含む。幾つかの実施形態において、抗体は、ヒト抗体のＦｃ領域を含むことができる。抗体という用語は、誘導体、例えば二重特異性抗体、一本鎖抗体、二重抗体、直鎖抗体及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を更に含む。

本明細書で使用されるように、用語「抗原結合断片」とは、完全長抗体の一部を指し、ここで、当該抗体の当該部分は、抗原に特異的に結合することができる。幾つかの実施形態において、抗原結合断片は、少なくとも１つの可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメイン）を含む。抗体断片の非限定的な例は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片及びＶＨＨを含む。本明細書で使用されるように、「ＶＨＨ」は、重鎖抗体の可変ドメインである。

本明細書で使用されるように、用語「ヒト抗体」とは、ヒト由来の核酸（例えば、再配列されたヒト免疫グロブリン重鎖又は軽鎖遺伝子座）によってコードされる抗体を指す。幾つかの実施形態において、ヒト抗体は、ヒトから収集されるか又はヒト細胞培養物（例えば、ヒトハイブリドーマ細胞）において産生される。幾つかの実施形態において、ヒト抗体は、非ヒト細胞（例えば、マウス又はハムスター細胞株）において産生される。幾つかの実施形態において、ヒト抗体は、細菌又は酵母細胞において産生される。幾つかの実施形態において、ヒト抗体は、再配列されていないか又は再配列されているヒト免疫グロブリン遺伝子座（例えば、重鎖又は軽鎖ヒト免疫グロブリン遺伝子座）を含むトランスジェニック非ヒト動物（例えば、ウシ）において産生される。

本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有し、且つヒト免疫グロブリンに由来する配列を含有する非ヒト抗体を指す。非限定的な例では、ヒト化抗体は、ヒト抗体（受容体抗体）であり、ここで、当該受容体抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ）残基は、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト抗体（例えば、ドナー抗体）、例えばマウス、ラット又はウサギ抗体由来の超可変領域（例えば、ＣＤＲ）残基で置換されている。幾つかの実施形態において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン残基で置換されている。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、受容体抗体又はドナー抗体に見出されていない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能を更に改善するために行うことができる。幾つかの実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、通常２つの可変ドメインの実質的に全ての部分を含み、ここで、全て又は実質的に全ての超可変ループ（ＣＤＲ）は、非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリンの超可変ループに対応し、且つ全て又は実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を更に含むことができる。ヒト化抗体は、当該技術分野で公知の分子生物学的方法を用いて産生することができる。本明細書では、ヒト化抗体を産生するための方法の非限定的な例が記載される。

本明細書で使用されるように、用語「キメラ抗体」は、少なくとも２つの異なる種に存在する配列を含む抗体（例えば、ヒト及びマウス抗体のような２つの異なる哺乳動物種由来の抗体）を指す。キメラ抗体の非限定的な例は、非ヒト（例えば、マウス）抗体の可変ドメイン配列（例えば、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメイン配列の全て又は一部）と、ヒト抗体の定常ドメインとを含む抗体である。キメラ抗体の他の例は、本明細書に記載されており、当該技術分野で公知である。

本明細書で使用されるように、用語「多重特異性抗原結合タンパク質構築物」は、２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する２つ以上の異なる抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質構築物である。２つ以上の異なるエピトープは、同じ抗原（例えば、細胞表面上に存在する単一のポリペプチド）上又は異なる抗原（例えば、同一細胞表面上に存在するか又は異なる細胞表面上に存在する異なるタンパク質）上のエピトープであってもよい。幾つかの態様において、多重特異性抗原結合タンパク質構築物は、２つの異なるエピトープに結合する（即ち、「二重特異性抗原結合タンパク質構築物」）。幾つかの態様において、多重特異性抗原結合タンパク質構築物は、３つの異なるエピトープに結合する（即ち、「三重特異性抗原結合タンパク質構築物」）。幾つかの態様において、多重特異性抗原結合タンパク質構築物は、４つの異なるエピトープに結合する（即ち、「四重特異性抗原結合タンパク質構築物」）。幾つかの態様において、多重特異性抗原結合タンパク質構築物は、５つの異なるエピトープに結合する（即ち、「五重特異性抗原結合タンパク質構築物」）。各結合特異性は、任意の適切な価数で存在してもよい。本明細書では、多重特異性抗原結合タンパク質構築物の非限定的な例が記載される。

本明細書で使用されるように、用語「二重特異性抗体」とは、２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。エピトープは、同一抗原上又は異なる抗原上にあってもよい。

本明細書で使用されるように、抗体に言及する場合、語句「特異的結合」とは、相互作用が標的分子上の特定の構造（即ち、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存するので、他の分子と比較して、抗体がその標的分子（例えば、ＰＤ－１）と優先的に相互作用することを指し、換言すれば、試薬は、通常の場合の全ての分子ではなく、特定の構造を含む分子を認識して結合する。標的分子に特異的に結合する抗体は、標的特異的抗体と呼ばれることができる。例えば、ＰＤ－１分子に特異的に結合する抗体は、ＰＤ－１特異的抗体又は抗ＰＤ－１抗体と呼ばれることができる。

特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術と科学用語は当業者の一般的な理解と同じ意味を有する。本明細書では、本発明のための方法及び材料が記載され、当該技術分野で公知の他の適切な方法及び材料も使用することができる。材料、方法及び実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図していない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合は、本明細書（定義を含む）に準ずる。

本発明の他の特徴及び利点は、以下の特定の実施形態及び添付の図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

二重特異性抗体Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧの概略構造である。二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧの概略構造である。Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４のゲル電気泳動結果を示す。Ｍはｍａｒｋｅｒである。Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４はレーン２にある。ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４のゲル電気泳動結果を示す。Ｍはｍａｒｋｅｒである。ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４はレーン３にある。抗ＰＤ１抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（ＰＤ－１）、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４又はＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４による活性化後のＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＰＤ－１細胞における発光レベルを示す。抗体はＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断し、それによってＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＰＤ－１細胞を活性化する。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＰＤ－１抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４と抗ＣＤ４０抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の１：１比の組み合わせ（ＰＤ－１＋ＣＤ４０）、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４からなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＰＤ－１抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４と抗ＣＤ４０抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の１：１比の組み合わせ（ＰＤ－１＋ＣＤ４０）、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４からなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢ及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（ＣＤ４０）、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４からなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（ＣＤ４０）、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡからなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１細胞及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（ＣＤ４０）、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡからなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢ細胞及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（ＣＤ４０）、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡからなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。マウス結腸がん細胞ＭＣ３８を注射し、且つ二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４又はＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡで処理したＢ－ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。マウス結腸がん細胞ＭＣ３８を注射し、且つ二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４又はＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡで処理したＢ－ｈＣＤ４０マウスの体重変化率の経時変化を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。マウス結腸がん細胞ＭＣ３８を注射し、且つ二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４又はＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡで処理した異なる群のＢ－ｈＣＤ４０マウスの平均腫瘍体積を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重変化率の経時変化を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの平均腫瘍体積を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞で注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の２５日目の平均腫瘍体積を示す。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重変化率の経時変化を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの平均腫瘍体積を示す図である。生理食塩水（ＰＳ）溶液を対照として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の７日目のマウス血液ＡＬＴレベルを示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の１３日目のマウス血液ＡＬＴレベルを示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の７日目のマウス血液ＡＳＴレベルを示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の１３日目のマウス血液ＡＳＴレベルを示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つＰＢＳで処理したＧ１群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにおけるマウス肝臓及び腎臓の代表的な組織学的切片画像を示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つセリクレルマブ（Ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）で処理したＧ２群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにおけるマウス肝臓及び腎臓の代表的な組織学的切片画像を示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２で処理したＧ３群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにおけるマウス肝臓及び腎臓の代表的な組織学的切片画像を示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４で処理したＧ４群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにおけるマウス肝臓及び腎臓の代表的な組織学的切片画像を示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４で処理したＧ５群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにおけるマウス肝臓及び腎臓の代表的な組織学的切片画像を示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４と抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２との組み合わせ（Ｃｏｍｂｏ）で処理したＧ１群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにおけるマウス肝臓及び腎臓の代表的な組織学的切片画像を示す。二重特異性抗体ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａの概略構造である。ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａのゲル電気泳動結果を示す。Ｍはｍａｒｋｅｒである。ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａはレーン４にある。ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢ細胞及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（ＣＤ４０）、Ｆａｂ－ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４及びＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａからなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ－１細胞（ＣＨＯＰＤ－１）及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４と抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２との組み合わせ（ＰＤ－１＋ＣＤ４０）、Ｆａｂ－ＳｃＦｖ－ＩｇＧ４及びＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａからなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される抗ＰＤ１抗体２５－１Ａ７、１８－３Ｆ１及び３－６Ｇ１のＣＤＲ配列を示す。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによって定義される抗ＰＤ１抗体２５－１Ａ７、１８－３Ｆ１及び３－６Ｇ１のＣＤＲ配列を示す。ヒト、マウス及びキメラＰＤ－１のアミノ酸配列を示す。ヒト化及びマウス抗ＰＤ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ヒト化及びマウス抗ＰＤ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ヒト化及びマウス抗ＰＤ１抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される抗ＣＤ４０抗体０３－７Ｆ１０、０６－６Ａ７及び０７－４Ｈ６のＣＤＲ配列を示す。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによって定義される抗ＣＤ４０抗体０３－７Ｆ１０、０６－６Ａ７及び０７－４Ｈ６のＣＤＲ配列を示す。ヒト、マウス及びキメラＣＤ４０のアミノ酸配列を示す。ヒト化及びマウス抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ヒト化及びマウス抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ヒト化及びマウス抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。ヒト化及びマウス抗ＣＤ４０抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照として注射する。Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ単一特異性又は二重特異性抗体で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照として注射する。Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡで処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス（Ｇ２－Ｇ７）の群分け後の７０日以内の腫瘍体積を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つ０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ２－Ｇ７）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の７０日以内の生存率を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ヒストグラムのセットであり、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、ＣＤ４５＋白血球中のマウスＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセント（Ｉ）、ＣＤ４５＋白血球中のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセント（ＩＩ）、及びＴ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞との比率（ＩＩＩ）を示す。ヒストグラムのセットであり、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のヒトＰＤ－１（ＣＤ２７９）陽性細胞のパーセント（Ｉ）、Ｔｒｅｇ細胞中のヒトＰＤ－１陽性細胞のパーセント（ＩＩ）、ＣＤ４＋（非Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞中のヒトＰＤ－１陽性細胞のパーセント（ＩＩＩ）、及びＮＫ細胞中のヒトＰＤ－１陽性細胞のパーセント（ＩＶ）を示す。ヒストグラムのセットであり、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、マウスＣＤ４５＋白血球中の樹状細胞（ＤＣ）のパーセント（Ｉ）、マウスＣＤ４５＋白血球中の骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）のパーセント（ＩＩ）、ＤＣ細胞中のＣＤ８０＋細胞のパーセント（ＩＩＩ）、及びＤＣ細胞中のＭＨＣＩＩ＋細胞のパーセント（ＩＶ）を示す。ヒストグラムのセットであり、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、ＣＤ４５＋白血球中のマウスＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセント（Ｉ）、ＣＤ４５＋白血球中のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセント（ＩＩ）、及びＴ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞との比率（ＩＩＩ）を示す。ヒストグラムのセットであり、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のヒトＰＤ－１（ＣＤ２７９）陽性細胞のパーセント（Ｉ）、Ｔｒｅｇ細胞中のヒトＰＤ－１陽性細胞のパーセント（ＩＩ）、ＣＤ４＋（非Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞中のヒトＰＤ－１陽性細胞のパーセント（ＩＩＩ）、及びＮＫ細胞中のヒトＰＤ－１陽性細胞のパーセント（ＩＶ）を示す。ヒストグラムのセットであり、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、マウスＣＤ４５＋白血球中の樹状細胞（ＤＣ）のパーセント（Ｉ）、マウスＣＤ４５＋白血球中の骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）のパーセント（ＩＩ）、ＤＣ細胞中ＣＤ８０＋細胞のパーセント（ＩＩＩ）、ＤＣ細胞中ＣＤ８６＋細胞のパーセント（ＩＶ）、及びＤＣ細胞中のＭＨＣＩＩ＋細胞のパーセント（Ｖ）を示す。フローサイトメトリー分析の戦略を示す。フローサイトメトリー分析の戦略を示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２－Ｇ４）、二重特異性抗体（Ｇ５及びＧ６）又は単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ７及びＧ８）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２－Ｇ４）、二重特異性抗体（Ｇ５及びＧ６）又は単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ７及びＧ８）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重変化の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２－Ｇ４）、二重特異性抗体（Ｇ５及びＧ６）又は単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ７及びＧ８）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、異なる構造を有する二重特異性抗体（Ｇ４－Ｇ７）又は二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ８）を注射したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、異なる構造を有する二重特異性抗体（Ｇ４－Ｇ７）又は二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ８）を注射したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重変化の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。二重特異性抗体１Ａ７－セリクレルマブ－ＤＡＲＴ－ＩｇＧ４のＤＡＲＴ－Ｆｃの概略構造である。ＤＡＲＴとは、二重親和性再標的抗体を指す。ＰＢＳ（Ｇ１）、モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、異なる構造を有する二重特異性抗体（Ｇ４－Ｇ７）又は二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ８）を注射した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の７日目のマウス血液ＡＬＴレベルを示す。ＰＢＳ（Ｇ１）、モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、異なる構造を有する二重特異性抗体（Ｇ４－Ｇ７）又は二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ８）を注射した異なる群のＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの群分け後の７日目のマウス血液ＡＳＴレベルを示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ４）又は二重特異性抗体（Ｇ５－Ｇ６）で処理したか、又は対照（Ｇ１）としてＰＢＳ溶液を注射したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ４）又は二重特異性抗体（Ｇ５－Ｇ６）で処理したか、又は対照（Ｇ１）としてＰＢＳ溶液を注射したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重変化の経時変化を示す図である。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）、単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ４）又は二重特異性抗体（Ｇ５－Ｇ６）で処理したか、又は対照（Ｇ１）としてＰＢＳ溶液を注射したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１細胞及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、ＢｓＡｂペムブロリズマブ－ｓｅｌｉ－ＨＣ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＫＨ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＤＡＲＴ－ＩｇＧ４、及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブ－ＩｇＧ２からなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。Ｊｕｒｋａｔ－ＰＤ１細胞及び選択された抗体が存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、ＢｓＡｂペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、ＳｄＡｂ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＡＰＸ００５Ｍ－ＩｇＧ１－Ｓ２６７Ｅ及び６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２からなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。Ｊｕｋａｔ－ｌｕｃ－ＰＤ１細胞及び選択された抗体が存在しない場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、ＢｓＡｂペムブロリズマブ－ｓｅｌｉ－ＨＣ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＫＨ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＤＡＲＴ－ＩｇＧ４、及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブ－ＩｇＧ２からなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。Ｊｕｋａｔ－ｌｕｃ－ＰＤ１細胞及び選択された抗体が存在しない場合、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞における発光レベルを示す。抗体は、ＢｓＡｂペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、ＳｄＡｂ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＡＰＸ００５Ｍ－ＩｇＧ１－Ｓ２６７Ｅ及び６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２からなる群より選ばれる。発光信号は相対光単位（Ｒｌｕ）として表される。ＰＤ１／ＣＤ４０二重特異性抗体によって誘導されるＣＤ４０シグナル伝達経路活性化の仮想機序を示す。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２、Ｇ３及びＧ４）、二重特異性抗体（Ｇ５－Ｇ７）又は単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ８及びＧ９）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。ＰＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２、Ｇ３及びＧ４）、二重特異性抗体（Ｇ５－Ｇ７）又は単一特異性抗体の組み合わせ（Ｇ８及びＧ９）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス体重変化の経時変化を示す図である。ＰＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つモノクローナル抗体（Ｇ２、Ｇ３及びＧ４）、二重特異性抗体（Ｇ５－Ｇ７）又は単一特異性抗体（Ｇ８及びＧ９）の組み合わせで処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４０マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。ＰＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ２及びＧ５）、アテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ３及びＧ６）又はアベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４及びＧ７）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４０マウスの体重の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ２及びＧ５）、アテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ３及びＧ６）又はアベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４及びＧ７）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４０マウス体重変化の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を注射し、且つＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ２及びＧ５）、アテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ３及びＧ６）又はアベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４及びＧ７）で処理したＢ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４０マウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。ＰＢＳ溶液を対照（Ｇ１）として注射する。本開示に記載の配列を示す。本開示に記載の配列を示す。本開示に記載の配列を示す。本開示に記載の配列を示す。本開示に記載の配列を示す。

二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、２つの異なるエピトープに（例えば、２つの異なる抗原で）同時に結合することができる人工タンパク質である。

幾つかの実施形態において、二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）を修飾することによって構築することができる。例えば、抗ＰＤ－１ＩｇＧのＦａｂ領域は、ＣＤ４０を標的とするｓｃＦｖドメインで置換されてもよい。或いは、ＣＤ４０を標的とするｓｃＦｖドメインは、抗ＰＤ－１ＩｇＧ重鎖のＣ末端に連結されることができる。

幾つかの実施形態において、二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、２本のアーム（アームＡ及びＢ）を有することができる。各アームは、１つの重鎖可変領域と１つの軽鎖可変領域とを有し、抗原結合ドメイン（又は抗原結合部位）を形成する。

二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ様及び非ＩｇＧ様であってもよい。ＩｇＧ様二重特異性抗体は、２本のＦａｂアーム及び１つのＦｃ領域を有してもよく、且つこの２本のＦａｂアームは、異なる抗原に結合する。非ＩｇＧ様二重特異性抗体又は抗原結合断片は、例えば化学的に連結されたＦａｂ（例えば、２つのＦａｂ領域が化学的に連結されている）及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であってもよい。例えば、ｓｃＦｖは、２つの重鎖可変領域と２つの軽鎖可変領域とを有することができる。幾つかの実施形態において、１本のアームは、ｓｃＦｖポリペプチドである。幾つかの実施形態において、２本のアームは、何れもｓｃＦｖポリペプチドである。

抗ＰＤ－１／ＣＤ４０抗原結合タンパク質構築物
免疫系は、体内の正常細胞と「外来」と考えられる細胞とを区別することができ、これにより、正常細胞に影響を及ぼすことなく、免疫系が外来細胞を攻撃することが可能になる。この機序は、免疫チェックポイントと呼ばれるタンパク質に関与することがある。免疫チェックポイントは、免疫系内のシグナルをオンにする分子（共刺激分子）又はオフにする分子である。

チェックポイント阻害剤は、免疫系が正常組織を攻撃するのを防止し、それによって自己免疫疾患を予防することができる。多くの腫瘍細胞もチェックポイント阻害剤を発現する。これらの腫瘍細胞は、特定の免疫チェックポイント経路（特に腫瘍抗原に特異的なＴ細胞において）を「取り込む」（ｃｏ－ｏｐｔ）ことで免疫モニタリングを回避する（Ｃｒｅｅｌａｎ，ＢｅｎｊａｍｉｎＣ．「Ｕｐｄａｔｅｏｎｉｍｍｕｎｅｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ」，ＣａｎｃｅｒＣｏｎｔｒｏｌ２１．１（２０１４年）：８０～８９ページ）。多くの免疫チェックポイントはリガンド－受容体相互作用によって開始されるため、それらはリガンド及び／又はその受容体に対する抗体によって容易に遮断される。

本開示は、本明細書に記載される様々な形態を有する抗ＰＤ１／ＣＤ４０抗原結合タンパク質構築物を提供する。理論に縛られることを望むものではないが、ＰＤ－１発現細胞の存在下で、ＰＤ１／ＣＤ４０二重特異性抗体は、ＣＤ４０シグナル伝達経路を効果的に活性化することができ、その機序は、ＣＤ４０がＰＤ－１発現細胞とＣＤ４０発現細胞の接触面に凝集することであり得ると想定される。二重特異性抗体は、接触表面におけるＣＤ４０及びＰＤ１分子の富化を促進することができる。この富化は、ＣＤ４０凝集を更に増加させ、それによってＣＤ４０経路を活性化する。

ＰＤ－１
ＰＤ－１（プログラム死－１）は、免疫チェックポイントがリンパ節における抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を促進しながら制御性Ｔ細胞（抗炎症性、抑制性Ｔ細胞）のアポトーシスを減少させるという二重の機序で自己免疫を防御する。

ＰＤ－１は、主にＴ細胞及び初期Ｂ細胞表面に発現し、ＰＤ－１の２種類のリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）において広く発現されている。ＰＤ－１とそのリガンドとの相互作用は、免疫応答の負の調節において重要な役割を果たす。ＰＤ－１とそのリガンドとの結合を抑制することは、腫瘍細胞を免疫系の殺傷作用に曝すことができ、それによって腫瘍組織を殺傷し、がんを治療するという効果を達成することができる。

ＰＤ－Ｌ１は、多くの異なるがんの腫瘍細胞上に発現される。Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合することでその抑制をもたらし、ＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍細胞が免疫攻撃から逃れる主な機序である。概念的には、ＰＤ－Ｌ１の過剰発現は、２つの機序、即ち、先天性機序及び適応機序によって引き起こされることがある。がん細胞上のＰＤ－Ｌ１の内在的発現は、これらの腫瘍細胞における細胞／遺伝子異常と関連する。ＡＫＴ及びＳＴＡＴ経路を含む細胞シグナル伝達の活性化は、ＰＤ－Ｌ１発現の増加をもたらす。原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫において、ＭＨＣクラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２と遺伝子的に融合し、これらのタンパク質の過剰発現をもたらす。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２が位置する染色体９ｐ２３－２４の増幅は、古典的ホジキンリンパ腫におけるこれらの２種類のタンパク質の発現の増加をもたらす。適応機序は、腫瘍微小環境におけるＰＤ－Ｌ１発現の誘導に関連する。ＰＤ－Ｌ１は、インターフェロンγに応答して腫瘍細胞上で誘導され得る。マイクロサテライト不安定性結腸がんでは、ＰＤ－Ｌ１は主に腫瘍内の骨髄系細胞上で発現し、更に細胞傷害性Ｔ細胞の機能を抑制する。

抗腫瘍免疫を増強するためのＰＤ－１ブロックの使用は、ＰＤ－１相互作用の抑制がＴ細胞枯渇を逆転させた慢性感染モデルでの所見に由来する。同様に、ＰＤ－１を遮断するとＴ細胞ＰＤ－１／腫瘍細胞ＰＤ－Ｌ１又はＴ細胞ＰＤ－１／腫瘍細胞ＰＤ－Ｌ２の相互作用を抑制し、それによってＴ細胞媒介性抗腫瘍免疫を回復させる。

ＰＤ－１の詳細な説明、及び抗ＰＤ－１抗体のがん治療への応用はＴｏｐａｌｉａｎ，ＳｕｚａｎｎｅＬ．ら，「Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄｉｍｍｕｎｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｏｆａｎｔｉ？ＰＤ－１ａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｃａｎｃｅｒ」，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ３６６．２６（２０１２年）：２４４３－２４５４ページ；Ｈｉｒａｎｏ，Ｆｕｍｉｙａら，「ＢｌｏｃｋａｄｅｏｆＢ７－Ｈ１ａｎｄＰＤ－１ｂｙｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｍｍｕｎｉｔｙ」，Ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ６５．３（２００５年）：１０８９－１０９６ページ；Ｒａｅｄｌｅｒ，ＬｉｓａＡ．「Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）：ｆｉｒｓｔＰＤ－１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｐｐｒｏｖｅｄｆｏｒｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｔｒｅａｔｅｄｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅｏｒｍｅｔａｓｔａｔｉｃｍｅｌａｎｏｍａ」，Ａｍｅｒｉｃａｎｈｅａｌｔｈ＆ｄｒｕｇｂｅｎｅｆｉｔｓ８．ＳｐｅｃＦｅａｔｕｒｅ（２０１５年）９６；Ｋｗｏｋ，Ｇｅｒｒｙら，「Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）」，（２０１６年）：２７７７－２７８９ページ；ＵＳ２０１７０２４７４５４；ＵＳ９，８３４，６０６Ｂ；及びＵＳ８，７２８，４７４に記載されており、これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＣＤ４０
ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５又はＴＮＦＲＳＦ５とも呼ばれる）は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、Ｂ細胞及び単球などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び多くの非免疫細胞及び広範な腫瘍上に発現する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバーである。活性化されたＴヘルパー細胞上でのその三量体リガンドＣＤ１５４（ＣＤ４０リガンド又はＣＤ４０Ｌとも呼ばれる）との相互作用は、ＡＰＣ活性化をもたらし、それによって適応免疫を誘導する。

生理学的に、ＣＤ４０を介したＡＰＣ上でのシグナル伝達は、Ｔ細胞ヘルパーの主要な構成要素を代表すると考えられており、ヘルパーＴ細胞がＡＰＣを承認（ｌｉｃｅｎｓｅ）する能力を大きく媒介している。例えば、ＣＤ４０のＤＣへの連結は、共刺激分子及びＭＨＣ分子の表面発現の増加、炎症誘発性サイトカインの産生及びＴ細胞誘発の増強を誘導する。休止Ｂ細胞上のＣＤ４０の連結は、抗原提示機能及び増殖を増加させる。

前臨床モデルでは、ラット抗マウスＣＤ４０ｍＡｂは、ＣＤ４０＋Ｂ細胞リンパ腫の治療において顕著な治療活性を示し（８０％～１００％のマウスが治癒し、ＣＤ８Ｔ細胞依存的に免疫再攻撃される）、且つ様々なＣＤ４０陰性腫瘍に対しても有効である。これらのｍＡｂは、終末期に近い疾患に罹患しているマウスの大きな腫瘍を除去することができる。ＣＤ４０ｍＡｂは、臨床試験で研究されており、黒色腫、膵臓がん、中皮腫、血液悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、及び進行性固形腫瘍の治療に用いられている。

治療的抗ＣＤ４０抗体は、強力なアゴニストからアンタゴニストまでの様々な活性を示す。現在のところ、この異質性については満足のいく説明がなされていない。アゴニストＣＤ４０ｍＡｂの主な機構は、宿主ＡＰＣを活性化し、患者に臨床的に有意な抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導することである。これらの応答には、Ｔ細胞に依存しないがマクロファージに依存する腫瘍消退誘発が含まれる。ＣＤ４０活性化マクロファージは、少なくとも膵臓がんでは腫瘍間質の枯渇を促進し、それによって体内腫瘍崩壊を誘導する可能性もある、殺腫瘍細胞となり得る。重要なことに、これらの機序は、腫瘍がＣＤ４０を発現することを必要としないため、多くの臨床試験において多くの腫瘍患者を組み入れるという理由がある。これらの戦略の目的がＤＣ、マクロファージ、又はその両方を活性化することである場合、ＣＤ４０ｍＡｂの目的は、必ずしも、例えば補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によってそれらが結合した細胞を死滅させることであるとは限らない。従って、設計により、強いアゴニスト抗体は、ＣＤＣ又はＡＤＣＣを媒介しない。
対照的に、他のヒトＣＤ４０ｍＡｂは、ほぼ全てのＢ細胞悪性腫瘍、一部の黒色腫及び一部のがんなどのＣＤ４０＋腫瘍に対してＣＤＣ及びＡＤＣＣを媒介することができる。最後に、ＣＤ４０が腫瘍細胞に結合してアポトーシスを促進することを示す幾つかの証拠があり、これは免疫エフェクター経路を一切伴わずに行うことができる。これは、ＣＤ４０＋Ｂ細胞悪性腫瘍、並びにＣＤ４０＋がん及び黒色腫などの特定の固形腫瘍に適用できることが証明されている。

ＣＤ４０及びその機能の詳細な説明は、例えば、Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら，「ＡｇｏｎｉｓｔｉｃＣＤ４０ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ」，（２０１３年）：１０３５－１０４３ページ；Ｂｅａｔｔｙら，「ＣＤ４０ａｇｏｎｉｓｔｓａｌｔｅｒｔｕｍｏｒｓｔｒｏｍａａｎｄｓｈｏｗｅｆｆｉｃａｃｙａｇａｉｎｓｔｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｉｎｍｉｃｅａｎｄｈｕｍａｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３１．６０２４（２０１１年）：１６１２－１６１６ページ；Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅら，「ＣｌｉｎｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｅｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｉｎｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＣＰ－８７０，８９３，ａｎｏｖｅｌＣＤ４０ａｇｏｎｉｓｔｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ２５．７（２００７年）：８７６～８８３ページを参照することができ、これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

幾つかの実施形態において、本開示は、２つの異なる抗原（例えば、ＰＤ－１及びＣＤ４０）に特異的に結合する抗原結合構築物（例えば、二重特異性抗体）を提供する。幾つかの実施形態において、抗原結合構築物（例えば、二重特異性抗体）は、ＰＤ－１発現細胞（例えば、Ｔ細胞）及びＣＤ４０発現細胞（例えば、ＡＰＣ細胞）を架橋し、それによって抗原提示、ＣＤ４０連結及び／又はＴ細胞活性化を促進することができる。幾つかの実施形態において、抗原結合構築物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断し、それによって免疫応答を活性化することができる。幾つかの実施形態において、抗原結合構築物（例えば、二重特異性抗体）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）細胞（例えば、樹状細胞又はマクロファージ）におけるＣＤ４０経路を活性化し、抗腫瘍応答を誘導することができる。幾つかの実施形態において、抗原結合構築物（例えば、二重特異性抗体）によって誘導されるＣＤ４０活性化は、ＰＤ－１を発現する細胞の存在下でのみ（例えば、架橋効果によって）起こる。従って、抗原結合構築物（例えば、二重特異性抗体）は、全身免疫活性化を引き起こすことなく、局所腫瘍微小環境内で免疫応答を誘導することができ、これは、肝臓における毒性などの副作用を誘導することができる。更に、幾つかの実施形態において、抗原結合構築物（例えば、二重特異性抗体）は、Ｆｃ受容体（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ）媒介性ＣＤ４０凝集によってＣＤ４０経路を活性化することができない。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、高ＦＣγＲＩＩＢ発現組織、例えば肝臓及び／又は腎臓における毒性を更に低減する。

更に、腫瘍の下流に隣接するリンパ節（腫瘍排出リンパ節（ＴＤＬＮ））は、上流の腫瘍の存在により極めて大きな変化を生じることができる。腫瘍排出リンパ節（ＴＤＬＮ）は、ＰＤ－Ｌ１＋の従来の樹状細胞と密接に関連する腫瘍特異的ＰＤ－１＋Ｔ細胞を富化する。ＴＤＬＮを標的とするＰＤ－１経路の遮断は、前駆細胞枯渇Ｔ細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ－ｅｘｈａｕｓｔｅｄＴｃｅｌｌ）を腫瘍部位に接種することにより、強化された抗腫瘍Ｔ細胞免疫を誘導し、それによって腫瘍制御を改善することができる。ＴＤＬＮでは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数及び抑制活性も増加する。これらのＴｒｅｇ細胞の幾つかは、特異的な腫瘍由来抗原に対して新規に生成することができる。場合によっては、ＴＤＬＮ新規抗原の提示は、防御免疫応答を誘発できないだけでなく、全身寛容を能動的に生じさせる可能性もある。従って、一態様において、抗原結合構築物（例えば、二重特異性抗体）は、腫瘍排出リンパ節における免疫応答を誘導し、腫瘍排出リンパ節におけるＴｒｅｇ細胞活性を抑制し、腫瘍抗原に対する全身耐性を抑制することもできる。

幾つかの実施形態において、本開示は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（例えば、セリクレルマブ）の毒性を低減する方法を提供する。当該方法は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の抗原結合断片を含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗体を製造することを含む。幾つかの実施形態において、多重特異性抗体は、ＰＤ－１に対する抗原結合断片を有する。幾つかの実施形態において、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、本明細書に記載される構造を有する。幾つかの実施形態において、血液生化学的試験（例えば、ＡＬＴ及び／又はＡＳＴレベルを測定することによって）又は肝臓の病理組織学的検査によって評価される。幾つかの実施形態において、非修飾抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の毒性と比較して、本明細書に記載される方法は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の毒性を８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満だけ低減することができる。

幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン（例えば、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を含む。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ノブイントホール（ＫＩＨ）突然変異を含む。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、第１のポリペプチド鎖にＩｇＧ４のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖にＩｇＧ４のＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含む。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４９、１５０又は１５１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１のＣＨ１、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）を含む。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＬＡＬＡ突然変異を含む。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、第１のポリペプチド鎖にＩｇＧ１のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含み、第２のポリペプチド鎖にＩｇＧ１のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインを含む。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４７又は１４８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）のＣ末端にリジン残基が欠失したアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、ＩｇＧＣＨ３のＣ末端リジン残基を含む抗体又は抗原結合断片と比較して、ＩｇＧＣＨ３ドメインのＣ末端リジン残基の欠失は、抗体又はその抗原結合断片の分解レベルを、例えば、少なくとも又は約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％低下させる。

幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含む。幾つかの実施形態において、ＣＬは、配列番号１４６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

一態様において、本開示は、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供し、当該二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：

（ａ）好ましくはＮ末端からＣ末端まで、第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む重鎖ポリペプチド、

（ｂ）好ましくはＮ末端からＣ末端まで、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖ポリペプチド、及び

（ｃ）好ましくはＮ末端からＣ末端まで、ｓｃＦｖドメイン、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む一本鎖可変断片ポリペプチド。

幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の重鎖可変領域、リンカーペプチド配列、第２の軽鎖可変領域を含む。

幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の軽鎖可変領域、リンカーペプチド配列、第２の重鎖可変領域を含む。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖可変領域と第１の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する。幾つかの実施形態において、第２の重鎖可変領域と第２の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。

幾つかの実施形態において、第２の重鎖可変領域、リンカーペプチド配列及び第２の軽鎖可変領域は、ＣＤ４０に特異的に結合するｓｃＦｖドメインを共に形成する。幾つかの実施形態において、リンカーペプチド配列は、配列番号１５２、１５３又は１５４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）に由来する。幾つかの実施形態において、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）は、ＫＩＨ及び／又はＬＡＬＡ突然変異を含む。

幾つかの実施形態において、重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１３０に示される。幾つかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１３１に示される。幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ポリペプチドの配列は、配列番号１３２又は１３３（例えば、配列番号１３２）に示される。幾つかの実施形態において、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４のＰＤ－１重鎖及び軽鎖の配列は、それぞれ配列番号１３０及び配列番号１３１に示され、且つＦａｂ－ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４のＣＤ４０アームの配列は、配列番号１３２に示される。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、図１Ａに示す概略構造を有する。幾つかの実施形態において、重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１６６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。幾つかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１６７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。幾つかの実施形態において、一本鎖可変断片ペプチドの配列は、配列番号２０６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片のＰＤ－１アームの重鎖配列及び軽鎖配列は、それぞれ配列番号１６６及び配列番号１６７に示され、且つ本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片のＣＤ４０アームの配列は、配列番号１７３に示される。

（ａ）好ましくはＮ末端からＣ末端まで、第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）、重鎖定常領域３（ＣＨ３）、第１のリンカーペプチド配列及びｓｃＦｖドメインを含む第１の重鎖ポリペプチド、

（ｂ）好ましくはＮ末端からＣ末端まで、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び第１の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む第１の軽鎖ポリペプチド。

幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）、第２のリンカーペプチド配列及び第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）を含む。

幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）、第２のリンカーペプチド配列及び第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）を含む。

幾つかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｂ及びＴリンパ球関連タンパク質（ＢＴＬＡ）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４７、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン－３（ＴＩＭ－３）又はＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４又はＯＸ４０）に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、ＰＤ－１に特異的に結合する。

幾つかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、がん特異的抗原又はがん関連抗原に特異的に結合する。本明細書で使用されるように、用語「がん特異的抗原」とは、がん細胞の表面に特異的に発現する抗原を指す。これらの抗原は、腫瘍細胞の確認に用いられることができる。正常細胞は、がん特異的抗原をほとんど発現しない。幾つかの例示的ながん特異的抗原は、例えば、ＣＤ２０、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＤ－Ｌ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、Ｈｅｒ１、β－カテニン、ＣＤ１９、ＣＥＡＣＡＭ３、ＥＧＦＲ、ｃ－Ｍｅｔ、ＥＰＣＡＭ、ＰＳＭＡ、ＣＤ４０、ＭＵＣ１及びＩＧＦ１Ｒなどを含む。ＰＳＡは主に前立腺がん細胞に発現し、Ｈｅｒ２は主に乳がん細胞に発現する。本明細書で使用されるように、用語「がん関連抗原」とは、がん細胞上で比較的高いレベルで発現されるが、正常細胞上で比較的低いレベルでも発現され得る抗原を指す。ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６及び多くの接着分子（例えばＮ－カドヘリン、ＶＥ－カドヘリン、ＮＣＡＭ、Ｍｅｌ－ＣＡＭ、ＩＣＡＭ、ＮｒＣＡＭ、ＶＣＡＭ１、ＡＬＣＡＭ、ＭＣＡＭなど）は、がん関連抗原である。がん特異的抗原とがん関連抗原とは両方ともがん細胞表面に発現しているが、がん特異的抗原とがん関連抗原との間には、がん関連抗原は正常細胞にも発現しているが、がん細胞に発現しているレベルと比較して発現レベルが低いという違いがある。これに対し、がん特異的抗原は正常細胞にはほとんど発現しておらず、正常細胞に発現していてもその量は極めて低い。

幾つかの実施形態において、第２の重鎖可変領域と第２の軽鎖可変領域とは、互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する。幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨを含むか、又はそれからなる。

幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、抗体（例えば、ＩｇＧ）のＦｃ領域に連結される。幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、Ｆｃ領域のＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、第２の抗原結合部位は、例えば３Ａ部位において、Ｆｃ領域に挿入される。

３Ａ部位とは、免疫グロブリンの機能又は融合ポリペプチドの生物活性を妨げることなく、非天然ペプチドを挿入することができるＦｃ中の領域を指す。３Ａ部位は、位置３４４から位置３８２（ＥＵ番号付け）までである。幾つかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個又は３９個のアミノ酸を置換するか、又は当該融合部位における任意の２つのアミノ酸の間に挿入される。幾つかの実施形態において、融合部位は、位置３５１～３６２の領域（ＥＵ番号付け）に位置する。幾つかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位における１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個又は全てのアミノ酸（例えば、３５１～３６２）を置換するか、又は当該融合部位における任意の２つのアミノ酸の間に挿入され、例えば、位置３５１～３５２、３５２～３５３、３５３～３５４、３５４～３５５、３５５～３５６、３５６～３５７、３５７～３５８、３５８～３５９、３５９～３６０、３６０～３６１又は３６１～３６２に挿入される。幾つかの実施形態において、２つの残基は、ＥＵ番号付けによる重鎖ＣＨ３ドメインの位置３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２及び３６３のうちの任意の２つの位置から選ばれる。幾つかの実施形態において、非天然ポリペプチドは、融合部位においてアミノ酸３５８～３６２を置換する。

幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖ＣＨ３ドメインのそれぞれに融合される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、図１８Ａに示す概略構造を有する。幾つかの実施形態において、融合重鎖ポリペプチドは、配列番号１６１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を有する。幾つかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドは、配列番号１４１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を有する。幾つかの実施形態において、融合重鎖ポリペプチドは、本明細書に記載される抗ＰＤ－１重鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドは、本明細書に記載される抗ＰＤ－１軽鎖可変領域を含む。

幾つかの実施形態において、融合重鎖ポリペプチドは、配列番号１６８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を有する。幾つかの実施形態において、軽鎖ポリペプチドは、配列番号１６９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を有する。

幾つかの実施形態において、二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、第１の重鎖ポリペプチドと少なくとも９０％、９５％又は１００％の同一性を有する第２の重鎖ポリペプチドと、第１の軽鎖ポリペプチドと少なくとも９０％、９５％又は１００％の同一性を有する第２の軽鎖ポリペプチドと、を更に含む。

幾つかの実施形態において、第２の軽鎖可変領域、リンカーペプチド配列及び第２の重鎖可変領域は、ＣＤ４０に特異的に結合するｓｃＦｖドメインを共に形成する。幾つかの実施形態において、第１の接続ペプチド配列は、配列番号１５３又は１５４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、第２のリンカーペプチド配列は、配列番号１５３又は１５４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）に由来する。幾つかの実施形態において、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）は、ＫＩＨ及び／又はＬＡＬＡ突然変異を含む。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断することができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、図１Ｂに示す概略構造を有する。幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１３４又は１３５に示される。幾つかの実施形態において、第１の軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１３６に示される。幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１３７又は１３８に示される。幾つかの実施形態において、第１の軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１３９に示される。幾つかの実施形態において、ＳｃＦｖ－ＨＣ－ＩｇＧ４の修飾された重鎖の配列は、配列番号１３４に示され、ＳｃＦｖ－ＨＣ－ＩｇＧ４の軽鎖の配列は、配列番号１３６に示される。幾つかの実施形態において、ＳｃＦｖ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡの修飾された重鎖の配列は、配列番号１３７に示され、ＳｃＦｖ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡの軽鎖の配列は、配列番号１３９に示される。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１６２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含み、且つ第１の軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１６３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１６４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含み、且つ第１の軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１７５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１７６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１７７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１７８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、第１の重鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１７２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含み、第１の軽鎖ポリペプチドの配列は、配列番号１７４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、本開示は、好ましくはＮ末端からＣ末端まで、ＰＤ－１に結合する単一可変ドメイン（ＶＨＨ）、任意選択でＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、リンカーペプチド配列、及びｓｃＦｖドメインを含むポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供する。幾つかの実施形態において、ＶＨＨは、配列番号２０４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。

幾つかの実施形態において、選択された抗ＰＤ－１抗体の可変領域（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ）は、本明細書に記載される二重特異性抗体の対応する抗ＰＤ－１可変領域（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ）をそれらの配列に従って置換するために用いられる。例えば、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨ配列は、配列番号１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、２０７又は２０９から選ばれることができ、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬ配列は、配列番号１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、２０８又は２１０から選ばれることができる。

幾つかの実施形態において、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨ及びＶＬは、両方とも本明細書に記載される二重特異性抗体の対応するＶＨ及びＶＬをそれらの配列に従って置換するために用いられる。例えば、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号１７９であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号１８０であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号１８１であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号１８２であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号１８３であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号１８４であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号１８５であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号１８６であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号１８７であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号１８８であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号１８９であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号１９０であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号２０７であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号２０８であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨは、配列番号２０９であり、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬは、配列番号２１０である。

幾つかの実施形態において、選択された抗ＣＤ４０抗体の可変領域（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ）は、本明細書に記載される二重特異性抗体の対応する抗ＣＤ４０可変領域（例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ）をそれらの配列に従って置換するために用いられる。例えば、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＨ配列は、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７又は１９９から選ばれることができ、選択された抗ＰＤ－１抗体のＶＬ配列は、配列番号１９２、１９４、１９６、１９８又は２００から選ばれることができる。

幾つかの実施形態において、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＨ及びＶＬは、両方とも本明細書に記載される二重特異性抗体の対応するＶＨ及びＶＬをそれらの配列に従って置換するために用いられる。例えば、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＨは、配列番号１９１であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＬは、配列番号１９２であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＨは、配列番号１９３であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＬは、配列番号１９４であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＨは、配列番号１９５であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＬは、配列番号１９６であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＨは、配列番号１９７であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＬは、配列番号１９８であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＨは、配列番号１９９であり、選択された抗ＣＤ４０抗体のＶＬは、配列番号２００である。

抗ＣＤ４０抗体及び抗原結合断片
本開示は、ＣＤ４０に特異的に結合する幾つかの抗体及び抗原結合断片を提供する。抗ＰＤ－１／ＣＤ４０抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）又は様々な抗原結合タンパク質構築物は、これらの抗体に由来する抗原結合部位を含むことができる。

本明細書に記載される抗体及び抗原結合断片は、ＣＤ４０に結合することができる。本開示は、例えばマウス抗ＣＤ４０抗体０３－７Ｆ１０（「７Ｆ１０」）、０６－６Ａ７（「６Ａ７」）及び０７－４Ｈ６（「４Ｈ６」）、キメラ抗体、及びそれらのヒト化抗体を提供する。

７Ｆ１０及び７Ｆ１０誘導抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される重鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号５９～６１）及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号６２～６４）を含む。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義することもできる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号７７～７９に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号８０～８２に示される。

同様に、６Ａ７及び６Ａ７誘導抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される重鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号６５～６７）及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号６８～７０）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号８３～８５に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号８６～８８に示される。

４Ｈ６及び４Ｈ６誘導抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される重鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号７１～７３）及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号７４～７６）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号８９～９１に示され、且つ軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号９２～９４に示される。

ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を更に提供する。マウス抗体のヒト化方法は異なるため（例えば、配列は異なるアミノ酸で置換されてもよい）、抗体の重鎖及び軽鎖は、１つより多くのバージョンのヒト化配列を有することができる。ヒト化７Ｆ１０抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号９８～１００に示される。ヒト化７Ｆ１０抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０１～１０４に示される。これらの重鎖可変領域配列（配列番号９８～１００）の何れかは、これらの軽鎖可変領域配列（配列番号１０１～１０４）の何れかとペアリングすることができる。

同様に、ヒト化６Ａ７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０５～１０８に示される。ヒト化６Ａ７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１０９～１１１に示される。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はまた、安定性又は相互作用を高めるために修飾されてもよい。６Ａ７－Ｈ４は、配列番号１２６を得るために更に修飾されることができる。６Ａ７－Ｋ２は、配列番号１２７を得るために更に修飾されることができる。同様に、マウス６Ａ７抗体の重鎖可変領域は、配列番号１２８を得るために更に修飾されることができる。マウス６Ａ７抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１２９を得るために更に修飾されることができる。これらの重鎖可変領域配列（配列番号１０５～１０８、１２６及び１２８）の何れかは、これらの軽鎖可変領域配列（配列番号１０９～１１１、１２７及び１２９）の何れかとペアリングすることができる。ヒト化４Ｈ６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１１２～１１５に示される。ヒト化４Ｈ６抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号１１６～１１９に示される。これらの重鎖可変領域配列（配列番号１１２～１１５）の何れかは、これらの軽鎖可変領域配列（配列番号１１６～１１９）の何れかとペアリングすることができる。

図２６に示すように、ヒト化パーセントは、国際免疫遺伝情報システム（ＩＭＧＴ）データベースにおいて、ヒト抗体配列と比較した重鎖又は軽鎖可変領域配列の同一性のパーセントを意味する。最適アライメント（ｔｏｐｈｉｔ）とは、重鎖又は軽鎖可変領域配列が他の種よりも特定の種に近いことを意味する。例えば、ヒトとの最適アライメントとは、当該配列が他の種よりもヒトに近いことを意味する。ヒト及びカニクイザルとの最適アライメントとは、当該配列がヒト及びカニクイザル配列と同一の同一性パーセントを有し、これらの同一性パーセントが他の種の配列と比較して最も高いことを意味する。幾つかの実施形態において、ヒト化パーセントは、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％を超える。ヒト化パーセントをどのように決定し、最適アライメントをどのように決定するかに関する詳細な説明は、当該技術分野で公知であり、例えばＪｏｎｅｓ，ＴｉｍＤ．ら，「ＴｈｅＩＮＮｓａｎｄｏｕｔｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｎｏｎｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙｎａｍｅｓ」，ＭＡｂｓ．，第８巻第１期，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，２０１６年に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。高ヒト化パーセントは、一般に、ヒトにおいてより安全且つ効果的であること、ヒト対象に許容される可能性が高いこと、及び/又は副作用を有する可能性が低いことなど、多くの利点を有する。

更に、幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５９～６１、配列番号６５～６７、配列番号７１～７３、配列番号７７～７９、配列番号８３～８５及び配列番号８９～９１からなる群より選ばれる１つ、２つ又は３つの重鎖可変領域ＣＤＲ、及び／又は配列番号６２～６４、配列番号６８～７０、配列番号７４～７６、配列番号８０～８２、配列番号８６～８８及び配列番号９２～９４からなる群より選ばれる１つ、２つ又は３つの軽鎖可変領域ＣＤＲを更に含むことができる。

幾つかの実施形態において、抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を有することができ、ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、また、ＣＤＲ１、２、３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を有することができ、ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。選択されたＶＨＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列及び選択されたＶＬＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、図２３（ＫａｂａｔＣＤＲ）及び図２４（ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ）に示される。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号５９のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６０のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６１のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６５のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６６のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６７のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７１のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７２のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７３のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７７のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７８のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７９のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８３のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８４のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８５のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８９のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号９０のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号９１のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６２のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６３のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６４のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６８のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６９のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７０のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７４のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７５のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７６のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８０のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８１のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８２のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８６のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８７のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８８のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号９２のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号９３のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号９４のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

挿入、欠失、及び置換は、ＣＤＲ配列内にあってもよく、ＣＤＲ配列の一方又は両方の末端にあってもよい。

本開示は、ＣＤ４０に結合する抗体又はその抗原結合断片を更に提供する。当該抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含有し、当該重鎖可変領域は、選択されたＶＨ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、当該軽鎖可変領域は、選択されたＶＬ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は、配列番号９８、９９、１００又は１２０であり、選択されたＶＬ配列は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４又は１２１である。幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は、配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１２２、１２６又は１２８であり、選択されたＶＬ配列は、配列番号１０９、１１０、１１１、１２３、１２７又は１２９である。幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は、配列番号１１２、１１３、１１４、１１５又は１２４であり、選択されたＶＬ配列は、配列番号１１６、１１７、１１８、１１９又は１２５である。

幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されるＶＨ配列の何れかのＣＤＲと同じ３つのＶＨＣＤＲを有することができる。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載されるＶＬ配列の何れかのＣＤＲと同じ３つのＶＬＣＤＲを有することができる。

本開示は、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を更に提供する。免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖は、図２３又は図２４に示されるＣＤＲを含むか、又は図２６に示される配列を有する。ポリペプチドが対応するポリペプチド（例えば、対応する重鎖可変領域又は対応する軽鎖可変領域）とペアリングされる場合、ペアリングされたポリペプチドは、ＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０）に結合する。

抗ＣＤ４０抗体及び抗原結合断片はまた、抗体又は抗体断片及び多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又は抗体断片の抗体変異体（誘導体及び複合体を含む）であってもよい。本明細書で提供される他の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性（多量体、例えば、二重特異性）抗体、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ）、一本鎖抗体、細胞内で製造された抗体（即ち、細胞内抗体）及びそれらの抗原結合断片である。抗体又はその抗原結合断片は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合断片である。

抗体断片は、それらが全長抗体の所望の親和性及び特異性を保持する限り、提供された方法に適している。従って、ＣＤ４０に結合する抗体断片は、ＣＤ４０に結合する能力を保持する。Ｆｖ断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片である。当該領域は、緊密に結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなり、それは例えばｓｃＦｖなどの自然共有結合であってもよい。かかる配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲの相互作用より、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位が限定される。６つのＣＤＲ又はそのサブセットは共に、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又はある抗原に対して特異性を有する３つのＣＤＲを含む半分のＦｖ）であっても、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体より親和性が低い。

幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０）に結合する１つ又は複数（例えば１個、２個、３個又は４個）のｓｃＦｖドメインを含む、二重特異性抗体である。

幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ４）Ｆｃ領域の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）のＮ末端に連結される。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）Ｆｃ領域のＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、例えば３Ａ部位において、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）のＦｃ領域に挿入される。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片の１本のポリペプチド鎖は、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖに連結される。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片の２本のポリペプチド鎖は、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖに連結される。

幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、重鎖可変領域（ＶＨ）、リンカーペプチド及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域（ＶＬ）、リンカーペプチド及び重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。幾つかの実施形態において、ＶＬ－リンカーペプチド－ＶＨ構造は、抗体又はその抗原結合断片の発現を増加させる（例えば、少なくとも又は約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％増加させる）。免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）又は免疫グロブリン軽鎖（ＶＬ）は、図２３又は図２４に示されるＣＤＲを含むか、又は図２６に示される配列を有する。幾つかの実施形態において、リンカーペプチドは、配列番号１５２、１５３又は１５４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、配列番号１５５、１５６、１５７又は１５８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む。

抗ＰＤ－１抗体及び抗原結合断片
本開示は、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。抗ＰＤ－１／ＣＤ４０抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、これらの抗体に由来する抗原結合部位を含むことができる。

本明細書に記載される抗体及び抗原結合断片は、ＰＤ－１に結合することができる。本開示は、マウス抗ＰＤ－１抗体２５－１Ａ７（「１Ａ７」）、１８－３Ｆ１（「３Ｆ１」）及び３－６Ｇ１（「６Ｇ１」）及びそれらのヒト化抗体を提供する。

１Ａ７及び１Ａ７誘導抗体（例えば、ヒト化抗体）のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される重鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号１～３）及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号４～６）を含む。ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムによって定義することもできる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号１９～２１に示され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号２２～２４に示される。

同様に、３Ｆ１及び３Ｆ１誘導抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される重鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号７～９）及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号１０～１２）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号２５～２７に示され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号２８～３０に示される。

６Ｇ１及び６Ｇ１誘導抗体のＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔ番号付けによって定義される重鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号１３～１５）及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ（配列番号１６～１８）を含む。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けによれば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号３１～３３に示され、軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、配列番号３４～３６に示される。

ヒト化抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を更に提供する。マウス抗体のヒト化方法は異なるため（例えば、配列は異なるアミノ酸で置換されてもよい）、抗体の重鎖及び軽鎖は、１つより多くのバージョンのヒト化配列を有することができる。図２２は、これらのヒト化配列のヒト化パーセントを提供する。

ヒト化１Ａ７抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４０～４２に示される。ヒト化１Ａ７抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４３～４５に示される。これらの重鎖可変領域配列（配列番号４０～４２）の何れかは、これらの軽鎖可変領域配列（配列番号４３～４５）の何れかとペアになってもよい。

同様に、ヒト化３Ｆ１抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４６～４９に示される。ヒト化３Ｆ１抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５０～５２に示される。これらの重鎖可変領域配列（配列番号４６～４９）の何れかは、これらの軽鎖可変領域配列（配列番号５０～５２）の何れかとペアになってもよい。

更に、幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１～３、配列番号７～９、配列番号１３～１５、配列番号１９～２１、配列番号２５～２７及び配列番号３１～３３からなる群より選ばれる１つ、２つ又は３つの重鎖可変領域ＣＤＲ、及び／又は配列番号４～６、配列番号１０～１２、配列番号１６～１８、配列番号２２～２４、配列番号２８～３０及び配列番号３４～３６からなる群より選ばれる１つ、２つ又は３つの軽鎖可変領域ＣＤＲを更に含むことができる。

幾つかの実施形態において、抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を有することができ、ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、また、ＣＤＲ１、２、３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を有することができ、ここで、ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなる。選択されたＶＨＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列及び選択されたＶＬＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、図１９（ＫａｂａｔＣＤＲ）及び図２０（ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ）に示される。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号７のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号８のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号９のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１３のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１４のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１５のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１９のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２０のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２１のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２５のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２６のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２７のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３１のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３２のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３３のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号４のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号５のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号６のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１０のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１１のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１２のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１６のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１７のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号１８のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２２のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２３のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２４のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２８のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号２９のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３０のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片は、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３４のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３５のＣＤＲ、０個、１個又は２個のアミノ酸挿入、欠失又は置換を有する配列番号３６のＣＤＲ、のうちの１つ、２つ又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。

本開示は、ＰＤ－１に結合する抗体又はその抗原結合断片を更に提供する。当該抗体又はその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含有し、当該重鎖可変領域は、選択されたＶＨ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、当該軽鎖可変領域は、選択されたＶＬ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は、配列番号４０、４１、４２又は５３であり、選択されたＶＬ配列は、配列番号４３、４４、４５又は５４である。幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は、配列番号４６、４７、４８、４９又は５５であり、選択されたＶＬ配列は、配列番号５０、５１、５２又は５６である。幾つかの実施形態において、選択されたＶＨ配列は、配列番号５７であり、選択されたＶＬ配列は、配列番号５８である。

本開示は、免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン重鎖を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を更に提供する。免疫グロブリン重鎖又は免疫グロブリン軽鎖は、図１９又は図２０に示されるＣＤＲを含むか、又は図２２に示される配列を有する。ポリペプチドが対応するポリペプチド（例えば、対応する重鎖可変領域又は対応する軽鎖可変領域）とペアリングされる場合、ペアリングされたポリペプチドはＰＤ－１に結合する。

抗ＰＤ－１抗体及び抗原結合断片はまた、抗体又は抗体断片及び多重特異性（例えば、二重特異性）抗体又は抗体断片の抗体変異体（誘導体及び複合体を含む）であってもよい。本明細書で提供される他の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性（多量体、例えば、二重特異性）抗体、ヒト抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ）、一本鎖抗体、細胞内で製造された抗体（即ち、細胞内抗体）及びそれらの抗原結合断片である。抗体又はその抗原結合断片は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ抗体又はその抗原結合断片である。

抗体断片は、それらが全長抗体の所望の親和性及び特異性を保持する限り、提供された方法に適している。従って、ＰＤ－１に結合する抗体断片は、ＰＤ－１に結合する能力を保持する。Ｆｖ断片は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片である。当該領域は、緊密に結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなり、それは例えばｓｃＦｖなどの自然共有結合であってもよい。かかる配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲの相互作用より、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位が限定される。６つのＣＤＲ又はそのサブセットは共に、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又はある抗原に対して特異性を有する３つのＣＤＲを含む半分のＦｖ）であっても、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体より親和性が低い。

抗体の特徴
抗ＰＤ１、抗ＣＤ４０又は抗ＰＤ－１／ＣＤ４０抗原結合タンパク質構築物（例えば、抗体、二重特異性抗体又はその抗体断片）は、本明細書に記載される任意の抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＤ４０抗体又はその任意の抗原結合断片に由来する抗原結合部位を含むことができる。

本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－１に結合し、且つＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の結合及び／又はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の結合を遮断することができる。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の結合及び／又はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の結合を遮断することによって、抗ＰＤ－１／ＣＤ４０抗体は、ＰＤ－１阻害経路（例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断することによって）を破壊し、免疫応答を上方制御する。

抗体の抗原に対する親和性は、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む一般的な技術を用いて測定することができる。親和性は、動力学的速度定数の商（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋａ）から導き出すことができる。幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、０．１ｓ^－１未満、０．０１ｓ^－１未満、０．００１ｓ^－１未満、０．０００１ｓ^－１未満又は０．００００１ｓ^－１未満の解離速度（ｋｏｆｆ）でＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１、マウスＰＤ－１及び／又はキメラＰＤ－１）に結合することができる。幾つかの実施形態において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ｓ^－１以上、０．００１ｓ^－１以上、０．０００１ｓ^－１以上又は０．００００１ｓ^－１以上である。幾つかの実施形態において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、１．４×１０^－３ｓ^－１、１．３×１０^－３ｓ^－１又は１．２×１０^－３ｓ^－１未満である。

幾つかの実施形態において、動力学的結合速度（ｋｏｎ）は、１×１０^２/Ｍｓ以上、１×１０^３/Ｍｓ以上、１×１０^４/Ｍｓ以上、１×１０^５/Ｍｓ以上又は１×１０^６/Ｍｓ以上である。幾つかの実施形態において、動力学的結合速度（ｋａ）は、１×１０^５/Ｍｓ未満、１×１０^６/Ｍｓ未満又は１×１０^７/Ｍｓ未満である。幾つかの実施形態において、動力学的結合速度（ｋａ）は、１．０×１０^５/Ｍｓ、１．２×１０^５/Ｍｓ又は１．４×１０^５/Ｍｓ以上である。

幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、１×１０^－６Ｍ未満、１×１０^－７Ｍ未満、１×１０^－８Ｍ未満、１×１０^－９Ｍ未満又は１×１０^－１０Ｍ未満のKDでＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１、マウスＰＤ－１及び／又はキメラＰＤ－１）に結合することができる。幾つかの実施形態において、ＫＤは、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ又は１ｎＭ未満である。幾つかの実施形態において、ＫＤは、１×１０^－７Ｍ以上、１×１０^－８Ｍ以上、１×１０^－９Ｍ以上又は１×１０^－１０Ｍ以上である。幾つかの実施形態において、抗体は、約１０ｎＭ、９．５ｎＭ、９ｎＭ、８．５ｎＭ又は８ｎＭ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する。

抗ＰＤ－１／ＣＤ４０抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、本明細書に記載される任意の抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片に由来する抗原結合部位を含むこともできる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗ＰＤ１／ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌとの間の結合を遮断することができる。幾つかの実施形態において、抗体はまた、ＣＤ４０に結合することによって、ＣＤ４０シグナル伝達経路を促進し、免疫応答を上方制御することができる。従って、幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ４０アゴニストである。幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ４０アンタゴニストである。

幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、０．１ｓ^－１未満、０．０１ｓ^－１未満、０．００１ｓ^－１未満、０．０００１ｓ^-1未満又は０．００００１ｓ^-1未満の解離速度（ｋｏｆｆ）でＣＤ４０（例えば、ヒトＣＤ４０、マウスＣＤ４０及び／又はキメラＣＤ４０）に結合することができる。幾つかの実施形態において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ｓ^-1以上、０．００１ｓ^-1以上、０．０００１ｓ^-1以上又は０．００００１ｓ^－１以上である。幾つかの実施形態において、解離速度（ｋｏｆｆ）は、５×１０^－４ｓ^－１、４×１０^－４ｓ^－１又は３×１０^－４ｓ^－１未満である。

幾つかの実施形態において、動力学的結合速度（ｋｏｎ）は、１×１０２／Ｍｓ以上、１×１０３／Ｍｓ以上、１×１０４／Ｍｓ以上、１×１０５／Ｍｓ以上又は１×１０６／Ｍｓ以上である。幾つかの実施形態において、動力学的結合速度（ｋａ）は、１×１０５／Ｍｓ未満、１×１０６／Ｍｓ未満又は１×１０７／Ｍｓ未満である。幾つかの実施形態において、動力学的結合速度（ｋａ）は、１．０×１０５／Ｍｓ、１．５×１０５／Ｍｓ、２×１０５／Ｍｓ又は２．５×１０５／Ｍｓ以上である。

親和性は、動力学的速度定数の商（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋａ）から導き出すことができる。幾つかの実施形態において、ＫＤは、１×１０－６Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満又は１×１０－１０Ｍ未満である。幾つかの実施形態において、ＫＤは、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ又は１ｎＭ未満である。幾つかの実施形態において、ＫＤは、１×１０－７Ｍ以上、１×１０－８Ｍ以上、１×１０－９Ｍ以上、１×１０－１０Ｍ以上、１×１０－１１Ｍ以上又は１×１０－１２Ｍ以上である。幾つかの実施形態において、抗体は、約３．５ｎＭ、３ｎＭ、２．５ｎＭ、２ｎＭ又は１．５ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＤ４０に結合する。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、ＰＤ－１モノクローナル抗体（例えば、１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４）のＥＣ５０値と比較して約５０％、約８０％、約１００％、約２倍、約３倍、約４倍又は約５倍のＥＣ５０値（例えば、レポーター細胞活性化アッセイによって決定される）でＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断することができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、約１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬ又はそれら未満のＥＣ５０値（例えば、レポーター細胞活性化アッセイによって決定される）でＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断することができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、約１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ又は０．０２μｇ／ｍＬ又はそれら未満のＥＣ５０値（例えば、レポーター細胞活性化アッセイによって決定される）でＴ細胞（例えば、発現ＰＤ－１）及び抗原提示細胞（例えば、発現ＣＤ４０）を架橋することができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ細胞におけるＣＤ４０経路を活性化する）を活性化することができる。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１発現細胞の非存在下でのＡＰＣ細胞活性化（例えば、トランス活性化）と比較して、ＰＤ－１発現細胞の存在は、ＡＰＣ細胞活性化を少なくとも又は約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍又はそれ以上増加させることができる。

幾つかの実施形態において、ＰＤ－１又はその標的を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞又は骨髄系細胞）及びＡＰＣ細胞は、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）の架橋によって、ＡＰＣ細胞上のＣＤ４０凝集を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍又は２０倍刺激することができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、免疫応答、ＣＤ４０又はＣＤ４０関連経路の活性、ＡＰＣ細胞（例えば、樹状細胞又はマクロファージ）の活性又は数量及び／又はＴ細胞（例えばＣＤ８＋及び／又はＣＤ４＋細胞）の活性又は数量を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍又は２０倍増加させることができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、ＦＣγＲＩＩＢによって約１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ又は０．０２μｇ／ｍＬ又はそれら未満のＥＣ５０値（例えば、レポーター細胞活性化アッセイによって決定される）でＡＰＣ細胞（例えば、ＣＤ４０発現）を活性化することができる。

幾つかの実施形態において、ＣＤ４０モノクローナル抗体（例えば、６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２）と比較して、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、ＦＣγＲＩＩＢ受容体媒介性細胞（例えば、ＡＰＣ細胞）活性化を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍減少させることができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、ＣＤ４０アゴニストである。幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、ＣＤ４０を発現する標的細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達を増加させることができる。

抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）の遮断効果又は細胞活性化は、ＥＣ５０によって測定することができる。半数効果濃度（ＥＣ５０）とは、ベースラインと最大値との間の半分の応答を誘導する薬物の濃度を指す。幾つかの実施形態において、ＥＣ５０は、約５０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．００８μｇ／ｍＬ、０．００６μｇ／ｍＬ、０．００５μｇ／ｍＬ又は０．００１μｇ／ｍＬ又はそれら未満である。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、腫瘍微小環境又は腫瘍排出リンパ節における免疫応答シグナルを少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍又は２０倍増幅することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、全体的な免疫活性化を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２倍、３倍、５倍、１０倍又は２０倍減少させることができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、同様の腫瘍抑制作用（例えば、ＴＧＩ％で表される）を有することができ、その用量レベルは、約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％又はそれら未満又は同じ抗原を標的とするモノクローナル抗体（例えば、同じ重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体）の用量レベル未満である。

幾つかの実施形態において、同様の用量レベルで投与された場合に、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、同じ抗原を標的とするモノクローナル抗体の腫瘍増殖阻害効果の少なくとも又は約１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、２０倍又は５０倍高い腫瘍増殖阻害効果を有する。幾つかの実施形態において、ＰＤ－１発現細胞の非存在下での腫瘍増殖阻害作用と比較して、ＰＤ－１発現細胞の存在は、腫瘍増殖阻害作用を少なくとも又は約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍又はそれ以上増加させることができる。

幾つかの実施形態において、同様の用量レベルで投与された場合に、同じ抗原を標的とするモノクローナル抗体と比較して、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、少なくとも又は約１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％低下するインビボ毒性（例えば、血液ＡＳＴ、ＡＬＴレベル）を有する。

幾つかの実施形態において、同じ抗原を標的とするモノクローナル抗体を同様の用量レベルで投与した動物と比較して、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）を投与した動物（例えば、マウス）は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％又は５０％低下した炎症性レベル（例えば肝臓及び／又は腎臓の病変の程度）を有する。

幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、抗ＣＤ４０抗体、抗ＰＤ－１抗体又は二重特異性抗体）は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％又は２００％以上の腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）を有する。幾つかの実施形態において、抗体は、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％又は２００％未満の腫瘍増殖阻害率を有する。ＴＧＩ％は、例えば治療開始後３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日又は３０日、又は治療開始後１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月又は１２ヶ月に決定することができる。本明細書に使用されるように、腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％又はＴＧＩＴＶ％）は、以下の式を用いて計算される：
ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％

Ｔｉは、ｉ日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群における平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群における平均腫瘍体積である。

幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、機能的Ｆｃ領域を有する。幾つかの実施形態において、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。幾つかの実施形態において、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能は、貪食作用である。幾つかの実施形態において、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能は、ＡＤＣＣ及び貪食作用である。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３又はヒトＩｇＧ４である。幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、機能的Ｆｃ領域を有しない。例えば、抗体又は抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片である。

抗体及び抗原結合断片
本開示は、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）を提供する。抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、抗ＣＤ４０抗体又はその抗原結合断片、及び抗ＰＤ－１抗体又はその抗原結合断片を含むことができる。これらの抗原結合タンパク質構築物（例えば二重特異性抗体）、抗ＣＤ４０抗体、抗ＰＤ－１抗体及びその抗原結合断片は、様々な形態を有することができる。

通常、抗体（免疫グロブリンとも呼ばれる）は、２種類のポリペプチド鎖、即ち軽鎖及び重鎖からなる。本開示の非限定的抗体は、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む完全な４つの免疫グロブリン鎖抗体であってもよい。抗体の重鎖は、任意のアイソタイプ（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤを含む）又はサブアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２などを含む）であってもよい。軽鎖は、κ軽鎖又はλ軽鎖であってもよい。抗体は、軽鎖の２つの同じコピー及び／又は重鎖の２つの同じコピーを含むことができる。それぞれ１つの可変ドメイン（又は可変領域、ＶＨ）及び複数の定常ドメイン（又は定常領域）を含む重鎖は、その定常領域内のジスルフィド結合によって互いに結合して抗体の「ステム」を形成する。それぞれ１つの可変ドメイン（又は可変領域ＶＬ）及び１つの定常ドメイン（又は定常領域）を含む軽鎖は、それぞれジスルフィド結合によって１本の重鎖に結合する。各軽鎖の可変領域は、それが結合している重鎖の可変領域に位置合わせされる。軽鎖及び重鎖の可変領域は何れも３つの超可変領域を含み、それらはより保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）の間に挟まれている。

これらの超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）は、抗体の主要抗原結合表面を含むループを形成する。４つのフレームワーク領域の大部分は、β－シートコンフォメーションを採用し、且つＣＤＲは連結を形成し、場合によってはβ－シート構造の一部のループを形成する。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によって互いに緊密に保持され、且つ他の鎖からのＣＤＲと共に抗原結合部位の形成を促進する。

抗体のアミノ酸配列を分析することによって当該抗体のＣＤＲ領域を同定する方法は周知であり、ＣＤＲの多くの定義が一般的に用いられている。Ｋａｂａｔ定義は、配列変異性に基づいており、且つＣｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づいている。これらの方法及び定義は、例えばＭａｒｔｉｎ，「Ｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓ」、Ａｎｔｉｂｏｄｙｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＳｐｒｉｎｇｅｒＢｅｒｌｉｎＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００１年、４２２～４３９ページ；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎら、「ＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓｔｏＫａｂａｔａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙｃｏｒｒｅｃｔｎｕｍｂｅｒｉｎｇｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４５．１４（２００８年）：３８３２～３８３９ページ；Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．（１９７０年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１３２巻：２１１～２５０ページ；Ｍａｒｔｉｎら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．第２０３巻：１２１～５３ページ（１９９１年）；Ｍｏｒｅａら、ＢｉｏｐｈｙｓＣｈｅｍ．第６８巻（第１～３期）：９～１６ページ（１９９７年１０月）；Ｍｏｒｅａら、ＪＭｏｌＢｉｏｌ．，第２７５巻（第２期）：２６９～２９４ページ（１９９８年１月）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ，第３４２巻（第６２５２期）：８７７～８８３ページ（１９８９年１２月）；Ｐｏｎｏｍａｒｅｎｋｏ及びＢｏｕｒｎｅ，ＢＭＣＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ，第７巻：６４ページ（２００７年）に記載されており、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示で特に明記されていない限り、本開示ではＫａｂａｔ番号がデフォルト番号として使用される。

ＣＤＲは、抗原のエピトープを認識するのに重要である。本明細書で使用されるように、「エピトープ」は、抗体の抗原結合ドメインによって特異的に結合され得る標的分子の最小部分である。エピトープの最小サイズは、約３個、４個、５個、６個又は７個のアミノ酸であり得るが、エピトープは抗原の２次構造及び３次構造に基づく抗原の３次元立体配置に依存し得るので、これらのアミノ酸は抗原の一次構造の連続的な線状配列に存在する必要はない。

幾つかの実施形態において、抗体は、完全な免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）である。ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）は高度に保存的であり、それらの定常領域は異なり、特にそれらのヒンジ及び上部ＣＨ２ドメインは異なる。ＩｇＧサブクラスの配列及び相異は、当該技術分野で公知であり、例えばＶｉｄａｒｓｓｏｎら、「ＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓａｎｄａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔｏｅｆｆｅｃｔｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５（２０１４年）；Ｉｒａｎｉら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｈｕｍａｎＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｄｅｓｉｇｎｉｎｇｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ６７．２（２０１５年）：１７１～１８２ページ；Ｓｈａｋｉｂ，Ｆａｒｏｕｋ編著、「ＴｈｅｈｕｍａｎＩｇＧｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２０１６年に記載されており、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

抗体は更に、任意の種（例えばヒト、げっ歯類動物、マウス、ラット、ラクダ科動物）由来の免疫グロブリン分子であってもよい。本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体及び別のポリペプチドと融合した免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ抗体を更に含むが、これらに限定されない。用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合断片」は、完全抗体の特異的結合活性を保持する抗体の一部であり、即ち、完全抗体の標的分子上のエピトープに特異的に結合できる抗体の任意の部分である。それは、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びこれらの断片の変異体を含む。従って、幾つかの実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、例えばｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、二重特異性抗体、二重特異性ｓｃＦｖ、二重抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子、抗体断片から形成される多重特異性抗体及び抗体結合ドメイン又はそれと相同な結合ドメインとして含む任意のポリペプチドであり得る。抗原結合ドメインの非限定的な例は、例えば完全抗体の重鎖及び／又は軽鎖ＣＤＲ、完全抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域、完全抗体の全長重鎖又は軽鎖、又は完全抗体重鎖又は軽鎖由来の単一ＣＤＲを含む。

幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖは、２つの重鎖可変ドメインと、２つの軽鎖可変ドメインと、を有する。幾つかの実施形態において、ｓｃＦｖは、２つの抗原結合部位（抗原結合部位：Ａ及びＢ）を有し、且つ２つの抗原結合部位は、異なる親和性でそれぞれの標的抗原に結合することができる。

幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに結合することができる。

幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、図１９、図２０、図２３及び図２４から選ばれる重鎖可変領域ＣＤＲを１つ、２つ、又は３つ含むことができる。幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、図１９、図２０、図２３及び図２４から選ばれる軽鎖可変領域ＣＤＲを１つ、２つ、又は３つ含むことができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）は、治療剤に複合され得る。抗体又はその抗原結合断片を含む抗体薬物複合体は、治療剤に共有結合又は非共有結合され得る。幾つかの実施形態において、治療剤は、細胞毒性剤又は細胞増殖阻害剤（例えば、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシ炭疽菌ジケトン、メルタンシン（ＤＭ－１及びＤＭ－４など）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン及びシクロホスファミド及び類似体）である。

一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又は抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメイン（又は領域）を含み、ここで、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。通常、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するように、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを更に含む。
Ｆａｂ断片は、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメインと、重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と、を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、１対のＦａｂ断片を含み、これらの断片は、通常それらの間のヒンジシステインを介してそれらのカルボキシル基末端付近で共有結合される。抗体断片の他の化学的カップリングも当該技術分野で公知である。

二重抗体は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片であり、これらの断片は、同一ポリペプチド鎖においてＶＬに連結されたＶＨ（ＶＨ及びＶＬ）を含む。短すぎるために同じ鎖上の２つのドメインの間でペアリングすることができないリンカーを使用することによって、当該ドメインを別の鎖の相補ドメインとペアリングさせて２つの抗原結合部位を生成する。

線状抗体は、相補軽鎖ポリペプチドと共に１対の抗原結合部位を形成する、１対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異的又は単一特異的であってもよい。

抗体の多量体化は、抗体の自然凝集によって又は当技術分野で公知の化学的又は組換え結合技術によって達成され得る。例えば、あるパーセントの精製された抗体製剤（例えば、精製されたＩｇＧ１分子）は、抗体ホモ二量体及び他の高次抗体多量体を含有するタンパク質凝集体を自発的に形成する。

幾つかの実施形態において、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にするように、１対の抗体分子の間の界面をエンジニアリングすることによって製造できる。例えば、当該界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含むことができる。当該方法では、第１の抗体分子界面からの１本又は複数本の小さなアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換される。大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）で置換することにより、第２の抗体分子の界面に大きな側鎖のサイズと同じ又は類似の補償された「空洞」が形成される。これは、ヘテロ二量体の収率を他の不要な最終生成物（ホモ二量体など）よりも高くする機序を提供する。当該方法は、例えばＷＯ９６／２７０１１に記載されており、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

二重特異性抗体は、架橋又は「異種複合」抗体を含む。例えば、異種複合体における抗体の一方は、抗ビオチンタンパク質にカップリングすることができ、他方は、ビオチンにカップリングすることができる。また、任意の便利な架橋方法を使用して異種複合抗体を製造することができる。適切な架橋剤及び架橋技術は、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

抗体断片から二重特異性抗体を産生する方法も当技術分野で公知である。例えば、二重特異性抗体は、化学的連結を使用して製造され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２２９巻：８１ページ、１９８５年）は、完全抗体をタンパク質の加水分解切断によってＦ（ａｂ’）２断片を生成する方法を記述している。これらの断片は、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、隣接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで生成されたＦａｂ’断片をチオニトロ安息香酸エステル（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いでメルカプトエチルアミンで還元することによって、Ｆａｂ’ ＴＮＢ誘導体の一方をＦａｂ’チオールに変換し、等モル量の別のＦａｂ’ ＴＮＢ誘導体と混合することによって、二重特異性抗体を形成する。

本明細書に記載される抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）の何れかは、安定化分子（例えば、抗体又はその抗原結合断片の対象又は溶液における半減期を増加させる分子）に結合することができる。安定化分子の非限定的な例は、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）又はタンパク質（例えばヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン）を含む。安定化分子のコンジュゲーションは、インビトロ（例えば、組織培養物中又は医薬組成物の形態での保存中）又はインビボ（例えば、ヒト体内）での抗体又は抗原結合断片の半減期を増加させるか又はその生物活性を延長させることができる。

抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）も様々な形態を有することができる。多くの異なる形態の抗原結合構築物は、当該技術分野で公知であり、例えばＳｕｕｒｓら、「Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓｉｎｏｎｃｏｌｏｇｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１９年）に記載されており、これは全体が参照により本明細書に組み込まれる。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＢｉＴｅ、（ｓｃＦｖ）２、ナノボディ－ＨＳＡ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、ＨＳＡｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＨＡＳ又はタンデムｓｃＦｖである。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＶＨＨ－ｓｃＡｂ、ＶＨＨ－Ｆａｂ、二重ｓｃＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、二重抗体、ｃｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（二重結合）、ＤＡＦ（四重結合）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ＩｇＧ、ノブイントホール構造（ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ）共通軽鎖、ノブイントホール構造コンポーネント、電荷対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ－ｂｏｄｙ、直交Ｆａｂ、ＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ、ＤＶＩ－ＩｇＧ、二重抗体－ＣＨ３、三重抗体（ｔｒｉｐｌｅｂｏｄｙ）、ミニアンティバディ（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ＴｒｉＢｉミニ抗体（ＴｒｉＢｉｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃ二重抗体－Ｆｃ、二重抗体－Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、細胞内抗体、ドックアンドロック（ｄｏｃｋａｎｄｌｏｃｋ）、ｌｍｍＴＡＣ、ＩｇＧ－ＩｇＧ複合体、Ｃｏｖ－Ｘ－Ｂｏｄｙ又はｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２である。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＴｒｉｏＭａｂであってもよい。ＴｒｉｏＭａｂでは、２本の重鎖は、異なる種に由来し、ここで、異なる配列は、重鎖－軽鎖のペアリングを制限する。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、２本の異なる重鎖及び１本の共通軽鎖を有する。重鎖のヘテロ二量体化作用は、ノブイントホール構造又は幾つかの他の重鎖ペアリング技術に基づくことができる。

幾つかの実施形態において、ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術を用いて二重特異性抗体を産生することができる。ＣｒｏｓｓＭＡｂ技術を用いて二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ抗体において正確な軽鎖結合を達成するために、当該技術は、様々な二重特異性抗体形態の産生を可能にし、ビス－（１＋１）、トリス－（２＋１）及びテトラ？－（２＋２）価の二重特異性抗体、及び非Ｆｃタンデム抗原結合断片（Ｆａｂ）に基づく抗体を含む。これらの形態は、共通の軽鎖の同定、翻訳後の加工／インビトロ化学的組み立て、又は正しい軽鎖結合を達成する突然変異群の導入を必要とせずに、ドメイン交差を用いて任意の既存の抗体対から誘導することができる。当該方法は、Ｋｌｅｉｎら、「ＴｈｅｕｓｅｏｆＣｒｏｓｓＭＡｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｂｉ－ａｎｄｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．、第８巻第６期、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、２０１６年に記載されており、それは、その全体が参照により組み込まれる。幾つかの実施形態において、重鎖におけるＣＨ１及び軽鎖におけるＣＬドメインは、交換される。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、２：１ＣｒｏｓｓＭａｂであってもよい。他のＦａｂ断片をＣｒｏｓｓＭａｂのＶＨドメインのＮ末端に追加する。ＣｒｏｓｓＭａｂに追加されたＦａｂ断片は、二価結合を実現することで親和性を増加させる。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、２：２ＣｒｏｓｓＭａｂであってもよい。当該四価二重特異性抗体は、Ｆａｂ断片をＣｒｏｓｓＭａｂの各Ｃ末端に融合させることにより産生される。これらのＦａｂ断片は、これらのＣＨ１がこれらのＣＬと交換されるように交差され得る。ＶＨはこれらのＣＬに融合し、且つＶＬはこれらのＣＨ１に融合する。Ｆａｂ断片におけるＣｒｏｓｓＭａｂ技術は、特異的なペアリングを確保する。親和性は、二重二価結合によって高めることができる。

抗原結合タンパク質構築物は、Ｄｕｏｂｏｄｙであってもよい。ＩｇＧ４抗体に天然に存在するＦａｂ交換機序は、ＩｇＧ１抗体における制御された物質と類似しており、この機序は、制御されたＦａｂ交換と呼ばれる。当該形態は、重－軽鎖の間の特異的なペアリングを確保することができる。

二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）では、二重特異性標的化のために、他のＶＨ及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを各Ｎ末端に追加する。この形態は、ＩｇＧ－ｓｃＦｖと類似しているが、追加された結合ドメインは、ｓｃＦｖが各重鎖Ｎ末端に結合するのではなく、それぞれのＮ末端に単独で結合する。
ｓｃＦｖ－ＩｇＧでは、２つのｓｃＦｖは、重鎖のＣ末端に連結されている（ＣＨ３）。ｓｃＦｖ－ＩｇＧ形態は、２つの異なる二価結合部位を有し、従って四価とも呼ばれる。ｓｃＦｖ－ＩｇＧは、重鎖と軽鎖のペアリング問題がない。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＩｇＧ－ＩｇＧ形態を有することができる。２つの完全ＩｇＧ抗体は、重鎖に化学的に連結されたＣ末端を介して複合する。

抗原結合タンパク質構築物は、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ形態を有してもよい。Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ形態では、軽鎖と、重鎖と、Ｆｃ領域及びｓｃＦｖとを含む第３の鎖を組み立てる。それは効率的な製造及び精製を確保することができる。

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質構築物は、ＴＦであってもよい。３つのＦａｂ断片は、ジスルフィド架橋を介して連結される。ＴＦ形態は、Ｆｃ領域を有しない。

ＡＤＡＰＴＩＲは、Ｆｃ領域の両側に結合された２つのｓｃＦｖを有する。これは完全ＩｇＧをその構築物の基礎として放棄するが、半減期を延長し、精製を促進するためにＦｃ領域を保持する。

二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（「ＢｉＴＥ」）は、１本のペプチド鎖上の２つのｓｃＦｖ、ＶＬＡＶＨＡ及びＶＨＢＶＬＢからなる。これは、結合ドメインのみを有し、Ｆｃ領域を有しない。
ＢｉＴＥ－Ｆｃでは、Ｆｃ領域は、ＢｉＴＥ構築物に融合される。Ｆｃ領域の添加は、半減期を増加させ、それにより有効濃度を延長し、連続静脈内投与（ＩＶ）を回避する。

二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）抗体は、反対の断片、即ちＶＬＡとＶＨＢ、及びＶＬＢとＶＨＡを連結する２本のペプチド鎖を有し、それらのＣ末端にそれらを融合する硫黄結合を有する。ＤＡＲＴでは、硫黄結合は、ＢｉＴＥと比較して安定性を改善することができる。

ＤＡＲＴ－Ｆｃでは、Ｆｃ領域は、ＤＡＲＴ構造に連結される。これは、３本の鎖を組み立てることによって産生され、ここで、２本の鎖は、ＤＡＲＴなどのジスルフィド結合によって連結される。１本の鎖は、Ｆｃ領域の半分を含み、当該領域は、第３の鎖と二量体化し、Ｆｃ領域のみを発現する。Ｆｃ領域の添加は、半減期を増加させ、それにより有効濃度を延長し、連続静脈内投与（ＩＶ）を回避する。

四価ＤＡＲＴでは、４本のペプチド鎖を組み立てる。基本的には、２つのＤＡＲＴ分子を生成し、それは、Ｆｃ領域の半分を有し、二量体化する。当該形態は、２つの標的の両方に二価結合し、従って四価分子である。

タンデム二重抗体（ＴａｎｄＡｂ）は、２つの二重抗体を含む。各二重抗体は、ＶＨＡ及びＶＬＢ断片からなり、且つＶＨＡ及びＶＬＢ断片は、共有結合している。これらの２つの二重抗体は、ペプチド鎖に連結されている。２つのｓｃＦｖからなる二重抗体に比べて、その安定性が向上する。それは、２つの二価結合部位を有する。

ＳｃＦｖ－ｓｃＦｖ－毒素には、毒素及び安定なリンカーを有する２つのｓｃＦｖが含まれる。それは、ペイロードを特異的に送達するために用いられることができる。

モジュールｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖでは、ＴＡＡに対する１つのｓｃＦｖは、短い認識可能なペプチドでタグ付けされ、２つのｓｃＦｖからなるｂｓＡｂに組み立てられ、ここで、１つのｓｃＦｖがＣＤ３に対するものであり、１つのｓｃＦｖが当該認識可能なペプチドに対するものである。

ＩｍｍＴＡＣでは、安定で可溶性のＴ細胞受容体は、ＣＤ３を認識するｓｃＦｖに融合する。ＴＣＲを用いることにより、ＩｍｍＴＡＣは、標的化加工されたタンパク質、例えば細胞内タンパク質に適する。

三重特異性ナノボディは、２つの単一可変ドメイン（ナノボディ）と、半減期を延長するための他のモジュールと、を有する。追加のモジュールを追加して半減期を増加させる。

三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）では、２つのｓｃＦｖは、ヒトＩＬ－１５を組み込んだポリペプチドリンカーを介して連結されている。ＩＬ－１５に連結するリンカーを追加してＮＫの生存及び増殖を増加させる。

一態様において、本開示は、二重特異性抗体又はその抗原結合断片を提供し、当該二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、以下を含む：
（ａ）重鎖ポリペプチド：当該重鎖ポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端まで、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）、第１の接続ペプチド配列、第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）、任意選択的な重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、及び
（ｂ）軽鎖ポリペプチド、当該軽鎖ポリペプチドは、好ましくはＮ末端からＣ末端まで、第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）、第２のリンカーペプチド配列、第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）、第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）及び任意選択的な軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。

幾つかの実施形態において、ＶＨ１とＶＬ１とは互いに相互作用し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する。幾つかの実施形態において、ＶＨ２とＶＬ２とは互いに相互作用し、ＣＤ４０に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する。

幾つかの実施形態において、ＶＨ１とＶＬ１とは互いに相互作用し、ＣＤ４０に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する。幾つかの実施形態において、ＶＨ２とＶＬ２とは互いに相互作用し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する。

幾つかの実施形態において、第１の及び／又は第２のリンカーペプチドは、配列番号２０５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する配列を含む。幾つかの実施形態において、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインは、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）に由来する。幾つかの実施形態において、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４）は、ＫＩＨ及び／又はＬＡＬＡ突然変異を含む。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、図３７に示される概略構造を有する。幾つかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、配列番号１７０に示され、軽鎖ポリペプチドは、配列番号１７１に示される。

抗原結合タンパク質構築物を製造する方法
単離されたヒトタンパク質断片を免疫原として用いて、ポリクローナル及びモノクローナル抗体製造の標準技術を用いて抗体を産生することができる。ポリクローナル抗体は、抗原ペプチド又はタンパク質の複数回の注射（例えば、皮下又は腹膜内注射）によって動物体内で産生され得る。幾つかの実施形態において、抗原ペプチド又はタンパク質は、少なくとも１つのアジュバントと共に注射される。幾つかの実施形態において、抗原ペプチド又はタンパク質は、免疫される種において免疫原性を有する薬剤に複合され得る。動物は、抗原ペプチド又はタンパク質を１回よりも多い（例えば、２回、３回、又は４回）注射することができる。

全長ポリペプチド又はタンパク質、又はその抗原ペプチド断片を免疫原として用いることができる。タンパク質の抗原ペプチドは、当該タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも８個（例えば、少なくとも１０個、１５個、２０個又は３０個）のアミノ酸残基を含み、且つ当該ペプチドに対して産生された抗体が当該タンパク質と特異的な免疫複合体を形成するように当該タンパク質のエピトープを包含する。

免疫原は、通常、適切な対象（例えば、少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座を発現するヒト又はトランスジェニック動物）の免疫化による抗体の製造に用いられる。適切な免疫原性製剤は、例えば組換え発現又は化学的に合成されたポリペプチドを含むことができる。当該製剤は、アジュバント（例えばフロイント完全又は不完全アジュバント）又は類似の免疫賦活剤を更に含むことができる。

ポリクローナル抗体は、ポリペプチド又はその抗原ペプチド（例えば、タンパク質の一部）を免疫原として適切な対象に免疫することによって上記のように製造することができる。標準技術によって、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、固定化ポリペプチド又はペプチドを用いて免疫化された対象における抗体価を経時的にモニターすることができる。必要に応じて、哺乳動物（（例えば、血液）から抗体分子を単離し、且つＩｇＧ画分を得るために、周知の技術（例えばタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇクロマトグラフィー）によって更に精製する。免疫化の後の適切な時点で、例えば、特異的抗体価が最も高い場合、対象から抗体を産生する細胞を得ることができ、標準技術、例えば最初Ｋｏｈｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻：４９５～４９７ページ、１９７５年）に記載のハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、第４巻：７２ページ、１９８３年）、ＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ、ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、７７～９６ページ、１９８５年）又はトリオーマ技術（ｔｒｉｏｍａｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によってモノクローナル抗体を製造するために用いられることができる。ハイブリドーマを産生する技術は周知である（一般にＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、Ｃｏｌｉｇａｎら（編著）、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク、ＮＹを参照されたい）。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養物の上清中の目的ポリペプチド又はエピトープに結合する抗体をスクリーニングすることによって、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出する。

本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片の変異体は、本明細書に記載されるヒト、ヒト化又はキメラ抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって製造することができる。そのような変異体は、例えば、抗体又は抗原結合ドメインの抗原結合部位を構成するアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入又は置換を含む。そのような変異体の集団において、幾つかの抗体又は抗原結合断片は、標的タンパク質に対して増加した親和性を有する。欠失、挿入及び／又は組合せの任意の組合せを行って、標的に対する結合親和性が増加した抗体又はその抗原結合断片を得ることができる。抗体又は抗原結合断片に導入されるアミノ酸の変化はまた、抗体又は抗原結合断片に対する新たな翻訳後修飾を改変又は導入することができ、例えばグリコシル化部位の数を改変（例えば、増加又は減少）、グリコシル化部位のタイプを改変（例えば、異なる糖が細胞内に存在する酵素によって連結されるようにアミノ酸配列を改変）、又は新たなグリコシル化部位を導入する。

本明細書に開示される抗体は、哺乳動物を含む任意の種の動物に由来し得る。天然抗体の非限定的な例は、ヒト、霊長類動物（例えば、サル及び類人猿）、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラクダ科動物（例えば、ラクダ及びラマ）、ニワトリ、ヤギ及びげっ歯類動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター及びウサギ）（ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックげっ歯類動物を含む）に由来する抗体を含む。

ファージディスプレイ（パニング）は、所望の結合親和性を有する抗体配列を最適化するために用いられることができる。当該技術では、一本鎖Ｆｖをコードする遺伝子（ＶＨ又はＶＬを含む）を、ファージのコートタンパク質遺伝子に挿入して、当該ファージがその外側でｓｃＦｖを「ディスプレイ」する一方、その内部に当該タンパク質の遺伝子を含み、それによって遺伝子型と表現型との間の関連をもたらすことができる。次いでこれらのディスプレイファージを標的抗原に対してスクリーニングして、ディスプレイされた抗原結合部位と標的抗原との間の相互作用を検出することができる。従って、インビトロ選択と呼ばれるプロセスで増加したタンパク質ライブラリーをスクリーニング及び増幅し、所望の結合親和性を有する抗体配列を得ることができる。

ヒト及びヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する（又はヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する抗体と同じアミノ酸配列を有する）抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト生殖系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムに又は部位特異的な変異誘発、又はインビボの体細胞の突然変異により導入された突然変異）を含むことができ、例えば、ＣＤＲにある。

ヒト化抗体は、通常、非ヒトＣＤＲがグラフトされたヒトフレームワーク（ＦＲ）を有する。従って、ヒト化抗体は、非ヒト由来の導入された１つ又は複数のアミノ酸配列を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、通常「導入」残基と呼ばれ、それは、通常「導入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、基本的に例えばげっ歯類動物ＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行うことができる。これらの方法は、例えばＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第３２１巻：５２２～５２５ページ（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、第３３２巻：３２３～３２７ページ（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻：１５３４～１５３６ページ（１９８８年）に記載されており、これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。従って、「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり、ここで、完全ヒトＶドメインの一部が非ヒト種由来の対応する配列で置換されている。実際、ヒト化抗体は、通常マウス抗体であり、ここで、幾つかのＣＤＲ残基及び幾つかのＦＲ残基は、ヒト抗体の類似の部位からの残基で置換されている。

更に重要なことは、抗体をヒト化する同時に、抗原に対する高い特異性及び親和性、並びに他の有利な生物学的特性を保持することである。この目的を達成するために、ヒト化抗体は、親配列及びヒト化配列の３次元モデルを用いて親配列及び様々な概念的なヒト化産物を分析する方法によって製造することができる。３次元免疫グロブリンモデルは、当業者に一般的に利用可能であり、よく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な３次元立体構造を説明及び表示するためのコンピュータプログラムを取得することができる。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な効果の分析、即ち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。この方法により、標的抗原に対する増加した親和性などの所望の抗体特徴を得るために、受容体及び導入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。

元の配列との同一性又は相同性は、通常、候補配列を元の配列とアライメントし、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要な場合にギャップを導入した後、配列同一性の一部としての任意の保存的置換を考慮しないで、候補配列内に存在する、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体又は断片内に存在する配列と同じであるアミノ酸残基のパーセントである。

幾つかの実施形態において、抗体、その抗原結合断片又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）を共有結合修飾することができる。これらの共有結合修飾は、化学的合成又は酵素的合成によって、又は酵素的切断又は化学的切断によって行うことができる。抗体又は断片の標的アミノ酸残基が選択された側鎖又はＮ末端又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応することによって、抗体又は抗体断片の他のタイプの共有結合修飾を分子に導入する。

幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）連結したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体を提供する。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％又は２０％から４０％であってもよい。Ａｓｎ２９７に連結している全ての糖構造（例えば、複合体化、ヘテロ接合、及び高マンノース構造）の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内フコースの平均量を計算することによってフコースの量を決定し、例えばＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法（例えばＷＯ２００８／０７７５４６に記載されている）によって測定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約位置２９７に位置するアスパラニン残基を指し（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け、又はＫａｂａｔ番号付けにおける位置３１４）、しかしながら、抗体における配列の小さな配列変異のために、Ａｓｎ２９７はまた、位置２９７の上流又は下流約±３個のアミノ酸位置、即ち位置２９４と３００との間に位置する。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。幾つかの実施形態において、グリカン異質性を低減するために、抗体のＦｃ領域は、更にエンジニアリングされてアラニンで位置２９７のアスパラニン（Ｎ２９７Ａ）を置換することができる。

幾つかの実施形態において、Ｆａｂアーム交換を回避することによって生産効率を促進するために、抗体のＦｃ領域は更にエンジニアリングされてプロリンでＩｇＧ４の位置２２８（ＥＵ番号付け）のセリン（Ｓ２２８Ｐ）を置換する。Ｓ２２８突然変異の詳細な説明は、例えばＳｉｌｖａら、「ＴｈｅＳ２２８ＰｍｕｔａｔｉｏｎｐｒｅｖｅｎｔｓｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏＩｇＧ４Ｆａｂ－ａｒｍｅｘｃｈａｎｇｅａｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｕｓｉｎｇａｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｍａｔｒｉｘｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９０．９（２０１５年）：５４６２～５４６９ページに記載されており、これは全体が参照により組み込まれる。

幾つかの実施形態において、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ／Ｌｅｕ２３５Ａｌａ（ＥＵ番号付け）（ＬＡＬＡ）突然変異を導入して、抗体エフェクター機能を破壊する。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、二重特異性抗体を製造するように設計される。二重特異性抗体は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセントを最大にするように、１対の抗体分子の間の界面をエンジニアリングすることによって製造できる。例えば、当該界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含むことができる。当該方法では、第１の抗体分子界面からの１本又は複数本の小さなアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換される。大きなアミノ酸側鎖を小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）で置換することにより、第２の抗体分子の界面に大きな側鎖のサイズと同じ又は類似の補償された「空洞」が形成される。これは、ヘテロ二量体の収率を他の不要な最終生成物（ホモ二量体など）よりも高くする機序を提供する。当該方法は、例えばＷＯ９６／２７０１１に記載されており、それは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

幾つかの実施形態において、ヘテロ二量体化を促進するために、各重鎖に「ノブ」又は「ホール」を産生するようにＣＨ３ドメインをエンジニアリングすることを含む、ノブイントホール（ＫＩＨ）技術を使用してもよい。ＫＩＨ技術は、例えばＸｕ，Ｙｉｒｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎ ’ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ ｕｓｉｎｇａｃｅｌｌ－ｆｒｅｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ」、ＭＡｂｓ、第７巻第１期、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ、２０１５年、それは、その全体が参照により組み込まれる。幾つかの実施形態において、１本の重鎖は、Ｔ３６６Ｗ及び／又はＳ３５４Ｃ（ノブ）置換（ＥＵ番号付け）を有し、もう１本の重鎖は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖ（ホール）置換（ＥＵ番号付け）を有する。幾つかの実施形態において、１本の重鎖は、Ｙ３４９Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）という置換のうちの１つ又は複数を有する。もう１本の重鎖は、Ｅ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ（ＥＵ番号付け）という置換のうちの１つ又は複数を有することができる。更に、２つの置換のＩｇＧのヒンジ領域に置換（－ｐｐｃｐＳｃｐ－－＞－ｐｐｃｐＰｃｐ－）を導入することができる。

更に、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて二重特異性抗体を精製することができる。アニオン交換クロマトグラフィーは、正電荷を持つ基（ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）など）を含むイオン交換樹脂を用いて、物質の電荷に基づいて物質を分離する方法である。溶液では、樹脂は正電荷を持つ対イオン（カチオン）で被覆される。アニオン交換樹脂は、負電荷を持つ分子と結合し、対イオンと置換される。タンパク質の等電点（ｐＩ）に基づいてアニオン交換クロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製することができる。等電点は、タンパク質が正味電荷を有しない時のｐＨとして定義される。ｐＨ＞ｐＩの時に、タンパク質は正味の負電荷を有し、ｐＨ＜ｐＩの時に、タンパク質は正味の正電荷を有する。従って、幾つかの実施形態において、２本のアームＡを含むホモ二量体のｐＩが２本のアームＢを含むホモ二量体のｐＩと異なるように、異なるアミノ酸置換を２つの重鎖に導入することができる。アームＡ及びアームＢを有する二重特異性抗体のｐＩは、ホモ二量体の２つのｐＩの間にある。従って、２つのホモ二量体及び二重特異性抗体は、異なるｐＨ条件下で放出され得る。本開示は、ｐＩを調節するために、幾つかのアミノ酸残基置換が重鎖に導入され得ることを示している。

従って、幾つかの実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付け位置８３のアミノ酸残基は、リジン、アルギニン又はヒスチジンである。幾つかの実施形態において、位置１、６、４３、８１及び１０５（Ｋａｂａｔ番号付け）のうちの１つ又は複数の位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。幾つかの実施形態において、位置１３及び１０５（Ｋａｂａｔ番号付け）のうちの１つ又は複数の位置のアミノ酸残基は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。幾つかの実施形態において、位置１３及び４２（Ｋａｂａｔ番号付け）のうちの１つ又は複数の位置のアミノ酸残基は、リジン、アルギニン、ヒスチジン又はグリシンである。

二重特異性抗体は、例えば架橋又は「異種複合」抗体を更に含むことができる。例えば、異種複合体における抗体の一方は、抗ビオチンタンパク質にカップリングすることができ、他方は、ビオチンにカップリングすることができる。また、任意の便利な架橋方法を使用して異種複合抗体を製造することができる。適切な架橋剤及び架橋技術は、当該技術分野において周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

組換えベクター
本開示は、本明細書に開示される単離ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組換えベクター（例えば、発現ベクター）、これらの組換えベクターを導入する宿主細胞（即ち、これらの宿主細胞がポリヌクレオチドを含むように、及び／又はポリヌクレオチドを含むベクター）、並びに組換え技術による組換え抗体ポリペプチド又はその断片の産生を更に提供する。

本明細書で使用されるように、「ベクター」は、ベクターが宿主細胞に導入されると、１つ又は複数の目的ポリヌクレオチドを当該宿主細胞に送達することができる任意の構築物である。「発現ベクター」は、当該発現ベクターが導入された宿主細胞内で、１つ又は複数の目的ポリヌクレオチドを送達し、それをコードされるポリペプチドとして発現させることができる。従って、発現ベクターでは、当該ベクター内又は宿主細胞のゲノム中の目的ポリヌクレオチドの統合部位で、又はその近傍又は両側の調節要素（例えば、プロモーター、エンハンサー及び／又はｐｏｌｙ－Ａ尾）に操作可能に連結することによって、当該目的ポリヌクレオチドが当該発現ベクターに導入された宿主細胞において翻訳されるように、当該目的ポリヌクレオチドが当該ベクター中で発現するように局在化される。

ベクターは、電気穿孔、化学的トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－グルカン）、形質転換、トランスフェクション、感染及び／又は形質導入（例えば、組換えウイルスによる）などの当該技術分野で公知の方法で宿主細胞に導入することができる。従って、ベクターの非限定的な例は、（組換えウイルスの産生に有用な）ウイルスベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージベクター、及びカチオン性縮合剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターを含む。

幾つかの実施形態において、ウイルス発現系（例えば、ワクシニア又は他のポックスウイルス、レトロウイルス又はアデノウイルス）を用いて本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を導入することは、非病原性（欠陥性）、複製能を有するウイルスの使用を伴ってもよく、又は複製欠陥ウイルスを使用してもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、通常、相補的ウイルスパッケージング細胞においてのみ起こる。適切なシステムは、例えばＦｉｓｈｅｒ－Ｈｏｃｈら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８６巻：３１７～３２１ページ；Ｆｌｅｘｎｅｒら、１９８９年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．ＡｃａｄＳｃｉ．、第５６９巻：８６～１０３ページ；Ｆｌｅｘｎｅｒら、１９９０年、Ｖａｃｃｉｎｅ、第８巻：１７～２１ページ；米国特許第４，６０３，１１２、４，７６９，３３０及び５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ２，２００，６５１；ＥＰ０，３４５，２４２；ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ－Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第６巻：６１６～６２７ページ、１９８８年；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５２巻：４３１～４３４ページ；Ｋｏｌｌｓら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻：２１５～２１９ページ；Ｋａｓｓ－Ｅｓｉｓｌｅｒら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻：１１４９８～１１５０２ページ；Ｇｕｚｍａｎら、１９９３年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第８８巻：２８３８～２８４８ページ；及びＧｕｚｍａｎら、１９９３年、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．、第７３巻：１２０２～１２０７ページに開示されている。ＤＮＡをそのような発現系に組み込むための技術は、当業者に周知である。ＤＮＡは更に、例えばＵｌｍｅｒら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５９巻：１７４５～１７４９ページ；及びＣｏｈｅｎ、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５９巻：１６９１～１６９２ページのように、「裸」であってもよい。細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡを被覆することによって裸のＤＮＡの取り込みを増加することができる。

発現のために、本明細書に開示される抗体又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ挿入断片は、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの好適なプロモーター（例えば、異種プロモーター）に操作可能に連結され得る。他の適切なプロモーターは当業者に知られている。発現構築物は、転写開始部位、転写終了部位を更に含み、及び翻訳のためのリボソーム結合部位を転写領域に含むことができる。構築物によって発現される成熟転写産物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの開始位置における翻訳開始コドン、及び翻訳されるポリペプチドの末端の適切な位置における終端コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含むことができる。

上記のように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むことができる。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性遺伝子、及び大腸菌及び他の細菌での培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例として、大腸菌、ストレプトマイセス菌、及びネズミチフス菌細胞などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、ハエＳ２及びスポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓ黒色腫及びＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞、及び植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される宿主細胞における使用のための適切な培地及び条件は、当該技術分野において公知である。

細菌のための非限定的なベクターは、Ｑｉａｇｅｎから得たｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ－９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得たｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、及びＰｈａｒｍａｃｉａから得たｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。非限定的な真核ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得たｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ、及びＰｈａｒｍａｃｉａから得たｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬを含む。他の適切なベクターは、当業者にとって明らかであろう。

好適な非限定的細菌プロモーターとしては、大腸菌ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲ及びＰＬプロモーター、並びにｔｒｐプロモーターが含まれる。適切な真核プロモーターは、ＣＭＶ即時早期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲプロモーター（ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓｓａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）プロモーターなど）、及びメタロチオネインプロモーター（マウスメタロチオネイン？Ｉプロモーターなど）が含まれる。

出芽酵母では、α因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性プロモーターを含む多くのベクターを使用することができる。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８９年）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、Ｎ．Ｙ、及びＧｒａｎｔら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．、第１５３卷：５１６～５４４ページ（１９９７年）を参照されたい。

宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、又は他の方法によって達成され得る。これらの方法は、Ｄａｖｉｓら、ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓＩｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（１９８６年）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させることができる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常約１０ｂｐ～３００ｂｐであり、その作用は所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増加させることである。エンハンサーの例としては、塩基対１００～２７０の複製起点よりも後側（ｌａｔｅｓｉｄｅ）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点よりも後側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。

翻訳されたタンパク質を小胞体内腔、細胞周囲の間質、又は細胞外環境に分泌させるために、適切な分泌シグナルを発現されたポリペプチドに組み込むことができる。シグナルは、ポリペプチドの内因性シグナルであってもよく、異種シグナルであってもよい。

ポリペプチド（例えば、抗体）は、修飾形態、例えば、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質）又はヒスチジンタグを伴って発現され得、分泌シグナルだけでなく、他の異種機能領域も含み得る。例えば、他のアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域をポリペプチドのＮ末端に添加して、宿主細胞中、精製中、又はその後の取り扱い及び貯蔵中の安定性及び持続性を改善することができる。更に、精製を容易にするためにペプチド部分をポリペプチドに添加することができる。これらの領域は、ポリペプチドの最終的な調製の前に除去され得る。分泌又は排出を引き起こし、安定性を高め、精製を促進するためにペプチド部分をポリペプチドに添加することは、当該技術分野において周知の従来技術である。

本開示は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の何れかと少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する核酸配列、及び本明細書に記載されるアミノ酸配列の何れかと少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列を更に提供する。

本開示は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の何れかと少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する核酸配列、及び本明細書に記載されるアミノ酸配列の何れかと少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有するアミノ酸配列を更に提供する。

幾つかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載のペプチドの何れかをコードするヌクレオチド配列、又は本明細書に記載のヌクレオチド配列の何れかによってコードされるアミノ酸配列の何れかに関する。幾つかの実施形態において、核酸配列は、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、５００個又は６００個のヌクレオチド未満である。幾つかの実施形態において、アミノ酸配列は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、又は４００個のアミノ酸残基未満である。

幾つかの実施形態において、アミノ酸配列は（ｉ）アミノ酸配列を含み、又は（ｉｉ）アミノ酸配列からなり、ここで、当該アミノ酸配列が、本明細書に記載される配列の何れかである。

幾つかの実施形態において、核酸配列は（ｉ）核酸配列を含み、又は（ｉｉ）核酸配列からなり、ここで、当該核酸配列は、本明細書に記載される配列の何れかである。

２本のアミノ酸配列又は２本の核酸配列の同一性パーセントを決定するために、これらの配列を最適な比較目的でアライメントする（例えば、ギャップが最適アライメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入されてもよく、非相同配列が比較目的で無視されてもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、これらの分子は、当該位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アライメントを達成するために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列に共通の同じ位置の数の関数である。例示の目的で、配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスを使用して達成され得、ここで、ギャップペナルティは１２であり、ギャップ伸長ペナルティは４であり、フレームシフトギャップペナルティは５である。

配列相同性（例えば、アミノ酸配列相同性又は核酸相同性）のパーセントも、決定され得る。配列相同性のパーセントを決定する方法は、当該技術分野で公知である。幾つかの実施形態において、類似の理化学的性質（相同性パーセント）を有する保存アミノ酸残基、例えばロイシン及びイソロイシンは、配列類似性を測定するために使用され得る。類似の理化学的性質を有するアミノ酸残基のファミリーが、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、例えば、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。多くの場合、相同性パーセントは、同一性パーセントよりも高い。

本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドの何れかをコードする１つ又は複数の核酸を提供する。幾つかの実施形態において、核酸（例えばｃＤＮＡ）は、本明細書に記載される重鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、核酸は、本明細書に記載される軽鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、核酸は、本明細書に記載されるｓｃＦｖポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

幾つかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載される、ＰＤ－１に共通に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする核酸の両方を有することができる。幾つかの実施形態において、各ベクターが本明細書に記載される核酸の１つを含み、ＰＤ－１に共通に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域を共にコードする、一対のベクターを提供する。幾つかの実施形態において、ベクターは、本明細書に記載される核酸の両方を含み、ここで、ベクターは、ＣＤ４０に共通に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域をコードする。幾つかの実施形態において、各ベクターが本明細書に記載される核酸の１つを含み、ＣＤ４０に共通に結合するＶＬ領域及びＶＨ領域を共にコードする、１対のベクターを提供する。

ベクターはまた、特異的抗体又はポリペプチドを発現するように構築され得る。幾つかの実施形態において、ベクターは、１本又は複数本の抗体ポリペプチド鎖を共発現するように構築され得る。幾つかの実施形態において、ベクターは、５’末端から３’末端まで、サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）、第１のポリペプチド鎖をコードする配列、ポリアデニル化（ＰｏｌｙＡ）、ＣＭＶ、第２のポリペプチド鎖をコードする配列、ＰｏｌｙＡ、サル空胞ウイルス４０ターミネーター（ＳＶ４０）、及びグルタミン合成酵素マーカー（ＧＳ）の配列を含有することができる。幾つかの実施形態において、ベクターは、抗ＣＤ４０抗体ｓｃＦｖポリペプチド鎖を発現するように構築することができる。

治療方法
本明細書に記載される方法は、がんに関連する病状を治療するための方法を含む。通常、方法は、このような治療を必要とする、又は必要と判断された対象に、治療有効量の本明細書に記載されるエンジニアリング抗体、その抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）を投与することを含む。

本明細書で使用されるように、「治療する」は、がんに関連する病状の少なくとも１つの症状を改善することを意味する。通常、がんは死亡を引き起こし、従って、治療は、平均余命（例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、又は少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年）を増加させることができる。がんに関連する病状を治療するため、治療有効量の本明細書に記載される薬剤の投与は、がん細胞の数の減少及び／又は症状の軽減をもたらす。

本明細書で使用されるように、用語「がん」は、自己増殖能力を有する細胞、即ち、急速増殖性細胞増殖を特徴とする異常な状態又は状況を指す。当該用語は、その病理組織型又は侵襲段階に関わらず、がん性の増殖又は発がん過程、転移組織又は悪性に形質転換された細胞、組織又は器官の全てのタイプを含むことを意図する。本明細書で使用されるように、用語「腫瘍」は、がん細胞、例えば、がん細胞塊を指す。本明細書に記載される方法を用いて治療又は診断することができるがんには、肺、乳腺、甲状腺、リンパ系、胃腸管及び尿生殖路に影響を及ぼす悪性腫瘍などの様々な器官系の悪性腫瘍、及びほとんどの結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、非小細胞肺がん、小腸がん、及び食道がんなどの悪性腫瘍を含む腺がんが挙げられる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される薬剤は、対象におけるがんを治療又は診断するように設計される。用語「がん」は、当該技術分野で公知であり、呼吸器系がん、胃腸系がん、泌尿生殖器系がん、精巣がん、乳がん、前立腺がん、内分泌系がん及び黒色腫を含む、上皮又は内分泌組織の悪性腫瘍を指す。幾つかの実施形態において、がんは腎臓がん又は黒色腫である。例示的ながんには、子宮頸部、肺、前立腺、乳腺、頭部及び頸部、結腸及び卵巣の組織から形成されるがんが含まれる。この用語は、例えば、がん組織及び肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む、がん肉腫を更に含む。「腺がん」は、腺組織に由来するがん、又はここで、腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがんを指す。用語「肉腫」は、当該技術分野で公知であり、間葉系由来の悪性腫瘍を指す。

幾つかの実施形態において、がんは化学療法抵抗性がんである。
一態様において、本開示は、対象におけるがんを治療する方法、対象における経時的な腫瘍体積の増加率を低下させる方法、転移を形成するリスクを低下させる方法、又は対象における他の転移を形成するリスクを低下させる方法を更に提供する。幾つかの実施形態において、治療は、がんの進行を停止、緩和、遅延、又は阻害することができる。幾つかの実施形態において、治療は、対象におけるがんの１つ又は複数の症状の数、重症度、及び／又は持続時間を減少させることができる。

一態様において、本開示は、治療有効量の本明細書に開示される抗体、その抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）、又は抗体薬物複合体を、それを必要とする対象、例えば、がんに罹患している、又は罹患していると同定若しくは診断された対象に投与することを含む方法を有し、当該がんは、例えば乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、カルチノイド、子宮頸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝がん、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、尿路がん、又は血液悪性腫瘍である。幾つかの実施形態において、がんは、切除不可能な黒色腫若しくは転移性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膀胱がん、又は転移性ホルモン不応性前立腺がんである。幾つかの実施形態において、対象は、固形腫瘍に罹患している。幾つかの実施形態において、がんは、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）又は結腸直腸がんである。幾つかの実施形態において、対象はホジキンリンパ腫に罹患している。幾つかの実施形態において、対象は、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、胃がん、尿路上皮がん、メルケル細胞がん、又は頭頸部がんに罹患している。

幾つかの実施形態において、がんは、黒色腫、膵臓がん、中皮腫、血液悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、又は進行性固形腫瘍である。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、熱腫瘍を治療するために用いられることができる。熱腫瘍は、強い免疫応答を誘発し得る腫瘍である。熱腫瘍は、通常、その表面に多くの分子を有し、これらの分子は、Ｔ細胞が腫瘍細胞を攻撃し、死滅させることを可能にする。本明細書に記載される方法は、免疫応答を更に向上させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び浸潤を促進し、及び／又は腫瘍中の骨髄由来免疫抑制細胞の数を減少させることができる。

幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、冷腫瘍を治療するために用いられることができる。冷腫瘍は、強い免疫応答を引き起こす可能性が低い腫瘍である。冷腫瘍は、免疫応答を阻害し、Ｔ細胞による攻撃を妨げ、腫瘍細胞を死滅させる能力を有する細胞によってしばしば取り囲まれる。本明細書に記載される方法は、ＤＣ細胞の増殖、浸潤、及び／又は活性化を促進するのに有効であり、これにより抗原提示細胞の活性を増大させる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現を下方制御し、それによって、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を更に低減させ、免疫応答を向上させることができる。本明細書で使用されるように、用語「対象」及び「患者」は、本明細書全体を通して交換可能に使用され、且つ本発明の方法に従って治療が提供される動物（ヒト又は非ヒト）について記載される。本発明は、獣医及び非獣医の両方の用途を考慮する。ヒト患者は、成人又は青少年（例えば、１８歳以下のヒト）であり得る。ヒトに加えて、患者としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類動物が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、非ヒト霊長類動物（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類動物（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ目動物、ブタ（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、並びに他の家畜、農場動物及び動物園の動物が挙げられる。

幾つかの実施形態において、本明細書に開示される組成物及び方法は、がんのリスクのある患者を治療するために用いられることができる。がん患者は、当該技術分野で公知の様々な方法で特定され得る。

本明細書で使用されるように、「有効量」は、疾患（例えば、がん）の進行の停止、緩和、遅延、又は阻害を含む有益な又は所望の結果を達成するのに十分な量又は用量を指す。有効量は、例えば、抗体、抗原結合断片、抗体薬物複合体、抗体をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、及び／又はその組成物が投与される対象の年齢及び体重、症状の重症度、並びに投与経路に応じて変化し、従って、投与は、個体に基づいて決定され得る。

有効量は、１回又は複数回の投与で投与されてもよい。例えば、抗体、抗原結合断片、又は抗体薬物複合体の有効量は、患者における自己免疫疾患又はがんの進行を改善、停止、安定化、逆転、阻害、緩和、及び／又は遅延させるのに十分な量であるか、又はインビトロで細胞（例えば、生検細胞、本明細書に記載のがん細胞の何れか又は細胞株（例えば、がん細胞株））の増殖を改善、停止、安定化、逆転、緩和、及び／又は遅延させるのに十分な量である。当該技術分野で理解されるように、抗体、抗原結合断片、又は抗体薬物複合体の有効量は、特に患者の病歴、並びに使用される抗体のタイプ（及び／又は用量）などの他の要因に応じて変動し得る。

本明細書に開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗体薬物複合体、及び／又は組成物の有効量及び投与計画は、経験的に決定され得、そのような決定は、当該技術分野の技術の範囲内である。当業者は、投与されるべき用量が、例えば、本明細書に開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗体薬物複合体、及び／又は組成物を受けるべき哺乳動物、投与経路、使用される本明細書に開示される抗体、抗体をコードするポリヌクレオチド、抗原結合断片、抗体薬物複合体、及び／又は組成物の特定のタイプ、並びに哺乳動物に投与される他の薬物に応じて変化することを理解するであろう。抗体又は抗原結合断片の適切な用量を選択するための指針は、抗体及び抗原結合断片の治療的使用に関する文献、例えばＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｆｅｒｒｏｎｅら編著、ＮｏｇｅｓＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＰａｒｋＲｉｄｇｅ、Ｎ．Ｊ．、１９８５年、第２２章３０３～３５７ページ；Ｓｍｉｔｈら、ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎＨｕｍａｎＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＴｈｅｒａｐｙ、Ｈａｂｅｒら編著、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７７年、３６５～３８９ページを参照することができる。

有効量の抗体、その抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質構築物（例えば二重特異性抗体）の典型的な１日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇである。幾つかの実施形態において、用量は、１００ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ未満であり得る。幾つかの実施形態において、用量は、３０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、又は０．０１ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。幾つかの実施形態において、用量は、約又は少なくとも３０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇである。

本明細書に記載される方法の何れかにおいて、少なくとも１つの抗体、その抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）、抗体薬物複合体、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合断片、抗体薬物複合体、又は医薬組成物の何れか）、及び任意選択で少なくとも１つの追加の治療剤を、対象に少なくとも週１回（例えば、週１回、週２回、週３回、週４回、１日１回、１日２回、又は１日３回）投与することができる。幾つかの実施形態において、少なくとも２つの異なる抗体及び／又は抗原結合断片は、同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの抗体、その抗原結合断片、抗原結合タンパク質構築物（例えば、二重特異性抗体）又は抗体薬物複合体、及び少なくとも１つの追加の治療剤は、同じ組成物（例えば、液体組成物）で投与される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片及び少なくとも１つの追加の治療剤は、２つの異なる組成物（例えば、少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片を含む液体組成物及び少なくとも１つの追加の治療剤を含む固体経口組成物）で投与される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、丸剤、錠剤又はカプセル剤の形態で投与される。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は、持続放出経口製剤として投与される。

幾つかの実施形態において、１つ又は複数の他の治療剤は、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、抗体薬物複合体、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物の何れか）の投与前又は投与後に対象に投与され得る。幾つかの実施形態において、１つ又は複数の追加の治療剤及び少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、抗体薬物複合体、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物の何れか）は、対象における１つ又は複数の追加の治療剤及び当該少なくとも１つの抗体又は抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物の何れか）の生物学的活性期間が重複するように、対象に投与される。

幾つかの実施形態において、少なくとも１つの抗体、抗原結合抗体断片、抗体薬物複合体、又は医薬組成物（例えば、本明細書に記載される抗体、抗原結合抗体断片、又は医薬組成物の何れか）は、延長された期間（例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１年、２年、３年、４年又は５年の期間）にわたって対象に投与され得る。熟練した医療専門家は、本明細書に記載される方法の何れかを使用して、治療有効性を診断又は追跡する（例えば、がんの少なくとも１つの症状を観察する）ために、治療期間の長さを決定し得る。本明細書に記載されるように、熟練した医療専門家は更に、対象に投与される抗体若しくは抗原結合抗体断片、抗体薬物複合体（及び／又は１つ又は複数の追加の治療剤）の同一性及び数を変更（例えば、増加又は減少）することができ、対象に投与される少なくとも１つの抗体若しくは抗原結合抗体断片（及び／又は１つ又は複数の追加の治療剤）の用量又は頻度を、治療有効性の評価に基づいて（例えば、本明細書に記載され、当技術分野で公知の方法の何れかを使用して）調節（例えば、増加又は減少）することができる。

幾つかの実施形態において、１つ又は複数の追加の治療剤を対象に投与することができる。当該追加の治療剤は、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤、Ｋ－Ｒａｓ阻害剤、ｃ－Ｍｅｔ阻害剤、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、Ａｋｔ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤、及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）及び／又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）阻害剤からなる群より選ばれた１つ又は複数の阻害剤を含み得る。幾つかの実施形態において、追加の治療剤は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１（ＩＤＯ１）阻害剤（例えば、ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ）である。

幾つかの実施形態において、追加の治療剤は、ＨＥＲ３阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤、ＭＤＭ２阻害剤、ＢＣＬ２阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路（ｈｅｄｇｅｈｏｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ）の阻害剤、及びエストロゲン受容体を選択的に分解する薬剤からなる群より選ばれた１つ又は複数の阻害剤を含み得る。

幾つかの実施形態において、追加の治療剤は、トラベクテジン（Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ）、ナブパクリタキセル（ｎａｂ－ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、トレバナニブ（Ｔｒｅｂａｎａｎｉｂ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、セディラニブ（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ）、パルボシクリブ（Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ（ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ）、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ、アリムタ（Ａｌｉｍｔａ）、Ｚｙｋａｄｉａ、Ｓｕｔｅｎｔ、テムシロリムス（ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、アキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ（ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ）、ビンフルニン（Ｖｉｎｆｌｕｎｉｎｅ）、Ｈｓｐ９０阻害剤、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テモゾロミド（Ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンカリン、サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、レナリドマイド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、アザシチジン（ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ボーテゾミッド（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｄ）、アムルビシン（ａｍｒｕｂｉｃｉｎ）、カルフィルゾミブ（ｃａｒｆｉｌｚｏｍｉｂ）、プララトレキサート（ｐｒａｌａｔｒｅｘａｔｅ）及びエンザスタウリン（ｅｎｚａｓｔａｕｒｉｎ）からなる群より選ばれた１つ又は複数の治療剤を含み得る。

幾つかの実施形態において、追加の治療剤は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＨＶＥＭアンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１標的治療、ＣＸＣＬ９標的治療、ＣＸＣＬ１０標的治療、ＣＣＬ５標的治療、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニスト、及びセレクチンアゴニストからなる群より選ばれた１つ又は複数の治療剤を含み得る。

幾つかの実施形態において、カルボプラチン、アルブミン結合パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド、ゲムシタビン、ＦＯＬＦＯＸ、又はＦＯＬＦＩＲＩを対象に投与する。

幾つかの実施形態において、追加の治療剤は抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体又は抗ＧＩＴＲ抗体である。

幾つかの実施形態において、ＰＤ１／ＣＤ４０二重特異性抗体は、ＰＤ－１発現細胞（例えば、Ｔ細胞）の非存在下では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）においてＣＤ４０シグナル伝達経路を効果的に活性化することができない。

幾つかの実施形態において、ＰＤ１／ＣＤ４０二重特異性抗体は、ＰＤ－１発現細胞の存在下でＣＤ４０シグナル伝達経路を効果的に活性化することができる。

医薬組成物及び投与経路
本明細書は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物、抗体（例えば二重特異性抗体）、抗原結合断片、又は抗体薬物複合体のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ又は４つ）を含む医薬組成物を更に提供する。本明細書に記載の抗原結合タンパク質構築物、抗体、抗原結合断片、又は抗体薬物複合体のうちの何れか２つ又はそれ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）は、任意の組合せで医薬組成物中に存在し得る。医薬組成物は、当該技術分野で公知の任意の方法で製剤化され得る。

医薬組成物は、意図される投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）と適合するように製剤化される。組成物は、滅菌希釈剤（例えば、滅菌水又は生理食塩水）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒、抗菌剤又は抗真菌剤（ベンジルアルコール又はメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩など）、及び等張化剤（糖（例えば、グルコース）、ポリオール（例えば、マンニトール又はソルビトール）、又は塩（例えば、塩化ナトリウム））、又はそれらの任意の組合せを含み得る。リポソーム懸濁液はまた、薬学的に許容されるベクターとして使用され得る（例えば、米国特許第４，５２２，８１１号を参照）。組成物の製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又は多用量のバイアルに製剤化及び封入してもよい。所望により（例えば、注射用製剤において）、適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）又は界面活性剤の使用により維持され得る。抗体又はその抗原結合断片の吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含むことによって延長され得る。或いは、制御放出は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムによって達成されてもよく、それは、生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸、Ａｌｚａ社及びＮｏｖａ製薬社）を含むことができる。

本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物、抗体、抗原結合断片、抗体薬物複合体のうちの何れか１つ又は複数を含む組成物は、投与単位形態（即ち、投与及び投与均一性を容易にするために、所定の量の活性化合物を含む物理的に別個の単位）での非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）投与のために製剤化されてもよい。

標準的な医薬的方法によって細胞培養物又は実験動物（例えば、サル）において組成物の毒性及び治療効果を決定することができる。ＬＤ５０（５０％集団致死用量）及びＥＤ５０（５０％集団治療上有効な用量）：治療指数はＬＤ５０：ＥＤ５０の比率として決定され得る。高い治療指数を示す薬剤が好ましい。薬物が望ましくない副作用を示す場合、潜在的な損傷を最小限にする（即ち、望ましくない副作用を低減する）ことに留意すべきである。毒性及び治療効果は、他の標準的な医薬的方法によって決定することができる。

細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、対象（例えば、ヒト）に対する任意の所定の薬剤の適切な用量を製剤化するために用いられ得る。１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ又は４つ）の抗原結合タンパク質構築物、抗体又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗体断片の何れか）の治療有効量は、対象（例えば、がんを有すると同定されたヒト対象）又は疾患リスクがあると同定された対象（例えば、以前にがんを有していたが、現在治癒していた対象）における疾患を治療する（例えば、がん細胞を死滅させる）、対象（例えば、ヒト）における疾患の１つ又は複数の病状の重症度、頻度及び／又は持続時間を低減する量である。本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物、抗体又は抗原結合断片の何れかの有効性及び用量は、当該技術分野で公知の方法を用いて、医療従事者や獣医師によって、並びに対象（例えば、ヒト）における疾患の１つ又は複数の病状を観察することによって決定され得る。特定の因子は、対象の有効な治療のために必要とされる用量及びスケジュール（例えば、疾患又は病状の重症度、以前の治療、対象の一般的な健康状況及び／又は年齢、並びに他の疾患の存在）に影響を与え得る。

例示的な用量は、ミリグラム又はマイクログラム量の本明細書に記載される抗原結合タンパク質構築物、抗体又は抗原結合断片又は抗体薬物複合体の何れか／キログラムの対象の体重（例えば、約１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇ）を含む。これらの用量は広い範囲を包含するが、当業者は、治療剤（抗原結合タンパク質構築物、抗体及びその抗原結合断片を含む）の薬効が様々であり、且つ有効量が当該技術分野で公知の方法によって決定され得ることを理解するであろう。通常、まず比較的低い用量を投与し、その後、適切な応答が達成されるまで、主治医である医療従事者や獣医師（治療用途の場合）又は研究者（開発段階で依然として取り組んでいる場合）が用量を徐々に増加させることができる。更に、任意の特定の対象の具体的な用量レベルは、使用される具体的な化合物の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康状況、性別及び飲食、投与時間、投与経路、排出速度及び抗体又は抗体断片のインビボでの半減期を含む、様々な因子に依存することが理解されるべきである。

医薬組成物は、使用明細書と共に容器、包装又はディスペンサーに含まれてもよい。本開示はまた、本明細書に記載される様々な用途のための抗体又はその抗原結合断片又は抗体？薬物複合体を製造する方法を提供する。

実施例
本発明を以下の実施例に更に説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：抗ＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体の製造
２つの抗ＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を設計した。図１Ａに示すように、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧＢｓＡｂは、重鎖及び軽鎖を含む抗ＰＤ－１アームと、ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む抗ＣＤ４０アームと、を有する。図１Ｂに示すように、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧＢｓＡｂは、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の重鎖Ｃ末端のそれぞれに連結された抗ＣＤ４０ｓｃＦｖを有する。ＰＤ－１抗体１Ａ７に関連する配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７７０１６に記載されており、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤ４０抗体６Ａ７に関連する配列は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９６４９４に記載されており、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＢｓＡｂの各ポリペプチド鎖を発現するベクターをＣＨＯ細胞に共トランスフェクトした。培養１４日後、細胞上清を収集し、且つプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、更にサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製し、二重特異性抗体を得た。二重特異性抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４から選ばれた。特に、ＩｇＧ１はまた、Ｆｃ受容体結合親和性を低下させるために、突然変異、例えばＬＡＬＡ（Ｌ２３４Ａ／ＬＳ２３５Ａ）突然変異を導入した。これらのＦｃ突然変異は、抗体エフェクター機能を最小化することによって抗体の安全性を改善することができる。

これらの抗体を発現するための各種ベクターを製造して以下の実験を行った。以下の実験では、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧにおける抗ＰＤ－１のＶＨ及びＶＬは、抗ＰＤ１抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３に由来する。抗ＣＤ４０ＳｃＦＶのＶＨ及びＶＬは、６Ａ７－Ｈ４Ｋ２抗ＣＤ４０抗体に由来する。

Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ抗体では、またノブイントホール（ＫＩＨ）突然変異を定常領域に導入した。Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４のＰＤ－１アームは、１Ａ７－Ｈ２Ｋ３のＶＨと、ＫＩＨ突然変異を有するＩｇＧ４定常領域（配列番号４１及び１５０）と、を含む。ＳｃＦＶアームは、６Ａ７－Ｈ４Ｋ２のＶＨ及びＶＬ（配列番号１０８及び１１０、又は配列番号１２６及び１２７）と、対応するＫＩＨ突然変異を有するＩｇＧ４定常領域（配列番号１５１）と、を含む。ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧでは、リンカー配列を利用して抗ＣＤ４０ＳｃＦＶを抗ＰＤ－１抗体のＣ末端に付加した。
図２Ａ～図２Ｂに示すように、非還元ゲル電気泳動（６％分離ゲル）で精製されたＢｓＡｂを検出した。１レーンあたり２ μｇのタンパク質を加えた。結果は、全てのＢｓＡｂが発現され、且つ正しく組み立てられていることを示している。

実施例２：抗体結合親和性
ＢｓＡｂのヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）又はヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）への結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ系により決定された。ヒトＰＤ－１タンパク質（ヒトＰＤ－１／ＰＤＣＤ１タンパク質、Ｈｉｓタグ）及びヒトＣＤ４０タンパク質（ヒトＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５タンパク質、Ｈｉｓタグ）は、何れもＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入し、カタログ番号は、それぞれＰＤ１－Ｈ５２２１及びＣＤ０－Ｈ５２２８であった。結果を以下の表にまとめる。

結果は、２種類のタイプの二重特異性抗体が何れも親モノクローナル抗体と同等の結合親和性を有することを示している。従って、Ｆｃ領域突然変異（例えば、ＬＡＬＡ突然変異）は、結合親和性に影響を及ぼさない。

実施例３：Ｊｕｒｋａｔ－ｌｕｃ－ｈＰＤ１レポーター細胞活性化アッセイ
ＢｓＡｂＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路を遮断できるか否かを試験するために実験を行った。

基底細胞ＣＨＯ－ａＡＰＣ－ｈＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｊ１２５５）を９６ウェルプレート（細胞密度：４×１０４個細胞／ウェル）に接種し、且つ３７℃で一晩インキュベートした。二重特異性抗体Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４を（３倍）連続希釈し、最高濃度を１００ μｇ／ｍＬとした。アッセイバッファーは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地であった。翌日、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＰＤ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：Ｊ１２５５）を１２０ｇで１０分間遠心分離し、次いで９６ウェルプレート（細胞密度５×１０４個細胞／ウェル）に接種した。次いで、ＣＨＯ－ａＡＰＣ－ｈＰＤ－Ｌ１を接種した培養プレート上清を廃棄し、次いで５０ μＬＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＰＤ－１細胞を２５ μＬ抗体と共に各ウェルに加えた。上記９６ウェルプレートを３７℃のインキュベーターで６時間インキュベートした。インキュベート後、培養プレートを取り出し、７５ μＬのＢｉｏ－ｌｉｔｅルシフェラーゼ検出試薬（ヴァゼムバイオテック社、カタログ番号：ＤＤ１２０１－０２－ＡＢ）を加え、室温で５－１０分間インキュベートした。次いで培養プレートを発光検出器に入れて蛍光信号を検出した。抗体がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を遮断できる場合、エフェクター細胞は、シグナルを報告する。

図３及び表３に示すように、ＢｓＡｂは、何れもＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路に対する遮断作用を示している。Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４が単一の抗ＰＤ－１アームでＰＤ－１に結合するので、１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４が２本の抗ＰＤ－１アームを採用した場合に比べて、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４のＥＣ５０値は、相対的に高い。

実施例４：二重特異性抗体のＴ細胞／ＡＰＣ細胞架橋効果
以下では、ＢｓＡｂＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４がＴ細胞及びＡＰＣ細胞を架橋できるか否かを試験するために、レポーター細胞を用いて実験を行った。

基底細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１を９６ウェルプレート（細胞密度：５×１０４個細胞／ウェル）に接種し、且つ３７℃で一晩インキュベートした。ＢｓＡｂＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４を（３倍）連続希釈し、最高濃度を５ μｇ／ｍＬとした。同時に、抗ＰＤ－１抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及び抗ＣＤ４０抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２を１：１の割合で組み合わせ、次いで（３倍）連続希釈し、最高濃度を１０ μｇ／ｍＬ（モノクローナル抗体１種あたり５ μｇ／ｍＬ）とした。アッセイバッファーは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地であった。翌日、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：ＪＡ２１２５）を１２０ｇで１０分間遠心分離し、次いで９６ウェルプレート（細胞密度５×１０４個細胞／ウェル）に接種した。次いで、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１を接種した培養プレート上清を廃棄し、次いで５０ μＬＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞を２５ μＬ抗体と共に各ウェルに加えた。上記９６ウェルプレートを３７℃のインキュベーターで６時間インキュベートした。インキュベート後、培養プレートを取り出し、７５ μＬのＢｉｏ－ｌｉｔｅルシフェラーゼ検出試薬（ヴァゼムバイオテック社、カタログ番号：ＤＤ１２０１－０２－ＡＢ）を加え、室温で５－１０分間インキュベートした。次いで培養プレートを発光検出器に入れて蛍光信号を検出した。

図４Ａに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１細胞が存在する場合、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦｖ－ＨＣ－ＩｇＧ４は、何れもレポーター細胞をトランス活性化する。対照的に、モノクローナル抗体の組み合わせは、レポーター細胞を活性化しない。これは、ＣＤ４０の活性化にはＣＤ４０の凝集が必要であるが、この凝集が基底細胞によって促進されるからであると考えられる。図４Ｂに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１が存在しない場合、ＢｓＡｂ及びモノクローナル抗体の組み合わせは、何れもレポーター細胞を活性化しない。ＥＣ５０値を下記表に示す。従って、試験された二重特異性抗体は、Ｔ細胞及びＡＰＣ細胞を架橋することができる。

ここで、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞は、ＰＤ－１を発現せず、且つＡＰＣ細胞（例えば、樹状細胞又はマクロファージ）におけるＣＤ４０経路の活性化を検証するために用いられる。Ｔ細胞（例えば、ＰＤ－１又は他の標的を発現する）及びＡＰＣ細胞は、ＢｓＡｂの架橋によってＡＰＣ細胞上のＣＤ４０凝集を刺激し、それによって腫瘍微小環境における免疫応答シグナルを増幅することができる。結果は、二重特異性抗体によるＣＤ４０経路の活性化は、ＰＤ－１を発現する細胞とのそれらの架橋効果に依存することも示している。ＰＤ－１を発現する免疫細胞が腫瘍微小環境に動員され、且つＰＤ－１発現が通常腫瘍微小環境において上方制御されるので、当該機序は免疫活性化を腫瘍微小環境にかなり制限し、且つ肝臓における毒性などの副作用を低減することもできる。更に、腫瘍排出リンパ節は、抗原提示細胞と、ＰＤ－１を発現するＴ細胞と、を有する。二重特異性抗体は、腫瘍排出リンパ節における免疫応答を効果的に増加させることができる。同時に、それは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性を抑制し、それによって系の寛容性を抑制することができる。

実施例５：Ｆｃ受容体媒介性レポーター細胞活性化アッセイ
ＢｓＡｂＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４がＦｃＲ架橋によって（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ受容体によって）レポーター細胞を活性化できるか否かを試験するために、実験を行った。

基底細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：ＪＡ２２５１）を９６ウェルプレート中（細胞密度：５×１０４個細胞／ウェル）に接種し、且つ３７℃で一晩インキュベートした。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２及び二重特異性抗体Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４を（３倍）連続希釈し、最高濃度を１０μｇ／ｍＬとした。アッセイバッファーは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地であった。翌日、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号：ＪＡ２２５１）を１２０ｇで１０分間遠心分離し、次いで９６ウェルプレート（細胞密度５×１０４個細胞／ウェル）に接種した。次いで、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢを接種した培養プレート上清を廃棄し、次いで５０μＬＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０細胞を２５μＬ抗体と共に各ウェルに加えた。上記９６ウェルプレートを３７℃のインキュベーターで６時間インキュベートした。インキュベート後、培養プレートを取り出し、７５ μＬのＢｉｏ－ｌｉｔｅルシフェラーゼ検出試薬（ヴァゼムバイオテック社、カタログ番号：ＤＤ１２０１－０２－ＡＢ）を加え、室温で５－１０分間インキュベートした。次いで培養プレートを発光検出器に入れて蛍光信号を検出した。

図５及び表５に示すように、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢ細胞が存在する場合、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４は、レポーター細胞を活性化し、そのＥＣ５０は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２に相当する。しかしながら、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４は、ＦＣγＲＩＩＢ受容体媒介性レポーター細胞活性化を示さなかった。

ＣＤ４０抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２は、ＦＣγＲＩＩＢ受容体架橋によってレポーター細胞を活性化することができる。しかしながら、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖがＦｃ領域に連結される場合、ＦＣγＲＩＩＢは、ＦＣγＲＩＩＢ媒介性凝集によってＣＤ４０経路を活性化できない。ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４がＦＣγＲＩＩＢ受容体媒介性レポーター細胞活性化を示さないので、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４は、高レベルのＦＣγＲＩＩＢを発現する組織における毒性、例えば肝臓における毒性を効果的に低減することができる。

表６は、２種類の二重特異性抗体Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧのインビトロ活性をまとめる。ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１細胞が存在する場合、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４がＡＰＣ細胞においてＣＤ４０経路の活性化を示すが、ＦＣγＲＩＩＢ受容体媒介性Ｔ細胞活性化を示さないので、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４は何れもＦｃＲ非依存性方式でがんを効果的に治療することができる。

実施例６：ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧサブタイプによるレポーター細胞の活性化
ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧのサブタイプ（ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡを含む）がＰＤ－１を発現する基底細胞の存在下でレポーター細胞を活性化できるか否かを試験するために、当該実験を行った。当該実験は、実施例４に記載のステップと同様に行ったが、Ｊｕｒｋａｔ－ｈＰＤ１で基底細胞ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１を置換する点が異なる。図６Ａでは基底細胞は用いられなかった。図６Ｂ及び表７に示すように、ＢｓＡｂＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ並びに抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２は、何れもレポーター細胞を活性化した。

ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢ細胞の存在下でのレポーター細胞の活性化も評価した。図６Ｃに示すように、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡは、何れもＦＣγＲＩＩＢ受容体媒介性レポーター細胞活性化を示さず、これは、図５に示した結果と一致した。従って、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡは、主にＰＤ－１を発現する細胞に依存してＡＰＣ細胞におけるＣＤ４０経路を活性化する。

実施例７：腫瘍の増殖を抑制する二重特異性抗体のインビボ試験
二重特異性抗体をインビボで試験してヒトにおけるこれらの抗体の作用を予測するために、ヒト化ＣＤ４０マウスモデルを準備した。ヒト化ＣＤ４０マウスモデルは、キメラＣＤ４０タンパク質（配列番号９７）を発現するように工学化されており、ここでマウスＣＤ４０タンパク質の細胞外領域が対応するヒトＣＤ４０細胞外領域に置換された。マウスＣＤ４０のアミノ酸残基２０－１９２（配列番号９６）は、ヒトＣＤ４０のアミノ酸残基２０－１９２（配列番号９５）で置換された。ＣＤ４０ヒト化マウスをＰＤ－１ヒト化マウスと交配させることによって、二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウスモデルも作製した。ヒト化ＰＤ１マウスモデルは、キメラＰＤ１タンパク質（配列番号３９）を発現するように工学化されており、ここでマウスＰＤ１タンパク質の細胞外領域が対応するヒトＰＤ１細胞外領域に置換された。マウスＰＤ１のアミノ酸残基３１－１４１（配列番号３８）は、ヒトＰＤ１のアミノ酸残基３１－１４１（配列番号３７）で置換された。

ヒト化マウスモデル（例えば、Ｂ－ｈＣＤ４０マウス）又は二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）は、ヒトとマウスＣＤ４０又はＰＤ－１を発現する通常のマウスとの臨床結果の差を有意に減少させることにより、臨床環境における新しい治療方法を試験するための新しいツールを提供する。ヒト化ＣＤ４０、ヒト化ＰＤ－１又は二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウスモデルに関する詳細な説明は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９１８４５及びＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９０３２０を参照することができ、これらの特許の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＢｓＡｂ抗結腸がんのインビボ結果
結腸がんモデルにおいて二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのインビボでの腫瘍増殖に対する作用を試験した。ＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）をＣＤ４０ヒト化Ｂ－ｈＣＤ４０マウスに皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が１００ｍｍ３～１５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた。

各群において、Ｂ－ｈＣＤ４０マウスに生理食塩水（ＰＳ）（Ｇ１）、４ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ２）又は４ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ３）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によりそれぞれ注射した。投与頻度は、週２回（計４回投与）であった。

マウスの体重に基づいて４ｍｇ／ｋｇで注射体積を計算した。腫瘍の長軸及び短軸の長さを測定し、且つ０．５×（長軸）×（短軸）２で腫瘍の体積を計算した。以下の時間：注射前、マウスを異なる群に分けたとき（最初の抗体注射前）、抗体注射中（週２回）及び安楽死前のときにマウスの体重を測定した。
ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００％を用いて腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）を計算した。Ｔｉは、ｉ日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群における平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群における平均腫瘍体積である。

ｔ検定を採用して統計学的分析を行った。６０％超のＴＧＩ％は、腫瘍増殖が有意に抑制されたことを示す。Ｐ＜０．０５は、有意差を示す閾値である。

処理の全期間にわたってマウスの体重をモニターした。異なる群においてマウスの平均体重は、種々の程度で増加した（図７及び図８）。処理期間の終了時に、異なる群間で有意な体重差は観察されなかった。結果は、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡがマウスに対して寛容性に優れ、明らかな毒性がないことを示している。

ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡで処理した群における腫瘍体積は、図９に示される。２０日目（群分け後２０日目）のＴＧＩ％も下記表に示すように計算した。

結果は、ヒトＰＤ－１を発現する細胞が存在しない場合、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡが腫瘍増殖を抑制しないことを示している。

ＢｓＡｂ抗黒色腫のインビボ結果
黒色腫モデルにおいて二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのインビボでの腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＢ１６Ｆ１０細胞（黒色腫細胞）（Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が１００ｍｍ３～１５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに生理食塩水（ＰＳ）（Ｇ１）、３ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ３）、４ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）、４ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ５）、３ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及び３ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の組み合わせ（Ｇ６）又は４ｍｇ／ｋｇ二重特異性抗体ＰＤ－１－ＭＯＣＫ－ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ７）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。ＢｓＡｂＰＤ－１－ＭＯＣＫ－ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４は、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧと同じ構造を有するが、ｓｃＦｖは、ＯＸ４０を標的とし、ＣＤ４０を標的としない。投与頻度は、週２回（計４回投与）であった。

マウスの体重に基づいて注射体積を計算した。腫瘍の長軸及び短軸の長さを測定し、且つ０．５×（長軸）×（短軸）２で腫瘍の体積を計算した。以下の時間：注射前、マウスを異なる群に分けたとき（最初の抗体注射前）、抗体注射中（週２回）及び安楽死前のときにマウスの体重を測定した。

処理の全期間にわたってマウスの体重をモニターした。異なる群においてマウスの平均体重は、種々の程度で増加した（図１０及び図１１）。処理期間の終了時に、異なる群においてマウスの体重は増加した。

抗体で処理した群における腫瘍体積は、図１２に示される。下記表に示すように１４日目及び２１日目（群分け後１４又は２１日）のＴＧＩ％も計算した。Ｐ値は、２１日目のデータに基づくものである。図１２には２５日目のデータも含まれている。

結果は、モノクローナル抗体に比べて、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡが高いＴＧＩ％で腫瘍増殖を抑制することを示している。特に、４ｍｇ／ｋｇのＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ５）及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）は、６ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ１及び抗ＣＤ４０抗体の組み合わせ（Ｇ６）に比べて同様のＴＧＩ％を有する。結果はまた、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖドメインが腫瘍抑制に対して相乗的効果を有することを示している。

更に、ＰＤ－１－ＭＯＣＫ－ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ７）のＴＧＩ％は、抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ２）のＴＧＩ％と同程度であるが、（例えば、２１日目に）ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ５）及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）のＴＧＩ％よりも遥かに低い。これは、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ５）及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）誘導性の腫瘍抑制作用がＰＤ－１を発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）及びＣＤ４０を発現する細胞（例えば、ＡＰＣ細胞）の架橋によって部分的に誘導されることを示している。

ＢｓＡｂ抗結腸がんのインビボ結果
結腸がんモデルにおいて二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及びＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４のインビボでの腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約４００ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり７匹）。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに生理食塩水（ＮＣ；Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ３）、１．３５ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）、１ｍｇ／ｋｇＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４（Ｇ５）又は１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及び１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の組み合わせ（Ｃｏｍｂｏ（ＰＤ－１＋ＣＤ４０）；Ｇ６）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回（計５回投与）であった。詳細な情報は、下記表に示すとおりである。

マウスの体重に基づいて注射体積を計算した。腫瘍の長軸及び短軸の長さを測定し、且つ０．５×（長軸）×（短軸）２で腫瘍の体積を計算した。

上記群におけるマウスの群分け後２５日の腫瘍体積は、図１３に示される。結果は、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４及びＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４が腫瘍増殖を抑制することを示している。特に、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４；１．３５ｍｇ／ｋｇ）及びＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４（Ｇ５；１ｍｇ／ｋｇ）は、２ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１及び抗ＣＤ４０抗体の組み合わせ（Ｇ６）に比べて同様のＴＧＩＴＶ％を有する。

異なる実験において、ＳｃＦｖ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＫｅｙｔｒｕｄａＲ（ペムブロリズマブ）（ＶＨ配列番号２０７；ＶＬ配列番号２０８）も含まれる。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに生理食塩水（ＮＣ；Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ３）、１．３５ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）、１ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ５）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及び１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の組み合わせ（Ｃｏｍｂｏ（ＰＤ－１＋ＣＤ４０）；Ｇ６）又は１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体ペムブロリズマブ及び１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の組み合わせ（Ｃｏｍｂｏ（ペムブロリズマブ＋ＣＤ４０）；Ｇ７）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回（計５回投与）であった。詳細な情報は、下記表に示すとおりである。

処理の全期間にわたってマウスの体重をモニターした。異なる群においてマウスの平均体重は、種々の程度で増加した（図１４及び図１５）。処理期間の終了時に、異なる群においてマウスの体重は増加した。

抗体で処理した群における腫瘍体積は、図１６に示される。下記表に示すように１８日目及び２５日目（群分け後１８及び２５日）のＴＧＩ％も計算した。対照群では、大量のマウスが死亡したため、２５日目のＰ値は利用できなかった。下記表におけるＰ値は、１８日目のデータから計算された。

結果は、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ５）が腫瘍増殖を抑制し、そのＴＧＩ％（例えば１８日目に）ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）よりも高いことを示している。更に、１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４と６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２との組み合わせ（Ｇ６）は、ペムブロリズマブと６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２との組み合わせ（Ｇ７）に比べて同等の腫瘍抑制作用を示した。

実施例８：二重特異性抗体毒性インビボ試験
結腸がんモデルにおいて二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４のインビボ毒性を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約１００ｍｍ３－１５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり３匹）。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｇ１）、２０ｍｇ／ｋｇセリクレルマブ（重鎖配列番号１４４、軽鎖配列番号１４５）（Ｇ２）、２０ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ３）、２０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ４）、２６ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ５）又は２０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及び２０ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の組み合わせ（Ｃｏｍｂｏ；Ｇ６）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によりそれぞれ注射した。投与頻度は、週３回（計３回投与）であった。詳細な情報は、下記表に示すとおりである。

血液生化学試験
群分け後７日目及び１３日目に、マウス血液を抽出してアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルを試験した。図１７Ａ～図１７Ｄに示すように、他の群のマウスに比べて、セリクレルマブ（Ｇ２）で処理したマウスは、最高レベルの血液ＡＬＴ及びＡＳＴレベルを示した。更に、モノクローナル抗体（Ｇ３及びＧ４）又はその組み合わせ（Ｇ６）で処理したマウスに比べて、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ５）で処理したマウスは、同様のＡＬＴ及びＡＳＴレベルを示した。

肝臓の病理組織検査
群分け後１３日目に、マウス肝臓を単離して顕微鏡下で検査した。Ｇ１群及びＧ５群のマウスの肝臓には、有意な異常変化はなかった。Ｇ２群の３匹のマウスは何れも慢性炎症、例えば線維芽細胞増殖を示し、損傷程度は中等度であった。Ｇ３群では、３匹のマウスの肝臓は何れも限局性間質性炎症細胞浸潤を示し、損傷程度は軽度であった。Ｇ４群では、１匹のマウスの肝臓は、限局性血管周囲炎症性細胞浸潤を示し、損傷程度は軽度であった。Ｇ７群では、３匹のマウスの肝臓は何れも限局性間質性炎症細胞浸潤を示した。ここで１匹のマウスでは損傷程度が軽微であり、他の２匹のマウスでは損傷程度が軽度であった。
詳細な肝臓損傷程度を下記表に示す。損傷程度は、肝臓間質性／血管周囲炎症性細胞浸潤又は慢性肝臓炎症（主に線維芽細胞増殖）によって決定される。各群のマウスの肝臓及び腎臓の代表的な組織切片の画像を図１７Ｅ～図１７Ｊに示す。

実施例９：ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａの精製及びレポーター細胞活性化
ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａの製造
図１８Ａに示すように、ＢｓＡｂＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａは、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の各重鎖ＣＨ３ドメインに融合する抗ＣＤ４０ｓｃＦｖを有する。具体的には、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖは、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体重鎖ＣＨ３ドメインの位置３５８から３６２（ＥＵ番号付けによる）に融合した。ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａの融合重鎖配列は、配列番号１６１に示される。ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａの軽鎖配列は、その親抗体ＰＤ１－１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４の軽鎖と同じであり、当該軽鎖は、配列番号１４１に示される。配列は、抗ＰＤ－１抗体１Ａ７及び抗ＣＤ４０抗体６Ａ７に由来する。

図１８Ｂに示すように、非還元ゲル電気泳動（６％分離ゲル）によって精製されたＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａを検出した。ゲル上で単一のバンドが検出され（レーン４）、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａが高純度で発現されたことを示した。更に、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａの濃度を８４μｇ／ｍＬと測定した。

ｈＣＤ４０に対する結合親和性
ＢｉａｃｏｒｅシステムによってヒトＣＤ４（ｈＣＤ４０）に対する結合親和性を測定した。ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ及びその親モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２の結果を下記表にまとめる。

結果は、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａが親モノクローナル抗体と同等の結合親和性を有することを示している。

Ｆｃ受容体媒介性レポーター細胞活性化アッセイ
ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３ＡがＦｃ受容体（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ）によってレポーター細胞を活性化できるか否かを試験するために実験を行った。同様の実験ステップを実施例５に記載のように行った。

図１８Ｃに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＦｃγＲＩＩＢ細胞が存在する場合、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及び抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２は何れもレポーター細胞を活性化した。しかしながら、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａは、ＦＣγＲＩＩＢ受容体媒介性レポーター細胞活性化を示さなかった。

結果は、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖが抗ＰＤ－１抗体の重鎖ＣＨ３ドメインに融合する場合、Ｆｃ受容体（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ）がＦｃ受容体（例えば、ＦＣγＲＩＩＢ）媒介性凝集によってＣＤ４０経路を活性化できないことを示している。ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３ＡがＦｃ受容体媒介性レポーター細胞活性化を示さないので、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａは、組織、特に高レベルＦＣγＲＩＩＢを発現する組織、例えば肝臓組織における毒性を効果的に低減することができる。

Ｔ細胞／ＡＰＣ細胞架橋効果
以下では、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３ＡがＴ細胞及びＡＰＣ細胞を架橋できるか否かを試験するために、レポーター細胞を用いて実験を行った。同様の実験ステップを実施例４に記載のように行った。

図１８Ｄに示すように、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＰＤ１細胞が存在する場合、Ｆａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４及びＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａは、何れもレポーター細胞をトランス活性化した。対照的に、モノクローナル抗体の組み合わせは、レポーター細胞を活性化しない。

結果は、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３ＡのＣＤ４０経路に対する活性化がＰＤ－１を発現する細胞とのその架橋効果に依存することも示している。ＰＤ－１を発現する免疫細胞が腫瘍微小環境に動員され、且つＰＤ－１発現が通常腫瘍微小環境において上方制御されるので、当該機序は免疫活性化を腫瘍微小環境にかなり制限し、且つ肝臓における毒性などの副作用を低減することもできる。更に、腫瘍排出リンパ節は、抗原提示細胞と、ＰＤ－１を発現するＴ細胞と、を有する。二重特異性抗体は、腫瘍排出リンパ節における免疫応答を効果的に増加させることができる。同時に、それは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の抑制活性を抑制し、それによって系の寛容性を抑制することができる。

ＦｃＲｎに対する結合親和性
ＢｉａｃｏｒｅＲシステムによって新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を測定した。ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３Ａ及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７の結果を下記表にまとめる。

結果は、ＰＤ１－Ｃ４０－６Ａ７－ＦＶ３ＡのＦｃＲｎに対する結合親和性が抗ＰＤ－１抗体（１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４）と同等であることを示し、抗ＣＤ４０ｓｃＦｖの抗ＰＤ－１抗体重鎖ＣＨ３ドメインの位置３５８から３６２（ＥＵ番号付けによる）領域における融合がＦｃＲｎ結合に影響を及ぼさないことを示している。

実施例１０：ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡと市販の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との間の薬効比較
現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）及び中国医薬品局（ＮＭＰＡ）の承認を得た約１０種類の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体がある。承認された抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、メルク社（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）により開発されたＫｅｙｔｒｕｄａＲ（ペムブロリズマブ）、ブリストルマイヤーズスクイブ（ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ，ＢＭＳ）により開発されたＯｐｄｉｖｏＲ（ニボルマブ、ＶＨ配列番号２０９；ＶＬ配列番号２１０）、サノフィ（ＳａｎｏｆｉＳ．Ａ．）及び再生元製薬公司（ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）により共同開発されたＬｉｂｔａｙｏＲ（セミプリマブ、ＶＨ配列番号１８５；ＶＬ配列番号１８６）、信達生物製薬公司（ＩｎｎｏｖｅｎｔＢｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）により開発されたＴｙｖｙｔＲ（シンチリマブ、ＶＨ配列番号１８３；ＶＬ配列番号１８４）、ベイジーン（ＢｅｉＧｅｎｅ）により開発されたティスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７，ＶＨ配列番号１８７；ＶＬ配列番号１８８）、及び君実生物により開発されたトリパリマブ（ＶＨ配列番号１８１；ＶＬ配列番号１８２）を含む。更に、臨床段階及び前臨床段階にある複数種類の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体もある。当該実験では、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのインビボ薬効をこれらの承認された抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の薬効と比較した。

実験を以下のように行った。マウス黒色腫モデルにおいて５種類の抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブ、セミプリマブ、シンチリマブ、ティスレリズマブ、トリパリマブ及び二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのインビボ腫瘍増殖の抑制作用を試験した。具体的には、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＢ１６Ｆ１０細胞（黒色腫細胞）（Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約１００ｍｍ３～１５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり７匹）。対照群では、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにＰＢＳ（Ｇ１）を注射した。治療群（Ｇ２－Ｇ７）では、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに３ｍｇ／ｋｇのペムブロリズマブ（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇのセミプリマブ（Ｇ３）、３ｍｇ／ｋｇのシンチリマブ（Ｇ４）、３ｍｇ／ｋｇのティスレリズマブ（Ｇ５）、３ｍｇ／ｋｇのトリパリマブ（Ｇ６）又は４ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ７）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によりそれぞれ注射した。投与頻度は、週２回（計４回投与）であった。腫瘍体積を週に２回測定し、且つマウスの体重を記録した。マウスの腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達したときに安楽死させた。

実験結果は、上記投与量及び頻度で、治療群マウスの全ての抗ＰＤ－１モノクローナル抗体及びＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡに対する寛容性が良好であることを示している。図２７に示すように、全実験を通して、マウスの平均体重は、有意差がなかった。しかしながら、腫瘍体積（図２８）について、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ７）は、最もよい薬効（ＴＧＩＴＶ％）を示した。

実施例１１：ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのインビボ薬効及び毒性
多種類の腫瘍モデルにおいて二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのインビボ毒性及び薬効を試験した。例えば、Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が１００ｍｍ３～１５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり７匹）。

対照群Ｇ１では、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに生理食塩水（ＰＳ）を注射した。治療群Ｇ２－Ｇ７では、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ（即ち、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇ）の二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によりそれぞれ注射した。投与頻度は、週２回（計４回投与）であった。腫瘍体積を週に２回測定し、且つマウスの体重を記録した。マウスの腫瘍体積が３０００ｍｍ３に達したときに安楽死させた。実験は、群分け後７０日目に終了した。

上記の結果と同様に、実験結果は、上記用量レベル及び投与頻度で、治療群マウスの異なる投与量のＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡに対する寛容性が非常に良好であり、且つ全実験を通してマウス体重の平均値に有意差がないことを示した。しかしながら、腫瘍体積（図２９Ａ）及びマウス生存率（図２９Ｂ）について、ＴＧＩＴＶ％は増加傾向を示し、即ち用量レベルの増加と伴って、マウス生存率は有意に増加した。具体的には、群分け後２１日目、マウスの生存数は、Ｇ１群（ＰＢＳ）３匹、Ｇ２群（０．１ｍｇ／ｋｇ）２匹、Ｇ３群（０．３ｍｇ／ｋｇ）５匹、観察可能な治療効果（ＴＧＩＴＶ％＝２９．７％）を有し、Ｇ４群（１ｍｇ／ｋｇ）６匹、有意な治療効果（ＴＧＩＴＶ％＝６２．６％）を有し、Ｇ５群（３ｍｇ／ｋｇ）７匹、２匹の腫瘍のないマウスを含み、有意な治療効果（ＴＧＩＴＶ％＝７８．３％）を有し、Ｇ６群（１０ｍｇ／ｋｇ）７匹、５匹の腫瘍のないマウスを含み、有意な治療効果（ＴＧＩＴＶ％＝９９．４％）を有し、及びＧ７群（３０ｍｇ／ｋｇ）７匹、４匹の腫瘍のないマウスを含み、有意な治療効果（ＴＧＩＴＶ％＝８７．３％）を有する。２１日目までに残ったマウス（未生存マウス）は、腫瘍体積が３０００ｍｍ３を超えることにより安楽死させた。対照群における全てのマウスの群分け後２１日は、何れも安楽死基準に達し、１８日目及び２１日目の腫瘍体積及びＴＧＩＴＶ％、並びに実験期間の終了時（７０日目）の生存状態は、以下のように要約した。

実験期間の終了時に、腫瘍体積が大きすぎるため、Ｇ１～Ｇ４群における全てのマウスを安楽死させ、Ｇ５～Ｇ７群における生存マウスの数は、それぞれ２、４及び４であった。これは、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのマウスにおける薬効が用量と相関することを示している。更に、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのＧ６群（１０ｍｇ／ｋｇ）及びＧ７群（３０ｍｇ／ｋｇ）における治療効果は同様であり、１０ｍｇ／ｋｇがＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡインビボでの飽和用量レベルであることを示している。

実施例１２：腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）分析
ＴＩＬｓ分析を以下のように行った。ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。注射後１１日目、１４日目及び１８日目、ＰＢＳ（Ｇ１）、３ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ３）、４ｍｇ／ｋｇ二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）又は３ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及び３ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ５）の組み合わせを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によりそれぞれ投与した。注射後２１日目、対照群Ｇ１及び治療群Ｇ２－Ｇ５からの腫瘍組織のＴＩＬｓ分析を行った。試験結果を図３０Ａ～図３０Ｃに示す。

同様の実験では、Ｂ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。注射後９日目及び１３日目、ＰＢＳ（Ｇ１）、３ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ２）、３ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ３）、４ｍｇ／ｋｇ二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）又は３ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４及び３ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ５）の組み合わせを腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によりそれぞれ投与した。注射後１５日目、対照群Ｇ１及び治療群Ｇ２－Ｇ５からの腫瘍組織のＴＩＬｓ分析を行った。試験結果を図３０Ｄ～図３０Ｆに示す。

図３０Ａ－ＩＩＩ及び図３０Ｄ－ＩＩＩにおける結果によれば、ＭＣ３８腫瘍モデル及びＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、対照群（Ｇ１）に比べて、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ群（Ｇ４）は、Ｔ細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞との比率（ＣＴＬＳ／Ｔｒｅｇｓ）を効果的に向上させた。

更に、ＰＤ－１発現の分析結果（図３０Ｂ及び図３０Ｅ）は、ＭＣ３８腫瘍モデル及びＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、二重特異性抗体群（Ｇ４）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋（非Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞又はＮＫ細胞におけるＰＤ－１陽性細胞の割合がモノクローナル抗体群（Ｇ２又はＧ３）及び対照群（Ｇ１）に比べて有意に低下することを示している。特にＢ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１陽性細胞の割合は有意に低下し（Ｐ＜０．０００１、図３０Ｅ～図３０Ｉ参照）、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡで処理した後、ＰＤ－１のこれらの細胞表面での発現が下方制御されることを示している。

骨髄由来細胞を更に分析した。ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、白血球細胞（ＣＤ４５＋）における樹状細胞（ＤＣ）及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）のパーセントは、低下傾向を示した（図３０Ｃ－Ｉ及び図３０Ｃ－ＩＩ）。対照的に、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、白血球中のこの２つの細胞タイプ（ＣＤ４５＋）のパーセントは上昇傾向を示した（図３０Ｆ－Ｉ及び図３０Ｆ－ＩＩ）。ＭＣ３８腫瘍モデル（図３０Ｃ－ＩＩＩ及び図３０Ｃ－ＩＶ）及びＢ１６Ｆ１０腫瘍モデル（図３０Ｆ－ＩＩＩ及び図３０Ｆ－ＩＶ）におけるＤＣ細胞活性化（ＣＤ８０／ＣＤ８６＋ＤＣ及びＭＨＣＩＩ＋ＤＣ）の検出結果と組み合わせることにより、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、二重特異性抗体群（Ｇ４）は、モノクローナル抗体群（Ｇ２又はＧ３）及び抗体組み合わせ群（Ｇ５）に比べて殺傷Ｔ細胞増殖／浸潤促進作用及び骨髄由来の抑制細胞（骨髄由来免疫抑制細胞、ＭＤＳＣ）の割合低下作用がより良好であることが見出され、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいて、二重特異性抗体群（Ｇ４）は、モノクローナル抗体群（Ｇ２又はＧ３）及び抗体組み合わせ群（Ｇ５）に比べて、主にＤＣ細胞の増殖／浸潤及び活性化、並びにＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１割合の下方制御を促進した。ＭＣ３８腫瘍モデルは、熱腫瘍の特徴を有する。結果は、熱腫瘍モデルにおいて、二重特異性抗体がＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び浸潤を効果的に促進し、骨髄由来免疫抑制細胞の数を減少させることができることを示している。冷腫瘍特徴を有するＢ１６Ｆ１０－ＰＤＬ１腫瘍モデルにおいて、二重特異性抗体は、ＤＣ細胞の増殖、浸潤及び活性化を効果的に促進し、且つＰＤ１のＣＤ８＋Ｔ細胞における発現を下方制御できる。フローサイトメトリー分析の戦略を図３１Ａ～図３１Ｂに示す。

実施例１３：ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ構造における異なるＰＤ－１抗体の置換
２種類の市販の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体であるトリパリマブ及びペムブロリズマブを選択し、且つそれらの配列に従って、それらの可変領域でＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ二重特異性抗体の抗ＰＤ－１可変領域を置換した。得られた抗体をそれぞれトリパリマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（重鎖配列は、配列番号１６２に示され、軽鎖配列は、配列番号１６３に示される）及びペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（重鎖配列は、配列番号１６４に示され、軽鎖配列は、配列番号１６５に示される）と命名した。

以前のインビボ薬効実験と同様に、結腸がんマウスモデルにおいて二重特異性抗体トリパリマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ及びペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡのインビボ腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約４００ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり６匹）。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２（Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体トリパリマブ（Ｇ３）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体ペムブロリズマブ（Ｇ４）、１．３５ｍｇ／ｋｇ（類似モル量に基づく）トリパリマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ５）、１．３５ｍｇ／ｋｇペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ６）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体トリパリマブと１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２との組み合わせ（Ｇ７）又は１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体ペムブロリズマブと１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２との組み合わせ（Ｇ８）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回（計５回投与）であった。詳細な情報は、下記表に示すとおりである。

処理の全期間にわたってマウスの体重をモニターした。異なる群においてマウスの平均体重は、種々の程度で増加した（図３２及び図３３）。処理期間の終了時に、異なる群においてマウスの体重は増加した。

抗体で処理した群における腫瘍体積は、図３４に示される。１７日目及び２１日目（群分け後１７日及び２１日）のＴＧＩＴＶ％を下記表に示すように計算した。対照群における大量のマウスは腫瘍体積過剰によって安楽死されたため、２１日目のＰ値は得られなかった。下記表におけるＰ値は、１７日目のデータに基づいて計算された。

結果は、トリパリマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ５）及びペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ６）が何れも腫瘍増殖を抑制し、そのＴＧＩＴＶ％が（例えば、２１日目に）モノクローナル抗体（Ｇ２、Ｇ３及びＧ４）及び抗体組み合わせ（Ｇ７及びＧ８）よりも高いことを示している。特に、Ｇ５群における全てのマウスは生存しており、且つここで１匹のマウスの腫瘍は完全に消失した。結果は、よりよい薬効を得るために、異なる抗ＰＤ－１抗原結合断片がＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ構造上の抗ＣＤ４０ｓｃＦｖと共に用いることができることを示している。

実施例１４：ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ構造における異なるＣＤ４０ｓｃＦｖの置換
ＣＤ４０は、重要な免疫共刺激経路受容体であって、それは免疫系における抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在し、且つ先天性及び適応免疫系機序の活性化において重要な役割を果たす。現在開発されている抗ＣＤ４０抗体は、例えば、Ａｐｅｘｉｇｅｎにより開発されたＡＰＸ００５Ｍ（ＶＨ配列番号１９１；ＶＬ配列番号１９２）、ロシュ公司（Ｒｏｃｈｅ）により開発されたＲＧ７８７６（セリクレルマブ）、ＶｉｅｌａＢｉｏにより開発されたＶＩＢ４９２０及びＡｌｌｉｇａｔｏｒＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発されたＡＤＣ－１０１３を含む。当該実験では、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体のうちの２つの抗体、即ちセリクレルマブ及びＡＰＸ００５Ｍを選択してペムブロリズマブと併用された二重特異性抗体を産生した。得られた抗体は、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧの構造を有し、図１Ｂに示すように、且つこれらの抗体は、ペムブロリズマブ－Ｓｅｌｉ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（重鎖配列は、配列番号１７５に示され、軽鎖配列は、配列番号１７６に示される）及びペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（重鎖配列は、配列番号１７７に示され、軽鎖配列は、配列番号１７８に示される）と命名された。更に、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４におけるＰＤ－１抗原結合部位は、ＣＤ４０抗原結合部位と交換され、セリクレルマブ－１Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４を産生した（重鎖配列は、配列番号２０１に示され、軽鎖配列は、配列番号２０２に示される）。

結腸がんマウスモデルにおいて二重特異性抗体ペムブロリズマブ－Ｓｅｌｉ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４及びペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４のインビボ腫瘍増殖に対する作用を試験した。具体的には、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約４００ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり６匹）。

以前のインビボ薬効実験と同様に、結腸がんマウスモデルにおいて二重特異性抗体ペムブロリズマブ－Ｓｅｌｉ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４及びセリクレルマブ－１Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４のインビボ腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約４００ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり６匹）。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスに生理食塩水（ＰＳ，Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体ペムブロリズマブ（Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＡＰＸ００５Ｍ（ＩｇＧ１－Ｓ２６７Ｅ）（Ｇ３）、セリクレルマブ－ＩｇＧ２（Ｇ４）、１．３５ｍｇ／ｋｇペムブロリズマブ－Ｓｅｌｉ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ５）、１．３５ｍｇ／ｋｇペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ６）、１．３５ｍｇ／ｋｇセリクレルマブ－１Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ７）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体ペムブロリズマブと１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＡＰＸ００５Ｍとの組み合わせ（Ｇ８）又は１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体ペムブロリズマブと１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブとの組み合わせ（Ｇ８）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回（計６回投与）であった。詳細な情報は、下記表に示すとおりである。

群分け後１４日、各群の平均体重に有意差はなかった（図４４Ａ及び図４４Ｂ）。異なる群における全てのマウス体重は何れも増加した。各群の腫瘍体積を図４４Ｃに示す。結果は、ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ６）がモノクローナル抗体（Ｇ２）及び（Ｇ３）又は併用療法（Ｇ８）よりも良好な薬効を有することを示している。

実施例１５：異なる構造の二重特異性抗体のインビボ毒性試験
多数の構造形態のＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体を構築した。具体的には、セリクレルマブのｓｃＦｖ及び抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７の配列を用いて４種類の異なる構造を有する二重特異性抗体を産生し、且つそれらの毒性を試験した。得られた抗体は、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＫＨ－ＩｇＧ４（構造は、図１Ａに示され、重鎖配列は、配列番号１６６又は配列番号１７３に示され、軽鎖配列は、配列番号１６７に示される）、セリクレルマブの対応する配列で抗ＣＤ４０抗体６Ａ７配列を置換することを含む１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（構造は、図１８Ａに示され、重鎖配列は、配列番号１６８に示され、軽鎖配列は、配列番号１６９に示される）、１Ａ７－セリクレルマブ－ＤＡＲＴ－ＩｇＧ４（構造は、図３７に示され、重鎖配列は、配列番号１７０に示され、軽鎖配列は、配列番号１７１に示される）、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（構造は、図１Ｂに示され、重鎖配列は、配列番号１７２に示され、軽鎖配列は、配列番号１７４に示される）と命名された。

セリクレルマブは、比較的毒性が大きいことが当該技術分野で知られている。マウスにおいて多数の構造形態のＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体の毒性を試験した。二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（約７週齢）をその体重に基づいて８群（群あたり３匹）にランダムに分けた。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブ（Ｇ２）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ３）、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ４）、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）、１Ａ７－セリクレルマブ－ＤＡＲＴ－ＩｇＧ４（Ｇ６）、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＫＨ－ＩｇＧ４（Ｇ７）及び二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ８）のうちの１つをランダムに選択し、且つ群分け当日及びその後３日おきに投与した。対照群（Ｇ１）にＰＢＳを注射した。

図３５～図３６に示すように、実験結果は、対照群マウスに比べて、Ｇ２群のマウスのみの体重が顕著な軽減を示すが、他の治療群マウスの体重に有意差を示さないことを示している。
群分け後７日目、末梢血を収集してアスパラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の濃度を検出した。図３８Ａ～図３８Ｂに示すように、ＡＬＴ及びＡＳＴ検出結果は、Ｇ２群のマウス（抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブを投与する）のＡＬＴ及びＡＳＴトランスアミナーゼの濃度が最高であることを示している。二重特異性抗体群（Ｇ４－Ｇ８）におけるトランスアミナーゼの濃度は、Ｇ２群におけるトランスアミナーゼの濃度よりも低い。具体的には、Ｇ４及びＧ６群のマウスのみは、トランスアミナーゼの濃度が増加する傾向を示した。他の群のマウスのトランスアミナーゼの濃度は、Ｇ１群のマウスと同程度であった。

群分け後１０日目に、マウス肝臓を単離して顕微鏡下で検査した。結果を下記表に示し、それは、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ８）の毒性がモノクローナル抗体（Ｇ２－Ｇ３）及び他の二重特異性抗体（Ｇ４－Ｇ７）の毒性よりも低いことを示している。実際、二重特異性抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡは、毒性作用を全く示さなかった。
結果は、様々な形態を有するＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体が抗ＣＤ４０抗体の毒性を顕著に低減できることを示している。

実施例１６：ＢｓＡｂ抗結腸がんのインビボ結果
以前のインビボ薬効実験と同様に、結腸がんマウスモデルにおいて上記抗体のインビボ腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約４００ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり８匹）。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体セリクレルマブ（セリクレルマブ－ＩｇＧ２，Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１モノクローナル抗体１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４（Ｇ３）、１ｍｇ／ｋｇセリクレルマブ与１ｍｇ／ｋｇ１Ａ７－Ｈ２Ｋ３－ＩｇＧ４の組み合わせ（Ｇ４）、１．３５ｍｇ／ｋｇ１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）又は１．３５ｍｇ／ｋｇ１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ６）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回（計６回投与）であった。詳細な情報は、下記表に示すとおりである。

処理の全期間にわたってマウスの体重をモニターした。異なる群においてマウスの平均体重は、種々の程度で増加した（図３９及び図４０）。処理期間の終了時に、異なる群においてマウスの体重は増加した。

抗体で処理した群における腫瘍体積は、図４１に示される。１７日目（群分け後１７日）のＴＧＩＴＶ％も下記表に示すように計算した。下記表におけるＰ値は、１７日目のデータに基づいて計算された。

結果は、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４（Ｇ５）及び１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４（Ｇ６）が何れも腫瘍増殖を抑制し、そのＴＧＩＴＶ％が（例えば、１７日目に）モノクローナル抗体（Ｇ２及びＧ３）及び抗体組み合わせ（Ｇ４）よりも高いことを示している。結果は、異なる構造形態のＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体が優れた治療効果で腫瘍増殖を顕著に抑制できることを示している。

実施例１７：二重特異性抗体のＴ細胞／ＡＰＣ細胞架橋効果
ＰＤ１／ＣＤ４０ＢｓＡｂによって誘導されたＣＤ４０活性化がＰＤ－１発現細胞の存在に依存するか否かを試験するために実験を行った。以下のように２種類のＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体を産生した。

ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４：ＡＰＸ００５ＭのｓｃＦｖ配列を抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ペムブロリズマブ重鎖のＣ末端に連結し、二重特異性抗体ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４を得た。
ＳｄＡｂ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ：ＳｄＡｂは、抗ＰＤ－１ナノボディ（又はラクダ科単一ドメイン抗体）である（単一可変ドメイン（ＶＨＨ）配列は、公開情報の配列番号２０４に示される）。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２のｓｃＦｖ配列をＳｄＡｂのＣ末端に連結し、二重特異性抗体ＳｄＡｂ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡを得た。

エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃ－ｈＣＤ４０及び基底細胞Ｊｕｒｋａｔ－ｈＰＤ１を９６ウェルプレートに接種し（細胞密度５×１０４個細胞／ウェル）、且つ３７℃でインキュベートした。ＢｓＡｂペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、ペムブロリズマブ－Ｓｅｌｉ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、ＳｄＡｂ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＫＨ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＤＡＲＴ－ＩｇＧ４、ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、及び抗ＣＤ４０抗体ＡＰＸ００５Ｍ（ＩｇＧ１－Ｓ２６７Ｅ）、セリクレルマブ－ＩｇＧ２及び６Ａ７－Ｈ４Ｋ２－ＩｇＧ２を（３倍）連続希釈し、最高濃度を３ μｇ／ｍＬとした。各ウェルに２５ μＬ抗体を加え、且つ３７℃インキュベーターで６時間インキュベートした。インキュベート後、培養プレートを取り出し、７５ μＬのＢｉｏ－ｌｉｔｅルシフェラーゼ検出試薬（ヴァゼムバイオテック社、カタログ番号：ＤＤ１２０１－０２－ＡＢ）を加え、室温で５－１０分間インキュベートした。次いで培養プレートを発光検出器に入れて蛍光信号を検出した。対照実験を同様のステップで行ったが、基底細胞Ｊｕｒｋａｔ－ｌｕｃ－ｈＰＤ１は存在しなかった。

図４２Ａ～図４２Ｂに示すように、基底細胞Ｊｕｒｋａｔ－ｌｕｃ－ｈＰＤ１が存在する場合、ＢｓＡｂ（即ち、ペムブロリズマブ－６Ａ７－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、ペムブロリズマブ－Ｓｅｌｉ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、ＳｄＡｂ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶ３Ａ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＦＶＫＨ－ＩｇＧ４、１Ａ７－セリクレルマブ－ＤＡＲＴ－ＩｇＧ４和ペムブロリズマブ－ＡＰＸ００５Ｍ－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ４）のみは、レポーター細胞をトランス活性化した。対照的に、セリクレルマブ－ＩｇＧ２を除いて、モノクローナル抗ＣＤ４０抗体は、レポーター細胞を活性化しなかった。図４２Ｃ～図４２Ｄに示すように、基底細胞Ｊｕｒｋａｔ－ｌｕｃ－ｈＰＤ１が存在しない場合、ＢｓＡｂ及びモノクローナル抗体（セリクレルマブ－ＩｇＧ２を除く）はレポーター細胞を活性化しなかった。

結果は、本明細書に記載される二重特異性抗体によるＣＤ４０経路の活性化がＣＤ４０の凝集に依存し、それがＰＤ－１発現細胞上のＰＤ－１との架橋によって実現される可能性があることを示している。セリクレルマブ－ＩｇＧ２に対して、当該抗ＣＤ４０抗体は、架橋活性なしで（例えば、ＦＣγＲＩＩＢと架橋されずに）ＣＤ４０を活性化することができる。

実施例１８：様々な抗ＰＤ－１抗体及び抗ＣＤ４０抗体可変ドメインの置換
様々な抗ＰＤ－１抗体におけるＶＨ及びＶＬ又は別のＶＨＨがＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１二重特異性抗体における抗ＰＤ－１可変領域を置換するために用いられることができるか否かを試験するために更に実験を行った。更に、様々な抗ＣＤ４０モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬも試験した。これらの抗体及びそれらの配列を以下に列挙する。

以前のインビボ薬効実験と同様に、マウスモデルにおいてこれらの二重特異性抗体のインビボでの腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞（例えば、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約３００ｍｍ３～５００ｍｍ３に達するとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり６匹）。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体（Ｇ３）、１．３５ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）及び１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体と１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体との組み合わせ（Ｇ５）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回であり、投与回数は、適当であった（例えば、計５回投与）。処理の全期間にわたって各匹のマウスの体重及び腫瘍体積をモニターした。これらのＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ形態（例えば、図１Ｂ）を有する抗ＰＤ１／ＣＤ４０二重特異性抗体が、がんの治療において優れた薬効及び低レベルの毒性を有することが予想される。

更に、これらのＦＶ３Ａ形態（例えば、図１８Ａ）の抗体の薬効を試験するために実験を行った。当該構造で、抗ＣＤ４０抗原結合部位は、抗ＰＤ－１抗体の３Ａ部位に挿入された。

マウスモデルにおいてこれらの二重特異性抗体のインビボでの腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するがん細胞（例えば、ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）を二ヒト化ＣＤ４０／ＰＤ－１マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約３００ｍｍ３～５００ｍｍ３に達するとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり６匹）。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＣＤ４０マウスにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体（Ｇ３）、１．３５ｍｇ／ｋｇＰＤ１－Ｃ４０－ＦＶ３Ａ（Ｇ４）及び１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ１モノクローナル抗体と１ｍｇ／ｋｇ抗ＣＤ４０モノクローナル抗体との組み合わせ（Ｇ５）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回であり、投与回数は、適当であった（例えば、計５回投与）。処理の全期間にわたって体重及び腫瘍体積をモニターした。これらのＰＤ１－Ｃ４０－ＦＶ３Ａ形態（例えば、図１８Ａ）を有する抗ＰＤ１／ＣＤ４０二重特異性抗体ががんの治療において優れた薬効及び低レベルの毒性を有することが予想される。

更に、これらのＦａｂ－ＳｃＦＶ－ＩｇＧ４形態（例えば、図１Ａ）の抗体の薬効を試験するために実験を行った。当該構造で、抗ＰＤ－１アームは、重鎖と、軽鎖と、を含み、且つ抗ＣＤ４０アームは、ＩｇＧ４のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。又は、抗ＰＤ－１アームは、１本の重鎖のみを有し、且つＶＨＨは、任意選択的なＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３に連結される。

更に、これらのＦｃ含有ＤＡＲＴ形態（図３７）の抗体の表３１に列挙されたＶＨ、ＶＬ及びＶＨＨに対する薬効を試験するために実験を行った。これらの抗ＰＤ１／ＣＤ４０二重特異性抗体ががんの治療において優れた薬効及び低レベルの毒性を有すると予想される。

実施例１９：二重特異性抗体抗結腸がんのインビボ結果
アテゾリズマブは、ジェネンテック公司（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）により開発されたヒト化抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ＶＨ配列番号２１１；ＶＬ配列番号２１２）である。アベルマブは、メルク（Ｍｅｒｃｋ）／ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ）により開発されたヒト抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（ＶＨ配列番号２１３；ＶＬ配列番号２１４）である。当該実験では、本明細書に記載される二重特異性抗体の抗ＰＤ－１アームのＶＨ及びＶＬ配列（例えば、図１Ｂに示すように）を抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＶＨ及びＶＬ配列で置換した。更に、得られたＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４０二重特異性抗体の薬効を本明細書に開示される対応するＰＤ－１／ＣＤ４０二重特異性抗体の薬効と比較した。

以前のインビボ薬効実験と同様に、結腸がんマウスモデルにおいて抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ、アテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（重鎖配列は、配列番号２１５に示され、軽鎖配列は、配列番号２１６に示される）及びアベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（重鎖配列は、配列番号２１７に示され、軽鎖配列は、配列番号２１８に示される）のインビボ腫瘍増殖に対する作用を試験した。ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ－３８腫瘍細胞（結腸腺がん細胞）（ＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１）をヒト化ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４０マウス（Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４０マウス）に皮下注射した。マウスにおける腫瘍体積が約１００ｍｍ３～１５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積に基づいてマウスを異なる群にランダムに分けた（群あたり６匹）。ヒト化ＰＤ－Ｌ１マウスの詳細な情報は、例えばＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９９５７４及びＵＳ１０９４５４１８Ｂ２を参照することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

各群において、Ｂ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４０マウス（ヒト化ＰＤ－１、ヒト化ＰＤ－Ｌ１及びヒト化ＣＤ４０遺伝子を有するマウス）にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，Ｇ１）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１／ＣＤ４０抗体ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ２）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４０二重特異性抗体アテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ３）、１ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ４０二重特異性抗体アベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４）、３ｍｇ／ｋｇＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ５）、３ｍｇ／ｋｇアテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ６）又は３ｍｇ／ｋｇアベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ７）を腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により注射した。投与頻度は、週２回（計４回投与）であった。詳細な情報は、下記表に示すとおりである。

処理の全期間にわたってマウスの体重をモニターした。異なる群においてマウスの平均体重は、種々の程度で増加した（図４５及び図４６）。処理期間の終了時に、異なる群においてマウスの体重は増加した。
抗体で処理した群における腫瘍体積は、図４７に示される。２１日目（群分け後２１日）のＴＧＩＴＶ％も下記表に示すように計算した。下記表におけるＰ値は、２１日目のデータに基づいて計算された。

結果は、同じ用量レベルで、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ抗体がアテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ又はアベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡよりもよいインビボ薬効を示すことを示している。用量レベルが高いほど、治療はより有効である。

より具体的には、結果は、異なる用量レベルで、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１（Ｇ２、Ｇ５）がアテゾリズマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ３、Ｇ６）又はアベルマブ－６Ａ７－ＦＶＨＣ－ＩｇＧ１－ＬＡＬＡ（Ｇ４、Ｇ７）よりも高いＴＧＩＴＶ％（６９．６％、９２．５％）で腫瘍増殖を抑制し、用量が高いほど治療効果が高いことを示している。従って、データは、ＳｃＦＶ－ＨＣ－ＩｇＧ１形態の異なる分子がＢ－ｈＰＤ－１／ｈＰＤ－Ｌ１／ｈＣＤ４０マウスにおいて異なる治療効果を有することを示している。

他の実施例
なお、本発明は、本発明の具体的な実施形態に関連して説明されてきたが、前述した説明は、添付の請求項の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではなく、説明することを意図していることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims

ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位と、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位と、を含む、抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の抗原結合部位は、ＰＤ－１を発現する細胞に結合する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ４０を発現する細胞に結合する、請求項１又は２に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、ＣＤ４０経路を活性化することができ、ここで前記ＣＤ４０経路の活性化は、前記抗原結合タンパク質構築物と、ＰＤ－１を発現する細胞との結合に依存する、請求項１～３の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、ＰＤ－１を発現する１つ又は複数の細胞の存在下でＣＤ４０経路の活性化を誘導する、請求項１～４の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、腫瘍微小環境又は腫瘍排出リンパ節においてＣＤ４０経路の活性化を誘導する、請求項１～５の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、ＰＤ－１を発現する１つ又は複数の細胞の非存在下でＣＤ４０経路の活性化を誘導しない、請求項１～６の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記ＰＤ－１を発現する細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞又は骨髄系細胞（例えば、マクロファージ、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ））である、請求項１～７の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記ＣＤ４０を発現する細胞は、抗原提示細胞である、請求項１～８の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ領域を含み、ここで前記第２の抗原結合部位は、前記Ｆｃ領域に連結される、請求項１～９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ領域を含み、ここで前記第２の抗原結合部位は、前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結される、請求項１～１０の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ領域を含み、ここで前記抗原結合タンパク質構築物は、Ｆｃ受容体媒介性機序によってＣＤ４０経路を活性化できない、請求項１～１１の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、二重特異性抗体である、請求項１～１２の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
ＰＤ－１に特異的に結合する前記第１の抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨドメインを含む、請求項１～１３の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
ＰＤ－１に特異的に結合する前記抗原結合部位は、ＰＤ－１リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）又はその可溶性部分を含む、請求項１～１３の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
ＣＤ４０に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨドメインを含む、請求項１～１５の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
ＣＤ４０に特異的に結合する前記第２の抗原結合部位は、ＣＤ４０リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）又はその可溶性部分を含む、請求項１～１５の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の抗原結合部位は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１～１７の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の抗原結合部位の前記重鎖可変領域（ＶＨ１）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変領域（ＶＬ１）は、ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、
（３）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、８及び９に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１１及び１２に示され、
（４）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、２６及び２７に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２８、２９及び３０に示され、
（５）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、１４及び１５に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、１７及び１８に示され、及び
（６）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１、３２及び３３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４、３５及び３６に示される、請求項１８に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２の抗原結合部位は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１～１９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変領域（ＶＨ２）は、ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変領域（ＶＬ２）は、ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５９、６０及び６１に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６２、６３及び６４に示され、
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７７、７８及び７９に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８０、８１及び８２に示され、
（３）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、
（４）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示され、
（５）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７１、７２及び７３に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７４、７５及び７６に示され、及び
（６）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８９、９０及び９１に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号９２、９３及び９４に示される、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質構築物。
互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成する第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域と、
互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域と、を含む、抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の重鎖可変領域、第１の重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び第１の重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む第１のポリペプチドと、
前記第２の重鎖可変領域、第２の重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び第２の重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む第２のポリペプチドと、を含む、請求項２２に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の軽鎖可変領域を含む第３のポリペプチドと、
前記第２の軽鎖可変領域を含む第４のポリペプチドと、を含む、請求項２３に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２のポリペプチドは、前記第２の軽鎖可変領域を更に含む、請求項２３に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、前記第１の軽鎖可変領域を含む第３のポリペプチドを含む、請求項２５に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１のポリペプチドは、前記第１の軽鎖可変領域を更に含む、請求項２３又は２５に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の重鎖可変領域、前記第２の重鎖可変領域及び前記第２の軽鎖可変領域を含む第１のポリペプチドと、
前記第１の軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチドと、を含む、請求項２２に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１のポリペプチドは、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を更に含む、請求項２８に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）は、ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、
（３）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７、８及び９に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１１及び１２に示され、
（４）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、２６及び２７に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２８、２９及び３０に示され、
（５）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、１４及び１５に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、１７及び１８に示され、及び
（６）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３１、３２及び３３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４、３５及び３６に示される、請求項２２～２９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）は、ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び
前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）は、ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ここで選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号５９、６０及び６１に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６２、６３及び６４に示され、
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７７、７８及び７９に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８０、８１及び８２に示され、
（３）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、
（４）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示され、
（５）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７１、７２及び７３に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号７４、７５及び７６に示され、及び
（６）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８９、９０及び９１に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号９２、９３及び９４に示される、請求項２２～３０の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、且つ選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、又は
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、且つ選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される、請求項３０又は３１に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の重鎖可変領域は、配列番号４０、４１、４２又は５３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号４３、４４、４５又は５４と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２～３２の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の重鎖可変領域は、配列番号４６、４７、４８、４９又は５５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号５０、５１、５２又は５６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２～３１の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の重鎖可変領域は、配列番号５７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号５８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２～３１の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２の重鎖可変領域は、配列番号９８、９９、１００又は１２０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号１０１、１０２、１０３、１０４又は１２１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２～３１の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２の重鎖可変領域は、配列番号１０５、１０６、１０７、１０８、１２２、１２６又は１２８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号１０９、１１０、１１１、１２３、１２７又は１２９と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２～３２の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２の重鎖可変領域は、配列番号１１２、１１３、１１４、１１５又は１２４と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号１１６、１１７、１１８、１１９又は１２５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２～３１の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１の重鎖可変領域は、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の重鎖可変領域は、配列番号１０８又は１２６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号１１０又は１２７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２２～３２、３３及び３７の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１のポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第３のポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２６に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第２のポリペプチドは、配列番号１３２又は１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２６又は４０に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１のポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２のポリペプチドは、配列番号１３２又は１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第３のポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２６に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１のポリペプチドは、配列番号１３４又は１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２のポリペプチドは、配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２８又は２９に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記第１のポリペプチドは、配列番号１３７又は１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２のポリペプチドは、配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項２８又は２９に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、二重特異性抗体である、請求項１～４４の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃである、請求項１～４４の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、ＴｒｉｏＭａｂ、共通軽鎖を有する二重特異性抗体、ＣｒｏｓｓＭａｂ、２：１ＣｒｏｓｓＭａｂ、２：２ＣｒｏｓｓＭａｂ、Ｄｕｏｂｏｄｙ、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ＩｇＧ形態抗体、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ形態抗体、ＴＦ、ＡＤＡＰＴＩＲ、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）、ＢｉＴＥ－Ｆｃ、二重親和性再標的抗体（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、四価ＤＡＲＴ、タンデム二重抗体（ＴａｎｄＡｂ）、ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ、ＩｍｍＴＡＣ、三重特異性ナノボディ又は三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）である、請求項１～４４の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４に由来する１つ又は複数の重鎖定常ドメインを含む、請求項１～４７の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
前記抗原結合タンパク質構築物は、１つ又は複数の重鎖定常ドメインを含み、且つ前記１つ又は複数の重鎖定常ドメインは、ＬＡＬＡ突然変異及び／又はノブイントホール（ＫＩＨ）突然変異を含む、請求項１～４８の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物。
第１の重鎖可変領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、
第１の軽鎖可変領域を含む第１の軽鎖ポリペプチドと、
第２の重鎖可変領域を含む第２の重鎖ポリペプチドと、
第２の軽鎖可変領域を含む第２の軽鎖ポリペプチドと、を含み、
ここで前記第１の重鎖可変領域と前記第１の軽鎖可変領域とは互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変領域と前記第２の軽鎖可変領域とは互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）と、
ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）と、
相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）と、
ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）と、を含み、
ここで選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、及び
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される、請求項５０に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記第１の重鎖可変領域は、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の重鎖可変領域は、配列番号１０８又は１２６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号１１０又は１２７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項５０又は５１に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記第１の重鎖ポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項５０～５２の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
第１の重鎖可変領域を含む重鎖ポリペプチドと、
第１の軽鎖可変領域を含む軽鎖ポリペプチドと、
第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む一本鎖可変断片ポリペプチドと、を含み、
ここで前記第１の重鎖可変領域と前記第１の軽鎖可変領域とは互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変領域と前記第２の軽鎖可変領域とは互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記一本鎖可変断片ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、前記第２の重鎖可変領域、リンカーペプチド配列、前記第２の軽鎖可変領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む、請求項５４に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記リンカーペプチド配列は、ＡＳＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５２）と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項５５に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）と、
ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）と、
相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）と、
ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）と、を含み、
ここで選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、及び
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される、請求項５４～５６の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記第１の重鎖可変領域は、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の重鎖可変領域は、配列番号１０８又は１２６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号１１０又は１２７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項５４～５７の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
（１）前記重鎖ポリペプチドは、配列番号１３０と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、及び
（２）前記一本鎖可変断片ポリペプチドは、配列番号１３２又は１３３と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項５４～５８の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
第１の重鎖可変領域を含む重鎖ポリペプチドと、
第１の軽鎖可変領域を含む軽鎖ポリペプチドと、を含み、
ここで、一本鎖可変断片ポリペプチドは、前記重鎖ポリペプチドのＣ末端に連結され、ここで前記一本鎖可変断片ポリペプチドは、第２の重鎖可変領域と、第２の軽鎖可変領域と、を含み、
ここで前記第１の重鎖可変領域と前記第１の軽鎖可変領域とは互いに結合し、ＰＤ－１に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変領域と前記第２の軽鎖可変領域とは互いに結合し、ＣＤ４０に特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記一本鎖可変断片ポリペプチドは、第１のリンカーペプチド配列によって前記第１の重鎖ポリペプチドに連結される、請求項６０に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記第１のリンカーペプチド配列は、ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５３）と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６１に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記一本鎖可変断片ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、前記第２の軽鎖可変領域、第２のリンカーペプチド配列及び前記第２の重鎖可変領域を含む、請求項６０～６２の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記第２のリンカーペプチド配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５４）と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項６３に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）と、
ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ１ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ１ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ１ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第１の軽鎖可変領域（ＶＬ１）と、
相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び３を含み、ここで前記ＶＨ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＨ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第２の重鎖可変領域（ＶＨ２）と、
ＣＤＲ１、２及び３を含み、ここで前記ＶＬ２ＣＤＲ１領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ２領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ２アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ２ＣＤＲ３領域は、選択されたＶＬ２ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む前記第２の軽鎖可変領域（ＶＬ２）と、を含み、
ここで選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列及び選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２及び３アミノ酸配列は、以下の何れかである：
（１）Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２及び３に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、５及び６に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６５、６６及び６７に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号６８、６９及び７０に示され、及び
（２）Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、選択されたＶＨ１ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２０及び２１に示され、選択されたＶＬ１ＣＤＲ１、２、３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２２、２３及び２４に示され、選択されたＶＨ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８３、８４及び８５に示され、選択されたＶＬ２ＣＤＲ１、２、３アミノ酸配列は、それぞれ配列番号８６、８７及び８８に示される、請求項６０～６４の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記第１の重鎖可変領域は、配列番号４１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域は、配列番号４５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の重鎖可変領域は、配列番号１０８又は１２６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域は、配列番号１１０又は１２７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項６０～６５の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
（１）前記重鎖ポリペプチドは、配列番号１３４又は１３５と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、及び
（２）前記軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３６と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項６０～６６の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
（１）前記重鎖ポリペプチドは、配列番号１３７又は１３８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含み、及び
（２）前記軽鎖ポリペプチドは、配列番号１３９と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有する配列を含む、請求項６０～６６の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
Ｆｃ領域を含む、標的に特異的に結合する抗体と、
ＣＤ４０に特異的に結合する抗原結合部位と、を含み、
ここで前記抗原結合部位は、前記抗体のＦｃ領域に連結される、二重特異性抗体又はその抗原結合断片。
前記二重特異性抗体は、前記標的を発現する１つ又は複数の細胞の存在下で免疫細胞におけるＣＤ４０経路の活性化を誘導する、請求項６９に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体は、ＣＤ４０経路を活性化でき、ここで前記ＣＤ４０経路の活性化は、前記抗原結合タンパク質構築物と前記標的を発現する細胞との結合に依存する、請求項６９に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体は、腫瘍微小環境又は腫瘍排出リンパ節においてＣＤ４０経路の活性化を誘導する、請求項６９に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体は、前記標的を発現する１つ又は複数の細胞の非存在下でＣＤ４０経路の活性化を誘導しない、請求項６９に記載の二重特異性抗体。
前記二重特異性抗体は、Ｆｃ媒介性機序によってＣＤ４０経路を活性化できない、請求項６９～７３の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
前記標的は、免疫チェックポイント分子である、請求項６９～７４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
前記標的は、がん特異的抗原又はがん関連抗原である、請求項６９～７４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
前記標的は、ＰＤ－１である、請求項６９～７４の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
ＣＤ４０に特異的に結合する前記抗原結合部位は、ＳｃＦｖ又はＶＨＨドメインを含む、請求項６９～７７の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
ＣＤ４０に特異的に結合する前記抗原結合部位は、ＣＤ４０リガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ）又はその可溶性部分を含む、請求項６９～７７の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
ＣＤ４０に特異的に結合する前記抗原結合部位は、前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結される、請求項６９～７９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
ＣＤ４０に特異的に結合する前記抗原結合部位は、前記Ｆｃ領域に挿入される、請求項６９～７９の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
治療剤に共有結合する請求項１～４９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物或いは請求項５０～８１の何れか一項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合断片を含む、抗体薬物複合体。
前記治療剤は、細胞毒性剤又は細胞阻害剤である、請求項８２に記載の抗体薬物複合体。
がんに罹患している対象を治療する方法であって、前記方法は、前記対象に請求項１～４９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物、請求項５０～８１の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は抗原結合断片、或いは請求項８２又は８３に記載の抗体薬物複合体を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、がんに罹患している対象を治療する方法。
前記対象は、固形腫瘍に罹患している、請求項８４に記載の方法。
前記がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、頭頸部がん、腎細胞がん（ＲＣＣ）、黒色腫、膀胱がん、胃がん、尿路上皮がん、メルケル細胞がん、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）又は結腸直腸がんである、請求項８４に記載の方法。
前記がんは、黒色腫、膵臓がん、中皮腫又は悪性血液腫瘍である、請求項８４に記載の方法。
前記対象に抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｈｅｒ２抗体又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする抗体を投与することを更に含む、請求項８４～８７の何れか一項に記載の方法。
前記対象に化学療法を実施することを更に含む、請求項８４～８８の何れか一項に記載の方法。
請求項１～４９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物、請求項５０～８１の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は抗原結合断片、或いは請求項８２又は８３に記載の抗体薬物複合体を含む有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腫瘍増殖速度を低下させる方法。
前記腫瘍細胞を、請求項１～４９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物、請求項５０～８１の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は抗原結合断片、或いは請求項８２又は８３に記載の抗体薬物複合体を含む有効量の組成物と接触させることを含む、腫瘍細胞を死滅させる方法。
請求項１～４９の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質構築物、請求項５０～８１の何れか一項に記載の二重特異性抗体又は抗原結合断片、或いは請求項８２又は８３に記載の抗体薬物複合体、及び薬学的に許容されるベクターを含む、医薬組成物。